JP2003508065A - Ｕｖ励起性蛍光エネルギー移動色素 - Google Patents

Ｕｖ励起性蛍光エネルギー移動色素

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Abstract

(57)【要約】 短波長光源を用いて使用することができる新規なエネルギー移動色素が提供される。当該色素は、約２５０〜４５０ｎｍの波長に吸収極大を有する供与体色素及び当該供与体色素から放出するエネルギーを吸収することができる受容体色素を含んでいる。前記エネルギー転移色素の一つは、クマリン又はピレン環構造を有する色素のクラスのメンバーである供与体色素及び当該供与体色素から放出するエネルギーを吸収することができる受容体色素を有し、当該供与体色素は約２５０〜４５０ｎｍに吸収極大を有し、かつ、当該受容体色素は約５００ｎｍよりも大きい波長に発光極大を有している。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】発明の背景 発明の属する技術分野 本発明は、蛍光色素、より詳細にはエネルギー移動蛍光色素及びその使用に関
する。関連技術の説明 サンプル中の成分を標識及び検出するために、種々の蛍光色素が開発されてい
る。一般的に蛍光色素は、好ましくは、高い量子収率及び大きな吸光係数を有し
ている。そのため、当該色素は、少量の検出成分を検出するために使用されるだ
ろう。更に蛍光色素は、大きなストークスシフト（すなわち、当該色素が極大吸
収を有する波長と当該色素が極大発光を有する波長との間の差異）を有する。そ
のため、蛍光発光は、当該色素を励起するために使用する光源とは容易に区別さ
れる。 開発された蛍光色素の１つのクラスは、エネルギー移動蛍光色素である。一般
的に、エネルギー移動蛍光色素は、供与体フルオロホア（fluorophore）及び受
容体フルオロホアを含んでいる。これらの色素において、供与体及び受容体フル
オロホアが、互いに近接して、かつ、互いに対して適切な配向で位置付けられる
場合、供与体フルオロホアからのエネルギー放出（emission）は、受容体フルオ
ロホアにより吸収され、受容体フルオロホアの蛍光発光を引き起こす。それゆえ
、励起された供与体フルオロホアは、当該供与体フルオロホアの励起エネルギー
を効率的に吸収し、かつ、当該エネルギーを受容体フルオロホアへ効率的に移動
させることができることが重要である。 種々のエネルギー移動蛍光色素が文献に記載されている。例えば、米国特許第
４，９９６，１４３号及びＷＯ９５／２１２６６は、供与体及び受容体フルオロ
ホアがオリゴヌクレオチド鎖により連結しているエネルギー移動蛍光色素を記載
している。Leeら, Nucleic Acids Research 20:10 2471-2483 (1992)は、フルオ
レセイン上の４’−アミノメチル置換基により、４’−アミノメチル−５−カル
ボキシフルオレセインに連結した５−カルボキシローダミンを含む、エネルギー
移動蛍光色素を記載している。米国特許第５，８４７，１６２号は、追加のクラ
スのエネルギー移動色素を記載している。
【０００２】 幾つかの診断用及び分析用アッセイが開発されている。これらのアッセイには
、蛍光色素を使用したサンプル中の複数成分の検出、例えばフローサイトメトリ
ー（Lanierら, J. Immunol. 132 151-156 (1984)）、染色体分析（Grayら, Chro
mosoma 73 9-27 (1979)）及びＤＮＡ配列決定が含まれる。これらのアッセイに
対しては、２種類以上のスペクトル的に分解可能な蛍光色素のセットを同時に使
用して、１種以上の標的物質をサンプル中で同時に検出することができるように
することが望ましい。サンプル中の複数成分を複数の色素を用いて同時検出する
ことは、サンプル中の個々の成分を連続的に検出するために必要な時間を減少さ
せる。多遺伝子座ＤＮＡプローブアッセイの場合、スペクトル的に分解可能な複
数の色素の使用は、必要とされる反応チューブの数を減少させ、これにより、実
験プロトコルを単純化させ、かつ、用途−特異的キットの製造を促進させる。自
動ＤＮＡ配列決定の場合、スペクトル的に分解可能な複数の蛍光色素は、４種の
塩基全ての分析を単一のレーンで行い、これにより単一色法よりもスループット
を高くし、かつ、レーン間の電気泳動的移動度の変動に関連する不確実性を除去
することができる。Connelら, Biotechniques 5 342-348 (1987)、Proberら, Sc
ience 238 336-341 (1987)、Smithら, Nature 321 674-679 (1986)及びAnsorge
ら, Nucleic Acids Research 15 4593-4602 (1989)。 サンプル中の複数の標的物質を同時に検出するため、特に電気泳動的分離及び
酵素処理を要求する分析用、例えばＤＮＡ配列決定用の蛍光色素セットの入手に
関連して幾つかの困難性が存在する。例えば、セット中の各色素は、その他の色
素からスペクトル的に分解可能でなければならない。スペクトル的に分解可能な
発光スペクトルを有する色素のコレクションを見出すことは困難である。なぜな
ら、有機蛍光色素に対する典型的な発光バンド半値幅（emission band half-wid
th）は約４０〜８９ナノメートル（ｎｍ）であり、利用可能なスペクトルの幅は
、励起光源により制限されるからである。本明細書で使用するとき、色素のセッ
トに関連する用語「スペクトル的に分解」とは、色素の蛍光発光バンドが十分に
異なっていること、すなわち、非オーバーラップ（non-overlapping）が十分で
あること、及び、各色素が結びつく試薬、例えばポリヌクレオチドを、標準的な
光検知システム、例えば帯域通過フィルタ及び光電子増倍管、荷電−結合装置（
charged-coupled device）及び分光器など（米国特許第４，２３０，５５８号、
第４，８１１，２１８号又は Wheelessら, p.21-76, Flow Cytometry: Instrume
ntation and Data Analysis (Academic Press, New York, 1985)に記載されるシ
ステム）を用い、各色素により生成する蛍光シグナルに基づいて識別することが
できることを意味する。
【０００３】 各色素の蛍光シグナルは、各成分を十分な感度で検出することができるように
十分に強いものでなければならない。例えば、ＤＮＡ配列決定の場合、増加した
サンプルローディングは低い蛍光収率を補償することができない（Pringleら, D
NA Core Facilities Newsletter, 1 15-21(1998)）。色素により生成する蛍光シ
グナルは、一般的に、当該色素がその吸収極大（absorbance maximum）において
励起されるときに最大になる。それゆえ、各色素は、その吸収極大付近で励起さ
れることが好ましい。 色素のセットの使用に関連する更なる困難性は、色素は一般的に、同一の吸収
極大を有しないということである。同一の吸収極大を有しない色素のセットを使
用するとき、各色素を各々の吸収極大で励起するための複数の光源を提供するこ
とに関連する高コストと、各色素が吸収極大で励起されないことに起因する低感
度との間でトレードオフが作り出される。 前記の困難性に加えて、色素の電荷、分子の大きさ及びコンホメーションは、
断片の電気泳動的移動度へ悪影響を与えるものであってはならない。更に蛍光色
素は、断片の作成又は操作に使用する化学品、例えば、ＤＮＡ合成溶媒及び試薬
、緩衝液、ポリメラーゼ酵素、リガーゼ酵素などに適合するものでなければなら
ない。 多色用途の色素のセット開発における複数の制約のため、特に４色ＤＮＡ配列
決定の領域においては、わずかに数種の蛍光色素セットが開発されているのみで
ある。Connellら, Biotechniques 5 342-348 (1987); Proberら, Science 238 3
36-341 (1987)及び Smithら, Nature 321 674-679 (1986)及び米国特許第５，８
４７，１６２号。 エネルギー移動蛍光色素は、サンプル中の複数の標的物質の同時検出における
使用、例えばＤＮＡ配列決定における使用において当該色素を魅力的なものとす
る幾つかの特徴を有している。例えば、単一の供与体フルオロホアをエネルギー
移動蛍光色素のセットに使用して、各色素が共通の波長で強力な吸収を有するよ
うにすることができる。そのうえ、エネルギー移動蛍光色素内の受容体フルオロ
ホアを変化させることにより、スペクトル的に分解可能な蛍光発光を有する一連
のエネルギー移動色素を生成することができる。 エネルギー移動蛍光色素は、非エネルギー移動蛍光色素よりも大きな有効スト
ークスシフトを提供する。これは、エネルギー移動蛍光色素についてのストーク
スシフトは、供与体フルオロホアが光を最大に吸収する波長と受容体フルオロホ
アが光を最大に発光する波長との差異に基づくものだからである。一般的に、大
きいストークスシフトを有する蛍光色素に対するニーズが存在している。 蛍光色素を使用した全てのアッセイの感度は、当該蛍光色素により生成する蛍
光シグナルの強さに依存する。それゆえ、強力な蛍光シグナルを有する蛍光色素
の存在に対するニーズが存在する。エネルギー移動蛍光色素に関して、当該色素
の蛍光シグナル強度は、受容体フルオロホアが供与体フルオロホアのエネルギー
放出をどの程度効率的に吸収するかに依存している。
【０００４】発明の要約 本発明は、短波長光源を用いて使用することができるエネルギー移動色素に関
する。更に本発明は、本発明のエネルギー移動色素を含む試薬（reagent）に関
する。更に本発明は、短波長光源に適合した色素及び試薬を使用する方法に関す
る。色素及び試薬を含むキットも提供される。 エネルギー移動色素であって、約２５０〜４５０ｎｍの波長に吸収極大を有す
る供与体色素及び当該供与体色素からのエネルギーを吸収することができる受容
体色素を含む色素が提供される。 エネルギー移動は種々のメカニズムによって起こることに注目すべきである。
例えば、本発明の色素の大部分について、供与体色素の発光は、受容体色素の吸
収とオーバーラップする必要がない。 一つの変形において、供与体色素は、約３００〜４５０ｎｍ、より好ましくは
約３５０〜４００ｎｍの波長に吸収極大を有する。 受容体色素は、好ましくは約５００ｎｍよりも大きい発光極大を有している。
