JP2003503705A - メラニン形成に影響を与える化合物に関するスクリーニング方法 - Google Patents

メラニン形成に影響を与える化合物に関するスクリーニング方法

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Abstract

(57)【要約】 生物、細胞、または細胞不含系において、メラニン形成およびPタンパク質の機能に影響を与える化合物に関するスクリーニング方法が提供される。本発明はさらに、動物およびヒトメラノサイトおよびメラノサイト由来細胞において、メラニン合成を減少させるまたは増加させるための、こうした化合物の薬理学的および美容的使用に関する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 発明の分野： 本発明は、細胞生物学、薬剤発見、および化粧品の分野にある。Pタンパク質
機能に影響を与えることが可能な化合物をスクリーニングする方法が提供される
。本発明はさらに、こうした化合物を、ヒトおよび動物細胞におけるメラニン含
量の美容的および療法的減少または増加のために用いる方法に関する。
【０００２】 発明の背景： メラニンは、植物および動物に見られる黒っぽい色素であり、紫外線照射に対
し保護し、そして動物の皮膚、目、体毛（hair）、および柔毛（fur）の装飾を
提供する（Riley， P．A．， 1997， Int． J． Biochem． Cell Biol．
11：1235−39に概説される）。2つの異なる種類のメラニン：茶／黒ユーメラ
ニンおよび黄／赤フェオメラニンがある。メラノサイトは、メラニンを産生する
よう特殊化した、上皮細胞である。洗練された細胞間情報伝達系は、個々のメラ
ノサイトがユーメラニンまたはフェオメラニンを産生するであろうかどうかを決
定する（Brilliant， M．H．およびBarsh， G．S．， 1998， The Pigment
ary System： Physiology and Pathophysiology，中， 217−29， Oxford
University， ニューヨーク（Nordlund， J．J．ら監修）に概説される）。
【０００３】 メラノサイトは、メラノソームと呼ばれる特殊化細胞小器官の内部でメラニン
を合成する（Orlow， S．J．， 1998， The Pigmentary System： Physio
logy and Pathophysiology，中， 97−106， Oxford University， ニュ
ーヨーク（Nordlund， J．J．ら監修）に概説される）。メラノソームは、2種
類の小胞の融合により、形成される。小胞の1種類は、プレメラノソームと呼ば
れ、滑面小胞体またはトランス−ゴルジ網のいずれかに直接由来するようである
。もう1種類の小胞は、トランス−ゴルジ網に由来する。これらの種類の小胞は
、各々、その機能に必要なメラノソームに、タンパク質を提供する。
【０００４】 メラニン産生における欠損は、色素沈着不全、例えば白色症を生じる。マウス
の異常色素沈着系統の遺伝的解析により、メラニンの正常産生に必要な60を超え
る遺伝子が同定されてきている（Silves， W．K．， 1979， The Coat Col
ors of Mice： A Model for Mammalian Gene Action and Interactio
n， Springer−Verlag， バーゼルに概説される）。これらの遺伝子の1つは、
酵素、チロシナーゼをコードする。チロシナーゼタンパク質は、メラニン産生の
いくつかの工程を触媒する、多機能酵素であり；チロシナーゼ活性には、チロシ
ンをジヒドロキシフェニルアラニン（DOPA）に、そしてDOPAをドーパキノンに変
換する律速工程（Lerner， A．B．およびFitzpatrick， T．B．， 1950， P
hysiol． Rev． 30： 91−126に概説される）と共に、5，6−ジヒドロキシイ
ンドールの5，6−インドールキノンへの酸化（KornerおよびPawelek， 1982，
Science 217：1163−1165）が含まれる。チロシナーゼ活性を欠くヒトもそし
てマウスも、共に、重症型の白色症を患う。
【０００５】 2つのチロシン関連タンパク質（マウスbrown遺伝子にコードされるTRP−1、お
よびマウスslaty遺伝子にコードされるTRP−2）もまた、メラニン形成に重要で
ある（Hearing， V．J．， 1993， Am． J． Hum． Genet． 52：1−7に
概説される）。各TRPタンパク質は、チロシナーゼと、そして互いに、約40％の
配列同一性を共有する。これらの3つの酵素（チロシナーゼ、TRP−1およびTRP−
2）は各々、1つの膜貫通ドメインを含むと予測される。これらは、一緒に、メラ
ノソーム膜と結合する高分子量複合体を形成する（Orlow， S．J．ら， 1994
， J． Invest． Dermatol． 103：196−201）。
【０００６】 メラニン産生に重要である別のタンパク質は、Pタンパク質である。マウスに
おいて、該タンパク質は、ピンク目希釈（pink−eye dilution）（p）遺伝子の
産物である。ヒトにおいて、該タンパク質は、P遺伝子の産物である。Pタンパク
質機能を欠くヒトは、II型目・皮膚白色症を患う（Durham−Pierre， D．ら，
1994， Nature Genet． 7：176−79）。p−ヌルマウスは、野生型マウスよ
り有意に少ないメラニンを産生する（Silvers、上記）。野生型ヒトP遺伝子は、
p−ヌルマウスメラノサイトの過少色素沈着表現型を補足することが可能である
が、突然変異ヒトP遺伝子は不可能である（Sviderskaya， E．V．ら， 1997，
J． Invest． Dermatol． 108：30−34）。Pタンパク質は、ユーメラニン
の産生に必要とされるが、フェオメラニンの産生に必要とされないようである（
Lamoreux， M． L．ら， 1995， Pigment Cell Res． 8：263−70）。
【０００７】 Pタンパク質は、12の膜貫通ドメインを含むと予測される（Gardner， J．M．
ら， 1992， Science 257：1121−24）。この予測と一致し、Pタンパク質は
、メラノソームの表面と結合することが見出され（Rosemblat， S．ら， 1994
， Proc． Natl． Acad． Sci． USA 91：12071−75）、これは、上述の
高分子量チロシナーゼ含有複合体が結合すると考えられるのと同じ膜表面である
。
【０００８】 何人かの著者は、Pタンパク質が、チロシナーゼ活性によりメラニンに変換さ
れるメラノソームにチロシンを押出すことにより、チロシン輸送体として作用す
ると示唆してきている（例えば、Rinchik， E．M．ら， 1993， Nature 361
：72−76を参照されたい）。まず、Pタンパク質は、原核生物に見られる輸送タ
ンパク質にいくつかの類似点を持つ。第二に、培養野生型マウスメラノサイトよ
り、はるかに少ないメラニンを産生する、培養p−ヌル突然変異マウスメラノサ
イトは、細胞の増殖培地に、高濃度のチロシンが添加された際、増加したレベル
のメラニンを産生する（Sviderskaya， E．V．ら、上記； Rosemblat， S．
ら， 1998， Exp． Cell Res． 239：344−52）。しかし、この示唆を否定
し、メラノソームによるチロシン取り込みは、p−ヌルおよび野生型メラノサイ
トで、実質的に同一であることが見出されてきている（Gahl， W． A．ら，
1995， Pigment Cell Res． 8：229−233）。本観察により、他の著者らは
、Pタンパク質が、メラニン形成に必要な何らかの他の小分子のメラノソームへ
の輸送に必要であると仮定している（Brilliant， M．H．およびBarsh， G．S
．， 1998、上記に要約）。
【０００９】 他の著者らは、Pタンパク質が、メラノソームにおいて、構造的役割を果たす
と推測している（Lamoreux， M．L．ら、上記）。メラノソームの完全性は、P
タンパク質を欠く細胞で損なわれる。チロシナーゼ活性、そしてしたがってメラ
ニン産生は、これらの欠損メラノソームでは非常に減少する。特に、p−ヌルマ
ウス由来の皮膚および目のメラノサイト抽出物におけるチロシナーゼ活性レベル
は、野生型マウス由来のこうした抽出物より低い（Lamoreux， M．L．ら、上記
； Chiu， E．ら， 1993， Exp． Eye Res． 57：301−05）。さらに、
チロシナーゼ、TRP−1およびTRP−2タンパク質のレベルは、野生型抽出物におけ
るより、p−ヌル組織抽出物において、より低い（Rosemblat， S．ら， 1998
、上記）。さらに、野生型抽出物におけるよりp−ヌル組織抽出物において、よ
り高い割合のチロシナーゼ、TRP−1、およびTRP−2タンパク質が、高分子量複合
体の一部としてよりも、単量体型で見られ（Lamoreux， M．Lら、上記； Chiu
， E．ら、上記）、そしてチロシナーゼ、TRP−1、およびTRP−2はすべて、p−
ヌルマウスの目の組織で、迅速に分解される（Chiu， E．ら、上記）。最後に
、何人かの著者は、p−ヌル組織および培養メラノサイトにおけるメラノソーム
が異常であることを観察している（Russell， E．S．， 1949， Genetics 3
4：146−66； Rosemblat， S．ら， 1998、上記）。マウス目由来のp−突然
変異メラノサイトでは、非常にわずかなメラノソームしか観察されない（Orlow
， S．J．およびBrilliant， M．H．， 1999， Exp． Eye Res． 68：14
7−54）。培養突然変異メラノサイトでは、正常数より多いメラノソームが存在
するが、これらは野生型メラノサイトに見られるより小さい（Rosemblat， S．
ら， 1998、上記）。
【００１０】 したがって、Pタンパク質は、皮膚、体毛および目における正常量のメラニン
の産生に必須であることが知られているが、本過程におけるPタンパク質の機能
は、とらえどころがないままである。その代わり、研究者らは、阻害研究のため
、他の分子標的に目を向けてきた。例えば、チロシナーゼのよく性質決定された
活性、生化学解析に対するなじみやすさ、およびメラニン形成におけるきわめて
重要な役割が、チロシナーゼを阻害研究のための魅力的な標的としてきた（例え
ば、Tasaka， K．ら， 1998， Meth． Find． Exp． Clin． Pharmacol
． 20：99−109； Iida， K．ら， 1995， Planta Med． 61：425−28；
Reish， O．ら， 1995， Am． J． Hum． Genet． 57：127−32； Sh
irota， S．ら， 1994， Biol． Pharm． Bull． 17：266−69； Kameya
ma， K．ら， 1989， Differentiation 42：28−36を参照されたい）。研究
者らは、また、メラニン形成に対する細胞間情報伝達分子の影響にも焦点を置い
てきた（例えば、Furumura， M．ら， 1998， Proc． Natl． Acad． Sci
． USA 95：7374−78； Sakai， C．ら， 1997， EMBO J． 16：3544−
52； McLeod， S．D．ら， 1995， J． Endocrinol． 146：439−47を参
照されたい） 発明の概要： 本発明は、メラニン形成細胞におけるメラニン形成を阻害するまたは増加させ
る化合物の同定のための新規スクリーニングを提供する。これらのアッセイの発
展は、部分的に、メラニン形成を阻害するいくつかの化合物が、メラニン合成に
おける重要な酵素であるチロシナーゼの誤った局在を引き起こすことにより、阻
害するという発見に基づく。
【００１１】 Pタンパク質は、皮膚、体毛および／または目の色素沈着を減少させるまたは
増加させる化合物および薬剤のきわめて重要な標的である。したがって、1つの
側面において、本発明は、初めて、部分的に、Pタンパク質機能がチロシナーゼ
および他のメラノソームタンパク質の適切な細胞局在に必要とされ、そしてメラ
ニン形成細胞種、例えばメラノサイトおよび黒色腫細胞における完全なチロシナ
ーゼ活性およびメラニン形成両方に必要とされるという発見に基づき、Pタンパ
ク質機能を阻害するまたは亢進する化合物に関するスクリーニングを提供する。
【００１２】 野生型メラニン形成細胞は、チロシナーゼを主に、メラノソームに標的化する
。ある程度のチロシナーゼはまた、これらの細胞から分泌される。Pタンパク質
が損なわれたメラニン形成細胞は、チロシナーゼを誤って局在させる。これらは
、野生型メラニン形成細胞より、有意に多くのチロシナーゼを分泌し、そしてま
た、非メラノソーム小胞に、チロシナーゼを含む。メラニン形成細胞から分泌さ
れるチロシナーゼは、これらの細胞が正常なまたは阻害されたPタンパク質機能
を有するかどうかに関わらず、増殖またはインキュベーション培地において、酵
素的に活性であり、該培地において、チロシンをメラニンに変換することが可能
である。
【００１３】 1つの側面において、本発明は、メラニン形成細胞において、メラニン形成を
阻害する化合物に関するスクリーニング方法であって、これらの細胞を、試験し
ようとする化合物を含む培地中でインキュベーションし、そしてこれらの細胞中
のチロシナーゼの細胞局在における変化を引き起こす化合物を同定することを含
む、前記方法を提供する。チロシナーゼの誤った局在は、メラニン形成の阻害を
示す可能性がある。
【００１４】 さらなる側面において、本発明は、メラニン形成細胞において、メラニン形成
を増加させる化合物に関するスクリーニング方法であって、メラニン形成細胞を
、試験しようとする化合物を含む培地中でインキュベーションし、そして細胞に
保持されるチロシナーゼの量に比較した、細胞により分泌されるチロシナーゼの
量における減少を引き起こす化合物を同定し、分泌されるチロシナーゼの量にお
けるこうした相対的減少が、該化合物がメラニン形成を増加させる化合物の候補
であることを示す、前記方法を提供する。
【００１５】 本発明の別の側面は、部分的に、非メラニン形成細胞を、異種性チロシナーゼ
をコードする遺伝子でトランスフェクションすることにより、活性チロシナーゼ
を産生するよう作成することが可能であるという発見に基づく。これらの細胞の
チロシナーゼ活性は、異種性Pタンパク質をコードする遺伝子でのコトランスフ
ェクションにより、劇的に増加する。これらの細胞における最大チロシナーゼ活
性は、したがって、Pタンパク質機能に依存する。異種性チロシナーゼおよび異
種性Pタンパク質を両方発現している細胞を、Pタンパク質機能を阻害する薬剤、
例えばイミプラミンで処理すると、これらの細胞のチロシナーゼ活性は、異種性
チロシナーゼのみを発現している細胞のものに減少する。イミプラミンおよびP
タンパク質機能を阻害する他の薬剤は、別の状況では、異種性チロシナーゼを発
現するが、異種性Pタンパク質を発現しない細胞におけるチロシナーゼ活性に影
響を与えない。
【００１６】 したがって、さらなる側面において、本発明は、通常、チロシナーゼおよび／
またはPタンパク質を発現しない細胞において、Pタンパク質機能に影響を与える
（例えば、該機能を阻害するまたは増加させる）化合物に関するスクリーニング
方法であって、これらの細胞が、チロシナーゼおよびPタンパク質を両方発現す
るように操作し、そして該細胞を試験しようとする化合物で処理することを含む
、前記方法を提供する。これらの細胞のチロシナーゼ活性を測定する。これらの
細胞のチロシナーゼ活性に影響を与える（例えば、該機能を阻害するまたは増加
させる）が、チロシナーゼのみを発現している細胞のチロシナーゼ活性に影響を
与えない化合物は、Pタンパク質依存方式で、チロシナーゼに影響を与える化合
物と同定される。
【００１７】 さらなる側面において、本発明は、Pタンパク質機能に影響を与えるまたは該
機能を模倣することが知られる化学的化合物のモデルを作成するための方法を提
供する。モデル化化合物の類似体は、Pタンパク質機能に影響を与える能力に関
し、選択しまたは設計し、そしてスクリーニングする。Pタンパク質機能に影響
を与えるまたは該機能を模倣することが知られる化合物の類似体を用いることに
より、本発明の方法を用い、Pタンパク質機能に影響を与えるまたは該機能を模
倣する、新規のよりよい化合物を発見することが可能である。
【００１８】 さらなる側面において、本発明は、医薬または化粧品組成物において、Pタン
パク質機能に影響を与えるまたは該機能を模倣する化合物を用い、それにより、
メラニンの産生（過少産生または過剰産生）を伴う疾患、異常、または障害を治
療する方法を提供する。
【００１９】 発明の詳細な説明： 本発明は、部分的に、メラニン形成細胞にチロシナーゼの誤った局在（例えば
、分泌されるチロシナーゼ量または非メラノソーム小胞に見られるチロシナーゼ
量の増加）を引き起こす化合物がまた、メラニン形成を阻害するという発見に基
づく。本発明の目的のため、「メラニン形成細胞」という用語は、色素沈着メラ
ノソームを含む細胞と定義される（例えば、メラノサイト細胞および黒色腫細胞
）。メラニン形成細胞には、例えば、異種性メラノソームタンパク質を発現する
メラニン形成細胞を含んでもよい。例えば、好ましい態様において、マウスメラ
ニン形成細胞におけるPタンパク質遺伝子、チロシナーゼ遺伝子、TRP−1遺伝子
、および／またはTRP−2遺伝子の単数または複数のコード配列を、突然変異また
は欠失させてもよく、そして該細胞を操作し、ヒトPタンパク質遺伝子、チロシ
ナーゼ遺伝子、TRP−1遺伝子、および／またはTRP−2遺伝子の対応するコード配
列を代わりに発現させてもよい。
【００２０】 本発明の別の側面は、部分的に、Pタンパク質が、主に、メラノソームの膜に
、チロシナーゼを正しく局在化させるのに必要であるという発見に基づく。 本発明のさらに別の側面は、Pタンパク質機能を阻害する化合物で処理したメ
ラノサイトが、細胞内メラニンの蓄積量を減少させ、そして増殖培地中に増加し
た量のチロシナーゼを分泌するという発見に基づく。
【００２１】 本発明のさらに別の側面は、Pタンパク質の存在下で、培養細胞中のチロシナ
ーゼタンパク質の酵素的活性が増大するという発見に関する。 したがって、本発明は、メラニン形成を阻害する化合物に関し、スクリーニン
グする新規方法を提供する。本発明の方法を用いて同定された化合物は、メラニ
ンの過少産生または過剰産生に関連する疾患および美容上の欠点を治療するのに
有用である。
【００２２】 別の側面において、本発明は、正常Pタンパク質機能を持つ野生型メラニン形
成細胞が、ある程度のチロシナーゼを分泌するという発見、およびPタンパク質
依存方式で、チロシナーゼの分泌を増加させる化合物はまた、メラニン形成を阻
害するという発見に関する。したがって、本発明は、Pタンパク質の機能を増加
させることにより、メラニン形成を増加させる化合物に関する新規スクリーニン
グ方法を提供する。本適用の目的のため、Pタンパク質機能を増加させる化合物
およびPタンパク質機能を減少させる化合物は、本明細書において、集合的に、
「Pタンパク質機能に影響を与える化合物」と称される。本発明のさらに別の側
面は、Pタンパク質機能を模倣することにより、メラニン形成を増加させる化合
物に関するスクリーニング方法である。本発明の目的のため、「Pタンパク質機
能を模倣する化合物」は、Pタンパク質ではないが、それでも、Pタンパク質を含
まないメラニン形成細胞に投与され、または該細胞と共にインキュベーションさ
れた際、メラニン形成膜に対する、チロシナーゼの正しい標的化を、少なくとも
部分的に回復するよう作用する化合物である。Pタンパク質を含まないメラニン
形成細胞は、Pタンパク質転写物を発現しない細胞（例えば、本明細書に記載さ
れるmelan−p細胞）であってもよいし、または機能するPタンパク質遺伝子産物
を発現しないメラニン形成細胞であってもよい。
【００２３】 1．メラニン形成の阻害剤または誘導剤に関するスクリーニング方法； 1．1 メラニン形成細胞を用いた、メラニン形成の阻害剤に関するスクリー ニング方法； メラニン形成細胞が、頑強なメラニン形成に従事するためには、該細胞は、そ
のチロシナーゼを主に、メラノソーム膜に標的化しなければならない。その結果
、1つの側面において、本発明の方法は、メラニン形成細胞にチロシナーゼの謝
った局在を引き起こす化合物に関するスクリーニングを含む。Pタンパク質機能
は、チロシナーゼの正しい細胞局在に必要である。したがって、別の側面におい
て、本発明の方法は、Pタンパク質機能を阻害し、それにより、メラニン形成細
胞にチロシナーゼの誤った局在を引き起こす化合物に関するスクリーニングを含
む。こうした方法は、部分的に、Pタンパク質機能を除去するよう、遺伝的に改
変されている培養メラノサイトは、野生型メラノサイトより、増殖培地中に、有
意により多くのチロシナーゼを分泌するという発見に基づく。Pタンパク質機能
を減少させるまたは除去する化合物、例えばイミプラミンは、同じ影響を有する
であろう。したがって、試験化合物で処理された細胞による、チロシナーゼの細
胞の謝った局在は、試験化合物がメラニン形成を阻害することを示す。分泌を生
じるチロシナーゼの誤った局在は、まず、培地または細胞におけるチロシナーゼ
活性のレベル、あるいは、培地または細胞におけるチロシナーゼタンパク質のレ
ベルをアッセイすることにより、検出することが可能である。チロシナーゼの分
泌の増加、または細胞内チロシナーゼの減少を引き起こす試験化合物は、Pタン
パク質機能を阻害することにより、メラニン形成を阻害する化合物の候補である
。以下に、より完全に記載されるように、こうした候補化合物はさらに、メラニ
