JP2018193407A - 表皮ヒアルロン酸産生促進剤、グルタチオン産生促進剤、セリンパルミトイルトランスフェラーゼmRNA発現促進剤、最終糖化産物分解促進剤、クローディン−1産生促進剤、オクルディン産生促進剤、ヒト皮膚三次元モデルにおける表皮タイトジャンクション構成蛋白質産生促進剤、皮膚バリア機能低下抑制剤、テストステロン5α−リダクターゼ活性阻害剤、及び毛乳頭細胞増殖剤 - Google Patents
表皮ヒアルロン酸産生促進剤、グルタチオン産生促進剤、セリンパルミトイルトランスフェラーゼmRNA発現促進剤、最終糖化産物分解促進剤、クローディン−1産生促進剤、オクルディン産生促進剤、ヒト皮膚三次元モデルにおける表皮タイトジャンクション構成蛋白質産生促進剤、皮膚バリア機能低下抑制剤、テストステロン5α−リダクターゼ活性阻害剤、及び毛乳頭細胞増殖剤 Download PDFInfo
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Abstract
Description
AGEsとしては、例えば、イミダゾロン(非特許文献4参照)、Nε−カルボキシメチルリシン(CML)(非特許文献5参照)、ペントシジン、ピラリン、クロスリン、Nε−カルボキシエチルリシン、メチルグリオキサールリシンダイマー、グリオキサールリシンダイマーなどが同定されている。イミダゾロンは3−DGがアルギニンと反応して生成することが報告されている(非特許文献4参照)。
また、AGEs生成抑制作用を有する化合物として、例えば、アミノグアニジン、OPB−9195、ピリドキサミンなどの化合物が知られているが、これら化合物は副作用等の問題を有している(非特許文献4〜6参照)。
前記アンドロゲンは重要なホルモンであるが、それが過度に作用すると、男性型脱毛症、多毛症、脂漏症、座瘡(ニキビなど)、前立腺肥大症、前立腺腫瘍、男児性早熟等のさまざまな好ましくない症状を誘発する。そこで、これらの各種症状を改善するために過剰のアンドロゲンの作用を抑制する方法、具体的には、テストステロンを活性型5α−DHTに還元するテストステロン5α−レダクターゼの作用を阻害することにより、活性な5α−DHTが生じるのを抑制する方法や、テストステロンから生じた5α−DHTが受容体と結合するのを阻害することによりアンドロゲン活性を発現させない方法が開示されている。このような5α−DHTとその受容体との結合を阻害する作用を有する植物抽出物としては、例えば、マジト及びカチュアの少なくともいずれかの抽出物などが開示されている(特許文献7参照)。
<1> ハイビスカスの抽出物を含有することを特徴とするヒアルロニダーゼ活性阻害剤である。
<2> ハイビスカスの抽出物を含有することを特徴とする過酸化水素消去剤である。
<3> ハイビスカスの抽出物を含有することを特徴とする美白剤である。
<4> B16メラノーマ細胞に対するメラニン産生抑制作用、エンドセリン−1mRNA発現上昇抑制作用、幹細胞増殖因子mRNA発現上昇抑制作用、塩基性線維芽細胞増殖因子mRNA発現上昇抑制作用、及びプロオピオメラノコルチンmRNA発現上昇抑制作用の少なくともいずれかを有する前記<3>に記載の美白剤である。
<5> ハイビスカスの抽出物を含有することを特徴とする抗老化剤である。
<6> 表皮ヒアルロン酸産生促進作用、グルタチオン産生促進作用、セリンパルミトイルトランスフェラーゼmRNA発現促進作用、メイラード反応阻害作用、最終糖化産物形成抑制作用、最終糖化産物分解促進作用、クローディン−1産生促進作用試験、オクルディン産生促進作用、ヒト皮膚三次元モデルにおける表皮タイトジャンクション構成蛋白質産生促進作用、及び皮膚バリア機能低下抑制作用の少なくともいずれかを有する前記<5>に記載の抗老化剤である。
<7> ハイビスカスの抽出物を含有することを特徴とする育毛剤である。
<8> テストステロン5α−リダクターゼ活性阻害作用、及び毛乳頭細胞増殖作用の少なくともいずれかを有する前記<7>に記載の育毛剤である。
本発明のヒアルロニダーゼ活性阻害剤、過酸化水素消去剤、美白剤、抗老化剤、及び育毛剤は、いずれもハイビスカスの抽出物を含有し、更に必要に応じてその他の成分を含有してなる。
前記過酸化水素消去剤は、過酸化水素消去作用を有するものである。
前記美白剤は、B16メラノーマ細胞に対するメラニン産生抑制作用、エンドセリン−1mRNA発現上昇抑制作用、幹細胞増殖因子mRNA発現上昇抑制作用、塩基性線維芽細胞増殖因子mRNA発現上昇抑制作用、及びプロオピオメラノコルチンmRNA発現上昇抑制作用の少なくともいずれかに基づく美白作用を有するものである。
