CN1985002A

CN1985002A - Gm3合酶作为糖尿病微血管并发症的治疗靶标

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Publication number: CN1985002A
Application number: CNA2005800146021A
Authority: CN
Inventors: S·埃尔巴瓦布; E·马松; D·鲁吉洛; N·维尔恩斯佩尔格; M·拉佳德; L·特龙锡
Original assignee: Merck Patent GmbH
Current assignee: Merck Patent GmbH
Priority date: 2004-05-07
Filing date: 2005-04-07
Publication date: 2007-06-20
Also published as: FR2869915B1; FR2869915A1; ZA200610229B

Abstract

本发明涉及GM3合酶基因的表达或活性抑制剂用于治疗糖尿病微血管并发症的用途，以及筛选治疗和/或预防这些并发症的化合物的方法。

Description

GM3合酶作为糖尿病微血管并发症的治疗靶标

技术领域

本发明涉及GM3合酶抑制剂用于治疗糖尿病微血管并发症的用途，和筛选该酶抑制剂的方法。

背景技术

微血管病是糖尿病的慢性并发症，其特征为微血管结构和功能的改变。视网膜和肾是病理条件的两个主要靶标，该病理条件导致糖尿病视网膜病变和糖尿病肾病。

在发达国家，糖尿病视网膜病变是排在第二位的失明原因。患此疾病约二十年后，几乎所有的1型糖尿病患者和超过60％的2型糖尿病患者患有微血管并发症(Fong等人，2003)。毛细血管经历进行性的结构改变，如基底膜增厚和周细胞的特异性丢失和内皮细胞增殖和功能的继发改变。这些改变结合局部缺血共同损伤微血管壁并促进过度的毛细血管透性，导致危胁视力的水肿(oedemas)、微动脉瘤(microaneurisms)和出血(Forrester等人，1997)。

有20到30年糖尿病史的病人的50到60％受到肾病影响。其被认为是这些病人的主要死亡原因(Krolewski等人，1997)。该病理条件的主要特征之一是肾小球增大，其产生原因是基底膜增厚和由于生长停滞中的系膜细胞营养不足以及细胞外基质蛋白质积聚而产生的血管系膜扩张。这些事件结合血流动力不足共同诱发肾小球硬化、肾小球滤过或改变的肾小球滤过水平和微量蛋白尿，导致严重的肾功能不全(Wolf等人，2000)。

通常通过检查微量蛋白尿来评估糖尿病患者发展肾病的风险。目前使用的延缓糖尿病肾病发生和/或发展的预防或治疗手段包括监测糖血、施用抗高血压药特别是血管紧张素转化酶抑制剂、采用低蛋白质饮食或施用如他汀类(statins)的降血脂药(Rippin等人，2004)。

由于其对公共健康和经济方面的影响，预防和治疗糖尿病微血管并发症的新方法的鉴定构成主要的治疗挑战。

尽管对糖尿病视网膜病变和糖尿病肾病发病机制的细胞和分子基础还不完全理解，细胞增殖的调控和细胞-细胞以及细胞-基质间相互作用的调控看似具有重要作用。已提出许多生化假说解释糖尿病微血管并发症的发展，特别是糖化终产物(AGE)形成增多的机制(Singh等人，2001)。

还原糖，如蔗糖与蛋白质的氨基基团、脂质和核酸经由一系列形成希夫碱和阿马道里(Amadori)产物的反应发生非酶促反应，最终产生AGE。取决于葡萄糖浓度的糖化作用在糖尿病中有所上升。该糖化作用更多的发生在暴露于血液葡萄糖的长寿蛋白质，如细胞外基质蛋白质或循环蛋白质，从而改变它们的结构和功能。

另外，AGE能够结合膜受体通过产生氧化应激(Lal等人，2002；Schmidt等人，1994)、核因子κB的激活(Singh等人，2001；Schmidt等人，1994)和不同基因，如促炎症细胞因子或黏着分子的表达(Hofmann等人，1999；Schmidt等人，1995)而引起细胞应答。

所有这些改变具有重要的生物效应，可以解释在糖尿病微血管并发症中观察到的多种变化，特别是血管渗透性增加、细胞外基质产生和刚性的增加、以及在细胞基质相互作用和细胞生长的变化(Stitt等人，2003)。事实上，许多体内和体外研究已表明AGE涉及与糖尿病相关的视网膜病变和肾病的发展(Stitt等人，2003；Wautier等人，2001)。

神经节苷脂是集中在质膜微域且特征为在其结构中存在唾液酸的鞘糖脂。对乳糖苷神经酰胺成功的唾液酸化产生单唾液酰神经节苷脂(GM3)、双唾液神经节苷脂(GD3)和三唾液神经节苷脂(GT3)。这些神经节苷脂继而通过葡糖基转移酶和唾液酸转移酶催化的序列反应转化成更复杂的神经节苷脂，分别形成a、b和c系列(Van Echten等人，1993)。已知神经节苷脂通过与黏着受体，如整联蛋白或基质蛋白质(胶原蛋白和纤连蛋白)或其它鞘糖脂相互作用在细胞-细胞和细胞-基质识别中发挥主要作用。神经节苷脂，特别是a系列的神经节苷脂还通过调节不同生长因子的活性而参与调控细胞增殖(Hakomori等人，1990)。

已报道AGE在视网膜微血管的周细胞和内皮细胞引起鞘糖脂代谢的改变(Natalizio等人，2001)。这些改变特别伴随着GM3合酶活性的增加(A.Daleme-Natalizio，doctoral thesis at the Institut National desSciences Appliquées de Lyon，8 February 2002)。

本发明人业已表明神经节苷脂涉及AGE介导的导致病理条件DR和DN的效应。发明人因而业已证明由AGE引起的对视网膜周细胞和肾系膜细胞增殖的抑制(两种类型细胞分别涉及糖尿病视网膜病变和糖尿病肾病)至少部分的基于GM3合酶活性的增加和系列a神经节苷脂的累积。而且，在给予AGE的糖尿病小鼠模型观察到GM3合酶活性的增加。这些结果确定GM3合酶和系列a神经节苷脂作为治疗糖尿病微血管并发症的靶标。

发明内容

定义

“糖尿病的微血管并发症”指特征为微血管结构和功能变化的I型或II型糖尿病的慢性并发症。这些并发症主要包括糖尿病视网膜病变、糖尿病肾病和糖尿病神经病。外周神经病影响身体四肢的神经，丧失足部感觉是其最普遍的形式。不适和疼痛(感觉异常和感觉过敏)也是该病非常普遍的且使人虚弱的症状。该神经病可以导致足部溃疡和严重的可能必须进行切除的组织损伤。

在本专利申请的框架内，“GM3合酶”指乳糖苷神经酰胺α2，3-唾液酸转移酶(EC 2.4.99.9)，该酶催化唾液酸残基从唾液酸供体到唾液酸受体半乳糖残基的3-羟基基团的转移。优选的，唾液酸供体是CMP-N-乙酰神经氨酸和唾液酸受体是糖脂(如乳糖苷神经酰胺(LacCer))的半乳糖残基。催化反应可以是CMP-N-乙酰神经氨酸+β-D-半乳糖基-1，4-β-D-葡糖神经酰胺＝Cmp+α-N-乙酰神经氨酸基-2，3-β-D-半乳糖基-1，4-β-D-葡糖神经酰胺。优选的，根据本发明的GM3合酶是人GM3合酶或是如啮齿类(如大鼠或小鼠)、猫、犬、灵长类(猴)等非人哺乳动物的GM3合酶。例如，编码人和鼠的GM3合酶的基因已被分别置于Genbank数据库登录号NM 003896(SEQ ID NO：1)和NM 011375(SEQ ID NO：3)之下。对应的氨基酸序列分别描述于序列SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：4。

在本专利申请的框架内，“GM3合酶抑制剂”指化合物，其(i)在体外和/或体内抑制GM3合酶的活性和/或表达；和/或(ii)阻断唾液酸残基从唾液酸供体到唾液酸受体半乳糖残基的3-羟基基团的转移，特别阻止形成神经节苷脂GM3；和/或(iii)阻断神经节苷脂GM3的细胞内合成。抑制或阻止可以是局部的或整体的。

“神经节苷脂”被理解为指包含一个或多个唾液酸残基的鞘糖脂。更具体而言，“系列a神经节苷脂”指在乳糖苷神经酰胺的半乳糖仅有一个唾液酸残基的神经节苷脂。系列a神经节苷脂包括化合物GM3(α-N-乙酰神经氨酸基-2，3-β-D-半乳糖基-1，4-β-D-葡糖神经酰胺)、GM2、GM1、GD1a和GT1a(参见图2)。

