JP2007277565A - 電子欠乏窒素複素環で置換したフルオレセイン色素 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、概して、分子プローブを調製するための標識試薬として有用な蛍光色素化合物に関する。より詳細には、本発明は、キサンテン環構造および電子欠乏窒素複素環式置換基を有するフルオレセインに関する。
蛍光標識を使用する生物学的検体の非放射性検出は、現代の分析バイオテクノロジーにおいて重要な技術である。放射性標識の必要性を除くことによって、安 全性が高められ、そして試薬の処分に伴う環境への影響およびコストは大いに減少する。このような蛍光検出法を使用する例としては、自動DNA配列決定法、オリゴヌクレオチドプローブ法、ポリメラーゼ連鎖反応産物の検出、免疫アッセイなどが挙げられる。
の必要性が発生する。
R1、R2、R3、R4、R5、またはR7の少なくとも1つが、電子欠乏窒素複素環であり;
R1は単独の場合、H、F、Cl、(C1〜C6)アルキル、(C1〜C6)置換アルキル
、(C1〜C6)アルコキシ、スルホネート、スルホン、アミノ、イミニウム、アミド、ニトリル、反応性連結基、フェニル、置換フェニル、アリール、置換アリール、もしくは複素環であり、またはR1はR7と一緒になって、ベンゾまたは複素環であり;
R2は単独の場合、H、F、Cl、(C1〜C6)アルキル、(C1〜C6)置換アルキル
、(C1〜C6)アルコキシ、スルホネート、スルホン、アミノ、イミニウム、アミド、ニトリル、反応性連結基、フェニル、置換フェニル、アリール、置換アリール、もしくは複素環であり;
R3は単独の場合、H、F、Cl、(C1〜C6)アルキル、(C1〜C6)置換アルキル
、(C1〜C6)アルコキシ、スルホネート、スルホン、アミノ、イミニウム、アミド、ニトリル、反応性連結基、フェニル、置換フェニル、アリール、置換アリール、もしくは複素環であり;
R4は単独の場合、H、F、Cl、(C1〜C6)アルキル、(C1〜C6)置換アルキル
、(C1〜C6)アルコキシ、スルホネート、スルホン、アミノ、イミニウム、アミド、ニトリル、反応性連結基、フェニル、置換フェニル、アリール、置換アリール、もしくは複素環であり、またはR4はR5と一緒になって、ベンゾまたは複素環であり;
R5は単独の場合、H、F、Cl、(C1〜C6)アルキル、(C1〜C6)置換アルキル
、(C1〜C6)アルコキシ、スルホネート、スルホン、アミノ、イミニウム、アミド、ニトリル、反応性連結基、フェニル、置換フェニル、アリール、置換アリール、もしくは複素環であり、またはR5はR4と一緒になって、ベンゾまたは複素環であり;
R7は単独の場合、H、F、Cl、(C1〜C6)アルキル、(C1〜C6)置換アルキル
、(C1〜C6)アルコキシ、スルホネート、スルホン、アミノ、イミニウム、アミド、ニトリル、反応性連結基、フェニル、置換フェニル、アリール、置換アリール、もしくは複素環であり、またはR7はR1と一緒になって、ベンゾまたは複素環であり;そして
R6は、(C1〜C6)アルキル、(C2〜C6)アルケン、(C2〜C6)アルキン、シア
ノ、複素環式芳香族、フェニル、および以下:
ここで、X1、X2、X3、X4およびX5は、独立して、H、Cl、F、(C1〜C6)アル
キル、(C2〜C6)アルケン、(C2〜C6)アルキン、CO2H、SO3H、CH2OH、
または反応性連結基である、化合物。
(項目2) 項目1に記載のフルオレセイン色素であって、前記電子欠乏複素環が、2−ピリジル、3−ピリジル、4−ピリジル、2−キノリル、3−キノリ ル、4−キノリル、2−イミダゾール、4−イミダゾール、3−ピラゾール、4−ピラゾール、ピリダジン、ピリミジン、ピラジン、シンノリン、フタラジン、キナゾリン、キノキサリン、3−(1,2,4−N)−トリアゾリル、5−(1,2,4−N)−トリアゾリル、5−テトラゾリル、4−(1−O,3−N)− オキサゾール、5−(1−O,3−N)−オキサゾール、4−(1−S,3−N)−チアゾール、5−(1−S,3−N)−チアゾール、2−ベンゾキサゾール、2−ベンゾチアゾール、4−(1,2,3−N)−ベンゾトリアゾール、およびベンズイミダゾールからなる群から選択される、フルオレセイン色素。
(項目3) 項目1に記載のフルオレセイン色素であって、R4がR5と一緒になってベンゾである、フルオレセイン色素。
(項目4) 項目1に記載のフルオレセイン色素であって、R1がR7と一緒になってベンゾである、フルオレセイン色素。
(項目5) 項目1に記載のフルオレセイン色素であって、R6が以下:
(項目6) 項目5に記載のフルオレセイン色素であって、X3およびX4の一方がカルボキシルであり、他方が水素である、フルオレセイン色素。
(項目7) 項目1に記載のフルオレセイン色素であって、R1、R2、R3およびR4が各々独立して、フェニルまたは置換フェニルである、フルオレセイン色素。
(項目8) 項目1に記載のフルオレセイン色素であって、R1、R2、R3およびR4が各々独立して、ナフチルまたは置換ナフチルである、フルオレセイン色素。
(項目9) 項目1に記載のフルオレセイン色素であって、R2およびR3がそれぞれ独立して、フルオロまたはクロロである、フルオレセイン色素。
(項目10) 項目1に記載のフルオレセイン色素であって、R2およびR3がそれぞれ独立して、2−ピリジルまたは3−ピリジルである、フルオレセイン色素。
(項目11) 項目1に記載のフルオレセイン色素であって、R2およびR3がそれぞれ独立して、2−キノリルまたは3−キノリルである、フルオレセイン色素。
(項目12) 項目1に記載のフルオレセイン色素であって、R5およびR7が水素である、フルオレセイン色素。
(項目13) 項目1に記載のフルオレセイン色素であって、前記反応性連結基が、スクシンイミジルエステル、イソチオシアネート、塩化スルホニル、2,6 −ジクロロトリアジニル、ペンタフルオロフェニルエステル、ホスホルアミダイト、マレイミド、ハロアセチル、およびヨードアセトアミドからなる群から選択される、フルオレセイン色素。
(項目14) 以下:
(項目15) 項目1に記載のフルオレセイン色素で基質を標識する方法であって、該方法が、該基質を該フルオレセイン色素の反応性連結基と反応させ、基質−色素結合体が形成される工程を包含する、方法。
(項目16) 前記反応性連結基が、N−ヒドロキシスクシンイミドである、項目15に記載の方法。
(項目17) 前記反応性連結基が、ホスホルアミダイトである、項目15に記載の方法。
(項目18) 前記基質が、ポリヌクレオチド、ヌクレオチド、ヌクレオシド、ペプチド、タンパク質、炭水化物、リガンド、粒子、および表面からなる群から選択される、項目15に記載の方法。
(項目19) 前記粒子が、ナノ粒子、ミクロスフィア、ビーズ、およびリポソームである、項目18に記載の方法。
(項目20) 前記表面が、ガラスである、項目18に記載の方法。
(項目21) エネルギー移動色素化合物であって、以下:
第1波長で光を吸収し得、そしてドナー色素によって発せられる励起エネルギーを吸収し得るアクセプター色素にリンカーによって連結され、応答の際に励起エネルギーを発し、そして応答の際に第2波長で蛍光発光する、ドナー色素、
を含み、
ここで、該ドナー色素およびアクセプター色素の少なくとも1つが、項目1に記載のフルオレセイン色素である、エネルギー移動色素化合物。
(項目22) 前記リンカーが、以下:
(項目23) 前記リンカーが、以下:
(項目24) 前記リンカーが、以下:
Bが核酸塩基であり;
R8がH、モノホスフェート、ジホスフェート、トリホスフェート、チオフォスフェー
ト、またはホスフェートアナログであり;
R9およびR10が単独の場合、各々独立して、H、HO、F、およびポリメラーゼ媒介
標的指向重合を阻止する部分であるか、またはR9およびR10が一緒になって、2’−3
’−ジデヒドロリボースを形成し;そして
Lがリンカーである、標識したヌクレオシドまたはヌクレオチド。
(項目26) 項目25に記載の標識したヌクレオシドまたはヌクレオチドであって、Bが、ウラシル、チミン、シトシン、アデニン、7−デアザアデニン、グアニン、および8−デアザグアノシンからなる群から選択される、標識したヌクレオシドまたはヌクレオチド。
(項目27) 項目25に記載の標識したヌクレオシドまたはヌクレオチドであって、Lが以下:
(項目28) 酵素的に組み込み可能である、項目25に記載の標識したヌクレオシドまたはヌクレオチド。
(項目29) ターミネーターである、項目25に記載の標識したヌクレオシドまたはヌクレオチド。
(項目30) 以下の構造を有する、項目29に記載のターミネーターヌクレオチドであって:
Bが核酸塩基であり;
R8がトリホスフェート、α−チオトリホスフェート、またはトリホスフェートアナロ
グであり;
R9およびR10が単独の場合、各々独立して、H、F、およびポリメラーゼ媒介標的指
向重合を阻止する部分であるか、またはR9およびR10が一緒になって、2’−3’−ジ
デヒドロリボースを形成し;そして
Lがリンカーである、ターミネーターヌクレオチド。
(項目31) 酵素的に伸長可能である、項目25に記載の標識したヌクレオシドまたはヌクレオチド。
(項目32) 以下の式を有する、標識したオリゴヌクレオチドあって:
