JP6968772B2 - 表皮ヒアルロン酸産生促進剤 - Google Patents

Description

本発明は、ヒアルロニダーゼ活性阻害剤、過酸化水素消去剤、美白剤、抗老化剤、及び育毛剤に関する。

体組織への親和性を保つヒアルロン酸塩は、含水系の中では紫外線、酵素等によって分解され、分子量の低下に伴って保水効果も減少する。また、ヒアルロン酸は細胞間組織として存在し、血管透過性とも関与している。更に、ヒアルロニダーゼは肥満細胞中にあって活性化により、肥満細胞からの脱顆粒に関与していると考えられている。したがってヒアルロン酸の加水分解酵素であるヒアルロニダーゼの活性を阻害することにより、ヒアルロン酸の安定化をはかり、肥満細胞からの種々のケミカルメディエーターの放出を防止し、抗炎症が期待できる。このようなヒアルロニダーゼ活性阻害作用を有する生薬としては、例えば、オスベッキア属植物の抽出物（特許文献１参照）、藤茶抽出物（特許文献２参照）、ローズマリー抽出物、タイム抽出物及びメリッサ抽出物（特許文献３参照）、などが報告されている。

これまでの美白剤開発は、メラニン生成の律速酵素であるチロシナーゼに注力して進められてきたが、最近、紫外線ＵＶＢ照射後に表皮ケラチノサイトからの産生が上昇し、色素細胞（メラノサイト）を活性化するサイトカインとしてα−メラノサイト刺激ホルモン（α−ＭＳＨ）、エンドセリン−１（ＥＴ−１）、一酸化窒素（ＮＯ）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、顆粒球・マクロファージ・コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）等が報告されており、これらが関与する情報伝達系を遮断することによりメラニン産生を抑制して美白効果を導く物質の開発が盛んに行われるようになってきている。このようなエンドセリン−１（ＥＴ−１）の色素細胞（メラノサイト）への作用を阻害する生薬の抽出物として、例えば、カミツレ抽出物及びアルテア抽出物が報告されている（非特許文献１参照）。

また、従来は、皮膚のバリア機能は角層のみが担っていると考えられていたが、表皮顆粒層に存在するタイトジャンクション（以下、ＴＪと略記することがある。）の構成タンパク質を遺伝子レベルで欠損させると皮膚のバリア機能が崩壊することから、近年、ＴＪも皮膚のバリア機能に重要な役割を担うと考えられている（非特許文献２参照）。ＴＪは、隣接する細胞同士を密着させるだけでなく、細胞と細胞の隙間をシールすることで物質の透過を制御する結合装置である。このＴＪを構成しているタンパク質には、クローディン、オクルディン、ＺＯ−１及びＺＯ−２などがあり、これらのタンパク質はＴＪストランドの骨格を構成し、ＴＪのバリア機能を制御すると考えられている（非特許文献３参照）。以上のことから、クローディン、オクルディン、ＺＯ−１、ＺＯ−２の発現が何らかの原因で減少した場合、ＴＪの構造的な破壊が起こり、物質の透過バリアとして機能しなくなることによって、乾燥肌、荒れ肌、アトピー性皮膚炎や各種感染症などの皮膚症状の原因となると予想される。

したがって、表皮においてクローディン、オクルディン、ＺＯ−１、及びＺＯ−２の産生を促進することにより表皮角化細胞のＴＪ形成を促すことで、皮膚のバリア機能及び水分保持機能を高め、前記皮膚症状を予防又は改善することができると考えられる。このような考えに基づき、ＴＪ形成促進作用を介して皮膚バリア機能を向上させるものとして、天然物由来のオウレン抽出物（特許文献４参照）、トウヒ抽出物（特許文献５参照）などが開示されている。

アミノ酸、ペプチド、タンパク質のアミノ基とケトン、アルデヒド、特にグルコースなどの還元糖が反応して褐色色素を生成する反応をメイラード反応という。このメイラード反応の最終産物として生成する物質を最終糖化産物（ａｄｖａｎｃｅｄ ｇｌｙｃａｔｉｏｎ ｅｎｄ ｐｒｏｄｕｃｔｓ、以下、「ＡＧＥｓ」と称することもある。）という。メイラード反応は、アミノ基とグルコースが非酵素的に反応しシッフ塩基を形成し、ついでアマドリ転位を起こす早期反応、更に３−デオキシグルコソン（３−ＤＧ）などのジカルボニル基を有する活性中間体を生成する中期反応、活性中間体が更にアミノ基と非酵素的に反応し、脱水、縮合反応を繰り返してＡＧＥｓ形成する後期反応からなる。
ＡＧＥｓとしては、例えば、イミダゾロン（非特許文献４参照）、Ｎ^ε−カルボキシメチルリシン（ＣＭＬ）（非特許文献５参照）、ペントシジン、ピラリン、クロスリン、Ｎ^ε−カルボキシエチルリシン、メチルグリオキサールリシンダイマー、グリオキサールリシンダイマーなどが同定されている。イミダゾロンは３−ＤＧがアルギニンと反応して生成することが報告されている（非特許文献４参照）。

ＡＧＥｓが発症、進展に関与している病態の一つして、老化症状がある。生体組織におけるメイラード反応の進行により、皮膚組織においては皮膚弾性繊維の架橋などによる老化(弾性低下)を招き、また、血管壁組織や神経原線維へのＡＧＥｓの沈着により動脈硬化やアルツハイマー病を招くともいわれている。

ＡＧＥｓ生成抑制作用を有する天然物由来のものとしては、例えば、マメ科ディアリウムインダムの果皮抽出物が開示されている（特許文献６参照）。
また、ＡＧＥｓ生成抑制作用を有する化合物として、例えば、アミノグアニジン、ＯＰＢ−９１９５、ピリドキサミンなどの化合物が知られているが、これら化合物は副作用等の問題を有している（非特許文献４〜６参照）。

多くのステロイドホルモンは産生臓器から分泌された分子型で受容体と結合してその作用を発現するが、アンドロゲンと総称される男性ホルモンの場合、例えば、テストステロンは標的臓器の細胞内に入ってテストステロン５α−レダクターゼにより５α−ジヒドロテストステロン（５α−ＤＨＴ）に還元されてから受容体と結合し、アンドロゲンとしての作用を発現する。
前記アンドロゲンは重要なホルモンであるが、それが過度に作用すると、男性型脱毛症、多毛症、脂漏症、座瘡（ニキビなど）、前立腺肥大症、前立腺腫瘍、男児性早熟等のさまざまな好ましくない症状を誘発する。そこで、これらの各種症状を改善するために過剰のアンドロゲンの作用を抑制する方法、具体的には、テストステロンを活性型５α−ＤＨＴに還元するテストステロン５α−レダクターゼの作用を阻害することにより、活性な５α−ＤＨＴが生じるのを抑制する方法や、テストステロンから生じた５α−ＤＨＴが受容体と結合するのを阻害することによりアンドロゲン活性を発現させない方法が開示されている。このような５α−ＤＨＴとその受容体との結合を阻害する作用を有する植物抽出物としては、例えば、マジト及びカチュアの少なくともいずれかの抽出物などが開示されている（特許文献７参照）。

毛髪は、成長期、退行期及び休止期からなる周期的なヘアサイクル（毛周期）に従って成長及び脱落を繰り返している。このヘアサイクルのうち、休止期から成長期にかけての新たな毛包が形成されるステージが、発毛に最も重要であると考えられており、このステージにおける毛包上皮系細胞の増殖乃至分化に重要な役割を果たしているのが、毛乳頭細胞であると考えられている。毛乳頭細胞は、毛根近傍にある外毛根鞘細胞とマトリックス細胞とからなる毛包上皮系細胞の内側にあって、基底膜に包まれている毛根の根幹部分に位置する細胞であり、毛包上皮系細胞に働きかけてその増殖を促進する等、毛包上皮系細胞の増殖乃至分化及び毛髪の形成において重要な役割を担っている。前記毛乳頭細胞は、毛包上皮系細胞の増殖乃至分化及び毛髪の形成において最も重要な役割を果たしており、培養毛乳頭細胞に対象物質を接触させて、その細胞の増殖活性の有無乃至強弱を特定することで、その対象物質の育毛効果を検定する方法が提案されている。このような毛乳頭細胞増殖促進作用を有する生薬としては、例えば、オウギ抽出物、オウレン抽出物、クマノギク抽出物などが開示されている（特許文献８及び９参照）。

しかしながら、現在までのところ、上述した少なくともいずれかの作用を有し、かつ安全性が高く、そのため、化粧料、飲食品、研究用試薬などの成分として広く利用が可能な優れた物質は、未だ得られておらず、その速やかな提供が強く求められている。

特開２００３−５５２４２号公報 特開２００３−１２５３２号公報 特開平８−３３３２６７号公報 特開２００７−１７６８３０号公報 特開２００７−１７６８３５号公報 特開２０１０−１１１６１５号公報 特開２００２−２４１２９７号公報 特開平９−２０８４３１号公報 特開平１１−１２１３４号公報

「フレグランスジャーナル」，Ｖｏｌ．２８，Ｎｏ．９，ｐ６５〜７１，２０００年発行 Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，ｖｏｌ．１５６，ｐｐ．１０９９−１１１１（２００２） 日本香粧品科学会誌，ｖｏｌ．３１，ｐｐ．２９６−３０１（２００７） Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，ｖｏｌ．９９，ｐｐ．１２７２−１２８０（１９９７） Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ．，ｖｏｌ．５０，ｐｐ．１３０３−１３０９（１９９６） Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，ｖｏｌ．２７５，ｐｐ．２１１７７−２１１８４（２０００）

本発明は、前記従来における問題を解決し、以下の目的を達成することを課題とする。即ち、本発明は、優れたヒアルロニダーゼ活性阻害作用を有し、かつ安全性の高いヒアルロニダーゼ活性阻害剤、優れた過酸化水素消去作用を有し、かつ安全性の高い過酸化水素消去剤、優れた美白作用を有し、かつ安全性の高い美白剤、優れた抗老化作用を有し、かつ安全性の高い抗老化剤、優れた育毛作用を有し、かつ安全性の高い育毛剤を提供することを目的とする。

本発明者らは、前記課題を解決するために鋭意検討を行ったところ、ハイビスカスの抽出物が、優れたヒアルロニダーゼ活性阻害作用、過酸化水素消去作用、美白作用、抗老化作用、及び育毛作用を有することを知見した。