治疗应用

本发明人已证明涉及糖尿病微血管并发症的发展的提高的糖化终产物(AGE)是通过GM3合酶活性的增加来介导其影响。

因此本发明提出治疗糖尿病微血管并发症的方法，其中施用GM3合酶基因的表达或活性的抑制剂于患者。

本发明还涉及GM3合酶基因表达或活性的抑制剂用于制备治疗糖尿病微血管并发症的药物的用途。

优选的，糖尿病微血管并发症选自糖尿病视网膜病变、糖尿病肾病和糖尿病神经病。特别优选的，糖尿病微血管并发症是糖尿病肾病。

在本发明的框架内，“处理”指疾病的预防或治疗性处理，即对疾病或与该疾病相连系的一种或多种并发症所采取的逆转、减慢或抑制其进展或阻止其发展的行为。

“患者”指人或非人哺乳动物，如小鼠、大鼠、狗、猫、猪或猴，其受到或易于受到糖尿病微血管并发症的侵袭。优选的，根据本发明的患者是已检测出糖尿病的受试者。

优选的，抑制剂是GM3合酶基因的表达或活性的特异性抑制剂，即对除GM3合酶之外的基因或蛋白质基本没有影响的抑制剂。

在第一个实施方案中，根据本发明的方法或用途使用GM3合酶基因和/或蛋白质的表达的抑制剂。该抑制剂可以阻止或抑制基因的转录和/或转录信使(mRNA)的翻译。本领域技术人员可以针对此目的选择最适合的策略。

可以使用反义策略抑制GM3合酶的表达。该方法可以使用如反义核酸或核酶，其通过反义核酸掩蔽mRNA或通过核酶切割mRNA来阻断特定mRNA转录。在本发明文中，“反义”广泛包括RNA-RNA相互作用、RNA-DNA相互作用、核酶、干扰RNA、适体和RNA酶H介导的抑制。反义疗法通常使用载体，如带有反义序列的病毒载体，由于该载体将整合入基因组，所以该抑制通常是稳定的。还可能使用暂时抑制表达的反义寡核苷酸。反义技术的概述可见于《Antisense DNA and RNA》中(ColdSpring Harbor Laboratory，D.Melton，编辑，1988)。

由此优选的GM3合酶基因和/或蛋白质的表达抑制剂选自反义核酸、核酶、干扰RNA和适体。

“反义核酸”或“反义寡核苷酸”是单链核酸分子，其在胞质条件下与互补DNA或RNA分子杂交时，抑制后者功能。可以由在细胞中表达的重组基因编码反义核酸(参见，例如，US专利No.5814500和5811234)，或可以通过合成制备反义核酸(参见，例如US专利No.5780607)。可以设计GM3合酶的反义核酸与编码GM3合酶的同源序列特异性杂交，如与SEQ ID NO：1所示的人GM3合酶序列或SEQ ID NO：3所示的鼠GM3合酶序列特异性杂交。

“能够与核酸序列特异性杂交的序列”指能够与参考核酸序列在高度严格条件下杂交的序列(Sambrook等人，1989)。定义严格条件的参数决定于50％的匹配链分离的温度(Tm)和离子强度。对于包含了多于30个碱基的序列，通过以下公式定义Tm：Tm＝81.5+0.41(％G+C)+16.6log(阳离子浓度)-0.63(％甲酰胺)-(600/碱基数)(Sambrook等人，1989)。对于短于30个碱基的序列，通过以下公式定义Tm：Tm＝4(G+C)+2(A+T)。在非特异性序列不杂交的适当严格条件下，可以优选低于Tm5到10℃的杂交温度并优选使用高离子强度的杂交缓冲液，如6×SSC溶液。例如，对应于Tm和离子条件的高度严格杂交条件，如使用含有50％甲酰胺溶液和5×或6×SSC(0.15M NaCl，0.015M柠檬酸钠)所得到的高度严格杂交条件。

根据本发明的反义核酸可以被如此使用，例如注射如人或动物以预防或治疗糖尿病微血管并发症。具体而言，根据描述于国际专利申请WO90/11092的技术可以以裸DNA形式注射反义核酸。还可以通过与如葡聚糖-DEAE(Pagano等人，1967)、核蛋白质(Kaneda等人，1989)或脂质(Felgner等人，1987)形成复合物的形式、通过脂质体的形式(Fraley等人，1980)或通过其它相似的方法施用反义核酸。

优选核酸序列构成载体的部分。使用载体可能提高核酸向代处理细胞的施用，还可能提高核酸在这些细胞中的稳定性，提供延长的治疗效果。

术语“载体”指DNA或RNA序列可以经由其导入宿主细胞以转化宿主并获得表达(即转录和翻译)的载体。载体包括质粒、噬菌体、病毒等。

“核酶”是能够以相当类似于DNA限制性核酸内切酶的方式特异性切割其它单链RNA分子的RNA分子。核酶是通过证明某些mRNA能够切割它们自己的内含子而被发现。通过改变这些核酶的核苷酸序列，可能产生识别RNA分子中特定的核苷酸序列并对其切割的分子(Cech，1989)。由于这一特异性，仅失活具有特定序列的mRNA。

还可以使用干扰RNA获得对GM3合酶转录的可逆抑制。RNA干扰(RNAi)技术通过使用小RNA分子，如“小干扰RNA”(siRNA)阻止基因表达。该技术受益于RNA干扰是从植物到昆虫乃至哺乳动物的多种生物的多数细胞中天然的基因灭绝的生物机制这一事实(Sharp，2001)。RNA干扰通过破坏中间mRNA来阻止基因产生功能性蛋白质(Bass，2000；Sharp，2001)。可以以裸露的形式或通过整合入载体使用siRNA。优选阻断GM3合酶转录的干扰RNA能够有序列GGGUUAUUCUGAACAUGUUtt(SEQ ID NO：5)。

还可以使用适体抑制GM3合酶转录。适体是能够以高度的亲和力和特异性识别几乎任何类型靶分子的寡核苷酸序列。可以使用被称为SELEX(指数富集配体的系统进化)的筛选方法从随机序列文库中分离这些配体，该方法描述于Tuerk和Gold(1990)。可以使用组合化学的手段通过DNA合成获得随机序列文库。在这种文库中，每个成员是对应于唯一序列的线性寡聚体(任选为经化学修饰的)。这类分子的可能的修饰、应用和优势已由Jayasena作了综述(1999)。

在另一实施方案中，根据本发明的方法或用途包括使用GM3合酶蛋白质活性的抑制剂。可以使用如本专利申请所述的筛选方法(包括细胞或体外生化测试)方便的鉴定GM3合酶活性的抑制剂。抑制剂可以是肽、拟肽或非肽模拟物(Rubin-Carrez，2000)，如能够干扰GM3合酶活性的小有机分子，例如通过阻止或降低唾液酸基团从供体到唾液酸受体的转移，和/或通过阻断或降低GM3合成。

GM3合酶抑制剂还可以是抗体，特别是针对序列SEQ ID NO：2所示的人GM3合酶或序列SEQ ID NO：4所示的鼠GM3合酶的抗体。上述抗体可以是多克隆或单克隆抗体或其片段、或嵌合抗体，特别是人源化的或免疫缀合的抗体。

可以通过惯用方法从用蛋白质免疫的动物血清中获得多克隆抗体。例如，所用抗原可以是合适的肽复合物，如GM3合酶通过反应残基与蛋白质(如匙孔槭血蓝蛋白，KLH)或另一肽偶联的复合物。根据Benoit等人所述方法(1982)，用等量的1mg的肽抗原免疫兔子。每隔四周用200μg抗原注射动物，并在其后10到14天取血。第三次注射后，对抗血清进行检测以测定其结合用氯胺-T方法制备的碘-放射标记的肽抗原的能力，和随后将抗血清通过羧甲基纤维素(CMC)离子交换柱以层析法纯化。接着从哺乳动物收集抗体分子和通过技术人员熟知的方法分离抗体至想要的浓度，例如通过使用DEAE交联葡聚糖获得IgG级份。为了增加多克隆血清的特异性，可以通过免疫亲和层析法，在固相使用免疫多肽纯化抗体。令抗体与固相的免疫抗原接触足够的时间使多肽和抗体分子发生免疫反应从而在固相形成免疫复合物。

可以通过由Khler和Milstein所述(1975)的常规的淋巴细胞融合和杂交瘤培养方法获得单克隆抗体。其它制备单克隆抗体的方法也为人所知(Harlow等人，1988)。可以通过免疫哺乳动物(例如小鼠、大鼠或兔子，或甚至人等)和使用淋巴细胞融合技术产生杂交瘤(Khler和Milstein，1975)来制备单克隆抗体。存在该惯用技术的备选技术。例如可能通过表达克隆自杂交瘤的核酸产生单克隆抗体。还可以在载体中导入抗体cDNA通过噬菌体展示技术产生抗体，该载体通常是在噬茵体表面具有V基因文库的丝状噬菌体(如用于大肠杆菌的fUSE5，Scott和Smith，1990)。构建这些抗体文库的方法描述于Marks等人(1991)。

本发明的抗体或抗体片段可以是如嵌合抗体、人源化抗体或Fab和F(ab’)₂片段。也可以采用免疫缀合或标记的抗体形式。

适体构成在分子识别方面代表替代抗体的一类分子。

可以使用一种或多种可药用赋形剂制备GM3合酶的表达或活性抑制剂。如前所述，这些抑制剂可以是化学合成的化合物、反义或干扰RNA或抗GM3合酶抗体。

“赋形剂”或“可药用载体”被理解为指在人或动物中不产生次级反应，例如变态反应的任何溶剂、分散介质、吸收阻滞剂等。

剂量自然的取决于所讨论的活性物质、施用方式、治疗指征和患者的年龄及状态。优选蛋白质或抗体的剂量为每天0.1到250mg/kg和特别优选每天1到100mg/kg。当药物组合物包括核酸时，施用核酸(序列或载体)的剂量也要特别适应于施用方式、靶标病理条件和治疗持续时间。一般而言，如果使用重组病毒，以约为10⁴到10¹⁴pfu/ml和优选10⁶到10¹⁰pfu/ml的剂量配制和施用。术语“pfu”(蚀斑形成单位)反映病毒溶液的感染性，并能够通过感染合适的细胞培养物以及测量被感染细胞的蚀斑数(通常在48小时后)来确定。用于确定病毒溶液pfu滴度的技术在文献中有详细描述。