DYEが項目1に記載のフルオレセイン色素であるか、または項目21に記載のエネルギー移動色素であり;
Bが核酸塩基であり;
Lがリンカーであり;
R10がH、OH、ハライド、アジド、アミン、アルキルアミン、アルキル(C1〜C6)、アリル、アルコキシ(C1〜C6)、OCH3、またはOCH2CH=CH2であり;
R15がH、ホスフェート、ヌクレオチド間ホスホジエステル、またはヌクレオチド間アナログであり;そして
R16がH、ホスフェート、ヌクレオチド間ホスホジエステル、またはヌクレオチド間ア
ナログである、標識したオリゴヌクレオチド。
(項目33) 以下の式を有する、標識したオリゴヌクレオチドあって:
DYEが項目1に記載のフルオレセイン色素であり;
XがO、NH、またはSであり;
Bが核酸塩基であり;
Lがリンカーであり;
R10がH、OH、ハライド、アジド、アミン、アルキルアミン、アルキル(C1〜C6)、アリル、アルコキシ(C1〜C6)、OCH3、またはOCH2CH=CH2であり;そし
て
R15がヌクレオチド間ホスホジエステルまたはヌクレオチド間アナログである、標識したオリゴヌクレオチド。
(項目34) 項目33に記載の標識したオリゴヌクレオチドであって、Lがアルキルジイル(C1〜C12)である、標識したオリゴヌクレオチド。
(項目35) 項目33に記載の標識したオリゴヌクレオチドであって、Lが−(CH2
CH2O)n−を含む易動度改変因子であり、ここでnが1〜100である、標識したオリゴヌクレオチド。
(項目36) 以下の式を有する、ホスホルアミダイト化合物であって:
Lがリンカーであり;
R11およびR12が独立して、アルキル(C1〜C12)、アルケン、アリール、および1
0個までの炭素原子を含むシクロアルキルからなる群から選択され;またはR11およびR12が窒素原子と一緒になって、飽和した窒素複素環を形成し;そして
R13が亜リン酸エステル保護基である、ホスホルアミダイト化合物。
(項目37) R13が、メチル、2−シアノエチル、および2−(4−ニトロフェニル)エチルからなる群から選択される、項目36に記載のホスホルアミダイト化合物。
(項目38) R11およびR12が、それぞれイソプロピルである、項目36に記載のホス
ホルアミダイト化合物。
(項目39) R11およびR12が、一緒になってモルホリノである、項目36に記載のホスホルアミダイト化合物。
(項目40) Lが、アルキルジイル(C1〜C12)である、項目36に記載のホスホル
アミダイト化合物。
(項目41) 前記フルオレセイン色素が、R6でリンカーによって結合される、項目3
6に記載のホスホルアミダイト化合物。
(項目42) 以下の構造のホスホルアミダイト化合物であって:
(項目43) 以下の式を有する、ホスホルアミダイト化合物であって:
Bが核酸塩基であり;
Lがリンカーであり;
R11およびR12が独立して、アルキル(C1〜C6)、アルケン、アリール、および10個までの炭素原子を含むシクロアルキルからなる群から選択され;またはR11およびR12が窒素原子と一緒になって、飽和した窒素複素環を形成し;
R13が亜リン酸エステル保護基であり;そして
R14が酸−切断可能なヒドロキシ保護基である、ホスホルアミダイト化合物。
(項目44) 項目43に記載のホスホルアミダイト化合物であって、ここで、R13が、メチル、2−シアノエチル、および2−(4−ニトロフェニル)エチルからなる群から選択される、ホスホルアミダイト化合物。
(項目45) 項目43に記載のホスホルアミダイト化合物であって、ここで、R11およびR12が、それぞれイソプロピルである、ホスホルアミダイト化合物。
(項目46) 項目43に記載のホスホルアミダイト化合物であって、R11およびR12が
一緒になって、モルホリノである、ホスホルアミダイト化合物。
(項目47) 項目43に記載の化合物であって、ここで、Lが以下:
(項目48) 項目43に記載の化合物であって、ここで、Lが以下:
(項目49) 項目43に記載の化合物であって、ここで、Lが以下:
(項目50) 項目43に記載の化合物であって、Bが、ウラシル、チミン、シトシン、アデニン、7−デアザアデニン、グアニン、および8−デアザグアノシンからなる群から選択される、化合物。
(項目51) 標識したオリゴヌクレオチドを合成する方法であって、項目36のホスホルアミダイト化合物を固体支持体上のオリゴヌクレオチドにカップリングする工程を包含する、方法。
(項目52) 標識したオリゴヌクレオチドを合成する方法であって、ヌクレオシドホスホルアミダイト試薬を固体支持体にカップリングする工程を包含し、ここで、該固体支持体が、項目1に記載の色素または項目21に記載のエネルギー移動化合物で標識される、方法。
(項目53) 標識したプライマー伸長産物を産生する方法であって、連続プライマー伸長を支持し得る酵素的に伸長可能なヌクレオチドおよびターミネーター の混合物の存在下で、プライマー−標的ハイブリッドを酵素的に伸長する工程を包含し、ここで、該プライマーまたは該ターミネーターが、項目1に記載の色素または項目21に記載のエネルギー移動化合物で標識される、方法。
(項目54) オリゴヌクレオチド連結の方法であって、該方法は以下:
2つのプローブを標的配列にアニーリングする工程;および
一方のプローブの5’末端と他方のプローブの3’末端との間のホスホジエステル結合を形成する工程;
を包含し、
ここで、1つまたは両方のプローブが、項目1に記載の色素または項目21に記載のエネルギー移動化合物で標識される、方法。
(項目55) フラグメント分析の方法であって、該方法は以下:
ポリヌクレオチドフラグメントをサイズ依存分離プロセスに供する工程であって、該フラグメントが項目1に記載のフルオレセイン色素または項目21に記載のエネルギー移動化合物で標識される、工程;および
該分離プロセスの後に、該標識したポリヌクレオチドフラグメントを検出する工程、
を包含する、方法。
(項目56) 前記フラグメントが、易動度改変標識で標識される、項目55に記載の方法。
(項目57) 前記フラグメントが、連結によって形成される、項目55に記載の方法。(項目58) 項目55に記載の方法であって、前記サイズ依存分離プロセスが電気泳動であり、そして該標識したポリヌクレオチドフラグメントが蛍光によって検出される、方法。
(項目59) 増幅の方法であって、該方法が以下:
2つ以上のプライマーを標的DNA配列にアニーリングする工程;および
ポリメラーゼ、および酵素的に伸長可能なヌクレオチドの混合物によって該プライマーを伸長する工程;
を包含し、ここで、該プライマーまたはヌクレオチドが項目1に記載の色素で標識される、方法。
(項目60) 増幅の方法であって、該方法が以下:
2つ以上のプライマーおよび蛍光色素−クエンチャープローブを標的DNA配列にアニーリングする工程;および
ポリメラーゼ、および酵素的に伸長可能なヌクレオチドの混合物によって該プライマーを伸長する工程;
を包含し、ここで、該プローブが項目1に記載の色素で標識される、方法。
(項目61) オリゴヌクレオチドを標識するためのキットであって、項目1に記載の反応性連結基を含む色素およびオリゴヌクレオチドを含む、キット。
(項目62) オリゴヌクレオチドを標識するためのキットであって、項目36に記載のホスホルアミダイト化合物およびオリゴヌクレオチドを含む、キット。
(項目63) 標識したプライマー伸長産物を産生するためのキットであって、該キットは、連続プライマー伸長を支持し得る酵素的に伸長可能なヌクレオチ ド、ターミネーターおよびプライマーを含み、ここで、該プライマーまたは該ターミネーターが項目1に記載の色素で標識される、キット。
(項目64) 標識したプライマー伸長産物を産生するためのキットであって、該キットは、連続プライマー伸長を支持し得る酵素的に伸長可能なヌクレオチ ド、ターミネーターおよびプライマーを含み、ここで、該プライマーまたは該ターミネーターが項目21に記載のエネルギー移動色素で標識される、キット。
(項目65) 標識したプライマー伸長産物を産生するためのキットであって、該キットは、連続プライマー伸長を支持し得る酵素的に伸長可能なヌクレオチ ド、ターミネーターおよびプライマーを含み、ここで、該プライマーまたは該ターミネーターが項目14に記載の色素で標識される、キット。
(項目66) 項目65に記載のキットであって、前記ターミネーターが一組の4つの異なるターミネーターであって、該ターミネーターの1つは標的Aで終結 し、該ターミネーターの1つは標的Gで終結し、該ターミネーターの1つは標的Cで終結し、そして該ターミネーターの1つは標的TまたはUで終結する、キット。
(項目67) 項目66に記載のキットであって、前記一組の4つの異なるターミネーターが、一組の、易動度が一致したターミネーターである、キット。
本発明は、多色蛍光検出に有用なスペクトル的に分解可能な蛍光標識のセットの作製に適切な、色素化合物に関する。
に連結した少なくとも1つの電子欠乏窒素複素環で置換されている。
キル、(C1−C6)アルコキシ、スルホネート、スルホン、アミノ、イミニウム(imminium)、アミド、ニトリル、反応性連結基、フェニル、アリール、置換アリール、または複素環であるか、あるいはR7一緒の場合に、ベンゾまたは複素環である。