前記抗老化剤は、表皮ヒアルロン酸産生促進作用、グルタチオン産生促進作用、セリンパルミトイルトランスフェラーゼmRNA発現促進作用、メイラード反応阻害作用、最終糖化産物形成抑制作用、最終糖化産物分解促進作用、クローディン−1産生促進作用試験、オクルディン産生促進作用、ヒト皮膚三次元モデルにおける表皮タイトジャンクション構成蛋白質産生促進作用、及び皮膚バリア機能低下抑制作用の少なくともいずれかに基づく抗老化作用を有するものである。
前記育毛剤は、テストステロン5α−リダクターゼ活性阻害作用、及び毛乳頭細胞増殖作用の少なくともいずれかに基づく育毛作用を有するものである。
具体的には、前記ハイビスカスの抽出物の抽出方法としては、例えば、エタノール水溶液などの前記溶媒を満たした処理槽に、ハイビスカスの花等の抽出原料を投入し、必要に応じて適宜攪拌しながら、還流抽出器で80℃にて2時間加熱抽出し、熱時濾過して脂溶性成分を溶出した後、エバポレーターを用いて減圧下で濃縮し、更に同様の濾過処理を行う方法が挙げられる。
この際、抽出条件は、前記抽出原料などに応じて適宜調整し得るが、前記抽出溶媒量は、前記抽出原料に対して5倍量〜20倍量(質量比)が好ましく、抽出時間は1時間〜3時間が好ましく、抽出温度は20℃〜95℃が好ましい。
また、得られた前記ハイビスカスの抽出物は、そのままでも前記ヒアルロニダーゼ活性阻害剤、前記過酸化水素消去剤、前記美白剤、前記抗老化剤、及び前記育毛剤のいずれかとして使用することができるが、利用しやすい点で、前記濃縮液、前記乾燥物が好ましい。前記乾燥物を得るに当たって、吸湿性を改善するためにデキストリン、シクロデキストリンなどのキャリアーを加えてもよい。
なお、前記ハイビスカスの抽出物は、前記した各作用に基づき、B16メラノーマ細胞に対するメラニン産生抑制剤、エンドセリン−1mRNA発現上昇抑制剤、幹細胞増殖因子mRNA発現上昇抑制剤、塩基性線維芽細胞増殖因子mRNA発現上昇抑制剤、プロオピオメラノコルチンmRNA発現上昇抑制剤、表皮ヒアルロン酸産生促進剤、グルタチオン産生促進剤、セリンパルミトイルトランスフェラーゼmRNA発現促進剤、メイラード反応阻害剤、最終糖化産物形成抑制剤、最終糖化産物分解促進剤、クローディン−1産生促進剤、オクルディン産生促進剤、ヒト皮膚三次元モデルにおける表皮タイトジャンクション構成蛋白質産生促進剤、皮膚バリア機能低下抑制剤、テストステロン5α−リダクターゼ活性阻害剤、及び毛乳頭細胞増殖剤としても、それぞれ好適に利用可能である。
本発明の過酸化水素消去剤は、過酸化水素消去作用に基づいて発揮される。
本発明の美白剤における美白作用は、B16メラノーマ細胞に対するメラニン産生抑制作用、エンドセリン−1mRNA発現上昇抑制作用、幹細胞増殖因子mRNA発現上昇抑制作用、塩基性線維芽細胞増殖因子mRNA発現上昇抑制作用、及びプロオピオメラノコルチンmRNA発現上昇抑制作用の少なくともいずれかに基づいて発揮される。
本発明の抗老化剤における抗老化作用は、表皮ヒアルロン酸産生促進作用、グルタチオン産生促進作用、セリンパルミトイルトランスフェラーゼmRNA発現促進作用、メイラード反応阻害作用、最終糖化産物形成抑制作用、最終糖化産物分解促進作用、クローディン−1産生促進作用試験、オクルディン産生促進作用、ヒト皮膚三次元モデルにおける表皮タイトジャンクション構成蛋白質産生促進作用、及び皮膚バリア機能低下抑制作用の少なくともいずれかに基づいて発揮される。
本発明の育毛剤における育毛作用は、テストステロン5α−リダクターゼ活性阻害作用、及び毛乳頭細胞増殖作用の少なくともいずれかに基づいて発揮される。
また、前記ヒアルロニダーゼ活性阻害剤、前記過酸化水素消去剤、前記美白剤、前記抗老化剤、及び前記育毛剤は、必要に応じて製剤化することにより、粉末状、顆粒状、錠剤状等、任意の剤形とすることができる。
ハイビスカス花部抽出液(丸善製薬株式会社製)の凍結乾燥物を被験試料として用いた。
<ヒアルロニダーゼ活性阻害作用試験>
ハイビスカス花部抽出液(丸善製薬株式会社製)の凍結乾燥物を被験試料として用い、下記の試験方法によりヒアルロニダーゼ活性阻害作用を試験した。
ヒアルロニダーゼ活性阻害率の計算方法は、以下のとおりである。結果を表1に示した。
ヒアルロニダーゼ活性阻害率(%)=
1−(St−Sb)/(Ct−Cb)}×100
ただし、前記式中、Stは、被験試料溶液の波長585nmにおける吸光度、Sbは、被験試料溶液ブランクの波長585nmにおける吸光度、Ctは、コントロール溶液の波長585nmにおける吸光度、Cbはコントロール溶液ブランクの波長585nmにおける吸光度、をそれぞれ表す。
<過酸化水素消去作用試験>
ハイビスカス花部抽出液(丸善製薬株式会社製)の凍結乾燥物を被験試料として用い、下記の試験方法により過酸化水素消去作用を試験した。
過酸化水素消去率の計算方法は、以下のとおりである。また、50%阻害活性濃度(IC50:μg/mL)を算出した。これらの結果を表2に示した。