本発明は、本発明者らの前記知見に基づくものであり、前記課題を解決するための手段としては、以下の通りである。即ち、
＜１＞ ハイビスカスの抽出物を含有することを特徴とするヒアルロニダーゼ活性阻害剤である。
＜２＞ ハイビスカスの抽出物を含有することを特徴とする過酸化水素消去剤である。
＜３＞ ハイビスカスの抽出物を含有することを特徴とする美白剤である。
＜４＞ Ｂ１６メラノーマ細胞に対するメラニン産生抑制作用、エンドセリン−１ｍＲＮＡ発現上昇抑制作用、幹細胞増殖因子ｍＲＮＡ発現上昇抑制作用、塩基性線維芽細胞増殖因子ｍＲＮＡ発現上昇抑制作用、及びプロオピオメラノコルチンｍＲＮＡ発現上昇抑制作用の少なくともいずれかを有する前記＜３＞に記載の美白剤である。
＜５＞ ハイビスカスの抽出物を含有することを特徴とする抗老化剤である。
＜６＞ 表皮ヒアルロン酸産生促進作用、グルタチオン産生促進作用、セリンパルミトイルトランスフェラーゼｍＲＮＡ発現促進作用、メイラード反応阻害作用、最終糖化産物形成抑制作用、最終糖化産物分解促進作用、クローディン−１産生促進作用試験、オクルディン産生促進作用、ヒト皮膚三次元モデルにおける表皮タイトジャンクション構成蛋白質産生促進作用、及び皮膚バリア機能低下抑制作用の少なくともいずれかを有する前記＜５＞に記載の抗老化剤である。
＜７＞ ハイビスカスの抽出物を含有することを特徴とする育毛剤である。
＜８＞ テストステロン５α−リダクターゼ活性阻害作用、及び毛乳頭細胞増殖作用の少なくともいずれかを有する前記＜７＞に記載の育毛剤である。

本発明によると、従来における前記諸問題を解決し、前記目的を達成することができ、優れたヒアルロニダーゼ活性阻害作用を有し、かつ安全性の高いヒアルロニダーゼ活性阻害剤、優れた過酸化水素消去作用を有し、かつ安全性の高い過酸化水素消去剤、優れた美白作用を有し、かつ安全性の高い美白剤、優れた抗老化作用を有し、かつ安全性の高い抗老化剤、優れた育毛作用を有し、かつ安全性の高い育毛剤を提供することができる。

図１Ａは、実施例１６におけるクローディン−４免疫蛍光染色画像を示し、培養４日目の対照の結果を示す写真である。 図１Ｂは、実施例１６におけるクローディン−４免疫蛍光染色画像を示し、培養４日目の試料濃度１００μｇ／ｍＬのハイビスカスの抽出物の結果を示す写真である。 図１Ｃは、実施例１６におけるクローディン−４免疫蛍光染色画像を示し、培養４日目の試料濃度５００μｇ／ｍＬのハイビスカスの抽出物の結果を示す写真である。 図１Ｄは、実施例１６におけるクローディン−４免疫蛍光染色画像を示し、培養７日目の対照の結果を示す写真である。 図１Ｅは、実施例１６におけるクローディン−４免疫蛍光染色画像を示し、培養７日目の試料濃度１００μｇ／ｍＬのハイビスカスの抽出物の結果を示す写真である。 図１Ｆは、実施例１６におけるクローディン−４免疫蛍光染色画像を示し、培養７日目の試料濃度５００μｇ／ｍＬのハイビスカスの抽出物の結果を示す写真である。 図２Ａは、実施例１６におけるＺＯ−１免疫蛍光染色画像を示し、培養４日目の対照の結果を示す写真である。 図２Ｂは、実施例１６におけるＺＯ−１免疫蛍光染色画像を示し、培養４日目の試料濃度１００μｇ／ｍＬのハイビスカスの抽出物の結果を示す写真である。 図２Ｃは、実施例１６におけるＺＯ−１免疫蛍光染色画像を示し、培養４日目の試料濃度５００μｇ／ｍＬのハイビスカスの抽出物の結果を示す写真である。 図２Ｄは、実施例１６におけるＺＯ−１免疫蛍光染色画像を示し、培養７日目の対照の結果を示す写真である。 図２Ｅは、実施例１６におけるＺＯ−１免疫蛍光染色画像を示し、培養７日目の試料濃度１００μｇ／ｍＬのハイビスカスの抽出物の結果を示す写真である。 図２Ｆは、実施例１６におけるＺＯ−１免疫蛍光染色画像を示し、培養７日目の試料濃度５００μｇ／ｍＬのハイビスカスの抽出物の結果を示す写真である。 図３Ａは、実施例１６におけるＺＯ−２免疫蛍光染色画像を示し、培養４日目の対照の結果を示す写真である。 図３Ｂは、実施例１６におけるＺＯ−２免疫蛍光染色画像を示し、培養４日目の試料濃度１００μｇ／ｍＬのハイビスカスの抽出物の結果を示す写真である。 図３Ｃは、実施例１６におけるＺＯ−２免疫蛍光染色画像を示し、培養４日目の試料濃度５００μｇ／ｍＬのハイビスカスの抽出物の結果を示す写真である。 図３Ｄは、実施例１６におけるＺＯ−２免疫蛍光染色画像を示し、培養７日目の対照の結果を示す写真である。 図３Ｅは、実施例１６におけるＺＯ−２免疫蛍光染色画像を示し、培養７日目の試料濃度１００μｇ／ｍＬのハイビスカスの抽出物の結果を示す写真である。 図３Ｆは、実施例１６におけるＺＯ−２免疫蛍光染色画像を示し、培養７日目の試料濃度５００μｇ／ｍＬのハイビスカスの抽出物の結果を示す写真である。

（ヒアルロニダーゼ活性阻害剤、過酸化水素消去剤、美白剤、抗老化剤、及び育毛剤）
本発明のヒアルロニダーゼ活性阻害剤、過酸化水素消去剤、美白剤、抗老化剤、及び育毛剤は、いずれもハイビスカスの抽出物を含有し、更に必要に応じてその他の成分を含有してなる。

前記ヒアルロニダーゼ活性阻害剤は、ヒアルロニダーゼ活性阻害作用を有するものである。
前記過酸化水素消去剤は、過酸化水素消去作用を有するものである。
前記美白剤は、Ｂ１６メラノーマ細胞に対するメラニン産生抑制作用、エンドセリン−１ｍＲＮＡ発現上昇抑制作用、幹細胞増殖因子ｍＲＮＡ発現上昇抑制作用、塩基性線維芽細胞増殖因子ｍＲＮＡ発現上昇抑制作用、及びプロオピオメラノコルチンｍＲＮＡ発現上昇抑制作用の少なくともいずれかに基づく美白作用を有するものである。
前記抗老化剤は、表皮ヒアルロン酸産生促進作用、グルタチオン産生促進作用、セリンパルミトイルトランスフェラーゼｍＲＮＡ発現促進作用、メイラード反応阻害作用、最終糖化産物形成抑制作用、最終糖化産物分解促進作用、クローディン−１産生促進作用試験、オクルディン産生促進作用、ヒト皮膚三次元モデルにおける表皮タイトジャンクション構成蛋白質産生促進作用、及び皮膚バリア機能低下抑制作用の少なくともいずれかに基づく抗老化作用を有するものである。
前記育毛剤は、テストステロン５α−リダクターゼ活性阻害作用、及び毛乳頭細胞増殖作用の少なくともいずれかに基づく育毛作用を有するものである。

前記ハイビスカスの抽出物が含有する、ヒアルロニダーゼ活性阻害作用、過酸化水素消去作用、美白作用、抗老化作用、及び育毛作用の少なくともいずれかを発揮する物質の詳細については不明であるが、前記ハイビスカスの抽出物がこのような優れた作用を有し、ヒアルロニダーゼ活性阻害剤、過酸化水素消去剤、美白剤、抗老化剤、及び育毛剤として有用であることは、従来には全く知られておらず、本発明者らによる新たな知見である。

前記ハイビスカスは、アオイ科フヨウ属に属する常緑低木で、学名：ハイビスカスサブダリファ（Ｈｉｂｉｓｃｕｓ ｓａｂｄａｒｉｆａ）といいアフリカを原産とし、和名ではロゼルと呼ばれている。前記ハイビスカスは、さわやかな酸味があり、フランス料理やイタリア料理のソースとしても使われており、ハーブとして用いられている。

抽出原料として使用する前記ハイビスカスの部位としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、花、がく、蕾、果実、果皮、種子、種皮、茎、葉、枝、枝葉、幹、樹皮、根、根茎、根皮、これらの混合物などが挙げられ、これらの中でも、花、がく、蕾等の花部が好ましい。

抽出原料である前記ハイビスカスは、例えば、乾燥した後に、そのままの状態で又は粗砕機等を用いて粉砕した状態で、溶媒抽出に供することができる。中でも、前記抽出原料としては、採取後ただちに乾燥し、粉砕したものが好ましい。前記乾燥は、例えば、天日で行ってもよいし、通常使用される乾燥機を用いて行ってもよい。なお、前記ハイビスカスは、ヘキサン、ベンゼン等の非極性溶媒によって脱脂等の前処理を施してから抽出原料として使用してもよい。脱脂等の前処理を行うことにより、前記ハイビスカスの極性溶媒による抽出処理を、効率よく行うことができる。

前記ハイビスカスの抽出物は、植物の抽出に一般に用いられる方法を利用することによって、容易に得ることができる。また、前記ハイビスカスの抽出物としては、市販品を使用してもよい。なお、前記ハイビスカスの抽出物には、前記ハイビスカスの抽出液、該抽出液の希釈液若しくは濃縮液、該抽出液の乾燥物、又は、これらの粗精製物若しくは精製物のいずれもが含まれる。

前記抽出に用いる溶媒としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、水、親水性有機溶媒、又は、これらの混合溶媒を、室温又は溶媒の沸点以下の温度で用いることが好ましい。前記ハイビスカスに含まれるヒアルロニダーゼ活性阻害作用、過酸化水素消去作用、美白作用、抗老化作用、及び育毛作用の少なくともいずれかを示す成分は、極性溶媒を抽出溶媒とする抽出処理によって、容易に抽出することができる。

前記抽出溶媒として使用し得る水としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、純水、水道水、井戸水、鉱泉水、鉱水、温泉水、湧水、淡水等の他、これらに各種処理を施したものが含まれる。水に施す処理としては、例えば、精製、加熱、殺菌、ろ過、イオン交換、浸透圧の調整、緩衝化等が含まれる。したがって、前記抽出溶媒として使用し得る水には、精製水、熱水、イオン交換水、生理食塩水、リン酸緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水等も含まれる。

前記抽出溶媒として使用し得る親水性有機溶媒としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、メタノール、エタノール、プロピルアルコール、イソプロピルアルコール等の炭素数１〜５の低級アルコール；アセトン、メチルエチルケトン等の低級脂肪族ケトン；１，３−ブチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリン等の炭素数２〜５の多価アルコールなどが挙げられ、該親水性有機溶媒と水との混合溶媒なども用いることができる。なお、前記水と前記親水性有機溶媒との混合溶媒を使用する際には、低級アルコールの場合は水１０質量部に対して１質量部〜９０質量部、低級脂肪族ケトンの場合は水１０質量部に対して１質量部〜４０質量部を混合したものを使用することが好ましい。また、多価アルコールの場合は水１０質量部に対して１質量部〜９０質量部を混合したものを使用することが好ましい。

