JP2007502123A - 改善されたハロヒドリンデハロゲナーゼおよび関連するポリヌクレオチド - Google Patents

Abstract

本発明は、新規なハロヒドリンデハロゲナーゼポリペプチド、および、そのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに関連する。これらのポリペプチドは、４位置換された３−酪酸誘導体、および、シアノ・ヒドロキシルがビシナル置換されたカルボン酸エステルの製造において有用である。本発明はまた、関連するベクター、宿主細胞および方法を提供する。本発明は、ハロヒドリンデハロゲナーゼ活性を有するポリペプチド、典型的には、ハロヒドリンデハロゲナーゼ活性を有する単離され、場合により精製されたポリペプチド（より典型的には、組換えポリペプチド）に関する。

Description

（発明の分野）
本発明は、新規なハロヒドリンデハロゲナーゼポリペプチド、および、そのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに関連する。

（発明の背景）
ハロヒドリンデハロゲナーゼ（「ＨＨＤＨ」）は、ハロヒドリンハロゲン化水素リアーゼまたはハロヒドリンエポキシダーゼ［ＥＣ４．５．１］とも呼ばれており、１，２−ハロヒドリンと、対応する１，２−エポキシドとの下記の相互変換を触媒する：

特許文献１には、プロピレンオキシドを製造するためにある種のハロヒドリンエポキシダーゼを使用することが記載される。特許文献２および特許文献３には、１，３−ジクロロプロパノール（ＤＣＰ）およびエピクロロヒドリン（ＥＣＨ）をそれぞれ４−クロロ−３−ヒドロキシブチロニトリル（ＣＨＢＮ）に変換するためにこの酵素活性を使用することが記載される。アグロバクテリウム・ラジオバクター（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ）およびコリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｙｅｒｉｕｍ）から得られるＨＨＤＨ酵素が広範囲の様々なハロゲン化基質に対して特徴づけられている（非特許文献１；非特許文献２；非特許文献３）。

ＨＨＤＨはまた、クロリドまたはブロミドとは異なる求核試薬によるエポキシドの開環を触媒する。アジド（Ｎ_３ ⁻）、ニトリト（ＮＯ_２ ⁻）およびシアニド（ＣＮ⁻）により、クロリドがエポキシドの開環の際に置換され得ることが明らかにされている（非特許文献４；非特許文献５；非特許文献６；非特許文献７を参照のこと）：

Ｎａｋａｍｕｒａら（非特許文献５）は、ＤＣＰを、中間体としてのエピクロロヒドリン（ＥＣＨ）を介してクロロ−３−ヒドロキシブチロニトリル（ＣＨＢＮ）に直接的に変換するためにＨＨＤＨを使用することを記載する：

いくつかのハロヒドリンデハロゲナーゼが特徴づけられている。例えば、Ａ．ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ ＡＤ１から得られたＨＨＤＨは２８ｋＤサブユニットのホモ四量体である。Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．Ｎ−１０７４は２つのＨＨＤＨ酵素を産生し、そのうちの一方は２８ｋＤサブユニットから構成され（Ｉａ）、もう一方は３５ｋＤおよび／または３２ｋＤの関連したサブユニットから構成される（Ｉｂ）。いくつかの供給源から得られたＨＨＤＨは、サブユニットの解離を生じさせるプロセスにおける酸化性条件下で容易に失活し、ｐＨ８〜９の至適ｐＨおよび５０℃の至適温度を有する（非特許文献８；非特許文献９）。ＨＨＤＨにより触媒されるエポキシド形成に対する至適ｐＨが８．０〜９．０として、また、至適温度が４５℃〜５５℃の範囲にあるとして報告されている（非特許文献１；非特許文献２；非特許文献３）。逆反応（クロリドによる開環）に対する至適ｐＨがＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．Ｎ−１０７４の２つの酵素について報告されており、７．４（Ｉａ）または５（Ｉｂ）である。Ａ．ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ ＡＤ１のＨＨＤＨに対する部位特異的変異誘発研究では、酸化的失活が、酵素の四次構造がシステイン残基の酸化により破壊されるためであることが示された（非特許文献１０）。

種々の供給源から得られた精製ＨＨＤＨ酵素は、１４６Ｕ／ｍｇ（Ｉｂ）〜２．７５Ｕ／ｍｇ（Ｉａ）に及ぶＤＣＰに対する比活性を示す（非特許文献２；非特許文献３）。Ｉｂ酵素の高い活性には、高いエナンチオ選択性が伴っており、Ｅ−ＥＣＨがＤＣＰから生じ、一方、Ｉａ酵素はラセミ状のＥＣＨをもたらす。

ＨＨＤＨをコードする遺伝子が下記の微生物において同定されている：アグロバクテリウム・ラジオバクターＡＤ１（ｈｈｅＣ）、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）（ｈａｌＢ）、コリネバクテリウムｓｐ．（ＩａをコードするｈｈｅＡ、およびＩｂをコードするｈｈｅＢ）、アルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）ｓｐ．（ｈｈｅＡ_ＡＤ２）、およびミコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ｓｐ．ＧＰ１（ｈｈｅＢ_ＧＰ１）。すべての酵素が大腸菌において機能的に発現させられている。

酵素が大きい容積生産性を示すこと、反応が、大きい最終生成物濃度を伴い、かつ、大きいエナンチオ選択性を伴って比較的短い期間で完了すること、および、化学的副生成物が形成されないことが、ＨＨＤＨの様々な商業的適用のためには非常に望ましい。プロセスのこれらの特性は一般に、酵素の幅広い特性（例えば、基質に対する低いＫｍ、大きいプロセス安定性、高い比活性、化学反応が進行していない条件下での基質阻害および生成物阻害がないこと）を規定するために使用することができる。現在利用可能なＨＨＤＨ酵素はこれらの基準のすべてを満たしていない。例えば、ＨＨＤＨによる３−ヒドロキシバレロニトリルへの１，２−エポキシブタンおよびシアニドに対する変換は３ｍｍｏｌ／ｈｒの最大速度で進行するが、この速度はほんの１０分間しか持続されない（非特許文献４）。４−クロロ−３−ヒドロキシブチロニトリル（ＣＨＢＮ）へのＤＣＰおよびＥＣＨの変換もまた２ｍｍｏｌ／ｈｒ〜３ｍｍｏｌ／ｈｒの速度に制限される（Ｎａｋａｍｕｒａら、特許文献２および特許文献３）。ＥＣＨからＣＨＢＮへの変換を詳しく分析することにより、ｈｈｅＢによりコードされるＨＨＤＨ−Ｉｂ酵素は大きい活性を有する一方で、大きい生産性はほんの２０分間しか維持されず、その後では、さらなる変換が、少なくとも１／５０に低下した速度で生じ、全体的な変換率が６０％をちょうど超えた程度であることが明らかにされている（非特許文献５）。ＤＣＰの、ＥＣＨを介したＣＨＢＮへの直接的な変換は、低下した速度で進行し、６５．３％の収率をもたらしている。従って、文献に記載されるようなＨＨＤＨは、商業的適用における触媒のための所望される基準を満していない。
米国特許第４，２８４，７２３号明細書 米国特許第５，１６６，０６１号明細書 米国特許第５，２１０，０３１号明細書 Ｖａｎ Ｈｙｌｃｋａｍａ Ｖｌｉｅｇら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．（２００１）１８３：５０５８〜５０６６ Ｎａｋａｍｕｒａら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（１９９４）６０：１２９７〜１３０１ Ｎａｇａｓａｗａら、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（１９９２）３６：４７８〜４８２ Ｎａｋａｍｕｒａら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．（１９９１）１８０：１２４〜１３０ Ｎａｋａｍｕｒａら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ（１９９４）５０：１１８２１〜１１８２６ Ｌｕｔｊｅ Ｓｐｅｌｂｅｒｇら、Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．（２００１）３：４１〜４３ Ｌｕｔｊｅ Ｓｐｅｌｂｅｒｇら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ａｓｓｙｍ．（２００２）１３：１０８３ Ｔａｎｇ、Ｅｎｚ．Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．（２００２）３０：２５１〜２５８ Ｓｗａｎｓｏｎ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（１９９９）１０：３６５〜３６９ Ｔａｎｇら、Ｅｎｚ．Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．（２００２）３０：２５１〜２５８

従って、新しいハロヒドリンデハロゲナーゼが非常に望ましい。

（発明の簡単な要旨）
本発明は、ハロヒドリンデハロゲナーゼ活性を有するポリペプチド、典型的には、ハロヒドリンデハロゲナーゼ活性を有する単離され、場合により精製されたポリペプチド（より典型的には、組換えポリペプチド）に関し、この場合、前記ポリペプチドは、下記のポリペプチドからなる群より選択されるアミノ酸配列を含む：
（ａ）配列番号４、配列番号１２、配列番号１６、配列番号１８、配列番号３４、配列番号３８、配列番号４４、配列番号４８、配列番号５２、配列番号６６、配列番号８０、配列番号８４、配列番号１１４、配列番号１５４、配列番号１５８、配列番号１７０または配列番号２７０に対して少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチド；
（ｂ）配列番号１０、配列番号１４、配列番号６８、配列番号１１８、配列番号１６４、配列番号１６６または配列番号１８０に対して少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチド；
（ｃ）配列番号１１０、配列番号１６２、配列番号２６２、配列番号４２２、配列番号４４０または配列番号５２０に対して少なくとも９７％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチド；
（ｄ）配列番号１１６または配列番号４４８に対して少なくとも９６％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチド；
（ｅ）配列番号２６４、配列番号２６６、配列番号４７０または配列番号４７６に対して少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチド；
（ｆ）配列番号２００に対して少なくとも９３％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチド；
（ｇ）配列番号４４２に対して少なくとも８９％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチド；
（ｈ）配列番号７０２に対して少なくとも８８％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチド；
（ｉ）配列番号２と最適に整列された場合、配列番号２に対して少なくとも８０％同一であり、かつ、２位の（残基）位置におけるＴ、３位におけるＡまたはＰまたはＳ、４位におけるＶ、６位におけるＤ、９位におけるＩまたはＦのいずれか、１０位におけるＬ、１３位におけるＳ、１４位におけるＳ、１５位におけるＫ、１６位におけるＣ、１７位におけるＴまたはＲ、２０位におけるＣまたはＳまたはＫのいずれか、２４位におけるＴ、２６位におけるＱ、２８位におけるＦ、２９位におけるＴ、３０位におけるＡ、３１位におけるＬ、３３位におけるＧ、３４位におけるＲ、３５位におけるＬ、３６位におけるＮ、３７位におけるＨ、４０位におけるＤ、４４位におけるＬ、４５位におけるＰ、４７位におけるＰまたはＡのいずれか、５２位におけるＮ、５４位におけるＶ、５５位におけるＲ、５６位におけるＤ、５８位におけるＫ、６１位におけるＧまたはＤ、６３位におけるＶ、７２位におけるＲ、７５位におけるＩ、７６位におけるＰ、７８位におけるＣ、８２位におけるＹ、８４位におけるＳまたはＬのいずれか、８５位におけるＡ、９１位におけるＥ、９３位におけるＤ、９５位におけるＱまたはＧ、９６位におけるＮ、１０７位におけるＫ、１１２位におけるＡ、１１４位におけるＴ、ＳまたはＧのいずれか、１１５位におけるＡ、１１７位におけるＰ、１２０位におけるＮ、１２１位におけるＥ、１２２位におけるＰ、１２６位におけるＲ、１３０位におけるＶ、１３３位におけるＳ、１３４位におけるＡまたはＶ、１３６位におけるＬ、ＷまたはＶ、１３９位におけるＨ、１４２位におけるＩまたはＲ、１４４位におけるＳ、１４６位におけるＳ、１５２位におけるＴ、１５３位におけるＳ、１５４位におけるＳまたはＡのいずれか、１６８位におけるＶ、１６９位におけるＴ、１７７位におけるＦ、１７８位におけるＶ、１８０位におけるＩ、１８１位におけるＧまたはＩ、１８４位におけるＫ、１８６位におけるＹ、１９４位におけるＬ、１９８位におけるＮ、１９９位におけるＭ、２１５位におけるＥ、２３６位におけるＧ、２３７位におけるＶ、２３８位におけるＬ、２４０位におけるＴ、２４５位におけるＩまたはＡまたはＶのいずれか、２４９位におけるＹ、２５２位におけるＶまたはＩ、および、２５４位におけるＶからなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基を含むポリペプチド；
（ｊ）配列番号１に対応する核酸の実質的に全長にわたってストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるポリペプチド（ただし、コードされるポリペプチドは、配列番号２と最適に整列された場合、２位の（残基）位置におけるＴ、３位におけるＡ、ＰまたはＳ、４位におけるＶ、６位におけるＤ、９位におけるＩまたはＦのいずれか、１０位におけるＬ、１３位におけるＳ、１４位におけるＳ、１５位におけるＫ、１６位におけるＣ、１７位におけるＴまたはＲ、２０位におけるＳまたはＫまたはＣのいずれか、２４位におけるＴ、２６位におけるＱ、２８位におけるＦ、２９位におけるＴ、３０位におけるＡ、３１位におけるＬ、３３位におけるＧ、３４位におけるＲ、３５位におけるＬ、３６位におけるＮ、３７位におけるＨ、４０位におけるＤ、４４位におけるＬ、４５位におけるＰ、４７位におけるＰまたはＡのいずれか、５２位におけるＮ、５４位におけるＶ、５５位におけるＲ、５６位におけるＤ、５８位におけるＫ、６１位におけるＧまたはＤ、６３位におけるＶ、７２位におけるＲまたはＱ、７５位におけるＩ、７６位におけるＰ、７８位におけるＣ、８２位におけるＹ、８４位におけるＳまたはＬのいずれか、８５位におけるＡ、９１位におけるＥ、９３位におけるＤ、９５位におけるＱまたはＧ、９６位におけるＮ、９９位におけるＧ、１０７位におけるＫ、１１２位におけるＡ、１１４位におけるＴ、ＧまたはＳのいずれか、１１５位におけるＡ、１１７位におけるＰ、１２０位におけるＮ、１２１位におけるＥ、１２２位におけるＰ、１２６位におけるＲ、１３０位におけるＶ、１３３位におけるＳ、１３４位におけるＡまたはＶ、１３６位におけるＬ、ＷまたはＶ、１３９位におけるＨ、１４２位におけるＩまたはＲ、１４４位におけるＳ、１４６位におけるＳ、１５２位におけるＴ、１５３位におけるＳ、１５４位におけるＳまたはＡのいずれか、１６８位におけるＶ、１６９位におけるＴ、１７７位におけるＦ、１７８位におけるＶ、１８０位におけるＩ、１８１位におけるＧまたはＩ、１８４位におけるＫ、１８６位におけるＹ、１８９位におけるＴ、１９４位におけるＬ、１９８位におけるＮ、１９９位におけるＭ、２１５位におけるＥ、２２２位におけるＡ、２３６位におけるＧ、２３７位におけるＶ、２３８位におけるＬ、２４０位におけるＴ、２４５位におけるＩまたはＡまたはＶのいずれか、２５２位におけるＶまたはＩ、および、２５４位におけるＶからなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基を有するアミノ酸配列を含む）。

別の局面において、本発明は、ＨＨＤＨを有するポリペプチド、典型的には、ＨＨＤＨを有する単離され、場合により精製されたポリペプチド（より典型的には、組換えポリペプチド）に関し、この場合、前記ポリペプチドは、上記に記載されるような（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）、（ｉ）および（ｊ）からなる群より選択されるアミノ酸配列を含み、かつ、３７位におけるＱ、７０位におけるＹ、７２位におけるＱ、８０位におけるＱ、９９位におけるＧ、１０７位におけるＲ、１４６位におけるＴ、１５３位におけるＣ、１８６位におけるＦ、１８９位におけるＴ、および２２２位におけるＡからなる群より選択されるアミノ酸残基をさらに含む。

別の局面において、本発明は、アグロバクテリウムｓｐ．に由来する野生型ハロヒドリンデハロゲナーゼ（配列番号２）と比較して１．４倍〜１０，０００倍大きい活性を有するハロヒドリンデハロゲナーゼ（ＨＨＤＨ）に関する。

さらなる局面において、本発明は、配列番号２のアミノ酸を有する野生型ＨＨＤＨと比較して少なくとも１．４倍大きいＨＨＤＨ活性を有する単離されたポリペプチドまたは組換えポリペプチドに関し、
この場合、前記ポリペプチドは、配列番号３、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号３３、配列番号３７、配列番号４３、配列番号４７、配列番号４９、配列番号５１、配列番号６５、配列番号６７、配列番号７９、配列番号８３、配列番号１０９、配列番号１１３、配列番号１１５、配列番号１１７、配列番号１５３、配列番号１５７、配列番号１６１、配列番号１６３、配列番号１６５、配列番号１６９、配列番号１７９、配列番号１６１、配列番号１９９、配列番号２６１、配列番号２６３、配列番号２６５、配列番号２６９、配列番号４２１、配列番号４３９、配列番号４４１、配列番号４４７、配列番号４６９、配列番号４７５、配列番号５１９、配列番号７０１、配列番号７２５、配列番号７２９、配列番号７３１、配列番号７３３、配列番号７３５、配列番号７３７、およびその相補的配列からなる群より選択される配列を有する核酸の実質的に全長にわたってストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされる。

別の局面において、本発明は、ハロヒドリンデハロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＨＨＤＨポリヌクレオチドに関する。

さらにさらなる局面において、本発明は、プロモーターに作動可能に連結された本発明のＨＨＤＨポリヌクレオチドを含むベクターに関する。

他の実施形態において、本発明は、本発明のＨＨＤＨポリペプチドを産生させるための宿主細胞、および、そのような宿主細胞から本発明のＨＨＤＨポリペプチドを産生させるための方法に関する。

（詳細な説明）
（ＨＨＤＨポリペプチド）
本発明は、ハロヒドリンデハロゲナーゼ（「ＨＨＤＨ」）活性を有する新規なポリペプチド、ならびに、そのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。本発明のＨＨＤＨポリペプチドは、例えば、発明の名称が「４位置換された３−ヒドロキシ酪酸誘導体を製造するための酵素プロセス」である特許出願明細書（これは代理人文書番号０３３９．２１０ＵＳに対応する；２００３年８月１１日出願、米国特許出願第１０／６３９，１５９号［これは本明細書によって参照として本明細書中に組み込まれる］）に記載される方法を使用して、４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸誘導体を、４位置換された３−ヒドロキシ酪酸誘導体に変換することを触媒するために好適である。このような本発明のポリペプチドはまた、例えば、発明の名称が「４位置換された３−ヒドロキシ酪酸誘導体、ならびに、シアノおよびヒドロキシがビシナル置換されたカルボン酸エステルを製造するための酵素プロセス」である特許出願明細書（これは代理人文書番号０３３９．３１０ＵＳに対応する；２００４年２月１８日出願、米国特許出願第１０／７８２，２５８号［これは本明細書によって参照として本明細書中に組み込まれる］）に記載される方法を使用して、ハロおよびヒドロキシがビシナル置換されたカルボン酸エステルを、シアノおよびヒドロキシのビシナル置換のカルボン酸エステルに変換することを触媒するためにも好適である。本発明のポリペプチドは、ハロヒドリンを、医薬品中間体として有用なシアノヒドリンに変換するための触媒として特に有用である。具体的な適用において、本発明のＨＨＤＨポリペプチドは、４−クロロ−３−ヒドロキシ酪酸エチルを４−シアノ−３−ヒドロキシ酪酸エチルに変換することを触媒するために使用される。そのような変換を例示する様々な例が本明細書中下記に示される。そのような使用のより詳細な記載が、発明の名称が「４位置換された３−ヒドロキシ酪酸誘導体を製造するための酵素プロセス」および「４位置換された３−ヒドロキシ酪酸誘導体、ならびに、シアノおよびヒドロキシがビシナル置換されたカルボン酸エステルを製造するための酵素プロセス」（同上）である上記の特許出願明細書に示されている。

本発明は、ＨＨＤＨ活性を有する単離されたポリペプチドまたは組換えポリペプチドを提供し、この場合、そのようなＨＨＤＨポリペプチドは、配列番号４、配列番号１２、配列番号１６、配列番号１８、配列番号３４、配列番号３８、配列番号４４、配列番号４８、配列番号５２、配列番号６６、配列番号８０、配列番号８４、配列番号１１４、配列番号１５４、配列番号１５８、配列番号１７０または配列番号２７０に対して少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドからなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。

本明細書中で使用される用語「ＨＨＤＨ活性」および用語「ハロヒドリンデハロゲナーゼ活性」は、実施例５Ａに記載されるアッセイを使用して、（Ｓ）−４−クロロ−３−ヒドロキシ酪酸エチル（「ＥＣＨＢ」）を検出可能な量の（Ｒ）−４−シアノ−３−ヒドロキシ酪酸エチル（「ＨＮ」）に変換することを触媒する能力を示すために本明細書中では交換可能に使用される。用語「ＨＨＤＨポリペプチド」は、本明細書中では、ＨＨＤＨ活性を有するポリペプチドを示す。用語「ＨＨＤＨポリヌクレオチド」は、ＨＨＤＨ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを示す。

本明細書中で使用される用語「単離された」は、通常の場合には会合している成分（他のタンパク質、核酸、細胞、合成試薬など）から部分的または完全に分離されている核酸、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、タンパク質または他の成分を示す。核酸またはポリペプチドが人工的または操作されているか、あるいは、人工的または操作されたタンパク質または核酸に由来するとき、核酸またはポリペプチドは「組換え」である。例えば、自然界において見出されるように通常の場合にはポリヌクレオチドに隣接するヌクレオチド配列と会合しないように、ベクターまたは任意の他の異種位置（例えば、組換え生物のゲノム）に挿入されているポリヌクレオチドは、組換えポリヌクレオチドである。組換えポリヌクレオチドからインビトロまたはインビボで発現したタンパク質は、組換えポリペプチドの一例である。同様に、自然界において現れないポリヌクレオチド配列（例えば、天然に存在する遺伝子の改変体）は組換えである。

用語「同一性パーセント」、用語「同一性％」、「パーセント同一」および用語「％同一」は、アラインメントにおける同一の一致体の数を数え、同一の一致体のそのような数を参照配列の長さによって除算し、かつ、時間のかかる／正確な対毎の最適なアラインメントを達成するために下記の初期設定ＣｌｕｓｔａｌＷパラメーター（Ｇａｐ Ｏｐｅｎ Ｐｅｎａｌｔｙ：１０；Ｇａｐ Ｅｘｔｅｎｔｉｏｎ Ｐｅｎａｌｔｙ：０．１０；Ｐｒｏｔｅｉｎ加重行列：Ｇｏｎｎｅｔシリーズ；ＤＮＡ加重行列：ＩＵＢ；対毎のＳｌｏｗ／Ｆａｓｔアラインメントの選択＝ＳＬＯＷまたはＦＵＬＬ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ）を使用するＣｌｕｓｔａｌＷ分析（バーションＷ１．８［これは、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｂｉｏｉｎｆｏｍａｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、英国）から入手可能である］）によって得られるパーセントアミノ酸配列同一性を示すために本明細書中では交換可能に使用される。

本発明はまた、配列番号１０、配列番号１４、配列番号６８、配列番号１１８、配列番号１６４、配列番号１６６または配列番号１８０に対して少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを提供する。望ましいＨＨＤＨポリペプチドには、配列番号１０、配列番号１４、配列番号６８、配列番号１１８、配列番号１６４、配列番号１６６または配列番号１８０に対して少なくとも９９％同一であるポリペプチドが含まれる。

別の実施形態において、本発明は、配列番号１１０、配列番号１６２、配列番号２６２、配列番号４２２、配列番号４４０または配列番号５２０に対して少なくとも９７％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを提供する。本発明のいくつかのＨＨＤＨポリペプチドは、配列番号１１０、配列番号１６２、配列番号２６２、配列番号４２２、配列番号４４０または配列番号５２０に対して少なくとも９８％同一であり、場合により、少なくとも９９％同一であることがある。