過酸化水素消去率(%)={1−(St−Sb)/(Ct−Cb)}×100
ただし、前記式中、Stは、被験試料溶液の波長650nmにおける吸光度、Sbは、被験試料溶液ブランクの波長650nmにおける吸光度、Ctは、コントロール溶液の波長650nmにおける吸光度、Cbは、コントロール溶液ブランクの波長650nmにおける吸光度、をそれぞれ表す。
<B16メラノーマ細胞に対するメラニン産生抑制作用試験>
ハイビスカス花部抽出液(丸善製薬株式会社製)の凍結乾燥物を被験試料として用い、下記の試験方法によりB16メラノーマ細胞に対するメラニン産生抑制作用を試験した。
また、細胞生存率の測定のため、同様に培養後、400μLのPBS(−)リン酸生理緩衝液で洗浄し、終濃度0.05mg/mLで10体積%FBS含有ダルベッコMEMに溶解した13.8mmol/Lニュートラルレッドを各ウェルに200μL添加した。2.5時間培養した後、ニュートラルレッド溶液を捨て、エタノール・酢酸溶液(エタノール:酢酸:水=50:1:49)を各ウェルに200μL添加し、色素を抽出した。抽出後、波長540nmにおける吸光度を測定した。
空試験として、10体積%FBS及び1mmol/Lテオフィリン含有ダルベッコMEMのみで培養した細胞を同様の方法で試験した。
メラニン産生抑制率の計算方法は、以下のとおりである。結果を表3に示した。
メラニン産生抑制率(%)={1−(B/D)/(A/C)}×100
ただし、前記式中、Aは、被験試料を添加しない細胞での波長475nmにおける吸光度、Bは、被験試料を添加した細胞での波長475nmにおける吸光度、Cは、被験試料を添加しない細胞での波長540nmにおける吸光度、Dは、被験試料を添加した細胞での波長540nmにおける吸光度、をそれぞれ表す。
<エンドセリン−1mRNA発現上昇抑制作用試験>
ハイビスカス花部抽出液(丸善製薬株式会社製)の凍結乾燥物を被験試料として用い、下記の試験方法によりエンドセリン−1mRNA発現上昇抑制作用を試験した。
KGMを用いて35mmシャーレ(FALCON社製)に40×104cells/2mL/シャーレずつ播き、37℃、5%CO2下で一晩培養した。24時間後に培養液を捨て、HEPES緩衝液1mLを加え、UV−B照射(50mJ/cm2)を行い、その後KGMで必要濃度に溶解した被験試料を各シャーレに2mLずつ添加し、37℃、5%CO2下で24時間培養した。培養後、培養液を捨て、ISOGEN II(NIPPON GENE;Cat.No.311−07361)にてtotal RNAを抽出し、それぞれのRNA量を分光光度計にて測定し、200ng/μLになるようにtotal RNAを調製した。
このtotal RNAを鋳型とし、エンドセリン−1及び内部標準であるGAPDHのmRNAの発現量を測定した。検出はリアルタイムPCR装置Smart Cycler(R)(Cepheid社製)を用いて、TaKaRa SYBR(R) PrimeScriptTM RT−PCR Kit(Perfect Real Time)(code No.RR063A)によるリアルタイム2ステップRT−PCR反応により行った。
エンドセリン−1のmRNAの発現量は、「紫外線未照射、被験試料無添加」、「紫外線照射、被験試料無添加」、及び「紫外線照射、被験試料添加」でそれぞれ培養した細胞から調製した総RNA標品を基にして、GAPDHの値で補正値を求め、更に「紫外線未照射、被験試料無添加」の補正値を100とした時の「紫外線照射、被験試料無添加」、及び「紫外線照射、被験試料添加」の補正値を算出した。
そして、これらの結果から、下記数式により、エンドセリン−1mRNA発現上昇抑制率を算出した。結果を表4に示した。
エンドセリン−1mRNA発現上昇抑制率(%)
={(A−B)−(A−C)}/(A−B)×100
ただし、前記数式中、Aは、「紫外線未照射、被験試料無添加」時の補正値、Bは、「紫外線照射、被験試料無添加」時の補正値、Cは、「紫外線照射、被験試料添加」時の補正値である。
<幹細胞増殖因子(SCF)mRNA発現上昇抑制作用試験>
ハイビスカス花部抽出液(丸善製薬株式会社製)の凍結乾燥物を被験試料として用い、下記の試験方法により幹細胞増殖因子(SCF)mRNA発現上昇抑制作用を試験した。
KGMを用いて35mmシャーレ(FALCON社製)に40×104cells/2mLシャーレずつ播き、37℃、5%CO2下で一晩培養した。24時間後に培養液を捨て、HEPES緩衝液1mLを加えUV−B照射(50mJ/cm2)を行った。その後、KGMで必要濃度に溶解した被験試料を各シャーレに2mLずつ添加し、37℃、5%CO2下で24時間培養した。培養後、培養液を捨て、ISOGEN II(NIPPON GENE;Cat.No.311−07361)にてtotal RNAを抽出し、それぞれのRNA量を分光光度計にて測定し、200ng/μLになるようにtotal RNAを調製した。