如果设想肠胃外施用，更具体的采用注射，本发明的组合物包括采用可注射的溶液和悬浮液剂型包装于安瓿或用于缓慢灌注的瓶子的活性成分。

对于口服施用的情况，本发明的组合物采用的剂型包括明胶胶囊、起泡片剂、有包衣或无包衣的片剂、香囊(sachet)、糖衣丸、口服的安瓿剂或溶液、微粒或缓释剂型。

以常规方法将活性成分与缓冲液、稳定剂、防腐剂、增溶剂、等渗剂和悬浮剂混合得到肠胃外施用的剂型。随后将这些混合物使用已知技术灭菌后以静脉注射的剂型包装。

技术人员使用的缓冲液可以是基于有机磷酸盐的缓冲液。

悬浮剂的实例包括甲基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、金合欢和羧甲基纤维素钠。

此外，根据本发明使用的稳定剂是亚硫酸钠和偏亚硫酸氢钠，而提到的防腐剂可以是对羟基苯甲酸钠、山梨酸、甲酚和氯甲酚。为了制备口服溶液或悬浮液，将活性成分溶解或悬浮于含有分散剂、湿润剂、悬浮剂(如聚乙烯吡咯烷酮)、防腐剂(如对羟苯甲酸甲酯或对羟苯甲酸丙酯)、矫味剂或着色剂的合适载体。

为了制备微囊，将活性成分与合适的稀释剂、合适的稳定剂、活性物的缓释剂、或用于形成核心的任何其它类型的添加剂混合，随后将其用合适的聚合物(如水溶的树脂或不溶于水的树脂)包被。为此目的使用技术人员所熟知的技术。

任选的，产生的微囊随后被配制成合适的剂量单位。

还可以设想经眼途径施用药物。

如果是经眼给药，本发明的药物组合物采用局部施用于眼的眼组合物剂型，例如眼洗剂或眼霜。

抑制剂还可以配制成脂质体。脂质体是由磷脂形成，磷脂分散于水介质且能自发形成多层同心双分子层小泡。这些小泡通常直径为25nm到4μm，可以被超声形成直径为200到500中心含有水溶液的更小的单层小泡。

在施用活性成分于明确的细胞或组织靶标时使用脂质体特别有利。可以通过使脂质体与寻靶分子(如寻靶肽，例如激素)、或抗体化学偶联而实现

筛选方法

本发明还涉及筛选或鉴定用于治疗和/或预防糖尿病微血管并发症的化合物的体外方法，其中评估至少一种测试化合物抑制GM3合酶活性的能力，该酶活性水平的下降是化合物有效治疗和/或预防糖尿病微血管并发症的指征。

优选糖尿病微血管并发症选自糖尿病视网膜病变、糖尿病肾病和糖尿病神经病。更优选糖尿病微血管并发症是糖尿病肾病。

测试化合物可以是任何类型。其可以是天然或合成的化合物或这些化合物的混合物。还可以是结构被详细定义的物质或结构未知的物质，例如生物提取物。

可以将存在测试化合物时GM3合酶活性水平与缺乏测试化合物时的对照活性水平比较。

在第一个实施方案中，筛选方法所包括由以下组成的步骤：将至少一种测试化合物与表达GM3合酶的细胞接触，并测定所述化合物抑制(即阻止或减少)细胞内神经节苷脂GM3合成的能力。与未暴露于测试化合物的细胞相比，细胞中神经节苷脂GM3合成水平的下降是化合物有效治疗和/或预防糖尿病微血管并发症的指征。

细胞可以是内源性表达GM3合酶的细胞，例如视网膜周细胞或肾系膜细胞。细胞还可以是经过转染借助于表达GM3合酶基因产物的载体以暂时或稳定的方式表达GM3合酶的细胞。可以通过向原核或真核宿主细胞导入插入于载体上且含有编码GM3合酶序列的核苷酸序列而获得这些细胞，随后在允许所转染的核苷酸序列复制和/或表达的条件下培养上述细胞。

可以用技术人员熟悉的任何技术将含有编码GM3合酶序列的DNA载体，例如质粒载体导入宿主细胞。具体而言，可以用裸露的形式，即没有借助任何类型的促进载体转染进入细胞的媒介物或系统(EP 465 529)导入DNA载体。其它可用的技术有微量注射、电穿孔、磷酸钙沉淀或借助于纳米胶囊或脂质体的制剂。生物可降解的聚烷基氰基丙烯酸酯纳米胶囊是特别有用的。对于脂质体的情况，使用阳离子脂质有利于带负电荷的核酸的包装，和促进与带负电荷的细胞膜的融合。

备选的，载体可以是重组病毒的形式，该重组病毒包括插入其基因组的编码GM3合酶的核酸序列。优选的，病毒载体选自腺病毒、逆转录病毒，特别是慢病毒、腺伴随病毒(AAV)、疱疹病毒、巨细胞病毒(CMV)、痘苗病毒等。

技术人员熟知如何实施这些重组表达技术。

宿主细胞的实例特别包括哺乳动物细胞(如CHO、COS-7、293和MDCK细胞)、昆虫细胞(如SF9细胞)、细菌(如大肠杆菌)和酵母菌株。

可以直接或通过如报告基因检测基因的转录水平或GM3合酶基因编码蛋白质的翻译水平，从而评估表达水平。

跟踪靶基因(本例为GM3合酶基因)或报告基因转录(即检测转录水平)的最常用的测试是基于Northern印迹技术。跟踪GM3合酶蛋白质或报告蛋白质的翻译(即检测翻译水平)的测试可以特别基于免疫测定技术或者可以使用荧光、发光或其它检测报告蛋白质(绿色荧光蛋白，GFP；荧光素酶；氯霉素乙酰转移酶，CAT；等)的技术。

可以根据多种技术人员熟知的形式(例如通过ELISA、放射免疫测定、原位免疫测定、Western印迹、免疫荧光等)实行免疫测定技术。可以按照如下描述生产用于检测GM3合酶蛋白质的抗GM3合酶蛋白质的抗体。

在另一实施方案中，筛选方式包括的步骤组成为将至少一种测试化合物与天然、突变或重组的GM3合酶或生物来源的GM3合酶接触，并测定所述化合物抑制(即阻止或减少)唾液酸残基从唾液酸供体转移到唾液酸受体半乳糖残基的3-羟基基团的能力。与缺乏所述化合物时的唾液酸转移水平相比，存在所述化合物时唾液酸转移活性水平的下降是抑制GM3合酶和有效治疗和/或预防糖尿病的微血管并发症的化合物的指征。

可以通过在允许唾液酸从供体转移至受体的合适条件下使GM3合酶与唾液酸供体和唾液酸受体接触来方便的评估GM3合酶的活性水平。一般而言，合适条件指催化反应发生的反应介质。该介质可以包括如缓冲液、氧化和/或还原剂和辅助因子。通常调整pH、温度和介质的离子浓度。优选在pH缓冲范围为6到7并优选6.5到6.7之间的介质中，在35到39℃并优选在37℃的温度下评估GM3合酶活性。含有10mM Mn²⁺，例如10mM MnCl₂的介质有利于反应的进行。GM3合酶测试已被特别描述于国际专利申请WO 97/47749，US专利6555371或Wakarchuk等人的文献(1996)。

优选的，通过定量唾液酸的转移(即唾液酸从唾液酸供体，如CMP-N-乙酰神经氨酸到乳糖苷神经酰胺(LacCer)半乳糖残基的3-羟基基团以形成神经节苷脂GM3)评估GM3合酶活性。在CMP-N-乙酰神经氨酸和/或乳糖苷神经酰胺的消失和/或GM3的形成方面的减少是抑制GM3合酶的化合物的指征。因此根据本发明的方法，包括在存在或缺乏测试化合物条件下测定从CMP-N-乙酰神经氨酸到乳糖苷神经酰胺的唾液酸转移水平。

以可检测的方式标记唾液酸供体和/或受体是有利的。可以使用技术人员所熟知的任何合适的技术实现标记。其可以是如放射性、酶促、发光或荧光标记或这些技术的组合。

根据本发明优选的筛选测试描述于图7。在此测试中，将GM3合酶和[¹⁴C]-CMP-唾液酸以及偶联了生物素的乳糖苷神经酰胺接触。SPA^技术(Amersham Biosciences)是基于某些放射性元素分裂产生的β粒子的发射。如果放射性分子充分接进SPA闪烁珠，放射性分裂刺激微粒中闪烁体的基团产生光发射。可以用闪烁计数和/或CCD成像仪检测信号。另一方面，在含有SPA珠的溶液中游离的放射性分子情况下(即放射性分子不与SPA珠相互作用)，伴随着放射性分子分裂的β发射没有足够能量到达SPA珠，并且不产生光发射。在本测试中，由于在反应介质中只有该化合物经由生物素/链霉抗生物素复合物与SPA珠相连且带有放射性唾液酸基团，因此发光信号的测量反映GM3的量。