前記ハイビスカスの抽出物の抽出方法としては、前記ハイビスカスの抽出原料に含まれる脂溶性成分を前記溶媒に溶出させることが可能であれば、特に限定されるものではなく、常法に従って行うことができる。また、抽出処理の際には、特殊な抽出方法を採用する必要はなく、室温乃至還流加熱下において任意の装置を使用することができる。
具体的には、前記ハイビスカスの抽出物の抽出方法としては、例えば、エタノール水溶液などの前記溶媒を満たした処理槽に、ハイビスカスの花等の抽出原料を投入し、必要に応じて適宜攪拌しながら、還流抽出器で８０℃にて２時間加熱抽出し、熱時濾過して脂溶性成分を溶出した後、エバポレーターを用いて減圧下で濃縮し、更に同様の濾過処理を行う方法が挙げられる。
この際、抽出条件は、前記抽出原料などに応じて適宜調整し得るが、前記抽出溶媒量は、前記抽出原料に対して５倍量〜２０倍量（質量比）が好ましく、抽出時間は１時間〜３時間が好ましく、抽出温度は２０℃〜９５℃が好ましい。

なお、得られた前記ハイビスカスの抽出物は、前記ハイビスカスの抽出物の希釈物、濃縮物、乾燥物、粗精製物、精製物などを得るために、常法に従って希釈、濃縮、乾燥、精製などの処理を施してもよい。
また、得られた前記ハイビスカスの抽出物は、そのままでも前記ヒアルロニダーゼ活性阻害剤、前記過酸化水素消去剤、前記美白剤、前記抗老化剤、及び前記育毛剤のいずれかとして使用することができるが、利用しやすい点で、前記濃縮液、前記乾燥物が好ましい。前記乾燥物を得るに当たって、吸湿性を改善するためにデキストリン、シクロデキストリンなどのキャリアーを加えてもよい。

前記その他の成分としては、本発明の効果を損なわない範囲内であれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、安定化剤、矯味剤、矯臭剤、などが挙げられる。

前記賦形剤としては、例えば、乳糖、白糖、塩化ナトリウム、ブドウ糖、デンプン、炭酸カルシウム、カオリン、微結晶セルロース、珪酸、などが挙げられる。前記結合剤としては、例えば、水、エタノール、プロパノール、単シロップ、ブドウ糖液、デンプン液、ゼラチン液、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルスターチ、メチルセルロース、エチルセルロース、シェラック、リン酸カルシウム、ポリビニルピロリドン、などが挙げられる。前記崩壊剤としては、例えば、乾燥デンプン、アルギン酸ナトリウム、カンテン末、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノグリセリド、乳糖、などが挙げられる。前記滑沢剤としては、例えば、精製タルク、ステアリン酸塩、ホウ砂、ポリエチレングリコール、などが挙げられる。前記安定化剤としては、例えば、ピロ亜硫酸ナトリウム、ＥＤＴＡ、チオグリコール酸、チオ乳酸、などが挙げられる。また、前記矯味剤乃至矯臭剤としては、例えば、白糖、橙皮、クエン酸、酒石酸、などが挙げられる。

以上のようにして得られる前記ハイビスカスの抽出物は、ヒアルロニダーゼ活性阻害作用、過酸化水素消去作用、Ｂ１６メラノーマ細胞に対するメラニン産生抑制作用、エンドセリン−１ｍＲＮＡ発現上昇抑制作用、幹細胞増殖因子ｍＲＮＡ発現上昇抑制作用、塩基性線維芽細胞増殖因子ｍＲＮＡ発現上昇抑制作用、プロオピオメラノコルチンｍＲＮＡ発現上昇抑制作用、表皮ヒアルロン酸産生促進作用、グルタチオン産生促進作用、セリンパルミトイルトランスフェラーゼｍＲＮＡ発現促進作用、メイラード反応阻害作用、最終糖化産物形成抑制作用、最終糖化産物分解促進作用、クローディン−１産生促進作用試験、オクルディン産生促進作用、ヒト皮膚三次元モデルにおける表皮タイトジャンクション構成蛋白質産生促進作用、皮膚バリア機能低下抑制作用、テストステロン５α−リダクターゼ活性阻害作用、及び毛乳頭細胞増殖作用の少なくともいずれかを有し、これらの作用に基づき、本発明のヒアルロニダーゼ活性阻害剤、過酸化水素消去剤、美白剤、抗老化剤、及び育毛剤の少なくともいずれかの有効成分として好適に利用可能なものである。
なお、前記ハイビスカスの抽出物は、前記した各作用に基づき、Ｂ１６メラノーマ細胞に対するメラニン産生抑制剤、エンドセリン−１ｍＲＮＡ発現上昇抑制剤、幹細胞増殖因子ｍＲＮＡ発現上昇抑制剤、塩基性線維芽細胞増殖因子ｍＲＮＡ発現上昇抑制剤、プロオピオメラノコルチンｍＲＮＡ発現上昇抑制剤、表皮ヒアルロン酸産生促進剤、グルタチオン産生促進剤、セリンパルミトイルトランスフェラーゼｍＲＮＡ発現促進剤、メイラード反応阻害剤、最終糖化産物形成抑制剤、最終糖化産物分解促進剤、クローディン−１産生促進剤、オクルディン産生促進剤、ヒト皮膚三次元モデルにおける表皮タイトジャンクション構成蛋白質産生促進剤、皮膚バリア機能低下抑制剤、テストステロン５α−リダクターゼ活性阻害剤、及び毛乳頭細胞増殖剤としても、それぞれ好適に利用可能である。

本発明のヒアルロニダーゼ活性阻害剤は、ヒアルロニダーゼ活性阻害作用に基づいて発揮される。
本発明の過酸化水素消去剤は、過酸化水素消去作用に基づいて発揮される。
本発明の美白剤における美白作用は、Ｂ１６メラノーマ細胞に対するメラニン産生抑制作用、エンドセリン−１ｍＲＮＡ発現上昇抑制作用、幹細胞増殖因子ｍＲＮＡ発現上昇抑制作用、塩基性線維芽細胞増殖因子ｍＲＮＡ発現上昇抑制作用、及びプロオピオメラノコルチンｍＲＮＡ発現上昇抑制作用の少なくともいずれかに基づいて発揮される。
本発明の抗老化剤における抗老化作用は、表皮ヒアルロン酸産生促進作用、グルタチオン産生促進作用、セリンパルミトイルトランスフェラーゼｍＲＮＡ発現促進作用、メイラード反応阻害作用、最終糖化産物形成抑制作用、最終糖化産物分解促進作用、クローディン−１産生促進作用試験、オクルディン産生促進作用、ヒト皮膚三次元モデルにおける表皮タイトジャンクション構成蛋白質産生促進作用、及び皮膚バリア機能低下抑制作用の少なくともいずれかに基づいて発揮される。
本発明の育毛剤における育毛作用は、テストステロン５α−リダクターゼ活性阻害作用、及び毛乳頭細胞増殖作用の少なくともいずれかに基づいて発揮される。

前記ヒアルロニダーゼ活性阻害剤、前記過酸化水素消去剤、前記美白剤、前記抗老化剤、及び前記育毛剤中の前記ハイビスカスの抽出物の含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、また、前記ヒアルロニダーゼ活性阻害剤、前記過酸化水素消去剤、前記美白剤、前記抗老化剤、及び前記育毛剤は、前記ハイビスカスの抽出物そのものであってもよい。

また、前記ヒアルロニダーゼ活性阻害剤、前記過酸化水素消去剤、前記美白剤、前記抗老化剤、及び前記育毛剤中に含まれ得る、前記ハイビスカスの抽出物以外のその他の成分としても、本発明の効果を損なわない範囲内であれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記ハイビスカスの抽出物を所望の濃度に希釈等するための、生理食塩液などが挙げられる。また、前記ヒアルロニダーゼ活性阻害剤、前記過酸化水素消去剤、前記美白剤、前記抗老化剤、及び前記育毛剤中の前記その他の成分の含有量にも、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
また、前記ヒアルロニダーゼ活性阻害剤、前記過酸化水素消去剤、前記美白剤、前記抗老化剤、及び前記育毛剤は、必要に応じて製剤化することにより、粉末状、顆粒状、錠剤状等、任意の剤形とすることができる。

本発明のヒアルロニダーゼ活性阻害剤、過酸化水素消去剤、美白剤、抗老化剤、及び育毛剤は、優れたヒアルロニダーゼ活性阻害作用、過酸化水素消去作用、美白作用、抗老化作用、及び育毛作用を有すると共に、安全性に優れるため、例えば、各種化粧料、飲食品などへの利用に好適である。

本発明のヒアルロニダーゼ活性阻害剤、過酸化水素消去剤、美白剤、抗老化剤、及び育毛剤は、ヒトに対して好適に適用されるものであるが、それぞれの作用効果が奏される限り、ヒト以外の動物に対して適用することもできる。

以下、本発明の実施例を説明するが、本発明は、これらの実施例に何ら限定されるものではない。

＜ハイビスカスの抽出物＞
ハイビスカス花部抽出液（丸善製薬株式会社製）の凍結乾燥物を被験試料として用いた。

（実施例１）
＜ヒアルロニダーゼ活性阻害作用試験＞
ハイビスカス花部抽出液（丸善製薬株式会社製）の凍結乾燥物を被験試料として用い、下記の試験方法によりヒアルロニダーゼ活性阻害作用を試験した。

被験試料を溶解した０．１ｍｏｌ／Ｌ酢酸緩衝液（ｐＨ３．５）０．２ｍＬにヒアルロニダーゼ溶液（Ｔｙｐｅ ＩＶ−Ｓ（ウシ精巣由来）、４００ ＮＦ ｕｎｉｔｓ／ｍＬ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｊａｐａｎ社製）０．１ｍＬを加え、３７℃で２０分間反応した。更に、活性化剤として２．５ｍｍｏｌ／Ｌ塩化カルシウム０．２ｍＬを加え、３７℃で２０分間反応した。これに０．８ｍｇ／ｍＬヒアルロン酸ナトリウム溶液（トリ鶏冠由来ヒアルロン酸ナトリウム、和光純薬工業株式会社製）０．５ｍＬを加え、３７℃で４０分間反応した。その後、０．４ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム０．２ｍＬを加えて反応を止め冷却した後、各反応溶液にホウ酸溶液０．２ｍＬを加え、３分間煮沸した。氷冷後、ｐ−ＤＡＢＡ試薬（ｐ−ジメチルアミノベンズアルデヒド、和光純薬工業株式会社製）６ｍＬを加え、３７℃で２０分間反応した。その後、波長５８５ｎｍにおける吸光度を測定した。同様の方法で空試験を行い補正した。
ヒアルロニダーゼ活性阻害率の計算方法は、以下のとおりである。結果を表１に示した。
ヒアルロニダーゼ活性阻害率（％）＝
１−（Ｓｔ−Ｓｂ）／（Ｃｔ−Ｃｂ）｝×１００
ただし、前記式中、Ｓｔは、被験試料溶液の波長５８５ｎｍにおける吸光度、Ｓｂは、被験試料溶液ブランクの波長５８５ｎｍにおける吸光度、Ｃｔは、コントロール溶液の波長５８５ｎｍにおける吸光度、Ｃｂはコントロール溶液ブランクの波長５８５ｎｍにおける吸光度、をそれぞれ表す。