このtotal RNAを鋳型とし、SCF(Stem Cell Factor)及び内部標準であるGAPDHのmRNAの発現量を測定した。検出はリアルタイムPCR装置Smart Cycler(R)(Cepheid社製)を用いて、TaKaRa SYBR(R) PrimeScriptTM RT−PCR Kit(Perfect Real Time)(code No.RR063A)によるリアルタイム2ステップRT−PCR反応により行った。
SCFのmRNAの発現量は、「紫外線未照射、被験試料無添加」、「紫外線照射、被験試料無添加」、及び「紫外線照射、被験試料添加」でそれぞれ培養した細胞から調製した総RNA標品を基にして、GAPDHの値で補正値を求め、更に「紫外線未照射、被験試料無添加」の補正値を100とした時の「紫外線照射、被験試料無添加」、及び「紫外線照射、被験試料添加」の補正値を算出した。
そして、これらの結果から、下記数式により、幹細胞増殖因子(SCF)mRNA発現上昇抑制率を算出した。結果を表5に示した。
幹細胞増殖因子(SCF)mRNA発現上昇抑制率(%)
={(A−B)−(A−C)}/(A−B)×100
ただし、前記数式中、Aは「紫外線未照射、被験試料無添加」時の補正値、Bは「紫外線照射、被験試料無添加」時の補正値、Cは「紫外線照射、被験試料添加」時の補正値をそれぞれ表す。
<塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)mRNA発現上昇抑制作用試験>
ハイビスカス花部抽出液(丸善製薬株式会社製)の凍結乾燥物を被験試料として用い、下記の試験方法により塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)mRNA発現上昇抑制作用を試験した。
KGMを用いて35mmシャーレ(FALCON社製)に40×104cells/2mLシャーレずつ播き、37℃、5%CO2下で一晩培養した。24時間後に培養液を捨て、HEPES緩衝液1mLを加えUV−B照射(50mJ/cm2)を行った。その後、KGMで必要濃度に溶解した被験試料を各シャーレに2mLずつ添加し、37℃、5%CO2下で24時間培養した。培養後、培養液を捨て、ISOGEN II(NIPPON GENE;Cat.No.311−07361)にてtotal RNAを抽出し、それぞれのRNA量を分光光度計にて測定し、200ng/μLになるようにtotal RNAを調製した。
このtotal RNAを鋳型とし、bFGF(basic Fibroblast Growth Factor;塩基性線維芽細胞増殖因子)及び内部標準であるGAPDHのmRNAの発現量を測定した。検出はリアルタイムPCR装置Smart Cycler(R)(Cepheid社製)を用いて、TaKaRa SYBR(R) PrimeScriptTM RT−PCR Kit(Perfect Real Time)(code No.RR063A)によるリアルタイム2ステップRT−PCR反応により行った。
bFGFのmRNAの発現量は、「紫外線未照射、被験試料無添加」、「紫外線照射、被験試料無添加」、及び「紫外線照射、被験試料添加」でそれぞれ培養した細胞から調製した総RNA標品を基にして、GAPDHの値で補正値を求め、更に「紫外線未照射、被験試料無添加」の補正値を100とした時の「紫外線照射、被験試料無添加」、及び「紫外線照射、被験試料添加」の補正値を算出した。
これらの結果から、下記数式により、bFGFmRNA発現上昇抑制率を算出した。結果を表6に示した。
bFGFmRNA発現上昇抑制率(%)
={(A−B)−(A−C)}/(A−B)×100
ただし、前記数式中、Aは、紫外線未照射・被験試料無添加時の補正値、Bは、紫外線照射・被験試料無添加時の補正値、Cは、紫外線照射・被験試料添加時の補正値を表す。
<プロオピオメラノコルチン(POMC)mRNA発現上昇抑制作用試験>
ハイビスカス花部抽出液(丸善製薬株式会社製)の凍結乾燥物を被験試料として用い、下記の試験方法によりプロオピオメラノコルチン(POMC)mRNA発現上昇抑制作用を試験した。
KGMを用いて35mmシャーレ(FALCON社製)に40×104cells/2mLシャーレずつ播き、37℃、5%CO2下で一晩培養した。24時間後に培養液を捨て、HEPES緩衝液1mLを加えUV−B照射(50mJ/cm2)を行った。その後、KGMで必要濃度に溶解した被験試料を各シャーレに2mLずつ添加し、37℃、5%CO2下で24時間培養した。培養後、培養液を捨て、ISOGEN II(NIPPON GENE;Cat.No.311−07361)にてtotal RNAを抽出し、それぞれのRNA量を分光光度計にて測定し、200ng/μLになるようにtotal RNAを調製した。