ル、(C1−C6)アルコキシ、スルホネート、スルホン、アミノ、イミニウム、アミド、ニトリル、反応性連結基、フェニル、アリール、置換アリール、または複素環である。
ル、(C1−C6)アルコキシ、スルホネート、スルホン、アミノ、イミニウム、アミド、ニトリル、反応性連結基、フェニル、アリール、置換アリール、または複素環である。
キル、(C1−C6)アルコキシ、スルホネート、スルホン、アミノ、イミニウム、アミド、ニトリル、反応性連結基、フェニル、アリール、置換アリール、または複素環であるか、あるいはR5一緒の場合に、ベンゾまたは複素環である。
キル、(C1−C6)アルコキシ、スルホネート、スルホン、アミノ、イミニウム、アミド、ニトリル、反応性連結基、フェニル、アリール、置換アリール、または複素環であるか、あるいはR4一緒の場合に、ベンゾまたは複素環である。
キル、(C1−C6)アルコキシ、スルホネート、スルホン、アミノ、イミニウム、アミド、ニトリル、反応性連結基、フェニル、アリール、置換アリール、または複素環であるか、あるいはR1一緒の場合に、ベンゾまたは複素環である。
ルキル、(C2−C6)アルケン、(C2−C6)アルキン、CO2H、SO3H、CH2OH
、または反応性連結基である。
ここで、本発明の好ましい実施形態への言及が詳細になされ、これらの例は、付随する図面に示される。本発明は好ましい実施形態と組み合わせて記載されるが、本発明をこれ
らの実施形態に限定することは意図されないことが理解される。逆に、本発明は、添付の特許請求の範囲によって規定される本発明の範囲内に含まれ得る、あらゆる変更、改変、および等価物を包含することを意図する。
他で述べられない限り、以下の用語および語句は、本明細書中で使用される場合、以下の意味を有することが意図される:
「核酸塩基」は、相補的な核酸塩基または核酸塩基アナログとワトソンクリック水素結合を形成し得る、窒素含有複素環部分(例えば、プリン、7−デアザプ リン、またはピリミジン)を意味する。代表的な核酸塩基は、天然に存在する拡散塩基であるアデニン、グアニン、シトシン、ウラシル、チミン、およびこれらの天然に存在する核酸塩基のアナログ(例えば、7−デアザアデニン、7−デアザグアニン、イノシン、ネブラリン、ニトロピロール、ニトロインドール、2− アミノ−プリン、2,6−ジアミノ−プリン、ヒポキサンチン、プソイドウリジン、プソイドシチジン、プソイドイソシチジン、5−プロピニル−シチジン、イソシチジン、イソグアニン、7−デアザ−グアニン、2−チオ−ピリミジン、
6−チオ−グアニン、4−チオ−チミン、4−チオ−ウラシル、O6−メチル−グアニン
、N6−メチル−アデニン、O4− メチル−チミン、5,6−ジヒドロチミン、5,6−ジヒドロウラシル、4−メチル−インドール、およびエテノアデニン(Fasman、Practical Handbook of Biochemistry and Molecular Biology、385〜394頁、CRC Press、Boca Raton、Fl(1989)))である。
に限定されない。特定の好ましいリボースは、リボース、2’−デオキシリボース、2’,3’−デオキシリボース、3’−ハロリボース、3’−フルオロリ ボース、3’−クロロリボース、および3’−アルキルリボースである。核酸塩基がAまたはGである場合、リボース糖は核酸塩基のN9位置に結合している。核酸塩基がC、T、またはUである場
合、ペントース糖は、核酸塩基のN1位置に結合している(KornbergおよびBa
ker、DNA Replication、第2版、Freeman、San Francisco、CA、(1992))。
た、デオキシリボヌクレオチドのみからなるか、リボヌクレオチドのみからなるか、またはそのキメラ混合物からなり得る。オリゴヌクレオチドは、核酸塩基アナログおよび糖アナログからなり得る。ポリヌクレオチドの大きさの範囲は、代表的に2〜3個のモノマー単位からであり、それらが一般にオリゴヌクレオチド といわれる場合は、例えば5〜40個から数千個のモノマーヌクレオチド単位である。他に示されない限りオリゴヌクレオチド配列が示されるときはいつでもヌクレオチドは左から右へ5’〜3’の順序であること、および他に示されない限り「A」はデオキシアデノシンを示し、「C」はデオキシシチジンを示し、 「G」はデオキシグアノシンを示し、「T」はチミジンを示すことが理解される。
ニル(−CH=CH2)、エチニル(−C≡CH)のようなエチル;プロパン−1−イル
(−CH2−CH2−CH3)、プロパン−2−イル、シクロプロパン−1−イル、プロパ
−1−エン−1−イル(−CH=CH−CH2)、プロパ−1−エン−2−イル、プロパ
−2−エン−1−イル(−CH2−CH=CH2)、プロパ−2−エン−2−イル、シクロプロパ−1−エン−1−イル;シクロプロパ−2−エン−1−イル、プロパ−1−イン−1−イル(−C≡C−CH3)、プロパ−2−イン−1−イル(−CH2−C≡CH)な
どのようなプロピル;ブタン−1−イル(−CH2−CH2−CH2−CH3)、ブタン−2−イル、シクロブタン−1−イル、ブタ−1−エン−1−イル(−CH=CH2−CH2−CH3)、ブタ−1−エン−2−イル、ブタ−2−エン−1−イル(−CH2−CH=CH2−CH3)、ブタ−2−エン−2−イル、ブタ−1,3−ジエン−1−イル(−CH=CH−CH=CH2)、ブタ−1,3−ジエン−2−イル、シクロブタ−1−エン−1−イ
ル、シクロブタ−1−エン−3−イル、シクロブタ−1,3−ジエン−1−イル、ブタ−1−イン−1−イル(−C≡C−CH2−CH3)、ブタ−1−イン−3−イル、ブタ−3−イン−1−イル(−CH2−CH2−C≡CH)などのようなブチル;など。好ましい実施形態において、アルキル基は(C1−C6)アルキルであり、(C1−C3)が特に好ましい。
);1,2−エチルジイル;1,3−プロピルジイル;1,4−ブチルジイル;などが挙げられるがこれらに限定されない。
SCN、−NCO、−NCS、−NO、−NO2=N2、−N3、−S(O)2O-、−S(
O)2OH、−S(O)2R、−P(O)(O-)2、−P(O)(OH)2、−C(O)R
、−C(O)X、−C(S)R、−C(O)OR、−C(O)O-、−C(S)OR、−
C(O)SR、−C(S)SR、−C(O)NRR、−C(S)NRR、および−C(NR)NRR、ここで、各Xは、独立してハロゲンであり、そして各Rは、独立して−H、アルキル、アリール、または複素環である。特に好ましい置換基は、以下である:ハロゲン、−OS(O)2OR、−S(O)2OR、−S(O)2R、−S(O)2NR、−S(O)R、−OP(O)O2RR、−P(O)O2RR、−C(O)OR、−NRR、−NRRR、−NC(O)R、−C(O)R、−C(O)NRR、−CN、−O、および−OR、ここでRは、−H、アルキル、アリール、ヘテロアリール、複素環、および連結基からなる群より独立して選択される。
& Sonsの部、New York(1967))。いくつかの例示的な電子欠乏窒素複素環が図11に示される。
にポリメラーゼ酵素の作用を介して酵素的に組み込まれ得る、ヌクレオチドの性質をいう。
984)Nucleic Acids Res.、12:1671−1686;およびChidgeavadzeら、(1985)FEB.Lett.、 183:275−278)。ヌクレオチドターミネーターはまた、可逆ヌクレオチドターミネーターを含む(Metzkerら(1994)Nucleic
Acids Res.、22(20):4259)。
polyamide”Science 254:1497−1500)。
に、実質的に類似の電気泳動易動度を有する、別個に標識されたポリヌクレオチドを生じる、蛍光色素のセットをいう。代表的に、易動度一致色素のセットで標識されたポリヌクレオチドの相対的な電気泳動易動度は、ヌクレオチドの約1/2未満だけ異なる。好ましくは、易動度一致色素は、上記で定義されたようにス ペクトル的に分解可能である。
第1の局面において、本発明は、以下の構造Iに従う新しいクラスのフルオレセイン型キサンテン環化合物:
キル、(C1−C6)アルコキシ、スルホネート、スルホン、アミノ、イミニウム、アミド、ニトリル、反応性連結基、フェニル、置換フェニル、アリール、置換アリール、または複素環であるか、あるいはR7と一緒の場合に、ベンゾまたは複素環である。
ル、(C1−C6)アルコキシ、スルホネート、スルホン、アミノ、イミニウム、アミド、ニトリル、反応性連結基、フェニル、置換フェニル、アリール、置換アリール、または複素環である。
ル、(C1−C6)アルコキシ、スルホネート、スルホン、アミノ、イミニウム、アミド、ニトリル、反応性連結基、フェニル、置換フェニル、アリール、置換アリール、または複素環である。
キル、(C1−C6)アルコキシ、スルホネート、スルホン、アミノ、イミニウム、アミド
、ニトリル、反応性連結基、フェニル、置換フェニル、アリール、置換アリール、または複素環であるか、あるいはR5と一緒の場合に、ベンゾまたは複素環である。
キル、(C1−C6)アルコキシ、スルホネート、スルホン、アミノ、イミニウム、アミド、ニトリル、反応性連結基、フェニル、置換フェニル、アリール、置換アリール、または複素環であるか、あるいはR4と一緒の場合に、ベンゾまたは複素環である。