一つの変形において、受容体色素は約５５０ｎｍよりも大きい波長に発光極大を
有している。受容体色素は、約５００〜７００ｎｍの波長に発光極大を有してい
るだろう。受容体色素は、当該受容体色素が供与体色素の吸収極大よりも少なく
とも約１５０ｎｍ大きい波長に発光極大を有するように、当該供与体色素に対し
て選択されるだろう。 本発明の別の態様において、エネルギー移動色素は、クマリン又はピレン環構
造を有する色素クラスのメンバーである供与体色素並びに当該供与体色素からの
エネルギーを吸収することができる受容体色素を有している。 この態様の一つの変形では、供与体色素は、約２５０〜４５０ｎｍ、好ましく
は約３００〜４５０ｎｍ、更に好ましくは約３５０〜４５０ｎｍの波長に吸収極
大を有している。 この態様の別の変形では、受容体色素は、約５００ｎｍ、適宜５５０ｎｍより
も大きい波長に発光極大を有している。更に受容体色素は、約５００〜７００ｎ
ｍの波長に発光極大を有しているだろう。受容体色素は、当該受容体色素が供与
体色素の吸収極大よりも少なくとも約１５０ｎｍ大きい波長に発光極大を有する
ように、供与体色素に対して選択される。
【０００５】 本発明のエネルギー移動色素は、多数の供与体色素が１つの受容体色素にカッ
プリングしている「アンテナ」色素又はデンドリマー構造であって、当該供与体
色素が２５０〜４５０ｎｍの吸収極大を有するか又はクマリン又はピレン環構造
を有する構造を有しているだろう。 更に本発明は、本発明のエネルギー移動色素のいずれかを含む蛍光試薬に関す
る。一般的に、これらの試薬には、本発明のエネルギー移動色素が結びつくこと
ができる全ての分子又は材料が含まれる。試薬の存在は、エネルギー移動色素の
蛍光によって検出される。本発明の試薬の一つの用途は、核酸配列決定における
ものである。 蛍光試薬のクラスの例には、デオキシヌクレオシド及びエネルギー移動色素で
標識したデオキシヌクレオシドのモノ−、ジ−又はトリホススフェートが含まれ
る。デオキシヌクレオシドの例には、デオキシシトシン、デオキシアデノシン、
デオキシグアノシン又はデオキシチミジン並びにこれらの類似体及び誘導体が含
まれる。 そのほかのクラスの試薬には、３’部位においてポリメラーゼによって伸長し
ないデオキシヌクレオチドの類似体及び誘導体が含まれる。伸長を防ぐための部
分（ハライド、アセチル、ベンジル及びアジド基を含む）を３’部位に含む種々
の類似体及び誘導体が開発されている。伸長することができないジデオキシヌク
レオシド及びジデオキシヌクレオシドモノ−、ジ−又はトリホスフェートも開発
されている。ジデオキシヌクレオチドの例には、ジデオキシシトシン、ジデオキ
シアデノシン、ジデオキシグアノシン又はジデオキシチミジン並びにこれらの類
似体及び誘導体が含まれる。 蛍光標識される試薬は、オリゴヌクレオチドであってもよい。オリゴヌクレオ
チドは、ヌクレオチドポリメラーゼを使用することにより伸長可能な３’末端を
有していてもよい。前記の標識オリゴヌクレオチドは、例えば核酸配列決定にお
ける色素標識プライマーとして使用してもよい。
【０００６】 更に本発明は、本発明のエネルギー移動色素及び試薬を使用する方法に関する
。一つの態様において、本発明の方法は、本発明のエネルギー移動色素で標識さ
れた異なる大きさのオリゴヌクレオチドのシリーズを形成する工程、当該標識オ
リゴヌクレオチドのシリーズを大きさに基づいて分離する工程、及び、当該分離
した標識オリゴヌクレオチドを、当該エネルギー移動色素の蛍光に基づいて検出
する工程を含んでいる。 別の態様において、本発明の方法は、核酸とオリゴヌクレオチドプライマーと
を、デオキシヌクレオシドトリホスフェート、少なくとも１種のジデオキシヌク
レオシドトリホスフェート及びＤＮＡポリメラーゼの存在下でハイブリダイズす
ることにより、伸長した標識プライマーの混合物を形成する工程であって、当該
ＤＮＡポリメラーゼは、プライマーの伸長を終結させるジデオキシヌクレオシド
トリホスフェートが組み込まれるまで、デオキシヌクレオシドトリホスフェート
を用いてプライマーを伸長させることができるものである工程を含んでいる。一
旦、終結すると、伸長したプライマーの混合物を分離し、当該分離した伸長プラ
イマーを、オリゴヌクレオチドプライマー、デオキシヌクレオチドトリホスフェ
ート又はジデオキシヌクレオチドトリホスフェートのいずれかへ組み込まれた本
発明のエネルギー移動色素を検出することにより検出する。 更に本発明は、本発明のエネルギー移動色素を使用した核酸の配列決定方法に
関する。一つの態様において、本発明の方法は、核酸とオリゴヌクレオチドプラ
イマーとを、デオキシヌクレオシドトリホスフェート、少なくとも１種のジデオ
キシヌクレオシドトリホスフェート及びＤＮＡポリメラーゼの存在下でハイブリ
ダイズすることにより、伸長した標識プライマーの混合物を形成する工程を含ん
でいる。オリゴヌクレオチドプライマー及び／又はジデオキシヌクレオチドは、
本発明のエネルギー移動色素を用いて標識される。ＤＮＡポリメラーゼを、プラ
イマーの伸長を終結させるジデオキシヌクレオシドトリホスフェートが組み込ま
れるまで使用して、デオキシヌクレオシドトリホスフェートを用いてプライマー
を伸長する。次いで伸長したプライマーの混合物を分離し、伸長したプライマー
中のエネルギー移動色素を検出することにより核酸配列を決定する。
【０００７】 更に本発明は、エネルギー移動色素で標識したオリゴヌクレオチド及び試薬を
、短波長光源を使用して検出する方法に関する。これらの方法に使用する光源は
、好ましくは４５０ｎｍ未満の波長にエネルギーを供給する。一つの変形におい
て、光源は約２５０〜４５０ｎｍ、好ましくは約３００〜４５０ｎｍ、特に好ま
しくは約３５０〜４５０ｎｍの波長にエネルギーを供給する。一つの特定の態様
において、使用する光源は約４００ｎｍにおいてエネルギーを供給する。 一つの態様において、本発明の方法は、エネルギー移動色素で標識した、異な
る大きさのオリゴヌクレオチドのシリーズを形成する工程、当該標識オリゴヌク
レオチドのシリーズを大きさに基づいて分離する工程及び当該分離したオリゴヌ
クレオチドを、短波長光源に暴露したときのエネルギー移動色素の蛍光に基づい
て検出する工程を含んでいる。 別の態様において、本発明の方法は、核酸とオリゴヌクレオチドとを、デオキ
シヌクレオシドトリホスフェート、少なくとも１種のジデオキシヌクレオシドト
リホスフェート及びＤＮＡポリメラーゼの存在下でハイブリダイズすることによ
り、伸長した標識プライマーの混合物を形成する工程であって、当該ＤＮＡポリ
メラーゼは、プライマーの伸長を終結させるジデオキシヌクレオシドトリホスフ
ェートが組み込まれるまで、デオキシヌクレオシドトリホスフェートを用いてプ
ライマーを伸長させるものである工程を含んでいる。一旦、終結すると、伸長し
たプライマーの混合物を分離する。分離した伸長プライマーは、当該伸長プライ
マーを、約２５０〜４５０ｎｍの波長を有する光に暴露し、約５００ｎｍよりも
大きい波長でエネルギー移動色素により放射される光を測定することにより検出
される。エネルギー移動色素は、オリゴヌクレオチドプライマー、デオキシヌク
レオチドトリホスフェート又はジデオキシヌクレオチドトリホスフェートのいず
れかへ組み込まれる。
【０００８】 更に本発明は、短波長光源を使用して核酸を配列決定する方法に関する。一つ
の態様において、本発明の方法は、核酸とオリゴヌクレオチドプライマーとを、
デオキシヌクレオシドトリホスフェート、少なくとも１種のジデオキシヌクレオ
シドトリホスフェート及びＤＮＡポリメラーゼの存在下でハイブリダイズするこ
とにより、伸長した標識プライマーの混合物を形成する工程を含んでいる。オリ
ゴヌクレオチドプライマー及び／又はジデオキシヌクレオチドは、短波長光源を
用いた使用に適合するエネルギー移動色素により標識される。ＤＮＡポリメラー
ゼを、プライマーの伸長を終結させるジデオキシヌクレオシドトリホスフェート
が組み込まれるまで使用して、デオキシヌクレオシドトリホスフェートを用いて
プライマーを伸長する。次いで伸長したプライマーの混合物を分離し、当該伸長
したプライマーを約２５０〜４５０ｎｍの波長を有する光に暴露し、約５００ｎ
ｍよりも大きい波長でエネルギー移動色素により放射される光を測定することに
より核酸配列を決定する。 この態様の好ましい変形において、伸長したプライマーは、約３００〜４５０
ｎｍの波長を有する光に暴露される。伸長したプライマーを、約３５０〜４００
ｎｍの波長を有する光に暴露してもよい。この態様の別の好ましい変形において
、エネルギー移動色素により放射される光は、約５５０ｎｍよりも大きい波長を
有している。エネルギー移動色素により放射される光は、約５００〜７００ｎｍ
の波長を有していてもよい。別の態様において、エネルギー移動色素により放射
される光は、プライマーを暴露する光の波長よりも少なくとも約１５０ｎｍ大き
い波長を有している。 更に本発明は、本発明の色素及び試薬を使用した、ＤＮＡ配列決定を行うため
の色素及び試薬を含むキットに関する。キットは、本発明のエネルギー移動色素
又は試薬の２、３、４種又はそれ以上からなるセットを含んでいてもよい。適宜
、キットは、ヌクレオチドポリメラーゼ、核酸配列決定の実施に有用な追加のヌ
クレオチド及び／又は試薬を含んでいてもよい。
【０００９】発明の詳細な説明 本発明は、短波長光源を用いて使用するエネルギー移動色素に関する。例えば
、エネルギー移動色素は、好ましくは約２５０〜４５０ｎｍの波長で励起される
ように適合している。更に本発明は、本発明のエネルギー移動色素を含む試薬に
関する。更に本発明は、前記の色素及び試薬を使用する方法に関する。前記の色
素及び試薬を含むキットも提供される。 Ｉ．エネルギー移動色素 本発明のエネルギー移動色素は、供与体色素及び当該供与体色素からのエネル
ギー吸収に反応してエネルギーを放出することができる受容体色素を含んでいる
。 一つの態様において、エネルギー移動色素は約２５０〜４５０ｎｍの波長で励
起されるだろう。この態様によると、供与体色素は、好ましくは約２５０〜４５
０ｎｍ、より好ましくは約３００〜４５０ｎｍ、特に好ましくは約３５０〜４５
０ｎｍの波長に吸収極大を有している。 別の態様において、エネルギー移動色素は、クマリン又はピレン環構造を有す
る供与体色素を含んでいる。 受容体色素は、供与体色素からエネルギーを吸収することができるすべての色
素であってよい。一つの態様において、受容体色素は、約５００ｎｍよりも大き
い、より好ましくは約５５０ｎｍよりも大きい発光極大（emission maxima）を