このtotal RNAを鋳型とし、POMC(proopiomelanocortin;プロオピオメラノコルチン)及び内部標準であるGAPDHのmRNAの発現量を測定した。検出はリアルタイムPCR装置Smart Cycler(R)(Cepheid社製)を用いて、TaKaRa SYBR(R) PrimeScriptTM RT−PCR Kit(Perfect Real Time)(code No.RR063A)によるリアルタイム2ステップRT−PCR反応により行った。
POMCのmRNAの発現量は、「紫外線未照射、被験試料無添加」、「紫外線照射、被験試料無添加」、及び「紫外線照射、被験試料添加」でそれぞれ培養した細胞から調製した総RNA標品を基にして、GAPDHの値で補正値を求め、更に「紫外線未照射、被験試料無添加」の補正値を100とした時の「紫外線照射、被験試料無添加」、及び「紫外線照射、被験試料添加」の補正値を算出した。
これらの結果から、下記数式により、POMCmRNA発現上昇抑制率を算出した。結果を表7に示した。
POMCmRNA発現上昇抑制率(%)
={(A−B)−(A−C)}/(A−B)×100
ただし、前記数式中、Aは、「紫外線未照射、被験試料無添加」時の補正値、Bは、「紫外線照射、被験試料無添加」時の補正値、Cは、「紫外線照射、被験試料添加」時の補正値を表す。
<表皮ヒアルロン酸産生促進作用試験>
ハイビスカス花部抽出液(丸善製薬株式会社製)の凍結乾燥物を被験試料として用い、下記の試験方法により表皮ヒアルロン酸産生促進作用を試験した。
ヒアルロン酸産生促進率(%)=A/B×100
ただし、前記式中、Aは、被験試料添加時のヒアルロン酸量、Bは、被験試料無添加時のヒアルロン酸量、を表す。
<グルタチオン産生促進作用試験(ヒト正常皮膚線維芽細胞)>
ハイビスカス花部抽出液(丸善製薬株式会社製)の凍結乾燥物を被験試料として用い、下記の試験方法によりグルタチオン産生促進作用試験(ヒト正常皮膚線維芽細胞)を試験した。
即ち、96wellプレートに溶解した細胞抽出液100μL、0.1Mのリン酸緩衝液50μL、2mMのNADPHを25μL及びグルタチオンレダクターゼ25μL(終濃度17.5unit/mL)を加え、37℃で10分間加温した後、10mMの5,5’−dithiobis(2−nitorobenzoic acid)25μLを加え、5分間後までの波長412nmにおける吸光度を測定し、ΔOD/minを求めた。総グルタチオン濃度は酸化型グルタチオンを用いて作成した検量線に基づき算出した。
得られた値は総タンパク量当たりのグルタチオン量に補正した後、下記数式によりグルタチオン産生促進率を算出した。試料濃度12.5μg/mL、50μg/mL、及び200μg/mLでの結果を表9に示した。
グルタチオン産生促進率(%)=(B/A)×100
ただし、前記数式中、Aは、被験試料を添加しない細胞中における総タンパク量当たりのグルタチオン量(対照)、Bは、被験試料を添加した細胞中における総タンパク量当たりのグルタチオン量を表す。
<セリンパルミトイルトランスフェラーゼ(SPT)mRNA発現促進作用試験>
ハイビスカス花部抽出液(丸善製薬株式会社製)の凍結乾燥物を被験試料として用い、下記の試験方法によりセリンパルミトイルトランスフェラーゼ(SPT)mRNA発現促進作用を試験した。
KGMを用いて35mmシャーレ(FALCON社製)に40×104cells/2mL/シャーレずつ播き、37℃、5%CO2下で一晩培養した。24時間後に培養液を捨て、KGMで必要濃度に溶解した被験試料を各シャーレに2mLずつ添加し、37℃、5%CO2下で24時間培養した。培養後、培養液を捨て、ISOGEN II(NIPPON GENE;Cat.no.311−07361)にてtotal RNAを抽出し、それぞれのRNA量を分光光度計にて測定し、200ng/μLになるようにtotalRNAを調製した。
このtotalRNAを鋳型とし、SPT及び内部標準であるGAPDHのmRNAの発現量を測定した。検出はリアルタイムPCR装置Smart Cycler(登録商標)(Cepheid社)を用いて、TaKaRa SYBR(登録商標)PrimeScriptTM RT−PCR Kit(Perfect Real Time)(code No.RR063A)によるリアルタイム2 Step RT−PCR反応により行った。SPTの発現量は、被験試料無添加、被験試料添加でそれぞれ培養した細胞から調製した総RNA標品を基にして、GAPDHの値で補正値を求め、更に被験試料無添加の補正値を100とした時の被験試料添加の補正値を算出した。
SPTmRNA発現促進率の計算方法は、以下の通りである。結果を表10に示した。
SPTmRNA発現促進率(%)=A/B×100