下面的实施例和附图意在说明而非限制本发明。

附图

图1显示AGE对周细胞(BRP)和肾系膜细胞(RMC)增殖的抑制。细胞暴露于3μM BSA或AGE 4天(RMC)或7天(BRP)。随后用胰蛋白酶消化细胞并用血细胞计数器计数，并确定蛋白质的总量。结果用BSA对照的百分数表示，并代表6次(BRP)或9次(RMC)独立试验的平均数±SEM，每次试验一试两份。针对BSA对照^*P＜0.05。

图2显示基于van Echten等人发表文献(1993)修改的神经节苷脂生物合成途径。在BRP和RMC(周围的神经节苷脂)仅系列a和b神经节苷脂被检测。

图3表明周细胞和系膜细胞中的神经节苷脂谱的调节。周细胞(A)或系膜细胞(B)分别暴露于3μM BSA或AGE4或7天，随后收获细胞。使用HPTLC提取、纯化分析神经节苷脂，使用间苯二酚染色显影，方法如“材料和方法”部分所述。结果以BSA对照的百分数表示并代表6次(BRP)或9次(RMC)独立试验的平均数±SEM，每次试验一试两份。针对BSA对照^*P＜0.05。在(C)和(D)，用1μCi/ml的[¹⁴C]-半乳糖代谢标记神经节苷脂，使用HPTLC提取、分离神经节苷脂，并使用放射自显影分析。结果以BSA对照的百分数表示，并代表3次独立试验的平均数±SEM。

图4显示在分离的神经纤维球和细胞中由AGE造成的GM3合酶活性的增加。(A)用3μM BSA或AGE处理细胞4天(RMC)或7天(BRP)。在细胞匀浆中检测GM3合酶活性，方法如“材料和方法”部分所述。在BRP和RMC中对照活性分别是2.7和5.1pmol/h/mg蛋白质。结果以BSA对照的百分数表示，并代表4或5次独立试验的平均数±SEM。(B)在对照小鼠(db/m)和db/db小鼠神经纤维球的高度纯化的匀浆中测量GM3合酶活性。对照活性是4.7pmol/h/mg蛋白质。结果以对照的百分数表示，并代表4到5只动物的平均数±SEM。针对BSA对照或对照小鼠，^*P＜0.05。

图5表明外源的系列a神经节苷脂造成的对细胞增殖的抑制。用神经节苷脂-BSA复合物分别处理周细胞(A)或系膜细胞(B)4或7天。处理结束时测量总蛋白质。结果以BSA对照的百分数表示，并代表5到6次独立试验的平均数±SEM，每次试验一试三份。针对BSA对照^*P＜0.05。

图6显示抗系列a神经节苷脂的GM2和GM1抗体针对AGE效果的保护作用。在存在或缺乏每孔5μg的抗GM2或抗GM1多克隆抗体条件下，用3μM BSA或AGE处理周细胞(A)或系膜细胞(B)。处理结束后洗涤细胞并裂解，测量蛋白质的总量。结果以BSA对照的百分数表示，并代表5到6次独立试验的平均数±SEM，每次试验一试三份。针对AGE处理的细胞^*P＜0.05。

图7表明通过一种测试来检测GM3合酶活性，所述测试通过闪烁照像和发光组合检测反应产物——神经节苷脂。GM3合酶催化标记的唾液酸从[¹⁴C]-CMP-唾液酸到偶联生物素的乳糖苷神经酰胺(生物素-LacCer)的转移。将偶联链霉抗生物素的SPA(亲近闪烁测定法，AmershamBioscience)珠与产生的偶联生物素并用¹⁴C标记的神经节苷脂GM3接触。随后测量由GM3放射活性和SPA珠相互作用产生的SPA信号。

图8显示用GM3合酶siRNA转染保护RMC。用400nM GM3合酶siRNA转染RMC24小时后，用3μM BSA对照或AGE处理细胞。处理结束时测量总蛋白质。结果以BSA对照的百分数表示，并代表6次独立试验的平均数±SEM。针对AGE处理的细胞^*P＜0.05。

图9表明在糖尿病小鼠肾皮质中GM3和GD3合酶活性以及GM3水平有所改变。测量对照小鼠(db/m)和糖尿病小鼠(db/db)肾皮质匀浆中的GM3合酶活性(A)和GD3合酶活性(B)。显示对照小鼠(db/m)和糖尿病小鼠(db/db)的GM3水平(C)。对照小鼠的GM3水平为66±9ng/ml蛋白质。结果以BSA对照的百分数表示，并代表4到6只动物的平均数±SEM。针对AGE处理的细胞^*P＜0.05。

实施例

实施例1-材料和方法

细胞分离和培养

牛视网膜周细胞(BRP)分离自牛视网膜微血管，方法如先前所述(Lecomte等人，1996)。简言之，通过对从当地屠宰场得到的摘除的牛眼在无菌条件下解剖获得视网膜。在去除污染的视网膜色素上皮细胞后，将视网膜(每个培养皿2个)切成小片并用Dounce匀浆机在Hanks平衡盐溶液(无Ca²⁺/Mg²⁺的氧化HBSS，补充以Hepes 10mM，pH7.4、抗生素1％、牛血清白蛋白(BSA，Sigma，Saint-Quentin Fallavier，法国)0.5％)中匀浆化。匀浆物在1000g于4℃离心5分钟，残余物重悬于含有胶原酶/分散酶(Roche Diagnostics，Mannheim，德国)(1mg/ml在无Ca²⁺/Mg²⁺的氧化HBSS，Hepes 10mM，pH7.4、抗生素1％、DNA酶20U/ml和Nα-甲苯磺酰赖氨酰氯甲酮(TLCK)150ng/ml，Sigma)的酶促溶液。消化(20分钟于37℃)后，将微血管碎片置于40μm尼龙滤膜上，并保存(deposited)在纤连蛋白覆盖的6厘米皿中。原代培养物培养在补充10％的胎牛血清(Gibco，Invitrogen公司，N.Y.，美国)、1％的谷氨酰胺和1％的青霉素/链霉素(Sigma)的DMEM(Dulbecco改良的Eagle’s培养基)中，培养基每两天更换一次。细胞贴壁后，在48小时后出现来自微血管的周细胞小瘤，细胞在约10天达到汇合。由其带有伪足的不规则多边形形态和生长成为非并生细胞(non-apposed cell)的特征以及通过α₁-肌动蛋白和特异性的糖脂抗原(3G5抗体)的阳性标记和内皮细胞表达的冯维勒布兰德因子的阴性标记(Lecomte等人，1996)所进行的评估均证明BRP培养物是100％纯的。细胞用胰蛋白酶-EDTA(Sigma)(1∶3)传代，培养物被维持于相同的培养基直到第二代，在第二代处理BRP。

从年轻雄性Wistar大鼠(Charles River，I′Arbresle，法国)的纯化的神经纤维球获得大鼠肾系膜细胞(RMC)。简言之，在无菌条件下从新摘除的大鼠肾分离皮质碎片。以机械力使HBSS缓冲液中的小碎片通过230μm筛孔。随后向通过此筛孔的神经纤维球施加压力使其通过73.7μm筛孔。最后将其置于70μm筛孔上并放置于纤连蛋白覆盖的6厘米皿中(每两个肾神经纤维球用4个皿)，皿内的DMEM中补充20％的胎牛血清、1％的谷氨酰胺和1％的青霉素/链霉素培养。贴壁后，3周之后出现来自神经纤维球的RMC小瘤，随后对细胞进行第5次传代以去除残余的上皮和内皮细胞。RMC的特征在于其形态学标准(星形，汇合时呈灯芯形)和波形蛋白、平滑肌α-肌动蛋白和Thy-1抗原的阳性标记。随后在补充了15％的胎牛血清、1％的谷氨酰胺和1％的青霉素/链霉素的DMEM中培养细胞。使用在第5代和15代之间的细胞。

小鼠神经纤维球的分离

使用如Takemoto等人所述的(Takemoto等人，2002)磁珠灌流技术从糖尿病(db/db)或对照(db/m)的11周龄小鼠(Charles River)获得高度纯化的神经纤维球。简言之，用Dynabeads溶液(Dynal，Compiègne，法国)经心脏灌流小鼠，随后取出肾，细细切片并用胶原酶(Roche Diagnostics)消化。过滤后，在其毛细血管中积累了磁珠的神经纤维球由于磁力被保留，随后在匀浆前洗涤两次。该技术提供了低程度组织污染的神经纤维球的纯制品。

小鼠肾皮质的分离

从糖尿病(db/db)或对照(db/m)的11周龄小鼠(Charles River)肾分离肾皮质碎片。简言之，麻醉并处死动物，取出肾。随后通过解剖和用Dounce匀浆机在含有1mM EDTA和10μl/ml蛋白酶抑制剂的25mMHepes缓冲液中机械匀浆获得肾皮质碎片。

AGE的制备

将牛血清白蛋白(终浓度7.2mg/ml)(Sigma)和100mM甲基乙二醛(Sigma)在37℃孵育50小时制备AGE。在不合甲基乙二醛的相同条件下孵育牛血清白蛋白(BSA)并用作对照制品(BSA对照)。用PD10交联葡聚糖G25柱(Amersham Biosciences，Uppsala，瑞典)纯化AGE和BSA对照以去除盐和未反应的羰基，随后通过过滤灭菌并保存在-20℃直到使用。