ン形成に対するその影響、および／またはPタンパク質の存在下または非存在下
両方でのその影響に関し、調べてもよい。候補化合物の影響が、Pタンパク質の
存在に依存するならば、該化合物はPタンパク質の機能を阻害する。
【００２４】 培地中の高レベルのチロシナーゼの存在下で、Pタンパク質欠損メラノサイト
を増殖させると、部分的に、Pタンパク質欠損を救出することが可能であるため
、培地中の少量のチロシン、例えば0．01−0．05μM チロシン、より好ましく
は、0．014−0．03μM チロシンの存在下で、メラニン形成の阻害剤に関するス
クリーニングを行うことが好ましいが、必要ではない。
【００２５】 1．1．1 チロシナーゼ活性に関するアッセイを用いる、メラニン形成の
阻害剤に関するスクリーニング方法； in vitro培養で増殖させた野生型メラニン形成細胞は、in vivoでそうであ
るように、メラノソームの内部でメラニンを合成するであろう。これらの培養細
胞において、チロシナーゼは、主に、メラノソーム膜に見られるが、ある程度の
チロシナーゼはまた、分泌される。メラノソーム膜に見られるチロシナーゼは、
C−末端膜貫通ドメインにより、正しい位置に保持され、そしてその活性部位が
メラノソーム内腔に配置される。対照的に、Pタンパク質における突然変異また
はPタンパク質機能を阻害する化合物いずれかを通じ、メラニン形成に関し阻害
されたメラニン形成細胞において、チロシナーゼは、誤って局在化されるであろ
う。細胞のチロシナーゼの有意に多い割合が、細胞から、増殖またはインキュベ
ーション培地中に分泌される。さらに、分泌されたチロシナーゼポリペプチドは
、C−末端膜アンカーを欠くため、野生型細胞で見られるものより、短いだろう
。分泌されたチロシナーゼはしかし、増殖またはインキュベーション培地中で活
性であり、ここで、細胞外チロシンからメラニンを合成することが可能である。
その結果、メラニン形成に関し阻害されているメラニン形成細胞由来のチロシン
含有増殖またはインキュベーション培地は、黒っぽくなるであろう。培地中のチ
ロシン濃度が高ければ高いほど、培地は黒っぽくなり、そして培地中のチロシン
濃度が高ければ高いほど、培地はより速く黒っぽくなるであろう。メラニン形成
に関し、阻害されないメラニン形成細胞は、有意により少ないチロシナーゼを分
泌するため、培養されるチロシン含有増殖またはインキュベーション培地は、そ
れほど黒っぽくならないであろう。
【００２６】 本発見を、メラニン形成を阻害するまたは調節する化合物を同定する、新規ス
クリーニング方法で用いてもよい。メラニン細胞を、培養中で増殖させ、または
チロシンを含む培地中でインキュベーションする。細胞を試験化合物で処理する
。試験化合物が、チロシナーゼの誤った局在および処理細胞からの分泌を引き起
こすならば、培地中のチロシンは、メラニンに変換され、培地を黒っぽくするで
あろう。同様の条件下であるが、試験化合物を含まず増殖させたまたはインキュ
ベーションしたメラニン細胞の培地（コントロール培地）の色に、培地の色を比
較するアッセイを用いる。試験化合物で処理した細胞の培地が、コントロール培
地より黒っぽくなるならば、試験化合物は、メラニン形成を阻害する化合物の候
補と同定される。
【００２７】 より典型的には、少なくとも半定量的データを得るため、チロシナーゼ活性に
関するアッセイ前に、細胞由来の培地をまず、ろ過し、遠心分離し、および／ま
たは透析する。これらの種類の処理は、潜在的に混同される要因、例えば基質に
関し競合する可能性があるチロシナーゼを含む細胞または特定の物質（例えばメ
ラノソームまたは分断された膜）を除去し、および／または標識基質と競合する
可能性がある、過剰な遊離チロシンを除去する。いかなるものでもよい、いくつ
かのチロシナーゼ測定代替法を行ってもよく、例えば、限定されるわけではない
が、チロシンのジヒドロキシフェニルアラニン（DOPA）への、DOPAのドーパキノ
ンへの変換、および5，6−ジヒドロキシインドールの5，6−インドールキノンへ
の酸化を含む、酵素的チロシナーゼ活性のいずれを用いることによってもよい。
例えば、チロシナーゼのチロシン加水分解酵素活性に関しアッセイする際、チロ
シンに加え、チロシナーゼの非チロシンまたは改変チロシン基質を用いてもよい
。1つの側面において、メラニン形成細胞を、試験化合物を含む培養中で、増殖
させまたはインキュベーションする。培地の前処理後、チロシナーゼの非チロシ
ンまたは改変チロシン基質を増殖またはインキュベーション培地に添加する。基
質は、天然産物でも合成的に産生されてもよい、チロシンの同族体（homolog）
、類似体、または誘導体であってもよい。培地中のチロシナーゼ活性は、基質を
その産物に変換する。
【００２８】 その後、産物の存在および／または基質の非存在を検出するアッセイを用いる
。1つの限定されないアッセイは、比色アッセイである。比色アッセイを用いる
、メラニン形成を阻害する化合物に関するスクリーニング方法において、チロシ
ナーゼにより作用されると、色が変化する基質を選択する。すなわち、基質によ
り光吸収される波長は、チロシナーゼにより触媒される反応の産物に光吸収され
る波長と異なる。基質によりおよび／または産物により光吸収される波長は、ス
ペクトルの可視光範囲、赤外範囲、または紫外範囲であってもよい。基質濃度、
インキュベーション時間、および他の反応条件は、色変化の速度および／または
強度が、細胞の増殖またはインキュベーション培地におけるチロシナーゼ活性の
量に比例するように選択することが可能である。色変化は、直接の観察により検
出し、または装置、例えば分光光度計により測定し、そして例えば変化する量の
産物を用いて調製した標準曲線に対し、比較してもよい。
【００２９】 比色アッセイの例は、DOPA酸化酵素アッセイである。本アッセイを用いる、メ
ラニン形成を阻害する化合物に関するスクリーニングの1つの方法において、メ
ラニン形成を阻害する能力に関し、試験しようとする化合物を、メラニン形成細
胞の増殖またはインキュベーション培地に添加する。培地のろ過、遠心分離およ
び／または透析後、そうでなければ、チロシナーゼがL−DOPAからドーパクロム
の形成を触媒するのを可能にするであろう条件下で、L−DOPAを添加する。好ま
しいが制限されない態様において、培地中のL−DOPAの最終濃度は、約5 x 10- 3 Mであり、pHは約7．4であり、そして温度は約25℃である。475 nmでの培地
の吸光度の増加（同様の条件下であるが、試験化合物を含まず増殖させた同様の
細胞由来の培地の475 nmの吸光度と比較したもの）は、培地中のチロシナーゼ
による、ドーパクロムの形成を示し、そしてしたがって、試験化合物によるメラ
ニン形成の阻害を示す。
【００３０】 あるいは、ドーパクロムが、可視範囲で光を吸収するため、ドーパクロムの存
在、およびしたがって、メラニン形成の阻害は、分光光度計の補助なしに、反応
の直接の検査により、決定してもよい。
【００３１】 別のアッセイは、放射測定アッセイである。本アッセイを用いる、メラニン形
成を阻害する化合物に関するスクリーニングの代替法において、基質を放射能標
識し、そしてアッセイしようとする増殖またはインキュベーション培地に添加す
る。チロシナーゼが培地に存在する場合、該酵素は、基質を標識産物および非標
識産物に切断する。放射能産物に変換された放射能基質の量を測定する。基質濃
度、インキュベーション時間、インキュベーション温度、および他の反応条件は
、産生される放射能化合物の量が、アッセイされる増殖またはインキュベーショ
ン培地におけるチロシナーゼの量に比例するように選択することが可能である。
試験化合物で処理した細胞由来の培地における標識産物の量が、同様の条件下で
あるが、試験化合物を含まず増殖させた同様の細胞の培地におけるより多い場合
、試験化合物がメラニン形成を阻害する化合物の候補であることを示す。
【００３２】 本種類のアッセイの例は、放射測定チロシン加水分解酵素アッセイである。本
アッセイにおいて、チロシナーゼ酵素のチロシン加水分解酵素活性の結果として
、［3H］チロシンから放出される［3H］H2Oの量を測定する。本アッセイを用い
る、メラニン形成を阻害する化合物に関しスクリーニングする1つの方法におい
て、メラニン形成細胞由来の培地を採取し、そして細胞を除去する。さらに、培
地をアッセイ前に透析してもよい。アッセイには、1．5μCi［3H］チロシンを培
地に添加し、そして酵素活性に適した温度で、定義された時間、インキュベーシ
ョンする。未反応［3H］チロシンは、0．1 Mクエン酸中の10％（w／v）活性炭
上に吸着させ、その後、50％（w／v）Dowex樹脂溶液で処理することにより、培
地から除去する。培地をシンチラントと混合し、そしてベータ−カウンター中で
計測する。同様の条件下であるが、試験化合物を含まず増殖させた同様の細胞の
培地における［3H］H2Oレベルに比較した、試験化合物で処理した細胞の培地に
おける［3H］H2Oレベルの有意な増加は、試験化合物が、メラニン形成を阻害す
る化合物の候補であることを示す。
【００３３】 本種類のアッセイのさらに別の例は、放射測定メラニン合成アッセイである。
本アッセイにおいて、［14C］メラニンに取り込まれた［14C］チロシンまたは［ 14 C］DOPAの量を測定する。本アッセイを用いる、メラニン形成を阻害する化合
物に関するスクリーニング方法の限定されない例において、メラニン形成細胞を
、試験化合物を含む培地中で、増殖させまたはインキュベーションする。培地を
採取し、1μCi［14C］チロシンを添加し、そして適切な温度で4時間、インキュ
ベーションする。氷冷5％ TCA（w／v）で反応を終結させ、そして混合物をボル
テックスし、そして24時間、凍結させる。その後、混合物を融解し、そして4℃
で、1000 gで15分間遠心分離する。ペレットを氷冷5％ TCA（w／v）に再懸濁
する。本工程を2回繰り返す。［14C］メラニンを含む最終ペレットを、Soluene
（登録商標）−350（Packard Instrument Company、コネティカット州メリデ
ン）に4時間可溶化し、シンチラントと混合し、そして計測する。あるいは、ペ
レットをろ紙上に収集し、そして計測してもよい。同様の条件下であるが、試験
化合物を含まず増殖させた同様の細胞の培地における［14C］メラニンレベルに
比較した、試験化合物で処理した細胞の培地における［14C］メラニンレベルの
有意な増加は、試験化合物が、メラニン形成を阻害する化合物の候補であること
を示す。
【００３４】 別のアッセイは蛍光アッセイである。本アッセイにおいて、基質および／また
はその産物は、蛍光性である。基質により吸収されおよび／または放出される光
の波長は、産物により吸収されおよび／または放出される光の波長と異なる。本
アッセイを用いる、メラニン形成を阻害する化合物に関するスクリーニング方法
の限定されない例において、メラニン形成細胞を、試験化合物の存在下または非
存在下で、培養中で増殖させる。増殖またはインキュベーション期間後、培地を
除去し、チロシナーゼ基質を添加し、そして蛍光測定装置を用い、増殖またはイ
ンキュベーション培地の蛍光を測定する。基質濃度、インキュベーション時間、
インキュベーション温度、および他の反応条件は、蛍光の変化が、解析される培
地におけるチロシナーゼのレベルに比例するように選択することが可能である。
試験化合物で処理した細胞由来の培地における蛍光レベルが、同様の条件下であ
るが、試験化合物を含まず増殖させた同様の細胞の培地と比較し、有意に異なる
場合、試験化合物がメラニン形成を阻害する化合物の候補であることを示す。
【００３５】 別の種類のアッセイは、反応産物の沈殿を伴う。本アッセイを用いる、メラニ
ン形成を阻害する化合物に関するスクリーニング方法の例において、チロシナー
ゼの基質を、チロシナーゼ活性を促進する条件下で、採取された増殖またはイン
キュベーション培地とインキュベーションする。基質は、チロシナーゼにより、
作用され、沈殿することが可能な反応産物を産生する。反応産物を沈殿させる。
反応産物は、例えば、培地の温度を増加させるまたは減少させる、培地のpHを増
加させるまたは減少させる、培地のイオン強度または塩濃度を増加させるまたは
減少させる、あるいは別に培地を適切に改変することにより、あるいは反応産物
が不溶性である場合、遠心分離により、培地から沈殿させてもよい。基質濃度、
インキュベーション時間、インキュベーション温度、および他の反応条件は、沈
殿反応産物の量が、解析される培地におけるチロシナーゼ活性のレベルに比例す
るように選択することが可能である。試験化合物で処理した細胞の培地から沈殿
する反応産物の量が、同様の条件下であるが、試験化合物を含まず増殖させた同
様の細胞の培地から沈殿する反応産物の量と比較し、有意に増加する場合、試験
化合物がメラニン形成を阻害する化合物の候補であることを示す。
【００３６】 1．1．2． チロシナーゼタンパク質に関するアッセイを用いる、メラニン
形成の阻害剤に関するスクリーニング方法； 先行するスクリーニング方法は、チロシナーゼ活性（該タンパク質の酵素的活
性）に関するアッセイを用い、メラニン形成の阻害剤を同定するよう働く。本発
明はさらに、細胞外または細胞内チロシナーゼタンパク質レベルいずれかに関す
るアッセイを用い、メラニン形成の阻害剤をスクリーニングする方法を提供する
。上に説明されるように、チロシナーゼは、主に、メラニン形成細胞のメラノソ
ーム膜に局在する。チロシナーゼの誤った局在を引き起こす化合物は、メラニン
形成を阻害するよう働く。以下のスクリーニング方法において、チロシナーゼタ
ンパク質レベルおよび／または位置を決定するためのアッセイが用いられる。こ
れは、当該技術に知られるタンパク質検出の標準的技術のいずれを用い、行って
もよい。本明細書に使用されるタンパク質検出アッセイは、本明細書に完全に援
用される、HarlowおよびLane（Harlow， E．およびLane， D．， 1988， An
tibodies： A Laboratory Manual， Cold Spring Harbor Laboratory P
ress， ニューヨーク州コールドスプリングハーバー）に記載されるものであっ
てもよい。これらのアッセイには、限定されるわけではないが、ウェスタンブロ
ット、固相放射イムノアッセイ、in situハイブリダイゼーション、および免疫
沈降を含む、免疫学的アッセイが含まれる。抗−チロシナーゼ抗体は、当該技術
分野に知られ、そして公知の技術を用い、新規抗−チロシナーゼ抗体を生成して
もよい。同上。
【００３７】 メラニン形成を阻害する化合物に関する限定されないスクリーニング方法にお
いて、メラニン形成細胞を、試験化合物を含む培地中で増殖させ、またはインキ
ュベーションする。培地中のチロシナーゼの存在、濃度、または量を、上述のよ
うなタンパク質検出アッセイを用い、決定する。処理細胞に、同様の条件下であ
るが、試験化合物を含まず増殖させまたはインキュベーションした同様の細胞よ
り、多くのチロシナーゼを分泌させる試験化合物は、メラニン形成を阻害する化
合物の候補である。
【００３８】 本スクリーニングに用いてもよい別の種類のアッセイは、チロシナーゼタンパ
ク質の細胞局在を決定する。野生型メラニン形成細胞では、大部分のチロシナー
ゼはメラノソーム膜に標的化され、一方、ある程度のチロシナーゼは分泌される
。メラニン形成を阻害する突然変異または化合物（例えば、Pタンパク質機能を
阻害する突然変異または化合物）は、より多い量のチロシナーゼを培地に分泌さ
せるか、または非メラノソーム小胞に誤って局在させることが可能である。これ
らの非メラノソーム小胞は、細胞下分画技術を用い、メラノソームから分離する
ことが可能である。本アッセイを用いる、メラニン形成を阻害する化合物に関す
るスクリーニング方法の限定されない例において、試験化合物を含む培地中でメ
ラニン細胞を増殖させまたはインキュベーションし、そして細胞を採取する。そ
の後、これらの細胞におけるチロシナーゼの細胞下分布を決定し、そして同様の
条件下であるが、試験化合物を含まず増殖させ、またはインキュベーションした
同様の細胞におけるチロシナーゼの細胞下分布に比較する。本アッセイは、細胞
下分画（例えば、スクロースまたはPercoll密度勾配遠心分離による）、細胞内
容物のウェスタンブロッティング、および各細胞下分画のチロシナーゼ活性アッ
セイを含む、当該技術分野に知られるいかなる技術または技術の組み合わせを取
り込んでもよい。試験化合物で処理しない細胞に比較した、試験化合物で処理し
た細胞における、メラノソーム分画に見られる総チロシナーゼタンパク質の分画
中の減少、または非メラノソーム分画に見られる総チロシナーゼタンパク質の分
画中の増加は、試験化合物がメラニン形成を阻害することを示す。
【００３９】 例えば、試験化合物で処理した細胞の顕微鏡検査など、他の定性的アッセイを
用いてもよい。例えば、当該技術分野に知られるような、細胞染色技術を用いて
もよい。細胞は、チロシンを含む培地中で、そして試験化合物の存在下で増殖さ
せまたはインキュベーションする。細胞を、抗−チロシナーゼ抗体を用いて染色
し、その後、顕微鏡的に検査する。この種類のアッセイを用いたスクリーニング
方法の限定されない例において、メラニン形成細胞を、試験化合物を含む培地中
で増殖させ、またはインキュベーションし、そして当該技術分野に一般的に知ら
れる技術を用いた細胞染色のため、調製する。例えば、HarlowおよびLane， 19
88、上記を参照されたい。調製細胞を、抗−チロシナーゼ抗体を用いて染色する
。抗−チロシナーゼ抗体は、検出を可能にする部分と結合体化させてもよい。好
ましくは、二次抗体を用いる。二次抗体は、抗−チロシナーゼ抗体を認識し、そ
して結合する。好ましくは、二次抗体は、検出を可能にする部分に結合体化して
いる。あるいは、三次抗体もまた、用いてもよい。三次抗体は、好ましくは、検
出を可能にする部分に結合体化している。抗体の検出を可能にする部分の例には
、蛍光分子（例えば、フルオレセイン、ローダミン、ヘキスト33258、またはテ
キサスレッド）、酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスフ
ァターゼ、またはベータ−ガラクトシダーゼ）、金粒子、放射性同位体、および
ビオチンが含まれる。アッセイは、用いられる標識部分に基づいて、選択される
。例えば、蛍光顕微鏡を用い、蛍光標識抗体を検出してもよい。酵素−結合体化
抗体で染色した細胞では、細胞をさらに、抗体−結合酵素による変換に適した基
質で処理し、その後、光学顕微鏡で検査する。金粒子標識抗体は、光学または電
子顕微鏡を用いて検出することが可能である。同位体標識抗体は、放射線感受性
フィルムを用いて検出することが可能である。ビオチン−結合体化抗体で染色し
た細胞では、細胞をさらに、ストレプトアビジンまたはアビジンで処理する。ス
トレプトアビジンまたはアビジンは、例えば、蛍光分子、酵素、金粒子、または
放射性同位体など、検出を可能にする部分に結合体化させる。好ましくは、細胞
は、特定の細胞下区画（例えばエンドソーム、リソソーム、メラノソームなど）
に特異的な単数または複数の抗体で、同時染色する。これらの技術のいかなる1
つ、または抗体−染色細胞において抗体を検出するためのいかなる他の技術を用
い、チロシナーゼの細胞下分布を決定してもよい。試験化合物が、非メラノソー
ム小胞に見られるチロシナーゼの量の増加、およびメラノソーム中のより少ない
チロシナーゼを引き起こす場合、該化合物はメラニン形成を阻害する。
【００４０】 用いてもよい別の種類のアッセイは、チロシナーゼタンパク質のC−末端部分
の存在または非存在を決定する。本アッセイは、部分的に、メラニン形成に関し
阻害された（例えば、Pタンパク質機能を阻害する突然変異または化合物による
）メラニン形成細胞は、膜貫通ドメインおよびタンパク質局在化シグナルを含む
、チロシナーゼのC−末端部分を欠く型のチロシナーゼを含み、そして分泌する
という発見に基づく。上に説明されるように、このチロシナーゼの一部切除（tr
uncated）型は、にもかかわらず触媒活性を保持する。本アッセイに基づくスク
リーニング方法の限定されない例において、メラニン形成細胞を、試験化合物の
存在下で増殖させまたはインキュベーションする。チロシナーゼタンパク質の長
さおよび／または質量の測定を可能にするアッセイを選択する。例えば、チロシ
ナーゼタンパク質のN−末端または中央部分を認識する抗体を用いた、ウェスタ
ンブロッティングまたは他の免疫組織化学的技術、あるいは、タンパク質の長さ
または質量測定に有用な他の標準的分子生物学的技術を、これらの細胞の抽出物
および／またはその増殖またはインキュベーション培地に対し、行ってもよい。
これらのアッセイに適した抗体は、標準的免疫学的技術を用い、調製してもよい
。例えば、HarlowおよびLane， 1988、上記を参照されたい。アッセイが、同様
の条件下であるが、試験化合物を含まず増殖させ、またはインキュベーションし
た同様の細胞に比べ、より短いまたはより低い分子量型のチロシナーゼの存在を
明らかにする場合、試験化合物は、メラニン形成を阻害する。あるいは、チロシ
ナーゼのC−末端部分を認識する抗体（例えば、Jimenezら， 1991， J． Bio
l． Chem． 266：1147−1156に記載されるように調製された、抗−PEP7抗体）
を用いたウェスタンブロットまたは他の免疫組織化学的技術を、該アッセイで用
いてもよい。これらのアッセイにおいて、抗体により検出されるチロシナーゼタ
ンパク質の量の減少は、一部切除チロシナーゼが、該抗体に認識される配列を欠
くため、試験化合物がメラニン形成を阻害することを示す。
【００４１】 全長チロシナーゼ、およびPタンパク質が阻害されたまたは存在しないメラニ
ン形成細胞に見られ、そして該細胞から分泌される一部切除チロシナーゼは、共
に、非変性ポリアクリルアミドゲル上で泳動した際、触媒的に活性であるままで