ただし、前記式中、Aは被験試料添加時の補正値、Bは被験試料無添加時の補正値を表す。
<メイラード反応阻害作用試験>
ハイビスカス花部抽出液(丸善製薬株式会社製)の凍結乾燥物を被験試料として用い、下記の試験方法により、メイラード反応阻害作用を試験した。
泳動したゲルをクマシーブリリアントブルー染色後脱色し、画像撮影装置ChemiDocXRS Plus(Bio−Rad Laboratories社製)を用いて検出し、バンドをImage Lab Software version2.0(Bio−Rad Laboratories社製)にて定量的に測定した。
結果は、各バンドのNet intensity(バンド強度)を用いて、リゾチームの二量体及び三量体の形成阻害率を、下記式から算出した。結果を表11に示した。
メイラード反応阻害率(%)={1−(A−C)/(B−C)}×100
ただし、前記数式中、Aは、被験試料添加時の二量体と三量体のNet intensityの和、Bは、被験試料無添加時(コントロール)の二量体と三量体のNet intensityの和、Cは、被験試料無添加時の4℃で静置(ブランク)の二量体と三量体のNet intensityの和を、それぞれ表す。
<最終糖化産物(AGEs)形成抑制作用試験>
ハイビスカス花部抽出液(丸善製薬株式会社製)の凍結乾燥物を被験試料として用い、下記の試験方法により、最終糖化産物(AGEs)形成抑制作用を試験した。
AGEs形成抑制率の計算方法は、以下のとおりである。結果を表12に示した。
AGEs形成抑制率(%)={(B−C)/(B−A)}×100
ただし、前記式中、Aは陰性対照の波長405nmにおける吸光度を、Bは陽性対照の波長405nmにおける吸光度を、Cは被験試料添加時の波長405nmにおける吸光度を表す。
<最終糖化産物(AGEs)分解促進作用試験>
ハイビスカス花部抽出液(丸善製薬株式会社製)の凍結乾燥物を被験試料として用い、下記の試験方法により、最終糖化産物(AGEs)分解促進作用を試験した。
AGEs分解促進率の計算方法は、以下のとおりである。結果を表13に示した。
AGEs分解促進率(%)={(B−C)/(B−A)}×100
ただし、前記式中、Aは陰性対照の波長405nmにおける吸光度を、Bは陽性対照の波長405nmにおける吸光度を、Cは被験試料添加時の波長405nmにおける吸光度を表す。
<クローディン−1産生促進作用試験>
ハイビスカス花部抽出液(丸善製薬株式会社製)の凍結乾燥物を被験試料として用い、下記の試験方法によりクローディン−1産生促進作用を試験した。
培養終了後、KGMで溶解した被験試料の溶液を各ウェルに100μLずつ添加し、37℃、5%CO2下で24時間培養した。培養終了後、培地を抜き、細胞をプレートに固定させ、細胞表面に発現したクローディン−1の量をポリクローナルクローディン−1抗体を用いたELISA法により測定した。
得られた測定結果から、下記式によりクローディン−1産生促進率(%)を算出した。結果を表14に示した。
クローディン−1産生促進率(%)=A/B×100
ただし、前記式中、Aは、被験試料添加時の波長405nmにおける吸光度、Bは、被験試料無添加時の波長405nmにおける吸光度を表す。
<オクルディン産生促進作用試験>
ハイビスカス花部抽出液(丸善製薬株式会社製)の凍結乾燥物を被験試料として用い、下記の試験方法により、オクルディン産生促進作用を試験した。
培養終了後、KGMで溶解した被験試料(試料濃度:3.13μg/mL、12.5μg/mL、又は50μg/mL)を各ウェルに100μLずつ添加し、37℃、5%CO2下で24時間培養した。培養終了後、培地を抜き、細胞をプレートに固定し、細胞表面に発現したオクルディンの量をポリクローナル抗ヒトオクルディン抗体を用いたELISA法により測定した。
オクルディン産生促進率の計算方法は、以下のとおりである。結果を表15に示した。
オクルディン産生促進率(%)=A/B×100
ただし、前記式中、Aは被験試料添加時の波長405nmにおける吸光度を表し、Bは被験試料無添加時の波長405nmにおける吸光度を表す。
<ヒト皮膚三次元モデルにおける表皮タイトジャンクション構成タンパク質産生促進作用試験>
ハイビスカス花部抽出液(丸善製薬株式会社製)の凍結乾燥物を被験試料として用い、下記の試験方法により、ヒト皮膚三次元モデルにおける表皮タイトジャンクション構成タンパク質産生促進作用を試験した。