AGE处理

在接种24小时后将AGE和BSA对照(终浓度3μM)加入培养基。每种细胞类型处理一代(BRP约7天和RMC约4天)。每两天更换新鲜培养基。

细胞生长的测量

处理结束时，用胰蛋白酶收获细胞，用磷酸缓冲盐溶液(冰过的PBS)(Sigma)洗涤细胞残余物两次。对于每种样品，使用血细胞计数器计数一整分试样以确定细胞数。另一整分试样用于使用Bradford技术进行的蛋白质测量。

神经节苷脂的分析

为了代谢标记神经节苷脂，将0.2μCi/ml或1μCi/ml的[¹⁴C(U)]-D-半乳糖(329.5mCi/mmo1)(PerkinElmer Life Sciences，波士顿，MA)加入培养基过夜用于具有高度比活性的标记试验(GM2和GM1测量试验)。随后用胰蛋白酶消化细胞(5-8×10⁵个周细胞或12-20×10⁵个系膜细胞)，PBS洗涤细胞3次。按照由Bouchon等人所述(Bouchon等人，1990)Natalizio等人修改(Natalizio等人，2002)的方法从细胞残余物中提取神经节苷脂。简言之，将细胞残余物分散在2ml的氯仿(C)/甲醇(M)(1∶1，v/v)，剧烈混合并于4℃抽提过夜。离心后，用同样的2ml溶剂抽提细胞残余物两次。合并总脂质的抽提物，真空干燥并借助1mM C/M/PBS溶液(10∶10∶7，v/v/v)分离。随后，含有神经节苷脂的上层相在C18硅胶柱(Waters Corporation，Milford，MA)上脱盐，并用HPTLC分析(Merck，Darmstadt，德国)。在0.2％C/M/CaCl₂(55∶45∶10，v/v/v)的流动相中展开板。使用磷扫描和Storm 820(MolecularDynamics，Amersham Pharmacia Biotech，皮斯卡塔韦，美国)通过放射自显影方法和使用Image Master VDS-CL(Amersham PharmaciaBiotech)通过间苯二酚(神经节苷脂的特异性染色：间苯二酚0.3％(Sigma)、CuSO₄ 0.03％、HCl 30％)标记方法显现神经节苷脂。使用Image Quant(Molecular Dynamics)进行定量。由于在BRP和RMC的神经节苷脂谱中均缺乏GT1b，在脂质抽提前将其加入样品作为内标。

GM3合酶活性的测量

处理结束时用PBS洗涤细胞，而后在50μl裂解缓冲液(20mM二甲胂酸钠，pH6.6(Sigma)、0.2％的Triton X-100、1mM EDTA、10μl/ml的蛋白酶抑制剂(Calbiochem，La Jolla，加利福尼亚，美国))中于4℃孵育20分钟，随后刮下细胞并收集。合并4盘BRP(约2-3×10⁶个细胞)和3盘RMC(约3-6×10⁶个细胞)。细胞裂解液在10000g离心5分钟，测量上清液中蛋白质的GM3合酶活性。在含有1mM EDTA和10μl/ml蛋白酶抑制剂的25mM Hepes中使用注射器对肾小球残余物机械匀浆。所得匀浆在1000g离心2分钟，测量核后上清液中的GM3合酶活性。使用每份样品的等量的蛋白质(细胞约500μg和神经纤维球约100μg)进行测试。将样品与等体积的反应缓冲液混合，该缓冲液含有0.1mM乳糖苷神经酰胺(Matreya，Biovalley，Marne la Vallée，法国)、4μCi/ml的[唾液酸4，5，6，7，8，9-¹⁴C]-CMP-唾液酸(325.2mCi/mmol)(PerkinElmer LifeSciences)、100μM CMP-唾液酸(Sigma)、10mM MgCl₂、0.2％的TritonX-100和100mM二甲胂酸钠，pH6.6。搅拌后将反应混合物在37℃孵育50分钟。通过将样品加至硅胶60柱(Merck)进而从产物中分离出多余的底物来终止反应。用水涤洗柱之后，用C/M(1∶1，v/v)洗脱神经节苷脂，在氮气中干燥该溶剂。最后，用薄层层析(Merck)分离神经节苷脂并用放射自显影显影反应产物。以产生的GM3的pmol/h/mg的蛋白质表示GM3合酶活性。

用外源神经节苷脂处理

细胞被培养于96孔板以评估外源神经节苷脂对BRP和RMC增殖的影响。将外源糖脂(GM3、GM2、GM1和GD1a)、葡糖神经酰胺和乳糖苷神经酰胺(Matreya)加入完全培养基，在DMEM/10mM Hepes，pH7.4中这些加入物与BSA形成的1∶1比例的复合物的终浓度为50μM。处理结束时，用PBS洗细胞两次并在50μl Ripa裂解缓冲液PBS 10mM、NP40 1％(Pierce，Perbio Science，Brebières，法国)、脱氧胆酸钠0.5％、SDS 0.1％、蛋白酶抑制剂10μl/ml)中于37℃裂解30分钟。由于实验中的细胞数是用总蛋白质浓度校正的(参考图1)，使用BCA蛋白质测试(Pierce)测量总蛋白质以评估细胞增殖。

用抗系列a神经节苷脂抗体处理

为封闭系列a神经节苷脂的潜在影响，细胞被培养于96孔板并在存在或缺乏50μg/ml的抗GM2多克隆抗体(Calbiochem)或抗GM1多克隆抗体(Matreya)条件下用3μM AGE或BSA对照处理细胞。处理结束时，细胞用PBS洗两次并在50μl的Ripa裂解缓冲液中裂解且测量蛋白质以定量细胞增殖。

用GM3合酶siRNA转染RMC

为封闭GM3合酶活性，RMC被培养在6孔培养板至30％汇合，而后使用Oligofectamine试剂(Invitrogen Corporation)转染针对大鼠cDNA序列(Ambion，Huntingdon，英国)设计的特异于GM3合酶的干扰RNA(siRNA)。所用的GM3合酶反义序列是GGGUUAUUCUGAACAUGUUtt(SEQ ID NO：5)。在预试验中，通过用增加浓度的siRNA(0-800nM)转染细胞进行剂量-响应的研究。转染72小时后，测量转染的细胞匀浆中的GM3合酶活性。随后评估用siRNA转染的细胞的增殖。为此目的，在用400nM siRNA转染24小时后，用3μM BSA对照或AGE处理细胞(3天)。接着细胞用PBS洗涤两次和在Ripa裂解缓冲液中裂解，测量其蛋白质以评估细胞增殖。

统计分析

数据以平均数±SEM表示，并代表对照的百分数。在细胞研究中，使用Wilcoxon等级测试来评估组间差异的显著性。T-检验被用于评估小鼠实验中的GM3合酶活性。P＜0.05被认为有统计显著性。

实施例2-结果

1-AGE抑制周细胞和系膜细胞的增殖

为了比较AGE对于周细胞和系膜细胞增殖的效果，用浓度为3μM的BSA或AGE处理细胞4到7天。细胞计数表明AGE分别减少了33％和40％的周细胞和系膜细胞数(图1)。总蛋白质也被测量并发现其下降与细胞数相关。这些结果证明AGE对于周细胞和系膜细胞增殖都有相似的不利影响并使本发明人能够阐明在这两种细胞类型中涉及AGE应答的共同机制。

2-AGE增加周细胞和系膜细胞中的系列a神经节苷脂

本发明人先前的结果表明AGE能够调节视网膜微血管细胞的神经节苷脂谱(Natalizio等人，2001)。在BRP和RMC细胞中对应答BSA对照或AGE的神经节苷脂谱进行分析。神经节苷脂谱是特异于细胞类型的。在对照条件下，周细胞中主要的神经节苷脂是系列a神经节苷脂GM3(占检测的总神经节苷脂的63％)和GM1(9％)和系列b神经节苷脂GD3(28％)。系膜细胞神经节苷脂谱的差别在于非常少量的GD3(5％)和系列a存在GD1a(20％)，GM3仍然是主要的神经节苷脂(75％)。

在用AGE处理的两种细胞类型中都观察到系列a神经节苷脂的增加和系列b神经节苷脂的减少(图3)。在周细胞，系列a神经节苷脂GM3和GM1增加约40％，而系列b神经节苷脂GD3减少24％(图3A)。在系膜细胞，GM3增加33％，而GD3减少30％；GD1a水平不受影响(图3B)。在标记半乳糖后通过放射自显影得到了相似的结果。由于BRP中的系列a神经节苷脂GM2和RMC中的系列a神经节苷脂GM2和GM1难以通过间苯二酚标记检测，使用高比活性的[¹⁴C]-D-半乳糖标记细胞并随后分析对照细胞和AGE处理的细胞中的神经节苷脂。结果显示BRP中的GM2增加55％(图3C)，RMC中的GM2和GM1增加25％到35％(图3D)。这些结果表明AGE在周细胞和系膜细胞中均诱导神经节苷脂谱发生相似的改变。还表明系列a神经节苷脂的增加可能是细胞增殖下降的共同机制。