ある。本観察は、部分的に、一部切除チロシナーゼタンパク質に関する別のアッ
セイの基礎である。したがって、メラニン形成細胞を、試験しようとする化合物
を含む培地中で増殖させ、またはインキュベーションしてもよい。増殖またはイ
ンキュベーション培地いずれかを収集し、あるいは細胞抽出物を調製し、そして
非変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供する。より小さい、より柔軟なタン
パク質は、より複雑な三次元構造を持つより大きいタンパク質より、遠くに移動
するであろう。ろ紙または膜（例えば、ニトロセルロース）をL−DOPAに浸し、
そしてゲルに適用する。ゲル中の活性チロシナーゼは、L−DOPAをメラニンに変
換し、ろ紙または膜上に黒っぽい点を生成し、これはチロシナーゼの位置を、そ
してしたがって該酵素の相対的な大きさを示す。試験化合物で処理した細胞が、
ろ紙または膜上に2つの点を産生し、1つの点が、同様の条件下であるが、試験化
合物を含まず増殖させた同様の細胞に産生されるのと同一の大きさのチロシナー
ゼを示し、そして、他の点が、より小さい相対的な大きさのチロシナーゼを示す
場合、試験化合物は、メラニン形成を阻害する化合物の候補である。
【００４２】 正常Pタンパク質機能を持つ野生型メラニン形成細胞における全長チロシナー
ゼは、主に、細胞抽出物の不溶性分画に見られる。放出させるためには、界面活
性剤（例えばTriton X−100TM）で可溶化しなければならない。対照的に、Pタ
ンパク質機能が阻害されたメラニン形成細胞における、チロシナーゼのより小さ
い一部切除型は、可溶性分画の小胞に見られる。これらの観察は、部分的に、P
タンパク質が損なわれた細胞において一部切除チロシナーゼを検出するのに用い
ることが可能な別のアッセイの基礎である。したがって、メラニン形成細胞を、
試験しようとする化合物を含む培地中で増殖させ、またはインキュベーションす
る。細胞を採取し、そして界面活性剤相分離に供し、可溶性タンパク質から、膜
に係留されたタンパク質を分離してもよい。例えば、細胞を、Triton X−114TM を含む緩衝液中で、氷上で可溶化してもよい。不溶性混入物は、4℃で遠心分離
して除外してもよい。その後、可溶化タンパク質を含む上清を、室温または上昇
した温度で、界面活性剤相および水性相に相分離する。界面活性剤相（膜にチロ
シナーゼを係留する、該タンパク質のC−末端部分を含む、チロシナーゼタンパ
ク質を含むであろう）におけるチロシナーゼの、水性相（C−末端部分を欠くチ
ロシナーゼタンパク質を含むであろう）におけるチロシナーゼに対する比を決定
する。あるいは、細胞を採取し、そして単数または複数の凍結／融解周期により
、膜を破壊する。その後、破壊された細胞を、可溶性分画および膜結合不溶性分
画に分離する。可溶性分画中の可溶性チロシナーゼの、膜分画中の不溶性膜結合
チロシナーゼに対する比を決定する。試験化合物で処理した細胞が、同様の条件
下であるが、試験化合物を含まず増殖させた同様の細胞由来のものより、不溶性
膜結合チロシナーゼより高いレベルの可溶性チロシナーゼを有する場合、試験化
合物は、メラニン形成を阻害する化合物の候補である。
【００４３】 1．1．3 メラニン形成の阻害剤に関する他のスクリーニング方法； 上述のように、チロシナーゼの誤った局在および分泌、並びにチロシナーゼ活
性の減少は、メラニン形成の阻害の唯一の結果ではない。他のメラニン形成酵素
もまた、影響を受け、メラノソームの生合成も同様である。
【００４４】 Pタンパク質機能を阻害する突然変異によるメラニン形成の阻害は、TRP−1、T
RP−2、およびLAMP−1遺伝子産物を含む、メラノサイト中で産生されるいくつか
のメラニン形成タンパク質の量における顕著な改変も引き起こす可能性がある（
Orlow， S．J．およびBrilliant， M．H．， 1999、上記）。野生型マウスの
目において、TRP−1およびTRP−2遺伝子産物のレベルは、誕生時に高く、急激に
低下し、約2週間の別のピークに向かい徐々に増加し、その後、約40日までに検
出不能なレベルに、永続的に低下する。Pタンパク質機能を欠くマウスでは、例
えば、これらのタンパク質のレベルは、誕生時にはるかに低く、そしてわずか数
日後に、検出不能である（同上）。
【００４５】 Pタンパク質機能を阻害する突然変異により引き起こされるメラニン形成阻害
の別の影響は、チロシナーゼ、TRP−1タンパク質、およびTRP−2タンパク質を含
む、高分子量複合体の分解である（Orlow， S．J．ら， 1994、上記）。本発
明の目的のため、「高分子量複合体」という用語は、非変性ゲルろ過、HPLC、ま
たはスクロース勾配沈降中、互いに結合したままである共有および／または非共
有結合を介し、互いに結合されたタンパク質群と定義され、そして約200 kDお
よび約700 kDの間の見かけの分子量を有する。野生型メラニン形成細胞では、
メラノソームに結合するこの「メラニン形成複合体」は、チロシナーゼ、TRP−1
タンパク質およびTRP−2タンパク質の細胞の全量のかなりの分画を含む。Pタン
パク質機能の阻害により、メラニン形成に関し、阻害されたメラニン形成細胞で
は、これらのタンパク質のいずれも、高分子量複合体に非常にわずかしか見られ
ない。
【００４６】 別のアッセイは、部分的に、これらの影響を利用する。この種類のアッセイを
用いる、メラニン形成を阻害する化合物に関するスクリーニング方法の限定され
ない例において、メラニン形成細胞を、試験しようとする化合物を含む培地中で
増殖させ、またはインキュベーションする。細胞を採取し、破壊し、そして分画
する。本分画は、例えば、スクロース勾配沈降を用いて、行ってもよい。沈降か
らのアリコットを、例えば、チロシナーゼ、TRP−1、および／またはTRP−2活性
に関するアッセイを用いることにより、あるいは、例えば免疫ブロッティングな
どの免疫組織化学アッセイを用いることにより、メラニン形成タンパク質の存在
に関し、アッセイする。同様の条件下であるが、試験化合物を含まず増殖させ、
またはインキュベーションした同様の細胞に比較した、低密度アリコットにおけ
るこれらの3つのタンパク質のいずれの量の増加、および／または高密度アリコ
ットにおけるこれらの3つのタンパク質のいずれの量の減少も、試験化合物が、
メラニン形成を阻害する化合物の候補であることを示す。
【００４７】 メラニン形成阻害の別の結果は、メラノソームの異常な発生である可能性があ
る。野生型メラニン形成細胞は、典型的には、豊富な、完全に発生し、黒っぽく
色素沈着したメラノソームを含む。こうした完全に発生し、黒っぽく色素沈着し
たメラノソームは、低濃度のチロシンを含む培地中で増殖させ、またはインキュ
ベーションした際、Pタンパク質をコードする遺伝子における突然変異のため、
メラニン形成に関し阻害されたメラノサイトでは、より豊富でないかまたは欠け
ている。むしろ、これらの細胞は、異常に多数の未成熟メラノソームを含む。本
現象は、部分的に、用いてもよい別のアッセイの基礎である。この種類のアッセ
イを用いる、メラニン形成を阻害する化合物に関するスクリーニング方法の限定
されない例において、メラニン形成細胞を、試験しようとする化合物を含む培地
中で増殖させ、またはインキュベーションする。細胞中のメラノソームの数、大
きさ、形状、および／または色をアッセイする。こうしたアッセイは、当該技術
分野に公知である。例えば、細胞を固定し、そして染色し、そして光学顕微鏡を
用いて調べてもよい。あるいは、細胞を固定し、染色し、切片にし、そして電子
顕微鏡を用いて調べてもよい。あるいは、細胞を、密度遠心分離を用い、分画し
てもよい。成熟メラノソームは、未成熟メラノソームより、より密度が高く、そ
してしたがって、公知の技術を用い、密度に基づき、これらから分離することが
可能である。試験化合物で処理した細胞が、同様の条件下であるが、試験化合物
を含まず増殖させ、またはインキュベーションした同様の細胞由来のメラノソー
ムに比べ、数、大きさ、形状、および／または色が改変したメラノソームを有す
る場合、試験化合物がメラニン形成を阻害することを示す。
【００４８】 1．1．4． Pタンパク質機能の阻害剤に関するスクリーニング方法； 上に説明されるように、Pタンパク質は、メラニン形成にきわめて重要な役割
を果たす。Pタンパク質をコードする遺伝子における機能喪失突然変異を持つメ
ラノサイトは、メラニン形成に関し、阻害される。P欠損またはP阻害細胞におい
て、メラニン形成の阻害は、チロシナーゼの誤った局在に相関する。野生型メラ
ノサイトにおいて、チロシナーゼは主にメラノソームに局在するが、Pタンパク
質をコードする遺伝子の機能喪失突然変異を持つメラノサイトでは、チロシナー
ゼは、主に分泌されるかまたは非メラノソーム小胞に見られる。メラニン形成の
阻害およびチロシナーゼの誤った局在は、野生型メラノサイトを、Pタンパク質
機能を阻害する化合物（例えばイミプラミン）で処理することにより、模倣する
ことが可能である。
【００４９】 これらの発見は、部分的に、メラニン形成阻害剤に関するいくつかのスクリー
ニングの基礎である。これらのスクリーニングは、Pタンパク質機能の阻害剤を
同定することにより、メラニン形成の阻害剤を同定するよう働く。したがって、
メラニン形成細胞は、Pタンパク質機能を阻害する能力に関し、試験しようとす
る化合物を含む培地中で増殖させ、またはインキュベーションする。あるとすれ
ば、化合物の影響は、例えば、上述のアッセイのいかなる1つを用い、決定して
もよい。限定されない態様において、細胞の増殖またはインキュベーション培地
中のチロシナーゼ活性を測定してもよい。例えば、チロシンを培地に添加し、そ
してそのメラニンへの変換をモニターしてもよい。あるいは、チロシナーゼの非
チロシンまたは改変チロシン基質を培地に添加し、そして例えば、比色アッセイ
（例えばDOPA酸化酵素アッセイ）、放射測定アッセイ（例えば放射測定加水分解
酵素または放射測定メラニン合成アッセイ）、蛍光アッセイにより、あるいは、
反応産物の沈殿により、チロシナーゼによる該基質の反応産物への変換を追って
もよい。これらのアッセイは、上の1．1．1項に詳細に記載される。
【００５０】 あるいは、チロシナーゼタンパク質のアッセイを用いてもよい。これらのアッ
セイは、例えば、試験しようとする化合物で処理した細胞の増殖またはインキュ
ベーション培地中のチロシナーゼの量、チロシナーゼの細胞局在（例えば、細胞
下分画による、または細胞の染色および顕微鏡的検査による）、あるいは、細胞
内のチロシナーゼ分子の長さまたは質量を測定してもよい。これらのアッセイは
、上の1．1．2項に詳細に記載される。
【００５１】 用いてもよい他のアッセイには、Pタンパク質機能の阻害の他の影響を測定す
るものが含まれる。例えば、これらのアッセイは、試験しようとする化合物で処
理した細胞中のTRP−1および／またはTRP−2タンパク質の量または活性、高分子
量メラニン形成複合体の存在量または組成、あるいは、異常なメラノソームの存
在または非存在を測定してもよい。これらのアッセイは、上の1．1．3項に詳細
に記載される。
【００５２】 用いてもよいさらにべつのアッセイは、特定の種類のリソソーム加水分解酵素
の細胞内標的化、細胞内レベルおよび／または分泌を測定することを伴う。通常
、新たに合成されたリソソーム加水分解酵素は、トランス−ゴルジ網から、後期
エンドソーム区画に輸送され、該区画の一部は、最終的にリソソームと融合する
か、またはリソソームを形成すると考えられる。ほとんどの細胞内リソソーム加
水分解酵素を含むこれらのリソソームは、分画細胞から調製される、大顆粒分画
に検出される可能性がある。限定されない実施例として、以下に例示されるよう
に、すべてではないが、いくつかのリソソーム加水分解酵素は、melan−a細胞と
対照的に、melan−p細胞由来のリソソーム含有大顆粒分画に、正しく標的化され
ない。特に、マンノース−6−リン酸／インスリン様増殖因子II型受容体（「M6p
／IGF−II」受容体）への結合を介し、トランス−ゴルジ網から後期エンドソー
ムに輸送されるリソソーム加水分解酵素は、大顆粒分画に蓄積しない。こうした
誤って標的化されるリソソーム加水分解酵素には、β−ヘキソサミニダーゼ、β
−グルコシダーゼ、β−グルクロニダーゼおよびβ−ガラクトシダーゼが含まれ
る。対照的に、M6P／IGF−II受容体を介し、後期エンドソームに輸送されるので
はない、酸ホスファターゼは、melan−aおよびmelan−p細胞両方で、大顆粒分画
に正しく蓄積する。したがって、Pタンパク質機能はまた、M6P／IGF−II受容体
を介し、後期エンドソームに輸送されるリソソーム酵素の正しい標的化にも必要
である。こうした酵素の経路がないと、細胞外に分泌される。
【００５３】 これらの結果は、部分的に、Pタンパク質機能に影響を与える化合物に関する
さらなるスクリーニング方法の基礎である。したがって、チロシナーゼの誤った
局在に関するアッセイの代わりに、または該アッセイに加え、限定されるわけで
はないが、β−ヘキソサミニダーゼ、β−グルコシダーゼ、β−グルクロニダー
ゼおよびβ−ガラクトシダーゼを含む、通常、M6P／IGF−II受容体を介し、後期
エンドソームに輸送される、いかなるリソソーム加水分解酵素のレベルおよび／
または局在に対する、試験化合物の影響に関し、スクリーニングしてもよい。こ
れらのリソソーム加水分解酵素は、チロシナーゼのように、タンパク質およびよ
り詳細には酵素であるため、チロシナーゼの酵素的活性および／またはタンパク
質の存在に関しアッセイする上述の方法のいずれを、リソソーム加水分解酵素を
アッセイするのに適応させてもよい。これらの酵素の酵素的活性に関するアッセ
イは、当該技術分野に公知であり（そして、部分的に、限定されない例として以
下に例示され）、そのアミノ酸構造および該酵素を認識する抗体も同様である。
例えば、試験化合物で処理した全細胞または細胞抽出物、細胞抽出物の大顆粒分
画、および／または細胞由来の培地における、リソソーム加水分解酵素の存在お
よび／またはレベルに関し、アッセイしてもよい。細胞、またはより詳細には大
顆粒分画中のこうしたリソソーム酵素の蓄積の減少、あるいは、こうしたリソソ
ーム酵素の分泌の増加を引き起こす化合物は、Pタンパク質機能を阻害する化合
物の候補であり；こうした候補化合物をその後、本発明の他の方法の1つを用い
、さらに解析する。
【００５４】 1．2 メラニン形成を増加させる、Pタンパク質機能を増加させるおよび／ま
たはPタンパク質機能を模倣する化合物に関するスクリーニング方法； 上に説明されるように、野生型メラニン形成細胞は、典型的には、それらのチ
ロシナーゼの一部をin vitro培地に分泌する。分泌されたチロシナーゼは酵素
的に活性であるが、細胞のメラノソーム内で起こるメラニン形成に貢献すること
ができない。上述のように、メラニン形成細胞中のメラニン形成レベルは、メラ
ノソームに局在するチロシナーゼの分画に比例する。メラノソームに局在するチ
ロシナーゼの量を減少させる化合物は、メラニン形成を阻害するよう働く。逆に
、分泌されるチロシナーゼの量を減少させ、そしてそれにより、メラノソームに
局在するチロシナーゼの量を増加させる化合物は、メラニン形成を増加させると
期待される。上に説明されるように、Pタンパク質活性は、メラノソームへのチ
ロシナーゼの局在に必要とされる。したがって、メラニン形成細胞におけるPタ
ンパク質の活性を増加させる化合物と共に、Pタンパク質の活性を模倣する化合
物は、分泌されるチロシナーゼの量を減少させることにより、メラニン形成を増
加させるであろう。
【００５５】 部分的にこれらの観察に基づくいくつかのスクリーニングおよび予測を用い、
メラニン形成を増加させる、Pタンパク質機能を増加させるおよび／またはPタン
パク質機能を模倣する化合物を同定することが可能である。例えば、メラニン形
成細胞を用い、メラニン形成およびPタンパク質機能を同定するアッセイの変形
を用いてもよい。メラニン形成細胞は、メラニン形成を増加させる能力、Pタン
パク質機能を増加させる能力、またはPタンパク質機能を模倣する能力に関し、
試験しようとする化合物を含む培地中で、in vitroで増殖させ、またはインキ
ュベーションする。あるとすれば、化合物の影響を、上述のアッセイのいかなる
1つを用い、決定してもよい。例えば、細胞の増殖またはインキュベーション培
地中のチロシナーゼの活性を測定してもよい。培地中のチロシナーゼ活性の減少
は、より少ないチロシナーゼが分泌されており、そしてしたがって化合物がメラ
ニン形成またはPタンパク質機能を増加させる可能性があることを示す可能性が
ある。
【００５６】 あるいは、またはさらに、Pタンパク質を含まないメラニン形成細胞（例えばm
elan−p細胞）を用い、Pタンパク質機能を模倣する化合物に関しスクリーニング
してもよい。本発明で用いてもよい1つの種類のアッセイにおいて、Pタンパク質
を含まないメラニン形成細胞を、Pタンパク質機能を模倣し、そしてメラニン形
成を増加させる能力に関し、試験しようとする化合物を含む培地中でインキュベ
ーションする。正常メラニン形成細胞と対照的に、こうしたPタンパク質を含ま
ないメラニン形成細胞は、培地中で（動物においても）色が薄い。Pタンパク質
を含まないメラニン形成細胞が、化合物の非存在下よりも、化合物の存在下で、
より黒っぽくなる場合、該化合物は、Pタンパク質の機能をすべて、または部分
的に模倣する。細胞の色は、例えば視覚的検査により、定性的に、または、例え
ば反射率により、定量的に、測定することが可能である。あるいは、Pタンパク
質を含まないメラニン形成細胞を、試験しようとする化合物で処理し、そして培
地に分泌されるチロシナーゼの量をアッセイする。Pタンパク質を含まないメラ
ニン形成細胞（例えばmelan−p細胞）由来の培地中のチロシナーゼの量が、試験
化合物で処理した際に減少する場合、試験化合物は、Pタンパク質機能を模倣す
る化合物の候補である。培地中のチロシナーゼ活性は、例えば、上述の技術を用
い、測定してもよい。例えば、チロシンを培地に添加し、そしてメラニンへのそ
の変換をモニターしてもよい。
【００５７】 あるいは、チロシナーゼタンパク質のアッセイを用いてもよい。これらのアッ
セイは、例えば、試験しようとする化合物で処理した細胞の増殖またはインキュ
ベーション培地中のチロシナーゼの量、チロシナーゼの細胞局在（例えば、細胞
下分画による、または細胞の染色および顕微鏡的検査による）、あるいは、細胞
内のチロシナーゼ分子の長さまたは質量を測定してもよい。培地中に分泌される
チロシナーゼタンパク質量の減少、またはメラノソーム中のチロシナーゼタンパ
ク質の増加は、試験化合物が、メラニン形成を増加させるあるいはPタンパク質
機能を模倣するまたは亢進する化合物の候補であることを示す。試験化合物が、
Pタンパク質を含まないメラニン形成細胞（例えばmelan−p細胞）で同様の影響
を引き起こす場合、こうした結果は、該化合物がPタンパク質機能を模倣するこ
とを示すであろう。これらのアッセイは、上の1．1．2項に詳細に記載される。
【００５８】 用いてもよい他のアッセイには、Pタンパク質機能の増加、Pタンパク質機能の
模倣、および／またはメラニン形成の増加の他の影響を測定するものが含まれる
。例えば、これらのアッセイは、試験しようとする化合物で処理した細胞中のTR
P−1および／またはTRP−2タンパク質の量または活性、高分子量メラニン形成複
合体の存在量または組成、あるいは、異常なメラノソームの存在または非存在を
測定してもよい。TRP−1および／またはTRP−2タンパク質または活性の量の増加
、高分子量メラニン形成複合体に見られるこれらのタンパク質の量の増加、高分
子量複合体の数の増加は、試験化合物が、メラニン形成またはPタンパク質機能
を増加させる化合物の候補であることを示す。試験化合物が、Pタンパク質を含
まないメラニン形成細胞（例えばmelan−p細胞）で同様の影響を引き起こす場合
、こうした結果は、該化合物がPタンパク質機能を模倣することを示すであろう
。これらのアッセイは、上の1．1．3項に詳細に記載される。
【００５９】 これらのスクリーニングの変形では、分泌されるチロシナーゼの量を、細胞内
チロシナーゼの量に比較する。メラニン形成細胞を、試験しようとする化合物を
含む培地中で増殖させ、またはインキュベーションする。例えば、上述のアッセ
イのいずれでもよいものを用い、増殖またはインキュベーション培地中のチロシ
ナーゼの量を測定し、そしてこれらの細胞中のチロシナーゼの量もまた、測定す
る。その後、分泌されたチロシナーゼに対する細胞内チロシナーゼの比を計算す
る。限定されない好ましい態様において、分泌されたチロシナーゼに対する細胞
内チロシナーゼの比のこうした変化は、細胞により産生されるチロシナーゼの総
量における変化（例えば減少）を伴わず、観察される。同様に、Pタンパク質を
含まないメラニン形成細胞（例えばmelan−p細胞）が、試験しようとする化合物
を含む培地中で増殖し、またはインキュベーションされ、そして分泌されるチロ
シナーゼに対する細胞内チロシナーゼの比が、未処理細胞に関してより化合物で
処理した細胞に関し、より高い場合、該化合物は、Pタンパク質を模倣し、そし
てそれにより、メラニン形成を増加させることが可能である。
【００６０】 1．3 非メラニン形成細胞を用いる、Pタンパク質機能に影響を与える化合
物に関するスクリーニング方法； 大部分の非メラニン形成細胞は、Pタンパク質もチロシナーゼも発現しない。
本発明の目的のため、「非メラニン形成細胞」という用語は、メラノソームを含
まない細胞と定義される。しかし、非メラニン形成細胞は、Pタンパク質および
チロシナーゼを両方発現し、そしてメラニンを合成するよう、作成することも可
能である。本発明の目的のため、「Pタンパク質およびチロシナーゼを両方発現
するように作成された細胞」という用語は、通常、Pタンパク質および／または