さらにもう一つの実施形態において、本発明は、配列番号２の野生型ＨＨＤＨよりも大きいＨＨＤＨ活性を有するポリペプチドで、配列番号２００に対して少なくとも９３％同一であり、典型的には、配列番号２００に対して少なくとも９５％同一であり、より典型的には、配列番号２００に対して少なくとも９７％同一であり、最も典型的には、配列番号２００に対して少なくとも９９％同一であるポリペプチド（典型的には、単離および精製されたポリペプチド）に関する。

さらに別の実施形態において、本発明は、配列番号２の野生型ＨＨＤＨよりも大きいＨＨＤＨ活性を有するポリペプチドで、配列番号４４２に対して少なくとも８９％同一であり、典型的には、配列番号４４２に対して少なくとも９３％同一であり、より典型的には、配列番号４４２に対して少なくとも９５％同一であり、さらにより典型的には、配列番号４４２に対して少なくとも９７％同一であり、最も典型的には、配列番号４４２に対して少なくとも９９％同一であるポリペプチド（典型的には、単離および精製されたポリペプチド）に関する。

別の実施形態において、本発明は、配列番号２の野生型ＨＨＤＨよりも大きいＨＨＤＨ活性を有するポリペプチドで、配列番号７０２に対して少なくとも８８％同一であり、典型的には、配列番号７０２に対して少なくとも９３％同一であり、より典型的には、配列番号７０２に対して少なくとも９５％同一であり、さらにより典型的には、配列番号７０２に対して少なくとも９７％同一であり、最も典型的には、配列番号７０２に対して少なくとも９９％同一であるポリペプチド（典型的には、単離および精製されたポリペプチド）に関する。

さらなる実施形態において、本発明は、配列番号１１６または配列番号４４８に対して少なくとも９６％同一であるアミノ酸配列を有するＨＨＤＨポリペプチドを提供する。本発明のＨＨＤＨポリペプチドには、配列番号１１６または配列番号４４８に対して少なくとも９７％同一であるＨＨＤＨポリペプチド、配列番号１１６または配列番号４４８に対して少なくとも９８％同一であるＨＨＤＨポリペプチド、および、配列番号１１６または配列番号４４８に対して少なくとも９９％同一であるＨＨＤＨポリペプチドが含まれる。

本発明はさらに、配列番号２６４、配列番号２６６、配列番号４７０または配列番号４７６に対して少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有するＨＨＤＨポリペプチドを提供する。本発明の望ましいＨＨＤＨポリペプチドには、配列番号２６４、配列番号２６６、配列番号４７０または配列番号４７６に対して少なくとも９６％同一であるＨＨＤＨポリペプチド、配列番号２６４、配列番号２６６、配列番号４７０または配列番号４７６に対して少なくとも９７％同一であるＨＨＤＨポリペプチド、配列番号２６４、配列番号２６６、配列番号４７０または配列番号４７６に対して少なくとも９８％同一であるＨＨＤＨポリペプチド、および、配列番号２６４、配列番号２６６、配列番号４７０または配列番号４７６に対して少なくとも９９％同一であるＨＨＤＨポリペプチドが含まれる。

本発明はさらに、配列番号２と最適に整列された場合、配列番号２に対して少なくとも８０％同一であるＨＨＤＨポリペプチドで、Ｓ２Ｔ、Ｔ３ＡまたはＴ３Ｐのいずれか、Ａ４Ｖ、Ｖ６Ｄ、Ｖ９ＩまたはＶ９Ｆのいずれか、Ｋ１０Ｌ、Ｇ１３Ｓ、Ｇ１４Ｓ、Ｍ１５Ｋ、Ｇ１６Ｃ、Ｓ１７ＴまたはＳ１７Ｒのいずれか、Ｒ２０Ｓ、Ｒ２０ＣまたはＲ２０Ｋのいずれか、Ａ２４Ｔ、Ｈ２６Ｑ、Ｖ２８Ｆ、Ａ２９Ｔ、Ｃ３０Ａ、Ｈ３１Ｌ、Ｅ３３Ｇ、Ｓ３４Ｒ、Ｆ３５Ｌ、Ｋ３６Ｎ、Ｑ３７Ｈ、Ｅ４０Ｄ、Ｆ４４Ｌ、Ａ４５Ｐ、Ｔ４７ＰまたはＴ４７Ａのいずれか、Ｋ５２Ｎ、Ｍ５４Ｖ、Ｓ５５Ｒ、Ｅ５６Ｄ、Ｅ５８Ｋ、Ｅ６１ＧまたはＥ６１Ｄのいずれか、Ｉ６３Ｖ、Ｑ７２Ｒ、Ｖ７５Ｉ、Ｌ７６Ｐ、Ｓ７８Ｃ、Ｆ８２Ｙ、Ｐ８４ＳまたはＰ８４Ｌのいずれか、Ｅ８５Ｑ、Ｋ９１Ｅ、Ａ９３Ｄ、Ｅ９５ＱまたはＥ９５Ｇ、Ｄ９６Ｎ、Ｒ１０７Ｋ、Ｖ１１２Ａ、Ａ１１４ＴまたはＡ１１４ＧまたはＡ１１４Ｓのいずれか、Ｖ１１５Ａ、Ｓ１１７Ｐ、Ｋ１２０Ｎ、Ｋ１２１Ｅ、Ｒ１２２Ｐ、Ｈ１２６Ｒ、Ｉ１３０Ｖ、Ａ１３３Ｓ、Ｔ１３４ＡまたはＴ１３４Ｖ、Ｆ１３６ＬまたはＦ１３６ＷまたはＦ１３６Ｖ、Ｗ１３９Ｈ、Ｌ１４２ＩまたはＬ１４２Ｒ、Ｔ１４４Ｓ、Ｔ１４６Ｓ、Ａ１５２Ｔ、Ｃ１５３Ｓ、Ｔ１５４ＳまたはＴ１５４Ａのいずれか、Ｉ１６８Ｖ、Ｐ１６９Ｔ、Ｙ１７７Ｆ、Ｌ１７８Ｖ、Ｓ１８０Ｉ、Ｅ１８１ＧまたはＥ１８１Ｉ、Ｐ１８４Ｋ、Ｆ１８６Ｙ、Ｔ１９４Ｉ、Ｈ１９８Ｎ、Ｖ１９９Ｍ、Ｋ２１５Ｅ、Ｖ２３６Ｇ、Ｆ２３７Ｖ、Ｗ２３８Ｌ、Ａ２４０Ｔ、Ｍ２４５ＩまたはＭ２４５ＡまたはＭ２４５Ｖのいずれか、Ｗ２４９Ｙ、Ｍ２５２ＶまたはＭ２５２Ｉ、およびＥ２５４Ｖからなる群より選択される１つまたは複数の置換をさらに有するＨＨＤＨポリペプチドを提供する。いくつかの実施形態において、本発明のＨＨＤＨポリペプチドは、配列番号２に対して少なくとも８５％同一であり、かつ、上記で示された置換の１つまたは複数を有する。本発明のいくつかのＨＨＤＨポリペプチドは配列番号２に対して少なくとも約９０％同一であり、いくつかは配列番号２に対して少なくとも約９５％同一であり、いくつかは配列番号２に対して少なくとも９９％同一であり、ただし、これらのすべては、上記で示された置換の１つまたは複数を有する。これらのＨＨＤＨポリペプチドのいくつかは上記置換の少なくとも２つ以上を有し、また、これらのＨＨＤＨポリペプチドのいくつかは上記置換の少なくとも３つ以上を有する。

配列番号２と最適に整列された場合、本発明の特定のＨＨＤＨポリペプチドは、配列番号２に対応する配列を有するが、Ｓ２Ｔ、Ｔ３ＡまたはＴ３Ｐのいずれか、Ａ４Ｖ、Ｖ６Ｄ、Ｖ９ＩまたはＶ９Ｆのいずれか、Ｋ１０Ｌ、Ｇ１３Ｓ、Ｇ１４Ｓ、Ｍ１５Ｋ、Ｇ１６Ｃ、Ｓ１７ＴまたはＳ１７Ｒのいずれか、Ｒ２０Ｓ、Ｒ２０ＣまたはＲ２０Ｋのいずれか、Ａ２４Ｔ、Ｈ２６Ｑ、Ｖ２８Ｆ、Ａ２９Ｔ、Ｃ３０Ａ、Ｈ３１Ｌ、Ｅ３３Ｇ、Ｓ３４Ｒ、Ｆ３５Ｌ、Ｋ３６Ｎ、Ｑ３７Ｈ、Ｅ４０Ｄ、Ｆ４４Ｌ、Ａ４５Ｐ、Ｔ４７ＰまたはＴ４７Ａのいずれか、Ｋ５２Ｎ、Ｍ５４Ｖ、Ｓ５５Ｒ、Ｅ５６Ｄ、Ｅ５８Ｋ、Ｅ６１ＧまたはＥ６１Ｄのいずれか、Ｉ６３Ｖ、Ｑ７２Ｒ、Ｖ７５Ｉ、Ｌ７６Ｐ、Ｓ７８Ｃ、Ｆ８２Ｙ、Ｐ８４ＳまたはＰ８４Ｌのいずれか、Ｅ８５Ｑ、Ｋ９１Ｅ、Ａ９３Ｄ、Ｅ９５ＱまたはＥ９５Ｇ、Ｄ９６Ｎ、Ｒ１０７Ｋ、Ｖ１１２Ａ、Ａ１１４ＴまたはＡ１１４ＧまたはＡ１１４Ｓのいずれか、Ｖ１１５Ａ、Ｓ１１７Ｐ、Ｋ１２０Ｎ、Ｋ１２１Ｅ、Ｒ１２２Ｐ、Ｈ１２６Ｒ、Ｉ１３０Ｖ、Ａ１３３Ｓ、Ｔ１３４ＡまたはＴ１３４Ｖ、Ｆ１３６ＬまたはＦ１３６ＷまたはＦ１３６Ｖ、Ｗ１３９Ｈ、Ｌ１４２ＩまたはＬ１４２Ｒ、Ｔ１４４Ｓ、Ｔ１４６Ｓ、Ａ１５２Ｔ、Ｃ１５３Ｓ、Ｔ１５４ＳまたはＴ１５４Ａのいずれか、Ｉ１６８Ｖ、Ｐ１６９Ｔ、Ｙ１７７Ｆ、Ｌ１７８Ｖ、Ｓ１８０Ｉ、Ｅ１８１ＧまたはＥ１８１Ｉ、Ｐ１８４Ｋ、Ｆ１８６Ｙ、Ｔ１９４Ｉ、Ｈ１９８Ｎ、Ｖ１９９Ｍ、Ｋ２１５Ｅ、Ｖ２３６Ｇ、Ｆ２３７Ｖ、Ｗ２３８Ｌ、Ａ２４０Ｔ、Ｍ２４５ＩまたはＭ２４５ＡまたはＭ２４５Ｖのいずれか、Ｗ２４９Ｙ、Ｍ２５２ＶまたはＭ２５２Ｉ、およびＥ２５４Ｖからなる群より選択される１つまたは複数のアミノ酸置換を有する。いくつかの実施形態において、ＨＨＤＨポリペプチドは上記置換の２つ以上を有し、場合により、上記置換の３つまたは４つまたはそれ以上を有することがある。典型的には、この実施形態において、生じるＨＨＤＨポリペプチドは、配列番号２との配列同一性が少なくとも８０％であり、より典型的には少なくとも９０％の配列同一性を有し、さらにより典型的には少なくとも９５％の配列同一性を有し、なおさらにより典型的には少なくとも９８％の配列同一性を有する。

本明細書中に記載されるＨＨＤＨポリペプチドはさらに、３７位におけるＱ、７０位におけるＹ、７２位におけるＱ、８０位におけるＱ、９９位におけるＧ、１０７位におけるＲ、１４６位におけるＴ、１５３位におけるＣ、１８６位におけるＦ、１８９位におけるＴ、および２２２位におけるＡからなる群より選択される１つまたは複数のアミノ酸残基を有することができる。いくつかの実施形態において、本発明のＨＨＤＨポリペプチドは、これらの選択された残基の２つ、３つ、４つまたはそれ以上を有する。これらの残基のうち、Ｑ３７、Ｙ７０、Ｑ８７、Ｒ１０７、Ｔ１４６、Ｃ１５３およびＦ１８６は、ＨＨＤＨ活性と好都合に相関するようである。他の残基は、より詳しくは下記で議論されているように、４−クロロ酢酸エチルによる阻害に対する抵抗性と好都合に十分に相関するようである。

２つの配列が、その配列対に対してできる限り高いスコアに到達するように、規定されたアミノ酸置換行列（例えば、ＢＬＯＳＵＭ６２）、ギャップ存在ペナルティーおよびギャップ伸長ペナルティーを使用して類似性をスコア化するためにアラインメントされているとき、その２つの配列は「最適にアラインメントされている」。様々なアミノ酸置換行列、および、２つの配列の間における類似性を定量化することにおけるそれらの使用がこの分野では広く知られている。例えば、Ｄａｙｈｏｆｆら（１９７８）”Ａ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ ｃｈａｎｇｅ ｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎｓ”；”Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ”、Ｖｏｌ．５、Ｓｕｐｐｌ．３（Ｅｄ．Ｍ．Ｏ．Ｄａｙｈｏｆｆ）、ｐｐ．３４５〜３５２、Ｎａｔｌ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｒｏｕｎｄ．、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．；Ｈｅｎｉｋｏｆｆら（１９９２）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．、８９：１０９１５〜１０９１９を参照のこと。ＢＬＯＳＵＭ６２行列は、多くの場合、Ｃａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ２．０などの配列アラインメントプロトコルにおいて初期設定のスコア化置換行列として使用される。ギャップ存在ペナルティーは、アラインメントされた配列の一方に１つだけのアミノ酸ギャップを導入するために課され、ギャップ伸長ペナルティーは、既にあけられたギャップに挿入されたそれぞれのさらなる空位アミノ酸位置のために課される。アラインメントは、アラインメントが開始され、終了する各配列のアミノ酸位置によって、また、場合により、１個のギャップまたは多数のギャップを、できる限り高いスコアに到達するように一方の配列または両方の配列において挿入することによって規定される。最適なアラインメントおよびスコア化を手作業により達成することができる一方で、このプロセスは、コンピューターによって実行されるアラインメントアルゴリズムの使用によって、例えば、ギャップドＢＬＡＳＴ２．０（これは、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２５：３３８９〜３４０２に記載され、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｗｅｂｓｉｔｅにおいて公開されている）の使用によって容易になる。最適なアラインメントは、多重アラインメントを含めて、ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ（これはＡｌｔｓｃｈｕｌら（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２５：３３８９〜３４０２によって記載される）などの容易に入手可能なプログラムを使用して作成することができる。

参照配列と最適に整列されているアミノ酸配列に関して、アミノ酸残基は、残基がそれとのアラインメントにおいて対になっている参照配列における位置「に対応する」。「位置」は、Ｎ末端に対するその位置に基づいて参照配列における各アミノ酸を連続して特定する数字によって示される。最適なアラインメントを決定するときに考慮に入れなければならない欠失、挿入、短縮化、融合などのために、一般に、試験配列におけるアミノ酸残基の数は、Ｎ末端から単純に数えることによって決定され、参照配列におけるその対応する位置の数と同じである必要はない。例えば、アラインメントされた試験配列に欠失が存在する場合、その欠失部位での参照配列内の位置に対応するアミノ酸は存在しないことになる。アラインメントされた参照配列に挿入が存在する場合、その挿入は、参照配列内のどのアミノ酸位置にも対応しない。短縮化または融合の場合、対応する配列においてどのアミノ酸にも対応しないアミノ酸の領域が参照配列またはアラインメントされた配列のいずれかに存在し得る。

さらなる実施形態において、本発明は、配列番号２００に対して少なくとも９３％同一であるＨＨＤＨポリペプチド（すなわち、配列番号２００と最適に整列された場合、配列番号２００と比較して１８個以下のアミノ酸が異なるＨＨＤＨポリペプチド）を提供する。これらのＨＨＤＨポリペプチドのいくつかは配列番号２００に対して少なくとも９５％同一であり、いくつかは、配列番号２００に対して少なくとも９７％、９８％または９９％同一である。特定の実施形態において、これらのポリペプチドは下記の残基の１つ以上を有する：２位の（残基）位置におけるＴ、３位におけるＡまたはＰまたはＳ、４位におけるＶ、６位におけるＤ、９位におけるＩまたはＦのいずれか、１０位におけるＬ、１３位におけるＳ、１４位におけるＳ、１５位におけるＫ、１６位におけるＣ、１７位におけるＴまたはＲ、２０位におけるＣまたはＳまたはＫのいずれか、２４位におけるＴ、２６位におけるＱ、２８位におけるＦ、２９位におけるＴ、３０位におけるＡ、３１位におけるＬ、３３位におけるＧ、３４位におけるＲ、３５位におけるＬ、３６位におけるＮ、３７位におけるＨ、４０位におけるＤ、４４位におけるＬ、４５位におけるＰ、４７位におけるＰまたはＡのいずれか、５２位におけるＮ、５４位におけるＶ、５５位におけるＲ、５６位におけるＤ、５８位におけるＫ、６１位におけるＧまたはＤ、６３位におけるＶ、７２位におけるＲ、７５位におけるＩ、７６位におけるＰ、７８位におけるＣ、８２位におけるＹ、８４位におけるＳまたはＬのいずれか、８５位におけるＡ、９１位におけるＥ、９３位におけるＤ、９５位におけるＱまたはＧ、９６位におけるＮ、１０７位におけるＫ、１１２位におけるＡ、１１４位におけるＴ、ＳまたはＧのいずれか、１１５位におけるＡ、１１７位におけるＰ、１２０位におけるＮ、１２１位におけるＥ、１２２位におけるＰ、１２６位におけるＲ、１３０位におけるＶ、１３３位におけるＳ、１３４位におけるＡまたはＶ、１３６位におけるＬ、ＷまたはＶ、１３９位におけるＨ、１４２位におけるＩまたはＲ、１４４位におけるＳ、１４６位におけるＳ、１５２位におけるＴ、１５３位におけるＳ、１５４位におけるＳまたはＡのいずれか、１６８位におけるＶ、１６９位におけるＴ、１７７位におけるＦ、１７８位におけるＶ、１８０位におけるＩ、１８１位におけるＧまたはＩ、１８４位におけるＫ、１８６位におけるＹ、１９４位におけるＬ、１９８位におけるＮ、１９９位におけるＭ、２１５位におけるＥ、２３６位におけるＧ、２３７位におけるＶ、２３８位におけるＬ、２４０位におけるＴ、２４５位におけるＩまたはＡまたはＶのいずれか、２４９位におけるＹ、２５２位におけるＶまたはＩ、および、２５４位におけるＶ。

本発明はまた、配列番号１に対応する核酸の実質的に全長にわたってストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるＨＨＤＨポリペプチド（ただし、コードされるポリペプチドは、配列番号２と最適に整列された場合、２位の（残基）位置におけるＴ、３位におけるＡまたはＰまたはＳ、４位におけるＶ、６位におけるＤ、９位におけるＩまたはＦのいずれか、１０位におけるＬ、１３位におけるＳ、１４位におけるＳ、１５位におけるＫ、１６位におけるＣ、１７位におけるＴまたはＲ、２０位におけるＳまたはＫのいずれか、２４位におけるＴ、２６位におけるＱ、２８位におけるＦ、２９位におけるＴ、３０位におけるＡ、３１位におけるＬ、３３位におけるＧ、３４位におけるＲ、３５位におけるＬ、３６位におけるＮ、３７位におけるＨ、４０位におけるＤ、４４位におけるＬ、４５位におけるＰ、４７位におけるＰまたはＡのいずれか、５２位におけるＮ、５４位におけるＶ、５５位におけるＲ、５６位におけるＤ、６１位におけるＧまたはＤ、６３位におけるＶ、７２位におけるＲまたはＱ、７５位におけるＩ、７６位におけるＰ、７８位におけるＣ、８２位におけるＹ、８４位におけるＳまたはＬのいずれか、８５位におけるＡ、９１位におけるＥ、９３位におけるＤ、９５位におけるＱまたはＧ、９６位におけるＮ、９９位におけるＧ、１０７位におけるＫ、１１２位におけるＡ、１１４位におけるＴ、ＳまたはＧのいずれか、１１５位におけるＡ、１１７位におけるＰ、１２０位におけるＮ、１２１位におけるＥ、１２２位におけるＰ、１２６位におけるＲ、１３０位におけるＶ、１３３位におけるＳ、１３４位におけるＡまたはＶ、１３６位におけるＬ、ＷまたはＶ、１３９位におけるＨ、１４２位におけるＩまたはＲ、１４４位におけるＳ、１４６位におけるＳ、１５２位におけるＴ、１５３位におけるＳ、１５４位におけるＳまたはＡのいずれか、１６８位におけるＶ、１６９位におけるＴ、１７７位におけるＦ、１７８位におけるＶ、１８０位におけるＩ、１８１位におけるＧまたはＩ、１８４位におけるＫ、１８６位におけるＹ、１８９位におけるＴ、１９４位におけるＬ、１９８位におけるＮ、１９９位におけるＭ、２１５位におけるＥ、２２２位におけるＡ、２３６位におけるＧ、２３７位におけるＶ、２３８位におけるＬ、２４０位におけるＴ、２４５位におけるＩまたはＡまたはＶのいずれか、２４９位におけるＹ、２５２位におけるＶまたはＩ、および、２５４位におけるＶからなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基を有するアミノ酸配列を含む）を提供する。

本発明はまた、配列番号２のアミノ酸配列を有する野生型ＨＨＤＨと比較して少なくとも１．４倍大きいＨＨＤＨ活性を有する単離されたポリペプチドまたは組換えポリペプチドを提供し、
この場合、前記ポリペプチドは、配列番号３、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号３３、配列番号３７、配列番号４３、配列番号４７、配列番号４９、配列番号５１、配列番号６５、配列番号６７、配列番号７９、配列番号８３、配列番号１０９、配列番号１１３、配列番号１１５、配列番号１１７、配列番号１５３、配列番号１５７、配列番号１６１、配列番号１６３、配列番号１６５、配列番号１６９、配列番号１７９、配列番号１６１、配列番号１９９、配列番号２６１、配列番号２６３、配列番号２６５、配列番号２６９、配列番号４２１、配列番号４３９、配列番号４４１、配列番号４４７、配列番号４６９、配列番号４７５、配列番号５１９、配列番号７０１、配列番号７２５、配列番号７２９、配列番号７３１、配列番号７３３、配列番号７３５、配列番号７３７、およびその相補的配列からなる群より選択される配列を有する核酸の実質的に全長にわたってストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされる。

核酸が典型的には溶液中で会合するとき、その核酸は「ハイブリダイズする」。核酸は、十分に特徴づけられた物理化学的な力により、例えば、水素結合、溶媒排除、塩基積み重なりなどによりハイブリダイズする。核酸のハイブリダイゼーションに対する広範な指針が、Ｔｉｊｓｓｅｎ（１９９３）”Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｂｅｓ”、Ｐａｒｔ Ｉ、Ｃｈａｐｔｅｒ ２（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）に見出される。

本明細書中で使用される用語「ストリンジェントなハイブリダイゼーション洗浄条件」は、核酸ハイブリダイゼーション実験（例えば、サザンハイブリダイゼーションおよびノーザンハイブリダイゼーションなど）の関連では、配列依存的であり、異なる環境パラメーターのもとでは異なる。核酸のハイブリダイゼーションに対する広範な指針が、Ｔｉｊｓｓｅｎ（１９９３）”Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｂｅｓ”、Ｐａｒｔ Ｉ、Ｃｈａｐｔｅｒ ２（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）に見出される。