表１の結果から、ハイビスカスの抽出物が、ヒアルロニダーゼ活性阻害作用を有することが認められた。

（実施例２）
＜過酸化水素消去作用試験＞
ハイビスカス花部抽出液（丸善製薬株式会社製）の凍結乾燥物を被験試料として用い、下記の試験方法により過酸化水素消去作用を試験した。

９６ｗｅｌｌプレートに被験試料溶液２５μＬを入れ、０．１５ｍＭのＨ_２Ｏ_２を１０μＬ、０．１ｍｏｌ／ＬのＰＩＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０）（０．５％のトライトンＸ−１００、１００ ｕｎｉｔ／ｍＬのペルオキシダーゼ１ｍＬ含有）２５μＬを添加し、３７℃で２０分間反応した。反応後、速やかに１００μＭのＤＡ−６７を１８０μＬ添加した後、エタノール１０μＬを加え、３７℃で５分間の発色反応を行った。発色反応終了後、波長６５０ｎｍにおける吸光度を測定した。また、同様の方法で空試験を行い補正した。
過酸化水素消去率の計算方法は、以下のとおりである。また、５０％阻害活性濃度（ＩＣ_５０：μｇ／ｍＬ）を算出した。これらの結果を表２に示した。
過酸化水素消去率（％）＝｛１−（Ｓｔ−Ｓｂ）／（Ｃｔ−Ｃｂ）｝×１００
ただし、前記式中、Ｓｔは、被験試料溶液の波長６５０ｎｍにおける吸光度、Ｓｂは、被験試料溶液ブランクの波長６５０ｎｍにおける吸光度、Ｃｔは、コントロール溶液の波長６５０ｎｍにおける吸光度、Ｃｂは、コントロール溶液ブランクの波長６５０ｎｍにおける吸光度、をそれぞれ表す。

表２の結果から、ハイビスカスの抽出物が、過酸化水素消去作用を有することが認められた。

（実施例３）
＜Ｂ１６メラノーマ細胞に対するメラニン産生抑制作用試験＞
ハイビスカス花部抽出液（丸善製薬株式会社製）の凍結乾燥物を被験試料として用い、下記の試験方法によりＢ１６メラノーマ細胞に対するメラニン産生抑制作用を試験した。

Ｂ１６メラノーマ細胞を１０体積％ＦＢＳ（ＳＴＡＮＤＡＲＤ ＦＥＴＡＬ ＢＯＶＩＮＥ ＳＥＲＵＭ、ＨｙＣｌｏｎｅ社製）含有ダルベッコＭＥＭ（ダルベッコ変法イーグル培地（１）、日水製薬株式会社製）を用いて培養した後、トリプシン処理により細胞を回収した。回収した細胞を１０体積％ＦＢＳ及び１ｍｍｏｌ／Ｌテオフィリン（Ｔｈｅｏｐｈｙｌｌｉｎｅ、和光純薬工業株式会社製）含有ダルベッコＭＥＭで２４．０×１０^４細胞／ｍＬの濃度に希釈した後、４８ウェルプレートに１ウェル当たり３００μＬずつ播種し、６時間培養した。培養終了後、１０体積％ＦＢＳ及び１ｍｍｏｌ／Ｌテオフィリン含有ダルベッコＭＥＭで溶解した被験試料を各ウェルに３００μＬ添加し、４日間培養した。培養終了後、各ウェルから培地を取り除き、２ｍｏｌ／ＬのＮａＯＨ溶液２００μＬを添加して超音波破砕器により細胞を破壊し、波長４７５ｎｍにおける吸光度を測定した。測定した吸光度の値から合成メラニン（ＳＩＧＭＡ社製）を用いて作成した検量線を基にメラニン量を算出した。
また、細胞生存率の測定のため、同様に培養後、４００μＬのＰＢＳ（−）リン酸生理緩衝液で洗浄し、終濃度０．０５ｍｇ／ｍＬで１０体積％ＦＢＳ含有ダルベッコＭＥＭに溶解した１３．８ｍｍｏｌ／Ｌニュートラルレッドを各ウェルに２００μＬ添加した。２．５時間培養した後、ニュートラルレッド溶液を捨て、エタノール・酢酸溶液（エタノール：酢酸：水＝５０：１：４９）を各ウェルに２００μＬ添加し、色素を抽出した。抽出後、波長５４０ｎｍにおける吸光度を測定した。
空試験として、１０体積％ＦＢＳ及び１ｍｍｏｌ／Ｌテオフィリン含有ダルベッコＭＥＭのみで培養した細胞を同様の方法で試験した。
メラニン産生抑制率の計算方法は、以下のとおりである。結果を表３に示した。
メラニン産生抑制率（％）＝｛１−（Ｂ／Ｄ）／（Ａ／Ｃ）｝×１００
ただし、前記式中、Ａは、被験試料を添加しない細胞での波長４７５ｎｍにおける吸光度、Ｂは、被験試料を添加した細胞での波長４７５ｎｍにおける吸光度、Ｃは、被験試料を添加しない細胞での波長５４０ｎｍにおける吸光度、Ｄは、被験試料を添加した細胞での波長５４０ｎｍにおける吸光度、をそれぞれ表す。

表３の結果から、ハイビスカスの抽出物が、メラニン産生抑制作用を有することが認められた。

（実施例４）
＜エンドセリン−１ｍＲＮＡ発現上昇抑制作用試験＞
ハイビスカス花部抽出液（丸善製薬株式会社製）の凍結乾燥物を被験試料として用い、下記の試験方法によりエンドセリン−１ｍＲＮＡ発現上昇抑制作用を試験した。

正常ヒト新生児包皮表皮角化細胞（ｎｏｒｍａｌ ｈｕｍａｎ ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ；ＮＨＥＫ）を７５ｃｍ^２フラスコで正常ヒト表皮角化細胞増殖培地（ＫＧＭ）において、３７℃、５％ＣＯ_２下で前培養し、トリプシン処理により細胞を集めた。
ＫＧＭを用いて３５ｍｍシャーレ（ＦＡＬＣＯＮ社製）に４０×１０^４ｃｅｌｌｓ／２ｍＬ／シャーレずつ播き、３７℃、５％ＣＯ_２下で一晩培養した。２４時間後に培養液を捨て、ＨＥＰＥＳ緩衝液１ｍＬを加え、ＵＶ−Ｂ照射（５０ｍＪ／ｃｍ^２）を行い、その後ＫＧＭで必要濃度に溶解した被験試料を各シャーレに２ｍＬずつ添加し、３７℃、５％ＣＯ_２下で２４時間培養した。培養後、培養液を捨て、ＩＳＯＧＥＮ ＩＩ（ＮＩＰＰＯＮ ＧＥＮＥ；Ｃａｔ．Ｎｏ．３１１−０７３６１）にてｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出し、それぞれのＲＮＡ量を分光光度計にて測定し、２００ｎｇ／μＬになるようにｔｏｔａｌ ＲＮＡを調製した。
このｔｏｔａｌ ＲＮＡを鋳型とし、エンドセリン−１及び内部標準であるＧＡＰＤＨのｍＲＮＡの発現量を測定した。検出はリアルタイムＰＣＲ装置Ｓｍａｒｔ Ｃｙｃｌｅｒ^（Ｒ）（Ｃｅｐｈｅｉｄ社製）を用いて、ＴａＫａＲａ ＳＹＢＲ^（Ｒ） ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ^ＴＭ ＲＴ−ＰＣＲ Ｋｉｔ（Ｐｅｒｆｅｃｔ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ）（ｃｏｄｅ Ｎｏ．ＲＲ０６３Ａ）によるリアルタイム２ステップＲＴ−ＰＣＲ反応により行った。
エンドセリン−１のｍＲＮＡの発現量は、「紫外線未照射、被験試料無添加」、「紫外線照射、被験試料無添加」、及び「紫外線照射、被験試料添加」でそれぞれ培養した細胞から調製した総ＲＮＡ標品を基にして、ＧＡＰＤＨの値で補正値を求め、更に「紫外線未照射、被験試料無添加」の補正値を１００とした時の「紫外線照射、被験試料無添加」、及び「紫外線照射、被験試料添加」の補正値を算出した。
そして、これらの結果から、下記数式により、エンドセリン−１ｍＲＮＡ発現上昇抑制率を算出した。結果を表４に示した。
エンドセリン−１ｍＲＮＡ発現上昇抑制率（％）
＝{（Ａ−Ｂ）−（Ａ−Ｃ）}／（Ａ−Ｂ）×１００
ただし、前記数式中、Ａは、「紫外線未照射、被験試料無添加」時の補正値、Ｂは、「紫外線照射、被験試料無添加」時の補正値、Ｃは、「紫外線照射、被験試料添加」時の補正値である。

表４の結果から、ハイビスカスの抽出物が、エンドセリン−１ｍＲＮＡ発現上昇抑制作用を有することが認められた。

（実施例５）
＜幹細胞増殖因子（ＳＣＦ）ｍＲＮＡ発現上昇抑制作用試験＞
ハイビスカス花部抽出液（丸善製薬株式会社製）の凍結乾燥物を被験試料として用い、下記の試験方法により幹細胞増殖因子（ＳＣＦ）ｍＲＮＡ発現上昇抑制作用を試験した。

正常ヒト新生児包皮表皮角化細胞（ｎｏｒｍａｌ ｈｕｍａｎ ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ；ＮＨＥＫ）を８０ｃｍ^２フラスコで正常ヒト表皮角化細胞増殖培地（ＫＧＭ）において、３７℃、５％ＣＯ_２下で前培養し、トリプシン処理により細胞を集めた。
ＫＧＭを用いて３５ｍｍシャーレ（ＦＡＬＣＯＮ社製）に４０×１０^４ｃｅｌｌｓ／２ｍＬシャーレずつ播き、３７℃、５％ＣＯ_２下で一晩培養した。２４時間後に培養液を捨て、ＨＥＰＥＳ緩衝液１ｍＬを加えＵＶ−Ｂ照射（５０ｍＪ／ｃｍ^２）を行った。その後、ＫＧＭで必要濃度に溶解した被験試料を各シャーレに２ｍＬずつ添加し、３７℃、５％ＣＯ_２下で２４時間培養した。培養後、培養液を捨て、ＩＳＯＧＥＮ ＩＩ（ＮＩＰＰＯＮ ＧＥＮＥ；Ｃａｔ．Ｎｏ．３１１−０７３６１）にてｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出し、それぞれのＲＮＡ量を分光光度計にて測定し、２００ｎｇ／μＬになるようにｔｏｔａｌ ＲＮＡを調製した。
このｔｏｔａｌ ＲＮＡを鋳型とし、ＳＣＦ（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｆａｃｔｏｒ）及び内部標準であるＧＡＰＤＨのｍＲＮＡの発現量を測定した。検出はリアルタイムＰＣＲ装置Ｓｍａｒｔ Ｃｙｃｌｅｒ^（Ｒ）（Ｃｅｐｈｅｉｄ社製）を用いて、ＴａＫａＲａ ＳＹＢＲ^（Ｒ） ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ^ＴＭ ＲＴ−ＰＣＲ Ｋｉｔ（Ｐｅｒｆｅｃｔ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ）（ｃｏｄｅ Ｎｏ．ＲＲ０６３Ａ）によるリアルタイム２ステップＲＴ−ＰＣＲ反応により行った。
ＳＣＦのｍＲＮＡの発現量は、「紫外線未照射、被験試料無添加」、「紫外線照射、被験試料無添加」、及び「紫外線照射、被験試料添加」でそれぞれ培養した細胞から調製した総ＲＮＡ標品を基にして、ＧＡＰＤＨの値で補正値を求め、更に「紫外線未照射、被験試料無添加」の補正値を１００とした時の「紫外線照射、被験試料無添加」、及び「紫外線照射、被験試料添加」の補正値を算出した。
そして、これらの結果から、下記数式により、幹細胞増殖因子（ＳＣＦ）ｍＲＮＡ発現上昇抑制率を算出した。結果を表５に示した。
幹細胞増殖因子（ＳＣＦ）ｍＲＮＡ発現上昇抑制率（％）
＝{（Ａ−Ｂ）−（Ａ−Ｃ）}／（Ａ−Ｂ）×１００
ただし、前記数式中、Ａは「紫外線未照射、被験試料無添加」時の補正値、Ｂは「紫外線照射、被験試料無添加」時の補正値、Ｃは「紫外線照射、被験試料添加」時の補正値をそれぞれ表す。