3-AGE增加周细胞和系膜细胞中的GM3合酶活性。

为了解释观察到的系列a神经节苷脂增加的相应机制，在对照和处理细胞中检测合成系列a神经节苷脂的限制性酶GM3合酶的活性。图4给出的结果显示用AGE处理以约1.8(周细胞)和约1.5(系膜细胞)的系数增加GM3合酶的活性，其很可能是由增加酶反应的最大速率导致的结果。这些结果表明AGE通过调控GM3合酶影响RMC和BRP中的共同机制。

4-外源系列a神经节苷脂抑制周细胞和系膜细胞的增殖

本发明人就外源加入系列a神经节苷脂是否影响周细胞和系膜细胞的增殖进行了研究。细胞用50μM神经节苷脂处理一代(BRP7天和RMC4天)，并用未唾液酸化的葡糖神经酰胺和乳糖苷神经酰胺前体处理作为对照。图5显示GM2、GM1和GD1a最有效的抑制周细胞和系膜细胞增殖(约15到30％)。GM3弱抑制周细胞增殖，但对系膜细胞无显著影响。作为对照使用的葡糖神经酰胺和乳糖苷神经酰胺没有影响。这些结果表明系列a神经节苷脂抑制周细胞和系膜细胞的增殖。特别是GM2和GM1在应答AGE的BRP和RMC中增加，且其降低这两种细胞类型的增殖；因此系列a神经节苷脂可能是AGE作用的通用传递介质。

5-抗系列a神经节苷脂抗体保护周细胞和系膜细胞免于由AGE引起的增殖抑制。

为了研究GM2和GM1是否介导AGE的影响，在抗GM1和抗GM2抗体存在下用AGE处理细胞。用BSA处理的对照细胞中，存在或缺乏抗神经节苷脂抗体时的增殖没有差别。用AGE处理的细胞中，存在抗GM2和抗GM1抗体能部分地阻止周细胞和系膜细胞增殖的下降(图6)。根据外源神经节苷脂的影响，这些观察表明系列a神经节苷脂，特别是GM1和GM2，是周细胞和系膜细胞中由AGE诱导的增殖抑制的通用传递介质。

6-在糖尿病小鼠神经纤维球中GM3合酶活性增加

为了体内评估糖尿病环境对GM3合酶活性的影响，测量db/db糖尿病小鼠模型的高纯化的神经纤维球中的酶活性。图4B的结果显示与对照(db/m)相比，糖尿病细胞的神经纤维球中的GM3合酶活性增加约50％。

7-GM3合酶siRNA部分的保护细胞免于AGE诱导的效果

为了更详细的阐明系列a神经节苷脂在介导AGE影响中的作用，用GM3合酶siRNA转染RMC。预试验显示siRNA有效抑制RMC中的GM3合酶活性。随后，测量所转染细胞和所处理细胞的增殖。如图8所示，在转染了GM3合酶siRNA的细胞中，AGE对于RMC增殖的影响被部分地抑制。这些结果清楚证明神经节苷脂涉及介导AGE的作用。该作用的部分性质可以通过下列事实解释：(i)如果在更高汇合度处理细胞以增加转染效率，AGE的影响弱于先前实验，且(ii)GM3合酶活性仅被抑制50％。

8-糖尿病小鼠肾皮质中的GM3和GD3合酶活性和GM3水平改变

为了离体评估糖尿病环境对神经节苷脂生物合成途径的影响，测量db/db糖尿病小鼠模型的肾皮质匀浆中的GM3和GD3合酶活性。图9A-B的结果显示与对照(db/m)相比，糖尿病小鼠肾皮质中的GM3合酶活性增力80％，而GD3合酶活性减少50％。在db/db糖尿病小鼠肾皮质中的GM3水平也被分析并显示出有所增加(尽管不具有统计显著性)(图9C)。总之，这些结果因而证明在AGE处理的RMC和BRP所获得的结果的病理生理学意义。

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序列表

<110>默克专利有限公司

<120>GM3合酶作为糖尿病微血管并发症的治疗靶标

<130>PCT/EP2005/003647

<160>5

<170>PatentIn版本3.1

<210>1

<211>2362

<212>DNA

<213>人

<220>

<221>CDS

<222>(278)..(1366)

<223>

<400>1

ctgagcgggg gagcggcggc ccccagctga atgggcgcga gagcggcgct gggggcgggt 60

gggggcgcgg ggtaccgggc tggcggccgg ccggcgcccc ctcattagta tgcggacgaa 120

ggcggcgggc tgcgcggagc ggcgtcccct gcagccgcgg accgaggcag cggcggcacc 180

tgccggccga gcaatgccaa gtgagtacac ctatgtgaaa ctgagaagtg attgctcgag 240

gccttccctg caatggtaca cccgagctca aagcaag atg aga agg ccc agc ttg 295

Met Arg Arg Pro Ser Leu

1 5

tta tta aaa gac atc ctc aaa tgt aca ttg ctt gtg ttt gga gtg tgg 343

Leu Leu Lys Asp Ile Leu Lys Cys Thr Leu Leu Val Phe Gly Val Trp

10 15 20

atc ctt tat atc ctc aag tta aat tat act act gaa gaa tgt gac atg 391

Ile Leu Tyr Ile Leu Lys Leu Asn Tyr Thr Thr Glu Glu Cys Asp Met

25 30 35

aaa aaa atg cat tat gtg gac cct gac cat gta aag aga gct cag aaa 439

Lys Lys Met His Tyr Val Asp Pro Asp His Val Lys Arg Ala Gln Lys

40 45 50

tat gct cag caa gtc ttg cag aag gaa tgt cgt ccc aag ttt gcc aag 487

Tyr Ala Gln Gln Val Leu Gln Lys Glu Cys Arg Pro Lys Phe Ala Lys

55 60 65 70

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Thr Ser Met Ala Leu Leu Phe Glu His Arg Tyr Ser Val Asp Leu Leu