本発明の目的のために、「高ストリンジェントな」（または「高ストリンジェンシー」の）ハイブリダイゼーション条件および洗浄条件は、一般には、（下記に記されるような）規定されたイオン強度およびｐＨにおいて、具体的な配列に対する熱的融解点（Ｔ_ｍ）よりも約５℃以上低くするために選択される（高ストリンジェントな条件はまた、比較の用語で示され得る）。Ｔ_ｍは、試験配列の５０％が、完全に一致したプローブにハイブリダイズする（規定されたイオン強度およびｐＨでの）温度である。非常にストリンジェントな条件は、特定のプローブに対するＴ_ｍと等しくなるように選択される。

核酸二重鎖のＴ_ｍは、二重鎖が所与の条件下で５０％変性する温度を示し、核酸ハイブリッドの安定性の直接的な尺度を表している。従って、Ｔ_ｍは、らせんからランダムコイルへの転移における中間点に対応する温度に対応する。そのため、Ｔ_ｍは、長いヌクレオチド領域については、長さ、ヌクレオチド組成およびイオン強度に依存する。

ハイブリダイゼーション後、ハイブリダイゼーションしていない核酸物質は一連の洗浄によって除くことができ、この場合、そのストリンジェンシーを、所望する結果に依存して調節することができる。低ストリンジェンシーの洗浄条件（例えば、より高い塩およびより低い温度を使用する洗浄条件）は感度を増大させ、しかし、非特異的なハイブリダイゼーションシグナルおよび高いバックグラウンドシグナルをもたらし得る（すなわち、特異性を失わせる）。より高いストリンジェンシーの条件（例えば、より低い塩、および、ハイブリダイゼーション温度により近いより高い温度を使用する条件）はバックグラウンドシグナルを低下させ、典型的には、特異的なシグナルのみが残留する（すなわち、特異性を増大させる）。Ｒａｐｌｅｙ，Ｒ．およびＷａｌｋｅｒ，Ｊ．Ｍ．Ｅｄｓ．、”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｍｅｔｈｏｄｓ Ｈａｎｄｂｏｏｋ”（Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．１９９８）を参照のこと。

ＤＮＡ−ＤＮＡ二重鎖のＴ_ｍを、下記の式１を使用して推定することができる：
Ｔ_ｍ（℃）＝８１．５℃＋１６．６（ｌｏｇ_１０Ｍ）＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−０．７２（％ｆ）−５００／ｎ
式中、Ｍは一価カチオン（通常、Ｎａ＋）のモル濃度であり、（％Ｇ＋Ｃ）はグアノシン（Ｇ）ヌクレオチドおよびシトシン（Ｃ）ヌクレオチドの割合であり、（％ｆ）はホルムアミドの割合であり、ｎはハイブリッドのヌクレオチド塩基の数（すなわち、長さ）である。上記文献を参照のこと。

ＲＮＡ−ＤＮＡ二重鎖のＴ_ｍを、下記の式２を使用することによって推定することができる：
Ｔｍ（℃）＝７９．８℃＋１８．５（ｌｏｇ_１０Ｍ）＋０．５８（％Ｇ＋Ｃ）−１１．８（％Ｇ＋Ｃ）^２−０．５６（％ｆ）−８２０／ｎ
式中、Ｍは一価カチオン（通常、Ｎａ＋）のモル濃度であり、（％Ｇ＋Ｃ）はグアノシン（Ｇ）ヌクレオチドおよびシトシン（Ｃ）ヌクレオチドの割合であり、（％ｆ）はホルムアミドの割合であり、ｎはハイブリッドのヌクレオチド塩基の数（すなわち、長さ）である。上記文献を参照のこと。

式１および式２は、典型的には、約１００ヌクレオチド〜２００ヌクレオチドよりも長いハイブリッド二重鎖についてのみ正確である。上記文献を参照のこと。

５０ヌクレオチド未満の短い核酸配列のＴｍは下記のように計算することができる：
Ｔ_ｍ（℃）＝４（Ｇ＋Ｃ）＋２（Ａ＋Ｔ）
式中、Ａ（アデニン）、Ｃ、Ｔ（チミン）およびＧは、対応するヌクレオチドの数である。

サザンブロットまたはノーザンブロットにおいてフィルター上に１００を超える相補的残留物を有する相補的核酸のハイブリダイゼーションのためのストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の一例が、１ｍｇのヘパリンを伴う４２℃での５０％ホルムアミドであり、この場合、ハイブリダイゼーションが一晩行われる。ストリンジェントな洗浄条件の一例が、６５℃での１５分間の０．２ｘＳＳＣ洗浄である（ＳＳＣ緩衝液の説明については、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”（１９８９）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）を参照のこと）。多くの場合、高ストリンジェンシーの洗浄の前に、低ストリンジェンシーの洗浄が、バックグランドプローブシグナルを除くために行われる。低ストリンジェンシーの洗浄の一例が、４０℃での１５分間の２ｘＳＳＣである。

一般に、特定のハイブリダイゼーションアッセイにおいて関連性のないプローブについて観測されるシグナル対ノイズ比よりも２．５倍〜５倍（またはそれ以上）のシグナル対ノイズ比により、特異的なハイブリダイゼーションの検出が示される。２つの配列の間における少なくともストリンジェントなハイブリダイゼーションの検出により、本発明の関連では、例えば、本明細書中の配列表に示される本発明の核酸に対する比較的強い構造的な類似性または相同性が示される。

記される場合、「高ストリンジェントな」条件が、規定されたイオン強度およびｐＨにおいて、具体的な配列に対する熱的融解点（Ｔ_ｍ）よりも約５℃以上低くするために選択される。関心のあるヌクレオチド配列（例えば、「プローブ」）に密接に関連するか、または同一である標的配列を高ストリンジェントな条件の下で同定することができる。より低いストリンジェンシーの条件が、あまり相補的でない配列については適切である。

ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件（同様に、高ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件、超高ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件、または超々高ストリンジェントシーのハイブリダイゼーション条件）および洗浄条件は、任意の試験核酸について経験的に容易に決定することができる。例えば、高ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件および洗浄条件を決定する際には、選択された一組の判断基準が満たされるまで、ハイブリダイゼーション条件および洗浄条件が、（例えば、ハイブリダイゼーションまたは洗浄において、温度を上昇させ、塩濃度を低下させ、界面活性剤の濃度を増大させ、かつ／または、有機溶媒（例えば、ホルムアミドなど）の濃度を増大させることによって）徐々に増大させられる。例えば、ハイブリダイゼーション条件または洗浄条件のストリンジェンシーが、配列番号３、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号３３、配列番号３７、配列番号４３、配列番号４７、配列番号４９、配列番号５１、配列番号６５、配列番号６７、配列番号７９、配列番号８３、配列番号１０９、配列番号１１３、配列番号１１５、配列番号１１７、配列番号１５３、配列番号１５７、配列番号１６１、配列番号１６３、配列番号１６５、配列番号１６９、配列番号１７９、配列番号１６１、配列番号１９９、配列番号２６１、配列番号２６３、配列番号２６５、配列番号２６９、配列番号４２１、配列番号４３９、配列番号４４１、配列番号４４７、配列番号４６９、配列番号４７５、配列番号５１９、配列番号７０１、またはその相補的配列に対応するプローブが、完全に一致した相補的配列に結合するまで、徐々に増大させられる。試験核酸は、試験核酸が、プローブに対して、完全に一致した相補的な標的に対するのと同じくらい良好に少なくとも１／２（すなわち、完全に一致したプローブが、完全に一致した相補的な標的に結合する条件下での標的に対するプローブのハイブリダイゼーションと同じくらい大きい少なくとも１／２のシグナル対ノイズ比で）ハイブリダイズするとき、プローブ核酸に特異的にハイブリダイズすると言われる。

超高ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件および洗浄条件は、完全に一致した相補的な標的核酸に対するプローブの結合についてのシグナル対ノイズ比が少なくとも１０ｘになるまで、ハイブリダイゼーション条件および洗浄条件のストリンジェンシーが増大させられる条件である。完全に一致した相補的な標的核酸のシグナル対ノイズ比の少なくとも１／２のシグナル対ノイズ比で、そのような条件下でプローブにハイブリダイズする標的核酸は、超高ストリンジェンシーの条件下でプローブに結合すると言われる。

同様に、さらにより高いレベルのストリンジェンシーを、関連したハイブリダイゼーションアッセイのハイブリダイゼーション条件および／または洗浄条件のストリンジェンシーを徐々に増大させることによって決定することができる。例えば、完全に一致した相補的な標的核酸に対するプローブの結合についてのシグナル対ノイズ比が少なくとも１０ｘ、２０Ｘ、５０Ｘ、１００Ｘまたは５００Ｘになるまで、ハイブリダイゼーション条件および洗浄条件のストリンジェンシーが増大させられる条件。完全に一致した相補的な標的核酸のシグナル対ノイズ比の少なくとも１／２のシグナル対ノイズ比で、そのような条件下でプローブにハイブリダイズする標的核酸は、超々高ストリンジェンシーの条件下でプローブに結合すると言われる。

本発明の具体的なＨＨＤＨポリペプチドには、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０、配列番号７２、配列番号７４、配列番号７６、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８２、配列番号８４、配列番号８６、配列番号８８、配列番号９０、配列番号９２、配列番号９４、配列番号９６、配列番号９８、配列番号１００、配列番号１０２、配列番号１０４、配列番号１０６、配列番号１０８、配列番号１１０、配列番号１１２、配列番号１１４、配列番号１１６、配列番号１１８、配列番号１２０、配列番号１２２、配列番号１２４、配列番号１２６、配列番号１２８、配列番号１３０、配列番号１３２、配列番号１３４、配列番号１３６、配列番号１３８、配列番号１４０、配列番号１４２、配列番号１４４、配列番号１４６、配列番号１４８、配列番号１５０、配列番号１５２、配列番号１５４、配列番号１５６、配列番号１５８、配列番号１６０、配列番号１６２、配列番号１６４、配列番号１６６、配列番号１６８、配列番号１７０、配列番号１７２、配列番号１７４、配列番号１７６、配列番号１７８、配列番号１８０、配列番号１８２、配列番号１８４、配列番号１８６、配列番号１８８、配列番号１９０、配列番号１９２、配列番号１９４、配列番号１９６、配列番号１９８、配列番号２００、配列番号２０２、配列番号２０４、配列番号２０６、配列番号２０８、配列番号２１０、配列番号２１２、配列番号２１４、配列番号２１６、配列番号２１８、配列番号２２０、配列番号２２２、配列番号２２４、配列番号２２６、配列番号２２８、配列番号２３０、配列番号２３２、配列番号２３４、配列番号２３６、配列番号２３８、配列番号２４０、配列番号２４２、配列番号２４４、配列番号２４６、配列番号２４８、配列番号２５０、配列番号２５２、配列番号２５４、配列番号２５６、配列番号２５８、配列番号２６０、配列番号２６２、配列番号２６４、配列番号２６６、配列番号２６８、配列番号２７０、配列番号２７２、配列番号２７４、配列番号２７６、配列番号２７８、配列番号２８０、配列番号２８２、配列番号２８４、配列番号２８６、配列番号２８８、配列番号２９０、配列番号２９２、配列番号２９４、配列番号２９６、配列番号２９８、配列番号３００、配列番号３０２、配列番号３０４、配列番号３０６、配列番号３０８、配列番号３１０、配列番号３１２、配列番号３１４、配列番号３１６、配列番号３１８、配列番号３２０、配列番号３２２、配列番号３２４、配列番号３２６、配列番号３２８、配列番号３３０、配列番号３３２、配列番号３３４、配列番号３３６、配列番号３３８、配列番号３４０、配列番号３４２、配列番号３４４、配列番号３４６、配列番号３４８、配列番号３５０、配列番号３５２、配列番号３５４、配列番号３５６、配列番号３５８、配列番号３６０、配列番号３６２、配列番号３６４、配列番号３６８、配列番号３７０、配列番号３７２、配列番号３７４、配列番号３７６、配列番号３７８、配列番号３８０、配列番号３８２、配列番号３８４、配列番号３８６、配列番号３８８、配列番号３９０、配列番号３９２、配列番号３９４、配列番号３９６、配列番号３９８、配列番号４００、配列番号４０２、配列番号４０４、配列番号４０６、配列番号４０８、配列番号４１０、配列番号４１２、配列番号４１４、配列番号４１６、配列番号４１８、配列番号４２０、配列番号４２２、配列番号４２４、配列番号４２６、配列番号４２８、配列番号４３０、配列番号４３２、配列番号４３４、配列番号４３６、配列番号４３８、配列番号４４０、配列番号４４２、配列番号４４４、配列番号４４６、配列番号４４８、配列番号４５０、配列番号４５２、配列番号４５４、配列番号４５６、配列番号４５８、配列番号４６０、配列番号４６２、配列番号４６４、配列番号４６６、配列番号４６８、配列番号４７０、配列番号４７２、配列番号４７４、配列番号４７６、配列番号４７８、配列番号４８０、配列番号４８２、配列番号４８４、配列番号４８６、配列番号４８８、配列番号４９０、配列番号４９２、配列番号４９４、配列番号４９６、配列番号４９８、配列番号５００、配列番号５０２、配列番号５０４、配列番号５０６、配列番号５０８、配列番号５１０、配列番号５１２、配列番号５１４、配列番号５１６、配列番号５１８、配列番号５２０、配列番号５２２、配列番号５２４、配列番号５２６、配列番号５２８、配列番号５３０、配列番号５３２、配列番号５３４、配列番号５３６、配列番号５３８、配列番号５４０、配列番号５４２、配列番号５４４、配列番号５４６、配列番号５４８、配列番号５５０、配列番号５５２、配列番号５５４、配列番号５５６、配列番号５５８、配列番号５６０、配列番号５６２、配列番号５６４、配列番号５６６、配列番号５６８、配列番号５７０、配列番号５７２、配列番号５７４、配列番号５７６、配列番号５７８、配列番号５８０、配列番号５８２、配列番号５８４、配列番号５８６、配列番号５８８、配列番号５９０、配列番号５９２、配列番号５９４、配列番号５９６、配列番号５９８、配列番号６００、配列番号６０２、配列番号６０４、配列番号６０６、配列番号６０８、配列番号６１０、配列番号６１２、配列番号６１４、配列番号６１６、配列番号６１８、配列番号６２０、配列番号６２２、配列番号６２４、配列番号６２６、配列番号６２８、配列番号６３０、配列番号６３２、配列番号６３４、配列番号６３６、配列番号６３８、配列番号６４０、配列番号６４２、配列番号６４４、配列番号６４６、配列番号６４８、配列番号６５０、配列番号６５２、配列番号６５４、配列番号６５６、配列番号６５８、配列番号６６０、配列番号６６２、配列番号６６４、配列番号６６６、配列番号６６８、配列番号６７０、配列番号６７２、配列番号６７４、配列番号６７６、配列番号６７８、配列番号６８０、配列番号６８２、配列番号６８４、配列番号６８６、配列番号６８８、配列番号６９０、配列番号６９２、配列番号６９４、配列番号６９６、配列番号６９８、配列番号７００、配列番号７０２、配列番号７０４、配列番号７０６、配列番号７０８、配列番号７１０、配列番号７１２、配列番号７１４、配列番号７１６、配列番号７１８、配列番号７２０、配列番号７２２、配列番号７２４、配列番号７２６、配列番号７２８、配列番号７３０、配列番号７３２、配列番号７３４、配列番号７３６、配列番号７３８、配列番号７４０、配列番号７４２または配列番号７４４に対応するアミノ酸配列を有するＨＨＤＨポリペプチドが含まれる。これらのＨＨＤＨポリペプチドのすべてが、実施例５Ａまたは実施例５Ｂに記載されるアッセイにおいて活性を明らかにしている。

これらのＨＨＤＨポリペプチドをコードする例示的なＨＨＤＨポリヌクレオチドが、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５５、配列番号５７、配列番号５９、配列番号６１、配列番号６３、配列番号６５、配列番号６７、配列番号６９、配列番号７１、配列番号７３、配列番号７５、配列番号７７、配列番号７９、配列番号８１、配列番号８３、配列番号８５、配列番号８７、配列番号８９、配列番号９１、配列番号９３、配列番号９５、配列番号９７、配列番号９９、配列番号１０１、配列番号１０３、配列番号１０５、配列番号１０７、配列番号１０９、配列番号１１１、配列番号１１３、配列番号１１５、配列番号１１７、配列番号１１９、配列番号１２１、配列番号１２３、配列番号１２５、配列番号１２７、配列番号１２９、配列番号１３１、配列番号１３３、配列番号１３５、配列番号１３７、配列番号１３９、配列番号１４１、配列番号１４３、配列番号１４５、配列番号１４７、配列番号１４９、配列番号１５１、配列番号１５３、配列番号１５５、配列番号１５７、配列番号１５９、配列番号１６１、配列番号１６３、配列番号１６５、配列番号１６７、配列番号１６９、配列番号１７１、配列番号１７３、配列番号１７５、配列番号１７７、配列番号１７９、配列番号１８１、配列番号１８３、配列番号１８５、配列番号１８７、配列番号１８９、配列番号１９１、配列番号１９３、配列番号１９５、配列番号１９７、配列番号１９９、配列番号２０１、配列番号２０３、配列番号２０５、配列番号２０７、配列番号２０９、配列番号２１１、配列番号２１３、配列番号２１５、配列番号２１７、配列番号２１９、配列番号２２１、配列番号２２３、配列番号２２５、配列番号２２７、配列番号２２９、配列番号２３１、配列番号２３３、配列番号２３５、配列番号２３７、配列番号２３９、配列番号２４１、配列番号２４３、配列番号２４５、配列番号２４７、配列番号２４９、配列番号２５１、配列番号２５３、配列番号２５５、配列番号２５７、配列番号２５９、配列番号２６１、配列番号２６３、配列番号２６５、配列番号２６７、配列番号２６９、配列番号２７１、配列番号２７３、配列番号２７５、配列番号２７７、配列番号２７９、配列番号２８１、配列番号２８３、配列番号２８５、配列番号２８７、配列番号２８９、配列番号２９１、配列番号２９３、配列番号２９５、配列番号２９７、配列番号２９９、配列番号３０１、配列番号３０３、配列番号３０５、配列番号３０７、配列番号３０９、配列番号３１１、配列番号３１３、配列番号３１５、配列番号３１７、配列番号３１９、配列番号３２１、配列番号３２３、配列番号３２５、配列番号３２７、配列番号３２９、配列番号３３１、配列番号３３３、配列番号３３５、配列番号３３７、配列番号３３９、配列番号３４１、配列番号３４３、配列番号３４５、配列番号３４７、配列番号３４９、配列番号３５１、配列番号３５３、配列番号３５５、配列番号３５７、配列番号３５９、配列番号３６１、配列番号３６３、配列番号３６５、配列番号３６７、配列番号３６９、配列番号３７１、配列番号３７３、配列番号３７５、配列番号３７７、配列番号３７９、配列番号３８１、配列番号３８３、配列番号３８５、配列番号３８７、配列番号３８９、配列番号３９１、配列番号３９３、配列番号３９５、配列番号３９７、配列番号３９９、配列番号４０１、配列番号４０３、配列番号４０５、配列番号４０７、配列番号４０９、配列番号４１１、配列番号４１３、配列番号４１５、配列番号４１７、配列番号４１９、配列番号４２１、配列番号４２３、配列番号４２５、配列番号４２７、配列番号４２９、配列番号４３１、配列番号４３３、配列番号４３５、配列番号４３７、配列番号４３９、配列番号４４１、配列番号４４３、配列番号４４５、配列番号４４７、配列番号４４９、配列番号４５１、配列番号４５３、配列番号４５５、配列番号４５７、配列番号４５９、配列番号４６１、配列番号４６３、配列番号４６５、配列番号４６７、配列番号４６９、配列番号４７１２、配列番号４７３、配列番号４７５、配列番号４７７、配列番号４７９、配列番号４８１、配列番号４８３、配列番号４８５、配列番号４８７、配列番号４８９、配列番号４９１、配列番号４９３、配列番号４９５、配列番号４９７、配列番号４９９、配列番号５０１、配列番号５０３、配列番号５０５、配列番号５０７、配列番号５０９、配列番号５１１、配列番号５１３、配列番号５１５、配列番号５１７、配列番号５１９、配列番号５２１、配列番号５２３、配列番号５２５、配列番号５２７、配列番号５２９、配列番号５３１、配列番号５３３、配列番号５３５、配列番号５３７、配列番号５３９、配列番号５４１、配列番号５４３、配列番号５４５、配列番号５４７、配列番号５４９、配列番号５５１、配列番号５５３、配列番号５５５、配列番号５５７、配列番号５５９、配列番号５６１、配列番号５６３、配列番号５６５、配列番号５６７、配列番号５６９、配列番号５７１、配列番号５７３、配列番号５７５、配列番号５７７、配列番号５７９、配列番号５８１、配列番号５８３、配列番号５８５、配列番号５８７、配列番号５８９、配列番号５９１、配列番号５９３、配列番号５９５、配列番号５９７、配列番号５９９、配列番号６０１、配列番号６０３、配列番号６０５、配列番号６０７、配列番号６０９、配列番号６１１、配列番号６１３、配列番号６１５、配列番号６１７、配列番号６１９、配列番号６２１、配列番号６２３、配列番号６２５、配列番号６２７、配列番号６２９、配列番号６３１、配列番号６３３、配列番号６３５、配列番号６３７、配列番号６３９、配列番号６４１、配列番号６４３、配列番号６４５、配列番号６４７、配列番号６４９、配列番号６５１、配列番号６５３、配列番号６５５、配列番号６５７、配列番号６５９、配列番号６６１、配列番号６６３、配列番号６６５、配列番号６６７、配列番号６６９、配列番号６７１、配列番号６７３、配列番号６７５、配列番号６７７、配列番号６７９、配列番号６８１、配列番号６８３、配列番号６８５、配列番号６８７、配列番号６８９、配列番号６９１、配列番号６９３、配列番号６９５、配列番号６９７、配列番号６９９、配列番号７０１、配列番号７０３、配列番号７０５、配列番号７０７、配列番号７０９、配列番号７１１、配列番号７１３、配列番号７１５、配列番号７１７、配列番号７１９、配列番号７２１、配列番号７２３、配列番号７２５、配列番号７２７、配列番号７２９、配列番号７３１、配列番号７３３、配列番号７３５、配列番号７３９、配列番号７４１および配列番号７４３としてそれぞれ本明細書中に示される。

本発明のＨＨＤＨポリペプチドは、多くの場合、実施例５Ａに記載されるアッセイで測定されたとき、配列番号２のアミノ酸配列を有する野性型ＨＨＤＨと比較して、少なくとも１．４倍大きいＨＨＤＨ活性であるＨＨＤＨ活性を有する。本発明のいくつかのＨＨＤＨポリペプチド（配列番号７４０、配列番号７４２、配列番号７２８、配列番号９０、配列番号９２、配列番号９４、配列番号９６および配列番号９６）は、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．のＨＨＤＨ（配列番号２）の活性よりも少なくとも２倍大きいＨＨＤＨ活性を有し、多くの場合、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．のＨＨＤＨ（配列番号２）の活性よりも少なくとも２．４倍〜１００倍大きいＨＨＤＨ活性を有し、配列番号１００、配列番号７３２、配列番号７３４および配列番号７３６のＨＨＤＨポリペプチドは、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．のＨＨＤＨ（配列番号２）の活性よりも１００倍〜５００倍大きいＨＨＤＨ酵素活性を有し、また、配列番号７２６および配列番号７３０のＨＨＤＨポリペプチドは、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．のＨＨＤＨ（配列番号２）の活性よりも５００倍〜１０００倍大きいＨＨＤＨ酵素活性を有する（この場合、酵素活性は、実施例５Ａに記載されるアッセイで測定される）。