キル、(C1−C6)アルコキシ、スルホネート、スルホン、アミノ、イミニウム、アミド、ニトリル、反応性連結基、フェニル、置換フェニル、アリール、置換アリール、または複素環であるか、あるいはR1と一緒の場合に、ベンゾまたは複素環である。
ノ、複素環式芳香族、フェニル、および以下の式IIを有する置換フェニルからなる群より選択され:
ルキル、(C2−C6)アルケン、(C2−C6)アルキン、CO2H、SO3H、CH2OH
、または反応性連結基である。
3−キノリル、4−キノリル、2−イミダゾール、4−イミダゾール、3−ピラゾール、4−ピラゾール、ピリダジン、ピリミジン、ピラジン、シノリン、フタラジン(pthalazine)、キナゾリン、キノキサリン、3−(1,2,4−N)−トリアゾリル、5−(1,2,4−N)−トリアゾリル、5−テトラ ゾリル、4−(1−O,3−N)−オキサゾール、5−(1−O,3−N)−オキサゾール、4−(1−S,3−N)−チアゾール、5−(1−S,3−N)−チアゾール、2−ベンゾキサゾール、2−ベンゾチアゾール、ベンゾトリアゾール、4−(1,2,3−N)−ベンゾトリアゾール、およびベンズイミダゾー ル。複素環は、複素環式環の炭素原子との結合によって直接的に、キサンテン環系に結合され得る。あるいは複素環は、複素環とキサンテン環系との間の芳香族性の非局在化を広げる不飽和リンカーを介して、キサンテン環系に結合され得る。広範な電子の非局在化を可能にするリンカーとしては、以下が挙げられるがこ れらに限定されない:(i)オレフィン型;−CR=CR−、(ii)ポリオレフィン型;−(CR=CR)n−、ここで、nは2〜10である(iii)アセチレン型;−C≡C−、(iv)ポリ
アセチレン型;−(C≡C)n−、ここで、nは2〜10である(v)スクアリン(sq
uarine)および(vi)他の結合体型リンカー。Rは、水素、(C1−C6)アルキル、ハロゲン、フッ素、塩素、CN、CF3、アリール、および置換アリールからなる群
より選択される。オレフィン結合の形状は、シスまたはトランス、EまたはZであり得る。
別の局面において本発明は、電子欠乏窒素複素環で置換された構造Iのフルオレセイン色素化合物を組み込んでいるエネルギー移動色素化合物を含む。一般 に、本発明のエネルギー移動色素は、ドナー色素(第1波長で光を吸収し、そしてそれに応じて励起エネルギーを発する)、アクセプター色素(ドナー色素によって発せられた励起エネルギーを吸収し得、そしてそれに応じて第2波長で蛍光を発し得る)およびリンカー(ドナー色素をアクセプター色素に結合する。こ のリンカーは、ドナー色素とアクセプター色素との間の効果的なエネルギー移動を容易にするために有効であり、そしてアクセプター色素の高い発光量子収量を維持する)を含む。(Leeら“Energy transfer dyes with enhanced fluorescence”、1998年9月1 日発行の米国特許第5,800,996号;Leeら“Energy transfer dyes with enhanced fluorescence”、1999年8月31日発行の米国特許第5,945,526号;Mathiesら“Fluorescent labels and their use in separations”1997年8月5日発行の米国特許第5,654,419号)。本発明のエネルギー移動色素において、少なくとも1つのドナーアクセプター色素は、電子欠乏窒素複素環で置換されたフルオレセイン色素である。
によって結合され得:
いくつかの合成方法が、本発明の蛍光色素の合成のために利用可能である。中間体の合成の好ましい方法は、白金触媒Suzukiボロネートカップリング反 応を介し、これにより、アリールボロン酸がハロゲン化アリールとカップリングされ、位置選択性を伴ってビアリール生成物が得られる(Zhangら(1998)「Base and cation effects on the Suzuki cross−coupling of bulky artlboronic acid with halopyridines:systhesis of pyridylphenols」,L.Org.Chem.63:6886−90;Martinら(1993)「Palladium−catalyzed cross−coupling reactions of organoboronic acids with organic electrophiles」,Acta Chemica Scan.47:221−30;Alipra
ntisら(1994)「Observation of catalytic intermediates in the Suzuki
reaction by electrospray mass spectrometry」,J.Am.Chem.Soc.116:6985−86; Thompsonら(1984)「A general synthesis of 5−arylnicotinates」,J.Org.Chem.49:5237−43)。
本発明は、標識試薬を含み、ここで、電子欠乏窒素複素環置換フルオレセイン色素は、基質と反応するための反応性形態である。別の局面において、本発明 は、本発明(すなわち、構造I)のフルオレセイン色素で標識または結合体化された基質を含む。基質は、実質的に、本発明の色素が結合体化され得る任意の分子または物質であり得、例えば、タンパク質、ポリペプチド、多糖、ヌクレオシド、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、脂質、固体支持体、有機および無機ポリ マー、ならびにその組み合わせおよびアセンブリ(例えば、染色体、核、生細胞(例えば、細菌または他の微生物、哺乳動物細胞、組織など)などが挙げられるがこれらに限定されない。この色素は、種々の手段によって任意のリンカー(疎水性引力、イオン性引力、および共有結合が挙げられる)を介して基質と結合体 化される。好ましくは、この色素は、共有結合を介して基質に結合体化される。
よって得られる。この色素結合体は、後の使用のために乾燥保存され得るかまたは溶液中で保存され得る。
おいて反応性結合基を含むか、または別の分子(すなわち、基質)への色素の共有結合を含み得る。反応性結合基は、色素および共有結合を形成し得る基質上の 部分である。代表的に、この色素は、基質上の求核性官能基と反応し得る求電子性官能基を有する。基質求核試薬の例としては、アルコール、アルコキシド、アミン、ヒドロキシルアミン、およびチオールが挙げられる。色素を基質に結合体化させるために使用される反応性結合基の選択は、代表的に、結合される基質上 の相補的な官能性に依存する。求電子反応性結合基の例としては、スクシンイミジルエステル、イソチオシアネート、塩化スルホニル、スルホネートエステル、ハロゲン化シリル、2,6−ジクロロトリアジニル、ペンタフルオロフェニルエステル、ホスホルアミダイト、マレイミド、ハロアセチル、エポキシド、アルキ ルハライド、ハロゲン化アリル、アルデヒド、ケトン、アシルアジド、無水物およびヨウ化アセトアミドが挙げられる。単一の型の反応性結合基は、基質(代表的に多糖)に関して利用可能であり得、または、種々の基(例えば、アミン、チオール、アルコール、フェノール)は、タンパク質について代表的であるよう に、利用可能であり得る。結合される基質は、1より多い色素(この色素は、同一であっても異なってもよい)、またはハプテンによってさらに修飾される基質に結合化され得る。いくらかの選択性は、反応条件の注意深い制御によって得られるが、標識の選択性は、適切な反応色素の選択によって最も良好に得られる。
の求核性基(例えば、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド、ペプチド、など)と反応し得る。代表的に、本発明の色素のカルボキシル形態(例えば、表1の色素 化合物)は、カルボジイミド試薬(例えば、ジシクロヘキシルカルボジイミド、ジイソプロピルカルボジイミド)、またはウロニウム試薬(例えば、HBTU(O−ベンゾトリアゾール−1−イル)−N,N,N’,N’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート)またはHATU(O−(7−アザベンゾ トリアゾール−1−イル)−N,N,N’,N’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート)、および活性化剤(例えば、1−ヒドロキシベンゾトリアゾール(HOBt)、ならびにN−ヒドロキシスクシンイミドと反応して、この色素のNHSエステルが生じる。
たはR11およびR12は、窒素原子形態と共に一緒になって飽和窒素複素環を形成する。R
13は、亜リン酸エステル保護基であり、オリゴヌクレオチドの不要な伸長を妨げる。一般的に、R13は、オ リゴヌクレオチド合成条件に対して安定であるが、このオリゴヌクレオチドまたは色素の完全性に不利に影響を与えない試薬を用いて合成的オリゴヌクレオチド生成物から取り除かれ得る。これらの特徴を有する種々の亜リン酸エステル基は、当該分野で周知である。好ましくは、R13は、メチル;2−シアノエチル、−CH2CH2CN;および2−(4−ニトロフェニル)エチル、−CH2CH2(p−NO2Ph)である。ホ