表５の結果から、ハイビスカスの抽出物が、幹細胞増殖因子（ＳＣＦ）ｍＲＮＡ発現上昇抑制作用を有することが認められた。

（実施例６）
＜塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）ｍＲＮＡ発現上昇抑制作用試験＞
ハイビスカス花部抽出液（丸善製薬株式会社製）の凍結乾燥物を被験試料として用い、下記の試験方法により塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）ｍＲＮＡ発現上昇抑制作用を試験した。

正常ヒト新生児包皮表皮角化細胞（ｎｏｒｍａｌ ｈｕｍａｎ ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ；ＮＨＥＫ）を７５ｃｍ^２フラスコで正常ヒト表皮角化細胞培養用増殖培地（ＫＧＭ）において、３７℃、５％ＣＯ_２下で前培養し、トリプシン処理により細胞を集めた。
ＫＧＭを用いて３５ｍｍシャーレ（ＦＡＬＣＯＮ社製）に４０×１０^４ｃｅｌｌｓ／２ｍＬシャーレずつ播き、３７℃、５％ＣＯ_２下で一晩培養した。２４時間後に培養液を捨て、ＨＥＰＥＳ緩衝液１ｍＬを加えＵＶ−Ｂ照射（５０ｍＪ／ｃｍ^２）を行った。その後、ＫＧＭで必要濃度に溶解した被験試料を各シャーレに２ｍＬずつ添加し、３７℃、５％ＣＯ_２下で２４時間培養した。培養後、培養液を捨て、ＩＳＯＧＥＮ ＩＩ（ＮＩＰＰＯＮ ＧＥＮＥ；Ｃａｔ．Ｎｏ．３１１−０７３６１）にてｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出し、それぞれのＲＮＡ量を分光光度計にて測定し、２００ｎｇ／μＬになるようにｔｏｔａｌ ＲＮＡを調製した。
このｔｏｔａｌ ＲＮＡを鋳型とし、ｂＦＧＦ（ｂａｓｉｃ Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ；塩基性線維芽細胞増殖因子)及び内部標準であるＧＡＰＤＨのｍＲＮＡの発現量を測定した。検出はリアルタイムＰＣＲ装置Ｓｍａｒｔ Ｃｙｃｌｅｒ^（Ｒ）（Ｃｅｐｈｅｉｄ社製）を用いて、ＴａＫａＲａ ＳＹＢＲ^（Ｒ） ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ^ＴＭ ＲＴ−ＰＣＲ Ｋｉｔ（Ｐｅｒｆｅｃｔ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ）（ｃｏｄｅ Ｎｏ．ＲＲ０６３Ａ）によるリアルタイム２ステップＲＴ−ＰＣＲ反応により行った。
ｂＦＧＦのｍＲＮＡの発現量は、「紫外線未照射、被験試料無添加」、「紫外線照射、被験試料無添加」、及び「紫外線照射、被験試料添加」でそれぞれ培養した細胞から調製した総ＲＮＡ標品を基にして、ＧＡＰＤＨの値で補正値を求め、更に「紫外線未照射、被験試料無添加」の補正値を１００とした時の「紫外線照射、被験試料無添加」、及び「紫外線照射、被験試料添加」の補正値を算出した。
これらの結果から、下記数式により、ｂＦＧＦｍＲＮＡ発現上昇抑制率を算出した。結果を表６に示した。
ｂＦＧＦｍＲＮＡ発現上昇抑制率（％）
＝{（Ａ−Ｂ）−（Ａ−Ｃ）}／（Ａ−Ｂ）×１００
ただし、前記数式中、Ａは、紫外線未照射・被験試料無添加時の補正値、Ｂは、紫外線照射・被験試料無添加時の補正値、Ｃは、紫外線照射・被験試料添加時の補正値を表す。

表６の結果から、ハイビスカスの抽出物が、強いｂＦＧＦｍＲＮＡ発現上昇抑制作用を有することが認められた。

（実施例７）
＜プロオピオメラノコルチン（ＰＯＭＣ）ｍＲＮＡ発現上昇抑制作用試験＞
ハイビスカス花部抽出液（丸善製薬株式会社製）の凍結乾燥物を被験試料として用い、下記の試験方法によりプロオピオメラノコルチン（ＰＯＭＣ）ｍＲＮＡ発現上昇抑制作用を試験した。

正常ヒト新生児包皮表皮角化細胞（ｎｏｒｍａｌ ｈｕｍａｎ ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ；ＮＨＥＫ）を７５ｃｍ^２フラスコで正常ヒト表皮角化細胞培養用増殖培地（ＫＧＭ）において、３７℃、５％ＣＯ_２下で前培養し、トリプシン処理により細胞を集めた。
ＫＧＭを用いて３５ｍｍシャーレ（ＦＡＬＣＯＮ社製）に４０×１０^４ｃｅｌｌｓ／２ｍＬシャーレずつ播き、３７℃、５％ＣＯ_２下で一晩培養した。２４時間後に培養液を捨て、ＨＥＰＥＳ緩衝液１ｍＬを加えＵＶ−Ｂ照射（５０ｍＪ／ｃｍ^２）を行った。その後、ＫＧＭで必要濃度に溶解した被験試料を各シャーレに２ｍＬずつ添加し、３７℃、５％ＣＯ_２下で２４時間培養した。培養後、培養液を捨て、ＩＳＯＧＥＮ ＩＩ（ＮＩＰＰＯＮ ＧＥＮＥ；Ｃａｔ．Ｎｏ．３１１−０７３６１）にてｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出し、それぞれのＲＮＡ量を分光光度計にて測定し、２００ｎｇ／μＬになるようにｔｏｔａｌ ＲＮＡを調製した。
このｔｏｔａｌ ＲＮＡを鋳型とし、ＰＯＭＣ（ｐｒｏｏｐｉｏｍｅｌａｎｏｃｏｒｔｉｎ；プロオピオメラノコルチン）及び内部標準であるＧＡＰＤＨのｍＲＮＡの発現量を測定した。検出はリアルタイムＰＣＲ装置Ｓｍａｒｔ Ｃｙｃｌｅｒ^（Ｒ）（Ｃｅｐｈｅｉｄ社製）を用いて、ＴａＫａＲａ ＳＹＢＲ^（Ｒ） ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ^ＴＭ ＲＴ−ＰＣＲ Ｋｉｔ（Ｐｅｒｆｅｃｔ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ）（ｃｏｄｅ Ｎｏ．ＲＲ０６３Ａ）によるリアルタイム２ステップＲＴ−ＰＣＲ反応により行った。
ＰＯＭＣのｍＲＮＡの発現量は、「紫外線未照射、被験試料無添加」、「紫外線照射、被験試料無添加」、及び「紫外線照射、被験試料添加」でそれぞれ培養した細胞から調製した総ＲＮＡ標品を基にして、ＧＡＰＤＨの値で補正値を求め、更に「紫外線未照射、被験試料無添加」の補正値を１００とした時の「紫外線照射、被験試料無添加」、及び「紫外線照射、被験試料添加」の補正値を算出した。
これらの結果から、下記数式により、ＰＯＭＣｍＲＮＡ発現上昇抑制率を算出した。結果を表７に示した。
ＰＯＭＣｍＲＮＡ発現上昇抑制率（％）
＝{（Ａ−Ｂ）−（Ａ−Ｃ）}／（Ａ−Ｂ）×１００
ただし、前記数式中、Ａは、「紫外線未照射、被験試料無添加」時の補正値、Ｂは、「紫外線照射、被験試料無添加」時の補正値、Ｃは、「紫外線照射、被験試料添加」時の補正値を表す。

表７の結果から、ハイビスカスの抽出物が、ＰＯＭＣｍＲＮＡ発現上昇抑制作用を有することが認められた。

（実施例８）
＜表皮ヒアルロン酸産生促進作用試験＞
ハイビスカス花部抽出液（丸善製薬株式会社製）の凍結乾燥物を被験試料として用い、下記の試験方法により表皮ヒアルロン酸産生促進作用を試験した。

ヒト正常新生児皮膚表皮角化細胞（ＮＨＥＫ）を、ヒト正常新生児表皮角化細胞増殖培地（ＫＧＭ）を用いて培養した後、トリプシン処理により細胞を回収した。回収した細胞を１×１０^５細胞／ｍＬの濃度になるようにＫＧＭで希釈した後、９６ウェルプレートに１ウェル当たり１００μＬずつ播種し、２４時間培養した。培養終了後、ＫＧＭで溶解した被験試料を各ウェルに１００μＬ添加し、７日間培養した。培養後、各ウェルの培地中のヒアルロン酸量を、ヒアルロン酸結合タンパク（ＨＡＢＰ、生化学バイオビジネス株式会社製）を用いたサンドイッチ法により測定した。

ヒアルロン酸産生促進率の計算方法は、以下のとおりである。結果を表８に示した。
ヒアルロン酸産生促進率（％）＝Ａ／Ｂ×１００
ただし、前記式中、Ａは、被験試料添加時のヒアルロン酸量、Ｂは、被験試料無添加時のヒアルロン酸量、を表す。

表８の結果から、ハイビスカスの抽出物が、表皮ヒアルロン酸産生促進作用を有することが認められた。

（実施例９）
＜グルタチオン産生促進作用試験（ヒト正常皮膚線維芽細胞）＞
ハイビスカス花部抽出液（丸善製薬株式会社製）の凍結乾燥物を被験試料として用い、下記の試験方法によりグルタチオン産生促進作用試験（ヒト正常皮膚線維芽細胞）を試験した。