チロシナーゼを発現しないが、当該技術分野に知られるいかなるものでもよい技
術、例えば分子遺伝的技術を用い、Pタンパク質およびチロシナーゼを両方発現
するようにされた細胞と定義される。例えば、異種性チロシナーゼおよび／また
はPタンパク質遺伝子を、例えば、トランスフェクション、形質転換、または形
質導入により、細胞に導入してもよい。本発明の目的のため、「異種性」という
用語は、その生物に天然には存在しない遺伝子または遺伝子産物、あるいは、通
常、その細胞種で発現されない遺伝子または遺伝子産物を記載すると定義される
。あるいは、内因性だが、通常静止した、チロシナーゼおよび／またはPタンパ
ク質をコードする遺伝子を、（例えば、転写コントロール産物の標的化相同組換
え、あるいはいかなるものでもよい他の活性化法を通じ）活性化し、チロシナー
ゼおよび／またはPタンパク質を発現させてもよい。本発明のいくつかの方法は
、部分的に、Pタンパク質およびチロシナーゼを共に発現する非メラニン産生細
胞が、チロシナーゼのみを発現する細胞の、ほぼ4倍のチロシナーゼ活性を有す
るという発見に基づく。Pタンパク質を発現するが、チロシナーゼを発現しない
細胞は、検出可能なチロシナーゼ活性を持たず、これらの細胞におけるチロシナ
ーゼ活性に対するPタンパク質の影響は、チロシナーゼの発現に完全に依存する
ことが示される。
【００６１】 チロシナーゼおよびPタンパク質を両方発現するよう作成された細胞のチロシ
ナーゼ活性は、Pタンパク質機能を阻害する化合物の機能に関し、感受性である
。これらの細胞を、例えばイミプラミンで処理すると、これらの細胞のチロシナ
ーゼ活性は、顕著に減少する。チロシナーゼ活性に対するこれらの化合物の影響
は、活性Pタンパク質の存在に完全に依存する。チロシナーゼを発現するが、Pタ
ンパク質を発現しない細胞は、試験された濃度で、化合物の存在により影響され
ないチロシナーゼ活性を有する。
【００６２】 これらの観察は、Pタンパク質機能に影響を与える（例えば該機能を減少させ
るまたは増加させる）化合物に関するいくつかのスクリーニング方法に利用され
る。そうでなければ検出可能チロシナーゼおよび／またはPタンパク質を持たな
い細胞を、これらのタンパク質を両方発現するように作成する。試験しようとす
る化合物を含む培地中で、細胞を増殖させ、またはインキュベーションする。こ
れらの細胞の抽出物のチロシナーゼ活性を測定する。チロシナーゼ活性は、放射
測定チロシン加水分解酵素アッセイ、比色DOPA酸化酵素アッセイ、［14C］DOPA
をTCA沈殿可能成分に変換する能力に関するアッセイであるDHICA変換アッセイを
含む、上に論じられるアッセイのいずれを用いて、あるいは当該技術分野に知ら
れる他のいかなる方法により、測定してもよい。試験化合物で処理した細胞の抽
出物のチロシナーゼ活性が、同様の条件下であるが、試験化合物を含まず増殖さ
せた同様の細胞の抽出物のチロシナーゼ活性より低い場合、および該化合物が、
別の状況では、チロシナーゼを発現するがPタンパク質を発現しない細胞の抽出
物におけるチロシナーゼ活性を減少させない場合、該化合物は、Pタンパク質機
能を減少させる。逆に、試験化合物で処理した細胞の抽出物のチロシナーゼ活性
が、同様の条件下であるが、試験化合物を含まず増殖させた同様の細胞の抽出物
のチロシナーゼ活性より高い場合、および該化合物が、別の状況では、チロシナ
ーゼを発現するがPタンパク質を発現しない細胞の抽出物におけるチロシナーゼ
活性を増加させない場合、該化合物は、Pタンパク質機能を増加させる。
【００６３】 チロシナーゼおよびPタンパク質を発現するように作成された非メラニン形成
細胞を用いた別のスクリーニング方法は、部分的に、これらの細胞が、十分に長
くインキュベーションした場合、メラニン堆積により、黒く変わるという発見を
利用する。チロシナーゼおよびPタンパク質を発現する、またはチロシナーゼを
発現するが、Pタンパク質を発現しない細胞を、試験しようとする化合物で処理
する。チロシナーゼおよびPタンパク質を両方発現するが、試験化合物で処理し
ない細胞がメラニンを蓄積するのに十分な時間、細胞をインキュベーションする
。処理および未処理細胞のメラニン含量を、細胞の視覚的検査または分光光度解
析により、あるいは当該技術分野に公知の他の技術を用いることにより、アッセ
イしてもよい。チロシナーゼおよびPタンパク質を両方発現し、そして試験化合
物で処理した細胞のメラニン含量が、該化合物で処理しない同様の細胞のメラニ
ン含量より低い場合、該化合物はメラニン形成を減少させる可能性がある。チロ
シナーゼを発現するが、Pタンパク質を発現しない細胞のメラニン含量が、該化
合物の存在または非存在により改変されない場合、該化合物はPタンパク質機能
を阻害する。逆に、同様の条件下であるが、化合物を含まず増殖させた同様の細
胞に比べ、これらの細胞において、メラニン形成の増加を引き起こす化合物は、
メラニン形成を増加させる。化合物がまた、チロシナーゼをコードする遺伝子を
発現するが、Pタンパク質をコードする遺伝子を発現しない非メラニン形成細胞
において、メラニン形成を増加させるのに失敗する場合、該化合物はPタンパク
質機能を増加させる。
【００６４】 あるいは、破壊細胞抽出物系を考案し、チロシナーゼの細胞内通行を研究して
もよい。限定されない例において、野生型メラノサイト由来のドナーゴルジ膜お
よび細胞質ゾルを、チロシナーゼ遺伝子に該酵素を不活性化させる突然変異を持
つマウスの細胞から調製したメラノソームと組み合わせてもよい。その後、野生
型ドナーゴルジ膜から、チロシナーゼ欠損メラノソームへのチロシナーゼの輸送
を観察してもよい。Pタンパク質機能を阻害する化合物の添加は、こうした輸送
を阻害するであろう。
【００６５】 異種性遺伝子を用いた方法では、異種性チロシナーゼおよびPタンパク質をコ
ードする遺伝子は、いかなる適切な供給源由来であってもよい。好ましくは、こ
れらは動物供給源に由来する。より好ましくは、これらは、哺乳動物供給源、例
えば以下の例示態様で用いられるマウス細胞由来である。さらにより好ましくは
、これらは、霊長類供給源、例えばヒトに由来する。チロシナーゼコード遺伝子
は、当該技術分野に公知であり（例えば、Bouchardら， 1989， J． Exp．
Med． 169（6），2029−2042におけるヒト遺伝子cDNAの発現、およびMEDLINEデ
ータベース、例えば寄託番号NM＿000372、M27160、およびU01873を参照されたい
）、Pタンパク質をコードする遺伝子も同様である（例えば、ヒト遺伝子に関し
、Rinchikら， 1993， Nature 361（6407），72−76、およびMEDLINEデータ
ベース、例えば寄託番号NM＿000275およびU19152を参照されたい）。
【００６６】 典型的には、発現カセットを用い、選択された細胞において、異種性遺伝子を
発現する。各発現カセットは、例えば、チロシナーゼをコードする遺伝子および
／またはPタンパク質をコードする遺伝子を発現するよう設計された制御配列を
含む。原核生物における発現のため、好ましくは、発現カセットに見られる各コ
ード配列は、少なくとも1つの制御配列、すなわちプロモーター配列に、機能可
能であるように連結される。「機能可能であるように連結される」により、制御
配列が、コード配列を制御するよう機能する（例えば、コード配列の発現のタイ
ミングまたは量を調節する、転写または翻訳の開始または終結を決定する、ある
いはメッセージ安定性に影響を与える）ことを意味する。真核細胞における発現
のため、好ましくは、発現カセットに見られる各コード配列は、少なくとも2つ
の制御配列、すなわちプロモーターおよびポリA配列に、「機能可能であるよう
に連結される」。各発現カセットは、ベクターのポリヌクレオチド配列に、機能
可能であるように連結される。各ベクターは、好ましくは、自律染色体外要素と
して、またはトランスフェクションされた細胞中の1つまたはそれ以上の染色体
の組込み構成要素として、トランスフェクションされた細胞における、その選択
、複製、および維持を可能にするポリヌクレオチド配列を含む。ほとんどすべて
のコード配列を発現するよう適応させることが可能な発現カセットを含むベクタ
ーが、当該技術分野に公知であり、そして商業的に入手可能である。Invitrogen
（カリフォルニア州サンディエゴ）から入手可能なpcDNAベクターを用いた、こ
うしたベクターの限定されない例が、以下に例示される。
【００６７】 十分に高い率の発現を促進するいかなるプロモーターを、発現カセットで用い
てもよい。プロモーターは、恒常性であっても誘導性であってもよい。例えば、
誘導性プロモーターを記載する、Resendezら， 1988， Mol． Cell Biol．
8：4579−4584；およびChangら， 1987， Proc． Natl． Acad． Sci．
USA 84：680−684を参照されたい。プロモーターの選択は、スクリーニング
で用いられる細胞種およびチロシナーゼおよび／またはPタンパク質をコードす
る異種性遺伝子発現の望ましいレベルに応じる。例えば、有用なプロモーター配
列を記載する、Gossenら， 1995， Science 268：1766−1769； Gossenおよ
びBujard， 1992， Proc． Natl． Acad． Sci． USA 89：5547−5551、
並びに、米国特許第5，851，984号；第5，849，997号；第5，827，687号；第5，
811，260号；第5，789，215号；第5，665，578号；第5，512，483号；第5，302
，517号；第4，959，313号；および第4，935，352号を参照されたい。
【００６８】 プロモーター配列および要素のさらなる限定されない例には、SV40初期プロモ
ーター領域（BernoistおよびChambon， 1981， Nature 290：304−310）、ラ
ウス肉腫ウイルスの3’末端反復配列に含まれるプロモーター（Yamamotoら， 1
980， Cell 22：787−797）、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター（Wagne
rら， 1981， Proc． Natl． Acad． Sci． U．S．A． 78：1441−1445
）、メタロチオネイン遺伝子の制御配列（Brinsterら， 1982， Nature 296
：39−42）；原核発現ベクター、例えばβ−ラクタマーゼプロモーター（Villa
−Kamaroffら， 1978， Proc． Natl． Acad． Sci． U．S．A． 75：37
27−3731）、およびtacプロモーター（DeBoerら， 1983， Proc． Natl． A
cad． Sci． U．S．A． 80：21−25）； “Useful proteins from recom
binant bacteria”， Scientific American，中， 1980，242：74−94も参
照されたい；ノパリンシンテターゼプロモーター領域を含む植物発現ベクター（
Herrera−Estrellaら， Nature 303：209−213）またはカリフラワーモザイク
ウイルス35S RNAプロモーター（Gardnerら， 1981， Nucl． Acids Res．
9：2871）、および光合成酵素、リブロース2リン酸カルボキシラーゼのプロモ
ーター（Herrera−Estrellaら， 1984， Nature 310：115−120）；酵母また
は他の真菌由来のプロモーター要素、例えばGal 4プロモーター、ADC（アルコ
ールデヒドロゲナーゼ）プロモーター、PGK（ホスホグリセロールキナーゼ）プ
ロモーター、アルカリホスファターゼプロモーター、並びに組織特異性を示し、
そしてトランスジェニック動物で利用されてきている、以下の動物転写調節領域
：膵臓腺房（acinar）細胞で活性であるエラスターゼI遺伝子調節領域（Swiftら
， 1984， Cell 38：639−646； Ornitzら， 1986， Cold Spring Harb
or Symp． Quant． Biol． 50：399−409； MacDonald， 1987， Hepato
logy 7：425−515）；膵臓ベータ細胞で活性であるインスリン遺伝子調節領域
（Hanahan， 1985， Nature 315：115−122）；リンパ細胞で活性である免疫
グロブリン遺伝子調節領域（Grosschedlら， 1984， Cell 38：647−658；
Adamesら， 1985， Nature 318：533−538； Alexanderら， 1987， Mol
． Cell． Biol． 7：1436−1444）；精巣、乳房、リンパおよびマスト細胞
で活性であるマウス乳腺腫瘍ウイルス調節領域（Lederら， 1986， Cell 45
：485−495）；肝臓で活性であるアルブミン遺伝子調節領域（Pinkertら， 198
7， Genes and Devel． 1：268−276）；肝臓で活性であるアルファ−フェ
トプロテイン遺伝子調節領域（Krumlaufら， 1985， Mol． Cell． Biol．
5：1639−1648； Hammerら， 1987， Science 235：53−58）；肝臓で活
性であるアルファ1−アンチトリプシン遺伝子調節領域（Kelseyら， 1987， G
enes and Devel． 1：161−171）；骨髄細胞で活性であるベータ−グロビン
遺伝子調節領域（Mogramら， 1985， Nature 315：338−340； Kolliasら，
1986， Cell 46：89−94）；脳のオリゴデンドロサイト細胞で活性であるミ
エリン塩基性タンパク質遺伝子調節領域（Readheadら， 1987， Cell 48：70
3−712）；骨格筋で活性であるミオシン軽鎖−2遺伝子調節領域（Sani， 1985
， Nature 314：283−286）；および視床下部で活性である性腺刺激ホルモン
放出ホルモン（Masonら， 1986， Science 234：1372−1378）が含まれる。
【００６９】 真核細胞発現のための発現カセットで用いてもよい別の制御要素は、ポリA配
列（またはポリAシグナル）であり、これは、ポリA配列が機能可能であるように
連結されているコード配列に特異的な転写物のポリアデニル化を効率的に誘導す
ることが可能であるはずである。例えば、ポリA配列を論じる、米国特許第5，86
1，290号；第5，851，984号；第5，840，525号および第5，627，033号を参照さ
れたい。
【００７０】 別の限定されない態様において、本発明にしたがって用いられる発現カセット
は、エンハンサー要素、5’または3’非翻訳配列（または領域）、1つまたはそ
れ以上のイントロン、RNA安定性を制御する配列、またはこれらの要素の1つ以上
の組み合わせをさらに含んでもよい。これらの分類のいずれに属する配列のいず
れを、本発明のベクターで用いてもよい。例えば、これらの制御要素を論じる、
米国特許第5，861，290号；第5，851，984号；第5，840，525号；第5，681，744
号および第5，627，033号を参照されたい。「5’非翻訳配列」という用語は、転
写開始部位および翻訳開始部位の間のmRNA分子の配列を指す。「3’非翻訳配列
」という用語は、翻訳終結部位およびポリAテールの間のmRNA分子の配列を指す
。
【００７１】 これらのアッセイに用いられる異種性遺伝子は、典型的には、トランスフェク
ション、形質導入、形質転換、または当該技術分野に知られる他のいかなるもの
でもよい適切な技術により、選択された細胞に導入される。例えば、エレクトロ
ポレーション、リン酸カルシウム同時沈殿、マイクロインジェクション、リポフ
ェクションなどを用いてもよい。例えば、トランスフェクション法を記載する、
米国特許第5，814，618号および第5，789，215号を参照されたい。その後、ゲノ
ムへの組込みを通じ、または染色体外要素の一部としての維持により、単数また
は複数の異種性遺伝子を取り込む細胞を、好ましくは、標準的技術により、選択
する。したがって、選択可能マーカーを有する細胞、そしてしたがってベクター
および単数または複数の異種性遺伝子を含む細胞を、該マーカーを持たない細胞
から単離するのを可能にする選択可能マーカーを、ベクターに含んでもよい。こ
れらのアッセイに用いる細胞を調製するのに、選択可能マーカーが必要かどうか
は、ベクターを細胞に導入する特定の方法に応じる。例えば、ベクターが、マイ
クロインジェクションを介して細胞に導入される場合、形質転換頻度は、マイク
ロインジェクションではより高い傾向があるため、エレクトロポレーションを用
いる場合より、選択可能マーカーは、より有用でない可能性がある。例えば、マ
ーカーは、選択条件下、すなわち、マーカーを持たない場合、細胞が増殖不可能
である条件下で、細胞を増殖させることが可能である（例えば、ネオマイシン耐
性遺伝子およびヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子）。マ
ーカーはまた、異種性ポリヌクレオチド分子またはベクターを取り込んだ細胞を
同定する別の手段も提供する可能性がある（例えば、優先的染色によるもの）。
例えば、選択可能マーカーを記載する、米国特許第5，851，984号および第5，78
9，215号を参照されたい。
【００７２】 これらのアッセイに用いられる細胞は、典型的には、いかなる供給源由来であ
ってもよい。これらのアッセイに用いられる細胞は、哺乳動物、例えば：ヒツジ
、ウシ、ブタ、または他の農場動物；ネコ、イヌ、または他の家畜動物；マウス
、ラット、または他のげっ歯類；サル（monkey）、類人猿（ape）、または他の
霊長類；および最も好ましくはヒト由来の細胞であってもよい。あるいは、これ
らのアッセイに用いられる細胞は、非哺乳動物、例えば、鳥、魚、爬虫類、両生
類、または昆虫であってもよい。これらのアッセイに使用するための動物由来の
細胞は、いかなる種類でもよく、例えば、線維芽細胞、グリア細胞、角化細胞、
肝細胞、上衣細胞、骨髄細胞、海馬細胞、幹細胞、胚性幹細胞、造血幹細胞、嗅
覚粘膜細胞、副腎細胞、白血球、リンパ球、クロム親和細胞、ニューロン、免疫
系の細胞、マクロファージ、シュワン細胞、オリゴデンドロサイト、アストロサ
イト、生殖系列細胞、体細胞、上皮細胞、内皮細胞、副腎髄質細胞、骨芽細胞、
破骨細胞、筋芽細胞、膵臓細胞（例えばランゲルハンス島の）、または上記の細
胞種の1つ以上の混合物などであってもよい。あるいは、これらのアッセイに用
いられる細胞は、植物供給源、例えば、双子葉植物、例えばタバコ（tabacco）
、または単子葉植物、例えばトウモロコシ（corn）由来であってもよい。あるい
は、これらのアッセイに用いられる細胞は、単細胞真核生物、例えば、原生動物
または酵母または他の単細胞真菌由来であってもよい。これらの細胞を増殖させ
る方法は、各細胞種に特異的であり、そして当該技術分野の技術内である。
【００７３】 好ましい態様において、これらの供給源のいずれ由来の樹立された細胞株を、
これらのアッセイに用いてもよい。適切な細胞株の例には、限定されるわけでは
ないが、チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞、HeLa細胞、NRK細胞、A293細
胞、およびCOS細胞が含まれる。細胞は、in vitro培養で増殖させると増殖する
能力を有するべきである。単数または複数の異種性遺伝子の細胞への導入、およ
び単数または複数の異種性遺伝子を取り込んだ細胞の選択後、好ましい態様にお
いて、こうした細胞は、in vitro培養中で、長い期間、増殖させ、保存し、再
増殖させるなどが可能である細胞株を樹立するのに有用であるはずである。例え
ば、本発明のアッセイに有用な細胞を記載する、米国特許第5，814，618号を参
照されたい。
【００７４】 1．4 Pタンパク質機能に影響を与える、または該機能を模倣する化合物に
関する高処理スクリーニング方法； 上述のPタンパク質機能に影響を与えるまたは該機能を模倣する化合物に関す
るスクリーニング方法を用い、個々の化合物あるいは少数または多数の化合物を
同時に試験してもよい。当該技術分野に知られるような、高処理スクリーニング
方法が好ましい。
【００７５】 本発明の目的のため、「高処理スクリーニング方法」という用語は、試験しよ
うとする多数の化合物を同時に試験することを可能にするスクリーニング方法と
定義される。Pタンパク質機能に影響を与えるまたは該機能を模倣する化合物を
スクリーニングする各工程またはすべての工程は、候補化合物に関しスクリーニ
ングする高処理法になじみやすい。好ましくは、高処理スクリーニング方法は、
部分的にまたは完全に自動化され、各化合物を試験するのに必要な注意の量を減
少させる。例えば、培地中に分泌されるチロシナーゼの量、またはチロシナーゼ
活性の総レベルにおける増加は、高処理スクリーニング方法に典型的に用いられ
る形式（例えば、96ウェルプレート）で、容易に検出することが可能である。高
処理スクリーニング方法は、当該技術分野に公知であり、そしていくつかの形式
のいずれで行ってもよい。ロボット技術を含む実験室自動化は、多数の化合物を
スクリーニングするのに必要な時間を有意に減少させることが可能であり、そし
て例えば、いくつかの会社のみをあげると、Tecan（ノースカロライナ州リサー
チトライアングル）、Scitec Laboratory Automation SA（スイス・ローザン
ヌ）、Rosys（デラウェア州ニューキャッスル）、Rixan Associates Inc．（
オハイオ州デイトン）、CRS Robotics（カナダ・オンタリオ州バーリントン）
、Fanuk Robotics、およびBeckman−Coulter Sagian（インディアナ州インデ
ィアナポリス）などから商業的に入手可能である。候補化合物の同定に際し、二