有している。別の態様において、受容体色素は、約５００〜７００ｎｍに発光極
大を有している。別の態様において、受容体色素は、供与体色素の吸収極大（ab
sorption maxima）よりも少なくとも１５０ｎｍ大きい波長に発光極大を有する
ように選択される。 エネルギー移動色素は、供与体色素と受容体色素とを連結するリンカーを含ん
でいてもよい。リンカーは、好ましくは、供与体色素と受容体色素とを、当該受
容体色素が当該供与体色素によるエネルギーの実質的に全てを吸収することがで
きる様に連結する。
【００１０】 本発明のエネルギー移動色素の特定例が図１に示される。これらの例において
、５−カルボキシフルオレセインは５２３ｎｍの発光極大を有し、受容体色素と
して使用される。クマリンをベースとする供与体色素ＤＹＥ１１６（吸収極大＝
３７６ｎｍ）、ＤＹＥ１１４（吸収極大＝３２８ｎｍ）及びＤＹＥ１１２（吸収
極大＝３６２ｎｍ）又はピレンをベースとする供与体色素ＤＹＥ１１０（吸収極
大＝３９６ｎｍ）は、４−アミノメチルベンゾイックリンカー（５ＣＦ−Ｂ）で
誘導体化した５−カルボキシフルオレセイン受容体にコンジュゲートされる。５
ＣＦ−ＢコンジュゲートであるＤＹＥ１０２、ＤＹＥ１０４、ＤＹＥ１０６、Ｄ
ＹＥ１０８の構造が図１に示される。 Ａ．供与体色素 一つの態様において、供与体色素は、約２５０〜４５０ｎｍ、より好ましくは
約３００〜４５０ｎｍ、特に好ましくは約３５０〜４００ｎｍの波長に吸収極大
を有している。 別の態様において、供与体色素はピレン環構造を有している。本明細書で使用
するとき、ピレン色素には、下記の一般構造を含む全ての分子が含まれる。
【００１１】
【００１２】 全てのピレン色素が本発明で使用されるので、本発明は、全てのピレン色素を
包含することを意図する。ピレン色素の特定例、ＤＹＥ１１０、ＤＹＥ１２２、
ＤＹＥ１２４及びＤＹＥ１２６が図２に示される。図２において、Ｘは、置換基
、例えば受容体色素を供与体色素へ結びつけるために使用する官能基である。 別の態様において、供与体色素はクマリン環構造を有している。本明細書で使
用するとき、クマリン色素には、下記の一般構造を含む全ての分子が含まれる。
【００１３】
【００１４】 全てのクマリン色素が本発明で使用されるので、本発明は、全てのクマリン色
素を包含することを意図する。クマリン色素の特定例が図３に示される。図３に
おいて、Ｘは、置換基、例えば受容体色素を供与体色素へ結びつけるために使用
する官能基である。 更に本発明は、複数の供与体色素が受容体色素に連結しているエネルギー移動
色素に関する。クマリン色素は水溶性であり、クマリンコンジュゲートは大きな
色素よりも非常に良好な量子収率を示し、その水中における量子収率は遊離の受
容体色素の約１／３である。本発明は、クマリンの小さいサイズ及び溶解性を利
用して、多数の供与体色素が１つの受容体色素に連結される「アンテナ」色素又
はデンドリマーを合成する。デンドリマーエネルギー移動色素の例（ＤＹＥ１１
８）が図４に示される。
【００１５】 Ｂ．受容体色素 受容体色素は、供与体色素からのエネルギーを吸収することができる全ての色
素であってよい。一つの態様において、受容体色素は、約５００ｎｍよりも大き
い、より好ましくは５５０ｎｍよりも大きい発光極大を有する。別の態様におい
て、受容体色素は、約５００〜７００ｎｍに発光極大を有している。別の態様に
おいて、受容体色素は、供与体色素の吸収極大よりも少なくとも約１５０ｎｍ大
きい波長に発光極大を有するように選択される。 この態様のエネルギー移動色素に使用する受容体色素のクラスの例には、キサ
ンテン色素、シアニン色素、フタロシアニン色素及びスクアライン（squaraine
）色素が含まれるが、これらに限定されるものではない。これらの色素の一般構
造は図５に示される。これらの色素中に示される置換基は、異なるクラスの色素
へ組み込まれる広範囲の置換基から選択されるだろう。なぜなら、一般的なキサ
ンテン、フルオレセイン、ローダミン、不斉性ベンゾキサンテン、シアニン、フ
タロシアニン及びスクアライン環構造を有する全ての色素が、本発明の範囲内に
あることが意図されるからである。 本発明のエネルギー移動色素において使用される受容体色素の１つの特定のク
ラスは、キサンテン色素である。本明細書で使用するとき、キサンテン色素には
、図６に示される一般構造を有する全ての分子が含まれる。図６において、Ｙ1
及びＹ2は、それぞれ独立してヒドロキシル、酸素、イミニウム（iminium）又は
アミンであり、イミニウム及びアミンは、好ましくは三級イミニウム又はアミン
である。キサンテン色素のクラスの例は、図６に示されるフルオレセイン、ロー
ダミン及び不斉性ベンゾキサンテンのクラスである。これらの色素中に示される
置換基は、異なるクラスの色素へ組み込まれる広範囲の置換基から選択されるだ
ろう。なぜなら、一般的なキサンテン、フルオレセイン、ローダミン及び不斉性
ベンゾキサンテン環構造を有する全ての色素が、本発明の範囲内にあることが意
図されるからである。フルオレセイン及びローダミン色素は、置換基、例えば受
容体色素、ヌクレオシド又はオリゴヌクレオチドへ、種々の位置において連結し
ていてもよい。図６中のアスタリスク「＊」は、置換にとって好ましい位置であ
る。
【００１６】 フルオレセイン及びローダミンクラスの色素は、キサンテン色素の特定のサブ
クラスメンバーであり、Ｒ17はフェニル又は以下の一般式を有する置換フェニル
である。
【００１７】
【００１８】 式中、フェニル環の置換基Ｘ1〜Ｘ5には、水素、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素
、カルボキシル、アルキル、アルケン、アルキン、スルホネート、アミノ、アン
モニウム、アミド、ニトリル、アルコキシが含まれ、隣接する置換基は一緒にな
って環及びこれらの組み合わせを形成する。図５に示されるように、Ｙ1がヒド
ロキシルであり、かつＹ2がカルボキシルである場合、色素はフルオレセイン色
素であり、Ｙ1がアミンであり、かつＹ2がイミニウムである場合、色素はローダ
ミン色素である。 Ｒ11〜Ｒ17は、本発明のエネルギー移動色素に適合する全ての置換基であろう
。Ｒ11〜Ｒ17を、色素のスペクトル特性及び移動特性を変化させるために広範囲
に変化させてもよいことが注目される。Ｒ11〜Ｒ17置換基の例には、水素、フッ
素、塩素、臭素、ヨウ素、カルボキシル、アルキル、アルケン、アルキン、スル
ホネート、アミノ、アンモニウム、アミド、ニトリル、アルコキシ、フェニル、
置換フェニルが含まれるがこれらに限定されるものではない。隣接する置換基は
一緒になって環及びこれらの組み合わせを形成する。 一つの態様において、Ｒ15及びＲ16は一緒になって置換された又は置換されて
ないベンゼン環を形成する。本明細書において、このクラスのキサンテン色素は
不斉性ベンゾキサンテンと呼ばれ、これは米国特許第５，８４０，９９９号（名
称：Asymmetric Benzoxanthene Dyes, Scott C. Bensonら）（参照することによ
り本明細書に組み込まれる）に記載されている。 一つの特定の態様において、受容体色素は、Ｙ1がアミンであり、Ｙ2がイミニ
ウムであり、かつＸ2及びＸ5が塩素である、本明細書では４，７−ジクロロロー
ダミン色素と呼ばれるクラスのメンバーである。４，７−ジクロロローダミンク
ラスの色素の範囲内にある色素及びその製造は、米国特許第５，８４７，１６２
号（名称：4,7-Dichlororhodamine Dyes）（参照することにより本明細書に組み
込まれる）に記載されている。
【００１９】 Ｒ11〜Ｒ17及びＸ1〜Ｘ5は、それぞれ独立して、エネルギー移動色素を試薬、
例えばヌクレオチド、ヌクレオシド又はオリゴヌクレオチドへ結びつけるために
使用する連結部分であろう。連結部分の例には、イソチオシアネート、塩化スル
ホニル、４，６−ジクロロトリアジニルアミン、スクシンイミジルエステル又は
相補的機能性（complementary functionality）がアミンであるときはいつでも
その他の活性カルボキシレートが含まれる。好ましくは、連結基はマレイミド、
ハロアセチル（halo acetyl）又は相補的機能性がスルフヒドリルであるときは
いつでもヨードアセトアミドである。R. Haugland, Molecular Probes Handbook
of Fluorescent Probes and Research Chemicals, Molecular probes, Inc. (1
992)を参照のこと。特定の好ましい態様において、連結基は、供与体又は受容体
色素中のカルボキシル基から形成され、アミノヘキシル−オリゴマーと反応して
色素標識オリゴヌクレオチドプライマーを形成することができる活性化ＮＨＳエ
ステルである。 本明細書で使用するとき、アルキルとは、直鎖及び分岐した炭化水素部分、す
なわち、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ｔｅｒｔ−ブチル、イソブ
チル、ｓｅｃ−ブチル、ネオペンチル、ｔｅｒｔ−ペンチルなどを意味する。置
換アルキルとは、ヒドロキシ、アミノ、チオ、シアノ、ニトロ、スルホなどを含
む（但し、これらに限定されるわけではない）種々の置換基のいずれか１つで置
換されたアルキル部分を意味する。ハロアルキルとは、１以上のハロゲン原子置
換基、通常はフルオロ、クロロ、ブロモ又はヨードで置換されたアルキルを意味
する。アルケンとは、炭化水素であって、１以上の炭素−炭素結合が二重結合で
あり、かつ、非二重結合炭素がアルキル又は置換アルキルであるものを意味する
。アルキンとは、炭化水素であって、１以上の炭素が三重結合で結合しており、
かつ、非三重結合炭素がアルキル又は置換アルキルであるものを意味する。スル
ホネートとは、３つの酸素原子に結合した硫黄原子を含む部分であり、その一塩
及び二塩、例えばスルホン酸ナトリウム、スルホン酸カリウム、スルホン酸二ナ
トリウムなどが含まれる。アミノとは、２つの水素原子、アルキル部分又はこれ
らの組み合わせに結合した窒素原子を含む部分を意味する。アミドとは、酸素原
子に二重結合し、かつ、アミノ部分に単結合した炭素原子を含む部分を意味する
。ニトリルとは、窒素原子に三重結合した炭素原子を含む部分を意味する。アル
コキシとは、酸素原子に単結合したアルキル部分を含む部分を意味する。アリー
ルとは、単一又は複数のフェニル又は置換フェニル、例えばベンゼン、ナフタレ
