CN107475346B - 一种体外筛选糖尿病肾病药物的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了通过测定肾小球系膜细胞、肾小管上皮细胞和内皮细胞在给药后单位细胞的培养液中的葡萄糖浓度的变化和细胞增殖抑制率的变化，进行体外筛选糖尿病肾病药物的方法。该方法不仅适用于小分子化合物的筛选，还特别适用于中药组合物的组方配伍筛选和制备工艺筛选。应用该模型和方法筛选药物，成本低、时间短、简便易行、可靠性强，对于糖尿病肾病候选药物的早期筛选具有重要意义。

Description

一种体外筛选糖尿病肾病药物的方法
技术领域
本发明涉及一种体外筛选药物的方法，该方法主要用于筛选糖尿病肾病药物。更具体地，本发明涉及一种采用高通量手段体外筛选糖尿病肾病药物的方法。
背景技术
糖尿病肾病(diabetic nephropathy，DN)是目前糖尿病最严重和最常见的并发症之一，患者血管持续处于高糖状态下而产生各种微血管病变致病。DN早期表现为肾脏细胞外基质增生、肾小球高滤过和肾小管高灌注。随着病程的进展，引发肾小球和肾小管细胞进行性丢失，最终导致肾小球硬化和肾小管萎缩，肾间质纤维化。典型病理表现为：蛋白尿增多；肾小球滤过率(GFR)一过性增高，而后进行性下降；发生视网膜病变等微血管并发症；肾小球基底膜增厚、系膜基质增生、结节性肾小球硬化、肾小管间质纤维化、动脉玻璃样病变等。
目前在糖尿病肾病药物筛选领域，最多采用的思路是使用动物模型进行筛选。通常使用的动物模型主要有如下五种：
(1)大剂量STZ注射诱导大鼠1型DN模型。一般注射后4-24周诱发DN。使用该模型存在的问题包括：1)动物死亡率高；2)肾脏病变比较缓和，不易形成肾小球硬化、小管间质纤维化等类似于人类DN中、晚期患者的肾脏病理改变；3)STZ具有肾毒性，会一定程度的干扰实验结果；4)蛋白尿的严重程度与STZ剂量有关。
(2)小剂量STZ加高脂饲料诱导大鼠2型DN模型。该模型与人类2型DN较为接近，可出现几乎全部人类DN的典型病变；尤其是肾小球硬化和肾小管-间质纤维化。目前，该模型在2型DN的发病机制与药物筛选研究中的应用日益广泛。但是，据文献报道，小剂量STZ加高脂喂养5周后出现胰岛素抵抗，再15周后出现轻度蛋白尿，因此造模时间较长。
(3)单侧肾脏摘除加小剂量STZ诱导大鼠DN模型。肾脏摘除，不符合人类2型DN的发病过程；且据文献报道，肾脏摘除加小剂量STZ诱导后20周才出现蛋白尿，且为重度，造模时间较长。
(4)自发性2型糖尿病大鼠OLETF。据文献报道，36周时出现轻度蛋白尿，56周重度；因此造模时间长，且动物和饲料价格昂贵。
(5)自发性2型糖尿病小鼠KK-Ay。该模型在12周龄时出现早期DN病变，20周龄时出现近似于人类IV期DN的表现。但是，KK-Ay小鼠结节位于肾门附近，其不明显，且范围小；6-7个月出现肾盂积水，致使膀胱膨胀；7月龄时因肾衰竭的病死率很高；在研究DN终末期肾衰竭方面不具优势；不明原因梗阻性肾病。且KK-Ay小鼠8周龄时血糖升高糖尿病发病，20周龄左右血糖容易恢复而自愈或者出现高血糖致死。
综上可知，DN动物模型普遍存在造模时间长、操作繁琐、造价高、模型不稳定等问题。这对于DN新药研发时的药物筛选和药效评价来说，需要至少半年的时间，花费数十万至百余万元，且不可控因素较多。
因此，寻找一种简便易行、可靠性强、操作简单、检测效率高的药效筛选模型和方法，对于早期候选药物在糖尿病肾病上的药效考察具有重要意义和大量需求。
发明内容
本发明的目的是提供一种体外筛选糖尿病肾病药物的方法，方法中选定两至三种肾脏细胞制作模型，可采用高通量手段筛选药物。该模型和方法的优点在于：成本低、时间短、简便易行、可靠性强，对于糖尿病肾病候选药物的早期筛选具有重要意义。
肾脏是由肾脏固有细胞和细胞外基质构成的。肾脏固有细胞指的是肾小球毛细血管上皮细胞(足细胞)、肾小球毛细血管内皮细胞、肾小球系膜细胞、肾小管上皮细胞及肾间质成纤维细胞。通过查阅文献，发现与DN密切相关并研究较多的集中在以下4个细胞：肾小球毛细血管上皮细胞(足细胞)、肾小球毛细血管内皮细胞、肾小球系膜细胞、肾小管上皮细胞。
肾小球毛细血管上皮细胞(足细胞)的功能是滤过屏障(机械屏障和电荷屏障)和分泌Ⅳ型胶原、纤粘连蛋白、基质金属蛋白酶等。当患有肾脏疾病时，足细胞是最易和最先出现病变的细胞；而当足细胞受损时，足突的正常结构发生改变，滤过膜完整性受到破坏，导致蛋白尿发生；与此同时基底膜成分发生改变、组成基底膜的某些成分合成增加、降解减少，导致基底膜增厚、基质增多，最终肾小球硬化形成。该细胞培养条件特殊，33℃/干扰素存在条件下，细胞增殖；37℃培养6天以上，细胞分化。
肾小球毛细血管内皮细胞的主要功能是滤过屏障、维持肾小球血流动力学功能、维持血液通畅；其受损后会增生、肿胀，最终形成血栓、肾脏缺血缺氧、尿蛋白和/或潜血。肾小球毛细血管内皮细胞损伤是DN早期的特征性改变之一。
肾小球系膜细胞具有多种功能，如分泌细胞基质，产生细胞因子，它是肾小球中功能最活跃的一类细胞，也是研究肾小球疾病发病机制的重要细胞模型。免疫复合物及其他损伤因子常常引起系膜细胞增生。一方面，早期以系膜细胞增生为主，后期伴系膜基质增多。系膜细胞增生过度，系膜基质增宽，致使毛细血管官腔变窄。另一方面，系膜细胞增生后向基底膜及内皮细胞间插入，形成双轨或多轨。以上这些病理变化导致肾小球的滤过面积减小，滤过功能下降。
肾小管上皮细胞主要功能是对原尿吸收和稀释、保持电解质和酸碱平衡。病变发生后细胞会变性、坏死、脱落，继而引发夜尿增多、电解质紊乱和酸碱失衡等。最新研究发现，肾小管病变可不依赖肾小球的改变。肾小管损伤的研究中，人们发现无论是在糖尿病病人，还是1型或2型糖尿病动物模型，均出现肾小管细胞凋亡和萎缩。肾小管损害包括肾小管上皮细胞肥大、凋亡，细胞外基质堆积等。