次的なスクリーニング方法を行い、Pタンパク質機能に対する候補化合物の細胞
および／またはin vivo影響を決定してもよい。
【００７６】 1．5 Pタンパク質機能に影響を与えるまたは該機能を模倣する化合物に関
する二次スクリーニング方法およびさらなるスクリーニング方法； 上述のスクリーニング方法は各々、単独で用い、Pタンパク質機能に影響を与
えるまたは該機能を模倣する可能性がある化合物を同定することが可能である。
あるいは、複数のスクリーニング方法を連続的に用い、1つまたはそれ以上の化
合物の、Pタンパク質に影響を与える特性を確認し、またはより正確に決定して
もよい。例えば、上述のスクリーニング方法のいずれも、一次スクリーニング方
法として用いてもよく、その後に二次スクリーニング方法が続いてもよい。本発
明の目的のため、「一次スクリーニング方法」という用語は、化合物がPタンパ
ク質機能に影響を与えるまたは該機能を模倣する能力を試験するのに用いられる
一次スクリーニング方法と定義される。本発明の目的のため、「二次スクリーニ
ング方法」という用語は、一次スクリーニング方法でない、いかなるものでもよ
いスクリーニング方法と定義される。二次スクリーニング方法の使用は、一次ス
クリーニング方法が、チロシナーゼ活性または産生されるメラニン量を低下させ
る化合物、あるいは分泌されるチロシナーゼ量を低下させる化合物に基づく場合
、特に重要である。チロシナーゼの直接の阻害剤もまた、チロシナーゼの活性お
よび産生されるメラニン量の減少を引き起こすであろうし、またはチロシナーゼ
活性の減少を引き起こすことが可能であるが、必ずしもPタンパク質機能に影響
を与えないであろう。
【００７７】 上述のいかなるスクリーニング方法を、二次スクリーニング方法として用いて
もよい。例えば、一次スクリーニングとして、チロシナーゼおよびPタンパク質
を発現するように作成された細胞におけるチロシナーゼ活性への影響に関するア
ッセイを用い、それにもかかわらず、チロシナーゼのみを発現するように作成さ
れた細胞におけるチロシナーゼ活性に影響を与えない候補化合物を同定してもよ
い。この一次スクリーニングから有望である化合物を、その後、メラニン形成細
胞において、チロシナーゼおよび／またはリソソーム酵素の細胞局在に対する影
響に関するアッセイにおいて、二次スクリーニングで、試験してもよい。上述の
スクリーニング方法のうち、チロシナーゼタンパク質の誤った局在または活性ま
たは大きさの同定に頼るものが、二次スクリーニング方法として好ましい。
【００７８】 1つの態様において、二次スクリーニングを使用し、一般的にメラニン形成経
路に影響を与える試験分子の影響、並びにPタンパク質に特に影響を与える試験
化合物の影響、およびタンパク質合成、通行およびタンパク質分解を阻害するも
のを区別する。例えば、Pタンパク質機能の活性化因子に関するアッセイでは、
二次スクリーニングは、単に、試験メラノサイトを視覚的に検査して、試験分子
によるタンパク質合成、通行またはタンパク質分解の一般的な阻害およびその結
果生じるチロシナーゼ分泌の減少よりも、より黒い色およびしたがってPタンパ
ク質活性の増加を確実にしてもよい。あるいは、所望によりDOPA染色と共に（以
下の実施例4に記載されるように）、好ましくは電子顕微鏡により、細胞を組織
学的に検査し、メラノソーム含量を決定してもよい。Pタンパク質の真の活性化
因子は、段階I−IIIのメラノソームの段階III−IVへの成熟を促進するだろうし
、一方、タンパク質合成、通行およびタンパク質分解の阻害剤は、メラノソーム
成熟を促進する可能性が低い。
【００７９】 他のスクリーニング方法を用いてもよい。例えば、化合物をまず、精製Pタン
パク質に対する結合親和性に関し、スクリーニングしてもよい。あるいは、Pタ
ンパク質機能に影響を与えるとして、一次スクリーニング方法により同定された
化合物を、in vitroでの精製Pタンパク質への直接の結合に関し、または該化合
物で処理されたPタンパク質発現細胞からのPタンパク質との同時精製により、試
験してもよい。これらのスクリーニング方法は各々、化合物が直接Pタンパク質
に結合するかどうか、決定することが可能である。直接Pタンパク質に結合する
ことが可能であり、そしてまた、チロシナーゼ活性または局在あるいはメラニン
形成の他のある側面にも影響を与える化合物は、直接、Pタンパク質機能に影響
を与える可能性がある。あるいは、Pタンパク質機能に影響を与えるとして、一
次スクリーニング方法により同定された化合物を、チロシナーゼに直接影響を与
える能力に関し、試験してもよい。例えば、試験化合物を、チロシナーゼを含む
がPタンパク質を含まない系に添加してもよい。こうした系は、例えば、Pタンパ
ク質を含まないまたは本質的に含まない、精製されたまたは部分的に精製された
チロシナーゼタンパク質を含むin vitro系であってもよい。あるいは、該系は
、チロシナーゼを発現するが、Pタンパク質を発現しない系であってもよい。チ
ロシナーゼに対する試験化合物の影響が、Pタンパク質独立である場合、試験化
合物はPタンパク質機能に影響を与えない。チロシナーゼに対する試験化合物の
影響がまた、細胞通行の非存在においても観察される場合（例えば、精製チロシ
ナーゼタンパク質に対してであり、そして細胞内でない）も、試験化合物はPタ
ンパク質機能を模倣しない。
【００８０】 好ましい一次スクリーニング方法、特に高処理スクリーニング方法であるもの
は、最低のコストのものである（すなわち、可能な限り、迅速に、少ない人の監
督で、そして少ない成分を用いて行うことが可能である）が、二次スクリーニン
グ方法は、より時間、労働および成分集中的であってもよい。これは、二次スク
リーニング方法が、一次スクリーニング方法により、Pタンパク質機能に影響を
与えるまたは該機能を模倣すると同定された試験化合物に対してのみ、行われる
ためである。これらの化合物は、いかなるものでもよい大規模高処理スクリーニ
ング努力で試験された化合物の総数のごくわずかであると期待される。一次スク
リーニングより、二次スクリーニングに、より適切であるスクリーニング方法の
例には、動物（例えば局所的、皮下的、または経口的）または培養中で増殖させ
た動物皮膚同等物への試験化合物の投与が含まれてもよく、ここで、皮膚または
皮膚同等物の色が明るくなることは、該化合物がPタンパク質機能を阻害するこ
とを示す。または、Pタンパク質機能を模倣する化合物に関しては、二次スクリ
ーニングには、melan−p動物または動物皮膚同等物への試験化合物の投与が含ま
れてもよく、ここで、皮膚または皮膚同等物の色が濃くなることは、該化合物が
Pタンパク質機能を模倣することを示す。
【００８１】 一次または二次スクリーニング方法は、別の方法で用い、Pタンパク質機能に
影響を与えるまたは該機能を模倣する化合物を同定してもよい。例えば、一次ス
クリーニングを用いることにより、Pタンパク質機能に影響を与えるまたは該機
能を模倣する化合物がひとたび同定されたら、該化合物の化学的類似体を選択し
、または生成してもよい。本発明の目的のため、「化学的類似体」という用語は
、別の化学的化合物と化学的に関連する化合物と同定される。この関係は、例え
ば、2つの化合物が、置換基、例えばヒドロキシルまたはアルキル基の位置のみ
で異なるか、あるいは互いに化学的同族体である場合など、好ましくは、当該技
術分野に知られるように構造的である。あるいは、この関係は、例えば、両方の
化合物が同一の機構に影響を与える、例えば両化合物がキナーゼ阻害剤である場
合など、機能的であってもよい。化学的類似体を設計するまたは選択するための
方法は、以下の2項に記載される。これらの化学的類似体は、その後、例えば、
上述のいかなる方法を用い、Pタンパク質機能に影響を与えるまたは該機能を模
倣する能力に関し、試験してもよい。二次スクリーニング方法は、一次スクリー
ニング方法と同一であってもよいし、または異なるスクリーニング方法であって
もよい。元来の試験化合物より、Pタンパク質機能に対するより強い影響を有す
る化学的類似体が求められる。この方法を連続的に繰り返し、有効性を増加させ
る化合物を同定してもよい。
【００８２】 2． Pタンパク質機能を阻害する、増加させる、または模倣するための化合物 ； 本発明にしたがってスクリーニングすることが可能な化合物には、限定される
わけではないが、細胞への進入が可能であり、そしてPタンパク質活性に影響を
与える小さい有機分子が含まれる。いくつかの供給源のみをあげると、Pharmaco
peia（ニュージャージー州プリンストン）、Arqule（マサチューセッツ州メッド
フォード）、Enzymed（アイオワ州アイオワシティー）、Sigma−Aldrich（ミズ
ーリ州セントルイス）、Maybridge（英国・トレビレット）、Trega（カリフォル
ニア州サンディエゴ）およびPanLabs（ワシントン州ボセル）などの会社から、
いくつかの化合物ライブラリーが、商業的に入手可能である。また、天然産物ま
たは合成化学薬品、およびタンパク質を含む生物学的活性成分を含む、既知の化
合物のライブラリーを、Pタンパク質機能に影響を与えるまたは該機能を模倣す
る化合物に関し、スクリーニングしてもよい。
【００８３】 本発明の方法における使用のための、好ましい化合物の1つの種類は、イミプ
ラミンの化学的類似体を含む。上述のように、イミプラミンは、Pタンパク質機
能を阻害する。イミプラミンは、うつ病の治療に用いられる、三環式第三級アミ
ンである。Gilman， A．G．ら監修， 1990， GoodmanおよびGilman’s The
Pharmacological Basis of Therapeutics， 第8版， 405−14， Pergam
on Press， ニューヨークを参照されたい。うつ病の治療に用いられる、他の
三環式第三級アミン、例えば、アミトリプチリン、トリミプラミン、またはドキ
セピン（同上を参照されたい）が、Pタンパク質に影響を与える化合物に関する
スクリーニングの試験化合物であってもよい。うつ病の治療に用いられる第二級
アミン、例えば、デシプラミン、ノルトリプチリン、プロトリプチリン、アモキ
サピン、またはマプロチリン（同上を参照されたい）もまた、本発明のスクリー
ニングのための好ましい化合物である。イミプラミンのこれらの化学的類似体は
、すべて、イミプラミンと構造的および機能的特性を共有する。本発明の方法に
おける使用に好ましい化合物である、イミプラミンの他の化学的類似体には、イ
ミプラミンに、機能的および／または構造的類似性を持つ化学薬品が含まれる。
例えば、代表的ではない抗うつ剤、例えばトラゾドンおよびフルオキセチンは、
イミプラミンとの構造的類似性を欠く（同上を参照されたい）が、有用な抗うつ
剤であることで、イミプラミンと機能的な特性を共有し、そしてしたがって、本
発明のスクリーニングの好ましい化合物である。抗うつ効果を持たない、三環式
化合物、第三級アミン、および第二級アミンもまた、本発明の好ましい化合物で
ある。
【００８４】 ひとたびPタンパク質機能に影響を与えるまたは該機能を模倣する化合物が同
定されたら、分子モデリング技術を用い、より有効な、該化合物の化学的類似体
を設計してもよい。例えば、イミプラミン、または上に列挙される他の好ましい
化合物のいずれの化学的類似体を、これらのまたは他のモデリング技術を用い、
生成してもよい。分子モデリング系の例は、CHARM（Polygen Corporation、マ
サチューセッツ州ウォルサム）およびQUANTA（Molecular Simulations Inc．
、カリフォルニア州サンディエゴ）プログラムである。CHARMは、エネルギー最
小化および分子力学機能を行う。QUANTAは、分子構造の構築、図式的モデリング
および解析を行う。QUANTAは、分子の互いとの相互作用構築、修飾、視覚化、お
よび振る舞いの解析を可能にする。
【００８５】 例えば、ひとたびPタンパク質機能に影響を与えるまたは該機能を模倣する化
合物が同定されたら、該化合物を用い、仮説を生成してもよい。こうした仮説は
、例えば、プログラムCatalyst（Molecular Simulations Inc．、カリフォル
ニア州サンディエゴ）を用い、本発明の好ましい化合物のいかなる1つから生成
してもよい。さらに、Catalystは、該仮説を用い、例えばCambridge小分子デー
タベース（英国・ケンブリッジ）などの所有（proprietary）データベースと共
に、他のデータベースまたは化合物ライブラリー、例えば上に引用されるものを
検索し、本発明の化合物のさらなる例を同定することが可能である。
【００８６】 本発明の化合物はさらに、モデリングパッケージ、例えば、Ludi、Insight I
I、C2−MinimizerおよびAffinity（Molecular Simulations Inc．、カリフォ
ルニア州サンディエゴ）を用い、より有効な類似体を設計するのに用いてもよい
。特に好ましいモデリングパッケージは、MacroModel（コロンビア大学、ニュー
ヨーク州ニューヨーク）である。
【００８７】 本発明の化合物は、合理的コンビナトリアルライブラリーを発展させるための
基礎として、さらに用いてもよい。こうしたライブラリーはまた、より有効な化
合物を同定するため、スクリーニングしてもよい。コンビナトリアルライブラリ
ーの性質は、ライブラリーの基礎を形成するため、本発明の好ましい化合物から
選択される特定の化合物と共に、樹脂を用いてライブラリーを合成したいという
願望などの多様な要因に応じるが、本発明の化合物が、C2−QSAR（Molecular S
imulations Inc．、カリフォルニア州サンディエゴ）などのコンビナトリアル
設計プログラムに適した必須のデータを提供することが認識されるであろう。
【００８８】 Pタンパク質の機能を阻害するのに用いてもよい化合物の別の種類は、Pタンパ
ク質をコードする遺伝子アンチセンス核酸である。Pタンパク質をコードする遺
伝子アンチセンス核酸は、本明細書において、Pタンパク質−コードRNA（好まし
くはmRNA）の一部に、ある程度の度合いの配列相補性のためにハイブリダイズす
ることが可能な核酸配列を有するオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド分
子を指す。アンチセンス核酸は、合成されるPタンパク質量を減少させることに
より、Pタンパク質機能を阻害するように、Pタンパク質mRNAのコードおよび／ま
たは非コード領域いずれかに相補的でなければならない。
【００８９】 本発明のアンチセンス核酸は、二本鎖または一本鎖RNAまたはDNA、あるいはそ
の修飾または類似体であって、直接、細胞、または動物の皮膚に投与することが
可能であるか、あるいは、異種性導入配列の転写により、細胞内で産生されるこ
とが可能であるオリゴヌクレオチドである。
【００９０】 1つの態様において、本発明は、原核または真核細胞において、Pタンパク質−
コード核酸配列の発現を阻害するための方法であって、該細胞に、本発明のPタ
ンパク質をコードする遺伝子アンチセンス核酸を含む有効量の組成物を提供する
ことを含む、前記方法に関する。
【００９１】 本発明のPタンパク質をコードする遺伝子アンチセンス核酸は、少なくとも長
さ約6ヌクレオチドであり、そしてより好ましくは、約6ないし約50オリゴヌクレ
オチドの範囲のオリゴヌクレオチドである。特定の側面において、該オリゴヌク
レオチドは、少なくとも長さ約10ヌクレオチドであり、少なくとも約15ヌクレオ
チドであり、少なくとも約100ヌクレオチドであり、または少なくとも約200ヌク
レオチドである。該オリゴヌクレオチドは、DNAまたはRNA，あるいはキメラ混合
物または誘導体、およびその修飾型であってもよく、これはまた、一本鎖または
二本鎖でもよい。該オリゴヌクレオチドは、塩基部分、糖部分、またはリン酸骨
格レベルで修飾してもよい。該オリゴヌクレオチドは、他の付随する基、例えば
ペプチド、または細胞膜を越える輸送を促進する剤（例えば、Letsingerら 198
9， Proc． Natl． Acad． Sci． U．S．A． 86：6553−6556； Lemaitr
eら， 1987， Proc． Natl． Acad． Sci． 84：648−652； PCT刊行物
第WO 88／09810号、1988年12月15日公表を参照されたい）、ハイブリダイゼー
ション誘発切断剤（例えば、Krolら， 1988， BioTechniques 6：958−976を
参照されたい）、または挿入（intercalating）剤（例えば、Zon， 1988， Ph
arm． Res． 5：539−549を参照されたい）を含んでもよい。
【００９２】 本発明の好ましい側面において、Pタンパク質をコードする遺伝子アンチセン
スオリゴヌクレオチドは、一本鎖DNA分子である。該オリゴヌクレオチドは、当
該技術分野に一般的に知られる置換基を用い、その構造上のいかなる位で修飾し
てもよい。
【００９３】 Pタンパク質をコードする遺伝子アンチセンスオリゴヌクレオチドは、限定さ
れるわけではないが、5−フルオロウラシル、5−ブロモウラシル、5−クロロウ
ラシル、5−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、4−アセチルシトシ
ン、5−（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、5−カルボキシメチルアミ
ノメチル−2−チオウリジン、5−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒ
ドロウラシル、ベータ−D−ガラクトシルキューオシン、イノシン、N6−イソペ
ンテニルアデニン、1−メチルグアニン、1−メチルシトシン、2，2−ジメチルグ
アニン、2−メチルアデニン、2−メチルグアニン、3−メチルシトシン、5−メチ
ルシトシン、N6−アデニン、7−メチルグアニン、5−メチルアミノメチルウラシ
ル、5−メトキシアミノメチル−2−チオウラシル、ベータ−D−マンノシルキュ
ーオシン、5N−メトキシカルボキシメチルウラシル、5−メトキシウラシル、2−
メチルチオ−N6−イソペンテニルアデニン、ウラシル−5−オキシ酢酸（v）、ワ
イブトキソシン、プソイドウラシル、キューオシン、2−チオシトシン、5−メチ
ル−2−チオウラシル、2−チオウラシル、4−チオウラシル、5−メチルウラシル
、ウラシル−5−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−5−オキシ酢酸（v）、5
−メチル−2−チオウラシル、3−（3−アミノ−3−N−2−カルボキシプロピル）
ウラシル、（acp3）w、および2，6−ジアミノプリンを含む群から選択される、
少なくとも1つの修飾塩基部分を含んでもよい。
【００９４】 別の態様において、オリゴヌクレオチドは、限定されるわけではないが、アラ
ビノース、2−フルオロアラビノース、キシルロース、およびヘキソースを含む
群から選択される、少なくとも1つの修飾糖部分を含む。
【００９５】 さらに別の態様において、オリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエート、ホス
ホロジチオエート、ホスホロアミドチオエート、ホスホロアミデート、ホスホロ
ジアミデート、メチルホスホネート、アルキルホスホトリエステル、およびホル
ムアセチルまたはその類似体からなる群より選択される、少なくとも1つの修飾
リン酸骨格構成要素を含む。
【００９６】 さらに別の態様において、オリゴヌクレオチドは、アルファ−アノマーオリゴ
ヌクレオチドである。アルファ−アノマーオリゴヌクレオチドは、通常のベータ
単位と対照的に、鎖が互いに平行に走る、相補的RNAとの特異的な二本鎖ハイブ
リッドを形成する（Gautierら， 1987， Nucl． Acids Res． 15：6625−6
641）。
【００９７】 オリゴヌクレオチドを、別の分子、例えば、ペプチド、ハイブリダイゼーショ
ン誘発架橋剤、輸送剤、ハイブリダイゼーション誘発切断剤などに結合体化して
もよい。
【００９８】 本発明のオリゴヌクレオチドは、例えば、自動化DNA合成装置（例えばBiosear
ch、Applied Biosystemsなどより商業的に入手可能なもの）の使用によるもの
を含む、当該技術分野に知られる標準的方法により、合成してもよい。例えば、
ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、Steinら， 1988， Nucl． Acids
Res． 16：3209の方法により合成することが可能であり、そしてメチルホス
ホネートオリゴヌクレオチドは、Sarinら， 1988， Proc． Natl． Acad．
Sci． U．S．A． 85：7448−7451などの方法を用い、調節孔ガラスポリマー
支持体の使用により、調製してもよい。
【００９９】 特定の態様において、Pタンパク質アンチセンスオリゴヌクレオチドは、触媒R
NAまたはリボザイム（例えば、PCT国際公告第WO 90／11364号、1990年10月4日
公表； Sarverら， 1990， Science 247：1222−1225を参照されたい）を含
む。別の態様において、オリゴヌクレオチドは、2’−O−メチルリボヌクレオチ
ド（Inoueら， 1987， Nucl． Acids Res． 15：6131−6148）、またはキ
メラRNA−DNA類似体（Inoueら， 1987， FEBS Lett． 215：327−330）であ
る。
【０１００】 別の態様において、本発明のPタンパク質をコードする遺伝子アンチセンス核
酸は、異種性配列からの転写により、細胞内で産生される。例えば、細胞に取り
込まれ、細胞内部で、ベクターまたはその一部が転写され、本発明のアンチセン
ス核酸（RNA）を産生するように、in vivoでベクターを導入してもよい。こう