ン、アントラセン、ビフェニルなどを意味する。
【００２０】 別の態様において、受容体色素は、当該受容体色素が約５００ｎｍよりも大き
い発光極大を有し、かつ、当該発光極大が供与体色素の吸収極大より少なくとも
約１５０ｎｍ大きいものであるように選択される。本発明のこのクラスの色素は
、非常に大きなストークスシフト（供与体の吸収と受容体の発光との間の差異に
より測定される）を示す。更に、これらの色素は、最小の供与体蛍光が観察され
る点で有効なエネルギー移動を示す。興味深いことに、このクラスに属する色素
の幾つかにおいては、たとえ受容体色素の吸収スペクトルが供与体色素の発光ス
ペクトルとオーバーラップしなくても、エネルギーが供与体から受容体へ転移す
る。 本発明の色素において使用する受容体色素の特定例には、カルボキシフルオレ
セインの異性体（例えば、５及び６カルボキシ）、４，７−ジクロロフルオレセ
イン、４，７−ジクロロローダミン、フルオレセイン、不斉性ベンゾキサンテン
色素、カルボキシ−ＨＥＸの異性体（例えば、５及び６カルボキシ）、ＮＡＮ、
Ｃｌ−ＦＬＡＮ、ＴＥＴ、ＪＯＥ、ＺＯＥ、ローダミン、カルボキシローダミン
の異性体（例えば、５及び６カルボキシ）、カルボキシＲ１１０の異性体（例え
ば、５及び６カルボキシ）、カルボキシＲ６Ｇの異性体（例えば、５及び６カル
ボキシ）、４，７−ジクロロフルオレセイン（米国特許第５，１８８，９３４号
）、４，７−ジクロロローダミン（米国特許第５，８４７，１６２号）、不斉性
ベンゾキサンテン色素（米国特許第５，８４０，９９９号）、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ
’−テトラメチルカルボキシローダミン（ＴＡＭＲＡ）の異性体（例えば、５及
び６カルボキシ）、カルボキシ−Ｘ−ローダミン（ＲＯＸ）の異性体（例えば、
５及び６カルボキシ）及びＣｙ５が含まれるが、これらに限定されるものではな
い。図７及び図７−１にこれらの色素の構造が示される。
【００２１】 Ｃ．リンカー 供与体色素を、開発され、そのすべてが本発明の範囲内にあることが意図され
る種々のリンカーを使用して、受容体色素へ連結してもよい。リンカーを含むエ
ネルギー移動色素は、一般的に下記のように示される。 供与体リンカー−−−−受容体 好ましい態様において、リンカーは、供与体色素を受容体色素へ、当該受容体
色素が当該供与体色素によるエネルギーの実質的に全てを吸収するように連結す
る。理論に束縛されるものではないが、供与体色素から受容体色素へのエネルギ
ー移動効率は、色素間の距離及び色素の相対的配向に依存していると考えられる
。米国特許第５，８００，９９６号には、供与体及び受容体色素間に非常に高い
レベルのエネルギー移動を提供するのに有効であることが見出されているリンカ
ーが記載されている。更に米国特許第５，８００，９９６号は、これらのリンカ
ーを組み込む色素の合成方法を記載している。米国特許第５，８００，９９６号
は、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる。 一つの特定の態様において、本発明のエネルギー移動色素において使用するリ
ンカーは、受容体色素が供与体色素による励起エネルギーの実質的に全てを吸収
するようにするものである。そのようなリンカーは、当該リンカーへ構造的剛性
を提供する官能基を含んでいるだろう。そのような官能基の例には、アルケン、
ジエン、アルキン、少なくとも１つの不飽和結合及び／又は融合環構造を有する
５及び６員環が含まれる。 少なくとも１つの不飽和結合及び／又は融合環構造を有する５又は６員環を有
する官能基の例には、シクロペンテン、シクロヘキセン、シクロペンタジエン、
シクロヘキサジエン、フラン、チオフラン、ピロール、イソピロール、イソアゾ
ール、ピラゾール、イソイミダゾール、ピラン、ピロン、ベンゼン、ピリジン、
ピリダジン、ピリミジン、ピラジンオキサジン、インデン、ベンゾフラン、チオ
ナフテン、インドール及びナフタレンが含まれる。 エネルギー移動色素において供与体色素を受容体色素へ連結するための、本発
明のリンカーの一つは、サブユニット構造：−Ｃ（Ｏ）Ｒ22−（式中、Ｒ22には
官能基、例えば前述の構造的剛性を提供するものが含まれる）を含んでいる。図
８は、本発明のリンカーにおいて使用する、Ｃ（Ｏ）Ｒ22−リンカーサブユニッ
トの例を示している。
【００２２】 このリンカーの一つの態様は、一般構造：−Ｒ21Ｚ1Ｃ（Ｏ）Ｒ22Ｒ28−（式
中、Ｒ21は供与体色素に結びついたＣ1-5アルキルであり、Ｃ（Ｏ）はカルボニ
ル基であり、Ｚ1はＮＨ、イオウ又は酸素であり、Ｒ22はアルケン、ジエン、ア
ルキン、及び当該カルボニル炭素に結びついた、少なくとも１つの不飽和結合又
は融合環構造を有する５及び６員環を含む置換基であり、Ｒ28にはリンカーを受
容体色素に結びつける官能基が含まれる）を有している。 このリンカーの一つの態様は、一般構造：−Ｒ21Ｚ1Ｃ（Ｏ）Ｒ22Ｒ29Ｚ2Ｃ（
Ｏ）−（式中、Ｒ21及びＲ22は前記と同一であり、Ｚ1及びＺ2は、それぞれ独立
してＮＨ、イオウ又は酸素であり、Ｒ29はＣ1-5のアルキルであり、末端のカル
ボニル基は受容体色素の環構造に結びついている）を有している。変形では、Ｚ 2 は窒素であり、−Ｃ（Ｏ）Ｒ22Ｒ29Ｚ2−サブユニットはアミノ酸サブユニット
を形成している。 このリンカーの好ましい態様は、Ｒ21及びＲ29がメチレンであり、Ｚ1及びＺ2 がＮＨであり、Ｒ22がベンゼンであるものである。 更に別の変形において、リンカーは、一般式：Ｒ25Ｚ3Ｃ（Ｏ）又はＲ25Ｚ3Ｃ
（Ｏ）Ｒ26Ｚ4Ｃ（Ｏ）（式中、Ｒ25は供与体色素に結びついており、Ｃ（Ｏ）
はカルボニル基であり、末端カルボニル基は受容体色素に結びついており、Ｒ25 及びＲ26は、それぞれＣ1-4アルキルからなる群より選ばれ、Ｚ3及びＺ4はそれ
ぞれ独立してＮＨ、Ｏ又はＳである）を有している。 この態様の別の変形において、リンカーはＲ27Ｚ5Ｃ（Ｏ）基（式中、Ｒ27は
供与体色素に結びついたＣ1-5アルキルであり、Ｚ5はＮＨ、イオウ又は酸素であ
り、Ｃ（Ｏ）は受容体色素に結びついたカルボニル基である）を含んでいる。
【００２３】 II．本発明のエネルギー移動色素を含む試薬 更に本発明は、本発明のエネルギー移動色素を組み込む試薬に関する。セクシ
ョンIIIに詳述されるように、これらの試薬は、サンプル中のある成分の存在を
検出するために広範囲の方法で使用されるだろう。 本発明の試薬には、本発明のエネルギー移動色素を結びつけることができ、か
つ、当該エネルギー移動色素を使用して、当該エネルギー移動色素の蛍光に基づ
いてその存在を検出することができる全ての分子又は材料が含まれる。本発明の
色素を結びつけて試薬を形成する分子及び材料のタイプには、タンパク質、ポリ
ペプチド、多糖、ヌクレオチド、ヌクレオシド、オリゴヌクレオチド、オリゴヌ
クレオチド類似体（例えば、ペプチド核酸）、脂質、固体担体、有機及び無機ポ
リマー並びにこれらの組み合わせ及び集合物（assemblage）、例えば染色体、核
、生細胞、例えば細菌、その他の微生物、哺乳類細胞及び組織が含まれるが、こ
れらに限定されるものではない。 本発明の試薬の好ましいクラスは、ヌクレオチド、ヌクレオシド、オリゴヌク
レオチド及び本発明のエネルギー移動色素を含むように修飾されたオリゴヌクレ
オチド類似体である。ヌクレオチド及びヌクレオシド試薬についての使用例には
、酵素的合成により形成するオリゴヌクレオチドの標識、例えば、ＰＣＲ増幅、
サンガータイプのヌクレオチド配列決定及びニックトランスレーション反応にお
いて使用するヌクレオシドトリホスフェートの標識が含まれるが、これらに限定
されるものではない。オリゴヌクレオチド試薬の使用例には、ＤＮＡ配列決定用
プライマー、ＰＣＲプライマー、オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションプ
ローブなどが含まれるが、これらに限定されるものではない。 試薬の一つの特定の態様は、標識ヌクレオシド、例えば、本発明のエネルギー
移動色素で標識したシトシン、アデノシン、グアノシン及びチミジンである。こ
れらの試薬は、オリゴヌクレオチド合成を含む広範囲の方法において使用される
だろう。別の関連する態様は、標識ヌクレオチド（ＮＴＰ）、例えば、モノ−、
ジ−及びトリホスフェート ヌクレオシドホスフェートエステルである。これら
の試薬には、特に、本発明のエネルギー移動蛍光色素で標識されたデオキシヌク
レオシドトリホスフェート（ｄＮＴＰ）、例えばデオキシシトシントリホスフェ
ート、デオキシアデノシントリホスフェート、デオキシグアノシントリホスフェ
ート及びデオキシチミジントリホスフェートが含まれる。これらの試薬は、例え
ば色素標識オリゴヌクレオチドの調製におけるポリメラーゼ基質として使用され
るだろう。これらの試薬には、標識ジデオキシヌクレオシドトリホスフェート（
ｄｄＮＴＰ）、例えば本発明のエネルギー移動蛍光色素で標識されたジデオキシ
シトシントリホスフェート、ジデオキシアデノシントリホスフェート、ジデオキ
シグアノシントリホスフェート及びジデオキシチミジントリホスフェートが含ま
れる。これらの試薬は、例えば色素終結配列決定（dye termination sequencing
）において使用されるだろう。
【００２４】 試薬の別の態様は、本発明のエネルギー移動色素を含むオリゴヌクレオチドで
ある。これらの試薬は、例えば色素プライマー配列決定において使用されるだろ
う。 本明細書で使用するとき、「ヌクレオシド」とは、例えば、Kornberg及びBake
r, DNA Replication, 2nd Ed. (Freeman, San Francisco, 1992)に記載される、
２’−デオキシ及び２’−ヒドロキシ形態を含むペントースへ１’部位で連結し
ている、プリン、デアザプリン又はピリミジンヌクレオシド塩基、例えばアデニ
ン、グアニン、シトシン、ウラシル、チミン、デアザアデニン、デアザグアノシ
ンなどから構成される化合物を意味する。本明細書で使用する用語「ヌクレオチ
ド」とは、ヌクレオシドのリン酸エステル、例えばモノ、ジ及びトリリン酸エス
テルであって、エステル化の最も一般的な部位がペントースのＣ−５部位に結び
ついたヒドロキシル基であるものを意味する。ヌクレオシドに関する「類似体」
には、修飾塩基部分及び／又は修飾糖部分を有する合成ヌクレオシド、例えば S
cheit, Nucleotide Analogs (John Wiley, New York, 1980)に一般的に記載され