本発明はまた、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０、配列番号７２、配列番号７４、配列番号７６、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８２、配列番号８４、配列番号８６、配列番号８８、配列番号９０、配列番号９２、配列番号９４、配列番号９６、配列番号９８、配列番号１００、配列番号１０２、配列番号１０４、配列番号１０６、配列番号１０８、配列番号１１０、配列番号１１２、配列番号１１４、配列番号１１６、配列番号１１８、配列番号１２０、配列番号１２２、配列番号１２４、配列番号１２６、配列番号１２８、配列番号１３０、配列番号１３２、配列番号１３４、配列番号１３６、配列番号１３８、配列番号１４０、配列番号１４２、配列番号１４４、配列番号１４６、配列番号１４８、配列番号１５０、配列番号１５２、配列番号１５４、配列番号１５６、配列番号１５８、配列番号１６０、配列番号１６２、配列番号１６４、配列番号１６６、配列番号１６８、配列番号１７０、配列番号１７２、配列番号１７４、配列番号１７６、配列番号１７８、配列番号１８０、配列番号１８２、配列番号１８４、配列番号１８６、配列番号１８８、配列番号１９０、配列番号１９２、配列番号１９４、配列番号１９６、配列番号１９８、配列番号２００、配列番号２０２、配列番号２０４、配列番号２０６、配列番号２０８、配列番号２１０、配列番号２１２、配列番号２１４、配列番号２１６、配列番号２１８、配列番号２２０、配列番号２２２、配列番号２２４、配列番号２２６、配列番号２２８、配列番号２３０、配列番号２３２、配列番号２３４、配列番号２３６、配列番号２３８、配列番号２４０、配列番号２４２、配列番号２４４、配列番号２４６、配列番号２４８、配列番号２５０、配列番号２５２、配列番号２５４、配列番号２５６、配列番号２５８、配列番号２６０、配列番号２６２、配列番号２６４、配列番号２６６、配列番号２６８、配列番号２７０、配列番号２７２、配列番号２７４、配列番号２７６、配列番号２７８、配列番号２８０、配列番号２８２、配列番号２８４、配列番号２８６、配列番号２８８、配列番号２９０、配列番号２９２、配列番号２９４、配列番号２９６、配列番号２９８、配列番号３００、配列番号３０２、配列番号３０４、配列番号３０６、配列番号３０８、配列番号３１０、配列番号３１２、配列番号３１４、配列番号３１６、配列番号３１８、配列番号３２０、配列番号３２２、配列番号３２４、配列番号３２６、配列番号３２８、配列番号３３０、配列番号３３２、配列番号３３４、配列番号３３６、配列番号３３８、配列番号３４０、配列番号３４２、配列番号３４４、配列番号３４６、配列番号３４８、配列番号３５０、配列番号３５２、配列番号３５４、配列番号３５６、配列番号３５８、配列番号３６０、配列番号３６２、配列番号３６４、配列番号３６８、配列番号３７０、配列番号３７２、配列番号３７４、配列番号３７６、配列番号３７８、配列番号３８０、配列番号３８２、配列番号３８４、配列番号３８６、配列番号３８８、配列番号３９０、配列番号３９２、配列番号３９４、配列番号３９６、配列番号３９８、配列番号４００、配列番号４０２、配列番号４０４、配列番号４０６、配列番号４０８、配列番号４１０、配列番号４１２、配列番号４１４、配列番号４１６、配列番号４１８、配列番号４２０、配列番号４２２、配列番号４２４、配列番号４２６、配列番号４２８、配列番号４３０、配列番号４３２、配列番号４３４、配列番号４３６、配列番号４３８、配列番号４４０、配列番号４４２、配列番号４４４、配列番号４４６、配列番号４４８、配列番号４５０、配列番号４５２、配列番号４５４、配列番号４５６、配列番号４５８、配列番号４６０、配列番号４６２、配列番号４６４、配列番号４６６、配列番号４６８、配列番号４７０、配列番号４７２、配列番号４７４、配列番号４７６、配列番号４７８、配列番号４８０、配列番号４８２、配列番号４８４、配列番号４８６、配列番号４８８、配列番号４９０、配列番号４９２、配列番号４９４、配列番号４９６、配列番号４９８、配列番号５００、配列番号５０２、配列番号５０４、配列番号５０６、配列番号５０８、配列番号５１０、配列番号５１２、配列番号５１４、配列番号５１６、配列番号５１８、配列番号５２０、配列番号５２２、配列番号５２４、配列番号５２６、配列番号５２８、配列番号５３０、配列番号５３２、配列番号５３４、配列番号５３６、配列番号５３８、配列番号５４０、配列番号５４２、配列番号５４４、配列番号５４６、配列番号５４８、配列番号５５０、配列番号５５２、配列番号５５４、配列番号５５６、配列番号５５８、配列番号５６０、配列番号５６２、配列番号５６４、配列番号５６６、配列番号５６８、配列番号５７０、配列番号５７２、配列番号５７４、配列番号５７６、配列番号５７８、配列番号５８０、配列番号５８２、配列番号５８４、配列番号５８６、配列番号５８８、配列番号５９０、配列番号５９２、配列番号５９４、配列番号５９６、配列番号５９８、配列番号６００、配列番号６０２、配列番号６０４、配列番号６０６、配列番号６０８、配列番号６１０、配列番号６１２、配列番号６１４、配列番号６１６、配列番号６１８、配列番号６２０、配列番号６２２、配列番号６２４、配列番号６２６、配列番号６２８、配列番号６３０、配列番号６３２、配列番号６３４、配列番号６３６、配列番号６３８、配列番号６４０、配列番号６４２、配列番号６４４、配列番号６４６、配列番号６４８、配列番号６５０、配列番号６５２、配列番号６５４、配列番号６５６、配列番号６５８、配列番号６６０、配列番号６６２、配列番号６６４、配列番号６６６、配列番号６６８、配列番号６７０、配列番号６７２、配列番号６７４、配列番号６７６、配列番号６７８、配列番号６８０、配列番号６８２、配列番号６８４、配列番号６８６、配列番号６８８、配列番号６９０、配列番号６９２、配列番号６９４、配列番号６９６、配列番号６９８、配列番号７００、配列番号７０２、配列番号７０４、配列番号７０６、配列番号７０８、配列番号７１０、配列番号７１２、配列番号７１４、配列番号７１６、配列番号７１８、配列番号７２０、配列番号７２２、配列番号７２４、配列番号７２６、配列番号７２８、配列番号７３０、配列番号７３２、配列番号７３４、配列番号７３６、配列番号７３８、配列番号７４０または配列番号７４２のポリペプチドの改変体であるＨＨＤＨポリペプチドであって、１個〜６個のアミノ酸残基の置換、欠失および／または挿入を有するＨＨＤＨポリペプチドを提供する。

本発明のＨＨＤＨポリペプチドの改変体は、当業者に広く知られている方法を使用して作製することができる。これらの改変体のライブラリーを作製し、実施例４Ａに記載されるＨＨＤＨ活性の存在についてのハイスループットスクリーニングを使用してスクリーニングすることができる。場合により、シアノヒドリン生成物阻害剤の存在下で、例えば、（Ｒ）−４−シアノ−３−ヒドロキシ酪酸エチルの存在下で活性を示すハロヒドリンデハロゲナーゼを同定することが望ましい場合がある。そのような酵素を同定するためのハイスループットスクリーニングが実施例４Ｂに示される。

ＨＨＤＨポリペプチドに対する残基変化のそれぞれを、配列変化と、所望する機能（増大した酵素活性）との間に、何らかの関係性があるならば、どのような関係性が存在したかを明らかにするために評価した。そのような評価を行うために、国際特許出願公開ＷＯ００／４２５６１に記載される方法によって作製されたライブラリーの構成体における配列変化および得られる酵素活性を、米国特許出願第１０／３７９，３７８号（２００３年３月３日出願、発明の名称：「機能的生体分子を同定するための方法、システムおよびソフトウエア」、これは参照として本明細書中に組み込まれる）に開示される方法を使用して評価した。この方法に基づいて、活性に好都合に相関すると考えられる特定の位置における重要な残基をコードするコドンが特定され、続いて作製されたコンビナトリアルライブラリーのポリヌクレオチドに取り込まれた。すなわち、所望する変化をコードするポリヌクレオチドを作製し、発現させて、スクリーニングした。この方法は、スクリーニングでの当たり体の生じた配列および酵素活性に再び適用される。その結果は、その次のライブラリーにプログラム化するための、酵素活性を高めるそのような残基変化を選択するために再び利用される。この方法を使用することにより、様々な配列変化の機能性（および、特徴付けされていないが、同様に、潜在的な構造的変化）が直ちに評価される。野生型ＨＨＤＨと比較して高まった酵素活性をもたらす様々な残基位置における残基変化が、特定された位置における好ましい残基として、配列において、また、他のところで本明細書中に開示される。

ＨＨＤＨ活性の存在を示すそのような改変体は、実施例５Ａに記載される定量的ＨＨＤＨアッセイでさらに特徴付けすることができる。生成物シアノヒドリンの存在下で、例えば、（Ｒ）−４−シアノ−３−ヒドロキシ酪酸エチルの存在下でＨＨＤＨ活性を示す改変体を、実施例５Ｂに記載されるアッセイを使用してさらに特徴付けすることができる。実施例５Ｂには、生成物阻害に関して影響を受けない酵素についてアッセイするためのプロトコルが記載される。従って、改変体のライブラリーを、実際のプロセス条件を模倣する条件下で活性であるＨＨＤＨポリペプチドを同定するために容易にスクリーニングし、アッセイすることができる。本発明は、実施例５Ｂに記載されるアッセイにおいて、生成物の（Ｒ）−４−シアノ−３−ヒドロキシ酪酸エチルの存在下でさえ、有意な活性な示すＨＨＤＨポリペプチドを提供する（例えば、配列番号９８、配列番号１００、配列番号１０２、配列番号１０４、配列番号１０６、配列番号１０８、配列番号１２０、配列番号１２２、配列番号１２４、配列番号１２６、配列番号１２８、配列番号１３０、配列番号１３２、配列番号１３６、配列番号１３８、配列番号１４０、配列番号１４２、配列番号１４４、配列番号１４６、配列番号１４８、配列番号１５０、配列番号１５２、配列番号１６０、配列番号１７４、配列番号１７６、配列番号１７８、配列番号１８８、配列番号１９０、配列番号１９２、配列番号１９４、配列番号１９６、配列番号１９８、配列番号２００、配列番号２０２、配列番号２０４、配列番号２０６、配列番号２０８、配列番号２１０、配列番号２１２、配列番号２１４、配列番号２１６、配列番号２１８、配列番号２２０、配列番号２２２、配列番号２２４、配列番号２２６、配列番号２２８、配列番号２３０、配列番号２３２、配列番号２３４、配列番号２３６、配列番号２３８、配列番号２４０、配列番号２４２、配列番号２４４、配列番号２４６、配列番号２４８、配列番号２５０、配列番号２５２、配列番号２５４、配列番号２５６、配列番号２５８、配列番号２６０、配列番号２７６、配列番号２７８、配列番号２８０、配列番号２８２、配列番号２８４、配列番号２８６、配列番号２８８、配列番号２９０、配列番号２９２、配列番号２９４、配列番号２９６、配列番号３００、配列番号３０２、配列番号３０４、配列番号３０６、配列番号３０８、配列番号３１０、配列番号３１２、配列番号３１４、配列番号３１６、配列番号３１８、配列番号３２０、配列番号３２２、配列番号３２４、配列番号３２６、配列番号３２８、配列番号３３０、配列番号３３２、配列番号３３４、配列番号３３６、配列番号３３８、配列番号３４０、配列番号３４２、配列番号３４４、配列番号３４６、配列番号３４８、配列番号３５０、配列番号３５２、配列番号３５４、配列番号３５６、配列番号３５８、配列番号３６０、配列番号３６２、配列番号３６４、配列番号３６６、配列番号３６８、配列番号３７０、配列番号３７２、配列番号３７４、配列番号３７６、配列番号３７８、配列番号３８０、配列番号３８２、配列番号３８４、配列番号３８６、配列番号３８８、配列番号３９０、配列番号３９２、配列番号３９４、配列番号３９６、配列番号３９８、配列番号４００、配列番号４０２、配列番号４０４、配列番号４０６、配列番号４０８、配列番号４１０、配列番号４１２、配列番号４１４、配列番号４１６、配列番号４１８、配列番号４２０、配列番号４２２、配列番号４２４、配列番号４２６、配列番号４２８、配列番号４３０、配列番号４３２、配列番号４３４、配列番号４３６、配列番号４３８、配列番号４４０、配列番号４４２、配列番号４４４、配列番号４４６、配列番号４４８、配列番号４５０、配列番号４５２、配列番号４５４、配列番号４５６、配列番号４５８、配列番号４６０、配列番号４６２、配列番号４６４、配列番号４６６、配列番号４６８、配列番号４７０、配列番号４７２、配列番号４７４、配列番号４７６、配列番号４７８、配列番号４８０、配列番号４８２、配列番号４８４、配列番号４８６、配列番号４８８、配列番号４９０、配列番号４９２、配列番号４９４、配列番号４９６、配列番号４９８、配列番号５００、配列番号５０２、配列番号５０４、配列番号５０６、配列番号５０８、配列番号５１０、配列番号５１２、配列番号５１４、配列番号５１６、配列番号５１８、配列番号５２０、配列番号５２２、配列番号５２４、配列番号５２６、配列番号５２８、配列番号５３０、配列番号５３２、配列番号５３４、配列番号５３６、配列番号５３８、配列番号５４０、配列番号５４２、配列番号５４４、配列番号５４６、配列番号５４８、配列番号５５０、配列番号５５２、配列番号５５４、配列番号５５６、配列番号５５８、配列番号５６０、配列番号５６２、配列番号５６４、配列番号５６６、配列番号５６８、配列番号５７０、配列番号５７２、配列番号５７４、配列番号５７６、配列番号５７８、配列番号５８０、配列番号５８２、配列番号５８４、配列番号５８６、配列番号５８８、配列番号５９０、配列番号５９２、配列番号５９４、配列番号５９６、配列番号５９８、配列番号６００、配列番号６０２、配列番号６０４、配列番号６０６、配列番号６０８、配列番号６１０、配列番号６１２、配列番号６１４、配列番号６１６、配列番号６１８、配列番号６２０、配列番号６２２、配列番号６２４、配列番号６２６、配列番号６２８、配列番号６３０、配列番号６３２、配列番号６３４、配列番号６３６、配列番号６３８、配列番号６４０、配列番号６４２、配列番号６４４、配列番号６４６、配列番号６４８、配列番号６５０、配列番号６５２、配列番号６５４、配列番号６５６、配列番号６５８、配列番号６６０、配列番号６６２、配列番号６６４、配列番号６６６、配列番号６６８、配列番号６７０、配列番号６７２、配列番号６７４、配列番号６７６、配列番号６７８、配列番号６８０、配列番号６８２、配列番号６８４、配列番号６８６、配列番号６８８、配列番号６９０、配列番号６９２、配列番号６９４、配列番号６９６、配列番号６９８、配列番号７００、配列番号７０２、配列番号７０４、配列番号７０６、配列番号７０８、配列番号７１０、配列番号７１２、配列番号７１４、配列番号７１６、配列番号７１８、配列番号７２０、配列番号７２２、配列番号７２４、配列番号７２６、配列番号７２８、配列番号７３０、配列番号７３２、配列番号７３４、配列番号７３６、配列番号７３８、配列番号７４０または配列番号７４２）。実施例５Ｂのアッセイにおいて（Ｓ）−４−クロロ−３−ヒドロキシ酪酸エチルを（Ｒ）−４−シアノ−３−ヒドロキシ酪酸エチルに変換する能力を示すポリペプチドはまた実施例５ＡのアッセイにおいてＨＨＤＨ活性を明らかにすると考えられる。

改変体のライブラリーを作製するための様々な方法がこの分野では広く知られている。例えば、変異誘発法および指向性進化法を、本明細書中に記載される方法を使用して発現させ、スクリーニングし、かつ、アッセイすることができる改変体のライブラリーを作製するために、ポリヌクレオチド（例えば、野生型ＨＨＤＨをコードするポリヌクレオチド、または本発明のポリヌクレオチドなど）に対して容易に適用することができる。様々な変異誘発法および指向性進化法がこの分野では広く知られている。例えば、下記を参照のこと：Ｌｉｎｇら、”Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ ｔｏ ＤＮＡ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ：ａｎ ｏｖｅｒｖｉｅｗ”、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２５４（２）：１５７〜７８（１９９７）；Ｄａｌｅら、”Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｒａｎｄｏｍ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ ｍｅｔｈｏｄ”、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、５７：３６９〜７４（１９９６）；Ｓｍｉｔｈ、”Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ”、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．、１９：４２３〜４６２（１９８５）；Ｂｏｔｓｔｅｉｎら、”Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ”、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２９：１１９３〜１２０１（１９８５）；Ｃａｒｔｅｒ、”Ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ”、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．、２３７：１〜７（１９８６）；Ｋｒａｍｅｒら、”Ｐｏｉｎｔ Ｍｉｓｍａｔｃｈ Ｒｅｐａｉｒ”、Ｃｅｌｌ、３８：８７９〜８８７（１９８４）；Ｗｅｌｌｓら、”Ｃａｓｓｅｔｔｅ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ：ａｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ａｔ ｄｅｆｉｎｅｄ ｓｉｔｅｓ”、Ｇｅｎｅ、３４：３１５〜３２３（１９８５）；Ｍｉｎｓｈｕｌｌら、”Ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｂｙ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｒｅｅｄｉｎｇ”、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ、３：２８４〜２９０（１９９９）；Ｃｈｒｉｓｔｉａｎｓら、”Ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ ｆｏｒ ＡＺＴ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ＤＮＡ ｆａｍｉｌｙ ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ”、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１７：２５９〜２６４（１９９９）；Ｃｒａｍｅｒｉら、”ＤＮＡ ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ ｏｆ ａ ｆａｍｉｌｙ ｏｆ ｇｅｎｅｓ ｆｒｏｍ ｄｉｖｅｒｓｅ ｓｐｅｃｉｅｓ ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｓ ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ”、Ｎａｔｕｒｅ、３９１：２８８〜２９１；Ｃｒａｍｅｒｉら、”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ ａｒｓｅｎａｔｅ ｄｅｔｏｘｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｐａｔｈｗａｙ ｂｙ ＤＮＡ ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ”、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１５：４３６〜４３８（１９９７）；Ｚｈａｎｇら、”Ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｆｕｃｏｓｉｄａｓｅ ｆｒｏｍ ａ ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ ｂｙ ＤＮＡ ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ ａｎｄ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ”、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓｓ，Ｕ．Ｓ．Ａ．、９４：４５−４−４５０９；Ｃｒａｍｅｒｉら、”Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｂｙ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ＤＮＡ ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ”、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１４：３１５〜３１９（１９９６）；Ｓｔｅｍｍｅｒ、”Ｒａｐｉｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｂｙ ＤＮＡ ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ”、Ｎａｔｕｒｅ、３７０：３８９〜３９１（１９９４）；Ｓｔｅｍｍｅｒ、”ＤＮＡ ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ ｂｙ ｒａｎｄｏｍ ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｅａｓｓｅｍｂｌｙ：Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ”、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｕ．Ｓ．Ａ．、９１：１０７４７〜１０７５１（１９９４）；国際特許出願公開ＷＯ９５／２２６２５；国際特許出願公開ＷＯ９７／００７８；国際特許出願公開ＷＯ９７／３５９６６；国際特許出願公開ＷＯ９８／２７２３０；国際特許出願公開ＷＯ００／４２６５１；および国際特許出願公開ＷＯ０１／７５７６７。

別の実施形態において、本発明はまた、実施例５ＡのアッセイにおいてＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．の（野生型）ＨＨＤＨ（配列番号２）の活性より少なくとも１．４倍大きいＨＨＤＨ活性を有する本明細書中に記載されるＨＨＤＨポリペプチドのフラグメントを提供する。本明細書中で使用される用語「フラグメント」は、カルボキシ末端、アミノ末端または両方からの１個〜５個のアミノ酸残基の欠失を有するポリペプチドを示す。好ましくは、欠失はカルボキシ末端からの１個〜５個の残基である。

（ＨＨＤＨポリヌクレオチド）
本発明は、本発明のＨＨＤＨポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。本発明の具体的な実施形態において、ＨＨＤＨポリヌクレオチドは、配列番号１に対応する核酸の実質的に全長にわたってストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸を含み、この場合、ＨＨＤＨポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドは、配列番号２と最適に整列された場合、２位の（残基）位置におけるＴ、３位におけるＡまたはＰまたはＳ、４位におけるＶ、６位におけるＤ、９位におけるＩまたはＦのいずれか、１０位におけるＬ、１３位におけるＳ、１４位におけるＳ、１５位におけるＫ、１６位におけるＣ、１７位におけるＴまたはＲ、２０位におけるＣまたはＳまたはＫのいずれか、２４位におけるＴ、２６位におけるＱ、２８位におけるＦ、２９位におけるＴ、３０位におけるＡ、３１位におけるＬ、３３位におけるＧ、３４位におけるＲ、３５位におけるＬ、３６位におけるＮ、３７位におけるＨ、４０位におけるＤ、４４位におけるＬ、４５位におけるＰ、４７位におけるＰまたはＡのいずれか、５２位におけるＮ、５４位におけるＶ、５５位におけるＲ、５６位におけるＤ、５８位におけるＫ、６１位におけるＧまたはＤ、６３位におけるＶ、７２位におけるＲ、７５位におけるＩ、７６位におけるＰ、７８位におけるＣ、８２位におけるＹ、８４位におけるＳまたはＬのいずれか、８５位におけるＡ、９１位におけるＥ、９３位におけるＤ、９５位におけるＱまたはＧ、９６位におけるＮ、１０７位におけるＫ、１１２位におけるＡ、１１４位におけるＴ、ＳまたはＧのいずれか、１１５位におけるＡ、１１７位におけるＰ、１２０位におけるＮ、１２１位におけるＥ、１２２位におけるＰ、１２６位におけるＲ、１３０位におけるＶ、１３３位におけるＳ、１３４位におけるＡまたはＶ、１３６位におけるＬ、ＷまたはＶ、１３９位におけるＨ、１４２位におけるＩまたはＲ、１４４位におけるＳ、１４６位におけるＳ、１５２位におけるＴ、１５３位におけるＳ、１５４位におけるＳまたはＡのいずれか、１６８位におけるＶ、１６９位におけるＴ、１７７位におけるＦ、１７８位におけるＶ、１８０位におけるＩ、１８１位におけるＧまたはＩ、１８４位におけるＫ、１８６位におけるＹ、１９４位におけるＬ、１９８位におけるＮ、１９９位におけるＭ、２１５位におけるＥ、２３６位におけるＧ、２３７位におけるＶ、２３８位におけるＬ、２４０位におけるＴ、２４５位におけるＩまたはＡまたはＶのいずれか、２４９位におけるＹ、２５２位におけるＶまたはＩ、および、２５４位におけるＶからなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基を有するアミノ酸配列を含む。本発明はまた、大腸菌における発現のためにコドン最適化されているＨＨＤＨポリヌクレオチド（配列番号１）を提供する。このコドン最適化されたポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドは、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．に由来するＨＨＤＨポリペプチド（配列番号２）に対応する。