スホルアミダイト色素試薬の好ましい実施形態は、以下である:(i)R11およびR12が各々イソプロピルであり、(ii)一緒になったR11およびR12がモルホリノであり、(iii)Lが、アルキル(C1〜C12)であり、(iv)R13が、2−シアノエチルであ
り、そして(v)DYEがリンカーによってR6で結合される。ホスホルアミダイト色素
試薬IIIは、本発明の単一のフルオレセイン色素による基質の標識を行う。基質がオリゴヌクレオチドである場合、この色素は、オリゴヌクレオチドの5’末 端で結合され、結果として、3’から5’の方向で合成される。他のホスホルアミダイト色素試薬(ヌクレシドおよび非ヌクレオシド)は、オリゴヌクレオチドの他の部位(例えば、3’末端、核酸塩基、ヌクレオチド間結合、糖)で標識可能にする。核酸塩基、ヌクレオチド間結合、および糖部位での標識は、フルオレ セイン色素を用いて内部標識および複数の標識を可能にする。
dye phosphoramidite labelling of oligonucleotides」,Nucleic Acid Symposium Series No.27,Oxford University Press,Oxford,99〜100頁)により、非ヌクレオシドのホスホルアミダイト色素標識試薬(例えば、以下:
support reagents for the direct synthesis of 3’−labelled polynucleotides」、米国特許第5,736,626号(1998年4月7日発行);Caruthers,M.およびMatteucci,M.「Process for preparing polynu
cleotides」、米国特許第4,458,066号(1984年7月3日発行)。1つの実施形態において、この色素は、固体支持体(例えば、制御された細孔ガラス(Nelson,etal(1992)「Oligonucleotide labeling methods 3. Direct labeling of oligonucleotides employing a novel,non−nucleosidic,2−aminobutyl−1,3−propanediol backbone」,Nucl.Acid Res.20:6253−59;Nelson,P. 「Muitifunctional controlled pore
glass reagent for solid phase oligonucleotide synthesis」、米国特許第5,141,813 号(1992年8月25日発行))またはポリスチレン(Andrus,etal「Automated system for polynucleotide synthesis and purification」、米国特許第5,047,524(1991年9月10日発行)お よび米国特許第5,262,530号(1993年11月16日発行))への結合、およびホスホルアミダイトヌクレオシド試薬を用いる伸長について酸に不安定な官能性を有するリンカーに結合される。切断および脱保護の後、標識されたオリゴヌクレオチドは、3’末端において本発明の色素を有し得る。
好ましいクラスの標識された基質は、本発明のフルオレセイン色素を用いて標識されるヌクレオシドおよびヌクレオチドの結合体を含む。このような標識され たヌクレオシドおよびヌクレオチドは、酵素合成(例えば、PCR増幅の状況において使用される標識されたヌクレオチド5’−トリホスフェート、Sanger型ポリヌクレオチド配列決定、およびnick翻訳反応)によって形成されるポリヌクレオチドを標識するために特に有用である。
ホスフェート、ジホスフェート、トリホスフェート、チオホスフェート、またはホスフェートアナログである。R9およびR10は、単独の場合、各々の独立してH、HO、Fであ
る。標識されたヌクレオシドまたはヌクレオチドが、ターミネーターである場合、R9お
よびR10は、ポリメラーゼ媒介標的指向重合をブロックするように選択される。ターミネーターのヌクレオチドにおいて、R9およびR10は、単独の場合、各々独立してH、Fお
よびポリメラーゼ媒介標的指向重合をブロックする部分であるか、または一緒になる場合、2’−3’−ジデヒドロリボースを形成する。
別の好ましいクラスの標識された基質は、本発明のフルオレセイン色素で標識されるオリゴヌクレオチドの結合体を含む。このような標識されたポリヌクレオ チドまたはアナログは、多くの重要な状況において有用であり、DNA配列決定プライマーとして、PCRプライマー、オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブ、オリゴヌクレオチド連結プローブ、二重標識された5’−エキソヌクレアーゼ(TaqManTM) プローブなどを含む(Fung,etal.「Amino−derivatized phosphite and phosphate linking agents,phosphoramidites precursors,and useful conjugates thereof」,米国特許第 4,757,141号(1998年7月12日発行);Andrus,A.「Chemical methods for 5’non−isotopic labelling of PCR probes and primers」(1995)PCR2:A Practical Approach, Oxford University Press,Oxford,39〜54頁;Hermanson,(1996)Bioconjugate Techniques,Academic Press,San Diego,CA.40〜55頁、643〜71頁)。標識されたオリゴヌクレオチドは、構 造V:
クレオチド間ホスホジエステル、またはヌクレオチド間アナログである。R16は、H、ホスフェート、ヌクレオチド間ホスホジエステルまたはヌクレオチド間アナログである。本実施形態において、構造Vの核酸塩基標識オリゴヌクレオチドは、核酸塩基を通して結合された本発明の複数の色素を有し得る。
酵素学的組み込み、および(ii)自動合成によるホスホルアミダイト色素ヌクレオシド試薬VIのカップリング、によって形成され得る。
Press)。1つまたは両方のプライマーは、本発明の色素で標識され得る。あるいは、1以上のヌクレオチドの5’−トリホスフェートは、本発明の色素で標識され得る。各標識スキームは、本発明の1以上の色素を有するDNA増幅産物を生じる。
Tホスホルアミダイトヌクレオシドを用いて合成されたオリゴヌクレオチド(ならびにそれらの対応する3’ヌクレオシド固体支持体)は、65℃にて濃縮され た水酸化アンモニウム中で60分にわたって切断および脱保護され得る(Baucage,S.およびIyer,R.(1992)「Advances in the synthesis of
oligonucleotides by
the phosphoramidite approach」,Tetrahedron 48:2223−2311)。
クレオチドは、1つのDYEのみを保有する。易動度改変因子リンカーは、オリゴヌクレオチドの電気泳動易動度または疎水的性質に影響する。易動度改変因子リンカーの例としては、エチレンオキシユニット、−(CH2CH2O)n−が挙げられ、ここで、nは、1
〜100であり得る(Grossmanら、「Method of DNA sequencing employing a mixed DNA− polymer chain probe」、米国特許第5,624,800号、1997年4月29日発行)。好ましくは、nは、2〜20である。標識されたオリゴヌクレオチドVIIは、ホスホラミダイト試薬III(特に例えばId)を用いて自動化合成によって形成され得る。あるいは、標識されたオリゴヌク レオチドVIIは、本発明の色素の反応性連結基形態(例えば、Ib)を、5’−アミノアルキルオリゴヌクレオチドと反応させることによって形成され得る。
度のトリエチルアミンアセテート(TEAA))を用いて溶出するサイズ排除クロマトグラフィーカラムを通過させることによって未反応の色素から分離され得る。粗製の標識オリゴヌクレオチドVIIを含む画分(ここで、Lは、−(CH2)6−である)は、勾配溶出を使用する逆相HPLCによってさらに精製される。
本発明は、本発明の電子欠乏性窒素複素環置換蛍光色素および/またはそれらの標識された結合体を含むキットを包含する。1つの実施形態において、キット は、本発明の色素を他の分子(すなわち基質)に結合するのに有用である。このようなキットは、一般的に最適な連結部分を含む本発明の色素および別の分子または基質に対して色素を結合するのに適切な試薬、酵素、緩衝液、溶媒などを含む。
本発明の色素および試薬は、蛍光検出を利用する任意の方法、特に、複数の空間的に重なる分析物の同時検出を必要とする方法によく適する(Menchen ら、「4,7−dichlorofluorescein dyes as molecular probes」、米国特許第5,188,934号、1993年2月23日発行)。本発明の色素および試薬は、生化学分離手順(例えば、電気泳動)に供されるポリヌクレオチドのクラス、または空間的にアドレ ス可能なハイブリダイゼーションアレイにおける位置の中に分布しているポリヌクレオチドのクラスを同定するために特によく適する。