る合成ヌクレオシドが含まれる。用語「標識ヌクレオシド」及び「標識ヌクレオ
チド」とは、結合によりエネルギー移動色素へ共有結合的に結びついているヌク
レオシド及びヌクレオチドを意味する。 本明細書で使用するとき、用語「オリゴヌクレオチド」とは、二本鎖及び一本
鎖デオキシリボヌクレオシド、リボヌクレオシド、これらのアノマー形態などを
含む、天然又は修飾ヌクレオシドの直線状ポリマーを意味する。通常、ヌクレオ
シドモノマーは、ホスホジエステル結合により連結される。本明細書で使用する
とき、用語「ホスホジエステル結合」とは、ホスホジエステル結合又はホスホロ
チオネート、ホスホロジチオネート、ホスホロセレノエート（phosphoroselenoa
te）、ホスホロジセレノエート（phosphorodiselenoate）、ホスホロアニロチオ
ネート（phosphoroanilothioate）、ホスホラニリデート（phosphoranilidate）
、ホスホラミデート（phosphoramidate）など（関連する対イオンが存在する場
合は、当該対イオン、例えばＨ、ＮＨ4、Ｎａなどを含む）を含む類似体を意味
する。オリゴヌクレオチドは、幾つかのモノマー単位、例えば８〜４０から数千
モノマー単位の大きさの範囲にある。オリゴヌクレオチドが文字の配列、例えば
「ＡＴＧＣＣＴＧ」で示されるときは、別言しない限り常に、当該ヌクレオチド
は左から右へ５’→３’の順で存在すること、及び、「Ａ」はデオキシアデノシ
ン、「Ｃ」はデオキシシチジン、「Ｇ」はデオキシグアノシン及び「Ｔ」はチミ
ジンを意味することが理解されるだろう。
【００２５】 ヌクレオシドの標識は、既知の連結、連結基及び関連する相補的機能性を使用
した多数の既知のヌクレオシド標識技術のいずれかを使用して達成することがで
きる。色素及びヌクレオシドを連結する結合は、（ｉ）オリゴヌクレオチド合成
条件に対して安定である、（ii）オリゴヌクレオチド−標的ハイブリダイゼーシ
ョンを妨害しない、（iii）関連する酵素、例えばポリメラーゼ、リガーゼなど
に適合する及び（iv）色素の蛍光を消光しないものでなければならない。 好ましくは、色素は、ピリミジン塩基の５−炭素及び７−デアザプリン塩基の
７−炭素に共有結合している。本発明に用いることができる幾つかの適切な塩基
標識手順は、例えば Gibsonら, Nucleic Acids Research, 15 6455-6467 (1987)
; Gebeyehuら, Nucleic Acids Research, 15 4513-4535 (1987); Haralambidis
ら, Nucleic Acids Research, 15 4856-4876 (1987); Nelsonら, Nucleosides a
nd Nucleotides, 5(3) 233-241 (1986); Bergstromら, JACS, 111 374-375 (198
9); 米国特許第４，８５５，２２５号、第５，２３１，１９１号及び第５，４４
９，７６７号（これらの文献は参照することにより本明細書に組み込まれる）に
報告されている。 好ましくは、結合は、アセチレン型アミド結合又はアルケン型アミド結合であ
って、色素とヌクレオチドとの間の結合は、色素の活性化Ｎ−ヒドロキシスクシ
ンイミド（ＮＨＳ）エステルとヌクレオチドのアルキニルアミノ−、アルキニル
エトキシアミノ−又はアルケニルアミノ−誘導体化塩基との反応により形成され
る。より好ましくは、得られる結合は、プロアルギル（proargyl）−１−エトキ
シアミド（３−（アミノ）エトキシ−１−プロピニル）、３−（カルボキシ）ア
ミノ−１−プロピニル又は３−アミノ−１−プロピン−１−イルである。 本発明の色素をヌクレオシド塩基に連結するための好ましい幾つかの結合は以
下に示されるものである。
【００２６】
【００２７】 （式中、Ｒ1及びＲ2は別々に、Ｈ、アルキル、保護基又は蛍光色素である。） アルキニルアミノ−誘導体化ヌクレオシドの合成は、Hobbsら, 欧州特許出願
第８７３０５８４４．０及びHobbsら, J. Org. Chem., 54 3420(1989)（参照す
ることにより本明細書に組み込まれる）により教示される。要約すると、アルキ
ニルアミノ−誘導体化ヌクレオチドは、適切なハロジデオキシヌクレオシド（通
常は、Hobbesら（前掲）により教示された５−ヨードピリミジン及び７−ヨード
−７−デアザプリンジデオキシヌクレオシド）及びＣｕ（Ｉ）をフラスコ内に置
き、アルゴンを流して空気を除去し、乾燥ＤＭＦを添加し、続いてアルキニルア
ミン、トリエチルアミン及びＰｄ（０）を添加することにより形成される。反応
混合物を、数時間又は薄層クロマトグラフィーがハロジデオキシヌクレオシドの
消費を示すまで攪拌することができる。保護されていないアルキニルアミンを使
用するとき、アルキニルアミノ−ヌクレオシドは、反応混合物の濃縮及びカップ
リング反応において生成するハイドロハライドを中和する水酸化アンモニウムを
含む溶出溶媒を使用したシリカゲル中のクロマトグラフィーにより単離すること
ができる。保護されたアルキニルアミンを使用するとき、メタノール／塩化メチ
レンを反応混合物へ添加し、続いて強塩基性アニオン交換樹脂の炭酸水素塩形態
へ添加することができる。次いでスラリーを約４５分間攪拌し、ろ過し、樹脂を
追加のメタノール／塩化メチレンですすぐことができる。組み合わせたろ液は、
濃縮し、メタノール−塩化メチレン勾配を使用したシリカゲル中のフラッシュク
ロマトグラフィーにより精製することができる。トリホスフェートは、標準的技
術により得られる。
【００２８】 本発明のエネルギー移動色素で標識したオリゴヌクレオチドの合成は、既知の
結合、連結基及び関連する相補的機能性を使用した、多数の既知のオリゴヌクレ
オチド標識技術のいずれかを使用して達成することができる。例えば、標識オリ
ゴヌクレオチドは、酵素的に、例えばＤＮＡポリメラーゼ又はリガーゼを使用し
て（例えば、Stryer, Biochemistry, Chapter 24, W.H. Freeman and Company (
1981)）、又は化学合成、例えばホスホラミダイト法、ホスフィット−トリエス
テル法など（Gait, Oligonucleotide Synthesis, IRL Press (1990)）により合
成されるだろう。標識は、標識ヌクレオシドトリホスフェートモノマーを利用し
た酵素的合成の間、非ヌクレオチド又はヌクレオチドホスホラミダイトを使用し
た化学合成の間、又は合成の後に導入されるされるだろう。 一般的に、標識ヌクレオチドを、酵素的合成を使用して作成する場合には、以
下の手順が使用されるだろう。鋳型ＤＮＡを変性し、オリゴヌクレオチドプライ
マーを鋳型ＤＮＡへアニールする。デオキシヌクレオシドトリホスフェートの混
合物を、ｄＧＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ及びｄＴＴＰを含む反応物へ添加する。
ここで、デオキシヌクレオチドの内の１つの少なくとも１つの画分は、前記の本
発明の色素化合物で標識される。次に、ポリメラーゼ酵素を、当該ポリメラーゼ
酵素が活性である条件下で添加する。標識ポリヌクレオチドは、ポリメラーゼ鎖
合成の間に標識デオキシヌクレオチドを取り込むことにより形成される。代替の
酵素的合成法では、１種のプライマーの代わりに２種のプライマー（一方のプラ
イマーは標的の＋鎖に相補的であり、他方のプライマーは標的の−鎖に相補的で
ある）を使用し、ポリメラーゼは熱安定性ポリメラーゼであり、反応温度は変性
温度と伸長温度の間を繰り返し、これによりＰＣＲ（例えば、PCR Protocols, I
nnisら, eds., Academic Press (1990)）による標的配列に対する標識相補物を
指数関数的に合成する。 標識オリゴヌクレオチドを、化学合成を使用して作成する場合、一般的には、
ホスホラミダイト法を使用することが好ましい。ホスホラミダイト化合物及びポ
リヌクレオチド合成のホスホラミダイト法は、効率的かつ迅速なカップリング及
び出発物質の安定性により、オリゴヌクレオチドの合成において好ましい。合成
は、固体担体に結びついたオリゴヌクレオチド鎖の成長にともない行われる。そ
のため、液相に存在する過剰の試薬をろ過により容易に除去することができ、こ
れによりサイクル間の精製工程の必要性を排除することができる。
【００２９】 ヌクレオシド及びオリゴヌクレオチドの標識におけるホスホラミダイト試薬の
有用性の観点において、本発明は、本発明のエネルギー移動色素を含むホスホラ
ミダイト化合物に関する。 色素で標識したヌクレオシドは、既知の結合、連結基及び関連する相補的機能
性を使用した、多数の既知のオリゴヌクレオチド標識技術のいずれかを使用して
達成することができる。好ましくは、色素は、ピリミジン塩基の５−炭素及び７
−デアザプリン塩基の７−炭素に共有結合している。本発明に用いることができ
る幾つかの適切な塩基標識手順は、例えば Gibsonら, Nucleic Acids Res., 15
6455-6467 (1987); Gebeyehuら, Nucleic Acids Res., 15 4513-4535 (1987); H
aralambidisら, Nucleic Acids Res., 15 4856-4876; Nelsonら, Nucleosides a
nd Nucleotides, 5 233-241 (1986); Bergstromら, J. Am. Chem. Soc., 111 37
4-375 (1989); 米国特許第４，８５５，２２５号、第５，２３１，１９１号及び
第５，４４９，７６７号（これらの文献は参照することにより本明細書に組み込
まれる）に報告されている。 好ましくは、結合は、アセチレン型アミド結合又はアルケン型アミド結合であ
って、色素とヌクレオチドとの間の結合が、色素の活性化Ｎ−ヒドロキシスクシ
ンイミド（ＮＨＳ）エステルとヌクレオチドのアルキニルアミノ、アルキニルエ
トキシアミノ又はアルケニルアミノ−誘導体化塩基との反応により形成される結
合である。より好ましくは、得られる結合は、プロアルギル−１−エトキシアミ
ド（３−（アミノ）エトキシ−１−プロピニル）、３−（カルボキシ）アミノ−
１−プロピニル又は３−アミノ−１−プロピン−１−イルである。 アルキニルアミノ−誘導体化ヌクレオシドの合成は、Hobbsら, J. Org. Chem.