综上，肾小球毛细血管上皮细胞(足细胞)、肾小球毛细血管内皮细胞、肾小球系膜细胞和肾小管上皮细胞，作为肾脏固有细胞，与DN发病密切相关，体现了DN的几大诱因。因此，如果能使细胞增生和凋亡达到平衡，将大大增加治愈疾病的可能性。本发明人综合考虑细胞培养难易程度、生理病理特点、发病机制、检测方法可行性等因素，最终选择肾小球毛细血管内皮细胞、肾小球系膜细胞和肾小管上皮细胞作为研究对象；其中肾小球系膜细胞和肾小管上皮细胞与DN的发病最为密切。由于细胞库中没有商业化的肾小球毛细血管内皮细胞株，故选择可商业化的内皮细胞来代替。
高浓度葡萄糖诱导肾小球系膜细胞、肾小管上皮细胞和内皮细胞损伤后，致使这些细胞对葡萄糖的摄入率明显增高，所以单位细胞的培养液中的葡萄糖浓度下降；当加入药物干预后，细胞对葡萄糖的摄入率降低，单位细胞的培养液中的葡萄糖浓度升高。细胞中的高浓度葡萄糖致使肾小球系膜细胞、肾小管上皮细胞和内皮细胞增生；当加入药物干预后，细胞增生现象得以逆转。
基于上述原理，本发明人将候选药物作用于不同浓度葡萄糖诱导的肾小球系膜细胞、肾小管上皮细胞和内皮细胞不同的时间后，进行单位细胞的培养液中的葡萄糖浓度检测和细胞增殖检测，并以这两项检测的结果作为筛选治疗糖尿病肾病药物的依据。
该方法不仅适用于可以直接作用于细胞的小分子化合物的药效筛选，也适用于成分复杂、药代动力学参数不明确的中药复方的组方配伍筛选和制备工艺筛选，并且可多维度的观察候选药物对肾脏固有细胞的作用。该方法不但属于DN新药研发时体外筛选新方法，而且简便易行，极大地降低了经济和时间成本，提高了新药筛选效率。
具体而言，本发明提供了一种体外筛选糖尿病肾病药物的方法，其包括如下步骤：
第一步，造模及给药
将培养后的肾小球系膜细胞、肾小管上皮细胞和内皮细胞分别制成细胞悬液；将上述三种细胞悬液分别接种于培养板中，每种细胞分为模型组和模型给药组，之后模型组换用高浓度葡萄糖培养液，模型给药组换用含有待筛选药物的高浓度葡萄糖培养液，其中所述高浓度葡萄糖培养液为一种浓度或多种浓度；
第二步，检测及结果标记
在规定时间点测定培养板每个孔单位细胞的培养液中的葡萄糖浓度和每个孔的细胞增殖抑制率，其中对于每种浓度的葡萄糖培养液设定一个或多个测定时间点；如果相比于模型组，模型给药组的单位细胞的培养液中的葡萄糖浓度升高，则在对应葡萄糖浓度、对应测定时间点和对应细胞上标记阳性结果；如果相比于模型组，模型给药组的细胞增殖抑制率升高，则在对应葡萄糖浓度、对应测定时间点和对应细胞上标记阳性结果；当在某一细胞的某一葡萄糖浓度的某一测定时间点上同时存在单位细胞的培养液中的葡萄糖浓度升高和细胞增殖抑制率升高这两个阳性结果，则在对应葡萄糖浓度、对应时间点和对应细胞上标记强阳性结果；
第三步，得出结论
如果在任一细胞上存在任一强阳性结果，则该药物入选。
上述方法可用于筛选单一药物，也可同时用于筛选两种或两种以上的药物。
当同时筛选两种或两种以上药物时，按如下优先次序确定入选药物：(1)，对于上述三种细胞，在同一葡萄糖浓度的同一时间点上同时标记强阳性结果的总和最多的药物入选；(2)，若(1)判定不了，则对肾小球系膜细胞标记强阳性结果总和最多的药物入选；(3)，若(2)判定不了，则对肾小管上皮细胞标记强阳性结果总和最多的药物入选；(4)，若(3)判定不了，则对内皮细胞标记强阳性结果总和最多的药物入选。
上述方法可只使用肾小球系膜细胞和肾小管上皮细胞两种细胞。当使用这两种细胞同时用于筛选两种或两种以上药物时，按如下优先次序确定入选药物：(1)，对于这两种细胞，在同一葡萄糖浓度的同一时间点上同时标记强阳性结果的总和最多的药物入选；(2)，若(1)判定不了，则对肾小球系膜细胞标记强阳性结果的总和最多的药物入选；(3)，若(2)判定不了，则对肾小管上皮细胞标记强阳性结果总和最多的药物入选。
如使用了多种高葡萄糖浓度的培养液，则计算在多种高葡萄糖浓度培养液下标记的强阳性结果的总和，如在多个时间点进行了测定，则计算在多个时间点下标记的强阳性结果的总和，如果同时使用了多种高葡萄糖浓度的培养液及在多个时间点进行了测定，则计算多种高葡萄糖浓度培养液的多个时间点上标记的强阳性结果的总和。
该方法中使用的肾小球系膜细胞、肾小管上皮细胞和内皮细胞优选使用小鼠肾小球系膜细胞SV40MES 13、人肾小管上皮细胞HKC和人脐静脉内皮细胞EA.hy926，优选的前两种细胞用含5％FBS的DMEM/F-12培养液培养，后一种细胞用含10％FBS的DMEM培养液培养。
细胞培养后经胰酶消化，用基础培养液制成细胞悬液。该方法中的制成的细胞悬液的浓度为1.5*104个细胞/mL细胞悬液，细胞悬液以200μL/孔接种于96孔板。
任选地，按照规定检测时间点设置不同的培养板，例如规定检测的时间点为24小时、48小时和72小时，则分别设置三块板，分别用于24小时、48小时和72小时的检测。每块板在接种时，除模型组、模型给药组以外，任选地按需要设置调零组、空白组。每组均可任选地设置为四复孔。周边用PBS填充。调零组不加细胞，只加对应的培养液。
在接种后24小时换用培养液时，优选200μL/孔。调零组换用基础培养液；模型组换用高浓度葡萄糖培养液；模型给药组换用含有待筛选药物的高浓度葡萄糖培养液；空白组换用基础培养液后补加甘露醇至相应的高葡萄糖浓度，例如，当模型组和模型给药组中葡萄糖培养液浓度为25mmol/L，空白组中的基础培养液含葡萄糖11.875mmol/L时，再加入13.125mmol/L的甘露醇，即使葡糖糖和甘露醇的浓度之和为25mmol/L。