加えて、本発明は、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５５、配列番号５７、配列番号５９、配列番号６１、配列番号６３、配列番号６５、配列番号６７、配列番号６９、配列番号７１、配列番号７３、配列番号７５、配列番号７７、配列番号７９、配列番号８１、配列番号８３、配列番号８５、配列番号８７、配列番号８９、配列番号９１、配列番号９３、配列番号９５、配列番号９７、配列番号９９、配列番号１０１、配列番号１０３、配列番号１０５、配列番号１０７、配列番号１０９、配列番号１１１、配列番号１１３、配列番号１１５、配列番号１１７、配列番号１１９、配列番号１２１、配列番号１２３、配列番号１２５、配列番号１２７、配列番号１２９、配列番号１３１、配列番号１３３、配列番号１３５、配列番号１３７、配列番号１３９、配列番号１４１、配列番号１４３、配列番号１４５、配列番号１４７、配列番号１４９、配列番号１５１、配列番号１５３、配列番号１５５、配列番号１５７、配列番号１５９、配列番号１６１、配列番号１６３、配列番号１６５、配列番号１６７、配列番号１６９、配列番号１７１、配列番号１７３、配列番号１７５、配列番号１７７、配列番号１７９、配列番号１８１、配列番号１８３、配列番号１８５、配列番号１８７、配列番号１８９、配列番号１９１、配列番号１９３、配列番号１９５、配列番号１９７、配列番号１９９、配列番号２０１、配列番号２０３、配列番号２０５、配列番号２０７、配列番号２０９、配列番号２１１、配列番号２１３、配列番号２１５、配列番号２１７、配列番号２１９、配列番号２２１、配列番号２２３、配列番号２２５、配列番号２２７、配列番号２２９、配列番号２３１、配列番号２３３、配列番号２３５、配列番号２３７、配列番号２３９、配列番号２４１、配列番号２４３、配列番号２４５、配列番号２４７、配列番号２４９、配列番号２５１、配列番号２５３、配列番号２５５、配列番号２５７、配列番号２５９、配列番号２６１、配列番号２６３、配列番号２６５、配列番号２６７、配列番号２６９、配列番号２７１、配列番号２７３、配列番号２７５、配列番号２７７、配列番号２７９、配列番号２８１、配列番号２８３、配列番号２８５、配列番号２８７、配列番号２８９、配列番号２９１、配列番号２９３、配列番号２９５、配列番号２９７、配列番号２９９、配列番号３０１、配列番号３０３、配列番号３０５、配列番号３０７、配列番号３０９、配列番号３１１、配列番号３１３、配列番号３１５、配列番号３１７、配列番号３１９、配列番号３２１、配列番号３２３、配列番号３２５、配列番号３２７、配列番号３２９、配列番号３３１、配列番号３３３、配列番号３３５、配列番号３３７、配列番号３３９、配列番号３４１、配列番号３４３、配列番号３４５、配列番号３４７、配列番号３４９、配列番号３５１、配列番号３５３、配列番号３５５、配列番号３５７、配列番号３５９、配列番号３６１、配列番号３６３、配列番号３６５、配列番号３６７、配列番号３６９、配列番号３７１、配列番号３７３、配列番号３７５、配列番号３７７、配列番号３７９、配列番号３８１、配列番号３８３、配列番号３８５、配列番号３８７、配列番号３８９、配列番号３９１、配列番号３９３、配列番号３９５、配列番号３９７、配列番号３９９、配列番号４０１、配列番号４０３、配列番号４０５、配列番号４０７、配列番号４０９、配列番号４１１、配列番号４１３、配列番号４１５、配列番号４１７、配列番号４１９、配列番号４２１、配列番号４２３、配列番号４２５、配列番号４２７、配列番号４２９、配列番号４３１、配列番号４３３、配列番号４３５、配列番号４３７、配列番号４３９、配列番号４４１、配列番号４４３、配列番号４４５、配列番号４４７、配列番号４４９、配列番号４５１、配列番号４５３、配列番号４５５、配列番号４５７、配列番号４５９、配列番号４６１、配列番号４６３、配列番号４６５、配列番号４６７、配列番号４６９、配列番号４７１２、配列番号４７３、配列番号４７５、配列番号４７７、配列番号４７９、配列番号４８１、配列番号４８３、配列番号４８５、配列番号４８７、配列番号４８９、配列番号４９１、配列番号４９３、配列番号４９５、配列番号４９７、配列番号４９９、配列番号５０１、配列番号５０３、配列番号５０５、配列番号５０７、配列番号５０９、配列番号５１１、配列番号５１３、配列番号５１５、配列番号５１７、配列番号５１９、配列番号５２１、配列番号５２３、配列番号５２５、配列番号５２７、配列番号５２９、配列番号５３１、配列番号５３３、配列番号５３５、配列番号５３７、配列番号５３９、配列番号５４１、配列番号５４３、配列番号５４５、配列番号５４７、配列番号５４９、配列番号５５１、配列番号５５３、配列番号５５５、配列番号５５７、配列番号５５９、配列番号５６１、配列番号５６３、配列番号５６５、配列番号５６７、配列番号５６９、配列番号５７１、配列番号５７３、配列番号５７５、配列番号５７７、配列番号５７９、配列番号５８１、配列番号５８３、配列番号５８５、配列番号５８７、配列番号５８９、配列番号５９１、配列番号５９３、配列番号５９５、配列番号５９７、配列番号５９９、配列番号６０１、配列番号６０３、配列番号６０５、配列番号６０７、配列番号６０９、配列番号６１１、配列番号６１３、配列番号６１５、配列番号６１７、配列番号６１９、配列番号６２１、配列番号６２３、配列番号６２５、配列番号６２７、配列番号６２９、配列番号６３１、配列番号６３３、配列番号６３５、配列番号６３７、配列番号６３９、配列番号６４１、配列番号６４３、配列番号６４５、配列番号６４７、配列番号６４９、配列番号６５１、配列番号６５３、配列番号６５５、配列番号６５７、配列番号６５９、配列番号６６１、配列番号６６３、配列番号６６５、配列番号６６７、配列番号６６９、配列番号６７１、配列番号６７３、配列番号６７５、配列番号６７７、配列番号６７９、配列番号６８１、配列番号６８３、配列番号６８５、配列番号６８７、配列番号６８９、配列番号６９１、配列番号６９３、配列番号６９５、配列番号６９７、配列番号６９９、配列番号７０１、配列番号７０３、配列番号７０５、配列番号７０７、配列番号７０９、配列番号７１１、配列番号７１３、配列番号７１５、配列番号７１７、配列番号７１９、配列番号７２１、配列番号７２３、配列番号７２５、配列番号７２７、配列番号７２９、配列番号７３１、配列番号７３３、配列番号７３５、配列番号７３９および配列番号７４１に対応する具体的なポリヌクレオチドを提供する。

当業者は、遺伝暗号の縮重性のために、本発明のＨＨＤＨポリペプチドをコードする多数のヌクレオチド配列が存在することを容易に理解するであろう。表Ｉは、各アミノ酸についての同義的コドンを提供するコドン表である。例えば、ＡＧＡ、ＡＧＧ、ＣＧＡ、ＣＧＣ、ＣＧＧおよびＣＧＵのコドンはすべてがアミノ酸のアルギニンをコードする。従って、アルギニンがいずれかのコドンによって指定される本発明の核酸におけるすべての位置において、そのコドンを、コードされるポリペプチドを変化させることなく、上記の対応するコドンのいずれかに変更することができる。ＲＮＡ配列におけるＵはＤＮＡ配列におけるＴに対応することが理解される。

（表１：コドン表）

そのような「サイレントな変化」は「保存的」変化の１つの化学種である。当業者は、核酸における各コドン（通常の場合にはメチオニンに対する唯一のコドンであるＡＵＧを除く）が、機能的に同一のポリペプチドをコードするように、標準的な技術によって改変され得ることを認識するであろう。従って、ポリペプチドをコードする核酸のサイレントな改変体のそれぞれが任意の記載された配列において暗示される。本発明は、可能なコドン選択に基づいて組合せを選択することによって作製することができる、本発明のポリペプチドをコードする核酸配列のありとあらゆる可能な変化を意図し、かつ、そのような変化を提供する。これらの組合せは、本発明のポリヌクレオチド配列に適用されるような、（表１に示される）標準的なトリプレット遺伝暗号に従って作製される。

同じ文脈で翻訳されたとき、すべてが同じアミノ酸をコードする２つ以上の異なるコドンの一群は、本明細書中では、「同義的コドン」と呼ばれる。本発明のＨＨＤＨポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドを改変して、所望の宿主生物の最適なコドン使用と一致させることによって、特定の宿主生物における発現のためにコドン最適化することができる。当業者は、広範囲の様々な生物についてのえり好み情報を提供する様々な表および他の参考文献が容易に利用可能であることを認識する。例えば、ＨｅｎａｕｔおよびＤａｎｃｈｉｎ、”Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ａｎｄ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ”（Ｎｅｉｄｈａｒｄｔら編、ＡＳＭ Ｐｒｅｓ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ．（１９９６）、ｐｐ．２０４７〜２０６６）を参照のこと。

本発明の例示的なＨＨＤＨ改変体ポリヌクレオチド配列が配列番号３１として提供され、これは大腸菌において良好に発現する。このポリヌクレオチドは、配列番号２に対応するポリペプチドを、配列番号１（すなわち、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．に由来する天然型ＨＨＤＨをコードするＨＨＤＨコードポリヌクレオチド）から発現される量よりも約４．５倍大きいレベルで大腸菌から発現する配列番号１の改変体である。

本発明のいくつかの実施形態において、下記の残基が本発明のＨＨＤＨポリペプチドにおいて用いられるときには、特定のコドンが好まれる：５位のアミノ酸位置においてイソロイシンをコードするＡＴＴ、３６位のアミノ酸位置においてリジンをコードするＡＡＧ、６３位のアミノ酸位置においてイソロイシンをコードするＡＴＴ、９５位のアミノ酸位置においてグルタミン酸をコードするＧＡＧ、および、１８８位のアミノ酸位置においてプロリンをコードするＣＣＣ。上記に示されたアミノ酸位置は、本発明のＨＨＤＨポリペプチドが配列番号２と整列された場合の配列番号２における対応するアミノ酸位置である。

用語「保存的に改変された変化」および用語「保存的変化」は、同一のアミノ酸配列または本質的に同一のアミノ酸配列をコードするそのような核酸を示すために本明細書中では交換可能に使用され、あるいは、核酸がコード配列でない状況では、この用語は、同一である核酸を示す。当業者は、コードされた配列において１個だけのアミノ酸または少ない割合のアミノ酸を変化させ、または付加し、または欠失する個々の置換、欠失または付加が、そのような変化が下記の１つ以上を生じさせる場合には、保存的に改変された変化であると見なされることを認識する：アミノ酸の欠失、アミノ酸の付加、または、化学的に類似するアミノ酸によるアミノ酸の置換。２つ以上のアミノ酸が影響を受けるとき、その割合は、典型的には、コードされた配列の長さにわたってアミノ酸残基の５％未満であり、より典型的には２％未満である。互いに保存的置換と見なされるアミノ酸を提供する様々な参考文献がこの分野では広く知られている。

保存的置換の様々な例が、塩基性アミノ酸（アルギニン、リジンおよびヒスチジン）、酸性アミノ酸（グルタミン酸およびアスパラギン酸）、極性アミノ酸（グルタミンおよびアスパラギン）、疎水性アミノ酸（ロイシン、イソロイシンおよびバリン）、芳香族アミノ酸（フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシン）および小型アミノ酸（グリシン、アラニン、セリン、トレオニン、プロリン、システインおよびメチオニン）の群の中においてである。比活性を一般には変化させないアミノ酸置換がこの分野では知られており、例えば、Ｈ．ＮｅｕｒａｔｈおよびＲ．Ｌ．Ｈｉｌｌ（１９７９）によって、”Ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ”（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）に記載される。最も一般的に存在する交換は、Ａｌａ／Ｓｅｒ、Ｖａｌ／Ｉｌｅ、Ａｓｐ／Ｇｌｕ、Ｔｈｒ／Ｓｅｒ、Ａｌａ／Ｇｌｙ、Ａｌａ／Ｔｈｒ、Ｓｅｒ／Ａｓｎ、Ａｌａ／Ｖａｌ、Ｓｅｒ／Ｇｌｙ、Ｔｙｒ／Ｐｈｅ、Ａｌａ／Ｐｒｏ、Ｌｙｓ／Ａｒｇ、Ａｓｐ／Ａｓｎ、Ｌｅｕ／Ｉｌｅ、Ｌｅｕ／Ｖａｌ、Ａｌａ／ＧｌｕおよびＡｓｐ／Ｇｌｙ、ならびに、これらの逆である。

本発明のＨＨＤＨポリペプチドの保存的に置換された変化は、同じ保存的置換群の保存的に選択されたアミノ酸によるポリペプチド配列のアミノ酸の少ない割合の置換、典型的には５％未満の置換、より典型的には２％未満の置換、多くの場合には１％未満の置換を含む。ＨＨＤＨポリヌクレオチドのコードされた活性を変化させない配列の付加、例えば、非機能的配列または非コード配列の付加などはＨＨＤＨポリヌクレオチドの保存的変化であると見なされる。

本発明のポリヌクレオチドは、この分野では広く知られている方法を使用して調製することができる。典型的には、約１２０塩基までのオリゴヌクレオチドが個々に合成され、その後、（例えば、酵素的もしくは化学的な連結方法、またはポリメラーゼ媒介による方法によって）連結されて、本質的には任意の所望する連続した配列が形成される。例えば、本発明のポリヌクレオチドは、例えば、自動化された合成方法で典型的には実施されているように、例えば、Ｂｅａｕｃａｇｅら（１９８１）（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ、２２：１８５９〜６９）によって記載される古典的なホスホルアミダイト法、または、Ｍａｔｔｈｅｓら（１９８４）（ＥＭＢＯ Ｊ．、３：８０１〜０５）によって記載される方法を使用する化学合成によって調製することができる。ホスホルアミダイト法に従って、オリゴヌクレオチドが、例えば、自動ＤＮＡ合成機で合成されて、精製され、アニーリングされ、連結されて、適切なベクターにクローン化される。

加えて、本質的には任意の核酸を様々な商業的供給元のいずれかから特注することができる：例えば、Ｔｈｅ Ｍｉｄｌａｎｄ Ｃｅｒｔｉｆｉｅｄ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｍｉｄｌａｎｄ、ＴＸ）、Ｔｈｅ Ｇｒｅａｔ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｇｅｎｅ Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｒａｍｏｎａ、ＣＡ）、ＥｘｐｒｅｓｓＧｅｎ Ｉｎｃ．（Ｃｈｉｃａｇｏ、ＩＬ）、Ｏｐｅｒｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．（Ａｌａｍｅｄａ、ＣＡ）など。

ポリヌクレオチドはまた、科学文献に記載されるような広く知られている技術によって合成することができる。例えば、Ｃａｒｒｕｔｈｅｒｓら、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．、４７：４１１〜４１８（１９８２）、および、Ａｄａｍｓら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１０５：６６１（１９８３）を参照のこと。その後、相補鎖を合成し、適切な条件下で鎖をアニーリングして一緒にすることによるか、または、適切なプライマー配列とともにＤＮＡポリメラーゼを使用して相補鎖を加えることによるかのいずれかによって、二本鎖ＤＮＡフラグメントを得ることができる。

本発明において有用な分子生物学的技術（これには、ベクターおよびプロモーターの使用、ならびに多くの他の関連項目が含まれる）を記載する一般的な教本には、ＢｅｒｇｅｒおよびＫｉｍｍｅｌ、Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、ｖｏｌｕｍｅ １５２ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ（Ｂｅｒｇｅｒ）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ Ｅｄ．）、Ｖｏｌ．１〜３、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８９（”Ｓａｍｂｒｏｏｋ”）、そして、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．およびＪｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．の共同事業（１９９９年以降増補されている）（”Ａｕｓｕｂｅｌ”）が含まれる。様々なインビトロ増幅方法、例えば、本発明の相同的核酸を作製するための、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、Ｑβレプリカーゼ増幅および他のＲＮＡポリメラーゼ媒介増幅（例えば、ＮＡＳＡＢ）をはじめとするインビトロ増幅方法によって当業者を導くために十分なプロトコルの例が下記に見出される：Ｂｅｒｇｅｒ、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、およびＡｕｓｕｂｅｌ、ならびに、Ｍｕｌｌｉｓら（１９８７）米国特許第４，６８３，２０２号；ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｉｎｎｉｓら編）、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ（１９９０）（Ｉｎｎｉｓ）；Ａｒｎｈｅｉｍ＆Ｌｅｖｉｎｓｏｎ（１９９０年１０月１日）、Ｃ＆ＥＮ ３６〜４７；Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ Ｏｆ ＮＩＨ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９９１）３、８１〜９４；（Ｋｗｏｈら（１９８９）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８６、１１７３；Ｇｕａｔｅｌｌｉら（１９９０）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８７、１８７４；Ｌｏｍｅｌｌら（１９８９）、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ、３５、１８２６；Ｌａｎｄｅｇｒｅｎら（１９８８）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４１、１０７７〜１０８０；Ｖａｎ Ｂｒｕｎｔ（１９９０）、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、８、２９１〜２９４；ＷｕおよびＷａｌｌａｃｅ（１９８９）、Ｇｅｎｅ、４、５６０；Ｂａｒｒｉｎｇｅｒら（１９９０）、Ｇｅｎｅ、８９、１１７、そして、ＳｏｏｋｎａｎａｎおよびＭａｌｅｋ（１９９５）、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１３：５６３〜５６４。インビトロ増幅された核酸をクローン化するための改善された方法が、Ｗａｌｌａｃｅらの米国特許第５，４２６，０３９号に記載される。大きい核酸をＰＣＲによって増幅するための改善された方法が、Ｃｈｅｎｇら（１９９４）、Ｎａｔｕｒｅ、３６９：６８４〜６８５、およびその引用参考文献にまとめられており、この方法では、４０ｋｂまでのＰＣＲアンプリコンが生じる。当業者は、本質的には任意のＲＮＡを、逆転写酵素およびポリメラーゼを使用して、制限消化、ＰＣＲ拡大および配列決定のために好適な二本鎖ＤＮＡに変換することができることを容易に理解する。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、およびＢｅｒｇｅｒを参照のこと（すべて、上記参照）。

（ベクター、プロモーターおよび発現システム）
本発明はまた、上記に幅広く記載されるようなＨＨＤＨポリヌクレオチドの１つ以上を含む組換え構築物を包含する。用語「構築物」または用語「核酸構築物」は、本明細書中では、一本鎖または二本鎖のいずれかであっても、天然に存在する遺伝子から単離されている核酸、または、そうでない場合には、自然界に存在しない様式で核酸のセグメントを含有するように改変されている核酸を示す。用語「核酸構築物」は、核酸構築物が、本発明のＨＨＤＨコード配列の発現のために要求される制御配列を含有するとき、用語「発現カセット」と同義的である。

本発明はまた、プロモーターに作動可能に連結された本発明のＨＨＤＨポリヌクレオチドを含む発現ベクターを提供する。実施例１には、ハロヒドリンデハロゲナーゼを発現させるための発現構築物を作製する方法が記載される。用語「制御配列」は、本明細書中では、本発明のポリペプチドの発現のために必要であるか、または好都合である成分のすべてを示す。それぞれの制御配列は、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に対して生来的または外来的であり得る。そのような制御配列は、リーダー、ポリアデニル化配列、プロペプチド配列、プロモーター、シグナルペプチド配列および転写ターミネーターを含むが、これらに限定されない。最低限でも、制御配列は、プロモーター、ならびに、転写停止シグナルおよび翻訳停止シグナルを含む。制御配列は、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列のコード領域との制御配列の連結を容易にする特異的な制限部位を導入するためのリンカーを備えることができる。

用語「作動可能に連結された（される）」は、本明細書中では、制御配列がポリペプチドの発現を導くように、制御配列がＤＮＡ配列のコード配列に対して所定位置に適切に設置されている（される）形態を示す。

本明細書中で使用されるとき、用語「コード配列」は、そのタンパク質生成物のアミノ酸配列を直接に指定するヌクレオチド配列を包含することが意図される。コード配列の境界は、ＡＴＧの開始コドンで通常の場合には始まるオープンリーディングフレームによって一般には決定される。コード配列は、典型的には、ＤＮＡ配列、ｃＤＮＡ配列および／または組換えヌクレオチド配列を含む。

本明細書中で使用される用語「発現」は、ポリペプチドの産生に関与する任意の段階を包含し、これには、転写、転写後修飾、翻訳、翻訳後修飾および分泌が含まれるが、これらに限定されない。

用語「発現ベクター」は、本明細書中では、本発明のポリペプチドをコードするセグメントを含み、かつ、その転写を規定するさらなるセグメントに機能的に連結されているＤＮＡ分子（線状または環状）を示す。

本明細書中で使用される用語「宿主細胞」は、核酸構築物による形質転換を受けやすい任意の細胞タイプを示す。

本発明の核酸構築物は、本発明の核酸配列が順方向または逆方向の向きで挿入されているベクター（例えば、プラスミド、コスミド、ファージ、ウイルス、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）など）を含む。この実施形態の好ましい形態において、構築物はさらに、配列に作動可能に連結された調節配列（これには、例えば、プロモーターが含まれる）を含む。非常に多数の好適なベクターおよびプロモーターが当業者には知られており、また市販されている。

本発明のポリヌクレオチドは、ポリペプチドを発現させるために好適な様々な発現ベクターの任意の１つに組み込むことができる。好適なベクターには、染色体配列、非染色体配列および合成ＤＮＡ配列、例えば、ＳＶ４０の誘導体；細菌プラスミド；ファージＤＮＡ；バキュロウイルス；酵母プラスミド；プラスミドおよびファージＤＮＡの組合せに由来するベクター；ウイルスＤＮＡ（例えば、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、偽狂犬病ウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、レトロウイルスなど）が含まれる。遺伝物質を細胞に形質導入し、また、複製が所望されるならば、適切な宿主細胞において複製可能かつ生存可能であるベクターはどれも使用することができる。

発現ベクターに組み込まれるとき、本発明のポリヌクレオチドは、ｍＲＮＡ合成を導くための適切な転写制御配列（プロモーター）に機能的に連結され、例えば、Ｔ５プロモーターに機能的に連結される。遺伝子組換え植物における使用のために特に適するそのような転写制御配列の例には、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）およびゴマノハグサモザイクウイルス（ＦＭＶ）が含まれる。原核生物細胞または真核生物細胞ならびにそれらのウイルスにおいて遺伝子の発現を制御することが知られている、本発明のいくつかの実施形態において使用することができる他のプロモーターには、ＳＶ４０プロモーター、大腸菌のｌａｃプロモーターまたはｔｒｐプロモーター、ファージラムダのＰ_Ｌプロモーター、ｔａｃプロモーター、およびＴ７プロモーターなどが含まれる。発現ベクターは、場合により、翻訳開始のためのリボソーム結合部位、および、転写ターミネーター（例えば、ＰｉｎＩＩなど）を含有する。ベクターはまた、場合により、発現を増幅するための適切な配列（例えば、エンハンサー）を含む。

加えて、本発明の発現ベクターは、形質転換された宿主細胞を選択するための表現型形質を提供するための１つ以上の選択マーカー遺伝子を場合により含有する。好適なマーカー遺伝子には、スペクチノマイシンまたはストレプトマイシンの抗生物質に対する耐性をコードする遺伝子（例えば、ａａｄａ遺伝子）、ストレプトマイシン耐性をコードするストレプトマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＳＰＴ）遺伝子、カナマイシン耐性またはゲンタマイシン耐性をコードするネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＮＰＴＩＩ）遺伝子、ヒグロマイシン耐性をコードするヒグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＨＰＴ）遺伝子が含まれる。さらなる選択マーカー遺伝子には、真核生物細胞培養のためのジヒドロ葉酸レダクターゼまたはネオマイシン耐性、および、大腸菌におけるテトラサイクリン耐性またはアンピシリン耐性が含まれる。