ヒト正常皮膚線維芽細胞（ＮＢ１ＲＧＢ）を１０質量％ＦＢＳ含有α−ＭＥＭ培地を用いて培養した後、トリプシン処理により細胞を回収した。回収した細胞を２．０×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍＬの濃度に１０質量％ＦＢＳ含有α−ＭＥＭ培地で希釈した後、４８ｗｅｌｌプレートに１ｗｅｌｌ当たり２００μＬずつ播種し、一晩培養した。培養後、１質量％ＦＢＳ含有α−ＭＥＭ培地で溶解した被験試料を各ｗｅｌｌに２００μＬ添加し、２４時間培養した。培養終了後、各ｗｅｌｌから培地を抜き、４００μＬのＰＢＳ（−）にて洗浄後、１５０μＬのＭ−ＰＥＲ^（Ｒ）（ＰＩＥＲＣＥ社）を用いて細胞を溶解した。このうちの１００μＬを用いて総グルタチオンの定量を行った。
即ち、９６ｗｅｌｌプレートに溶解した細胞抽出液１００μＬ、０．１Ｍのリン酸緩衝液５０μＬ、２ｍＭのＮＡＤＰＨを２５μＬ及びグルタチオンレダクターゼ２５μＬ（終濃度１７．５ｕｎｉｔ／ｍＬ）を加え、３７℃で１０分間加温した後、１０ｍＭの５，５’−ｄｉｔｈｉｏｂｉｓ（２−ｎｉｔｏｒｏｂｅｎｚｏｉｃ ａｃｉｄ）２５μＬを加え、５分間後までの波長４１２ｎｍにおける吸光度を測定し、ΔＯＤ／ｍｉｎを求めた。総グルタチオン濃度は酸化型グルタチオンを用いて作成した検量線に基づき算出した。
得られた値は総タンパク量当たりのグルタチオン量に補正した後、下記数式によりグルタチオン産生促進率を算出した。試料濃度１２．５μｇ／ｍＬ、５０μｇ／ｍＬ、及び２００μｇ／ｍＬでの結果を表９に示した。
グルタチオン産生促進率（％）＝（Ｂ／Ａ）×１００
ただし、前記数式中、Ａは、被験試料を添加しない細胞中における総タンパク量当たりのグルタチオン量（対照）、Ｂは、被験試料を添加した細胞中における総タンパク量当たりのグルタチオン量を表す。

表９の結果から、ハイビスカスの抽出物が、グルタチオン産生促進作用を有することが認められた。

（実施例１０）
＜セリンパルミトイルトランスフェラーゼ（ＳＰＴ）ｍＲＮＡ発現促進作用試験＞
ハイビスカス花部抽出液（丸善製薬株式会社製）の凍結乾燥物を被験試料として用い、下記の試験方法によりセリンパルミトイルトランスフェラーゼ（ＳＰＴ）ｍＲＮＡ発現促進作用を試験した。

正常ヒト新生児包皮表皮角化細胞（ｎｏｒｍａｌ ｈｕｍａｎ ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ；ＮＨＥＫ）を７５ｃｍ^２フラスコで正常ヒト表皮角化細胞増殖培地（ＫＧＭ）において、３７℃、５％ＣＯ_２下で前培養し、トリプシン処理により細胞を集めた。
ＫＧＭを用いて３５ｍｍシャーレ（ＦＡＬＣＯＮ社製）に４０×１０^４ｃｅｌｌｓ／２ｍＬ／シャーレずつ播き、３７℃、５％ＣＯ_２下で一晩培養した。２４時間後に培養液を捨て、ＫＧＭで必要濃度に溶解した被験試料を各シャーレに２ｍＬずつ添加し、３７℃、５％ＣＯ_２下で２４時間培養した。培養後、培養液を捨て、ＩＳＯＧＥＮ ＩＩ（ＮＩＰＰＯＮ ＧＥＮＥ；Ｃａｔ．ｎｏ．３１１−０７３６１）にてｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出し、それぞれのＲＮＡ量を分光光度計にて測定し、２００ｎｇ／μＬになるようにｔｏｔａｌＲＮＡを調製した。
このｔｏｔａｌＲＮＡを鋳型とし、ＳＰＴ及び内部標準であるＧＡＰＤＨのｍＲＮＡの発現量を測定した。検出はリアルタイムＰＣＲ装置Ｓｍａｒｔ Ｃｙｃｌｅｒ（登録商標）（Ｃｅｐｈｅｉｄ社）を用いて、ＴａＫａＲａ ＳＹＢＲ（登録商標）ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ^ＴＭ ＲＴ−ＰＣＲ Ｋｉｔ（Ｐｅｒｆｅｃｔ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ）（ｃｏｄｅ Ｎｏ．ＲＲ０６３Ａ）によるリアルタイム２ Ｓｔｅｐ ＲＴ−ＰＣＲ反応により行った。ＳＰＴの発現量は、被験試料無添加、被験試料添加でそれぞれ培養した細胞から調製した総ＲＮＡ標品を基にして、ＧＡＰＤＨの値で補正値を求め、更に被験試料無添加の補正値を１００とした時の被験試料添加の補正値を算出した。
ＳＰＴｍＲＮＡ発現促進率の計算方法は、以下の通りである。結果を表１０に示した。
ＳＰＴｍＲＮＡ発現促進率（％）＝Ａ／Ｂ×１００
ただし、前記式中、Ａは被験試料添加時の補正値、Ｂは被験試料無添加時の補正値を表す。

表１０の結果から、ハイビスカスの抽出物が、高いセリンパルミトイルトランスフェラーゼ（ＳＰＴ）産生促進作用を有することが認められた。

（実施例１１）
＜メイラード反応阻害作用試験＞
ハイビスカス花部抽出液（丸善製薬株式会社製）の凍結乾燥物を被験試料として用い、下記の試験方法により、メイラード反応阻害作用を試験した。

被験試料の凍結乾燥品を蒸留水に溶解した被験試料溶液５０μＬ、１００ｍｍｏｌ／ＬのＤ（−）−リボース２００μＬ、２５ｍｇ／ｍＬのリゾチーム２００μＬ、１００ｍｍｏｌ／Ｌのリン酸水素ナトリウム（ｐＨ７．４）５００μＬ、及び滅菌蒸留水５０μＬを混合（全量１，０００μＬ）し、３７℃で静置した。コントロールは、被験試料溶液に代えて蒸留水とした以外は、前記と同様にして調製した。ブランクは、被験試料溶液に代えて蒸留水としたこと、３７℃に代えて４℃で静置した以外は、前記と同様にして調製した。

７日間後、ボルテックスで攪拌し、反応液４０μＬにＳＤＳ−ＰＡＧＥ用サンプルバッファー４０μＬを混合した後、沸騰浴中で３分間加熱し、分析サンプルとした。アクリルアミド濃度を、分離ゲル１５％、濃縮ゲル４％に調製したポリアクリルアミドゲルに分析サンプル１２μＬをアプライし、電気泳動を行った。
泳動したゲルをクマシーブリリアントブルー染色後脱色し、画像撮影装置ＣｈｅｍｉＤｏｃＸＲＳ Ｐｌｕｓ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）を用いて検出し、バンドをＩｍａｇｅ Ｌａｂ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ｖｅｒｓｉｏｎ２．０（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）にて定量的に測定した。
結果は、各バンドのＮｅｔ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ（バンド強度）を用いて、リゾチームの二量体及び三量体の形成阻害率を、下記式から算出した。結果を表１１に示した。
メイラード反応阻害率（％）＝｛１−（Ａ−Ｃ）／（Ｂ−Ｃ）｝×１００
ただし、前記数式中、Ａは、被験試料添加時の二量体と三量体のＮｅｔ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙの和、Ｂは、被験試料無添加時（コントロール）の二量体と三量体のＮｅｔ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙの和、Ｃは、被験試料無添加時の４℃で静置（ブランク）の二量体と三量体のＮｅｔ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙの和を、それぞれ表す。

表１１の結果から、ハイビスカスの抽出物が、メイラード反応阻害作用を有することが認められた。

（実施例１２）
＜最終糖化産物（ＡＧＥｓ）形成抑制作用試験＞
ハイビスカス花部抽出液（丸善製薬株式会社製）の凍結乾燥物を被験試料として用い、下記の試験方法により、最終糖化産物（ＡＧＥｓ）形成抑制作用を試験した。

９６穴のＩ型コラーゲンコートプレートにＰＢＳ（−）にて調製した０．２ＭのＤ（−）−リボース及び被験試料（試料濃度：６．２５μｇ／ｍＬ、２５μｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬ又は４００μｇ／ｍＬ）の混合物を１００μＬ添加し、３７℃で２週間静置し、ＡＧＥｓを形成させた。このとき、陰性対照としてＰＢＳ（−）のみを添加したもの、陽性対照としてＤ（−）−リボースのみを添加したものを同様に静置した。１７日後、抗ＡＧＥｓ抗体（トランスジェニック社製）を用いたＥＬＩＳＡ法によりＡＧＥｓ量を測定し、ＡＧＥｓ形成抑制作用を評価した。
ＡＧＥｓ形成抑制率の計算方法は、以下のとおりである。結果を表１２に示した。
ＡＧＥｓ形成抑制率（％）＝｛（Ｂ−Ｃ）／（Ｂ−Ａ）｝×１００
ただし、前記式中、Ａは陰性対照の波長４０５ｎｍにおける吸光度を、Ｂは陽性対照の波長４０５ｎｍにおける吸光度を、Ｃは被験試料添加時の波長４０５ｎｍにおける吸光度を表す。

表１２の結果から、ハイビスカスの抽出物が、極めて強い最終糖化産物形成抑制作用を有することが認められた。

（実施例１３）
＜最終糖化産物（ＡＧＥｓ）分解促進作用試験＞
ハイビスカス花部抽出液（丸善製薬株式会社製）の凍結乾燥物を被験試料として用い、下記の試験方法により、最終糖化産物（ＡＧＥｓ）分解促進作用を試験した。

９６穴のＩ型コラーゲンコートプレートにＰＢＳ（−）にて調製した０．２ＭのＤ（−）−リボース１００μＬを添加し、３７℃で２週間静置し、ＡＧＥｓを形成させた。陰性対照として、ＰＢＳ（−）を添加したものを同様に静置した。２週間後、ＰＢＳ（−）にて調製した被験試料（試料濃度：６．２５μｇ／ｍＬ、２５μｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬ又は４００μｇ／ｍＬ）を１００μＬずつ添加し、更に１６日間静置した。この時、陽性対照としてＤ（−）−リボース処理後被験試料の代わりにＰＢＳ（−）を添加したものを同様に静置した。また、陰性対照は引き続きＰＢＳ（−）を処理した。１６日後、抗ＡＧＥｓ抗体（トランスジェニック社製）を用いたＥＬＩＳＡ法によりＡＧＥｓ量を測定し、ＡＧＥｓ分解促進作用を評価した。
ＡＧＥｓ分解促進率の計算方法は、以下のとおりである。結果を表１３に示した。
ＡＧＥｓ分解促進率（％）＝｛（Ｂ−Ｃ）／（Ｂ−Ａ）｝×１００
ただし、前記式中、Ａは陰性対照の波長４０５ｎｍにおける吸光度を、Ｂは陽性対照の波長４０５ｎｍにおける吸光度を、Ｃは被験試料添加時の波長４０５ｎｍにおける吸光度を表す。