, 54:3420 (1989)（参照することにより本明細書に組み込まれる）により教示さ
れる。要約すると、アルキニルアミノ−誘導体化ヌクレオシドは、適切なハロジ
デオキシヌクレオシド（通常は、Hobbesら（前掲）により教示された５−ヨード
ピリミジン及び７−ヨード−７−デアザプリンジデオキシヌクレオシド）及びＣ
ｕ（Ｉ）をフラスコ内に置き、アルゴンを流して空気を除去し、乾燥ＤＭＦを添
加し、続いてアルキニルアミン、トリエチルアミン及びＰｄ（０）を添加するこ
とにより形成される。反応混合物を、数時間又は薄層クロマトグラフィーがハロ
ジデオキシヌクレオシドの消費を示すまで攪拌することができる。保護されてい
ないアルキニルアミンを使用するとき、アルキニルアミノヌクレオシドは、反応
混合物の濃縮及びカップリング反応において生成するハイドロハライドを中和す
る水酸化アンモニウムを含む溶出溶媒を使用したシリカゲル中のクロマトグラフ
ィーにより単離することができる。保護されたアルキニルアミンを使用するとき
、メタノール／塩化メチレンを反応混合物へ添加し、続いて強塩基性アニオン交
換樹脂の炭酸水素塩形態へ添加することができる。次いでスラリーを約４５分間
攪拌し、ろ過し、樹脂を追加のメタノール／塩化メチレンですすぐことができる
。組み合わせたろ液は、濃縮し、かつメタノール−塩化メチレン勾配を使用した
シリカゲル中のフラッシュクロマトグラフィーにより精製することができる。ト
リホスフェートは、標準的技術により得られる。
【００３０】 ホスホラミダイト法によりオリゴヌクレオチドを形成するために使用する化学
についての詳細な説明は、Caruthersら、米国特許第４，４５８，０６６号、Car
uthersら、米国特許第４，４１５，７３２号、Caruthersら, Genetic Engineeri
ng, 4 1-17 (1982)、Users Manual Model 392 and 394 Polynucleotide Synthes
izers, p.6-1〜6-22, Applied Biosystems, Part No. 901237 (1991)（参照する
ことにより、これらの文献の全体が本明細書に組み込まれる）に提供されている
。 以下の記載は、ホスホラミダイト法を使用した典型的なオリゴヌクレオチド合
成サイクルの工程を簡単に説明している。最初に、保護されたヌクレオチドモノ
マーを含む固体担体を、酸、例えばトリクロロ酢酸で処理して、５’−ヒドロキ
シル保護基を除去し、続くカップリング反応のためにヒドロキシルを遊離させる
。次いで、保護されたホスホラミダイトヌクレオシドモノマー及び弱酸、例えば
テトラゾールを反応物へ同時に添加することにより、活性化した中間体を形成す
る。弱酸は、反応性中間体を形成するホスホラミダイトの窒素をプロトン化する
。ヌクレオシドの添加は３０秒以内に完了する。次に、キャッピング工程を行い
、ヌクレオシドの添加を受けない全てのポリヌクレオチド鎖を終結させる。キャ
ッピングは、好ましくは無水酢酸及び１−メチルイミダゾールを用いて行う。次
いで、好ましい酸化剤としてヨウ素を使用し、酸素供与体として水を使用した酸
化により、ヌクレオチド間の結合をホスフィットからより安定なホスホジエステ
ルへ転換する。酸化後、ヒドロキシル保護基を、プロトン性酸、例えばトリクロ
ロ酢酸又はジクロロ酢酸を用いて除去し、鎖伸長が完了するまでこのサイクルを
繰り返す。合成後、塩基、例えば水酸化アンモニウム又はｔ−ブチルアミンを使
用して、ポリヌクレオチド鎖を担体から切断する。切断反応は、全てのホスフェ
ート保護基、例えば、シアノエチルを除去する。最後に、塩基中のポリヌクレオ
チド溶液を高温、例えば５５℃中で処理することにより、塩基の環外アミンの保
護基及び色素のヒドロキシル保護基を除去する。
【００３１】 全てのホスホラミダイトヌクレオシドモノマーが色素標識ホスホラミダイトに
なるだろう。ヌクレオチドの５’−末端部位が標識される場合、本発明の標識非
ヌクレオチド性ホスホラミダイトは、最終の濃縮工程の間に使用されるだろう。
オリゴヌクレオチドの内部部位を標識する場合、本発明の標識ヌクレオチド性ホ
スホラミダイトは、全ての濃縮工程の間で使用されるだろう。合成に続いて、オ
リゴヌクレオチドは、５’−末端を含む多数の部位で標識されるだろう。Oligon
ucleotides and Analogs, Eckstein ed., Chapter 8, IRL Press (1991)及びOrg
elら, Nucleic Acids Research 11(18) 6513 (1983)、米国特許第５，１１８，
８００号を参照のこと（これらの文献は参照することにより本明細書に組み込ま
れる）。 オリゴヌクレオチドは、そのホスホジエステルバックボーン（Oligonucleotid
es and Analogs, Eckstein ed., Chapter 9）において、又は３’−末端（Nelso
n, Nucleic Acids Research 20(23) 6253-6259並びに米国特許第５，４０１，８
３７号及び同５，１４１，８１３号）（これらの文献は参照することにより本明
細書に組み込まれる）においても標識されるだろう。オリゴヌクレオチドの標識
手順の総説は、R. Haugland, Excited States of Biopolymers, Steiner ed., P
lenum Press, NY (1983)を参照のこと。 一つの好ましい合成後化学標識法において、オリゴヌクレオチドは以下のよう
にして標識される。カルボキシ連結基を含む色素は、約１当量の１，３−ジシク
ロヘキシルカルボジイミド及び約３当量のｎ−ヒドロキシスクシンイミドと、乾
燥酢酸エチル中、室温下で３時間反応させることにより、ｎ−ヒドロキシスクシ
ンイミドエステルへ転換させる。反応混合物を５％ＨＣｌで洗浄し、硫酸マグネ
シウムで乾燥し、ろ過し、固体になるまで濃縮し、ＤＭＳＯ中に懸濁させる。次
いで、ＤＭＳＯ色素ストックを過剰量（１０〜２０×）で、０．２５Ｍ 炭酸水
素塩／炭酸塩緩衝液（ｐＨ９．４）中のアミノヘキシル誘導体化オリゴヌクレオ
チドへ添加し、６時間反応させる（例えば、米国特許第４，７５７，１４１号）
。色素標識オリゴヌクレオチドを、緩衝液、例えば０．１Ｍトリエチルアミンア
セテート（ＴＥＡＡ）を用いたサイズ排除クロマトグラフィーカラム溶離を通す
ことにより、未反応の色素から分離する。粗標識オリゴヌクレオチドを含む画分
を、勾配溶離を用いた逆相ＨＰＬＣにより更に精製する。
【００３２】 III．本発明の色素及び試薬を使用した方法 本発明のエネルギー移動色素は、サンプル中のある成分の存在を検出するため
の広範囲の方法において、当該サンプル中の成分を、当該色素を含有する試薬で
標識することにより使用されるだろう。特に、本発明のエネルギー移動色素及び
試薬は、分離及び蛍光検出技術を組み合わせた方法、特に多数の空間的にオーバ
ーラップする分析物の同時検出を要求する方法における使用に十分に適合してい
る。例えば、色素及び試薬は、生化学的分離手順、例えば電気泳動（この場合、
生理化学的性質、例えば大きさ、コンホメーション、電荷、疎水性などが類似し
ている標的物質の一連のバンド又はスポットが、直線的又は平面的配列で存在す
る）などに付されるオリゴヌクレオチドのクラスの同定に十分に適合している。
本明細書で使用するとき、用語「バンド」には、類似又は同一の生理化学的性質
に基づく、全ての分析物の空間的グループ化又は凝集が含まれる。通常、バンド
は、電気泳動による色素−オリゴヌクレオチドコンジュゲートの分離において生
じる。 オリゴヌクレオチドのクラスは、種々の事情で生じることができる。「断片分
析」又は「遺伝子分析」として本明細書に言及される方法の好ましいカテゴリー
においては、標識オリゴヌクレオチド断片を、例えば、連結又はポリメラーゼ特
異的プライマー伸長により、標識プライマー又はヌクレオチドを使用した鋳型特
異的酵素的合成により生成し、生成した断片を、大きさに依存する分離工程、例
えば電気泳動又はクロマトグラフィーに付し、分離に続いて、分離された断片を
、例えばレーザー誘導蛍光により検出する。特に好ましい態様において、オリゴ
ヌクレオチドの複数のクラスは同時に分離され、異なるクラスが、スペクトル的
に分離可能なレベルで識別される。 一つの断片分析法は、増幅断片長多型検出（AmpFLP）であり、この方法は、増
幅断片長多型、すなわち、ＰＣＲにより増幅された制限断片長多型に基づくもの
である。変化した大きさを有する増幅断片は、ファミリーを通して変異遺伝子を
追跡する連鎖マーカー（linked marker）として役立つ。増幅した断片が染色体
中で変異遺伝子と接近している程、連鎖の相関関係（linkage correlation）は
高くなる。多数の遺伝病についての遺伝子は同定されていないので、連鎖マーカ
ーは、疾患の危険性又は起源（paternity）の評価の補助に役立つ。ＡｍｐＦＬ
Ｐ技術において、ポリヌクレオチドは、ＰＣＲにおいて標識オリゴヌクレオチド
ＰＣＲプライマーを使用することにより又は標識ヌクレオチドトリホスフェート
を利用することにより標識されるだろう。
【００３３】 別の断片分析法は、ニックトランスレーションである。ニックトランスレーシ
ョンは、二本鎖ＤＮＡ分子中の標識されていないヌクレオチドトリホスフェート
を、標識ヌクレオチドトリホスフェートで置換する反応を含んでいる。遊離の３
’−ヒドロキシル基は、デオキシリボヌクレアーゼＩ（DNAaseI）処理により引
き起こされる「ニック」により、標識されていないＤＮＡ内に作成される。次い
でＤＮＡポリメラーゼＩは、標識ヌクレオチドがニックの３’−ヒドロキシル末
端へ付加することを触媒する。同時に、この酵素の５’→３’エキソヌクレアー
ゼ活性は、ニックの５’−ホスホリル末端からヌクレオチド単位を除去する。遊
離の３’−ＯＨ基を有する新規なヌクレオチドは、元の切除されたヌクレオチド
の部位に組み込まれ、ニックは３’方向へ１ヌクレオチド分シフトする。この３
’シフトは、標識されていないヌクレオチドの切除による除去を伴う、新規な標
識ヌクレオチドのＤＮＡへの連続的付加を生じるだろう。次いで、ニックトラン
スレーションしたポリヌクレオチドを、分離方法、例えば電気泳動を使用して分
析する。 別の例示的断片分析法は、可変数の直列型繰り返し配列又はＶＮＴＲに基づく
。ＶＮＴＲとは、繰り返し単位数が可変である、特定配列の隣接する複数のコピ
ーを含む二本鎖ＤＮＡ領域である。ＶＮＴＲ遺伝子座の例はｐＹＮＺ２２、ｐＭ
ＣＴ１１８及びＡｐｏＢである。ＶＮＴＲ法にサブセットは、ミクロサテライト
繰り返し単位、又は短直列型繰り返し配列（ＳＴＲ）、すなわち、短い（２〜４
塩基）繰り返し配列により特徴付けられるＤＮＡの直列型繰り返し配列の検出に
基づいている。ヒトにおける最も豊富な分散型繰り返しＤＮＡファミリーの一つ
は、（ｄＣ−ｄＡ）ｎ−−（ｄＧ−ｄＴ）ｎジヌクレオチド繰り返しファミリー
（（ＣＡ）ｎジヌクレオチド繰り返しファミリーとも呼ばれる）である。ヒトゲ
ノムには、１ブロックあたり１５〜３０の繰り返しを有する５００００〜１００
０００の（ＣＡ）ｎが存在すると考えられる。これらの繰り返し領域の多数が、
長さにおいて多型性であり、それゆえ、有用な遺伝子マーカーとして役立つこと
ができる。好ましくは、ＶＮＴＲ又はＳＴＲ法において、標識は、色素標識ＰＣ
Ｒプライマーを使用することによりポリヌクレオチド断片へ組み込まれる。
【００３４】 別の例示的な断片分析法はＤＮＡ配列決定である。一般的に、ＤＮＡ配列決定
は、オリゴヌクレオチドプライマーの伸長／終結反応を含んでいる。プライマー
を伸長するために使用するデオキシヌクレオシドトリホスフェート（ｄＮＴＰ）
が、反応混合物中に含まれる。更に、伸長しているプライマーに組み込まれたと