当各组设置为四复孔时，模型组中换用的高葡萄糖培养液浓度分别为25、40、60和80mmoL/L；空白组每孔在换用基础培养液后均补加甘露醇至相应的高葡萄糖浓度；模型给药组换用含有待筛选药物的高葡萄糖培养液，浓度分别为25、40、60和80mmoL/L。
该方法中所述的待筛选药物是小分子化合物或中药组合物。所述中药组合物优选是不同组方配伍的或是用不同制备工艺获得的。所述中药组合物优选是含药血清的形式。所述含药血清优选选自用药后多个不同的时间点。
当待筛选药物为含药血清形式时，空白组换用的基础培养液为含空白血清的基础培养液，对于肾小球系膜细胞和肾小管上皮细胞，空白血清占基础培养液的比率为5％；对于内皮细胞，空白血清占基础培养液的比率为10％；模型给药组换用的为含有含药血清的高葡萄糖培养液，对于肾小球系膜细胞和肾小管上皮细胞，含药血清占高葡萄糖培养液的比率为5％；对于内皮细胞，含药血清占高葡萄糖培养液的比率为10％。
当待测药物为中药组合物时可按如下方案制备含药血清，将实验动物随机分组，可分为空白组、中药组合物给药组、西药阳性对照组，优选每组两只或多只实验动物，如中药组合物的组方配伍不同或制备工艺不同，中药组合物给药组也可按不同组方配伍或不同制备工艺分为多组。空白组灌服蒸馏水，中药给药组和西药对照组均以等临床剂量灌胃，持续灌胃7天，每天1次，在第8天灌胃后，在规定的时间点，例如在1.5小时、2小时、3小时、4小时，麻醉取血，离心分离血清，同组混匀，用培养液配成相应浓度。
优选的，测定时间点为换用培养液培养后24小时、48小时和/或72小时。
在该方法中单位细胞的培养液中的葡萄糖浓度的测定采用氧化酶-过氧化物酶法，可使用商购试剂盒，按照试剂盒说明取上清液进行上清液中葡萄糖浓度的测定，然后计算出单位细胞的培养液中的葡萄糖浓度，单位细胞的培养液中的葡萄糖浓度＝每个孔的葡萄糖浓度/(A测量-A调零)，A为吸光度；所述细胞增殖检测采用本领域已知的噻唑蓝(MTT)方法，使用MTT法测定时，设定空白组，空白组换用基础培养液并用甘露醇补至相应的葡萄糖浓度。具体操作方法是，在葡萄糖含量检测后，每孔加入20μL MTT溶液(5mg/mL)，培养4h。去除上清，每孔加入150μL DMSO，室温震荡混匀15min。酶标仪570nm检测吸光度(A)。细胞增殖抑制率(％)＝[(A空白-A调零)-(A测量-A调零)]/(A空白-A调零)*100％。在该公式中，A测量分别代入模型组和模型给药组测定的吸光度。
内皮细胞、肾小球系膜细胞和肾小管上皮细胞，作为3株肾脏固有细胞，是肾脏的重要组成部分，体现了DN发病的几大诱因：肾小球滤过功能障碍、肾脏基质分泌增加导致肾小球基底膜增厚、肾小管重吸收功能受损，最终导致肾小球硬化和肾小管萎缩，肾间质纤维化。使用这三种细胞进行多维度观察，结果可靠。
肾脏固有细胞糖摄入的增加可能是糖尿病患者肾脏病变形成的基础，内皮细胞、肾小球系膜细胞和肾小管上皮细胞均属于对葡萄糖浓度敏感的细胞。因此发明人从量效和时效关系上观察了不同浓度葡萄糖对这3株肾脏固有细胞作用不同时间后的影响，以期体外模拟临床糖尿病人血糖的高低和发病时间的长短与肾脏病变之间的关系。
高浓度葡萄糖使得肾脏固有细胞葡萄糖转运蛋白mRNA和蛋白表达上调，细胞对葡萄糖的摄取增加，致使细胞代偿性的肿大、增生和转化加快、纤维连接蛋白表达量增加等表型和功能的改变，继而引起细胞外基质聚集，基膜增厚。因此发明人从细胞增殖、细胞糖代谢两个角度评判药效，体现了糖尿病肾病发生和进展的一般过程。
高浓度葡萄糖对肾脏固有细胞不仅有糖代谢功能的损伤，还有高渗的物理学损伤，所以空白组用甘露醇调整渗透压，排除了高浓度葡萄糖所产生的高渗透压对体外细胞的干扰。
当待筛选药物是中药复方时，由于中药复方中的成分复杂，药效物质基础不明确，药代动力学参数不易获取，渗透压和pH等极易干扰细胞的正常生长。本发明采用的血清药理学的方法，使中药复方经动物体内代谢，分不同的时间点采血制备含药血清，可最大程度的模拟动物体内代谢。
综上，本发明的方法能够将多个待筛选药物如化合物或使用不同组方配伍或不同制备工艺的中药复方的不同采血点的含药血清、三株细胞、多个葡萄糖浓度、多个细胞干预时间等多因素集成于96孔板中，从细胞增殖、细胞糖代谢两个角度进行高通量药物筛选，集成性好，适用性强，该方法不仅适用于可直接细胞干预的小分子化合物的糖尿病肾病治疗的筛选，也适用于成分复杂的中药复方的工艺或者组方配伍等的筛选。该方法操作简便易行，时间短(1周)、成本低(3万以内)，还可避免使用大批量实验动物的伦理问题。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。
实施例1黄芪芡实大黄中药组合物制备工艺筛选实验
实验目的：通过血清药理学的方法，结合本发明体外药效筛选方法，筛选中药组合物的最优制备工艺，为后续研发奠定基础。
1.实验材料
(1)实验动物
SPF级SD大鼠30只，180-220g，购于北京华阜康生物科技股份有限公司，许可证号：SCXK(京)2014-0004，饲养于北京亦庄国际生物医药科技有限公司，许可证号：SYXK(京)2015-0010。
(2)实验细胞
人肾小管上皮细胞HKC，购于中国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心；小鼠肾小球系膜细胞SV40MES 13，购于中科院上海细胞库；人脐静脉内皮细胞EA.hy926，为本实验室保种。
(3)实验药品
中药组合物处方：黄芪1500g，芡实1200g，大黄500g。
待筛选制备工艺1：取黄芪1500g，芡实1200g，大黄500g，加12倍量水，煎煮2次，每次1.5小时，合并滤液，浓缩至70℃测定相对密度为1.35～1.38的浸膏，喷雾干燥，即得。