75 80 85

cct ttt gtg cag aag gcc ccc aaa gac agt gaa gct gag tcc aag tac 583

Pro Phe Val Gln Lys Ala Pro Lys Asp Ser Glu Ala Glu Ser Lys Tyr

90 95 100

gat cct cct ttt ggg ttc cgg aag ttc tcc agt aaa gtc cag acc ctc 631

Asp Pro Pro Phe Gly Phe Arg Lys Phe Ser Ser Lys Val Gln Thr Leu

105 110 115

ttg gaa ctc ttg cca gag cac gac ctc cct gaa cac ttg aaa gcc aag 679

Leu Glu Leu Leu Pro Glu His Asp Leu Pro Glu His Leu Lys Ala Lys

120 125 130

acc tgt cgg cgc tgt gtg gtt att gga agc gga gga ata ctg cac gga 727

Thr Cys Arg Arg Cys Val Val Ile Gly Ser Gly Gly Ile Leu His Gly

135 140 145 150

tta gaa ctg ggc cac acc ctg aac cag ttc gat gtt gtg ata agg tta 775

Leu Glu Leu Gly His Thr Leu Asn Gln Phe Asp Val Val Ile Arg Leu

155 160 165

aac agt gca cca gtt gag gga tat tca gaa cat gtt gga aat aaa act 823

Asn Ser Ala Pro Val Glu Gly Tyr Ser Glu His Val Gly Asn Lys Thr

170 175 180

act ata agg atg act tat cca gag ggc gca cca ctg tct gac ctt gaa 871

Thr Ile Arg Met Thr Tyr Pro Glu Gly Ala Pro Leu Ser Asp Leu Glu

185 190 195

tat tat tcc aat gac tta ttt gtt gct gtt tta ttt aag agt gtt gat 919

Tyr Tyr Ser Asn Asp Leu Phe Val Ala Val Leu Phe Lys Ser Val Asp

200 205 210

ttc aac tgg ctt caa gca atg gta aaa aag gaa acc ctg cca ttc tgg 967

Phe Asn Trp Leu Gln Ala Met Val Lys Lys Glu Thr Leu Pro Phe Trp

215 220 225 230

gta cga ctc ttc ttt tgg aag cag gtg gca gaa aaa atc cca ctg cag 1015

Val Arg Leu Phe Phe Trp Lys Gln Val Ala Glu Lys Ile Pro Leu Gln

235 240 245

cca aaa cat ttc agg att ttg aat cca gtt atc atc aaa gag act gcc 1063

Pro Lys His Phe Arg Ile Leu Asn Pro Val Ile Ile Lys Glu Thr Ala

250 255 260

ttt gac atc ctt cag tac tca gag cct cag tca agg ttc tgg ggc cga 1111

Phe Asp Ile Leu Gln Tyr Ser Glu Pro Gln Ser Arg Phe Trp Gly Arg

265 270 275

gat aag aac gtc ccc aca atc ggt gtc att gcc gtt gtc tta gcc aca 1159

Asp Lys Asn Val Pro Thr Ile Gly Val Ile Ala Val Val Leu Ala Thr

280 285 290

cat ctg tgc gat gaa gtc agt ttg gcg ggt ttt gga tat gac ctc aat 1207

His Leu Cys Asp Glu Val Ser Leu Ala Gly Phe Gly Tyr Asp Leu Asn

295 300 305 310

caa ccc aga aca cct ttg cac tac ttc gac agt caa tgc atg gct gct 1255

Gln Pro Arg Thr Pro Leu His Tyr Phe Asp Ser Gln Cys Met Ala Ala

315 320 325

atg aac ttt cag acc atg cat aat gtg aca acg gaa acc aag ttc ctc 1303

Met Asn Phe Gln Thr Met His Asn Val Thr Thr Glu Thr Lys Phe Leu

330 335 340

tta aag ctg gtc aaa gag gga gtg gtg aaa gat ctc agt gga ggc att 1351

Leu Lys Leu Val Lys Glu Gly Val Val Lys Asp Leu Ser Gly Gly Ile

345 350 355

gat cgt gaa ttt tga acacagaaaa cctcagttga aaatgcaact ctaactctga 1406

Asp Arg Glu Phe

360

gagctgtttt tgacagcctt cttgatgtat ttctccatcc tgcagatact ttgaagtgca 1466

gctcatgttt ttaactttta atttaaaaac acaaaaaaaa ttttagctct tcccactttt 1526

tttttcctat ttatttgagg tcagtgtttg tttttgcaca ccattttgta aatgaaactt 1586

aagaattgaa ttggaaagac ttctcaaaga gaattgtatg taacgatgtt gtattgattt 1646

ttaagaaagt aatttaattt gtaaaacttc tgctcgttta cactgcacat tgaatacagg 1706

taactaattg gaaggagagg ggaggtcact cttttgatgg tggccctgaa cctcattctg 1766

gttccctgct gcgctgcttg gtgtgaccca cggaggatcc actcccagga tgacgtgctc 1826

cgtagctctg ctgctgatac tgggtctgcg atgcagcggc gtgaggcctg ggctggttgg 1886

agaaggtcac aacccttctc tgttggtctg ccttctgctg aaagactcga gaaccaacca 1946

gggaagctgt cctggaggtc cctggtcgga gagggacata gaatctgtga cctctgacaa 2006

ctgtgaagcc accctgggct acagaaacca cagtcttccc agcaattatt acaattcttg 2066

aattccttgg ggatttttta ctgccctttc aaagcactta agtgttagat ctaacgtgtt 2126

ccagtgtctg tctgaggtga cttaaaaaat cagaacaaaa cttctattat ccagagtcat 2186

gggagagtac accctttcca ggaataatgt tttgggaaac actgaaatga aatcttccca 2246

gtattataaa ttgtgtattt aaaaaaaaga aacttttctg aatgcctacc tggcggtgta 2306

taccaggcag tgtgccagtt taaaaagatg aaaaagaata aaaacttttg aggaac 2362

<210>2

<211>362

<212>PRT

<213>人

<400>2

Met Arg Arg Pro Ser Leu Leu Leu Lys Asp Ile Leu Lys Cys Thr Leu

1 5 10 15

Leu Val Phe Gly Val Trp Ile Leu Tyr Ile Leu Lys Leu Asn Tyr Thr

20 25 30

Thr Glu Glu Cys Asp Met Lys Lys Met His Tyr Val Asp Pro Asp His

35 40 45

Val Lys Arg Ala Gln Lys Tyr Ala Gln Gln Val Leu Gln Lys Glu Cys

50 55 60

Arg Pro Lys Phe Ala Lys Thr Ser Met Ala Leu Leu Phe Glu His Arg

65 70 75 80

Tyr Ser Val Asp Leu Leu Pro Phe Val Gln Lys Ala Pro Lys Asp Ser

85 90 95

Glu Ala Glu Ser Lys Tyr Asp Pro Pro Phe Gly Phe Arg Lys Phe Ser

100 105 110

Ser Lys Val Gln Thr Leu Leu Glu Leu Leu Pro Glu His Asp Leu Pro

115 120 125

Glu His Leu Lys Ala Lys Thr Cys Arg Arg Cys Val Val Ile Gly Ser

130 135 140

Gly Gly Ile Leu His Gly Leu Glu Leu Gly His Thr Leu Asn Gln Phe

145 150 155 160

Asp Val Val Ile Arg Leu Asn Ser Ala Pro Val Glu Gly Tyr Ser Glu

165 170 175

His Val Gly Asn Lys Thr Thr Ile Arg Met Thr Tyr Pro Glu Gly Ala

180 185 190

Pro Leu Ser Asp Leu Glu Tyr Tyr Ser Asn Asp Leu Phe Val Ala Val

195 200 205

Leu Phe Lys Ser Val Asp Phe Asn Trp Leu Gln Ala Met Val Lys Lys

210 215 220

Glu Thr Leu Pro Phe Trp Val Arg Leu Phe Phe Trp Lys Gln Val Ala

225 230 235 240

Glu Lys Ile Pro Leu Gln Pro Lys His Phe Arg Ile Leu Asn Pro Val

245 250 255

Ile Ile Lys Glu Thr Ala Phe Asp Ile Leu Gln Tyr Ser Glu Pro Gln

260 265 270

Ser Arg Phe Trp Gly Arg Asp Lys Asn Val Pro Thr Ile Gly Val Ile

275 280 285

Ala Val Val Leu Ala Thr His Leu Cys Asp Glu Val Ser Leu Ala Gly

290 295 300

Phe Gly Tyr Asp Leu Asn Gln Pro Arg Thr Pro Leu His Tyr Phe Asp

305 310 315 320

Ser Gln Cys Met Ala Ala Met Asn Phe Gln Thr Met His Asn Val Thr

325 330 335

Thr Glu Thr Lys Phe Leu Leu Lys Leu Val Lys Glu Gly Val Val Lys

340 345 350

Asp Leu Ser Gly Gly Ile Asp Arg Glu Phe

355 360

<210>3

<211>2221

<212>DNA

<213>小鼠

<220>

<221>CDS

<222>(151)..(1314)