きに、当該伸長しているプライマーの更なる伸長を防ぐ、少なくとも１種のジデ
オキシヌクレオシド（ｄｄＮＴＰ）が、反応混合物中に含まれる。伸長反応が終
結した後、形成した異なる終結生成物を分離し、異なるヌクレオチドの位置を決
定するために分析する。 蛍光ＤＮＡ配列決定は、一般的に２つのカテゴリー：「色素プライマー配列決
定」及び「色素ターミネーター配列決定」に分割されるだろう。色素プライマー
配列決定において、蛍光色素は、伸長するプライマーへ組み込まれる。次いで、
４つの別々の伸長／終結反応を平行して行う。各伸長反応物は、伸長反応を終結
させる、異なるジデオキシヌクレオシドトリホスフェート（ｄｄＮＴＰ）を含ん
でいる。終結後、反応生成物をゲル電気泳動により分離し、分析する。例えば、
Ansorgeら, Nucleic Acids Res. 15 4593-4602 (1987)を参照のこと。 色素プライマー配列決定の一つの変形では、異なるプライマーを４つの別々の
伸長／終結反応物中で使用する。各プライマーは、スペクトル的に分解可能な異
なる色素を含んでいる。終結後、４種の伸長／終結反応由来の反応生成物をプー
ルし、電気泳動的に分離し、単一のレーン中で検出する。例えば、Smithら, Nat
ure 321 674-679 (1986)を参照のこと。したがって、スペクトル的に分解可能な
色素のセットを含むプライマーを使用することによる、色素プライマー配列決定
の変形において、１つ以上の伸長／終結反応に由来する生成物を同時に検出する
ことができる。 色素ターミネーター配列決定において、蛍光色素は、ジデオキシヌクレオシド
トリホスフェートのそれぞれに結びついている。次いで、伸長／終結反応を行う
。ここでは、標識ジデオキシヌクレオシドが伸長プライマーに組み込まれて更な
るプライマー伸長を防ぐまで、デオキシヌクレオシドトリホスフェートを用いて
プライマーが伸長する。一旦終結すると、各ジデオキシヌクレオシドの反応生成
物は分離されて、検出される。一つの態様において、別々の伸長／終結反応が、
４種のジデオキシヌクレオシドトリホスフェートのそれぞれについて行われる。
別の態様では、それぞれがスペクトル的に分解可能な異なる蛍光色素で標識され
た、４種のジデオキシヌクレオシドトリホスフェートを含む単一の伸長／終結反
応が行われる。
【００３５】 本発明の一つの側面にしたがうと、本発明の１種以上のオリゴヌクレオチド試
薬を使用した、色素プライマー配列決定を行う方法が提供される。この方法にし
たがうと、伸長した標識プライマーの混合物は、核酸配列と蛍光標識されたオリ
ゴヌクレオチドプライマーとを、デオキシヌクレオシドトリホスフェート、少な
くとも１種のジデオキシヌクレオシドトリホスフェート及びＤＮＡポリメラーゼ
の存在下でハイブリダイズすることにより形成される。蛍光標識されたオリゴヌ
クレオチドプライマーは、配列決定される核酸配列の一部に相補的なオリゴヌク
レオチド配列及び当該オリゴヌクレオチドに結びついたエネルギー移動蛍光色素
を含んでいる。 本発明の方法にしたがうと、ＤＮＡポリメラーゼは、プライマーの伸長を終結
させるジデオキシヌクレオシドトリホスフェートが組み込まれるまで、デオキシ
ヌクレオシドトリホスフェートを用いてプライマーを伸長する。終結後、伸長し
たプライマーの混合物を分離する。次いで核酸配列の配列を、形成した伸長プラ
イマーの混合物を蛍光的に検出することにより決定する。 この方法の更なる態様において、４種の色素プライマー配列決定反応が行われ
る。各プライマー配列決定反応は、異なる蛍光標識オリゴヌクレオチドプライマ
ー及び異なるジデオキシヌクレオシドトリホスフェート（ｄｄＡＴＰ、ｄｄＣＴ
Ｐ、ｄｄＧＴＰ及びｄｄＴＴＰ）を含んでいる。４種の色素プライマー配列決定
反応を行った後、得られた伸長プライマーの混合物はプールされるだろう。次い
で、伸長プライマーの混合物を、例えば電気泳動により分離し、４種の異なる蛍
光標識オリゴヌクレオチドプライマーの各々に由来する蛍光シグナルを検出して
、核酸配列の配列を決定する。 本発明の更なる側面にしたがうと、本発明のエネルギー移動色素で標識された
１種以上のジデオキシヌクレオシドトリホスフェートを用いた、色素ターミネー
ター配列決定を行う方法が提供される。この方法にしたがうと、伸長したプライ
マーの混合物は、核酸配列とオリゴヌクレオチドプライマーとを、デオキシヌク
レオシドトリホスフェート、少なくとも１種の蛍光標識ジデオキシヌクレオチド
トリホスフェート及びＤＮＡポリメラーゼの存在下でハイブリダイズすることに
より形成される。蛍光標識されたジデオキシヌクレオチドは、本発明のエネルギ
ー移動色素で標識されたジデオキシヌクレオシドトリホスフェートを含んでいる
。
【００３６】 この方法にしたがうと、ＤＮＡポリメラーゼは、蛍光標識されたジデオキシヌ
クレオシドトリホスフェートが伸長したプライマーに組み込まれるまで、デオキ
シヌクレオシドトリホスフェートを用いてプライマーを伸長する。終結後、伸長
したプライマーの混合物を分離する。次いで核酸配列の配列を、伸長プライマー
に結びついた蛍光標識ジデオキシヌクレオシドを検出することにより決定する。 この方法の更なる態様において、伸長したプライマーの混合物を形成する工程
は、核酸配列と４種の異なる蛍光標識ジデオキシヌクレオシドトリホスフェート
、すなわち、蛍光標識ジデオキシシトシントリホスフェート、蛍光標識ジデオキ
シアデノシントリホスフェート、蛍光標識ジデオキシグアノシントリホスフェー
ト及び蛍光標識ジデオキシチミジントリホスフェートとをハイブリダイズする工
程を含んでいる。 前記の断片分析法の各々において、標識オリゴヌクレオチドは、好ましくは電
気泳動手順、例えば Gould及びMatthews（前掲）、Rickwood及びHames, Eds., G
el Electrophoresis of Nucleic Acids; A Practical Approach, (IRL Press Li
mited, London, 1981)又はOsterman, Methods of Protein and Nucleic Acid Re
search, Vol.1 Springer-Verlag, Berlin, 1984に記載の手順により分離される
。好ましくは、電気泳動マトリックスのタイプは、約２〜２０質量％の濃度（質
量：容量）を有する架橋又は架橋していないポリアクリルアミドである。より好
ましくは、ポリアクリルアミド濃度は約４〜８％である。特にＤＮＡ配列決定に
関連して、好ましくは、電気泳動マトリックスは、鎖分離又は変性剤、例えば尿
素、ホルムアミドなどを含んでいる。前記のマトリックスの構築についての詳細
な手順は、Maniatisら, "Fractionation of Low Molecular Weight DNA and RNA
in Polyacrylamide Gels Containing 98% Formamide or 7M Urea", Methods in
Enzymology, 65 299-305 (1980)、Maniatisら, "Chain Length Determination
of Small Double- and Single-Stranded DNA Molecules by Polyacrylamide Gel
Electrophoresis", Biochemistry, 14 3787-3794 (1975)、Maniatisら, Molecu
lar Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, New Yor
k, 1982), p179-185及びABI PRISMTM 377 DNA Sequencer User's Manual, Rev.
A, January 1995, Chapter 2(p/n 903433, The Perkin-Elmer Corporation, Fos
ter City, CA)に与えられている。これらの文献は参照することによりその内容
が本明細書に組み込まれる。特定の分離において使用される最適のポリマー濃度
、ｐＨ、温度、変性剤濃度などは、分離する核酸の大きさの範囲、（一本鎖又は
二本鎖であるかに関係なく）塩基組成及び電気泳動により求める情報のクラスの
性質を含む多数の因子に依存する。したがって、本発明の適用は、特定の分離に
ついての最適条件に対する標準的な予備試験を必要とする。一例として、約２０
〜３００塩基の範囲の大きさを有するオリゴヌクレオチドを分離し、本発明にし
たがい、以下のマトリックス：Ｔｒｉｓ−ホウ酸塩ＥＤＴＡ緩衝液（ｐＨ８．３
）中、ビス−アクリルアミドに対して１９部〜１部のアクリルアミドにより形成
した６％ポリアクリルアミド中で検出した。 電気泳動的分離後、色素−オリゴヌクレオチドコンジュゲートを、色素標識ポ
リヌクレオチドから放出する蛍光を測定することにより検出する。前記の検出を
行うために、標識ポリヌクレオチドを、標準的光源、例えば高輝度水銀灯、レー
ザーなどにより照射する。以前は、４８８〜５５０ｎｍの波長で励起するフルオ
レセイン及びローダミンをベースとする色素及びフルオレセイン連結エネルギー
移動色素が使用されていた。しかしながら、本発明のエネルギー移動色素におい
て使用する供与体色素は、典型的には４５０ｎｍ未満の吸収極大を有し、それゆ
え短波長、好ましくは２５０〜４５０ｎｍで励起するだろう。
【００３７】 IV．短波長光源を使用した検出法 更に本発明は、検出法、例えばセクションIIIに記載の検出法であって、短波
長光源、好ましくは２５０〜４５０ｎｍの光を放出する光源を使用する方法に関
する。前記の通り、本発明のエネルギー移動色素の幾つかは、約２５０〜４５０
ｎｍの発光極大を有する供与体色素及び約５００ｎｍよりも大きい波長に発光極
大を有する受容体色素を有するという特徴を有している。結果として、これらの
色素は、短波長光源の使用を可能にする。したがって、本発明は、これらの短波
長光源を使用するための方法に関する。検出方法、例えばセクションIIIに記載
の検出方法における短波長光源の使用は、本発明の色素に限定されることを意図
するものではなく、２５０〜４５０ｎｍの波長を有する光を使用して励起するこ
とができる全てのエネルギー移動色素の使用を意図することに注意すべきである
。
【００３８】 Ｖ．エネルギー移動色素を組み込むキット 本発明は更に、エネルギー移動色素及び／又は試薬の組み合わせを有するキッ
トに関する。一つの態様において、キットは、少なくとも２種類のスペクトル的
に分解可能な本発明のエネルギー移動色素を含んでいる。このキットにおいて、
エネルギー移動色素は、好ましくは、色素を励起するために単一の光源が要求さ
れるように同一の供与体色素を含んでいる。 別の態様において、キットはジデオキシシトシントリホスフェート、ジデオキ
シアデノシントリホスフェート、ジデオキシグアノシントリホスフェート及びジ
デオキシチミジントリホスフェートを含んでいる。各ジデオキシヌクレオチドは
、本発明のエネルギー移動色素で標識されている。一つの態様において、各エネ
ルギー移動色素は、その他のジデオキシヌクレオチドトリホスフェートに結びつ
いたその他のエネルギー移動色素からスペクトル的に分離可能である。このキッ
トにおいて、エネルギー移動色素は、好ましくは同一の第一キサンテン色素を含
んでいる。 更に別の態様において、キットは、少なくとも２種のオリゴヌクレオチドを含
んでいる。各ヌクレオチドは、本発明のエネルギー移動色素を含んでいる。一つ
の態様において、各オリゴヌクレオチドは、その他のオリゴヌクレオチドに結び
ついたエネルギー移動色素からスペクトル的に分離可能なエネルギー移動色素を
含んでいる。別の態様において、キットは、スペクトル的に分離可能なエネルギ