待筛选制备工艺2：取黄芪1500g，大黄500g，加6倍量60％乙醇，回流提取2次，每次2小时，过滤，备用；芡实1200g，加6倍量80％乙醇，回流提取4次，每次1小时，过滤，与上述醇提取液合并，浓缩至70℃测定相对密度为1.35～1.38的浸膏，喷雾干燥，即得。
待筛选制备工艺3：取黄芪1500g，大黄500g，加6倍量60％乙醇，回流提取2次，每次2小时，过滤，备用；芡实1200g，加12倍量水，煎煮2次，每次1.5小时，过滤，与上述醇提取液合并，浓缩至70℃测定相对密度为1.35～1.38的浸膏，喷雾干燥，即得。
待筛选制备工艺4：取黄芪1500g，加6倍量60％乙醇，回流提取2次，每次2小时，过滤，备用；大黄500g，芡实1200g，加12倍量水，煎煮2次，每次1.5小时，过滤，与上述醇提取液合并，浓缩至70℃测定相对密度为1.35～1.38的浸膏，喷雾干燥，即得。
(4)实验试剂
水合氯醛(批号20161102，国药集团化学试剂有限公司)；DMEM培养液(批号1750052，美国Hyclone公司)；F-12培养液(批号1806084，美国Hyclone公司)；胎牛血清(批号NZJ1221，美国Hyclone公司)；青霉素硫酸链霉素混合液(批号20130118，北京索莱宝科技有限公司)；胰蛋白酶(批号J160030，美国Hyclone公司)；葡萄糖(glucose,glu)(批号20170110，北京博奥星生物技术有限责任公司)；甘露醇(批号20140810，北京博奥星生物技术有限责任公司)；葡萄糖测定试剂盒(批号20161105147，上海荣盛生物药业有限公司)；MTT(批号3495C435，美国aMResco公司)；DMSO(批号0231，美国aMResco公司分装)。
(5)实验材料
10mL真空采血管，血样采集针，江苏宇力医疗器械有限公司；1.5mLEP管，10μL/200μL/1mL枪头，购自美国Axygen公司；0.45μm有机滤器，天津市东康科技有限公司；5mL/10mL移液管，25cm2细胞培养瓶，96孔细胞培养板，美国Corning公司。
(6)实验仪器
HC-2518R型高速冷冻离心机(安徽中科中佳科学仪器有限公司)，SSW-420-2S型水浴锅(上海博迅实业有限公司医疗设备厂)，DW-HL218型超低温冰箱(中科美菱低温科技股份有限公司)，AL204型电子天平(梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司)，YT-CJ-2ND型超净工作台(北京亚泰科隆仪器技术有限公司)，MCO-175型二氧化碳培养箱(日本SANYO)，BDS200型倒置显微镜(重庆奥特光学仪器有限责任公司)，EOS600D单反相机(日本佳能)，MULTISKAN MK3型酶标仪(美国Thermo公司)。
2.实验方法
(1)含药血清的制备
SPF级SD大鼠30只，检疫5天，饲养于IVC实验动物房，自由摄食、饮水。按体重随机分为如下组：空白组(2h取血)，6只大鼠；工艺1组(2h,3h,4h取血)，每个取血点2只大鼠，共6只大鼠；工艺2组(2h,3h,4h取血)，每个取血点2只大鼠，共6只大鼠；工艺3组(2h,3h,4h取血)，每个取血点2只大鼠，共6只大鼠；工艺4组(2h,3h,4h取血)，每个取血点2只大鼠，共6只大鼠。给药组以等临床剂量3.31g生药/Kg体重灌胃，空白组灌服蒸馏水，持续灌胃7天，每天1次。于第8天灌胃，禁食不禁水，2h、3h或4h后，3.5％水合氯醛1mL/100g体重腹腔注射麻醉，腹主动脉取血，室温静置2h，2500rpm 4℃离心20min，分离血清，同组混匀，56℃灭活30min，1.5mLEP管分装，封口，-80℃保存。用时4℃融化，用培养液配成相应浓度(具体配制方法见(2))，0.45μm过滤除菌，4℃保存。
(2)造模、给药及检测
造模和给药
小鼠肾小球系膜细胞SV40MES 13和人肾小管上皮细胞HKC，用含5％FBS的DMEM/F-12培养液培养；人脐静脉内皮细胞EA.hy926，用含10％FBS的DMEM培养液培养。
细胞第3代，经胰酶消化，用基础培养液制成1.5*104/mL细胞悬液，以200μL/孔接种于96孔培养板中，共3个板子(24h,48h和72h测定各用一个板子)，每个板子分为调零组、空白组、模型组和模型给药组，每组4复孔，周边PBS填充，其中调零组不加细胞只加对应的培养液。
接种24h后，换用相应的培养液，200μL/孔：调零组换用基础培养液；模型组换用25、40、60、80mmoL/L的高葡萄糖培养液；空白组换用含空白组血清的基础培养液(含11.875mM glu)，用甘露醇补至相应的高葡萄糖浓度，例如，模型组为25mmoL/L的葡萄糖时，空白组为基础培养液(含11.875mM glu)再加入13.125mmoL/L的甘露醇，即葡萄糖和甘露醇的浓度之和为25mmoL/L；模型给药组换用含有含药血清的25、40、60、80mmoL/L的高葡萄糖培养液，培养。其中针对肾小球系膜细胞和肾小管上皮细胞，空白组换用含5％空白组血清的基础培养液，模型给药组换用含有5％含药血清的高葡萄糖培养液；针对内皮细胞，空白组换用含10％空白组血清的基础培养液，模型给药组换用含有10％含药血清的高葡萄糖培养液。
培养24h、48h、72h后，进行检测。
细胞培养液中葡萄糖含量检测
培养24h、48h、72h后，取相应时间的培养板各孔上清液用葡萄糖测定试剂盒(葡萄糖氧化酶-过氧化物酶法)进行葡萄糖含量测定，具体步骤参照试剂盒说明书。然后换算为单位细胞的培养液中的葡萄糖浓度，单位细胞的培养液中的葡萄糖浓度＝每个孔的葡萄糖浓度/(A测量-A调零)，A为吸光度。
如果相比于模型组，模型给药组的单位细胞的培养液中的葡萄糖浓度升高，则在对应浓度、对应时间点和对应细胞上标记阳性结果。
细胞增殖检测