表１３の結果から、ハイビスカスの抽出物が、最終糖化産物分解促進作用を有することが認められた。

（実施例１４）
＜クローディン−１産生促進作用試験＞
ハイビスカス花部抽出液（丸善製薬株式会社製）の凍結乾燥物を被験試料として用い、下記の試験方法によりクローディン−１産生促進作用を試験した。

正常ヒト皮膚表皮角化細胞（ＮＨＥＫ）を８０ｃｍ^２のフラスコで正常ヒト表皮角化細胞増殖培地（ＫＧＭ）にて３７℃、５％ＣＯ_２下で培養し、トリプシン処理により細胞を回収した。回収した細胞を２．０×１０^５個／ｍＬの細胞密度となるようにＫＧＭで希釈した後、９６ウェルプレートに１ウェルあたり１００μＬずつ播種し、５％ＣＯ_２下、３７℃で１日間培養した。
培養終了後、ＫＧＭで溶解した被験試料の溶液を各ウェルに１００μＬずつ添加し、３７℃、５％ＣＯ_２下で２４時間培養した。培養終了後、培地を抜き、細胞をプレートに固定させ、細胞表面に発現したクローディン−１の量をポリクローナルクローディン−１抗体を用いたＥＬＩＳＡ法により測定した。
得られた測定結果から、下記式によりクローディン−１産生促進率（％）を算出した。結果を表１４に示した。
クローディン−１産生促進率（％）＝Ａ／Ｂ×１００
ただし、前記式中、Ａは、被験試料添加時の波長４０５ｎｍにおける吸光度、Ｂは、被験試料無添加時の波長４０５ｎｍにおける吸光度を表す。

表１４の結果から、ハイビスカスの抽出物が、有意なクローディン−１産生促進作用を有することが認められた。

（実施例１５）
＜オクルディン産生促進作用試験＞
ハイビスカス花部抽出液（丸善製薬株式会社製）の凍結乾燥物を被験試料として用い、下記の試験方法により、オクルディン産生促進作用を試験した。

正常ヒト皮膚表皮角化細胞（ＮＨＥＫ）を８０ｃｍ^３のフラスコで正常ヒト表皮角化細胞増殖培地（ＫＧＭ）にて３７℃、５％ＣＯ_２下で培養し、トリプシン処理により細胞を回収した。回収した細胞を２．０×１０^５個／ｍＬの細胞密度となるようにＫＧＭで希釈した後、９６穴プレートに１穴あたり１００μＬずつ播種し、５％ＣＯ₂下、３７℃で一晩培養した。
培養終了後、ＫＧＭで溶解した被験試料（試料濃度：３．１３μｇ／ｍＬ、１２．５μｇ／ｍＬ、又は５０μｇ／ｍＬ）を各ウェルに１００μＬずつ添加し、３７℃、５％ＣＯ₂下で２４時間培養した。培養終了後、培地を抜き、細胞をプレートに固定し、細胞表面に発現したオクルディンの量をポリクローナル抗ヒトオクルディン抗体を用いたＥＬＩＳＡ法により測定した。
オクルディン産生促進率の計算方法は、以下のとおりである。結果を表１５に示した。
オクルディン産生促進率（％）＝Ａ／Ｂ×１００
ただし、前記式中、Ａは被験試料添加時の波長４０５ｎｍにおける吸光度を表し、Ｂは被験試料無添加時の波長４０５ｎｍにおける吸光度を表す。

表１５の結果から、ハイビスカスの抽出物が、オクルディン産生促進作用を有することが認められた。

（実施例１６）
＜ヒト皮膚三次元モデルにおける表皮タイトジャンクション構成タンパク質産生促進作用試験＞
ハイビスカス花部抽出液（丸善製薬株式会社製）の凍結乾燥物を被験試料として用い、下記の試験方法により、ヒト皮膚三次元モデルにおける表皮タイトジャンクション構成タンパク質産生促進作用を試験した。

試験は正常ヒト皮膚三次元モデル（ＥＰＩ−２００、ＫＵＲＡＢＯ社製）を用いて行った。
三次元皮膚モデルを購入後、６ウェルプレートにてアッセイ培地（ＥＰＩ−ＮＭＭ Ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ Ｍｅｄｉｕｍ、ＫＵＲＡＢＯ社製）を用いて３７℃、５％ＣＯ_２の条件下で１時間培養した。培養後、１％ＤＭＳＯに溶解した被験試料を含む、又は含まない（コントロール）アッセイ培地１００μＬを皮膚モデルの表面に供し、皮膚モデル底面にアッセイ培地（維持培地）を供し、３７℃、５％ＣＯ_２条件下で７日間培養した。培養期間中は常時試験試料での曝露を行った。培養４日目に維持培地と被験試料を含むアッセイ培地を交換した。培養４日目及び培養終了後に６ｍｍのバイオプシパンチを用いて切り抜き、プラスチック製包埋皿に包埋剤を入れ、ドライアイスと液体窒素で凍結させた。その後、クリオスタットＨＭ５５０（ＭＩＣＲＯＭ社製）にて、４μｍの厚さに切り切片をスライドグラスに貼り付け、切片を乾燥させた。

＜クローディン−４免疫蛍光染色＞
切片を貼り付けたスライドグラスを染色バットに入れ、４％パラホルムアルデヒドにて固定し、ＰＢＳ（−）にて切片のまわりの包埋剤を良く洗い流した。１％ＢＳＡでブロッキングを行った後、液を捨て、１次抗体であるマウス由来抗ヒトクローディン−４モノクローナル抗体（ＺＹＭＥＤ^（Ｒ） Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を各スライドグラス上に注ぎ、室温で１時間インキュベートした。抗体液を捨て、ＰＢＳ（−）にて洗浄し、２次抗体であるＡｌｅｘａ−Ｆｌｕｏｒ ４８８標識ヤギ由来抗マウスＩｇＧ抗体（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を処理し、４℃の暗所で１時間インキュベートした。更にＰＢＳ（−）にて洗浄し、ＤＡＰＩ溶液により核染色をした。蛍光顕微鏡により、目的のクローディン−４を解析した。結果を図１Ａ〜図１Ｆに示した。
図１Ａ〜図１Ｆの画像は角質層下部〜基底層の部分を示しており、図１Ａは、培養４日目の対照、図１Ｂは、培養４日目の試料濃度１００μｇ／ｍＬのハイビスカスの抽出物、図１Ｃは、培養４日目の試料濃度５００μｇ／ｍＬのハイビスカスの抽出物、図１Ｄは、培養７日目の対照、図１Ｅは、培養７日目の試料濃度１００μｇ／ｍＬのハイビスカスの抽出物、図１Ｆは、培養７日目の試料濃度５００μｇ／ｍＬのハイビスカスの抽出物の結果を示し、クローディン−４が緑色（顆粒層の細胞膜付近）に染色されている。
また、培養４日目と培養７日目の両方において、対照と比較して、ハイビスカスの抽出物では顆粒層細胞膜付近の線状の蛍光が強くなったことから、クローディン−４産生促進作用が皮膚三次元モデルにおいて確認できた。

＜ＺＯ−１、ＺＯ−２免疫蛍光染色＞
切片を貼り付けたスライドグラスを染色バットに入れ、４％パラホルムアルデヒドにて固定し、ＰＢＳ（−）にて切片のまわりの包埋剤を良く洗い流した。１％ＢＳＡでブロッキングを行った後、液を捨て、１次抗体であるマウス由来抗ヒトＺＯ−１モノクローナル抗体（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）及びウサギ由来抗ヒトＺＯ−２ポリクローナル抗体（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を各スライドグラス上に注ぎ、室温で１時間インキュベートした。抗体液を捨て、ＰＢＳ（−）にて洗浄し、２次抗体であるＡｌｅｘａ−Ｆｌｕｏｒ ４８８標識ヤギ由来抗マウスＩｇＧ抗体（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）及びＡｌｅｘａ−Ｆｌｕｏｒ ５９４標識ヤギ由来抗ウサギＩｇＧ抗体（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を処理し、４℃の暗所で１時間インキュベートした。更に、ＰＢＳ（−）にて洗浄し、ＤＡＰＩ溶液により核染色をした。蛍光顕微鏡により、目的のＺＯ−１及びＺＯ−２を解析した。結果を図２Ａ〜図２Ｆ、及び図３Ａ〜図３Ｆに示した。
図２Ａ〜図２Ｆの写真は角質層下部〜基底層の部分を示している。
図２Ａは、培養４日目の対照、図２Ｂは、培養４日目の試料濃度１００μｇ／ｍＬのハイビスカスの抽出物、図２Ｃは、培養４日目の試料濃度５００μｇ／ｍＬのハイビスカスの抽出物、図２Ｄは、培養７日目の対照、図２Ｅは、培養７日目の試料濃度１００μｇ／ｍＬのハイビスカスの抽出物、図２Ｆは、培養７日目の試料濃度５００μｇ／ｍＬのハイビスカスの抽出物の結果を示し、図２Ａ〜図２ＦよりＺＯ−１が緑色（顆粒層〜基底層の細胞膜付近）に染色されている。
図３Ａ〜図３Ｆの写真は角質層下部〜基底層の部分を示している。
図３Ａは、培養４日目の対照、図３Ｂは、培養４日目の試料濃度１００μｇ／ｍＬのハイビスカスの抽出物、図３Ｃは、培養４日目の試料濃度５００μｇ／ｍＬのハイビスカスの抽出物、図３Ｄは、培養７日目の対照、図３Ｅは、培養７日目の試料濃度１００μｇ／ｍＬのハイビスカスの抽出物、図３Ｆは、培養７日目の試料濃度５００μｇ／ｍＬのハイビスカスの抽出物の結果を示し、図３Ａ〜図３ＦよりＺＯ−２が赤色（顆粒層〜基底層の細胞膜付近）に染色されている。
培養４日目において、対照と比較して、ハイビスカスの抽出物は１００μｇ／ｍＬの濃度において細胞膜付近の線状の蛍光が強くなったことから、ＺＯ−１及びＺＯ−２の産生促進作用が三次元皮膚モデルにおいて確認できた。

（実施例１７）
＜皮膚バリア機能低下抑制作用試験（電気抵抗値ＴＥＲ測定及びＦＩＴＣ−Ｄｅｘによる透過性評価＞
ハイビスカス花部抽出液（丸善製薬株式会社製）の凍結乾燥物を被験試料として用い、下記の試験方法により、皮膚バリア機能低下抑制作用を試験した。