したベクターは、Pタンパク質をコードする遺伝子アンチセンス核酸をコードす
る配列を含むであろう。こうしたベクターは、転写され、望ましいアンチセンス
RNAを生じることが可能である限り、エピソームにあってもよいし、または染色
体に組み込まれてもよい。こうしたベクターは、当該技術分野に知られる標準的
な組換えDNA技術の方法により、構築してもよい。ベクターは、プラスミド、ウ
イルスベクター、または哺乳動物細胞における複製および発現に有用であると当
該技術分野に知られる他のものであってもよい。Pタンパク質をコードする遺伝
子アンチセンスRNAをコードする配列の発現は、こうした細胞において作用する
ことが当該技術分野に知られるいかなるプロモーターにより、制御されてもよい
。こうしたプロモーターは、誘導性であっても恒常性であってもよく、そして限
定されるわけではないが、上に列挙されるものを含んでもよい。
【０１０１】 本発明のアンチセンス核酸は、Pタンパク質をコードする遺伝子、好ましくは
ヒトPタンパク質をコードする遺伝子のRNA転写物の少なくとも一部に相補的な配
列を含む。しかし、アンチセンス核酸が、RNAとハイブリダイズするのに十分な
相補性を有し、安定な二重鎖を形成する限り、絶対相補性は、好ましいが必要で
はない。二本鎖Pタンパク質をコードする遺伝子アンチセンス核酸の場合、二重
鎖DNAの一本鎖をこうして試験し、または三重鎖形成をアッセイしてもよい。ハ
イブリダイズする能力は、相補性の度合いおよびアンチセンス核酸の長さ両方に
依存するであろう。一般的に、ハイブリダイズ核酸がより長ければ、Pタンパク
質をコードする遺伝子RNAとのより多くの塩基ミスマッチを含んでもよく、そし
て、それでも安定な二重鎖（場合によって、三重鎖）を形成する。当業者は、例
えばハイブリダイズ複合体の融点を測定する標準的方法の使用により、ミスマッ
チ寛容性を決定することが可能である。
【０１０２】 3． Pタンパク質機能を阻害する、増加させる、または模倣する方法； Pタンパク質機能に影響を与えるまたは該機能を模倣する化合物を用い、メラ
ニンの産生または過剰産生により引き起こされる疾患、異常、または障害を有す
る動物、または好ましくはヒトを治療してもよい。こうした疾患、異常、または
障害には、皮膚または体毛の変色により特徴付けることが可能なもの、例えば、
炎症により、または黒皮症などの疾患から引き起こされる色素過剰、あるいは茶
色の点、例えば「カフェオレ」斑が含まれる。あるいは、被験者は、体毛または
皮膚の色を明るくすることを望む可能性がある。Pタンパク質機能を増加させる
またはPタンパク質機能を模倣する化合物を用い、メラニンの過少発現により引
き起こされる疾患、異常、または障害、例えば、炎症後色素低下、白色ひこう疹
、および特定の型の白色症、例えばOCA II白色症を有する動物、または好まし
くはヒトを治療してもよい。さらに、こうした化合物を用い、体毛または皮膚の
色を黒くしてもよい。本出願の目的のため、「治療」「療法的使用」、および「
医薬品使用」という用語は、疾患状態あるいは1つまたはそれ以上の症状を取り
除く、あるいはそうでなければ疾患あるいは1つまたはそれ以上の他の望ましく
ない症状の進行を、どのような方式でも、予防し、妨げ、遅延させ、または逆転
させる、本発明の組成物のいかなるものでもよいまたはすべての使用を指すもの
とする。
【０１０３】 3．1 薬学的適用； 薬学的使用のため、Pタンパク質機能に影響を与えるまたは該機能を模倣する
化合物が、薬剤組成物の一部であることが好ましい。薬学的に許容しうるキャリ
アー中に、Pタンパク質機能に影響を与える化合物の有効量を含む薬剤組成物を
、メラニンを産生する、または過剰産生する種類である疾患、障害、または異常
を有する患者、個人、動物に投与してもよい。
【０１０４】 Pタンパク質機能に影響を与えるまたは該機能を模倣する化合物の、特定の疾
患、障害、または異常の治療に有効であるであろう量は、疾患、障害、または異
常の性質に応じるであろうし、そして標準的な臨床的技術により、決定すること
が可能である。可能な場合、in vitroで、そしてその後、ヒトで試験しそして
使用する前に、有用な動物モデル系で、治療しようとする組織種に対する化合物
の細胞毒性を決定することが望ましい。
【０１０５】 Pタンパク質機能に影響を与えるまたは該機能を模倣する化合物は、活性剤と
、哺乳動物の体内の作用部位の接触を生じるいかなる手段により、メラニン合成
の減少または増加のため、投与してもよい。化合物は、薬剤に関し、使用するの
に利用可能ないかなる慣用的な手段により、個々の療法剤として、または療法剤
の組み合わせで、投与してもよい。各々は単独で投与してもよいが、好ましくは
、選択された投与経路および標準的な薬学的実施に基づいて選択される薬学的キ
ャリアーと共に、投与される。本発明の薬剤組成物は、薬学業の当業者に公知の
方式で、経口、非経口、局所、または直腸投与のため、適応させてもよく、そし
て単位投薬型であってもよい。非経口投与には、限定されるわけではないが、皮
下、静脈内、腹腔内または筋内注射が含まれる。しかし、局所適用が好ましい。
【０１０６】 3．2 美容的適用； 薬学的使用に加え、本発明の方法は、美容的適用に有用である。本発明の方法
のための美容的適用には、皮膚または体毛の視覚的外見を亢進するまたはそうで
なければ改変する、Pタンパク質機能に影響を与えるまたは該機能を模倣する1つ
またはそれ以上の化合物を含む組成物の局所適用が含まれる。メラニン産生、過
剰産生または過少産生の結果としての、皮膚または体毛における、人目を引くが
、望ましくない色素沈着の発生は、本発明の方法を用い、治療することが可能で
ある。
【０１０７】 3．3 終点および投薬量； 有効投薬量および治療プロトコルは、慣用的な方法により、実験動物において
、低用量で開始し、そしてその後、効果をモニターしながら投薬量を増加させ、
そしてまた投薬措置を体系的に変化させることにより、決定することが可能であ
る。動物研究、好ましくは、哺乳動物研究は、キログラム体重当たりの生物活性
剤の最大寛容用量、またはMTDを決定するのに通常用いられる。当業者は、ヒト
を含む他の種に対し、有効でそして毒性を避ける用量を推測することが可能であ
る。
【０１０８】 有効性のヒト研究を行う前に、正常被験者での第1相臨床研究は、安全用量を
確立するのを補助することが可能である。既定の被験者に対する最適投薬量を決
定する際、臨床医は、多くの要因を考慮に入れる可能性がある。これらのうち主
なものは、Pタンパク質機能に影響を与えるまたは該機能を模倣する、選択され
た化合物の毒性および半減期である。さらなる要因には、患者の大きさ、患者の
年齢、患者の全身状態、治療される特定の疾患、異常、または障害、治療される
疾患、異常、または障害の重症度、患者中の他の薬剤の存在、望ましい効果、お
よびそれらに匹敵するものが含まれる。試験投薬量は、動物実験の結果および臨
床的文献を考慮した後、選択されるであろう。
【０１０９】 一般の当業者は、特定の場合に選択される終点は、治療される疾患、異常、ま
たは障害、患者、被験者、または治療医師により望まれる結果、および他の要因
に応じ、異なるであろうことを認識するであろう。組成物が、例えば炎症または
疾患、例えば黒皮症により引き起こされる過剰色素沈着を逆転させるため、ある
いは体毛の色を明るくするまたは黒っぽくするため、用いられる場合、いくつか
の終点のいかなる1つを選択してもよい。例えば、終点は、例えば、被験者が、
治療の結果に、単に「満足」した場合、主観的に定義してもよい。薬理学的組成
物では、終点は、患者または治療医師が治療の結果に満足することにより、決定
してもよい。あるいは、終点は、客観的に定義してもよい。例えば、患者または
被験者の治療部位の皮膚または体毛を、色チャートに比較してもよい。治療は、
治療領域の皮膚または体毛の色が、チャート上の色に似た外見になったとき、終
結する。あるいは、治療された皮膚または体毛の反射率を測定し、そして治療さ
れた皮膚または体毛が、指定された反射率に到達したとき、終結してもよい。あ
るいは、治療された体毛または皮膚のメラニン含量を測定してもよい。治療は、
治療された体毛または皮膚のメラニン含量が、指定された値に到達したとき、終
結してもよい。メラニン含量は、当該技術分野に知られるいかなる方法により決
定してもよく、メラニンに関する染色による亢進を伴うまたは伴わない、組織学
的方法によるものを含む。
【０１１０】 3．4 投与法； Pタンパク質機能に影響を与えるまたは該機能を模倣する化合物（すなわち活
性成分）は、固体または半固体投薬型、例えば硬または軟ゼラチンカプセル、錠
剤、または粉末中で、あるいは、液体投薬型、例えばエリキシル剤、シロップ、
または懸濁液中で、経口投与してもよい。該化合物はまた、無菌液体投薬型で、
非経口的に投与してもよい。局所適用が好ましいため、他の投薬型、例えばパッ
チ、軟膏、クリーム、ゲル、ローション、溶液、座薬または経皮投与が潜在的に
可能である。
【０１１１】 in vivo使用が意図されるため、組成物が、高純度で、そして潜在的に有害な
混入物質を実質的に含まない、例えば少なくとも米国食品（National Food）（
NF）等級、一般的に少なくとも分析等級、そして好ましくは少なくとも薬剤等級
であることが好ましい。既定の化合物が使用前に合成されなければならない程度
まで、こうした合成またはそれに続く精製は、好ましくは、合成または精製法中
用いられた可能性がある、いかなる潜在的な混入毒性剤も実質的に含まない産物
を生じるだろう。
【０１１２】 ゼラチンカプセルまたは液体充填軟ゼラチンカプセルは、活性成分および粉末
化または液体キャリアー、例えばラクトース、レシチンデンプン、セルロース誘
導体、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、およびそれらに匹敵するもの
を含んでもよい。同様の希釈剤を用い、圧縮錠剤を作成してもよい。錠剤および
カプセルは共に、数時間の期間に渡り、医薬品の連続的放出を提供する、持続放
出製品として製造してもよい。圧縮錠剤は、糖衣またはフィルム被覆し、いかな
る好ましくない風味も隠し、そして錠剤を空気から保護してもよいし、あるいは
、胃腸管における選択的標的化分解のため、腸被覆してもよい。経口投与のため
の液体投薬型は、患者の許容性を増加させるため、着色剤および／またはフレー
バー剤を含んでもよい。
【０１１３】 一般的に、無菌水、油、生理食塩水、水性デキストロース（グルコース）、ポ
リソルベートおよび関連糖溶液およびグリコール類、例えばプロピレングリコー
ルまたはポリエチレングリコール類が、非経口溶液に適したキャリアーである。
非経口投与のための溶液またはエマルジョンは、好ましくは、約5−15％のポリ
ソルベート80またはレシチン、適切な安定化剤、および必要な場合、緩衝物質を
含む。抗酸化剤、例えば限定されるわけではないが、単独のまたは組み合わせた
亜硫酸水素ナトリウム、亜硫酸ナトリウム、またはアスコルビン酸が、適切な安
定化剤である。やはり有用なのは、クエン酸およびその塩、並びにEDTAナトリウ
ムである。さらに、非経口溶液は、限定されるわけではないが、塩化ベンザルコ
ニウム、メチルまたはプロピル−パラベン、およびクロロブタノールを含む、保
存剤を含んでもよい。
【０１１４】 適切な薬学的キャリアーはさらに、本明細書に完全に援用される、本分野の標
準的な参照教科書であるRemington’s Pharmaceutical Sciences， 第17版，
Mack Publishing Company， ペンシルバニア州イーストン（1990）に記載
される。
【０１１５】 Pタンパク質機能に影響を与えるまたは該機能を模倣する化合物の投与に有用
な薬剤投薬型は、以下に記載される。 局所適用には、Pタンパク質機能に影響を与えるまたは該機能を模倣する化合
物を、溶液、ゲル、ローション、軟膏、クリーム、懸濁液、ペースト、リニメン
ト剤、粉末、チンキ、エアロゾル、経皮薬剤搬送系、または当該技術分野に公知
の方法により、薬学的または美容的に許容しうる型のそれらに匹敵するものとし
て、処方してもよい。組成物は、動物またはヒトへの局所適用のための、薬学ま
たは美容業に一般的な多様な型のいずれであってもよく、溶液、ローション、ス
プレー、クリーム、軟膏、膏薬（salves）、ゲルなどが含まれる。好ましい剤は
、治療される領域上にとどまるのに十分に粘性であるもの、容易に蒸発しないも
の、および／または水、所望により石鹸、洗剤および／またはシャンプーの補助
を伴うリンスにより、容易に除去されるものである。局所処方を調製するための
実際の方法は、当業者に知られまたは明らかであり、そしてRemington’s Phar
maceutical Sciences， 1990（上記）；およびPharmaceutical Dosage Form
s and Drug Delivery Systems， 第6版， Williams ＆ Wilkins（1995
）に詳細に記載される。
【０１１６】 活性成分の経皮吸収を亢進するため、限定されるわけではないが、ジメチルス
ルホキシド、ジメチルアセトアミド、ジメチルホルムアミド、界面活性剤、アゾ
ン（azone）、アルコール、アセトン、プロピレングリコールおよびポリエチレ
ングリコールを含む、1つまたはそれ以上のいくつかの剤を、局所処方に添加し
てもよい。さらに、イオン泳動法（iontophoresis）または超音波導入法（sonop
horesis）によるなど、物理的方法も用い、経皮浸透を亢進してもよい。あるい
は、またはさらに、リポソームを使用してもよい。
【０１１７】 薬剤組成物は、皮膚に直接適用してもよい。あるいは、これらは、多様な経皮
薬剤搬送系、例えば当該技術分野に知られるような、経皮パッチにより、搬送し
てもよい。
【０１１８】 本発明は、記載されてきており、以下の実施例は、例示の手段として提供され
、そして限定のためではない。
【０１１９】
【実施例】
実施例1：標的化機能スクリーニング： 本実施例において、チロシナーゼの細胞標的化に対するPタンパク質の影響を
調べた。その後、本機能を、Pタンパク質の活性を阻害する化合物に関するスク
リーニングで利用した。
【０１２０】 1． 材料および方法； p遺伝子座で野生型であるC57BL16Jマウス由来の不死化メラノサイト株、melan
−a細胞（a／a、P／P）（Bennetttら， 1987， Int． J． Cancer 39：414
−418）を、イーグル培地のダルベッコ修飾（DME）中の培養で維持した。重複す
る欠失（a／a、pcp／p25H）の存在のため、すべてのp遺伝子転写物を欠くマウス
由来のmelan−p1メラノサイト（Sviderskayaら， 1997， J． Invest． Der
matol． 108：30−34）を、HamのF10培地中で維持した。どちらの培地も、10％
ウシ胎児血清、5％ ピルビン酸ナトリウム、5％ グルタミン酸、5単位／ml
ペニシリン、5μg／ml ストレプトマイシン、1％ 非必須アミノ酸および200
nM 12−O−テトラデカノイルホルボール13−アセテートを補った。さらに、m
elan−p1細胞には、200 pM コレラ毒素を添加した。
【０１２１】 細胞は、適切な培地中で維持し、これをその後、低チロシン条件には0．03 m
M チロシン、または高チロシン条件には、0．3 mM チロシンいずれかを補っ
た、チロシン欠損DME培地（DME−D）と置き換えた（Bennettt， D．C．ら， 1
987， Int． J． Cancer 39：414−418）（Sviderskayaら， J． Invest
． Dermatol． 108：30−34）。培地のアリコットを抜き取り、0．1 M リン
酸ナトリウム緩衝液、pH 6．8に対し透析し、そして放射測定チロシン加水分解
酵素アッセイ（Orlow， S．J．ら， 1990， J． Invest． Dermatol． 94
：461−64）を用い、チロシナーゼ活性に関し、解析した。
【０１２２】 試験化合物での処理には、培養melan−aメラノサイトを、上述のような培地中
の低チロシンの存在下で、しかし、ベンズトロピン（10マイクロモル最終濃度）
、またはイミプラミン（10マイクロモル最終濃度）、またはニトロキパジン（30
マイクロモル最終濃度）の存在下で48時間インキュベーションするか、あるいは
処理せず放置した。上述のように、チロシナーゼ活性に関し、インキュベーショ
ン培地をアッセイした。
【０１２３】 2． 結果； 低チロシンの存在下で増殖させたmelan−p細胞培養から除去した培地中のチロ
シナーゼ活性の増加は、これらの細胞が、比較的多量のチロシナーゼをそのイン
キュベーション培地中に分泌することを示す（図1）。対照的に、野生型メラノ
サイトに相当するmelan−a細胞は、培地中に、有意により少ないチロシナーゼを
分泌する（図1）。過剰なチロシンの存在下の培養は、melan−a細胞にほとんど
影響を持たなかったが、melan−p1細胞に分泌される酵素の量は、減少した。上
に予測されるように、チロシンは、melan−p1細胞において、チロシナーゼの誤
った輸送を部分的に正すようである。
【０１２４】 ベンズトロピンでの処理は、melan−a細胞のインキュベーション培地に分泌さ
れるチロシナーゼ活性のレベルを改変しなかった（図2）。イミプラミンまたは
ニトロキパジンいずれかでの処理は、該細胞のインキュベーション培地に見られ
るチロシナーゼ活性のレベルを有意に増加させた（図2）。
【０１２５】 3． 考察； melan−a細胞は、野生型マウス由来のメラノサイトである。該細胞は、完全に
機能するPタンパク質およびチロシナーゼを有し、そしてメラニンを産生する。
しかし、melan−p細胞は、p−ヌルマウス由来であり、全p遺伝子コード配列の欠
失を有する。したがって、該細胞はPタンパク質をまったく産生しない。その結
果、melan−p細胞は、melan−a細胞より、より低いチロシナーゼ活性を有し、そ
してより少ないメラニンを作成する。
【０１２６】 いかなる種類のメラニン形成細胞で行ってもよい本実施例は、Pタンパク質機
能を欠くメラノサイトが、正常Pタンパク質機能を持つメラノサイトより、増殖
またはインキュベーション培地中に、有意により多くのチロシナーゼを分泌する
ことを立証する。この結果は、melan−p細胞におけるように、細胞が遺伝的に改
変され、Pタンパク質機能が減少しているかまたは除去されている場合（図1）、
あるいは、細胞が、Pタンパク質機能を阻害する化合物、例えばイミプラミンで
処理されている場合（図2）、いずれかに得られる。
【０１２７】 実施例2：チロシナーゼ活性スクリーニング： 本実施例では、チロシナーゼを発現するよう遺伝的に操作された細胞由来のチ
ロシナーゼの測定可能酵素的活性に対するPタンパク質の影響を調べた。Pタンパ
ク質およびチロシナーゼを両方発現するいかなるメラニン形成細胞種、またはP
タンパク質およびチロシナーゼを両方発現するように作成されたいかなる細胞種
を代用してもよい。その後、この機能を、Pタンパク質の機能を阻害する化合物
に関するスクリーニングで利用した。
【０１２８】 1． 材料および方法； 実施例1で上述されるような、培養melan−aメラノサイトを、ベンズトロピン
（10マイクロモル最終濃度）、またはイミプラミン（10マイクロモル最終濃度）
、またはニトロキパジン（30マイクロモル最終濃度）の存在下で48時間インキュ
ベーションするか、あるいは処理せず放置した。細胞を洗浄し、そして50 mM
Tris−HCl（pH 7．4）、2 mM EDTA、150 mM NaClおよび1％ Triton X−1
00で抽出した。放射測定チロシン加水分解酵素アッセイを用い、チロシナーゼ活
性に関し、細胞抽出物を解析した（Orlow， S．J．ら， 1990、上記）。
【０１２９】 培養細胞中で、Pタンパク質およびチロシナーゼ遺伝子を発現する、発現ベク
ターを構築した。具体的には、クローンTYBS（Yokohamaら， 1990， Nucl．
Acids． Res． 18：7293−7298）から、HindIII−EcoRI断片として、チロシナ
ーゼのコード配列を除去し、そしてpcDNA I／amp（Invitrogen、カリフォルニ
ア州）のHindIII／EcoRI部位にクローニングした。MC2701（Gardnerら， 1992
、上記）から、BamHI−EcoRV断片として、Pタンパク質のコード配列を除去し、
そしてpcDNA3およびpcDNA3．1／V5／His−TOPO（Invitrogen、カリフォルニア州
）のBamHI／EcoRV部位にクローニングした。COS細胞を、pcDNA1に基づくプラス
ミドおよびトランスフェクション剤としてのFuGENETM6（Roche Molecular Bio
chemicals、インディアナ州インディアナポリス）で、48時間トランスフェクシ
ョンした。細胞を：（i）ベクターのみ；（ii）チロシナーゼをコードする遺伝
子を持つベクター；（iii）Pタンパク質をコードする遺伝子を持つベクター；ま
たは（iv）チロシナーゼをコードする遺伝子およびPタンパク質をコードする遺
伝子を持つベクターで形質転換した。形質転換細胞を洗浄し、そして上述のよう
に抽出した。その後、チロシナーゼ活性を、上述のように測定した。チロシナー
ゼアッセイは、細胞タンパク質60マイクログラムに対して行った。
【０１３０】 上述のように、チロシナーゼをコードする遺伝子を持つベクター、またはチロ
シナーゼをコードする遺伝子およびPタンパク質をコードする遺伝子を持つベク
ターでトランスフェクションしたCOS細胞を、上述のように、ベンズトロピン、
またはイミプラミン、またはニトロキパジンで処理し、あるいは処理せず放置し
、そしてその後、上述のように、細胞抽出物を調製した。細胞抽出物のチロシナ
ーゼ活性は、上述のように測定した。