本発明のＨＨＤＨポリペプチドを発現させるための１つの例示的な発現ベクターが図１に示される。本発明のベクターは、適切な宿主を形質転換して、宿主が本発明のタンパク質またはポリペプチドを発現することができるようにするために用いることができる。適切な発現宿主の例には、細菌細胞、例えば、大腸菌、枯草菌およびストレプトミセス属細菌などが含まれる。細菌システムにおいて、数多くの発現ベクターを選択することができる（例えば、多機能な大腸菌クローニングベクターおよび発現ベクターなど）。

本発明のＨＨＤＨポリヌクレオチドはまた、例えば、細胞の所望する細胞区画、膜またはオルガネラにポリペプチド発現を標的化するために、あるいは、ポリペプチドの分泌を細胞周辺腔または細胞培養培地内に導くために、分泌／局在化配列をコードする核酸に読み枠を合わせて融合することができる。そのような配列は当業者には知られており、これらには、分泌リーダーペプチド、オルガネラ標的化配列（例えば、核局在化配列、小胞体（ＥＲ）保持シグナル、ミトコンドリア移行配列、葉緑体移行配列）、膜局在化／アンカー配列（例えば、膜透過停止配列、ＧＰＩアンカー配列）などが含まれる。

（発現宿主）
本発明はまた、本発明のベクターまたは構築物（例えば、本発明のクローニングベクターまたは本発明の発現ベクター）により形質導入（形質転換またはトランスフェクション）される操作された宿主細胞、ならびに、組換え技術による本発明のポリペプチドの産生に関連する。ベクターは、例えば、プラスミド、ウイルス粒子、ファージなどであり得る。宿主細胞は真核生物細胞（例えば、植物細胞など）が可能である。あるいは、宿主細胞は原核生物細胞（例えば、植物細胞など）が可能である。宿主細胞への構築物の導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、エレクトロポレーションまたは他の一般的な技術によって行うことができる（Ｄａｖｉｓ，Ｌ．、Ｄｉｂｎｅｒ，Ｍ．およびＢａｔｔｅｙ，Ｉ．（１９８６）、Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）。操作された宿主細胞は、プロモーターを活性化するために、形質転換体を選択するために、または、ＨＨＤＨポリヌクレオチドを増幅するために適切なように改変された従来の栄養培地において培養することができる。培養条件（例えば、温度およびｐＨなど）は、発現のために選択された宿主細胞とともに以前に使用された条件であり、当業者には明らかであり、また、本明細書中における引用参考文献（これには、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ａｕｓｕｂｅｌ、およびＢｅｒｇｅｒが含まれる）、ならびに、例えば、Ｆｒｅｓｈｎｅｙ（１９９４）、Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ，ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ（第３版、Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）、およびそれにおける引用参考文献において明らかである。

本発明のＨＨＤＨポリペプチドは、植物、酵母、菌類および細菌などの非動物細胞において産生させることができる。Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｂｅｒｇｅｒ、およびＡｕｓｕｂｅｌに加えて、非動物細胞の培養に関する詳細を下記に見出すことができる：Ｐａｙｎｅら（１９９２）、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ ｉｎ Ｌｉｑｕｉｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ；ＧａｍｂｏｒｇおよびＰｈｉｌｌｉｐｓ（編）（１９９５）、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ，Ｔｉｓｓｕｅ ａｎｄ Ｏｒｇａｎ Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｌａｂ Ｍａｎｕａｌ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ（Ｂｅｒｌｉｎ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）；そして、ＡｔｌａｓおよびＰａｒｋｓ（編）Ｔｈｅ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｄｉａ（１９９３）、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ、ＦＬ。宿主細胞は真核生物細胞（例えば、植物細胞など）が可能である。あるいは、宿主細胞は原核生物細胞（例えば、細菌細胞など）が可能である。宿主細胞への構築物の導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、エレクトロポレーションまたは他の一般的な技術によって行うことができる（Ｄａｖｉｓ，Ｌ．、Ｄｉｂｎｅｒ，Ｍ．およびＢａｔｔｅｙ，Ｉ．（１９８６）、Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）。

（精製のための融合ポリペプチド）
本発明のＨＨＤＨポリペプチドはまた、コードされるＨＨＤＨポリペプチドの精製を容易にするために、融合ポリペプチドの一部として発現させることができる。そのような融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、精製を容易にするドメインに読み枠を合わせて融合されている本発明のＨＨＤＨポリヌクレオチドに対応する核酸配列を含む。本明細書中で使用される用語「精製を容易にするドメイン」は、ドメインが融合されているポリペプチドの精製を媒介するドメインを示す。好適な精製ドメインには、金属にキレート化するペプチド、固定化された金属における精製を可能にするヒスチジン−トリプトファンモジュール、グルタチオンと結合する配列（例えば、ＧＳＴ）、ヘマグルチニン（ＨＡ）タグ（これは、インフルエンザのヘマグルチニンタンパク質に由来するエピトープに対応する；Ｗｉｌｓｏｎら（１９８４）、Ｃｅｌｌ、３７：７６７）、マルトース結合タンパク質配列、ＦＬＡＧ発現／アフィニティー精製システム（Ｉｍｍｕｎｅｘ Ｃｏｒｐ、Ｓｅａｔｔｌｅ、ＷＡ）において利用されるＦＬＡＧエピトープなどが含まれる。プロテアーゼ切断可能なポリペプチドリンカー配列を精製ドメインとＨＨＤＨポリペプチドとの間に含むことは、精製を容易にするために有用である。本明細書中に記載される組成物および方法における使用のために意図される１つの発現ベクターにより、エンテロキナーゼ切断部位によって隔てられるポリヒスチジン領域に融合された本発明のポリペプチドを含む融合タンパク質の発現がもたらされる。そのヒスチジン残基は、ＩＭＩＡＣ（固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィー；Ｐｏｒａｔｈら（１９９２）、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ３：２６３〜２８１に記載されるようなアフィニティークロマトグラフィー）での精製を容易にし、一方、エンテロキナーゼ切断部位は、ＨＨＤＨポリペプチドを融合タンパク質から分離するための手段を提供する。ｐＧＥＸベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ；Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）もまた、外来ポリペプチドをグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合タンパク質として発現させるために使用することができる。一般に、そのような融合タンパク質は可溶性であり、リガンド−アガロースビーズ（例えば、ＧＳＴ融合物の場合にはグルタチオン−アガロース）に吸着させ、続いて、遊離リガンドの存在下で溶出することによって、溶解した細胞から容易に精製することができる。

（ＨＨＤＨポリペプチドの産生および回収）
本発明はさらに、ＨＨＤＨポリペプチドを作製する方法を提供する。この場合、この方法は、（ａ）ＨＨＤＨポリヌクレオチドにより形質転換された宿主細胞を、ＨＨＤＨポリペプチドの産生のために好適な条件下で培養すること；および（ｂ）ＨＨＤＨポリペプチドを回収することを含む。典型的には、回収は、下記に記載される技術を含めて、この分野では広く知られているタンパク質回収技術を使用して、宿主細胞培養培地、宿主細胞または両方からである。

好適な宿主株の形質導入を行い、宿主株を適切な細胞密度に成長させた（培養した）後、選択されたプロモーターが適切な手段（例えば、温度変化または化学的誘導）によって誘導され、細胞がさらなる期間にわたって培養される。細胞は、典型的には、遠心分離によって集められ、物理的手段または化学的手段によって破壊され、得られた粗抽出物がさらなる精製のために保持される。タンパク質の発現において用いられる微生物細胞は、凍結解凍サイクル処理、超音波処理、機械的破壊、または細胞溶解剤の使用、または他の方法を含む、当業者には広く知られている任意の従来の方法によって破壊することができる。

記されたように、多くの参考文献が、細菌起源、植物起源、動物（特に哺乳動物）起源および古細菌起源の細胞を含めて、多くの細胞の培養および作製のために利用可能である。例えば、下記を参照のこと：Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ａｕｓｕｂｅｌ、およびＢｅｒｇｅｒ（すべて、上掲）、ならびに、Ｆｒｅｓｈｎｅｙ（１９９４）、Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ，ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ、第３版、Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、およびそれにおける引用参考文献；ＤｏｙｌｅおよびＧｒｉｆｆｉｔｈｓ（１９９７）、Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、ＮＹ；Ｈｕｍａｓｏｎ（１９７９）、Ａｎｉｍａｌ Ｔｉｓｓｕｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、第４版、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ；そして、Ｒｉｃｃｉａｒｄｅｌｌｉら（１９８９）、Ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．、２５：１０１６〜１０２４。植物細胞の培養および再生については、Ｐａｙｎｅら（１９９２）、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ ｉｎ Ｌｉｑｕｉｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ；ＧａｍｂｏｒｇおよびＰｈｉｌｌｉｐｓ（編）（１９９５）、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ，Ｔｉｓｓｕｅ ａｎｄ Ｏｒｇａｎ Ｃｕｌｔｕｒｅ；Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｌａｂ Ｍａｎｕａｌ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ（Ｂｅｒｌｉｎ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）；Ｊｏｎｅｓら（１９８４）、Ｐｌａｎｔ Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ、Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ；そして、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９３）、Ｒ．Ｒ．Ｄ．Ｃｒｏｙ編、Ｂｉｏｓ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、Ｕ．Ｋ．、ＩＳＢＮ ０１２１９８３７０６。細胞培養培地は、一般には、ＡｔｌａｓおよびＰａｒｋｓ（編）、Ｔｈｅ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｄｉａ（１９９３）（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ、ＦＬ）に示される。細胞培養のためのさらなる情報が下記の入手可能な商業的文献に見出される：例えば、Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃａｔａｌｏｇｕｅ（１９９８）（これはＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｉｎｃ（Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から得られる）（”Ｓｉｇｍａ−ＬＳＲＣＣＣ”）、ならびに、例えば、Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃａｔａｌｏｇｕｅおよび増補版（１９９７）（これらもまたＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｉｎｃ（Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から得られる）（”Ｓｉｇｍａ−ＰＣＣＳ”）。

本発明のＨＨＤＨポリペプチドは、硫酸アンモニウム沈殿または溶媒（例えば、エタノール、アセトンなど）沈殿、酸抽出、アニオン交換クロマトグラフィーまたはカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー（例えば、本明細書中に記されるようなタグ化システムのいずれかを使用するアフィニティークロマトグラフィー）、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィーをはじめとする、この分野では広く知られている数多くの方法のいずれかによって組換え細胞の培養物から回収および精製することができる。タンパク質折り畳み工程を、成熟タンパク質の立体配置を完成させる際に、所望に応じて使用することができる。最後に、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を最終精製工程で用いることができる。上記で記された参考文献に加えて、様々な精製方法がこの分野では広く知られており、これらには、例えば、下記に示される方法が含まれる：Ｓａｎｄａｎａ（１９９７）、Ｂｉｏｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．；そして、Ｂｏｌｌａｇら（１９９６）、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ，２^ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ、ＮＹ；Ｗａｌｋｅｒ（１９９６）、Ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｈａｎｄｂｏｏｋ、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、ＮＪ；ＨａｒｒｉｓおよびＡｎｇａｌ（１９９０）、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ ａｔ Ｏｘｆｏｒｄ、Ｏｘｆｏｒｄ、Ｅｎｇｌａｎｄ；ＨａｒｒｉｓおよびＡｎｇａｌ、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ ａｔ Ｏｘｆｏｒｄ、Ｏｘｆｏｒｄ、Ｅｎｇｌａｎｄ；Ｓｃｏｐｅｓ（１９９３）、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ３^ｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ、 Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ、ＮＹ；ＪａｎｓｏｎおよびＲｙｄｅｎ（１９９８）、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，Ｈｉｇｈ Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ、ＮＹ；そして、Ｗａｌｋｅｒ（１９９８）、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｏｎ ＣＤ−ＲＯＭ、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、ＮＪ。

場合により、本発明のＨＨＤＨポリペプチドを、工業的および／または商業的な適用のために好適な大規模で製造することが望ましい場合がある。そのような場合、大量発酵法が用いられる。ＨＨＤＨポリペプチドを製造するための１つの例示的な大量発酵法が実施例２に提供される。簡単に記載すると、ＨＨＤＨポリヌクレオチドが、例えば、図１に示されるベクター（ＰＣＫ１１０７００）などの発現ベクターにクローン化される。目的とするポリヌクレオチドをベクターに挿入した後、ベクターは、標準的な方法を使用して、大腸菌ＴＯＰ１０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）による継代の後、例えば、大腸菌ＢＬ２１（Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）などの細菌宿主に形質転換される。

形質転換された宿主細胞は、この分野で知られている方法を使用してポリペプチドの産生のために好適な栄養培地において培養される。例えば、細胞は、ポリペプチドを発現させ、かつ／または単離することを可能にする好適な培地において、また、そのような条件下で行われる振とうフラスコ培養、および、研究室発酵装置または工業的発酵装置における小規模または大規模な発酵（これには、連続発酵、回分発酵、流加回分発酵または固体発酵が含まれる）によって培養することができる。培養は、この分野で知られている手法を使用して、炭素源および窒素源ならびに無機塩を含む好適な栄養培地において行われる。様々な好適な培地を商業的供給元から入手することができ、または、発表された組成（例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎのカタログにおける組成）に従って調製することができる。分泌されたポリペプチドは栄養（培養）培地から直接に回収することができる。

生じたポリペプチドは、この分野で知られている方法によって単離することができる。例えば、ポリペプチドは、遠心分離、ろ過、抽出、噴霧乾燥、エバポレーションまたは沈殿化（これらに限定されない）をはじめとする従来の手法によって栄養培地から単離することができる。単離されたポリペプチドは、その後、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、アフィニティー、疎水性、クロマトフォーカシングおよびサイズ排除）、電気泳動的手法（例えば、調製用等電点フォーカシング）、溶解度差（例えば、硫酸アンモニウム沈殿）または抽出（これらに限定されない）をはじめとするこの分野で知られている様々な手法によってさらに精製することができる（例えば、下記を参照のこと：Ｂｏｌｌａｇら（１９９６）、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ，２^ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ、ＮＹ；Ｗａｌｋｅｒ（１９９６）、Ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｈａｎｄｂｏｏｋ、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、ＮＪ；Ｂｏｌｌａｇら（１９９６）、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ，２^ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ、ＮＹ；Ｗａｌｋｅｒ（１９９６）、Ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｈａｎｄｂｏｏｋ、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、ＮＪ）。ＨＨＤＨポリペプチドを細胞溶解物から回収するための手法が実施例３に例示される。

配列番号２の野生型ＨＨＤＨのｐＩは低すぎて、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）沈殿を使用して、ＨＨＤＨをＤＮＡから精製することができないかもしれないことが考えられる。出願人らは、ＰＥＩ沈殿による単離を可能にするために、しかし、ＨＨＤＨ酵素活性の喪失を伴うことなく、十分に高いｐＩを有する本発明のＨＨＤＨポリペプチドを産生させるために、配列番号２におけるアラインメントに対して下記の残基変化を行うことができることを発見している：Ｅ４０Ｑ，Ｋ、Ｅ４２Ｑ，Ｋ、Ｅ４６Ｑ，Ｋ、Ｅ５６Ｑ，Ｋ、Ｅ５８Ｑ，Ｋ、Ｅ６１Ｑ，Ｋ、およびＥ６４Ｑ，Ｋ。従って、別の実施形態において、本発明は、ＰＥＩ沈殿によって溶液から単離することができるＨＨＤＨポリペプチドに関し、この場合、ＨＨＤＨポリペプチドは、配列番号２と整列された場合、Ｅ４０Ｑ，Ｋ、Ｅ４２Ｑ，Ｋ、Ｅ４６Ｑ，Ｋ、Ｅ５６Ｑ，Ｋ、Ｅ５８Ｑ，Ｋ、Ｅ６１Ｑ，Ｋ、およびＥ６４Ｑ，Ｋからなる群より選択される残基変化の５つ以上を有する。例えば、ＰＥＩ沈殿は下記の配列番号７４４のＨＨＤＨポリペプチド：

に適用された。このポリペプチドは下記の配列番号７４３のポリヌクレオチド：

によってコードされる。

無細胞転写／翻訳システムもまた、本発明のポリヌクレオチドを使用してＨＨＤＨポリペプチドを産生させるために用いることができる。いくつかのそのようなシステムが市販されている。インビトロ転写プロトコルおよびインビトロ翻訳プロトコルのための一般的な指針が、Ｔｙｍｍｓ（１９９５）、Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（第３７巻、Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、ＮＹ）に見出される。

４−クロロアセト酢酸エチル（ＥＣＡＡ）は、（Ｓ）−４−クロロ−３−ヒドロキシ酪酸エチル（ＥＣＨＢ）を生じさせるためにＫＲＥＤ／ＧＤＨを使用する共役した還元反応のための基質である。ＥＣＨＢは、その後、ＨＨＤＨ反応のための基質として使用される。しかしながら、ＥＣＡＡ出発物質はＨＨＤＨの強力な阻害剤である（近似的Ｋ_ｉ＝７０μＭ）。ＫＲＥＤ／ＧＤＨにより触媒される反応は、所望する９９．９７％の代わりに、９９．９％の完了まで進行させることができるので、０．１％のＥＣＡＡがＥＣＨＢ物質中に残留し、この０．１％のＥＣＡＡがＨＨＤＨ反応を阻害し得る。すなわち、最初の反応に由来する残留基質が第２の反応における阻害剤である。従って、本発明のＨＨＤＨポリペプチドが、ＥＣＡＡによる阻害に対する抵抗性を有することが望ましい。

出願人らは、ＥＣＡＡによる阻害に対する増大した抵抗性を明らかにする本発明のＨＨＤＨポリペプチドを作製するために、配列番号２におけるアラインメントに対して下記の残基変化を行うことができることを発見している：Ａ４Ｖ、Ａ８２Ｙ、Ａ１３４Ｖ、Ｇ１３６Ｗ、Ｇ１３６Ｖ、Ｌ１４２Ｒ、Ｌ１７８Ｖ、Ｗ２３８Ｌ、Ａ２４０Ｔ、Ｗ２４９Ｙ、Ｍ２５２Ｉ。従って、別の実施形態において、本発明は、ＥＣＡＡによる阻害に対して抵抗性であるＨＨＤＨポリペプチドに関し、この場合、ＨＨＤＨポリペプチドは、配列番号２と整列された場合、Ａ４Ｖ、Ｆ８２Ｙ、Ｔ１３４Ｖ、Ｆ１３６Ｗ、Ｆ１３６Ｖ、Ｌ１４２Ｒ、Ｌ１７８Ｖ、Ｗ２３８Ｌ、Ａ２４０Ｔ、Ｗ２４９ＹおよびＭ２５２Ｉからなる群より選択される残基変化の１つ以上を有する。

本発明のＨＨＤＨポリペプチドをＥＣＡＡの存在下でのその反応性について試験するための方法が本明細書中において実施例５Ｃに開示される。実施例５Ｃからの反応生成物をスクリーニングし、かつ、生じた生成物の量を測定するためのガスクロマトグラフィー方法が、本明細書中、実施例６Ｂに開示される。

（ＨＨＤＨポリペプチドを使用する方法）
上記で記載されたように、本発明のＨＨＤＨポリペプチドは、４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸誘導体を、４位が求核試薬で置換された３−ヒドロキシ酪酸誘導体に変換することを触媒するために使用することができる。本発明の新規なハロヒドリンデハロゲナーゼはまた、国際特許出願公開ＷＯ０１／９０３９７（これはその全体が参照として本明細書中に組み込まれる）に開示される様式で、混合物をハロヒドリンデハロゲナーゼの存在下でアニオン性求核試薬と反応させることによって、鏡像異性体エポキシドの混合物を酵素分割するためのプロセスにおいて有用であり、この場合、酵素はエポキシド鏡像異性体の一方を求核試薬と優先的に反応させて、生じる鏡像異性体的に濃縮されたビシナル求核試薬置換アルコールと、もう一方の鏡像異性体において濃縮された未反応エポキシドとの混合物を形成する。

本発明の上記局面および他の局面が、下記の非限定的な実施例に関連してより良く理解され得る。

（実施例１）
（ハロヒドリンデハロゲナーゼを発現させるための発現構築物の構築）
Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．ハロヒドリンデハロゲナーゼに対する遺伝子を、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．から得られたハロヒドリンデハロゲナーゼのアミノ酸配列（配列番号２）に基づいて、大腸菌における発現のためにコドン最適化した（配列番号１）。遺伝子を、６０ｍｅｒのオリゴマーを使用して合成し、Ｔ５プロモーターの制御下で発現ベクターＰＣＫ１１０７００（図１に示される）にクローン化した。ベクターを大腸菌ＴＯＰ１０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）に形質転換し、この大腸菌ＴＯＰ１０から、プラスミドＤＮＡを、標準的な方法を使用して調製した。その後、プラスミドＤＮＡを、標準的な方法を使用して発現宿主の大腸菌ＢＬ２１（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）に形質転換した。活性なＨＨＤＨを発現するクローンが発現ライブラリーにおいて見出された。このクローンから得られた遺伝子を配列決定し（配列番号１（ＨＨＤＨ．１）を参照のこと）、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．のＨＨＤＨ（配列番号２）をコードすることを見出した。

本発明のハロヒドリンデハロゲナーゼをコードするポリヌクレオチドを、同様に、標準的な方法を使用してベクターＰＣＫ１１０７００（図１に示される）にクローン化し、その後、大腸菌ＴＯＰ１０による継代の後、形質転換し、大腸菌ＢＬ２１から発現させた。

（実施例２）
（ＨＨＤＨの産生）
通気撹拌型発酵装置において、０．５２８ｇ／Ｌの硫酸アンモニウム；７．５ｇ／Ｌのリン酸水素二カリウム三水和物；３．７ｇ／Ｌのリン酸二水素カリウム；２ｇ／ＬのＴａｓｔｏｎｅ−１５４酵母抽出物；０．０５ｇ／Ｌの硫酸第一鉄；および３ｍＬ／Ｌの微量元素溶液（これは、２ｇ／Ｌの塩化カルシウム二水和物、２．２ｇ／Ｌの硫酸亜鉛七水和物、０．５ｇ／Ｌの硫酸マンガン一水和物、１ｇ／Ｌの硫酸第一銅五水和物、０．１ｇ／Ｌのホウ酸ナトリウム十水和物および０．５ｇ／ＬのＥＤＴＡを含有する）を含有する１０．０Ｌの増殖培地を３０℃の温度にした。発酵装置に、実施例１で記載されるようなＨＨＤＨポリヌクレオチドを含有するプラスミドが与えられ、その後、ＬＢ、１％のグルコース（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）および３０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコール（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を含有する振とうフラスコで成長させた大腸菌ＢＬ２１（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）の後期指数培養物を、０．５〜２．０の６００ｎｍでの開始光学濃度（ＯＤ_６００）に接種した。発酵装置を５００ｒｐｍ〜１５００ｒｐｍで撹拌し、空気を１．０Ｌ／分〜１５．０Ｌ／分で発酵槽に供給して、３０％飽和以上の溶存酸素レベルを維持した。培養液のｐＨを２０％（ｖ／ｖ）の水酸化アンモニウムの添加によって７．０で制御した。培養が４０のＯＤ_６００に達した後、温度を３０℃で維持し、ハロヒドリンデハロゲナーゼの発現を、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を１ｍＭの最終濃度に添加することによって誘導した。培養物をさらに１５時間成長させた。誘導後、細胞を遠心分離によって集め、１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）により洗浄した。細胞ペーストを下工程の回収プロセスにおいてそのまま使用し、または、使用まで−８０℃で保存した。