system using the nuclease activity of a
nucleic acid polymerase」、米国特許第5,210,015号、1993年5月9日発行);Livakら、「Method for Detecting Nucleic Acid Amplification Using Self−Quenching Fluorescence Probe」、米国特許第5,538,848号、1996年7月23日発行)。蛍光色素−クエンチャープローブを使用するエキ ソヌクレアーゼアッセイ(Taqman(登録商標))(Livakら、「Self−quenching fluorescence probe」、米国特許第5,723,591号、1998年3月3日発行;Mullahら、(1998)「Efficient systhesis of double dye−labelled oligodeoxyribonucleotide probes and their
application in a real time PCR assay」、Nucl.Acids Res.26:1026〜1031)は、閉鎖 チューブシステムにおけるポリメラーゼ連鎖反応(PCR)生成物の直接検出を与え、これには、PCRを行うために必要とされるサンプルプロセシングを超えるサンプルプロセシングはない。Taqmanアッセイにおいて、プライマー伸長を行いそしてポリヌクレオチドを増幅するポリメラーゼはまた、5’〜3’エ キソヌクレアーゼ活性によって標的配列にアニールされるプローブを置換および切断する。Taqman型アッセイにおいて、プローブは、自己クエンチし、蛍光色素およびクエンチャー部分(これらのいずれもが本発明の色素であり得る)を用いて標識される。スペクトルの重なりは、プローブがインタクトである場 合、効率的なエネルギー移動(FRET)を可能にする(Clegg,R(1992)「Fluorescence resonance energy transfer and
nucleic acids」、Meth.Enzymol.211:353〜388)。標的配列にハイブリダイズされる場合、プローブは、PCRの間 に、標的−プローブハイブリッドの存在する量に比例した蛍光シグナルを放出するために切断される(Livakら、「Method for Detecting Nucleic Acid Amplification Using Self−Quenching Fluorescence Probe」、米国特許第5,538,848号、1996年7月23日発行;Livakら、「Self−quenching fluorescence probe」、米国特許第5,723,591号、1998年3月3日発行)。
2’,3’−ジデオキシリボヌクレオシド−5’−トリホスフェート)の存在下において標識された標的を用いてプライムされた標的配列を酵素的に伸長して得られ得る。あるいは、一連の標識されたポリヌクレオチドは、ポリメラーゼ、dNTP、および少なくとも1つの標識されたターミネーターの存在下で標識され ていないプライムされた標的を酵素的に伸長することによって得られ得る(Bergotら、「Spectrally resolvable rhodamine dyes for nucleic acid
sequence determination」、米国特許第5,366,860号、1994年11月22日発行)。いずれの実施形態においても、この ポリメラーゼは、ターミネーターが組み込まれる(これは、伸長反応を終了させる)までdNTPを用いてプライマーを伸長するのに役立つ。いったん終結すると、一連の標識されたポリヌクレオチドは、サイズに基づいて分離され、そして分離されたポリヌクレオチドが色素標識の蛍光に基づいて検出される。
ライマー配列のセットに依存する特定の遺伝型を示すプロフィールまたは特徴的データセットを確立する。
sequences in nucleic acids」、米国特許第4,883,750号、1989年発行;Landegrenら、(1988)「A ligase mediated
gene detection technique」、Science241:1077〜80;Nickersonら(1990)「Automated
DNA diagnostics using an ELISA−based oligonucleotide assay」Proc.Natl. Acid.Sci USA87:8923〜27)。オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイは、標的サンプル中の特定の配列の存在を検出する。1つまたは両方のプローブが、本発明の色素を用いて標識される場合、ライゲーション産物は、蛍光によって検出され得る(Grossmanら、(1994) 「High−density multiplex detection of nucleic acid sequences:oligonucleotide ligation assay and seqence−coded separation」、Nucl.Acids Res.22:4527〜34)。
5’トリホスフェート(ddNTP)を含む。適切な比率のdNTP(2’−デオキシヌクレオシド 5’−トリホスフェート)および4つのddNTPの1 つが使用される場合、酵素触媒重合が、ddNTPが組み込まれる各部位において連鎖の集団の画分において終結される。蛍光色素標識プライマーまたは標識ddNTPが各反応に使用される場合、配列情報が高分解能電気泳動による分離の後に蛍光によって検出され得る。連鎖終結方法において、本発明の色素が、配 列決定プライマーまたはジデオキシヌクレオチドのいずれかに接続し得る。色素は、プライマーの核酸塩基上の、プライマーの5’末端上の相補的な官能性に連結され得る(Fungら、「Amino−derivatized phosphite and phosphate linking agents、 phosphoramidite
precursors、and useful conjguates thereof」、米国特許第4,757,141号、1988年7月12日発行) か;あるいは、例えば、アルキニルアミノ連結基を介してジデオキシヌクレオチドの核酸塩基上に連結され得る(Khanら、「Substituted propargylethoxyamido nucleosides、oligonucleotide and methods for using same」米国特許第5,770,716号、1998年6月23日発行、および米国特許第5,821,356号、1998年10月13日発行;Hobbs,FおよびTrainor,G.「Alkynylamino−nucleotide」、米国特許第5,151,507号、1992年9月29日 発行)。
、色素化合物13を用いて、プロパルギルエトキシアミドリンカー(EO):3’FddGTP−EO−13を介して標識される:
2(P/N 903433、PE Corporation、Foster City、CA)January 1995)。最適電気泳動条件(例えば、特定の分離に使用さ
れる、ポリマー、ポリマー濃度、pH、温度、変性剤の濃度)は、分離されるべきポリヌクレオチドのサイズ範囲、それらの塩基組成(それらは一本鎖または二本鎖であるか否かにかかわらない)、および情報が電気泳動によって探索される分類の性質を含む多くの因子に依存する(Grossman,P.「High resolution DNA sequencing method using low viscosity medium」、米国特許第5,374,527号、1994年12月20日発行)。従って、本発明の用途は、特定の分離のために条件を最適化するために標準的な予備的試験を必要とし得る。
り得る)が挙げられる(Grossmannら、「Method of DNA sequencing employing a mixed DNA− polymer chain probe」、米国特許第5,624,800号、1997年4月29日発行)。好ましくは、nは、2〜20である。具体的には、フルオレセイン色素標識ポリヌクレオチドを、別個の既知のサイズのポリエチレンオキシのさらなる標識を用いて標識することによって、ポリヌクレオチド におけるヌクレオチドの数に独立して、電気泳動および検出による別次元の分離を可能にする。すなわち、同じ長さのポリヌクレオチドが、スペクトル的に分解可能な色素標識および易動度改変標識に基づいて識別され得る。色素標識と易動度改変標識の両方を有するポリヌクレオチドは、単一標識ポリヌクレオチドまた はヌクレオチド組成のライゲーションまたはポリメラーゼ伸長によって酵素的に形成され得る。あるいは、合成オリゴヌクレオチドは、本発明の色素の標識および易動度改変因子を有し得、これらは、自動化合成の間に(例えば、ホスホラミダイト試薬)、またはアミノ−またはチオール−オリゴヌクレオチドに合成後 カップリング(例えば、NHS標識カップリング)によって組み込まれる。
apparatus for DNA sequencing」、米国特許第4,811,218号、1989年3月7日発行)。