【０１３１】 2． 結果； 図2aに示されるように、ベンズトロピンまたはニトロキパジンで処理したmela
n−a由来の抽出物は、未処理細胞より高いチロシナーゼ活性を有した。イミプラ
ミンで処理した細胞由来の抽出物は、未処理細胞より低いチロシナーゼ活性を有
した。
【０１３２】 図3に示されるように、ベクター単独（V＋V）、またはPタンパク質をコードす
る遺伝子を持つベクター（V＋P）でトランスフェクションしたCOS細胞由来の抽
出物は、測定可能なチロシナーゼ活性を示さなかった。チロシナーゼをコードす
る遺伝子を持つベクター（V＋T）でトランスフェクションした細胞由来の抽出物
は、測定可能なチロシナーゼ活性を有し、一方、チロシナーゼをコードする遺伝
子およびPタンパク質をコードする遺伝子（T＋P）を持つベクターでトランスフ
ェクションした細胞由来の抽出物は、チロシナーゼをコードする遺伝子のみを持
つベクター（V＋T）でトランスフェクションした細胞の抽出物に見られるチロシ
ナーゼ活性より、およそ4倍高いチロシナーゼ活性を有した。
【０１３３】 図4は、Pタンパク質機能に対する3つの化合物の別個の影響を示す。ニトロキ
パジン（4）は、細胞がPタンパク質を発現しているかどうかに関わらず、チロシ
ナーゼ発現COS細胞由来の抽出物が、より低いチロシナーゼ活性を示すようにし
た。ベンズトロピン（2）は、これらの抽出物におけるチロシナーゼ活性に対し
、認識可能な影響を持たなかった。イミプラミン（3）は、Pタンパク質およびチ
ロシナーゼを両方発現している細胞のチロシナーゼ活性を劇的に減少させたが、
チロシナーゼのみを発現している細胞には、非常にわずかな影響しか持たなかっ
た。
【０１３４】 3． 考察； 本実施例は、細胞抽出物におけるPタンパク質機能およびチロシナーゼ活性の
間の関係を解明する。Pタンパク質を発現するメラノサイトは、Pタンパク質機能
を阻害する化合物の使用を通じ、Pタンパク質機能を欠く細胞を模倣するように
作成することが可能である。melan−a細胞は、Pタンパク質をコードする遺伝子
に関し、野生型である。それでも、これらの細胞をイミプラミンで処理した後、
これらの細胞から採取した抽出物は、未処理melan−a細胞より低いチロシナーゼ
活性を有する（図2）。対照的に、ベンズトロピンまたはニトロキパジンで処理
した細胞由来の抽出物は、未処理細胞より高いチロシナーゼ活性を有する（図2
）。
【０１３５】 COS細胞は、サル腎臓細胞に由来する。通常、これらはチロシナーゼもPタンパ
ク質も発現しない。本実施例は、COS細胞を、チロシナーゼをコードする遺伝子
およびPタンパク質コード遺伝子でトランスフェクションすることにより、「人
工的メラノサイト」とみなすことが可能なものを産生することが可能であること
を立証する。これらの細胞は、活性チロシナーゼおよびPタンパク質を発現し（
図3）、そしてメラニンさえ産生する。COS細胞をチロシナーゼをコードする遺伝
子およびPタンパク質をコードする遺伝子両方でコトランスフェクションすると
、チロシナーゼをコードする遺伝子のみでトランスフェクションしたCOS細胞よ
り、およそ4倍高いチロシナーゼ活性を持つ細胞が生じる（図3）。この結果は、
チロシナーゼの細胞内活性が、Pタンパク質発現により増加されたため、これら
の細胞でPタンパク質が発現され、そして活性であることを立証する。
【０１３６】 チロシナーゼをコードする遺伝子およびPタンパク質をコードする遺伝子両方
で形質転換し、そしてその後、イミプラミンで処理したCOS細胞の抽出物は、イ
ミプラミンで処理しない同様の細胞のチロシナーゼ活性の約3分の1しか含まなか
った（図4）。チロシナーゼをコードする遺伝子のみでトランスフェクションし
、そしてその後、イミプラミンで処理したCOS細胞のチロシナーゼ活性は、イミ
プラミンで処理しない同様の細胞の抽出物のチロシナーゼ活性と有意に異ならな
かった（図4）。これらの結果は、イミプラミンが、Pタンパク質機能を阻害する
ことにより、チロシナーゼ活性を減少させることを示す。対照的に、ベンズトロ
ピンは、細胞がPタンパク質を発現してもしなくても、トランスフェクションさ
れたCOS細胞の抽出物のチロシナーゼ活性を減少させなかった（図4）。さらに、
ニトロキパジンは、細胞がPタンパク質を発現してもしなくても、トランスフェ
クションされたCOS細胞の抽出物のチロシナーゼ活性を減少させた（図4）。この
結果は、ニトロキパジンが、Pタンパク質機能の阻害剤でないことを示す。
【０１３７】 実施例3：タンパク質分解から生じるmelan−p細胞におけるチロシナーゼの分
泌： 我々は培地中のチロシナーゼ活性を観察したが、Potterfら（1998， Exp．
Cell Res． 244：319−326）は、αPEP7を用い、培地中のチロシナーゼタンパ
ク質を検出しなかった。チロシナーゼは、膜に係留されるI型膜タンパク質であ
り、そしてしたがって、分泌には、テールの切り取りを導くタンパク質分解が必
要である可能性がある。一部切除タンパク質は、触媒ドメインが機能的なままで
あろうが、テールに対して向けられるαPEP7により検出されないであろう。我々
はしたがって、melan−aおよびmelan−p1細胞によるチロシナーゼの分泌に対す
る、一連のプロテアーゼ阻害剤の影響を調べた。エポキシスクシニルペプチドで
あり、そしてシステインプロテイナーゼの強力な阻害剤であるE64は、melan−p1
細胞の培地に分泌されるチロシナーゼの量を減少させるのに、最も有効であるこ
とが見出され（図5a）、したがって、チロシナーゼの分泌は、システイニルプロ
テアーゼの活性を遮断することにより、阻害されることが可能であることが立証
された。
【０１３８】 タンパク質分解およびチロシナーゼの分泌が、チロシナーゼの誤った輸送を急
に引き起こす要因であれば、E64は、melan−p1細胞におけるメラニン蓄積を増加
させるはずである。E64の影響をさらに調べ、そしてやはり培地への分泌を減少
させる、チロシンとの潜在的な相乗作用を調べた。低（0．03 mM）および高（0
．3 mM）チロシンで、E64濃度範囲を試験した。
【０１３９】 0．03 mM チロシンでは、12．5 μMのE64が、培地へのチロシナーゼの分泌
を7．1％から4．0％に低下させた（図5a）が、より高い濃度（25μM）では、E64
は、わずかにより有効であるだけであった（培地中で3．8％活性）。E64はまた
、より高いチロシン濃度（0．3 mM）で、チロシナーゼ分泌を減少させ、培地中
のチロシナーゼを6．5％から3．9％に減少させた。より高い濃度のE64は、より
有効ではなかった。驚くべきことに、E64は、高濃度のチロシンで、細胞内メラ
ニン産生を減少させた。したがって、タンパク質分解およびmelan−p1細胞から
のチロシナーゼの分泌を減少させる能力にも関わらず、E64は、チロシナーゼを
メラノソームに再輸送し、そしてメラニン合成および沈着を開始することが不可
能であった。
【０１４０】 実施例4：melan−aおよびmelan−p1細胞における超微細構造およびチロシナー ゼの比較： 1．材料および方法； メラノサイトを、Lab−Tekチャンバースライド（Nunc， Inc．、イリノイ州
ネーパービル）に植え付け、そして90％集密まで増殖させた。培養メラノサイト
を、pH 7．2のカコジル酸ナトリウム緩衝液中の半強度のKarnovsky固定剤（Kar
novsky， 1965）でウェル中で30分間、室温で固定した。ジヒドロキシフェニル
アラニン（DOPA）組織化学には、固定細胞を、0．1％ 1−DOPA中で、2．5時間
、2回インキュベーションした。細胞を緩衝液中で3回洗浄し、そして1．5％ フ
ェリシアン化カリウムを含む1．0％ 四酸化オスミウム（Karnovsky， 1971）
で、30分間処理した。細胞を洗浄し、一まとめにして、0．5％ 酢酸ウラニルで
30分間染色し、脱水し、そしてEponate 12に包埋した。Eponケースの領域を切
り落とし、そしてEpon釘上に乗せ、そしてRMC MT 6000−XLウルトラマイクロ
トーム上で切片にした。超薄切片を、酢酸ウラニル（2％）およびクエン酸鉛（0
．3％）の水性溶液で、各15分間染色し、そしてその後、JOEL JEM−IOOCX透過
電子顕微鏡中で、検査し、そして写真撮影した。
【０１４１】 2． 結果； 先の研究により、Pタンパク質の欠損は、超微細構造異常（Moyer， 1966，
Am Zool 6：43−66； SidmanおよびPearlstein， 1965， Dev． Biol．
12：93−116； OrlowおよびBrilliant， 1999， Exp． Eye Res． 68：14
7−154）と共に、チロシナーゼの異常な細胞下局在（Potterfら， 1998、上記
）を生じることが示されてきている。両方の特徴を同時に調べるため、我々は、
DOPA組織化学を伴うおよび伴わない、電子顕微鏡による、melan−aおよびmelan
−p1における細胞下構造およびチロシナーゼ分布を決定した。
【０１４２】 先に報告されたように（Rosemblatら， 1998， Exp． Cell Res． 239：
344−352）、培養melan−a細胞は、p遺伝子座で野生型であり、主に段階IV成熟
のメラノソームを含んだ（図6a）。対照的に、p−ヌルmelan−p1細胞は、主に段
階IおよびII、そして時折、段階IIIであるメラノソームを示した（図6b）。
【０１４３】 melan−a細胞のDOPAインキュベーションに際し、チロシナーゼ活性は、トラン
スゴルジ網（TGN）で、およびゴルジ装置の付近に限定される50 nm小胞に示さ
れた（図7a）。DOPA処理melan−p1細胞もまた、TGNおよびその周辺50 nm小胞に
反応産物を示した（図7b）。さらに、反応産物は、いくつかのmelan−p1メラノ
ソームに存在した。しかし、細胞体と共に樹状突起にある、多くのメラノソーム
は、どちらも反応産物を欠いたままだった（図7b）。melan−a細胞（図7a）と異
なり、melan−p1細胞は、核周囲ゴルジ領域のはるかに外側の50 nm小胞、およ
び形質膜のごく近接した領域（図7b）で反応産物を示し、小胞の集団で、チロシ
ナーゼの異常な蓄積があることが示唆された。
【０１４４】 3． 考察； Pタンパク質の欠失は、もはやTGN周囲の領域に限定されない、小チロシナーゼ
含有小胞まん延を生じた。したがって、チロシナーゼは、2つの細胞株の異なる
小胞にパッケージングされるか、または小胞は同じであるが、その輸送が、Pの
非存在下で途絶された。これらの異常な小胞中のチロシナーゼは、DOPA染色によ
り検出することが可能であり、そしてしたがって、酵素的に活性であった。高チ
ロシン下で培養されたmelan−p1細胞中の成熟メラノソームの増加は、50 nm小
胞の数の大きな減少を伴わず、チロシンによるp表現型の、完全ではないが部分
的な訂正が示唆された。
【０１４５】 実施例5：melan−aおよびmelan−p細胞におけるリソソーム加水分解酵素の標
的化： 本実施例は、melan−p細胞が、特定の種類のリソソーム加水分解酵素を、リソ
ソームに正しく標的化しないことを立証する。
【０１４６】 1． 材料および方法； 実施例1に上述されるようなmelan−aおよびmelan−p細胞を、高密度で植え付
け、そして低チロシン（14μM）DME培地中で増殖させた。大顆粒および小顆粒分
画を調製し、そして、Rosemblattら， 1994、上記およびSeiji， 1963， Ann
als N．Y． Acad． Sci．， 100：497−533に記載されるように、あらかじ
め層形成されたスクロース勾配上で遠心分離した。上から下に分画を収集した。
【０１４７】 0．2 M 酢酸ナトリウム、1％ Triton X−100中で調製されたリソソーム酵
素アッセイに適した反応基質は、以下のとおりである： β−ヘキソサミニダーゼ −4 mM 4−メチルウンベリフェリル−N−アセ
チル−β−D−グルコサミニド β−グルコシダーゼ −4．6 mM 4−メチルウンベリフェリル−N−アセチ
ル−β−D−グルコシド β−グルクロニダーゼ −4．6 mM 4−メチルウンベリフェリル−N−アセ
チル−β−D−グルクロニド β−ガラクトシダーゼ −4．6 mM 4−メチルウンベリフェリル−N−アセ
チル−β−D−ガラクトシド 酸ホスファターゼ −22．5 mM 4−メチルウンベリフェリル−ホスフェー
ト 96ウェル平底プレート中に、反応混合物を調製した。各ウェルに、25μlの勾
配分画、2．5μlの1 M 酢酸ナトリウム、および27．5μlの適切な基質混合物
を装填した。プレートをパラフィルムで覆い、そして37℃でインキュベーション
した。β−ヘキサミニダーゼ反応は、50分間インキュベーションし、β−グルコ
シダーゼ、β−グルクロニダーゼおよびβ−ガラクトシダーゼ反応は、20分間イ
ンキュベーションし、そして酸ホスファターゼ反応は、10分間インキュベーショ
ンした。反応は、200μlの停止緩衝液（132 mM グリシン、68 mM 塩化ナト
リウム、83 mM 無水炭酸ナトリウム）の添加により、停止し、そして370 nm
の励起波長および460 nmの発光波長を用い、直ちにプレートを読み取った。
【０１４８】 2． 結果； melan−aおよびmelan−p細胞両方において、非常にわずかのリソソーム加水分
解酵素が、小顆粒分画に検出された（図8−12を参照されたい）。小顆粒分画は
、ほとんど、リソソーム加水分解酵素が通常、蓄積しない、小さい小胞からなる
ため、この結果は期待されたものである。大顆粒分画は、小胞体、ゴルジ細胞小
器官、リソソームおよびメラノソームを含み、そしてしたがって、リソソーム加
水分解酵素のほとんどを含むはずである。酸ホスファターゼに関しては、melan
−a細胞由来のものと比較し、melan−p細胞由来の大顆粒分画における酵素に関
して、わずかに少ない総活性であるだけであった（図8B）。さらに、melan−a細
胞に比較し、melan−p細胞において、より低い密度の分画への酸ホスファターゼ
の局在の重要でないシフトがあった。しかし、アッセイした他のリソソーム加水
分解酵素に関し、melan−aおよびmelan−p細胞の間の相違は劇的であった。実際
、β−ヘキソサミニダーゼ、β−グルコシダーゼ、β−グルクロニダーゼおよび
β−ガラクトシダーゼの総活性は、melan−a細胞と対照的に、melan−p細胞で有
意に減少した（図9−12、右のパネルを参照されたい）。この活性の欠失は、細
胞抽出物が、melan−a細胞と対照的に、melan−p細胞で、β−ヘキソサミニダー
ゼ、β−グルコシダーゼ、β−グルクロニダーゼおよびβ−ガラクトシダーゼの
活性における同様の有意な減少を示したが、melan−pおよびmelan−a細胞の間の
アルカリホスファターゼの総量に本質的に相違はなかったため、細胞内の酵素の
シフトに起因するとは考えられない。酸ホスファターゼを含むmelan−a細胞由来
の同じ大顆粒分画はまた、β−ヘキソサミニダーゼ、β−グルコシダーゼ、β−
グルクロニダーゼおよびβ−ガラクトシダーゼ活性のほとんども含んだが、mela
n−p細胞は、大顆粒分画におけるこれらの酵素活性の有意な減少を有した。した
がって、β−ヘキソサミニダーゼ、β−グルコシダーゼ、β−グルクロニダーゼ
およびβ−ガラクトシダーゼ酵素は、melan−p細胞において、リソソームに正し
く蓄積しなかった。
【０１４９】 3． 考察； 酸ホスファターゼと異なり、酵素β−ヘキソサミニダーゼ、β−グルコシダー
ゼ、β−グルクロニダーゼおよびβ−ガラクトシダーゼは、最終的にリソソーム
に到達する前に、細胞表面に輸送されない。その代わり、これらの酵素は、M6P
／IGF−II受容体の活性を介し、トランスゴルジ網から後期エンドソームに輸送
される。melan−a細胞に対するmelan−p細胞における、これらの2種類のリソソ
ーム加水分解酵素の標的化の相違は、Pタンパク質機能の破壊が、M6P／IGF−II
受容体仲介標的化に影響を与えることを示す。melan−p細胞からのチロシナーゼ
の分泌、並びに同一細胞由来の大顆粒分画におけるβ−ヘキソサミニダーゼ、β
−グルコシダーゼ、β−グルクロニダーゼおよびβ−ガラクトシダーゼの細胞内
欠失を示す我々の結果に基づき、この種類のリソソーム酵素は、melan−p細胞か
ら分泌されるはずである。したがって、分泌の増加またはリソソーム膜分画にお
ける蓄積の減少によりアッセイされる、これらの酵素の標的化もまた、Pタンパ
ク質機能に影響を与える化合物に関しスクリーニングするアッセイの一部として
、用いてもよい。
【０１５０】 均等物： 前述の書面の明細書は、当業者が本発明を実施するのを可能にするのに十分で
ある。実際、分子生物学、医学または関連分野の当業者に明白である、本発明を
実施するための上述の手段の多様な修飾は、請求項の範囲内であると意図される
。
【０１５１】 上に引用される、すべての特許、特許出願、および刊行物は、本明細書に完全
に援用される。
【図面の簡単な説明】
【図１】 培養メラノサイト由来の培地中のチロシナーゼ活性。ブラックマ
ウスから培養したmelan−aメラノサイト、およびP遺伝子転写物を欠くマウスか
ら培養したmelan−pメラノサイトを、別個に、示される期間に渡り、低（0．03
mM）または高（0．3 mM）チロシンを含むDMEM中で培養した。メラノサイト由
来の培地中のチロシナーゼ活性は、特定の時間間隔で測定した。酵素活性を測定
する前に、培地を透析し、該活性は、1時間当たりに生成されるトリチウム化水
のcpmとして表す。▲melan−a、高チロシン；●melan−a、低チロシン；△melan
−p1、高チロシン；○melan−p1、低チロシン。0．03 mMのチロシンの存在下で
増殖させた、Pタンパク質転写物を持たないmelan−p細胞から除去された培地中
のチロシナーゼ活性の増加は、これらの細胞によるチロシナーゼの分泌の増加を
反映する。対照的に、野生型メラノサイトに相当するmelan−a細胞は、培地中に
有意に少ないチロシナーゼを分泌する。高チロシン存在下で増殖するmelan−p細
胞は、部分的に、P−欠損表現型を軽減された。
【図２】 melan−A細胞由来の細胞抽出物および培地におけるチロシナーゼ
活性。培養melan−aメラノサイトは、ベンズトロピン、イミプラミン、ニトロキ
パジンの存在下で48時間インキュベーションし、または処理せず放置した。イン
キュベーション培地または細胞抽出物を、図1におけるように、チロシン加水分
解酵素活性に関し、アッセイした。柱1、未処理メラノサイト；柱2、ベンズトロ
ピンで処理したメラノサイト；柱3、10，11−ジヒドロ−n，n−ジメチル−5−H
−ジベンズ［b，f］アゼピン−5−プロパンアミン（イミプラミン）で処理した
メラノサイト；柱4、6−ニトロ−2−（1−ピペラジニル）−キノリンマレート（
ニトロキパジン）で処理したメラノサイト。図2A（左）において、melan−a細胞
抽出物のチロシン加水分解酵素活性は、cpm［3H］H2O／60ミリグラムタンパク質
／時間で測定される。図2B（右）において、melan−a細胞由来の培地中のチロシ
ン加水分解酵素活性は、細胞抽出物タンパク質の量に対し、規準化された、cpm
［3H］H2O／時間で測定される。ベンズトロピン（図2Aの柱2）およびニトロキパ
ジン（図2Aの柱4）と共にインキュベーションされたmelan−a細胞由来の抽出物
のチロシン加水分解酵素活性は、未処理細胞で見られるものより高い。イミプラ
ミン（図2Aの柱3）で処理した細胞由来の抽出物は、活性減少を示す。細胞抽出
物の酵素活性に対する薬剤の影響は、培地に分泌された酵素の活性に反映されな
い。ベンズトロピンは、活性に対し、ほとんど影響を持たない（図2Bの柱2）が
、イミプラミン（図2Bの柱3）およびニトロキパジン（図2Bの柱4）は、培地中の
活性における有意な増加を引き起こす。
【図３】 トランスフェクションされたCOS細胞中の相対チロシナーゼ活性
。COS細胞を、2用量のベクター単独（V＋V）、1用量のベクター単独および1用量
のチロシナーゼをコードする遺伝子を持つベクター（V＋T）、1用量のベクター
単独および1用量のPタンパク質をコードする遺伝子を持つベクター（V＋P）、ま
たは各1用量のチロシナーゼをコードする遺伝子およびPタンパク質をコードする
遺伝子を持つベクター（T＋P）でトランスフェクションした。等量の細胞抽出物
タンパク質を、チロシン加水分解酵素活性に関し、アッセイした。示される相対
活性は、V＋T試料の活性で割った試験試料の活性として計算する。チロシナーゼ
遺伝子を持つ発現プラスミド（V＋T）の導入は、COS細胞において、チロシン加
水分解酵素活性を生じる。本活性は、発現ベクター（V＋V）単独でのトランスフ
ェクションは、いかなるチロシン加水分解酵素活性も生じないため、チロシナー
ゼ−コードプラスミドの直接の結果である。チロシナーゼ−コードプラスミドを
持つ細胞におけるチロシン加水分解酵素活性は、P遺伝子発現プラスミドのコト
ランスフェクション（T＋P）により、ほぼ4倍増加させることが可能である。本
増加は、チロシナーゼを伴わないP（V＋P）の導入が、いかなるチロシン加水分
解酵素活性も生じないため、チロシナーゼおよびPタンパク質間の相互作用の結
果である。
【図４】 トランスフェクションCOS細胞中のチロシナーゼ活性。図3におけ
るように、チロシナーゼをコードする遺伝子を持つベクターで、またはチロシナ
ーゼをコードする遺伝子を持つ第一のベクターで、そしてPタンパク質をコード
する遺伝子を持つ第二のベクターで、トランスフェクションされたCOS細胞を、
図2におけるように、ベンズトロピン、イミプラミン、ニトロキパジンで処理し
、または処理せず放置した。細胞抽出物は、図3におけるように抽出した。細胞
抽出物のチロシン加水分解酵素活性は、チロシナーゼ活性の測定として、図1に
おけるように測定した。柱1、未処理トランスフェクタント；柱2、ベンズトロピ
ンで処理したトランスフェクタント；柱3、イミプラミンで処理したトランスフ