（実施例３）
（酵素調製）
実施例２から得られた細胞ペーストを、１体積湿重量の細胞ペーストを３体積の１００ｍＭ Ｔｒｉｓ／硫酸（ｐＨ７．２）に懸濁し、その後、Ｓｏｒｖａｌ １２ＢＰにおける５０００ｇでの４０分間の遠心分離によって洗浄した。洗浄された細胞ペーストを２体積の１００ｍＭ Ｔｒｉｓ／硫酸（ｐＨ７．２）に懸濁した。細胞内のＨＨＤＨを、最初の通過については１４，０００ｐｓｉｇの圧力を使用し、２回目の通過については８，０００ｐｓｉｇの圧力を使用して懸濁物をホモジナイザーに２回通すことによって細胞から放出させた。細胞溶解物はホモジナイザーの通過の間で０℃に冷却された。溶解物を室温に暖め、その後、２．５ＭのＭｎＳＯ_４（５０ｍＭ〜３５０ｍＭの最終濃度）または１０％（ｗ／ｖ）のポリエチレンイミン（ＰＥＩ）溶液（ｐＨ７．２）（０．６％（ｗ／ｖ）〜１．０％（ｗ／ｖ）の最終濃度）を溶解物に加え、３０分間撹拌した。ホモジネートを、標準的な研究室遠心分離機で３０分間〜６０分間、５，０００ｇと１０，０００ｇとの間で遠心分離した。上清を限外ろ過によって脱塩し、濃縮して、底の浅い容器に分注し、−２０℃で凍結し、粉末に凍結乾燥して、粉末を−８０℃で保存した。

発酵後の調製物の性状を評価するために、発現したハロヒドリンデハロゲナーゼ酵素を含有する細胞溶解物を下記のプロトコルに従ってアッセイした。１００ｍＭのＴｒｉｓ／ＳＯ_４、１００ｍＭのＮａＣＮ（ｐＨ８．０）における清澄化された細胞溶解物の約５０μｌを、１０ｍＭの（Ｓ）−４−クロロ−３−ヒドロキシ酪酸エチル（ＥＣＨＢ）（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）と混合した。総反応体積は０．２ｍｌであった。反応液を室温で３０分間〜１時間インキュベーションした。反応液を７体積の酢酸エチルで抽出し、有機層を１．８ｍｌのガスクロマトグラフィー（ＧＣ）バイアルに取り出した。有機層を生成物の（Ｒ）−４−シアノ−３−ヒドロキシ酪酸エチルの存在についてＧＣによって分析した。生じた生成物の量を、同じ条件下で調製および分析された標準曲線との比較によって求めた。

（実施例４）
（ＨＨＤＨ活性の存在についてのハイスループットスクリーニング）
（Ａ．アガロース中にシアノヒドリンが存在しない場合）
下記のスクリーニングを、ＨＨＤＨ活性の存在を確認するために使用した。１日目に、２００ｍｌのＬＢ寒天＋１％のグルコース、３０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含有するＱトレー（Ｇｅｎｅｔｉｘ ＵＳＡ，Ｉｎｃ．、Ｂｅａｖｅｒｔｏｎ、ＯＲ）における新たに形質転換されたコロニーを、Ｑ−ｂｏｔ（登録商標）ロボットコロニー採取装置（Ｇｅｎｅｔｉｘ ＵＳＡ，Ｉｎｃ．、Ｂｅａｖｅｒｔｏｎ、ＯＲ）を使用して選び、培地（７０μＬ／ウエルの２ｘＹＴ＋１％のグルコース、３０μｇ／ｍｌのｃａｍ）を含有する底の浅い３８４ウエルＮｕｎｃプレート（Ｎａｌｇｅ Ｎｕｎｃ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、ＮＹ）に入れ、３０℃、２５０回転／分（ｒｐｍ）、８５％の相対湿度（ＲＨ）で一晩成長させた。陰性コントロール（空ベクターを有する大腸菌ＢＬ２１）および陽性コントロール（ＨＨＤＨ Ｍｚｌ／２Ｇ５（配列番号３１）を含有するベクターを有する大腸菌ＢＬ２１）を含めた。これらのマスターウエルプレート培養物をＡｉｒＰｏｒｅ（商標）微孔性テープ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．、Ｖａｌｅｎｃｉａ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）で覆った。

２日目に、マスタープレート培養物をナイロンメンブラン（Ｏｍｉｎｉｔｒａｙのために事前に切断されたＰａｌｌ Ｂｉｏｄｙｎｅ Ｂ Ｎｙｌｏｎ Ｍｅｍｂｒａｎｅ、１１５ｘ７６ｍｍ、Ｎａｌｇｅ Ｎｕｎｃ＃２５０３８５）に方眼状に置き、その後、２００ｍｌのＬＢ寒天＋１％のグルコース、３０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含有するＱトレー（Ｇｅｎｅｔｉｘ ＵＳＡ，Ｉｎｃ．、Ｂｅａｖｅｒｔｏｎ、ＯＲ）に載せた。Ｑトレーを、成長が検出されるまで、３０℃で８時間〜１２時間インキュベーションした。各ナイロンメンブランを、誘導培地（２００ｍｌのＬＢ寒天＋１ｍＭのＩＰＴＧ、３０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコール）を含有するＱトレーに移した。その後、Ｑトレーを２３℃または室温で一晩インキュベーションした。

３日目に、アッセイプレートを下記のように準備した。１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＳＯ_４（ｐＨ７．０）および１．０％の低融点アガロースの１５０ｍｌの溶液を調製し、約４５℃に冷却した。５ＭのＮａＣｌを加えて、５００ｍＭのＮａＣｌの最終濃度にした。ブロムクレゾールパープル（ＢＣＰ）および（Ｓ）−４−クロロ−３−ヒドロキシ酪酸エチル（ＥＣＨＢ）をそれぞれ０．００４％および０．３％の最終濃度に加えた。溶液を１５０ｍＬのＱトレーに注ぎ、固化させた。

コロニーを有するナイロンメンブランを、誘導培地を含有するＱトレーから取り出し、アッセイプレートに裏返しで置いた。メンブランを、Ａｌｐｈａ Ｉｍａｇｉｎｇ ＣｈｅｍＳｔａｔｉｏｎ（Ａｌｐｈａ Ｉｎｎｏｔｅｃｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｓａｎ Ｌｅａｎｄｒｏ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）（４の絞り設定）を４２０ｎｍ（＋／−１０ｎｍフィルター）とともに使用して、反転させたＱトレーを透過により画像化した。画像を、反応の最初の１時間の間、取得した。その後、それぞれの画像化されたスポットについての強度データを陰性コントロールのスポットの値に対して正規化した。１よりも大きい正規化された値により、ＨＨＤＨ活性の存在が示される。このスクリーニングから得られた活性なクローンを、実施例５Ａに記載される方法を使用してさらに特徴付けした。このスクリーニングから得られたクローンはまた、実施例５Ｂに記載される培地スループットアッセイを使用してさらに特徴付けすることができる。

（Ｂ．アガロース中にシアノヒドリンが存在する場合）
このハイスループットスクリーニングは、シアノヒドリン生成物の存在下で、例えば、（Ｒ）−４−シアノ−３−ヒドロキシ酪酸エチルの存在下でＨＨＤＨ活性を示すＨＨＤＨポリペプチドについてスクリーニングすることが望ましいときに使用される。１日目および２日目に対するプロトコルはパートＡの場合と同じである。３日目に、アッセイプレートを下記のように準備した：１５０ｍｌの低融点アガロース溶液を下記のように作製した：１０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．０）、２．０％の低融点アガロース（電子レンジで融解された）、０．００４％のブロムクレゾールパープル（１．２ｍｌ／１５０ｍｌ）。この溶液を３７℃に一晩冷却した。３日目に、ＥＣＨＢ（０．４５ｍｌのＥＣＨＢ／１５０ｍｌ溶液）および（Ｒ）−４−シアノ−３−ヒドロキシ酪酸エチル（８．２６ｍｌの（Ｒ）−４−シアノ−３−ヒドロキシ酪酸エチル／１５０ｍｌ溶液）を加えて、０．３％のＥＣＨＢおよび４００ｍＭの（Ｒ）−４−シアノ−３−ヒドロキシ酪酸エチルの溶液にした。この溶液を混合し、そして、パートＡに記載されるように、１５０ｍＬのＱトレーに注ぎ、その後、固化させた。

コロニーを有するナイロンメンブランを、誘導培地を含有するＱトレーから取り出し、アッセイプレートに裏返しで置いた。メンブランを、上記のパートＡに記載されるように画像化した。

このスクリーニングから得られた活性なクローンを、実施例５Ｂに記載されるガスクロマトグラフィー法（培地スループットアッセイ）を使用してさらに特徴付けした。

（実施例５）
（ハロヒドリンデハロゲナーゼ活性の特徴付け）
（Ａ．生成物の（Ｒ）−４−シアノ−３−ヒドロキシ酪酸エチルを検出するためのガスクロマトグラフィー法）
５００ｍＭのＨＣＮ（リン酸によりｐＨ７．０に調節された５００ｍＭのＮａＣＮ）における（Ｓ）−４−クロロ−３−ヒドロキシ酪酸エチル（１０ｍＭ〜１００ｍＭ）の溶液に、ハロヒドリンデヒドロゲナーゼ酵素を同じ緩衝液に事前に溶解された溶液として加えた。経時的に混合物の一定量を抜き取り、３体積の酢酸エチルにより抽出した。その後、有機層を、本明細書中下記において実施例６に記載されるように、（Ｒ）−４−シアノ−３−ヒドロキシ酪酸エチルについてガスクロマトグラフィー（ＧＣ）によって分析した。サンプルを様々な時点で採取し、生成物のシアノヒドリンである（Ｒ）−４−シアノ−３−ヒドロキシ酪酸エチルのピーク面積を時間の関数としてプロットした。時間点は、生成物阻害の影響を避けるために、低い転換率で、例えば、５％未満の転換率で選択される（例えば、０．５％、１．０％、１．５％、２．０％、２．５％、３．０％など）。ピーク面積を、（Ｒ）−４−シアノ−３−ヒドロキシ酪酸エチルについて調製された標準曲線を使用して濃度単位に変換した。ハロヒドリンデヒドロゲナーゼの活性をμｍｏｌ（生成シアノヒドリン）／分／ｍｇ（総ハロヒドリンデヒドロゲナーゼ触媒）の単位で求めた。クローンのいくつかの相対的活性を、改善されたＨＨＤＨ酵素の活性／Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．ＨＨＤＨ（配列番号２）の活性としてコンピューター処理して表２に示す。

（表２．改善されたＨＨＤＨ酵素のＥＣＨＢ基質に対する相対的ＨＨＤＨ活性）

（Ｂ．シアノヒドリン生成物の存在下での培地スループット−ガスクロマトグラフィーアッセイ）
当たりを予備スクリーニングのマスターウエルプレートにおける所望のウエル（１０μＬの培養物）から選び、９６ウエルのＮＵＮＣプレートのウエル（各ウエルは、２００ｕｌのＬＢ＋１％のグルコース、３０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコール（ｃａｍ）を含有する）に移し、３０℃、２５０ｒｐｍ、８５％の相対湿度で一晩成長させた。陽性コントロールを予備スクリーニングのマスターウエルプレートから選んだ。

翌日、一晩成長物の１０μｌ量を、３００μｌの２ｘＹＴ、１００ｍＭのＮａＨ_２ＰＯ_４／Ｎａ_２ＨＰＯ_４（ｐＨ７）、１ｍＭのＭｇＳＯ_４、３０μｇ／ｍｌのｃａｍを各ウエルが含有する９６深底ウエルプレートに継代培養した。これらのプレートを、細胞密度がＯＤ（６００ｎｍ）＝０．６に達するまで、３０℃、２５０ｒｐｍ、８５％の相対湿度で２時間〜４時間インキュベーションした。その後、プレートを１ｍＭのイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）（例えば、３４ｍＭのＩＰＴＧストック溶液の１０μｌ／ウエル、または、１０ｍＭのＩＰＴＧストックの３０μＬ／ウエル）により誘導し、３０℃、２５０ｒｐｍ、８５％の相対湿度で一晩インキュベーションした。

翌日、プレートを遠心分離（４０００ｒｐｍ、１０分間、４℃）して、細胞をペレット化し、使用済み培地を捨てた。プレートは、細胞の破壊を助けるために、−８０℃で１時間凍結することができる。

ペレット化された細胞を、２．０４Ｍの４−シアノ−３−ヒドロキシ酪酸エチル（「ＮＨ」）（３２０ｇ／Ｌ）（ｆｗ＝１５７、ｄ１．１９、２６．８ｍｌ／１００ｍｌ溶解混合物）を含有する２００μＬのＢ−ＰＥＲ（登録商標）溶解液（Ｐｉｅｒｃｅ、カタログ＃７８２４３）および１ｕｌ／１０ｍｌのＤＮａｓｅ（約２００Ｕ／ｕｌ）を加えることによって溶解した。細胞および溶解液の混合物をボルテックス処理して、細胞を再懸濁し、その後、２時間振とうしながら５０℃でインキュベーションした。

反応溶液を、好ましくはプラスチック（ポリプロピレン）製使い捨て容器を使用して、ドラフト内で作製した。反応溶液の体積は、スクリーニングされるプレートの数によって決定された。ＮａＣＮの１Ｍの最終濃度を有する反応溶液を調製するために、ＮａＣＮ（ｆｗ＝４９．０１、４．９ｇ／１００ｍＬ）を、所望する体積の１００ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７）に加えて、ＮａＣＮの１．４７Ｍの濃度を作製した。このＮａＣＮ溶液の各６８ｍＬに２４ｍＬの５ＭストックＮａＣｌおよび８ｍｌの濃ＨＣｌ（約１０Ｍ）を加えて、１．２ＭのＮａＣｌ、８００ｍＭのＨＣｌおよび１ＭのＮａＣＮである所望する体積の反応混合物を作製した。反応混合物の最終ｐＨは７．０〜７．２であった。この溶液に、ＥＣＨＢ（ｆｗ＝１６６．６、ｄ＝１．１９）を２８０μＬ／１００ｍＬ反応ミックスで加えて、２０ｍＭの最終濃度を得た。反応ミックスにおける最終濃度は、約１ＭのＨＣＮ、２ＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０〜７．２）、２０ｍＭのＥＣＨＢである。

２００μＬの反応混合物を各ウエルにおける溶解された細胞に加えた。プレートを、Ｖｅｌｏｃｉｔｙ１１ＰｌａｔｅＬｏｃ（商標）熱シーラーを使用して密封した。その後、密封されたプレートを室温で１２０分間振とうした。振とう後、プレートを密封から解き、１ｍＬの１ｍＭチモール（酢酸エチルに溶解）を各ウエルに加えた。プレートを、Ｖｅｌｏｃｉｔｙ１１ＰｌａｔｅＬｏｃ（商標）熱シーラーを使用して再び密封し、激しく振とうし、その後、約１分間静置して、層を分離させた。

上部層の１５０μＬ量を、Ｈｙｄｒａ（商標）陽圧移動液体処理装置（Ａｓｐモード、ＡＶ１５０、ＡＨ２６５０、ＥＨ３７８００、ＷＨ３７３０、ＷＶ：ｆｕｌｌ、洗浄：３）を使用して、Ｃｏｓｔａｒ社の丸底の浅底ウエルのポリプロピレン（ＰＰ）製反応プレート（カタログ＃３３６５）に移した。サンプルを深底ウエルプレートから浅底ウエルプレートに移した。

これらのプレートを、Ｖｅｌｏｃｉｔｙ１１ＰｌａｔｅＬｏｃ（商標）熱シーラーを使用して密封し、実施例６Ｂに記載されるようなガスクロマトグラフィーによる分析まで−２０℃で保存した。

（Ｃ．４−クロロアセト酢酸エチル（ＥＣＡＡ）の存在下での阻害についての培地スループット−ガスクロマトグラフィーアッセイ）
当たりを予備スクリーニングのマスターウエルプレートにおける所望のウエル（１０μＬの培養物）から選び、９６ウエルのＮＵＮＣプレートのウエル（各ウエルは、２００ｕｌのＬＢ＋１％のグルコース、３０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコール（ｃａｍ）を含有する）に移し、３０℃、２５０ｒｐｍ、８５％の相対湿度で一晩成長させた。陽性コントロールを予備スクリーニングのマスターウエルプレートから選んだ。

翌日、一晩成長物の１０μｌ量を、３００μｌの２ｘＹＴ、１００ｍＭのＮａＨ_２ＰＯ_４／Ｎａ_２ＨＰＯ_４（ｐＨ７）、１ｍＭのＭｇＳＯ_４、３０μｇ／ｍｌのｃａｍを各ウエルが含有する９６深底ウエルプレートに継代培養した。これらのプレートを、細胞密度がＯＤ（６００ｎｍ）＝０．６に達するまで、３０℃、２５０ｒｐｍ、８５％の相対湿度で２時間〜４時間インキュベーションした。その後、プレートを１ｍＭのＩＰＴＧ（例えば、３４ｍＭのＩＰＴＧストック溶液の１０μｌ／ウエル、または、１０ｍＭのＩＰＴＧストックの３０μＬ／ウエル）により誘導し、３０℃、２５０ｒｐｍ、８５％の相対湿度で一晩インキュベーションした。

翌日、プレートを遠心分離（４０００ｒｐｍ、１０分間、４℃）して、細胞をペレット化し、使用済み培地を捨てた。プレートは、細胞の破壊を助けるために、−８０℃で１時間凍結することができる。

ペレット化された細胞を、２００μＬのＢ−ＰＥＲ（登録商標）溶解液（Ｐｉｅｒｃｅ、カタログ＃７８２４３）を１ｕｌ／１０ｍｌのＤＮａｓｅ（約２００Ｕ／ｕｌ）とともに加えることによって溶解した。細胞および溶解液の混合物をボルテックス処理して、細胞を再懸濁し、その後、２時間振とうしながら５０℃でインキュベーションした。

反応溶液を、好ましくはプラスチック（ＰＰ）製使い捨て容器を使用して、ドラフト内で作製した（反応溶液の体積は、スクリーニングされているプレートの数によって決定された）。ＮａＣＮの１Ｍの最終濃度を有する反応溶液を調製するために、ＮａＣＮ（ｆｗ＝４９．０１、４．９ｇ／１００ｍＬ）を、所望する体積の１００ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７）に加えて、ＮａＣＮの１．４７Ｍの濃度を作製した。このＮａＣＮ溶液の各６８ｍＬに２４ｍＬの５ＭストックＮａＣｌおよび８ｍｌの濃ＨＣｌ（約１０Ｍ）を加えて、１．２ＭのＮａＣｌ、８００ｍＭのＨＣｌおよび１ＭのＮａＣＮである所望する体積の反応混合物を作製した。反応混合物の最終ｐＨは７．０〜７．２である。この溶液に、ＥＣＨＢ（ｆｗ＝１６６．６、ｄ＝１．１９）を１００ｍＭの最終濃度に加え（１４００μＬ／１００ｍＬ反応ミックス）、また、ＥＣＡＡ（ｆｗ＝１６４．６、ｄ＝１．２１）を５ｍＭの最終濃度に加える（１００μＬ／１００ｍＬ反応ミックス）。

２００μＬの反応混合物を各ウエルにおける溶解された細胞に加えた。プレートを、Ｖｅｌｏｃｉｔｙ１１ＰｌａｔｅＬｏｃ（商標）熱シーラーを使用して密封した。その後、密封されたプレートを室温で６０分間振とうした。振とう後、プレートを密封から解き、１ｍＬの１ｍＭチモール（酢酸エチルに溶解）を各ウエルに加えた。プレートを、Ｖｅｌｏｃｉｔｙ１１ＰｌａｔｅＬｏｃ（商標）熱シーラーを使用して再び密封し、激しく振とうし、その後、約１分間静置して、層を分離させた。

上部層の１５０μＬ量を、Ｈｙｄｒａ（商標）陽圧移動液体処理装置（Ａｓｐモード、ＡＶ１５０、ＡＨ２６５０、ＥＨ３７８００、ＷＨ３７３０、ＷＶ：ｆｕｌｌ、洗浄：３）を使用して、Ｃｏｓｔａｒ社の丸底の浅底ウエルのポリプロピレン（ＰＰ）製反応プレート（カタログ＃３３６５）に移した。サンプルを深底ウエルプレートから浅底ウエルプレートに移した。これらのプレートを、Ｖｅｌｏｃｉｔｙ１１ＰｌａｔｅＬｏｃ（商標）熱シーラーを使用して密封し、実施例６Ｂに記載されるようなガスクロマトグラフィーによる分析まで−２０℃で保存した。

（実施例６）
（Ａ．ガスクロマトグラフィーによる（Ｒ）−４−シアノ−３−ヒドロキシ酪酸エチルの検出）
実施例５Ａで生じた（Ｒ）−４−シアノ−３−ヒドロキシ酪酸エチルを、下記のプログラムを使用する、Ａｇｉｌｅｎｔ（登録商標）ＨＰ−５（商標）カラム（長さ：３０ｍ、内径：０．３２ｍｍ、膜厚：０．２５μｍ）を使用するフレームイオン化（ＦＩＤ）検出によるガスクロマトグラフィーを使用して分析した：１００℃で１分間、５℃／分で１０分間、２５℃／分で２分間、次いで２００℃で２分間。入口温度および出口温度はともに３００℃であり、流速は２ｍｌ／分であった。これらの条件下で、（Ｒ）−４−シアノ−３−ヒドロキシ酪酸エチルが６．２５分で溶出し、（Ｓ）−４−クロロ−３−ヒドロキシ酪酸エチルが４．５分で溶出する。この化学種の化学的純度を、ガスクロマトグラフィー結果から得られる積分されたピーク面積を使用して測定した。

（Ｒ）−４−シアノ−３−ヒドロキシ酪酸エチルに関するハロヒドリンデハロゲナーゼ（ＨＨＤＨ）のエナンチオ選択性を、下記のプログラムを使用して、ガスクロマトグラフィー、および、Ｒｅｓｔｅｋ ｇａｍｍａＤｅｘ ＳＡ（商標）カラム（長さ：３０ｍ、内径：０．３２μｍ）を使用するＦＩＤ検出によって測定した：１６５℃で２５分間、および、２ｍｌ／分での流速。入口温度および出口温度はともに２３０℃であった。これらの条件下で、（Ｒ）−４−シアノ−３−ヒドロキシ酪酸エチルが１９．６分で溶出し、（Ｓ）−４−シアノ−３−ヒドロキシ酪酸エチルが１９．２分で溶出する。

（Ｂ．ガスクロマトグラフィーによる残留（Ｓ）−４−クロロ−３−ヒドロキシ酪酸エチルの検出）
実施例４Ｂの予備スクリーニング法においてシアノヒドリン生成物の存在下で活性を示した本発明のハロヒドリンデハロゲナーゼを、実施例５Ｂに記載されるアッセイでさらに特徴付けした。実施例５Ｂから得られる反応混合物における残留（Ｓ）−４−クロロ−３−ヒドロキシ酪酸エチルを、Ａｇｉｌｅｎｔ（登録商標）１９０９１Ｊ−４１３ＨＰ−５（商標） ５％フェニルメチルシロキサンカラム（３０．０ｍ（長さ）ｘ３２０μｍ（内径）ｘ０．２５μｍ（公称））および２．６ｍｌ／分の流速によるガスクロマトグラフィーを使用して分析した。下記のプログラムを使用した：１００℃で１分間、５０℃／分で２分間、２分間の保持、１０分のサイクル時間。検出器の条件は下記の通りであった：３００℃、４０ｍｌ／分のＨ_２、４５０ｍｌ／分の空気。これらの条件下で、（Ｓ）−４−クロロ−３−ヒドロキシ酪酸エチルが３．１２分で溶出し、（Ｒ）−４−シアノ−３−ヒドロキシ酪酸エチルが３．０６分で溶出し、チモールが３．２１分で溶出する。活性を、抽出効率に対して正規化された残留（Ｓ）−４−クロロ−３−ヒドロキシ酪酸エチルの量（すなわち、ＥＣＨＢ面積／チモール面積）によって特徴付けることができる。チモールは、水から酢酸エチルへの反応混合物の抽出効率のための内部標準として使用される。