培养24h、48h、72h后，葡萄糖含量检测后，用噻唑蓝(MTT)方法测定细胞增殖抑制率。每孔加入20μL MTT溶液(5mg/mL)，培养4h。去除上清，每孔加入150μL DMSO，室温震荡混匀15min。酶标仪570nm检测吸光度(A)。细胞增殖抑制率(％)＝[(A空白-A调零)-(A测量-A调零)]/(A空白-A调零)*100％。在该公式中，A测量分别代入模型组和模型给药组测定的吸光度。
如果相比于模型组，模型给药组的细胞增殖抑制率升高，则在对应浓度、对应时间点和对应细胞上标记阳性结果。
3.实验数据和实验结果
上述标记的实验结果请见如下表1。
表1中药组合物含药血清对高糖诱导的肾脏三种固有细胞的影响的阳性结果的汇总表
Figure BDA0001376367610000121
Figure BDA0001376367610000131
注：肾小球系膜细胞(增殖●/葡萄糖浓度○)；肾小管上皮细胞(增殖▲/葡萄糖浓度△)；内皮细胞(增殖★/葡萄糖浓度☆)
当在某一细胞的某一葡萄糖浓度的某一时间点上同时存在单位细胞的培养液中的葡萄糖浓度升高和细胞增殖抑制率升高两个阳性结果，则在对应葡萄糖浓度、对应时间点和对应细胞上标记强阳性结果。如在肾小球系膜细胞上，在某一葡萄糖浓度的某一时间点上同时存在单位细胞的培养液中的葡萄糖浓度升高和细胞增殖抑制率升高两个阳性结果，则在该对应葡萄糖浓度的对应时间点上标记A；如在肾小管上皮细胞上，在某一葡萄糖浓度的某一时间点上同时存在单位细胞的培养液中的葡萄糖浓度升高和细胞增殖抑制率升高两个阳性结果，则在该对应葡萄糖浓度的对应时间点上标记B；如在内皮细胞上，在某一葡萄糖浓度的某一时间点上同时存在单位细胞的培养液中的葡萄糖浓度升高和细胞增殖抑制率升高两个阳性结果，则在该对应葡萄糖浓度的对应时间点上标记C。标记后的结果请见如下表2。
表2中药组合物含药血清对高糖诱导的肾脏固有细胞的影响的强阳性结果的计数
Figure BDA0001376367610000132
Figure BDA0001376367610000141
注：肾小球系膜细胞(A)；肾小管上皮细胞(B)；内皮细胞(C)
结果判定，按照判定标准第一条，计算对这三株细胞在同一葡萄糖浓度下的同一时间点下都存在强阳性的结果(即在同一葡萄糖浓度下的同一时间点下同时标记为ABC)的总和，阳性药对照组与各工艺组均为0个，此步无法判定；之后，对肾小球系膜细胞标记强阳性的结果总数进行统计，即统计每个工艺组(包括2h、3h、4h)中A的总数，工艺1组0个，工艺2组2个，工艺3组2个，工艺4组3个。
至此，可得出结论：与其它工艺比较，中药组合物工艺4含药血清对高糖诱导的肾脏固有细胞的增殖抑制作用和葡萄糖摄入的抑制作用比较明显，且药物经体内代谢3h～4h达到药效峰值。
4.实验结果分析
在经不同浓度葡萄糖诱导后，小鼠肾小球系膜细胞SV40MES 13、人肾小管上皮细胞HKC和人脐静脉内皮细胞EA.hy926均表现出不同程度的增生，葡萄糖的摄入率明显增高，所以单位细胞的培养液中的葡萄糖浓度下降，但由于实验中是直接在模型组加入了外源性的高浓度葡萄糖，所以模型组的单位细胞的培养液中的葡萄糖浓度略高于空白组，这与文献报道一致，说明我们的模型制作成功。
模型给药组与模型组比较，细胞增殖现象得到显著抑制，单位细胞的培养液中的葡萄糖浓度不同程度的升高。工艺4组对肾小球系膜细胞增殖和葡萄糖浓度均为阳性的计数最多，说明其对高糖诱导的细胞的增殖的抑制作用和葡萄糖摄入的抑制作用较显著。其中工艺4-3h组对高糖诱导的细胞的增殖的抑制作用较显著，对高糖诱导的单位肾脏固有细胞葡萄糖摄入的抑制作用主要集中在工艺4-4h组。中药复方成分复杂，药效物质基础不明确，不同的成分的达峰时间不一致，这些可能是导致中药组合物相同的工艺经动物体内代谢后，不同时间的含药血清的作用靶点不同的主要原因。中药组合物的药效物质基础的确定则需要进行进一步的药代动力学等相关研究。
虽然对肾小球系膜细胞标记强阳性的结果总数进行统计就得出了判定结果，但是以肾小管上皮细胞标记强阳性的结果总数进行统计以及以内皮细胞标记强阳性的结果总数进行统计得出的结论也是一致的。对肾小管上皮细胞标记强阳性的结果总数进行统计，即统计每个工艺组(包括2h、3h、4h)中B的总数，工艺1组0个，工艺2组2个，工艺3组3个，工艺4组4个，其中工艺4组最多；对内皮细胞标记强阳性的结果总数进行统计，即统计每个工艺组(包括2h、3h、4h)中C的总数，工艺1组0个，工艺2组4个，工艺3组1个，工艺4组6个，其中工艺4组最多。
实施例2大黄制备工艺筛选实验
实施例1的结果显示，工艺4的药效优于工艺3，工艺4与工艺3的区别仅在于大黄的提取溶剂不同，工艺3中大黄是醇提，工艺4中大黄是水提，本实验选用与糖尿病肾病发病最为密切的肾小球系膜细胞和肾小管上皮细胞，以检验大黄的水提样品的药效是否优于大黄的醇提样品。
1.实验材料
(1)实验动物
动物SPF级SD大鼠18只，180-220g，购于北京华阜康生物科技股份有限公司，许可证号：SCXK(京)2014-0004，饲养于北京亦庄国际生物医药科技有限公司，许可证号：SYXK(京)2015-0010。
(2)实验细胞
细胞人肾小管上皮细胞HKC，购于中国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心；小鼠肾小球系膜细胞SV40MES 13，购于中科院上海细胞库。
(3)实验药品
大黄Et(醇提)：取大黄500g，加6倍量60％乙醇，回流提取2次，每次2小时，合并滤液，浓缩至70℃测定相对密度为1.35～1.38的浸膏，喷雾干燥，即得。
大黄W(水提)：取大黄500g，加12倍量水，煎煮2次，每次1.5小时，合并滤液，浓缩至70℃测定相对密度为1.35～1.38的浸膏喷雾干燥，即得。