本発明は、以下の実施例によってさらに実施され得る。これは、本発明の純粋な例示であり、いずれの方法においても本発明の範囲を限定しないことを意図する。
(1,3−ジメトキシ−2−(トール−2−イル)−ベンゼン1の合成)
1,3−ジメトキシフェン−2−イルボロン酸:
(4g、3.46mmol)を、15分間攪拌し、次いで、8gの炭酸カリウム(35ml、水(ref)中)を添加した。6時間還流後、この反応混合物を、 水と酢酸エチルの1:1混合物800ml中に注いだ。有機層を水(300ml×2)、およびブライン(200×1)によって洗浄し、溶媒を除去し、そして粗生成物を、シリカゲルクロマトグラフィー(ヘキサン、酢酸エチル0%〜10%)によって精製し、1を10.5g(84%)で得た(図1)。
(1,3−ジメトキシ−2−(トール−2−イル)−4−ブロモベンゼン2の合成)
1,3−ジメトキシ−2−(トール−2−イル)−ベンゼン1(10g、43.86mmol)、N−ブロモスクシンイミド(8.26g、46. 4mmol)、および過塩素酸(70%、0.5ml)を、ジクロロメタン(200ml)中で混合し、そして室温で4時間攪拌させた。この反応混合物を、重炭酸ナトリウム溶液(5%、100ml)でクエンチし、ジクロロメタン層を、水(100ml)、ブライン(100ml)で洗浄し、そしてこの溶媒を除去し た。この粗生成物を、ヘキサンおよび酢酸エチル(0%〜10%の酢酸エチル)で溶出するシリカゲルクロマトグラフィーによって精製し、2を10.8g(80%)で得た。
(1,3−ジメトキシ−2−(トール−2−イル)−4−(ピリド−3−イル)−ベンゼン3の合成)
ピリジン−3−ボロン酸(5.81g、47.27mmol、Frontier Scientific,Inc.)、1,3−ジメトキシ−2−(トール− 2−イル)−4−ブロモベンゼン(2)(10.7g、34.8mmol)、グリム(200ml)、およびテトラキス(トリフェニルホスフィン)パラジウム(Ph3P)4Pd0(4g、3.4
6mmol)を、15分間攪拌し、次いで、炭酸カリウム(16g、70mlの水中)を添加した。10時間還流後、この反応混合物を、水と酢酸エチルの1: 1混合物800ml中に注いだ。有機層を水(300ml×2)、およびブライン(200ml)によって洗浄し、溶媒を除去し、そして粗生成物を、ヘキサンおよび酢酸エチル(10%〜25%の酢酸エチル)で溶出するシリカゲルクロマトグラフィーによって精製し、3を8.8g(83%)で得た。
(2−(トール−2−イル)−4−(ピリド−3−イル)−1,3−ジヒドロキシベン
ゼン4の合成)
1,3−ジメトキシ−2−(トール−2−イル)−4−(ピリド−3−イル)−ベンゼン3(3.5g、11.46mmol)、酢酸(30ml)、および臭 化水素酸(48%)(15ml)を、24時間還流した。この反応混合物を冷却後、この試薬のほとんどを減圧下で除去し、この残留の酸を、重炭酸ナトリウム溶液(5%)(100ml)とこの濃縮物を混合することによって除去した。この生成物を、酢酸エチル(100ml)で抽出し、水(100ml×2)および ブライン(100ml)で洗浄し、そしてこの酢酸エチルをエバポレートした。この粗生成物を、ジクロロメタンおよびアセトン(0%〜10%のアセトン)で溶出するシリカゲルクロマトグラフィーによって精製し、4を2.8g(90%)で得た。
(ケトン5の合成)
(2−(トール−2−イル)−4−(ピリド−3−イル)−1,3−ジヒドロキシベンゼン4(630mg、2.25mmol)、2,5−ジクロロトリメリト酸無水物:
dyes as molecular probes”、米国特許第5,885,778号、1999年3月23日発行)(590mg、2. 25mmol)、ニトロベンゼン(20ml)、および塩化アルミニウム(ニトロベンゼン中)(12ml、1M)を、室温で24時間攪拌した。この反応混合物を、氷水(50ml)、酢酸エチル(100ml)、およびn−ブタノール(20ml)の混合物中に注ぎ、次いで、10%のHCl(50ml)を添加し て、このアルミニウム塩を溶解させた。有機層を、水(50ml×2)およびブライン(50ml)で洗浄し、そしてこの溶媒をエバポレートして、異性体5aおよび5bの混合物として生成物を得た。ジクロロメタン中のメタノール(10%〜30%のメタノール)、および酢酸(1%)を用いるシリカゲルカラムクロ マトグラフィーによる分離によって、所望の遅く移動する異性体5b(380mg、31%)を得た。これは、図1に示される構造を有すると考えられる。
(1,3−ジメトキシナフタレン6)
1,3−ジヒドロキシナフタレン(15g、93.6mmol)および炭酸カリウム(20g、144.7mmol)(アセトン(200ml)中)に、ジメ チルスルフェート(21ml、222mmol)を添加した。一晩攪拌後、この反応混合物を、10%の水酸化ナトリウム(100ml)と混合し、酢酸エチル(200ml×2)で抽出した。有機層を、水(100ml×2)で洗浄し、エバポレートし、そして任意の未反応ジメチルスルフェートをクエンチするため に、この残渣を、水酸化アンモニウム(50ml)で2時間攪拌させた。生成物を、酢酸エチル(200ml)で抽出し、そして水(100ml×2)およびブライン(100ml)で洗浄した。この溶媒をエバポレートして、6を15g(85%)で得た。
(Bis−(1,3−ジメトキシナフト−2−イル)−ジメチルスズ7)
1,3−ジメトキシナフタレン(6)(7.1g、37.73mmol)を、無水THF(60ml)に溶解させ、−70℃まで冷却させ、テトラメチルエチ レンジアミン(0.2ml)を添加し、次いで、n−ブチルリチウム(26ml、1.6M(ヘキサン中))を添加した。この溶液を、冷却状態で30分間、そして周囲温度で1時間攪拌した後、この溶液を再び−20℃まで冷却させ、そして2塩化ジメチルスズ、SnMe2Cl2(5.05g(20ml THF中))を添加した。この反応混合物を、周囲温度で2時間攪拌させ、水(100ml)に注ぎ、そして酢酸エチル(100ml)で抽 出させた。有機層を、水(50ml)、ブライン(50ml)で洗浄し、そしてエバポレートした。残渣を、ヘキサン(50ml)より再結晶し、7を6.8g(69%)で得た。
(1,3−ジメトキシ−2−ブロモナフタレン8)
Bis−(1,3−ジメトキシナフト−2−イル)−ジメチルスズ7(11g、21mmol)(THF(500ml)中)を、−30℃まで冷却し、そして N−ブロモスクシンイミド(8g、45mmol)を添加した。−30℃で2時間攪拌させた後、この反応混合物を、水(200ml)および酢酸エチル(200ml)でクエンチした。有機層を、10%塩化水素酸(100ml)、水(100ml×2)、ブライン(100ml)で洗浄し、そしてエバポレート した。この粗生成物を、ヘキサン−酢酸エチル(0%〜10%の酢酸エチル)で溶出させるシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製し、8を9g(80%)で得た。
(2−(ピリド−3−イル)−1,3−ジメトキシナフタレン9)
ピリジン−3−ボロン酸(3.94g、32mmol、Frontier Scientific,Inc.)、1,3−ジメトキシ−2−ブロモナフタレン
8(6.6g、24.7mmol)、グリム(200ml)、およびテトラキス(トリフェニルホスフィン)パラジウム(Ph3P)4Pd(3g、2.7mmol)を、15分間攪拌し、次いで、炭酸カリウム(11.4g、水(50mL)中)を添加した。一晩還流後、この反応混合物を、水と酢 酸エチルの1:1(800ml)中に注いだ。有機層を水(300ml×2)、およびブライン(200ml)によって洗浄し、溶媒を除去し、そして粗生成物を、ジクロロメタンおよびアセトン(0%〜5%のアセトン)を用いて溶出するシリカゲルクロマトグラフィーによって精製し、9を5.1g(84%)で得 た。
(2−(トール−2−イル)−1,3−ジメトキシナフタレン10)
この化合物を、8およびトール−2−イルボロン酸(Frontier Scientific,Inc.)を使用して、本質的に実施例9と同じ手順によって調製した。
(2−(ピリド−3−イル)−1,3−ジヒドロキシナフタレン11の合成)
この化合物を、2−(ピリド−3−イル)−1,3−ジメトキシナフタレン9を使用して、実施例4に使用したのと同じ手順によって調製し、11を得た。
(2−(トール−2−イル)−1,3−ジヒドロキシナフタレン12の合成)
この化合物を、2−(トール−2−イル)−1,3−ジメトキシナフタレン10を使用して、実施例4に使用したのと同じ手順によって調製し、12を得た。
(色素13の合成)
ケトン5b(250mg、0.45mmol)および2−(ピリド−3−イル)−1,3−ジヒドロキシナフタレン11(109mg、0.45mmol) を、メタンスルホン酸(7ml)と混合し、そして100℃で1時間攪拌した。この溶液を、室温まで冷却し、次いで氷水(50ml)に注いだ。色素を、n−ブタノール(50ml×2)で抽出し、そして水(20ml×2)で洗浄した。この溶媒を、減圧下でエバポレートし、そして色素を逆相シリカゲルクロマトグ ラフィー(50%のメタノール)により精製し、13を103mg(30%)で得た(図3)。