（実施例７）
（（Ｓ）−４−クロロ−３−ヒドロキシ酪酸エチルからの（Ｒ）−４−シアノ−３−ヒドロキシ酪酸エチルの製造）
機械的撹拌装置を備え、ｐＨ電極による自動滴定装置と、塩基を添加するための供給チューブとにつながれた三つ口のジャケット付き３Ｌフラスコに、Ｈ_２Ｏ（１２００ｍＬ）、ＮａＣＮ（３７．２５ｇ）およびＮａＨ_２ＰＯ_４（１２５ｇ）を仕込み、溶液をｐＨ７にした。水循環装置を４０℃に設定した。１０分後、ハロヒドリンデハロゲナーゼ（配列番号３２）を細胞溶媒物（２５０ｍＬ）として加えた。反応混合物を５分間撹拌した。滴下ロートを使用して、（Ｓ）−４−クロロ−３−ヒドロキシ酪酸エチル（４５ｇ）を１時間かけてゆっくり加えた。ｐＨが、１７時間にわたる１０ＭのＮａＯＨ（２７ｍＬ）の添加により自動滴定装置によって７で維持された。その後で、反応サンプルのガスクロマトグラフィーは生成物への完全な変換を示した。セライト（１６ｇ）をフラスコに加えて、フラスコをダイアフラムポンプにつなぎ、その排気を、ＨＣＮを除くために５ＭのＮａＯＨ（２００ｍＬ）に吹き込む。混合物を１００ｍｍＨｇの圧力のもとで６０℃に加熱した。１時間後、液面下の空気吹き込み管を溶液に入れて、ＨＣＮの除去を助けた。３時間後、ＨＣＮ検出器は、排ガス中のＨＣＮが５ｐｐｍ未満であることを示した。混合物を室温に冷却し、その後、セライトの詰め物に通してろ過した。ろ液を酢酸エチル（８００ｍＬで３回）で抽出し、有機層を一緒にして、活性炭の詰め物に通してろ過した。溶媒をロータリーエバポレーションによって真空下で除き、２８．５ｇの（Ｒ）−４−シアノ−３−ヒドロキシ酪酸エチルを得た。純度はＨＰＬＣによって９８％（ｗ／ｗ）であり、エナンチオマー過剰は＞９９％であった（キラルＧＣによって、Ｓエナンチオマーは検出できなかった）。本明細書中で使用される用語「エナンチオマー過剰」または用語「ｅ．ｅ．」は、主成分エナンチオマー（Ｆ_（＋））および副成分エナンチオマー（Ｆ_（−））のモル割合または重量割合の絶対差（すなわち、｜Ｆ_（＋）−Ｆ_（−）｜）を示す（ただし、Ｆ_（＋）＋Ｆ_（−）＝１）。パーセントｅ．ｅ．は１００Ｘ｜Ｆ_（＋）−Ｆ_（−）｜である。エナンチオマー組成物は、上記の実施例６に記載されるガスクロマトグラフィー法を使用することによって、また、この分野で知られている方法を使用することによって容易に特徴付けすることができる。

（実施例８〜１２）
（（Ｓ）−４−シアノ−３−ヒドロキシ酪酸エチルへの（Ｒ）−４−クロロ−３−ヒドロキシ酪酸エチルの変換）
実施例８〜１２のそれぞれについて、ｐＨ電極による自動滴定装置と、塩基を添加するための供給チューブとにつながれた１７０ｍＬの容器に、ＮａＣＮ（１．５ｇ、３１ｍｍｏｌ）および水（５０ｍＬ）を仕込んだ。容器を密封し、ｐＨを濃Ｈ_２ＳＯ_４（０．９ｍＬ）の添加によって７に調節した。反応混合物を４０℃に加熱し、ハロヒドリンデハロゲナーゼの溶液（１０ｍＬの水における０．４ｇ）により処理した。これらの実施例のために使用されたハロヒドリンデハロゲナーゼは、下記の配列番号：
実施例８ 配列番号３２
実施例９ 配列番号９０
実施例１０ 配列番号９４
実施例１１ 配列番号９６
実施例１２ 配列番号９８
について示されるポリペプチド配列を有した。その後、（Ｓ）−４−クロロ−３−ヒドロキシ酪酸エチル（５．００ｇ、３０．１ｍｍｏｌ）をシリンジによって加えた。自動滴定装置により、ｐＨを４ＭのＮａＣＮの添加によって７で維持した。反応の進行を、時間に対する添加ＮａＣＮ溶液の累積体積を記録することによってモニターした。

図２は、これらの実施例のそれぞれについて時間に対する（Ｓ）−４−クロロ−３−ヒドロキシ酪酸エチルのパーセント変換率（これは添加ＮａＣＮの累積当量から計算された）を示す。実施例８では、配列番号３１に対応する新規な核酸から発現させた、配列番号３２のアミノ酸配列（これはアグロバクテリウム・ラジオバクターＡＤ１（ｈｈｅＣ）由来の天然型ハロヒドリンデハロゲナーゼである）を有するハロヒドリンデハロゲナーゼが使用された。実施例９〜実施例１２についてのパーセント変換率対時間を実施例８のパーセント変換率対時間と比較することにより、本発明の新規なハロヒドリンデハロゲナーゼはアグロバクテリウム・ラジオバクターＡＤ１（ｈｈｅＣ）由来の天然型ハロヒドリンデハロゲナーゼよりも大きな活性を有することが示される。

本明細書に引用されているすべての刊行物、特許、特許出願および他の文書は、それぞれの個々の刊行物、特許、特許出願または他の文書が、すべての目的のために参照として組み込まれることが個々に示されている場合と同様に、すべての目的のためにその全体が参照として組み込まれる。

本発明の好ましい実施形態が例示および記載されているが、様々な変化が、本発明の精神および範囲から逸脱することなく本発明において行われ得ることが容易に理解されるであろう。

図１は、ｐ１５Ａの複製起点（Ｐ１５Ａｏｒｉ）、ｌａｃＩリプレッサー、Ｔ５プロモーター、Ｔ７リボソーム結合部位（Ｔ７ｇ１０）およびクロラムフェニコール耐性遺伝子（ｃａｍＲ）を含む本発明の３９４４ｂｐの発現ベクター（ＰＣＫ１１０７００）である。 図２は、実施例８〜実施例１２に記載される様々なハロヒドリンデハロゲナーゼ酵素の存在下でのシアン化水素酸水溶液を用いた（Ｓ）−４−クロロ−（３）−ヒドロキシ酪酸エチルの反応についてのパーセント変換率対時間を示す。

Claims (13)

1. ＨＨＤＨ活性を有する単離されたポリペプチドであって、該ポリペプチドは、
   （ａ）配列番号４、配列番号１２、配列番号１６、配列番号１８、配列番号３４、配列番号３８、配列番号４４、配列番号４８、配列番号５２、配列番号６６、配列番号８０、配列番号８４、配列番号１１４、配列番号１５４、配列番号１５８、配列番号１７０または配列番号２７０に対して少なくとも９９％同一である、アミノ酸配列；
   （ｂ）配列番号１０、配列番号１４または配列番号６８、配列番号１１８、配列番号１６４、配列番号１６６または配列番号１８０に対して少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列を有する、ポリペプチド；
   （ｃ）配列番号１１０、配列番号１６２、配列番号２６２、配列番号４２２、配列番号４４０または配列番号５２０に対して少なくとも９７％同一である、アミノ酸配列；
   （ｄ）配列番号１１６または配列番号４４８に対して少なくとも９６％同一である、アミノ酸配列；
   （ｅ）配列番号２６４、配列番号２６６、配列番号４７０または配列番号４７６に対して少なくとも９５％同一である、アミノ酸配列；
   （ｆ）配列番号２００に対して少なくとも９３％同一である、アミノ酸配列；
   （ｇ）配列番号４４２に対して少なくとも８９％同一である、アミノ酸配列；
   （ｈ）配列番号７０２に対して少なくとも８８％同一である、アミノ酸配列；
   （ｉ）配列番号２と最適に整列された場合に配列番号２に対して少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列であって、該アミノ酸配列は、２位の（残基）位置におけるＴ、３位におけるＡまたはＰまたはＳ、４位におけるＶ、６位におけるＤ、９位におけるＩまたはＦのいずれか、１０位におけるＬ、１３位におけるＳ、１４位におけるＳ、１５位におけるＫ、１６位におけるＣ、１７位におけるＴまたはＲ、２０位におけるＣまたはＳまたはＫのいずれか、２４位におけるＴ、２６位におけるＱ、２８位におけるＦ、２９位におけるＴ、３０位におけるＡ、３１位におけるＬ、３３位におけるＧ、３４位におけるＲ、３５位におけるＬ、３６位におけるＮ、３７位におけるＨ、４０位におけるＤ、４４位におけるＬ、４５位におけるＰ、４７位におけるＰまたはＡのいずれか、５２位におけるＮ、５４位におけるＶ、５５位におけるＲ、５６位におけるＤ、５８位におけるＫ、６１位におけるＧまたはＤ、６３位におけるＶ、７２位におけるＲ、７５位におけるＩ、７６位におけるＰ、７８位におけるＣ、８２位におけるＹ、８４位におけるＳまたはＬのいずれか、８５位におけるＡ、９１位におけるＥ、９３位におけるＤ、９５位におけるＱまたはＧ、９６位におけるＮ、１０７位におけるＫ、１１２位におけるＡ、１１４位におけるＴ、ＳまたはＧのいずれか、１１５位におけるＡ、１１７位におけるＰ、１２０位におけるＮ、１２１位におけるＥ、１２２位におけるＰ、１２６位におけるＲ、１３０位におけるＶ、１３３位におけるＳ、１３４位におけるＡまたはＶ、１３６位におけるＬ、ＷまたはＶ、１３９位におけるＨ、１４２位におけるＩまたはＲ、１４４位におけるＳ、１４６位におけるＳ、１５２位におけるＴ、１５３位におけるＳ、１５４位におけるＳまたはＡのいずれか、１６８位におけるＶ、１６９位におけるＴ、１７７位におけるＦ、１７８位におけるＶ、１８０位におけるＩ、１８１位におけるＧまたはＩ、１８４位におけるＫ、１８６位におけるＹ、１９４位におけるＬ、１９８位におけるＮ、１９９位におけるＭ、２１５位におけるＥ、２３６位におけるＧ、２３７位におけるＶ、２３８位におけるＬ、２４０位におけるＴ、２４５位におけるＩまたはＡまたはＶのいずれか、２４９位におけるＹ、２５２位におけるＶまたはＩ、および、２５４位におけるＶからなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基を含む、アミノ酸配列；あるいは
   （ｊ）配列番号１に対応する核酸の実質的に全長にわたってストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるアミノ酸配列であって、コードされるポリペプチドが、配列番号２と最適にアラインメントされた場合に、２位の（残基）位置におけるＴ、３位におけるＡまたはＰまたはＳ、４位におけるＶ、６位におけるＤ、９位におけるＩまたはＦのいずれか、１０位におけるＬ、１３位におけるＳ、１４位におけるＳ、１５位におけるＫ、１６位におけるＣ、１７位におけるＴまたはＲ、２０位におけるＣまたはＳまたはＫのいずれか、２４位におけるＴ、２６位におけるＱ、２８位におけるＦ、２９位におけるＴ、３０位におけるＡ、３１位におけるＬ、３３位におけるＧ、３４位におけるＲ、３５位におけるＬ、３６位におけるＮ、３７位におけるＨ、４０位におけるＤ、４４位におけるＬ、４５位におけるＰ、４７位におけるＰまたはＡのいずれか、５２位におけるＮ、５４位におけるＶ、５５位におけるＲ、５６位におけるＤ、５８位におけるＫ、６１位におけるＧまたはＤ、６３位におけるＶ、７２位におけるＲ、７５位におけるＩ、７６位におけるＰ、７８位におけるＣ、８２位におけるＹ、８４位におけるＳまたはＬのいずれか、８５位におけるＡ、９１位におけるＥ、９３位におけるＤ、９５位におけるＱまたはＧ、９６位におけるＮ、１０７位におけるＫ、１１２位におけるＡ、１１４位におけるＴ、ＳまたはＧのいずれか、１１５位におけるＡ、１１７位におけるＰ、１２０位におけるＮ、１２１位におけるＥ、１２２位におけるＰ、１２６位におけるＲ、１３０位におけるＶ、１３３位におけるＳ、１３４位におけるＡまたはＶ、１３６位におけるＬ、ＷまたはＶ、１３９位におけるＨ、１４２位におけるＩまたはＲ、１４４位におけるＳ、１４６位におけるＳ、１５２位におけるＴ、１５３位におけるＳ、１５４位におけるＳまたはＡのいずれか、１６８位におけるＶ、１６９位におけるＴ、１７７位におけるＦ、１７８位におけるＶ、１８０位におけるＩ、１８１位におけるＧまたはＩ、１８４位におけるＫ、１８６位におけるＹ、１９４位におけるＬ、１９８位におけるＮ、１９９位におけるＭ、２１５位におけるＥ、２３６位におけるＧ、２３７位におけるＶ、２３８位におけるＬ、２４０位におけるＴ、２４５位におけるＩまたはＡまたはＶのいずれか、２４９位におけるＹ、２５２位におけるＶまたはＩ、および、２５４位におけるＶからなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基を有するアミノ酸配列を含む、アミノ酸配列；
   からなるアミノ酸配列を含む、ポリペプチド。
2. 請求項１に記載の単離されたポリペプチドであって、該ポリペプチドは、配列番号２に対応するアミノ酸配列を有するが、Ｓ２Ｔ、Ｔ３ＡまたはＴ３Ｐのいずれか、Ａ４Ｖ、Ｖ６Ｄ、Ｖ９ＩまたはＶ９Ｆのいずれか、Ｋ１０Ｌ、Ｇ１３Ｓ、Ｇ１４Ｓ、Ｍ１５Ｋ、Ｇ１６Ｃ、Ｓ１７ＴまたはＳ１７Ｒのいずれか、Ｒ２０Ｓ、Ｒ２０ＣまたはＲ２０Ｋのいずれか、Ａ２４Ｔ、Ｈ２６Ｑ、Ｖ２８Ｆ、Ａ２９Ｔ、Ｃ３０Ａ、Ｈ３１Ｌ、Ｅ３３Ｇ、Ｓ３４Ｒ、Ｆ３５Ｌ、Ｋ３６Ｎ、Ｑ３７Ｈ、Ｅ４０Ｄ、Ｆ４４Ｌ、Ａ４５Ｐ、Ｔ４７ＰまたはＴ４７Ａのいずれか、Ｋ５２Ｎ、Ｍ５４Ｖ、Ｓ５５Ｒ、Ｅ５６Ｄ、Ｅ５８Ｋ、Ｅ６１ＧまたはＥ６１Ｄのいずれか、Ｉ６３Ｖ、Ｑ７２Ｒ、Ｖ７５Ｉ、Ｌ７６Ｐ、Ｓ７８Ｃ、Ｆ８２Ｙ、Ｐ８４ＳまたはＰ８４Ｌのいずれか、Ｅ８５Ｑ、Ｋ９１Ｅ、Ａ９３Ｄ、Ｅ９５ＱまたはＥ９５Ｇ、Ｄ９６Ｎ、Ｒ１０７Ｋ、Ｖ１１２Ａ、Ａ１１４ＴまたはＡ１１４ＧまたはＡ１１４Ｓのいずれか、Ｖ１１５Ａ、Ｓ１１７Ｐ、Ｋ１２０Ｎ、Ｋ１２１Ｅ、Ｒ１２２Ｐ、Ｈ１２６Ｒ、Ｉ１３０Ｖ、Ａ１３３Ｓ、Ｔ１３４ＡまたはＴ１３４Ｖ、Ｆ１３６ＬまたはＦ１３６ＷまたはＦ１３６Ｖ、Ｗ１３９Ｈ、Ｌ１４２ＩまたはＬ１４２Ｒ、Ｔ１４４Ｓ、Ｔ１４６Ｓ、Ａ１５２Ｔ、Ｃ１５３Ｓ、Ｔ１５４ＳまたはＴ１５４Ａのいずれか、Ｉ１６８Ｖ、Ｐ１６９Ｔ、Ｙ１７７Ｆ、Ｌ１７８Ｖ、Ｓ１８０Ｉ、Ｅ１８１ＧまたはＥ１８１Ｉ、Ｐ１８４Ｋ、Ｆ１８６Ｙ、Ｔ１９４Ｉ、Ｈ１９８Ｎ、Ｖ１９９Ｍ、Ｋ２１５Ｅ、Ｖ２３６Ｇ、Ｆ２３７Ｖ、Ｗ２３８Ｌ、Ａ２４０Ｔ、Ｍ２４５ＩまたはＭ２４５ＡまたはＭ２４５Ｖのいずれか、Ｗ２４９Ｙ、Ｍ２５２ＶまたはＭ２５２Ｉ、およびＥ２５４Ｖからなる群より選択される１つ以上の置換を有する、単離されたポリペプチド。
3. 配列番号２のアミノ酸配列を有する野生型ＨＨＤＨと比較して少なくとも１．４倍〜１０，０００倍大きいＨＨＤＨ活性を有する、請求項１に記載の単離されたポリペプチド。
4. 配列番号２のアミノ酸配列を有する野生型ＨＨＤＨと比較して少なくとも１．４倍〜１０，０００倍大きいＨＨＤＨ活性を有する単離されたポリペプチドまたは組換えポリペプチドであって、
   該ポリペプチドは、配列番号３、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号３３、配列番号３７、配列番号４３、配列番号４７、配列番号４９、配列番号５１、配列番号６５、配列番号６７、配列番号７９、配列番号８３、配列番号１０９、配列番号１１３、配列番号１１５、配列番号１１７、配列番号１５３、配列番号１５７、配列番号１６１、配列番号１６３、配列番号１６５、配列番号１６９、配列番号１７９、配列番号１６１、配列番号１９９、配列番号２６１、配列番号２６３、配列番号２６５、配列番号２６９、配列番号４２１、配列番号４３９、配列番号４４１、配列番号４４７、配列番号４６９、配列番号４７５、配列番号５１９、配列番号７０１、配列番号７２５、配列番号７２９、配列番号７３１、配列番号７３３、配列番号７３５、配列番号７３７、およびその相補的配列からなる群より選択される配列を有する核酸の実質的に全長にわたってストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされる、単離されたポリペプチドまたは組換えポリペプチド。
5. 請求項１、請求項２または請求項４に記載されるポリペプチドをコードする、単離されたポリヌクレオチドまたは組換えポリヌクレオチド。
6. 請求項５に記載の単離されたポリヌクレオチドまたは組換えポリヌクレオチドであって、該ポリヌクレオチドは、コードされるＨＨＤＨポリペプチドにおけるアミノ酸位置５においてイソロイシンをコードするＡＴＴ、コードされるＨＨＤＨポリペプチドにおけるアミノ酸位置３６においてリジンをコードするＡＡＧ、コードされるＨＨＤＨポリペプチドにおけるアミノ酸位置６３においてイソロイシンをコードするＡＴＴ、コードされるＨＨＤＨポリペプチドにおけるアミノ酸位置９５においてグルタミン酸をコードするＧＡＧ、および、コードされるＨＨＤＨポリペプチドにおけるアミノ酸位置１８８においてプロリンをコードするＣＣＣからなる群より選択される１つ以上のコドンを含み、
   前記アミノ酸位置は、配列番号２に関して、コードされるポリペプチドにおける対応する位置である、単離されたポリヌクレオチドまたは組換えポリヌクレオチド。
7. プロモーターに作動可能に連結された請求項５に記載されるポリヌクレオチドを含む、発現ベクター。
8. 請求項５に記載されるポリヌクレオチドにより形質転換された、宿主細胞。
9. ＨＨＤＨポリペプチドを作製する方法であって、該方法は、
   （ａ）請求項８に記載の宿主細胞を、ＨＨＤＨポリペプチドを産生させるために好適な条件下で培養する工程、および
   （ｂ）ＨＨＤＨポリペプチドを回収する工程、
   を包含する、方法。
10. 請求項１に記載の単離されたポリペプチドであって、該ポリペプチドは、ＥＣＡＡによる阻害に対する抵抗性をさらに有し、該ポリペプチドは、配列番号２と整列された場合に、Ａ４Ｖ、Ｆ８２Ｙ、Ｔ１３４Ｖ、Ｆ１３６Ｗ、Ｆ１３６Ｖ、Ｌ１４２Ｒ、Ｌ１７８Ｖ、Ｗ２３８Ｌ、Ａ２４０Ｔ、Ｗ２４９ＹおよびＭ２５２Ｉからなる群より選択される残基変化のうちの１つ以上を有する、単離されたポリペプチド。
11. 配列番号４、配列番号１２、配列番号１６、配列番号１８、配列番号３４、配列番号３８、配列番号４４、配列番号４８、配列番号５２、配列番号６６、配列番号８０、配列番号８４、配列番号１１４、配列番号１５４、配列番号１５８、配列番号１７０または配列番号２７０に対して少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のポリペプチド。
12. 配列番号１０、配列番号１４、または配列番号６８、配列番号１１８、配列番号１６４、配列番号１６６、または配列番号１８０に対して少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のポリペプチド。
13. 請求項１に記載のポリペプチドであって、該ポリペプチドは、配列番号２と最適に整列された場合に、配列番号２に対して少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含み、該アミノ酸配列は、２位の（残基）位置におけるＴ、３位におけるＡまたはＰまたはＳ、４位におけるＶ、６位におけるＤ、９位におけるＩまたはＦのいずれか、１０位におけるＬ、１３位におけるＳ、１４位におけるＳ、１５位におけるＫ、１６位におけるＣ、１７位におけるＴまたはＲ、２０位におけるＣまたはＳまたはＫのいずれか、２４位におけるＴ、２６位におけるＱ、２８位におけるＦ、２９位におけるＴ、３０位におけるＡ、３１位におけるＬ、３３位におけるＧ、３４位におけるＲ、３５位におけるＬ、３６位におけるＮ、３７位におけるＨ、４０位におけるＤ、４４位におけるＬ、４５位におけるＰ、４７位におけるＰまたはＡのいずれか、５２位におけるＮ、５４位におけるＶ、５５位におけるＲ、５６位におけるＤ、５８位におけるＫ、６１位におけるＧまたはＤ、６３位におけるＶ、７２位におけるＲ、７５位におけるＩ、７６位におけるＰ、７８位におけるＣ、８２位におけるＹ、８４位におけるＳまたはＬのいずれか、８５位におけるＡ、９１位におけるＥ、９３位におけるＤ、９５位におけるＱまたはＧ、９６位におけるＮ、１０７位におけるＫ、１１２位におけるＡ、１１４位におけるＴ、ＳまたはＧのいずれか、１１５位におけるＡ、１１７位におけるＰ、１２０位におけるＮ、１２１位におけるＥ、１２２位におけるＰ、１２６位におけるＲ、１３０位におけるＶ、１３３位におけるＳ、１３４位におけるＡまたはＶ、１３６位におけるＬ、ＷまたはＶ、１３９位におけるＨ、１４２位におけるＩまたはＲ、１４４位におけるＳ、１４６位におけるＳ、１５２位におけるＴ、１５３位におけるＳ、１５４位におけるＳまたはＡのいずれか、１６８位におけるＶ、１６９位におけるＴ、１７７位におけるＦ、１７８位におけるＶ、１８０位におけるＩ、１８１位におけるＧまたはＩ、１８４位におけるＫ、１８６位におけるＹ、１９４位におけるＬ、１９８位におけるＮ、１９９位におけるＭ、２１５位におけるＥ、２３６位におけるＧ、２３７位におけるＶ、２３８位におけるＬ、２４０位におけるＴ、２４５位におけるＩまたはＡまたはＶのいずれか、２４９位におけるＹ、２５２位におけるＶまたはＩ、および、２５４位におけるＶからなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基を含む、ポリペプチド。

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