ェクタント；柱4、ニトロキパジンで処理したトランスフェクタント。チロシン
加水分解酵素は、cpm［3H］H2O／60ミリグラムタンパク質／時間で測定される。
チロシナーゼをコードする遺伝子およびPタンパク質をコードする遺伝子（T＋P
）でコトランスフェクションされた細胞は、チロシナーゼをコードする遺伝子単
独（V＋T）でトランスフェクションされた細胞より、高いチロシン加水分解酵素
活性を示す（柱1）。本影響は、ベンズトロピン（柱2）またはニトロキパジン（
柱4）の存在下での細胞のインキュベーションにより改変されない。しかし、イ
ミプラミンの存在は、Pタンパク質の影響を無効にし、一方、チロシナーゼ単独
の細胞における活性に対しほとんど影響を持たないようである（柱3）。
【図５】 分泌されるチロシナーゼのレベルは、melan−p1で上昇し、そし
てシステイニルプロテアーゼの阻害により減少する。（図5A）低（0．03 mM）
チロシンおよび高（0．3 mM）チロシン（TYR）中でインキュベーションされたm
elan−p1細胞を、増加する濃度のプロテアーゼ阻害剤E64（μM）で、48時間処理
した。培地中のチロシナーゼ活性は、抽出物および培地における総活性の割合と
して表す。（図5B）細胞ペレットを可溶化し、そして470 nmで吸光度を測定す
ることにより、メラニン濃度を測定した。
【図６】 培養メラノサイトの超微細構造。ゴルジ装置（G）を示す、melan
−a（図6A）およびmelan−p1（図6B）メラノサイトの核周囲領域。melan−a細胞
中のメラノソームは、段階I、II、III、および大部分段階IV（矢印）である。me
lan−p1細胞中のメラノソームは、大部分、段階IおよびIIであり、時折、初期段
階III（矢じり）があり；段階IVのメラノソームは観察されない。棒＝1．0ミク
ロン。
【図７】 DOPA組織化学のため、プロセシングされた培養メラノサイトの超
微細構造。ゴルジ装置を示す、melan−a（図7A）およびmelan−p1（図7B）メラ
ノサイトの核周囲領域、DOPA反応産物がシステルナおよびTGN（G）の50 nm小胞
にある。50 nm小胞は、melan−a細胞ではTGNに制限され、そしてmelan−p1細胞
ではTGNから放射状に広がり（矢じり）、そして細胞膜にごく近接して観察され
ることが可能である（差し込み図）。時折、段階IIIのメラノソームが見られる
（矢印）。棒＝1．0ミクロン。
【図８】 melan−Aおよびmelan−P細胞における、酸ホスファターゼ標的化
。酸ホスファターゼ活性を、実施例4に記載されるように、melan−a（正方形）
およびmelan−p細胞（円）由来の分画膜において測定した。図8A＝小顆粒分画。
図8B＝大顆粒分画。
【図９】 melan−Aおよびmelan−P細胞における、β−ガラクトシダーゼ標
的化。β−ガラクトシダーゼ活性を、実施例4に記載されるように、melan−a（
正方形）およびmelan−p細胞（円）由来の分画膜において測定した。図9A＝小顆
粒分画。図9B＝大顆粒分画。
【図１０】 melan−Aおよびmelan−P細胞における、β−ヘキサミニダーゼ
標的化。β−ヘキサミニダーゼ活性を、実施例4に記載されるように、melan−a
（正方形）およびmelan−p細胞（円）由来の分画膜において測定した。図10A＝
小顆粒分画。図10B＝大顆粒分画。
【図１１】 melan−Aおよびmelan−P細胞における、β−グルコシダーゼ標
的化。β−グルコシダーゼ活性を、実施例4に記載されるように、melan−a（正
方形）およびmelan−p細胞（円）由来の分画膜において測定した。図11A＝小顆
粒分画。図11B＝大顆粒分画。
【図１２】 melan−Aおよびmelan−P細胞における、β−グルクロニダーゼ
標的化。β−グルクロニダーゼ活性を、実施例4に記載されるように、melan−a
（正方形）およびmelan−p細胞（円）由来の分画膜において測定した。図12A＝
小顆粒分画。図12B＝大顆粒分画。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 33/566 Ｇ０１Ｎ 33/566 // Ａ６１Ｋ 7/00 Ａ６１Ｋ 7/00 Ｄ Ｘ Ｚ 31/55 31/55 45/00 45/00 Ａ６１Ｐ 17/00 Ａ６１Ｐ 17/00 17/16 17/16 43/00 １１１ 43/00 １１１ (72)発明者 マンガ，プラシエラ アメリカ合衆国ニューヨーク州10016，ニ ューヨーク，ファースト・アベニュー 550 Ｆターム(参考） 2G045 BB14 BB20 BB22 BB24 CB01 FA16 FA20 FB01 4B063 QA01 QA18 QQ02 QQ23 QQ44 QQ61 QQ79 QQ96 QR48 QR77 QS36 QX01 4C083 AC851 CC19 CC36 EE16 EE24 4C084 AA17 NA14 ZA89 ZC20 4C086 AA01 BC32 MA01 MA04 NA14 ZA90 ZA92 ZC01 ZC19 ZC20

Claims (43)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 メラニン形成を阻害する化合物に関するスクリーニング方法
    であって：該方法は、チロシナーゼをコードする遺伝子を発現している細胞を試
    験化合物で処理し、そして試験化合物の存在下でのチロシナーゼの細胞局在を決
    定することを含み；このとき、試験化合物の非存在下と比較した、試験化合物の
    存在下でのチロシナーゼの細胞局在における変化が、試験化合物がメラニン形成
    を阻害する化合物の候補であることを示す、前記方法。
  2. 【請求項２】 細胞がさらに、Pタンパク質をコードする遺伝子を発現し、
    そして試験化合物の非存在下と比較した、試験化合物の存在下でのチロシナーゼ
    の細胞局在における変化が、Pタンパク質をコードする遺伝子の発現に依存する
    、請求項1の方法。
  3. 【請求項３】 チロシナーゼの細胞局在が、化合物の存在下で、細胞により
    分泌されるチロシナーゼの量をアッセイすることにより決定され、試験化合物の
    非存在下と比較した、試験化合物の存在下での細胞により分泌されるチロシナー
    ゼの量における増加が、試験化合物がメラニン形成を阻害する化合物の候補であ
    ることを示す、請求項1または2の方法。
  4. 【請求項４】 チロシナーゼの細胞局在が、チロシナーゼ活性についてアッ
    セイすることにより検出される、請求項1または2の方法。
  5. 【請求項５】 チロシナーゼの細胞局在が、免疫学的技術を用いてチロシナ
    ーゼタンパク質の存在についてアッセイすることにより検出される、請求項1ま
    たは2の方法。
  6. 【請求項６】 試験化合物の存在下での高分子量複合体に結合するチロシナ
    ーゼの量をアッセイする工程をさらに含み、試験化合物の非存在下と比較した、
    試験化合物の存在下での高分子量複合体に結合するチロシナーゼの量における減
    少が、試験化合物がメラニン形成を阻害する化合物の候補であることを示す、請
    求項1または2の方法。
  7. 【請求項７】 化合物の存在下での高分子量複合体に結合するTRP−1または
    TRP−2タンパク質の量をアッセイする工程をさらに含み、試験化合物の非存在下
    と比較した、試験化合物の存在下での高分子量複合体に結合するTRP−1またはTR
    P−2タンパク質の量における減少が、試験化合物がメラニン形成を阻害する化合
    物の候補であることを示す、請求項1または2の方法。
  8. 【請求項８】 化合物の存在下での細胞中のメラノソームの数または大きさ
    をアッセイする工程をさらに含み、試験化合物の非存在下と比較した、試験化合
    物の存在下での細胞中のメラノソームの数または大きさにおける減少が、試験化
    合物がメラニン形成を阻害することを示す、請求項1または2の方法。
  9. 【請求項９】 化合物の存在下での細胞中のチロシナーゼの質量または長さ
    をアッセイする工程をさらに含み、試験化合物の非存在下と比較した、試験化合
    物の存在下での細胞中のチロシナーゼの質量または長さにおける減少が、試験化
    合物がメラニン形成を阻害する化合物の候補であることを示す、請求項1または2
    の方法。
  10. 【請求項１０】 化合物の存在下での細胞中のリソソーム加水分解酵素のレ
    ベルおよび／または標的化をアッセイする工程をさらに含み、試験化合物の非存
    在下と比較した、試験化合物の存在下での細胞中のリソソームにおけるM6P／IGF
    −II受容体を介して輸送されるリソソーム加水分解酵素の蓄積における減少が、
    試験化合物がメラニン形成を阻害する化合物の候補であることを示す、請求項1
    または2の方法。
  11. 【請求項１１】 細胞が、低チロシンの存在下で増殖する、請求項1または2
    の方法。
  12. 【請求項１２】 チロシン濃度が0．01〜0．03mMである、請求項11の方法。
  13. 【請求項１３】 細胞がメラノサイトである、請求項1の方法。
  14. 【請求項１４】 細胞が黒色腫細胞である、請求項1の方法。
  15. 【請求項１５】 細胞が哺乳動物由来である、請求項1の方法。
  16. 【請求項１６】 哺乳動物がヒトである、請求項15の方法。
  17. 【請求項１７】 哺乳動物が、マウス、ハムスター、およびモルモットから
    なる群より選択される、請求項15の方法。
  18. 【請求項１８】 メラニン形成を増加させる化合物に関するスクリーニング
    方法であって：チロシナーゼをコードする遺伝子を発現している細胞を、試験化
    合物で処理し、そして試験化合物の存在下で細胞により分泌されるチロシナーゼ
    の量を決定することを含み；このとき、試験化合物の非存在下と比較した、試験
    化合物の存在下での細胞により分泌されるチロシナーゼの量における減少が、試
    験化合物がメラニン形成を増加させる化合物の候補であることを示す、前記方法
    。
  19. 【請求項１９】 細胞がさらに、Pタンパク質をコードする遺伝子を発現し
    、そして試験化合物の非存在下と比較した、試験化合物の存在下での細胞により
    分泌されるチロシナーゼの量における減少が、Pタンパク質をコードする遺伝子
    の発現に依存する、請求項18の方法。
  20. 【請求項２０】 細胞により分泌されるチロシナーゼに対する細胞内のチロ
    シナーゼの比を決定することをさらに含み、試験化合物の非存在下と比較した、
    試験化合物の存在下での該比における増加が、試験化合物がメラニン形成を誘導
    することを示す、請求項18または19の方法。
  21. 【請求項２１】 チロシナーゼの量が、チロシナーゼ活性についてアッセイ
    することにより検出される、請求項18または19の方法。
  22. 【請求項２２】 チロシナーゼの量が、免疫学的技術を用いてチロシナーゼ
    タンパク質の存在についてアッセイすることにより検出される、請求項18または
    19の方法。
  23. 【請求項２３】 細胞がメラノサイトである、請求項18の方法。
  24. 【請求項２４】 細胞が黒色腫細胞である、請求項18の方法。
  25. 【請求項２５】 細胞が、メラニン産生における増加に関し、視覚的に検査
    される、請求項23または24の方法。
  26. 【請求項２６】 細胞がPタンパク質を発現せず、そして試験化合物の非存
    在下と比較した、試験化合物の存在下での細胞により分泌されるチロシナーゼの
    量における減少が、試験化合物がPタンパク質機能を模倣する化合物の候補であ
    ることを示す、請求項23または24の方法。
  27. 【請求項２７】 細胞がマウスmelan−pメラノサイトである、請求項23の方
    法。
  28. 【請求項２８】 細胞が哺乳動物由来である、請求項18の方法。
  29. 【請求項２９】 哺乳動物がヒトである、請求項28の方法。
  30. 【請求項３０】 哺乳動物が、マウス、ハムスター、およびモルモットから
    なる群より選択される、請求項28の方法。
  31. 【請求項３１】 細胞が、メラニン産生における増加について視覚的に検査
    される、請求項26の方法。
  32. 【請求項３２】 Pタンパク質の機能に影響を与える化合物に関するスクリ
    ーニング方法であって：Pタンパク質およびチロシナーゼを含む系を試験化合物
    と接触させ；そしてPタンパク質依存方式で、該系におけるチロシナーゼ活性に
    影響を与える試験化合物を同定することを含む、前記方法。
  33. 【請求項３３】 系が、Pタンパク質をコードする遺伝子およびチロシナー
    ゼをコードする遺伝子を発現する細胞である、請求項32の方法。
  34. 【請求項３４】 細胞が培養細胞である、請求項33の方法。
  35. 【請求項３５】 系においてチロシナーゼ活性を減少させる化合物が、Pタ
    ンパク質の機能を阻害する化合物として同定される、請求項32の方法。
  36. 【請求項３６】 化合物の存在下での細胞中のリソソーム加水分解酵素の標
    的化についてアッセイする工程をさらに含み、試験化合物の非存在下と比較した
    、試験化合物の存在下での細胞中のリソソームにおけるM6P／IGF−II受容体を介
    して輸送されるリソソーム加水分解酵素の蓄積における減少が、試験化合物がP
    タンパク質の機能を阻害することを示す、請求項35の方法。
  37. 【請求項３７】 系においてチロシナーゼ活性の増加を生じる化合物が、P
    タンパク質の機能を増加させる化合物として同定される、請求項32の方法。
  38. 【請求項３８】 Pタンパク質をコードする遺伝子が、ヒト、ハムスター、
    モルモット、およびマウスからなる群より選択される哺乳動物に由来する、請求
    項32の方法。
  39. 【請求項３９】 チロシナーゼをコードする遺伝子が、ヒト、ハムスター、
    モルモット、およびマウスからなる群より選択される哺乳動物に由来する、請求
    項32の方法。
  40. 【請求項４０】 Pタンパク質の機能に影響を与える化合物に関するスクリ
    ーニング方法であって：一次スクリーニング方法を用いて試験化合物がPタンパ
    ク質機能に影響を与える可能性があるかどうかを予備的に決定し；そして1以上
    の二次スクリーニング方法を用いて試験化合物がPタンパク質機能に影響を与え
    るかどうか決定することを含む、前記方法。
  41. 【請求項４１】 一次スクリーニング方法が、チロシナーゼ分泌についてア
    ッセイすることおよび少なくとも1つのリソソーム加水分解酵素の誤った局在化
    についてアッセイすることからなる群より選択される、少なくとも1つのスクリ
    ーニングアッセイを含む、請求項40の方法。
  42. 【請求項４２】 Pタンパク質の機能に影響を与える化合物に関するスクリ
    ーニング方法であって：Pタンパク質機能に影響を与える化合物のモデルを作成
    し；該化合物の化学的類似体を作成し；そしてPタンパク質機能に対する影響に
    関し、該化学的類似体をアッセイすることを含む、前記方法。
  43. 【請求項４３】 化合物がイミプラミンである、請求項42の方法。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2008232693A (ja) * 2007-03-19 2008-10-02 Kose Corp 美白成分のスクリーニング方法
WO2019098352A1 (ja) * 2017-11-17 2019-05-23 ロート製薬株式会社 美容組成物、スクリーニング方法及び美容方法

Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20020034772A1 (en) 1999-06-29 2002-03-21 Orlow Seth J. Methods and compositions that affect melanogenesis
WO2003095645A1 (en) * 2002-05-09 2003-11-20 New York University Assay for melanogenesis
DE102004007032A1 (de) * 2004-02-12 2005-08-25 Beiersdorf Ag Antisense-Oligonukleotide zur Behandlung von unerwünschter Pigmentierung der Haut und der Haare
WO2009064493A1 (en) * 2007-11-14 2009-05-22 New York University School Of Medicine Tricyclic compounds as melanogenesis modifiers and uses thereof
US8563754B2 (en) 2010-01-28 2013-10-22 New York University Compounds, compositions and methods for preventing skin darkening
US8772252B2 (en) 2011-01-27 2014-07-08 New York University Coumarin compounds as melanogenesis modifiers and uses thereof
JP5563710B2 (ja) * 2013-11-05 2014-07-30 株式会社ファンケル 皮膚色素沈着マーカーとその利用技術
EP3785696A1 (en) 2019-08-28 2021-03-03 B.R.A.I.N. Biotechnology Research And Information Network AG Cosmetic use of aromatic formamidine derivatives
EP4341400A1 (en) * 2021-05-10 2024-03-27 Nikhil Goel Engineered cells for increased production of difficult-to-express proteins

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS6470499A (en) * 1987-05-22 1989-03-15 University Patents Inc Linear and cyclic alpha-melanotropin analogue
JPH04505249A (ja) * 1989-04-26 1992-09-17 スローン―ケツテリング・インステイテユート・フオー・キヤンサー・リサーチ 生物学的に活性なヒトチロシナーゼを構成的に発現する非メラノサイト真核細胞及びその使用
JPH0648935A (ja) * 1992-06-02 1994-02-22 Sansho Seiyaku Co Ltd メラニン生成抑制外用剤
JPH07138300A (ja) * 1993-11-16 1995-05-30 Pola Chem Ind Inc 抗ヒトチロシナーゼモノクローナル抗体

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5540914A (en) * 1989-12-15 1996-07-30 The Board Of Regents Of The University Of Oklahoma Pigmentation enhancer and method
JPH07324095A (ja) * 1994-05-30 1995-12-12 Hideji Itokawa 環状ペプチドシュードステラリン並びにこれを含有するチロシナーゼ活性阻害剤、メラニン生成抑制剤および皮膚化粧料

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS6470499A (en) * 1987-05-22 1989-03-15 University Patents Inc Linear and cyclic alpha-melanotropin analogue
JPH04505249A (ja) * 1989-04-26 1992-09-17 スローン―ケツテリング・インステイテユート・フオー・キヤンサー・リサーチ 生物学的に活性なヒトチロシナーゼを構成的に発現する非メラノサイト真核細胞及びその使用
JPH0648935A (ja) * 1992-06-02 1994-02-22 Sansho Seiyaku Co Ltd メラニン生成抑制外用剤
JPH07138300A (ja) * 1993-11-16 1995-05-30 Pola Chem Ind Inc 抗ヒトチロシナーゼモノクローナル抗体

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2008232693A (ja) * 2007-03-19 2008-10-02 Kose Corp 美白成分のスクリーニング方法
WO2019098352A1 (ja) * 2017-11-17 2019-05-23 ロート製薬株式会社 美容組成物、スクリーニング方法及び美容方法
JPWO2019098352A1 (ja) * 2017-11-17 2021-01-14 ロート製薬株式会社 美容組成物、スクリーニング方法及び美容方法

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