三次元皮膚モデルを購入後、6ウェルプレートにてアッセイ培地(EPI−NMM Maintenance Medium、KURABO社製)を用いて37℃、5%CO2の条件下で1時間培養した。培養後、1%DMSOに溶解した被験試料を含む、又は含まない(コントロール)アッセイ培地100μLを皮膚モデルの表面に供し、皮膚モデル底面にアッセイ培地(維持培地)を供し、37℃、5%CO2条件下で7日間培養した。培養期間中は常時試験試料での曝露を行った。培養4日目に維持培地と被験試料を含むアッセイ培地を交換した。培養4日目及び培養終了後に6mmのバイオプシパンチを用いて切り抜き、プラスチック製包埋皿に包埋剤を入れ、ドライアイスと液体窒素で凍結させた。その後、クリオスタットHM550(MICROM社製)にて、4μmの厚さに切り切片をスライドグラスに貼り付け、切片を乾燥させた。
切片を貼り付けたスライドグラスを染色バットに入れ、4%パラホルムアルデヒドにて固定し、PBS(−)にて切片のまわりの包埋剤を良く洗い流した。1%BSAでブロッキングを行った後、液を捨て、1次抗体であるマウス由来抗ヒトクローディン−4モノクローナル抗体(ZYMED(R) Laboratories)を各スライドグラス上に注ぎ、室温で1時間インキュベートした。抗体液を捨て、PBS(−)にて洗浄し、2次抗体であるAlexa−Fluor 488標識ヤギ由来抗マウスIgG抗体(invitrogen社製)を処理し、4℃の暗所で1時間インキュベートした。更にPBS(−)にて洗浄し、DAPI溶液により核染色をした。蛍光顕微鏡により、目的のクローディン−4を解析した。結果を図1A〜図1Fに示した。
図1A〜図1Fの画像は角質層下部〜基底層の部分を示しており、図1Aは、培養4日目の対照、図1Bは、培養4日目の試料濃度100μg/mLのハイビスカスの抽出物、図1Cは、培養4日目の試料濃度500μg/mLのハイビスカスの抽出物、図1Dは、培養7日目の対照、図1Eは、培養7日目の試料濃度100μg/mLのハイビスカスの抽出物、図1Fは、培養7日目の試料濃度500μg/mLのハイビスカスの抽出物の結果を示し、クローディン−4が緑色(顆粒層の細胞膜付近)に染色されている。
また、培養4日目と培養7日目の両方において、対照と比較して、ハイビスカスの抽出物では顆粒層細胞膜付近の線状の蛍光が強くなったことから、クローディン−4産生促進作用が皮膚三次元モデルにおいて確認できた。
切片を貼り付けたスライドグラスを染色バットに入れ、4%パラホルムアルデヒドにて固定し、PBS(−)にて切片のまわりの包埋剤を良く洗い流した。1%BSAでブロッキングを行った後、液を捨て、1次抗体であるマウス由来抗ヒトZO−1モノクローナル抗体(invitrogen社製)及びウサギ由来抗ヒトZO−2ポリクローナル抗体(invitrogen社製)を各スライドグラス上に注ぎ、室温で1時間インキュベートした。抗体液を捨て、PBS(−)にて洗浄し、2次抗体であるAlexa−Fluor 488標識ヤギ由来抗マウスIgG抗体(invitrogen社製)及びAlexa−Fluor 594標識ヤギ由来抗ウサギIgG抗体(invitrogen社製)を処理し、4℃の暗所で1時間インキュベートした。更に、PBS(−)にて洗浄し、DAPI溶液により核染色をした。蛍光顕微鏡により、目的のZO−1及びZO−2を解析した。結果を図2A〜図2F、及び図3A〜図3Fに示した。
図2A〜図2Fの写真は角質層下部〜基底層の部分を示している。
図2Aは、培養4日目の対照、図2Bは、培養4日目の試料濃度100μg/mLのハイビスカスの抽出物、図2Cは、培養4日目の試料濃度500μg/mLのハイビスカスの抽出物、図2Dは、培養7日目の対照、図2Eは、培養7日目の試料濃度100μg/mLのハイビスカスの抽出物、図2Fは、培養7日目の試料濃度500μg/mLのハイビスカスの抽出物の結果を示し、図2A〜図2FよりZO−1が緑色(顆粒層〜基底層の細胞膜付近)に染色されている。
図3A〜図3Fの写真は角質層下部〜基底層の部分を示している。
図3Aは、培養4日目の対照、図3Bは、培養4日目の試料濃度100μg/mLのハイビスカスの抽出物、図3Cは、培養4日目の試料濃度500μg/mLのハイビスカスの抽出物、図3Dは、培養7日目の対照、図3Eは、培養7日目の試料濃度100μg/mLのハイビスカスの抽出物、図3Fは、培養7日目の試料濃度500μg/mLのハイビスカスの抽出物の結果を示し、図3A〜図3FよりZO−2が赤色(顆粒層〜基底層の細胞膜付近)に染色されている。
培養4日目において、対照と比較して、ハイビスカスの抽出物は100μg/mLの濃度において細胞膜付近の線状の蛍光が強くなったことから、ZO−1及びZO−2の産生促進作用が三次元皮膚モデルにおいて確認できた。
<皮膚バリア機能低下抑制作用試験(電気抵抗値TER測定及びFITC−Dexによる透過性評価>
ハイビスカス花部抽出液(丸善製薬株式会社製)の凍結乾燥物を被験試料として用い、下記の試験方法により、皮膚バリア機能低下抑制作用を試験した。