(4)实验试剂
水合氯醛(批号20161102，国药集团化学试剂有限公司)；DMEM培养液(批号1750052，美国Hyclone公司)；F-12培养液(批号1806084，美国Hyclone公司)；胎牛血清(批号NZJ1221，美国Hyclone公司)；青霉素硫酸链霉素混合液(批号20130118，北京索莱宝科技有限公司)；胰蛋白酶(批号J160030，美国Hyclone公司)；葡萄糖(glucose,glu)(批号20170110，北京博奥星生物技术有限责任公司)；甘露醇(批号20140810，北京博奥星生物技术有限责任公司)；葡萄糖测定试剂盒(批号20161105147，上海荣盛生物药业有限公司)；MTT(批号3495C435，美国aMResco公司)；DMSO(批号0231，美国aMResco公司分装)。
(5)实验材料
10mL真空采血管，血样采集针，江苏宇力医疗器械有限公司；1.5mLEP管，10μL/200μL/1mL枪头，购自美国Axygen公司；0.45μm有机滤器，天津市东康科技有限公司；5mL/10mL移液管，25cm2细胞培养瓶，96孔细胞培养板，美国Corning公司。
(6)实验仪器
HC-2518R型高速冷冻离心机(安徽中科中佳科学仪器有限公司)，SSW-420-2S型水浴锅(上海博迅实业有限公司医疗设备厂)，DW-HL218型超低温冰箱(中科美菱低温科技股份有限公司)，AL204型电子天平(梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司)，YT-CJ-2ND型超净工作台(北京亚泰科隆仪器技术有限公司)，MCO-175型二氧化碳培养箱(日本SANYO)，BDS200型倒置显微镜(重庆奥特光学仪器有限责任公司)，EOS600D单反相机(日本佳能)，MULTISKAN MK3型酶标仪(美国Thermo公司)。
2.实验方法
(1)含药血清的制备
SPF级SD大鼠18只，检疫5天，饲养于IVC实验动物房，自由摄食、饮水。按体重随机分为如下组：空白组(2h取血)，共6只大鼠；大黄Et组(2h,3h,4h取血)，每个取血点2只大鼠，共6只大鼠；大黄W组(2h,3h,4h取血)，每个取血点2只大鼠，共6只大鼠。模型给药组以等临床剂量0.5g生药/Kg体重灌胃，空白组灌服蒸馏水，持续灌胃7天，每天1次。于第8天灌胃，禁食不禁水，2h、3h或4h后，3.5％水合氯醛1mL/100g体重腹腔注射麻醉，腹主动脉取血，室温静置2h，2500rpm 4℃离心20min，分离血清，同组混匀，56℃灭活30min，1.5mLEP管分装，封口，-80℃保存。用时4℃融化，用培养液配成相应浓度，0.45μm过滤除菌，4℃保存。
(2)造模、给药及检测
造模和给药
小鼠肾小球系膜细胞SV40MES 13和人肾小管上皮细胞HKC，用含5％FBS的DMEM/F-12培养液培养。
细胞第3代，经胰酶消化，用基础培养液制成1.5*104/mL细胞悬液，以200μL/孔接种于96孔培养板中，共3个板子(24h,48h和72h测定各用一个板子)，每个板子分为调零组、空白组、模型组和模型给药组，每组4复孔，周边PBS填充，其中调零组不加细胞只加对应的培养液。
接种24h后，换用相应的培养液，200μL/孔：调零组换用基础培养液；模型组换用25、40、60、80mmoL/L的高糖培养液；空白组换用含5％空白组血清的基础培养液(含11.875mM glu)，用甘露醇补至相应的单位细胞的培养液中的葡萄糖浓度，例如，模型组为25mmoL/L的葡萄糖时，空白组为基础培养液(含11.875mM glu)再加入13.125mmoL/L的甘露醇，即葡萄糖和甘露醇的浓度之和为25mmoL/L；模型给药组换用含有5％含药血清的25、40、60、80mmoL/L的高糖培养液，培养。
培养24h、48h、72h后，进行检测。
细胞培养液中葡萄糖含量检测
培养24h、48h、72h后，取相应时间的培养板各孔上清液用葡萄糖测定试剂盒(葡萄糖氧化酶-过氧化物酶法)进行葡萄糖含量测定，具体步骤参照试剂盒说明书。然后换算为单位细胞的培养液中的葡萄糖浓度，单位细胞的培养液中的葡萄糖浓度＝每个孔的葡萄糖浓度/(A测量-A调零)，A为吸光度。
如果相比于模型组，模型给药组的单位细胞的培养液中的葡萄糖浓度升高，则在对应浓度、对应时间点和对应细胞上标记阳性结果。
细胞增殖检测
培养24h、48h、72h后，葡萄糖含量检测后，用噻唑蓝(MTT)方法测定细胞增殖抑制率。每孔加入20μL MTT溶液(5mg/mL)，培养4h。去除上清，每孔加入150μL DMSO，室温震荡混匀15min。酶标仪570nm检测吸光度(A)。细胞增殖抑制率(％)＝[(A空白-A调零)-(A测量-A调零)]/(A空白-A调零)*100％。在该公式中，A测量分别代入模型组和模型给药组测定的吸光度。
如果相比于模型组，模型给药组的细胞增殖抑制率升高，则在对应浓度、对应时间点和对应细胞上标记阳性结果。
3.实验数据和结果
上述标记的实验结果请见如下表3。
表3大黄Et组和大黄W组含药血清对高糖诱导的肾脏固有细胞的影响的阳性结果的汇总表
Figure BDA0001376367610000181
Figure BDA0001376367610000191
注：肾小球系膜细胞(增殖●/葡萄糖浓度○)；肾小管上皮细胞(增殖▲/葡萄糖浓度△)