ヒト正常新生児皮膚表皮角化細胞（ＮＨＥＫ）をヒト正常新生児表皮角化細胞用培地（ＫＧＭ）を用いて培養した後、トリプシン処理により細胞を回収した。回収した細胞を２．２×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍＬの濃度になるようにＫＧＭで希釈した後、１２ｗｅｌｌトランスウェル（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製、直径１２ｍｍ、０．４μｍポア）の上層に１ｗｅｌｌ当たり０．５ｍＬずつ播種し、更に下層に０．５ｍＬずつＫＧＭを加え３日間培養した。培養終了後、ＫＧＭで溶解したＣａＣｌ_２（最終濃度１．８ｍＭ）を各ｗｅｌｌの上下層に０．５ｍＬずつ添加し、３日間培養してタイトジャンクション形成を誘導した。培養終了後、高ＣａＣｌ_２培地を除去し、ＫＧＭのみ、又はＫＧＭで溶解した被験試料を各ｗｅｌｌの上下層に０．５ｍＬずつ添加して低ＣａＣｌ_２状態で培養を開始した。また同時に、対照として高ＣａＣｌ_２培地でバリア機能を維持したｗｅｌｌも設定した。培養開始３日後にＭｉｌｌｉｃｅｌｌ−ＥＲＳ抵抗値測定システム（ミリポア社製）を用いて、電気抵抗値（ＴＥＲ）を測定し、コントロールと比較して被験試料のバリア低下抑制率（％）を算出した。
また、ＴＥＲ測定後、ＰＢＳ（−）で上下層を洗浄し、上層にＰ ｂｕｆｆｅｒ（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、１ｍＭ ｓｏｄｉｕｍ ｐｙｒｕｖａｔｅ、１０ｍＭ ｇｌｕｃｏｓｅ、３ｍＭ ＣａＣｌ_２、１４５ｍＭ ＮａＣｌ）で１ｍｇ／ｍＬとなるように溶解した４ｋＤａ ＦＩＴＣ−Ｄｅｘｔｒａｎ（ＦＩＴＣ−Ｄｅｘ、Ｓｉｇｍａ社製)を０．５ｍＬ、下層にＰ ｂｕｆｆｅｒを０．５ｍＬ添加して、３７℃で９０分間培養した。培養終了後、各下層から１００μＬずつ採取して、励起波長４８５ｎｍ、蛍光波長５４５ｎｍにおける蛍光強度を測定し、検量線を基に上層から下層に透過したＦＩＴＣ−Ｄｅｘ量を求め、コントロールと比較して被験試料の透過抑制率（％）を算出し、透過バリア機能を評価した。
バリア低下抑制率の計算方法は、以下のとおりである。結果を表１６に示した。
バリア低下抑制率（％）＝｛１−（Ｃ−Ａ）／（Ｃ−Ｂ）｝×１００
ただし、前記式中、Ａは、被験試料を添加した細胞での電気抵抗値（ＴＥＲ）、Ｂは、被験試料を添加しない細胞での電気抵抗値（ＴＥＲ）、Ｃは高ＣａＣｌ_２培地で処理した細胞での電気抵抗値（ＴＥＲ）、をそれぞれ表す。

透過抑制率の計算方法は、以下のとおりである。結果を表１７に示した。
透過抑制率（％）＝｛１−（Ｃ−Ａ）／（Ｃ−Ｂ）｝×１００
ただし、前記式中、Ａは、被験試料を添加した細胞での透過したＦＩＴＣ−Ｄｅｘ量、Ｂは、被験試料を添加しない細胞での透過したＦＩＴＣ−Ｄｅｘ量、Ｃは、高ＣａＣｌ_２培地で処理した細胞での透過したＦＩＴＣ−Ｄｅｘ量、をそれぞれ表す。

表１６及び表１７の結果から、ハイビスカスの抽出物が、電気抵抗値の低下抑制作用及びＦＩＴＣ−Ｄｅｘ透過抑制作用を有することが認められた。

（実施例１８）
＜テストステロン５α−リダクターゼ活性阻害作用試験＞
ハイビスカス花部抽出液（丸善製薬株式会社製）の凍結乾燥物を被験試料として用い、下記の試験方法により、テストステロン５α−リダクターゼ活性阻害作用を試験した。

まず、蓋付Ｖ底試験管にて、プロピレングリコールで調製した４．２ｍｇ／ｍＬのテストステロン２０μＬ、１ｍｇ／ｍＬ ＮＡＤＰＨ（還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸）含有５ｍｍｏｌ／ｍＬ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．１３）８２５μＬを混合した。これに、エタノール、５０％エタノール又は精製水で調製した被験試料８０μＬ及びＳ−９（オリエンタル酵母工業株式会社）７５μＬを加え再び混合し、３７℃にて３０分間反応させた後、塩化メチレン１ｍＬを加え反応を停止した。これを遠心（１，６００×ｇ、１０分間）し、塩化メチレン層をガスクロマトグラフィーにより分析した。前記ガスクロマトグラフィーの条件は以下の通りである。また、同様の方法で空試験を行った。
なお、前記Ｓ−９とは、ＳＤラットの雄に酵素誘導剤（フェノバルビタール、５，６−ベンゾフラボン）を腹腔内投与したのち肝臓をすりつぶして、９，０００×ｇで遠心した上清である。

＜ガスクロマトグラフィーの条件＞
使用機器 ：Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＧＣ−７Ａ
カラム ：ＤＢ−１７０１（直径０．５３ｍｍ×３０ｍ、膜厚；１．０μｍ）
カラム／注入温度：２４０℃／３００℃
検出器 ：ＦＩＤ
キャリアガス ：窒素ガス

あらかじめ、３α−アンドロスタンジオール（ＳＩＧＭＡ社）、ジヒドロテストステロン（ＤＨＴ、東京化成工業株式会社）及びテストステロン（東京化成工業株式会社）の標準品の塩化メチレン溶液をガスクロマトグラフィーにより分析し、これら３化合物の精秤量とピーク面積よりピーク面積あたりの化合物量を算出した。
そして、Ｓ−９による反応後の３α−アンドロスタンジオール、ジヒドロテストステロン（ＤＨＴ）及びテストステロンをガスクロマトグラフィーにより分析し、それぞれのピーク面積あたりの濃度を、下記の（２）式に従って算出した。次に、被験試料の変換率を下記の（３）式に従って算出した。そして、前記変換率に基づいて、テストステロン５α−リダクターゼ活性阻害率を、下記の（４）式に従って算出した。結果を表１８に示した。

濃度（％）＝（被験試料のピーク面積×標準品濃度）／標準品のピーク面積・・・（２）
変換率（％）＝（Ａ＋Ｂ）／（Ａ＋Ｂ＋Ｃ）・・・（３）
ただし、前記（３）式中、Ａは、３α−アンドロスタンジオールの濃度、Ｂは、ジヒドロテストステロン（ＤＨＴ）の濃度、Ｃは、テストステロンの濃度、を表す。

テストステロン５α−リダクターゼ活性阻害率（％）＝（１−Ｅ／Ｄ）×１００・・・（４）
ただし、前記（４）式中、Ｄは、空試験での変換率、Ｅは、被験試料添加での変換率を表す。

表１８の結果から、ハイビスカスの抽出物が、テストステロン５α−リダクターゼ活性阻害作用を有することが認められた。

（実施例１９）
＜毛乳頭細胞増殖作用試験＞
ハイビスカス花部抽出液（丸善製薬株式会社製）の凍結乾燥物を被験試料として用い、下記の試験方法により、毛乳頭細胞増殖作用を試験した。

正常ヒト頭髪毛乳頭細胞（東洋紡績株式会社製）を、１％ＦＣＳ及び増殖添加剤を含有した毛乳頭細胞増殖培地（東洋紡績株式会社製）を用いて培養した後、トリプシン処理により細胞を回収した。回収した細胞を、１０体積％ＦＢＳ含有ダルベッコＭＥＭ（ダルベッコ変法イーグル培地（１）、日水製薬株式会社製）を用いて１．０×１０^４細胞／ｍＬの濃度に希釈した後、コラーゲンコートした９６ウェルプレートに１ウェル当り２００μＬ播種し、３日間培養した。培養後、培地を抜き、無血清ＤＭＥＭ（ダルベッコ変法イーグル培地（１）、日水製薬株式会社製）に溶解した被験試料を各ウェルに２００μＬ添加し、更に４日間培養した。毛乳頭細胞増殖作用はＭＴＴアッセイを用いて測定した。培養終了後、培地を抜き、終濃度０．４ｍｇ／ｍＬで無血清のＤＭＥＭに溶解した３−（４，５−ジメチル-チアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロマイド（ＭＴＴ、株式会社同仁化学研究所製）を各ウェルに１００μＬ添加した。２時間培養した後に、細胞内に生成したブルーホルマザンを２−プロパノール１００μＬで抽出した。抽出後、波長５７０ｎｍにおける吸光度を測定した。同時に濁度として波長６５０ｎｍにおける吸光度を測定し、両者の差をもってブルーホルマザン生成量とした。

毛乳頭細胞増殖率の計算方法は、以下のとおりである。結果を表１９に示した。
毛乳頭細胞増殖率（％）＝Ａ／Ｂ×１００
ただし、前記式中、Ａは、被験試料添加時のブルーホルマザン生成量、Ｂは、被験試料無添加時のブルーホルマザン生成量をそれぞれ表す。

表１９の結果から、ハイビスカスの抽出物が、毛乳頭細胞増殖作用を有することが認められた。

本発明のヒアルロニダーゼ活性阻害剤、過酸化水素消去剤、美白剤、抗老化剤、及び育毛剤は、安全性に優れ日常的に摂取可能であり、かつ安価でありながら、優れたヒアルロニダーゼ活性阻害作用、過酸化水素消去作用、Ｂ１６メラノーマ細胞に対するメラニン産生抑制作用、エンドセリン−１ｍＲＮＡ発現上昇抑制作用、幹細胞増殖因子ｍＲＮＡ発現上昇抑制作用、塩基性線維芽細胞増殖因子ｍＲＮＡ発現上昇抑制作用、プロオピオメラノコルチンｍＲＮＡ発現上昇抑制作用、表皮ヒアルロン酸産生促進作用、グルタチオン産生促進作用、セリンパルミトイルトランスフェラーゼｍＲＮＡ発現促進作用、メイラード反応阻害作用、最終糖化産物形成抑制作用、最終糖化産物分解促進作用、クローディン−１産生促進作用試験、オクルディン産生促進作用、ヒト皮膚三次元モデルにおける表皮タイトジャンクション構成蛋白質産生促進作用、皮膚バリア機能低下抑制作用、テストステロン５α−リダクターゼ活性阻害作用、及び毛乳頭細胞増殖作用の少なくともいずれかを有するので、化粧料、飲食品の成分や、研究用の試薬として好適に利用可能である。

Claims (3)

1. ハイビスカスの抽出物を有効成分として含有し、角化細胞におけるヒアルロン酸産生促進作用を有することを特徴とする表皮ヒアルロン酸産生促進剤。
2. ハイビスカスの花部の抽出物である請求項１に記載の表皮ヒアルロン酸産生促進剤。
3. ハイビスカスの花部の水抽出物、親水性有機溶媒抽出物、又は水と親水性溶媒との混合溶媒抽出物である請求項１及び２のいずれかに記載の表皮ヒアルロン酸産生促進剤。

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