また、TER測定後、PBS(−)で上下層を洗浄し、上層にP buffer(10mM HEPES、pH7.4、1mM sodium pyruvate、10mM glucose、3mM CaCl2、145mM NaCl)で1mg/mLとなるように溶解した4kDa FITC−Dextran(FITC−Dex、Sigma社製)を0.5mL、下層にP bufferを0.5mL添加して、37℃で90分間培養した。培養終了後、各下層から100μLずつ採取して、励起波長485nm、蛍光波長545nmにおける蛍光強度を測定し、検量線を基に上層から下層に透過したFITC−Dex量を求め、コントロールと比較して被験試料の透過抑制率(%)を算出し、透過バリア機能を評価した。
バリア低下抑制率の計算方法は、以下のとおりである。結果を表16に示した。
バリア低下抑制率(%)={1−(C−A)/(C−B)}×100
ただし、前記式中、Aは、被験試料を添加した細胞での電気抵抗値(TER)、Bは、被験試料を添加しない細胞での電気抵抗値(TER)、Cは高CaCl2培地で処理した細胞での電気抵抗値(TER)、をそれぞれ表す。
透過抑制率(%)={1−(C−A)/(C−B)}×100
ただし、前記式中、Aは、被験試料を添加した細胞での透過したFITC−Dex量、Bは、被験試料を添加しない細胞での透過したFITC−Dex量、Cは、高CaCl2培地で処理した細胞での透過したFITC−Dex量、をそれぞれ表す。
<テストステロン5α−リダクターゼ活性阻害作用試験>
ハイビスカス花部抽出液(丸善製薬株式会社製)の凍結乾燥物を被験試料として用い、下記の試験方法により、テストステロン5α−リダクターゼ活性阻害作用を試験した。
なお、前記S−9とは、SDラットの雄に酵素誘導剤(フェノバルビタール、5,6−ベンゾフラボン)を腹腔内投与したのち肝臓をすりつぶして、9,000×gで遠心した上清である。
使用機器 :Shimadzu GC−7A
カラム :DB−1701(直径0.53mm×30m、膜厚;1.0μm)
カラム/注入温度:240℃/300℃
検出器 :FID
キャリアガス :窒素ガス
そして、S−9による反応後の3α−アンドロスタンジオール、ジヒドロテストステロン(DHT)及びテストステロンをガスクロマトグラフィーにより分析し、それぞれのピーク面積あたりの濃度を、下記の(2)式に従って算出した。次に、被験試料の変換率を下記の(3)式に従って算出した。そして、前記変換率に基づいて、テストステロン5α−リダクターゼ活性阻害率を、下記の(4)式に従って算出した。結果を表18に示した。
変換率(%)=(A+B)/(A+B+C)・・・(3)
ただし、前記(3)式中、Aは、3α−アンドロスタンジオールの濃度、Bは、ジヒドロテストステロン(DHT)の濃度、Cは、テストステロンの濃度、を表す。
ただし、前記(4)式中、Dは、空試験での変換率、Eは、被験試料添加での変換率を表す。
<毛乳頭細胞増殖作用試験>
ハイビスカス花部抽出液(丸善製薬株式会社製)の凍結乾燥物を被験試料として用い、下記の試験方法により、毛乳頭細胞増殖作用を試験した。
毛乳頭細胞増殖率(%)=A/B×100
ただし、前記式中、Aは、被験試料添加時のブルーホルマザン生成量、Bは、被験試料無添加時のブルーホルマザン生成量をそれぞれ表す。
Claims (4)
- ハイビスカスの抽出物を含有することを特徴とする、表皮ヒアルロン酸産生促進剤、グルタチオン産生促進剤、セリンパルミトイルトランスフェラーゼmRNA発現促進剤、最終糖化産物分解促進剤、クローディン−1産生促進剤、オクルディン産生促進剤、ヒト皮膚三次元モデルにおける表皮タイトジャンクション構成蛋白質産生促進剤、又は皮膚バリア機能低下抑制剤。
- ハイビスカスの抽出物を含有することを特徴とする、テストステロン5α−リダクターゼ活性阻害剤、又は毛乳頭細胞増殖剤。
- ハイビスカスの花部の抽出物である請求項1及び2のいずれかに記載の表皮ヒアルロン酸産生促進剤、グルタチオン産生促進剤、セリンパルミトイルトランスフェラーゼmRNA発現促進剤、最終糖化産物分解促進剤、クローディン−1産生促進剤、オクルディン産生促進剤、ヒト皮膚三次元モデルにおける表皮タイトジャンクション構成蛋白質産生促進剤、皮膚バリア機能低下抑制剤、テストステロン5α−リダクターゼ活性阻害剤、又は毛乳頭細胞増殖剤。
- ハイビスカスの花部の水抽出物、親水性有機溶媒抽出物、又はこれらの混合溶媒抽出物である請求項1及び2のいずれかに記載の表皮ヒアルロン酸産生促進剤、グルタチオン産生促進剤、セリンパルミトイルトランスフェラーゼmRNA発現促進剤、最終糖化産物分解促進剤、クローディン−1産生促進剤、オクルディン産生促進剤、ヒト皮膚三次元モデルにおける表皮タイトジャンクション構成蛋白質産生促進剤、皮膚バリア機能低下抑制剤、テストステロン5α−リダクターゼ活性阻害剤、又は毛乳頭細胞増殖剤。
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