<223>

<400>3

tctttgcgat accccaggcc cagcggctcc tccccagccc tgcgacgccg gacgcgcctg 60

ctaggggaca cgggcggagg gtcgcggccc ctggctgcct acatgggcgc ccccggcgag 120

ctgcgcaggt gtggacgcgg cgctgcggca atg cca agt gag ttc acc tct gca 174

Met Pro Ser Glu Phe Thr Ser Ala

1 5

aag ctg aga agt gat tgc tca agg acc tcc ctg caa tgg tac acc cga 222

Lys Leu Arg Ser Asp Cys Ser Arg Thr Ser Leu Gln Trp Tyr Thr Arg

10 15 20

acc cag cac aag atg aga aga ccc agc ttg tta ata aaa gac atc tgc 270

Thr Gln His Lys Met Arg Arg Pro Ser Leu Leu Ile Lys Asp Ile Cys

25 30 35 40

aag tgc acg ttg gtt gca ttt gga gtc tgg ctc ctg tac atc ctc att 318

Lys Cys Thr Leu Val Ala Phe Gly Val Trp Leu Leu Tyr Ile Leu Ile

45 50 55

ttg aat tac acc gct gaa gaa tgt gac atg aaa aga atg cac tat gtg 366

Leu Asn Tyr Thr Ala Glu Glu Cys Asp Met Lys Arg Met His Tyr Val

60 65 70

gac cct gac cgg ata aag aga gct cag agc tat gct cag gaa gtc ttg 414

Asp Pro Asp Arg Ile Lys Arg Ala Gln Ser Tyr Ala Gln Glu Val Leu

75 80 85

cag aag gaa tgt cgg ccc agg tac gcg aag acg gct atg gct ctg tta 462

Gln Lys Glu Cys Arg Pro Arg Tyr Ala Lys Thr Ala Met Ala Leu Leu

90 95 100

ttt gag gac agg tac agc atc aac ttg gag cct ttt gtg cag aag gtc 510

Phe Glu Asp Arg Tyr Ser Ile Asn Leu Glu Pro Phe Val Gln Lys Val

105 110 115 120

ccc acg gcc agt gaa gct gag ctc aag tat gac ccg cct ttt gga ttc 558

Pro Thr Ala Ser Glu Ala Glu Leu Lys Tyr Asp Pro Pro Phe Gly Phe

125 130 135

cgg aag ttc tcc agt aaa gtc cag agc ctc ttg gat atg ctg ccc gaa 606

Arg Lys Phe Ser Ser Lys Val Gln Ser Leu Leu Asp Met Leu Pro Glu

140 145 150

cat gac ttt tct gaa cac ttg aga gcc aag gcc tgc aag cgc tgt gtg 654

His Asp Phe Ser Glu His Leu Arg Ala Lys Ala Cys Lys Arg Cys Val

155 160 165

gtt gtt ggg aac ggg ggc atc ctg cac gga cta gag ctg ggt cac gcc 702

Val Val Gly Asn Gly Gly Ile Leu His Gly Leu Glu Leu Gly His Ala

170 175 180

ctc aac cag ttc gat gtg gta ata agg ttg aac agt gcg cca gtt gag 750

Leu Asn Gln Phe Asp Val Val Ile Arg Leu Asn Ser Ala Pro Val Glu

185 190 195 200

ggt tac tct gaa cac gtt ggg aat aaa act act ata agg atg act tac 798

Gly Tyr Ser Glu His Val Gly Asn Lys Thr Thr Ile Arg Met Thr Tyr

205 210 215

cca gag ggt gcg cca ctg tcg gac gtt gaa tac tac gcc aat gat ttg 846

Pro Glu Gly Ala Pro Leu Ser Asp Val Glu Tyr Tyr Ala Asn Asp Leu

220 225 230

ttc gtt act gtt tta ttt aag agt gtt gat ttc aag tgg ctt caa gca 894

Phe Val Thr Val Leu Phe Lys Ser Val Asp Phe Lys Trp Leu Gln Ala

235 240 245

atg gta aaa aat gaa agc ctg ccc ttt tgg gtt cgc ctc ttc ttt tgg 942

Met Val Lys Asn Glu Ser Leu Pro Phe Trp Val Arg Leu Phe Phe Trp

250 255 260

aag caa gtg gca gaa aaa gtc cca ctc cag cca aag cac ttc agg att 990

Lys Gln Val Ala Glu Lys Val Pro Leu Gln Pro Lys His Phe Arg Ile

265 270 275 280

ttg aac cca gtt atc atc aaa gaa act gcc ttc gac atc ctt cag tac 1038

Leu Asn Pro Val Ile Ile Lys Glu Thr Ala Phe Asp Ile Leu Gln Tyr

285 290 295

tca gag cct cag tca aga ttc tgg ggc cat gat aag aac atc ccc acg 1086

Ser Glu Pro Gln Ser Arg Phe Trp Gly His Asp Lys Asn Ile Pro Thr

300 305 3l0

atc ggc gtc att gcc gtt gtc ttg gct aca cat ctg tgt gat gaa gtc 1134

Ile Gly Val Ile Ala Val Val Leu Ala Thr His Leu Cys Asp Glu Val

315 320 325

agc ctg gca ggc ttt ggc tac gac ctc agt caa ccc agg acc cct ctg 1182

Ser Leu Ala Gly Phe Gly Tyr Asp Leu Ser Gln Pro Arg Thr Pro Leu

330 335 340

cac tac ttt gac agt cag tgc atg ggc gcc atg cac tgg cag gtc atg 1230

His Tyr Phe Asp Ser Gln Cys Met Gly Ala Met His Trp Gln Val Met

345 350 355 360

cac aat gtg acc aca gag acc aag ttc ctc ctg aag ctc ctc aag gag 1278

His Asn Val Thr Thr Glu Thr Lys Phe Leu Leu Lys Leu Leu Lys Glu

365 370 375

ggc gtg gtg gag gac ctc agc ggc ggc atc cac tga gaactcggaa 1324

Gly Val Val Glu Asp Leu Ser Gly Gly Ile His

380 385

cacggcaaac ctcacccagc accgcagctg agagcgtggt gagcagcctc cacagggact 1384

tcaccctgca gctgcttcga tgtgcagcta gtgttttcaa actccacatt ttttttaaaa 1444

aaggaaaaga aagaacaaca gcaacaacaa aagctctgct ctgtgcacct cttcgtccta 1504

tttatttgaa gtcagtgttg gattttgcac agttttgtaa gttaatctta agaatgggat 1564

tggaaggact tttcaaagag aattgtatag tttattgttt tttaaggaag taatttaatt 1624

tgcagaaact gtacacacgt actctgctca ggtgttgagg tgggaggaga ggggcttctg 1684

gcccctggat gatggctgtg atgcccgata ctggggtctg ctgctctgtt tggtagaact 1744

gatggcagag aaacttcctg cctccaggat aaagggctta ctcatcacct ctggcagctg 1804

ctagacaagt tcataacccc tttctgctag tccatctgcc agctggctcg caggactcag 1864

gcagggcagc tgtcccggag gctgctggtt ggtgagccac tgtcagctga gcgccgtgat 1924

gttgccccag ggtggaagaa gccacacttc ctacactgtc agggcacttt taaacttctg 1984

gaggggtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgttca 2044

ttctgccctt ccaaatcatc taagtgttat ttaaggcact ctgctgtttg tatgagatgg 2104

ctcatagata ttatgacaaa gcctttgtta tccaggccat gggaagagga aaaagaaaag 2164

aaagagagaa aagaataaaa gcttttgagg agcccctgtg atttcctgaa aaaaaaa 2221

<210>4

<211>387

<212>PRT

<213>小鼠

<400>4

Met Pro Ser Glu Phe Thr Ser Ala Lys Leu Arg Ser Asp Cys Ser Arg

1 5 10 15

Thr Ser Leu Gln Trp Tyr Thr Arg Thr Gln His Lys Met Arg Arg Pro

20 25 30

Ser Leu Leu Ile Lys Asp Ile Cys Lys Cys Thr Leu Val Ala Phe Gly

35 40 45

Val Trp Leu Leu Tyr Ile Leu Ile Leu Asn Tyr Thr Ala Glu Glu Cys

50 55 60

Asp Met Lys Arg Met His Tyr Val Asp Pro Asp Arg Ile Lys Arg Ala

65 70 75 80

Gln Ser Tyr Ala Gln Glu Val Leu Gln Lys Glu Cys Arg Pro Arg Tyr

85 90 95

Ala Lys Thr Ala Met Ala Leu Leu Phe Glu Asp Arg Tyr Ser Ile Asn

100 105 110

Leu Glu Pro Phe Val Gln Lys Val Pro Thr Ala Ser Glu Ala Glu Leu

115 120 125

Lys Tyr Asp Pro Pro Phe Gly Phe Arg Lys Phe Ser Ser Lys Val Gln

130 135 140

Ser Leu Leu Asp Met Leu Pro Glu His Asp Phe Ser Glu His Leu Arg

145 150 155 160

Ala Lys Ala Cys Lys Arg Cys Val Val Val Gly Asn Gly Gly Ile Leu

165 170 175

His Gly Leu Glu Leu Gly His Ala Leu Asn Gln Phe Asp Val Val Ile

180 185 190

Arg Leu Asn Ser Ala Pro Val Glu Gly Tyr Ser Glu His Val Gly Asn

195 200 205

Lys Thr Thr Ile Arg Met Thr Tyr Pro Glu Gly Ala Pro Leu Ser Asp

210 215 220

Val Glu Tyr Tyr Ala Asn Asp Leu Phe Val Thr Val Leu Phe Lys Ser

225 230 235 240

Val Asp Phe Lys Trp Leu Gln Ala Met Val Lys Asn Glu Ser Leu Pro

245 250 255

Phe Trp Val Arg Leu Phe Phe Trp Lys Gln Val Ala Glu Lys Val Pro

260 265 270

Leu Gln Pro Lys His Phe Arg Ile Leu Asn Pro Val Ile Ile Lys Glu

275 280 285

Thr Ala Phe Asp Ile Leu Gln Tyr Ser Glu Pro Gln Ser Arg Phe Trp

290 295 300

Gly His Asp Lys Asn Ile Pro Thr Ile Gly Val Ile Ala Val Val Leu

305 310 315 320

Ala Thr His Leu Cys Asp Glu Val Ser Leu Ala Gly Phe Gly Tyr Asp

325 330 335

Leu Ser Gln Pro Arg Thr Pro Leu His Tyr Phe Asp Ser Gln Cys Met

340 345 350

Gly Ala Met His Trp Gln Val Met His Asn Val Thr Thr Glu Thr Lys

355 360 365

Phe Leu Leu Lys Leu Leu Lys Glu Gly Val Val Glu Asp Leu Set Gly

370 375 380

Gly Ile His

385

<210>5

<211>21

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>干扰RNA

<220>

<221>misc_feature

<222>(20)..(21)

<223>n＝t 5-甲基尿苷

<400>5

ggguuauucu gaacauguun n 21

Claims

1.GM3合酶抑制剂用于制造旨在治疗糖尿病微血管并发症的药物的用途。

2.根据权利要求1的用途，其中糖尿病微血管并发症是糖尿病肾病。

3.根据权利要求1或2的用途，其中抑制剂是GM3合酶基因或蛋白质的表达抑制剂。

4.根据权利要求3的用途，其中抑制剂选自反义核酸、核酶、干扰RNA和适体。

5.根据权利要求4的用途，其中抑制剂是在高度严格条件下与序列SEQ ID NO：1特异性杂交的反义核酸序列。

6.根据权利要求1或2的用途，其中抑制剂是GM3合酶活性抑制剂。

7.根据权利要求6的用途，其中抑制剂是针对人GM3合酶的单克隆或多克隆的抗体。

8.筛选或鉴定用于治疗和/或预防糖尿病微血管并发症的化合物的体外方法，其中评估至少一种测试化合物抑制GM3合酶活性的能力，GM3合酶活性水平的下降是化合物有效治疗和/或预防糖尿病微血管并发症的指征。

9.根据权利要求8的方法，其中糖尿病微血管并发症是糖尿病肾病。

10.根据权利要求8或9的方法，所述筛选方法包括由以下组成的步骤：将至少一种测试化合物与表达GM3合酶的细胞接触，并确定所述化合物抑制细胞中神经节苷脂GM3合成的能力，细胞中神经节苷脂GM3合成水平的下降是化合物有效治疗和/或预防糖尿病微血管并发症的指征。

11.根据权利要求8到10中任一项的方法，所述筛选方法包括由一下组成的步骤：将至少一种测试化合物与GM3合酶接触，并确定所述化合物抑制唾液酸残基从唾液酸供体到唾液酸受体半乳糖残基的3-羟基基团的转移能力，唾液酸转移活性水平的下降是化合物抑制GM3合酶和有效治疗和/或预防糖尿病微血管并发症的指征。

12.根据权利要求11的方法，其中测定从CMP-N-乙酰神经氨酸到乳糖苷神经酰胺的唾液酸转移水平。

13.根据权利要求11或12的方法，其中以可检测的方式标记唾液酸供体和/或受体。