(色素14の合成)
この色素を、2−(トール−2−イル)−1,3−ジヒドロキシナフタレン 12および5を使用して、実施例13に使用したのと同じ手順によって調製した。
(色素15の合成)
この色素を、2−フルオロ−1,3−ジヒドロキシナフタレン(Bensonら、”Asymmetric benzoxanthene dyes”、米国 特許第5,840,999号(1998年11月24日発行))および5を使用して、実施例13に使用したのと同じ手順によって調製した。
(色素16の合成)
2−(トール−2−イル)−4−(ピリド−3−イル)−1,3−ジヒドロベンゼン4(52mg、0.28mmol)、2,5−ジクロロトリメリト酸無水 物(Menchenら、”4,7−dichlorofluorescein dyes as molecular probes”、米国特許第5,885,778号、1999年3月23日発行))(36.5mg、14mmol)、およびメタンスルホン酸(1ml)を加熱し、そして130〜135℃で 2時間攪拌した。この溶液を室温まで冷却し、次いで氷水(50ml)に注いだ。この粗色素を、n−ブタノール(50mg×2)で抽出し、そいてこの抽出物を水(20ml×2)で洗浄した。溶媒を、減圧下でエバポレートし、2つの異性体の混合物として粗色素を得た。この異性体を、分取薄層クロマトグラフィー (シリカゲル;ジクロロメタン:メタノール;酢酸/100:10:2(v:v:v)移動相)によって分離し、所望の遅く移動する異性体16を24mg(30%)で得た。
(2,3−ジメトキシ−4−(ピリド−3−イル)ベンジル17の合成)
2,4−ジメトキシフェニル−4−イルボロン酸(0.9g、4.97mmol、Frontier Scientific,Inc.)、3−ブロモピリジン(0.82g、5mmol)、テトラキス(トリフェニルホスフィン)パラジウム(Ph3P)4Pd0(
0.65g、0.56mmol)、N,N−ジメチルホルムアミド(20ml)、およびトリエチルアミン(2.1ml)を混合し、110〜120℃で16時 間攪拌した。この反応混合物を、水および酢酸エチルの混合物1:1(100ml)に注ぎ、そして有機層を、水(50ml×2)およびブライン(50ml)で洗浄した。溶媒を取り除いた後、粗生成物を、シリカゲルクロマトグラフィー(0%〜10%のアセトン(ジクロロメタン中))によって精製し、17を0. 45g(42.5%)で得た。
(4−(ピリド−3−イル)−1,3−ジヒドロキシベンゼン18の合成)
この化合物を、2,3−ジメトキシ−4−(ピリド−3−イル)ベンジル17を使用して、実施例4で使用されるのと同じ手順によって調製し、18を得た。
(色素19の合成)
この色素を、4−(ピリド−3−イル)−1,3−ジヒドロキシベンゼン18および2,5−ジクロロトリメリト酸無水物を使用して、実施例16で使用されるのと同じ手順によって調製した。
(2,3−ジメトキシ−4−(ピリド−2−イル)ベンゼン20の合成)
この化合物を、2,4−ジメトキシフェニル−4−イルボロン酸および2−ブロモピリジンを使用して、実施例17で使用されるのと同じ手順によって調製し、20を得た。
(2,3−ジヒドロキシ−4−(ピリド−2−イル)ベンゼン21の合成)
この化合物を、2,3−ジメトキシ−4−(ピリド−2−イル)ベンゼン20を使用して、実施例4で使用されるのと同じ手順によって調製し、21を得た。
(色素22の合成)
この化合物を、4−(ピリド−3−イル)−1,3−ジヒドロベンゼン21および2,5−ジクロロメリト酸無水物を使用して、実施例16で使用されるのと同じ手順によって調製した。
(1,3−ジメトキシ−4−(キノン−3−イル)ベンゼン23の合成)
この化合物を、1,3−ジメトキシフェン−4−イルボロン酸および3−ブロモキノリンを使用して、実施例17で使用されるのと同じ手順を使用して調製し、23を得た。
(1,3−ジヒドロキシ−4−(キノン−3−イル)ベンゼン24の合成)
この化合物を、1,3−ジメトキシ−4−(キノン−3−イル)ベンゼン23を使用して、実施例4で使用されるのと同じ手順によって調製し、24を得た。
(色素25の合成)
この色素を、1,3−ジヒドロキシ−4−(キノン−3−イル)ベンゼン24および2,5−ジクロロメリト酸無水物を使用して、実施例16で使用されるのと同じ手順によって調製した。
(1,3−ジメトキシ−4−(キノン−2−イル)ベンゼン26の合成)
この化合物を、1,3−ジヒドロキシフェン−4−ボロン酸および2−ブロモキノリンを使用して、実施例17で使用されるのと同じ手順を使用して調製し、26を得た。
(1,3−ジヒドロキシ−4−(キノン−2−イル)ベンゼン27の合成)
この化合物を、1,3−ジメトキシ−4−(キノン−2−イル)ベンゼン26を使用して、実施例4で使用されるのと同じ手順によって調製し、27を得た。
(色素28の合成)
この色素を、1,3−ジヒドロキシ−4−(キノン−2−イル)ベンゼン27および2,5−ジクロロメリト酸無水物を使用して、実施例16で使用されるのと同じ手順によって調製した。
(1,3−ジメトキシ−2−(ピリド−3−イル)ベンゼン29の合成)
この化合物を、1,3−ジメトキシフェン−2−イルボロン酸および3−ブロモピリジンを使用して、実施例1で使用されるのと同じ手順によって調製し、29を得た。
(1,3−ジメトキシ−2−(ピリド−3−イル)−4−ブロモベンゼン30の合成)
この化合物を、1,3−ジメトキシ−2−(ピリド−3−イル)ベンゼン29およびN−ブロモスクシンイミドを使用して、実施例2で使用されるのと同じ手順によって調製し、30を得た。
(1,3−ジメトキシ−2−(ピリド−3−イル)−4−フェニルベンゼン 31の合成)
この化合物を、1,3−ジメトキシ−2−(ピリド−3−イル)−4−ブロモベンゼン30およびフェニルボロン酸を使用して、実施例3で使用されるのと同じ手順によって調製し、31を得た。
(1,3−ジメトキシ−2−(ピリド−3−イル)−4−フェニルベンゼン32の合成)
この化合物を、1,3−ジメトキシ−2−(ピリド−3−イル)−4−フェニルベンゼン31を使用して、実施例4で使用されるのと同じ手順によって調製し、32を得た。
(色素33の合成)
この色素を、1,3−ジメトキシ−2−(ピリド−3−イル)−4−フェニルベンゼン32および2,5−ジクロロメリト酸無水物を使用して、実施例16で使用されるのと同じ手順によって調製した。
(1,3−ジメトキシ−2−(トール−2−イル)−4−フェニルベンゼン34の合成)
この化合物を、1,3−ジメトキシ−2−(トール−2−イル)−4−ブロモベンゼン2およびフェニルボロン酸を使用して、実施例3で使用されるのと同じ手順によって調製し、34を得た。
(1,3−ジヒドロキシ−2−(トール−2−イル)−4−フェニルベンゼン35の合成)
この化合物を、1,3−ジメトキシ−2−(トール−2−イル)−4−フェニルベンゼン34を使用して、実施例4で使用されるのと同じ手順によって調製して、35を得た。
(色素36の合成)
この色素を、1,3−ジヒドロキシ−2−(トール−2−イル)−4−フェニルベンゼン35および2,5−ジクロロメリト酸無水物を使用して、実施例16で使用されるのと同じ手順によって調製した。
(1,3−ジメトキシ−2−(ピリド−2−イル)ベンゼン37の合成)
この化合物を、1,3−ジメトキシフェン−2−イルボロン酸および2−ブロモピリジンを使用して、実施例1で使用されるのと同じ手順によって調製し、37を得た。
(1,3−ジメトキシ−2−(ピリド−2−イル)−4−ブロモベンゼン38の合成)
この化合物を、1,3−ジメトキシ−2−(ピリド−2−イル)ベンゼン37およびN−ブロモスクシンイミドを使用して、実施例2で使用されるのと同じ手順によって調製し、38を得た。
(1,3−ジメトキシ−2−(ピリド−2−イル)−4−(ナフト−2−イル)ベンゼン39の合成)
この化合物を、1,3−ジメトキシ−2−(ピリド−2−イル)−4−ブロモベンゼン38およびナフト−2−イルボロン酸を使用して、実施例3で使用されるのと同じ手順によって調製し、39を得た。
(1,3−ジヒドロキシ−2−(ピリド−2−イル)−4−(ナフト−2−イル)ベンゼン40の合成)
この化合物を、1,3−ジメトキシ−2−(ピリド−2−イル)−4−(ナフト−2−イル)ベンゼン39を脱メチル化して、実施例4で使用されるのと同じ手順によって調製し、40を得た。
(色素41の合成)
この色素を、1,3−ジヒドロキシ−2−(ピリド−2−イル)−4−(ナフト−2−イル)ベンゼン40および2,5−ジクロロメリト酸無水物を使用して、実施例16で使用されるのと同じ手順によって調製した。
(色素の性質)
本発明のフルオレセイン色素のいくつかの特定の性質を、測定した(表1)。
a色素の酸形態の発光最大
b半波高全幅値
c5−カルボキシフルオレセイン(5−FAM)との比較
各個々の刊行物または特許出願が、特異的および個々に参考として援用されると示される場合と同程度まで、全刊行物および特許出願は、本明細書中において参考として援用される。
Claims (1)
- 明細書に記載の化合物。
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