当在某一细胞的某一葡萄糖浓度的某一时间点上同时存在单位细胞的培养液中的葡萄糖浓度升高和细胞增殖抑制率升高这两个阳性结果，则在对应葡萄糖浓度、对应时间点和对应细胞上标记强阳性结果。如在肾小球系膜细胞上，在某一葡萄糖浓度的某一时间点上同时存在单位细胞的培养液中的葡萄糖浓度升高和细胞增殖抑制率升高这两个阳性结果，则在该对应葡萄糖浓度的对应时间点上标记A；如在肾小管上皮细胞上，在某一葡萄糖浓度的某一时间点上同时存在单位细胞的培养液中的葡萄糖浓度升高和细胞增殖抑制率升高这两个阳性结果，则在该对应葡萄糖浓度的对应时间点上标记B。标记后的结果请见如下表4。
表4大黄Et组和大黄W组含药血清对高糖诱导的肾脏固有细胞的影响的强阳性结果的计数
Figure BDA0001376367610000192
Figure BDA0001376367610000201
注：肾小球系膜细胞(A)；肾小管上皮细胞(B)
结果判定，按照判定标准第一条，计算对这两种细胞在同一浓度下的同一时间点下都存在强阳性的结果(即在同一浓度下的同一时间点下同时标记为AB)的总和，大黄Et组0个，大黄W组1个。
至此，可得出结论：大黄W含药血清对高糖诱导的肾脏固有细胞的增殖抑制作用和葡萄糖摄入的抑制作用明显优于大黄Et，且药物经体内代谢4h达到药效峰值。
4.实验结果分析
在经不同浓度葡萄糖诱导后，小鼠肾小球系膜细胞SV40MES 13、人肾小管上皮细胞HKC均表现出不同程度的增生，葡萄糖的摄入率明显增高，所以单位细胞的培养液中葡萄糖浓度下降。但由于实验中是直接在模型组加入了外源性的高浓度葡萄糖，所以模型组的单位细胞培养液中的单位细胞的培养液中的葡萄糖浓度略高于空白组，这与文献报道一致，说明我们的模型制作成功。
大黄总蒽醌和大黄酸可能是中药组合物防治DN的药效物质基础。谭正怀研究(《大黄防治糖尿病肾病的物质基础及作用机理研究》，成都中医药大学博士学位论文,2003,1-118)显示，大黄水提物与大黄蒽醌提取物以相同的生药量，对四氧嘧啶糖尿病肾病小鼠灌服2周后，均可降低DN小鼠的血清肌酐，减小其肾脏指数，两者疗效相当，说明大黄蒽醌是大黄治疗糖尿病肾病的物质基础之一。
模型给药组与模型组比较，细胞增生现象得到显著抑制，单位细胞的培养液中的葡萄糖浓度不同程度的升高。大黄水提对两种细胞在同一浓度下的同一时间点下都存在强阳性的结果多于大黄醇提，说明其对高糖诱导的细胞的增殖和抑制作用和葡萄糖摄入的抑制作用较显著，说明大黄水提药效优于醇提，且药物经体内代谢4h达到药效峰值，进一步印证了实施例1中大黄水提的工艺4药效优于大黄醇提的工艺3。
虽然按照判定标注第一条就得出了判定结果，但是以肾小球系膜细胞标记强阳性的结果总数进行统计以及以肾小管上皮细胞标记强阳性的结果总数进行统计得出的结论也是一致的。对肾小球系膜细胞标记强阳性的结果总数进行统计，即统计每个工艺组(包括2h、3h、4h)中A的总数，大黄Et组0个，大黄W组1个，其中大黄W组最多；对肾小管上皮细胞标记强阳性的结果总数进行统计，即统计每个工艺组(包括2h、3h、4h)中B的总数，大黄Et组2个，大黄W组8个，其中大黄W组最多。
实施例3黄芪芡实大黄中药组合物工艺3和工艺4动物体内实验
实施例1、2结果显示，在抑制高糖状态下肾脏固有细胞增殖、葡萄糖摄入增加方面，工艺4优于工艺3，更优于工艺1和2。为了进一步印证提出的筛选方法的可靠性，通过1型SD大鼠DN模型再次进行动物体内实验，检验体外细胞筛选试验的结论。
1.实验材料
(1)实验动物
SPF级SD大鼠57只，180-220g，购于北京华阜康生物科技股份有限公司，许可证号：SCXK(京)2014-0004，饲养于北京亦庄国际生物医药科技有限公司，许可证号：SYXK(京)2015-0010。
(2)实验药品
中药组合物处方：黄芪1500g，芡实1200g，大黄500g。
工艺3：取黄芪1500g，大黄500g，加6倍量60％乙醇，回流提取2次，每次2小时，过滤，备用；芡实1200g，加12倍量水，煎煮2次，每次1.5小时，过滤，与上述醇提取液合并，浓缩至70℃测定相对密度为1.35～1.38的浸膏，喷雾干燥，即得。
工艺4：取黄芪1500g，加6倍量60％乙醇，回流提取2次，每次2小时，过滤，备用；大黄500g，芡实1200g，加12倍量水，煎煮2次，每次1.5小时，过滤，与上述醇提取液合并，浓缩至70℃测定相对密度为1.35～1.38的浸膏，喷雾干燥，即得。
(3)实验试剂
链脲佐菌素(STZ)(批号WXBC3087V，Sigma)；血糖试纸(葡萄糖脱氢酶法)(批号475203，罗氏)；葡萄糖(批号20170110，北京博奥星生物技术有限责任公司)；水合氯醛(批号20161102，国药集团化学试剂有限公司)；尿蛋白定量测试盒(批号20170821)，白蛋白测试盒(批号20170222)，微量白蛋白测试盒(批号20170227)，4％多聚甲醛(批号33C00180，北京鼎国)。
(4)实验材料
96孔板(批号170222-078，广州浩特生物过滤股份有限公司)；静脉输液针(7#)(批号131227)(浙江京环医疗用品有限公司)；5mL采血管(普通管)(批号20160901，山东奥塞特医疗器械有限公司)。
(5)实验仪器
罗康全卓越精采型血糖仪(美国罗氏)；AL204型电子天平(梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司)；MB100-4A型微孔板恒温振荡器(杭州奥盛仪器有限公司)；HC-2518型高速冷冻离心机(安徽中科中佳科学仪器有限公司)；MULTISKAN MK3型酶标仪(美国Thermo公司)；DW-HL218型超低温冰箱(中科美菱低温科技股份有限公司)。
2.实验方法
8周龄SPF级SD大鼠57只，饲养于IVC级实验动物中心。卫生检疫5天后，按体重随机分为正常组(9只)和模型组(48只)，禁食10小时后，模型组按55mg/kg腹腔一次注射1％STZ枸橼酸缓冲溶液，正常组注射等量枸橼酸缓冲溶液，注射72小时后禁食3h，检测空腹血糖。血糖稳定4周后，以空腹血糖＞16.7mmo/L者入组。继续饲养12～16～20～24周。DN模型成功的标准需满足空腹血糖＞16.7mmo/L且MogensenⅢ期标准。
STZ注射后4周，按照前几次所测血糖，剔除任意一次血糖＜11.1mmoL/L的大鼠，剩余模型组大鼠按血糖、体重和尿液指标随机分组，分为模型组(9只)、工艺3组(12只)、工艺4组(12只)，进行工艺筛选药效试验。工艺3和工艺4组以人等临床使用剂量8.23g生药/kg灌胃相应药物，正常组与模型组灌胃等量蒸馏水，每日1次，连续4周。
观察指标：体重，空腹血糖，尿蛋白浓度，尿白蛋白浓度，UAE，尿微量白蛋白浓度。
计量数据采用SPSS 16.0软件进行统计分析，实验数据以x±SD表示，多组间比较采用One-Way Anova，P＜0.05为差异有统计学意义。
3.实验数据和实验结果
实验结果见如下表5。
表5采用工艺3和工艺4的中药组合物对1型糖尿病肾病大鼠的影响——体重、血糖和尿液生化(x±SD)
Figure BDA0001376367610000221
Figure BDA0001376367610000231
注：与正常组比较，▲P＜0.05；与模型组比较，●P＜0.05；与工艺3组比较，■P＜0.05。
①-与模型组比较，P＝0.061。
STZ注射4周后，即给药0周，与正常组比较，模型组大鼠体重下降；空腹血糖、尿蛋白浓度、尿白蛋白浓度、尿白蛋白排泄率(UAE)及尿微量白蛋白浓度上升；差异具有统计学意义(P＜0.05)，提示1型SD大鼠DN模型造模成功。药物灌服4周后，与模型组比较，工艺4组尿白蛋白浓度降低，差异具有统计学意义(P＜0.05)；UAE有降低的趋势(P＝0.061)，且工艺4组显著低于工艺3组(P＜0.05)。提示，该黄芪芡实大黄中药组合物对糖尿病肾病有效，且工艺4组药效优于工艺3组。
4.实验结果分析
我们用大剂量STZ我们对8周龄SPF级SD大鼠一次性STZ 55mg/Kg体重腹腔注射，连续观察4周后，空腹血糖＞16.7mmoL/L，尿UAE在30-300mg/24h范围内，符合1型糖尿病及Mogensen关于临床糖尿病肾病分期的Ⅲ期。中药组合物工艺3和工艺4给药4周后，对1型DN大鼠的治疗作用工艺4优于工艺3，这进一步印证了我们糖尿病肾病体外药效筛选方法的可行性。
上述实施例用于解释本发明，而不是对本发明进行限制，在本发明的精神和权利要求保护范围内，对本发明作出的任何修改和改变，都落入本发明的保护范围。

Claims (4)

1.一种体外筛选糖尿病肾病药物的方法，其包括如下步骤：
第一步，造模及给药
肾小球系膜细胞、肾小管上皮细胞用含5% FBS的DMEM/F-12培养液培养，内皮细胞用含10% FBS的DMEM培养液培养；将培养后的肾小球系膜细胞、肾小管上皮细胞和内皮细胞分别制成细胞悬液；将上述三种细胞悬液分别接种于培养板中，每种细胞分为模型组和模型给药组，之后模型组换用高浓度葡萄糖培养液，模型给药组换用含有待筛选药物的高浓度葡萄糖培养液，其中所述模型组和模型给药组均为四复孔，四复孔中的高浓度葡萄糖培养液分别为25、40、60和80mmoL/L的葡萄糖浓度，并且其中待筛选药物是用不同制备工艺获得的两种以上中药组合物，且是给药后多个不同的时间点的含药血清的形式；其中，所述肾小球系膜细胞、肾小管上皮细胞和内皮细胞分别选用小鼠肾小球系膜细胞SV40 MES 13、人肾小管上皮细胞HKC和人脐静脉内皮细胞EA.hy926；
第二步，检测及结果标记
在规定时间点测定培养板每个孔单位细胞的培养液中的葡萄糖浓度和每个孔的细胞增殖抑制率，其中对于每种浓度的葡萄糖培养液设定测定时间点为换用培养液后24小时、48小时和72小时；如果相比于模型组，模型给药组的单位细胞的培养液中的葡萄糖浓度升高，则在对应葡萄糖浓度、对应测定时间点和对应细胞上标记阳性结果；如果相比于模型组，模型给药组的细胞增殖抑制率升高，则在对应葡萄糖浓度、对应测定时间点和对应细胞上标记阳性结果；当在某一细胞的某一葡萄糖浓度的某一测定时间点上同时存在单位细胞的培养液中的葡萄糖浓度升高和细胞增殖抑制率升高这两个阳性结果，则在对应葡萄糖浓度、对应时间点和对应细胞上标记强阳性结果；
第三步，得出结论
其中，同时筛选两种以上药物时，按如下优先次序确定入选药物：（1），对于上述三种细胞，在同一葡萄糖浓度的同一时间点上同时标记强阳性结果的总和最多的药物入选；（2），若（1）判定不了，则对肾小球系膜细胞标记强阳性结果总和最多的药物入选；（3），若（2）还判定不了，则对肾小管上皮细胞标记强阳性结果总和最多的药物入选；（4），若（3）还判定不了，则对内皮细胞标记强阳性结果总和最多的药物入选。
2.根据权利要求1所述的方法，其中仅采用肾小球系膜细胞和肾小管上皮细胞；同时筛选两种以上药物，按如下优先次序确定入选药物：（1）对于这两种细胞，在同一葡萄糖浓度的同一时间点上同时标记强阳性结果的总和最多的药物入选；（2），若（1）判定不了，则对肾小球系膜细胞标记强阳性结果总和最多的药物入选；（3），若（2）还判定不了，则对肾小管上皮细胞标记强阳性结果总和最多的药物入选。
3.根据权利要求1所述的方法，其中制成的所述细胞悬液浓度为1.5*104/mL，以200μL/孔接种于96孔板，接种后24小时换用相应培养液。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述单位细胞的培养液中的葡萄糖浓度采用氧化酶-过氧化物酶法测定；所述细胞增殖检测采用MTT方法测定，使用所述MTT法测定时，设定空白组，所述空白组换用基础培养液并用甘露醇补至相应的高葡萄糖浓度。
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