ー移動色素を含んでいる少なくとも４種のオリゴヌクレオチドを含んでいる。 エネルギー移動色素及びＤＮＡ配列決定におけるその使用は、下記の実施例に
より説明される。前述したもの以外の目的及び利点は、実施例により明らかにな
る。
【００３９】 実施例 １．ＤＹＥ１０４の合成法 ５ＣＦ−Ｂ（０．４５ｍｌジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中の８ｍｇ、２０
ｍｌ）を、クマリンＤＹＥ１１４のスクシミジル（succimidyl）エステル溶液（
５ｍｇ／２００Ｌ ＤＭＦ溶液の２０Ｌ）へ添加した。ジイソプロピルエチルア
ミン（５Ｌ）を添加した。５分後、５％ＨＣｌの２００Ｌを添加した。混合物を
遠心分離した。固体を、炭酸水素塩溶液中に溶解し、逆相ＨＰＬＣにより精製し
た。ＤＹＥ１０４の合成スキームは図９に示される。 ２．ＤＹＥ１０６の合成法 ５ＣＦ−Ｂ（０．４５ｍｌジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中の８ｍｇ、２０
ｍｌ）を、クマリンＤＹＥ１１６のスクシミジルエステル溶液（５ｍｇ／２００
Ｌ ＤＭＦ溶液の２０Ｌ）へ添加した。ジイソプロピルエチルアミン（５Ｌ）を
添加した。５分後、５％ＨＣｌの２００Ｌを添加した。混合物を遠心分離した。
固体を、炭酸水素塩溶液中に溶解し、逆相ＨＰＬＣにより精製した。ＤＹＥ１０
６の合成スキームは図１０に示される。 ２．ＤＹＥ１０８の合成法 ５ＣＦ−Ｂ（０．４５ｍｌジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中の８ｍｇ、２０
ｍｌ）を、ＤＹＥ１１０、トリスルホピレンアセチルアジド（又はカスケードブ
ルーアセチルアジド、Molecular Probes）の溶液（５ｍｇ／２００Ｌ ＤＭＦ溶
液の２０Ｌ）へ添加した。ジイソプロピルエチルアミン（５Ｌ）を添加した。５
分後、５％ＨＣｌの２００Ｌを添加した。混合物を遠心分離した。固体を、炭酸
水素塩溶液中に溶解し、逆相ＨＰＬＣにより精製した。ＤＹＥ１０８の合成スキ
ームは図１１に示される。
【００４０】 ３．５ＣＦ−Ｂ−コンジュゲートの蛍光発光スペクトルの比較 以下の実施例は、一連の本発明のエネルギー移動色素の蛍光発光スペクトルを
比較している。５ＣＦ−Ｂ、ＤＹＥ１０２、ＤＹＥ１０４、ＤＹＥ１０６及びＤ
ＹＥ１０８の色素溶液を、Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ中で測定した。 これらの色素の構造は図１に示される。図１２は、３６５ｎｍで励起した個々
の色素成分の相対的発光極大を示している。更に図１２は、個々の色素成分の発
光極大を示している。図１２に示されるように、供与体色素の発光は、受容体色
素の吸収とオーバーラップしない。最高のコンジュゲートＤＹＥ１０８は、５Ｃ
Ｆ−Ｂ単独よりも１０倍強く輝いた。 表１は、５ＣＦ−Ｂコンジュゲートの相対的スペクトルデータ及び相対的量子
収率を示している。表１から理解されるように、供与体色素の発光の欠如により
観察されるように、量子収率は高く、エネルギー移動は実際的に定量的である。
クマリンをベースとする色素ＤＹＥ１０４及びＤＹＥ１０２並びにピレンをベー
スとする色素ＤＹＥ１０８は高い量子収率を示し、このことは、受容体が供与体
色素により放出される実質的に全てのエネルギーを吸収することができることを
示している。対照的に、ＤＹＥ１０６（クマリン）は、量子収率が低く、エネル
ギー移動は不十分である。 表１
【００４１】 ４．ピレントリスルホネート−ローダミン色素（ＤＹＥ１２０）の合成法 Ｄ−Ｒｏｘスクシンイミジルエステル（３ｍｇ）、１，４−シクロヘキサンジ
アミン（７ｍｇ）、ＤＭＦ（１００Ｌ）及びジイソプロピルエチルアミン（１０
Ｌ）を組み合わせた。５分後、エチルエーテルを添加した。混合物を遠心分離し
、デカントした。残渣をメタノール中に溶解し、アリコートを逆相ＨＰＬＣによ
り精製してｄ−Ｒｏｘ−酸をｄ−Ｒｏｘ−シクロヘキサンジアミン付加物から分
離した。精製した付加物を乾燥物まで濃縮し、１０Ｌ ＤＭＦ中に溶解した。 ＤＹＥ１１０、カスケードブルーアセチルアジドを作成した（Molecular Prob
es、８ｍｇ／１００Ｌ ＤＭＦ）。５ＬのＤＹＥ１１０溶液を、ｄ−Ｒｏｘ−シ
クロヘキサンジアミン付加物及び２Ｌ ジイソプロピルアミンへ添加した。混合
物を逆相ＨＰＬＣにより精製した。ピレントリスルホネート−ｄ−Ｒｏｘ色素（
ＤＹＥ１２０）の合成スキームが図１３に示される。 ピレントリスルホネート−ｄ−Ｒｏｘ付加物（ＤＹＥ１２０）の標準化した励
起及び発光スペクトルが図１４に示される。非常に小さいピレントリスルホネー
ト発光（４１０ｎｍ）が観察された。励起スペクトルは、４００ｎｍにおいて、
６００ｎｍにおける最大ピークの５０％であるピークを示した。 本発明は、前記で詳述した好ましい態様及び実施例を言及することにより開示
されているけれども、これらの実施例は、限定を意味するものではなく、説明を
意図するものであり、改変が当業者により容易に行われることが予期される。当
該改変は、本発明の精神及び請求項の範囲内にあるものであろう。本明細書にお
いて提供される全ての分子構造に関して、これらの分子構造は、示される正確な
電子構造だけでなく、全ての共鳴構造及びプロトン化状態も含んでいることが企
図される。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、本発明のエネルギー移動色素の例を示している。
【図２】 図２は、ピレン環構造を含む供与体色素の例を示している。
【図３】 図３は、クマリン環構造を含む供与体色素の例を示している。
【図４】 図４は、デンドリマーエネルギー移動色素の構造を示している。
【図５】 図５は、キサンテン色素、シアニン色素、フタロシアニン色素並びにスクアラ
イン色素を含む受容体色素のクラスを示している。
【図６】 図６は、キサンテン色素の一般構造及びキサンテン色素様フルオレセイン、ロ
ーダミン及び不斉性ベンゾキサンテンのクラスを示している。
【図７】 図７及び図７−１（続き）は、本発明の色素において使用する受容体色素の構
造を示している。
【図８】 図８は、本発明において使用するリンカーの−Ｃ（Ｏ）Ｒ22−サブユニットの
例を示している。
【図９】 図９は、エネルギー移動色素ＤＹＥ１０４の合成スキームを示している。
【図１０】 図１０は、エネルギー移動色素ＤＹＥ１０６の合成スキームを示している。
【図１１】 図１１は、エネルギー移動色素ＤＹＥ１０８の合成スキームを示している。
【図１２】 図１２は、本発明のエネルギー移動色素の蛍光発光スペクトルを示している。
【図１３】 図１３は、エネルギー移動色素ＤＹＥ１２０の合成スキームを示している。
【図１４】 図１４は、本発明のエネルギー移動色素ＤＹＥ１２０の蛍光発光スペクトルを
示している。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ， ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，Ｃ Ａ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ， ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，Ｋ Ｅ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ， ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，Ｒ Ｕ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ， ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ Ｆターム(参考） 2G045 AA35 DA12 DA13 FB02 FB07 FB12 4B024 AA11 AA20 CA01 CA11 CA20 HA11 HA19 4B063 QA13 QQ42 QQ52 QR08 QR32 QR35 QR38 QR42 QR62 QS16 QS24 QX02

Claims (26)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 核酸配列の配列を決定する方法であって、 核酸配列と蛍光標識オリゴヌクレオチドプライマーとを、デオキシヌクレオシ
    ドトリホスフェート、少なくとも１種のジデオキシヌクレオシドトリホスフェー
    ト及びＤＮＡポリメラーゼの存在下でハイブリダイズすることにより、伸長した
    標識プライマーの混合物を形成する工程であって、該ＤＮＡポリメラーゼは、該
    プライマーの伸長を終結させるジデオキシヌクレオシドトリホスフェートが取り
    込まれるまで、該デオキシヌクレオシドトリホスフェートにより該プライマーを
    伸長する工程、 該伸長したプライマーの混合物を分離する工程、及び、 形成した該伸長したプライマーの混合物を蛍光的に測定することにより、該核
    酸配列の配列を決定する工程、 を含み、 該蛍光標識オリゴヌクレオチドプライマーは、 配列を決定する核酸配列の一部に相補的であり、かつ、ポリメラーゼにより
    伸長可能な３’端を有するオリゴヌクレオチド配列、及び、 該オリゴヌクレオチドに結びついたエネルギー移動蛍光色素であって、 ２５０〜４５０ｎｍの波長に吸収極大を有する供与体色素、及び、 該供与体色素より放出される励起エネルギーを吸収し、かつ、これに応答
    して発光することができる受容体色素であって、５００ｎｍよりも大きい発光極
    大を有する受容体色素、 を含むエネルギー移動蛍光色素、 を含んでいることを特徴とする方法。
  2. 【請求項２】 核酸配列の配列を決定する方法であって、 核酸配列と蛍光標識オリゴヌクレオチドプライマーとを、デオキシヌクレオシ
    ドトリホスフェート、少なくとも１種のジデオキシヌクレオシドトリホスフェー
    ト及びＤＮＡポリメラーゼの存在下でハイブリダイズすることにより、伸長した
    標識プライマーの混合物を形成する工程であって、該ＤＮＡポリメラーゼは、該
    プライマーの伸長を終結させるジデオキシヌクレオシドトリホスフェートが取り
    込まれるまで、該デオキシヌクレオシドトリホスフェートにより該プライマーを
    伸長する工程、 該伸長したプライマーの混合物を分離する工程、及び、 形成した該伸長したプライマーの混合物を蛍光的に測定することにより、該核
    酸配列の配列を決定する工程、 を含み、 該蛍光標識オリゴヌクレオチドプライマーは、 配列を決定する核酸配列の一部に相補的であり、かつ、ポリメラーゼにより
    伸長可能な３’端を有するオリゴヌクレオチド配列、及び、 該オリゴヌクレオチドに結びついたエネルギー移動蛍光色素であって、 クマリン又はピレン環構造を有する色素のクラスのメンバーである供与体
    色素、及び、 該供与体色素より放出される励起エネルギーを吸収し、かつ、これに応答
    して発光することができる受容体色素であって、５００ｎｍよりも大きい発光極
    大を有する受容体色素、 を含むエネルギー移動蛍光色素、 を含んでいることを特徴とする方法。
  3. 【請求項３】 核酸配列の配列を決定する方法であって、 核酸配列とプライマーとを、デオキシヌクレオシドトリホスフェート、少なく
    とも１種の蛍光標識ジデオキシヌクレオシドトリホスフェート及びＤＮＡポリメ
    ラーゼの存在下でハイブリダイズすることにより、伸長したプライマーの混合物
    を形成する工程であって、該ＤＮＡポリメラーゼは、該プライマーの伸長を終結
    させる蛍光標識ジデオキシヌクレオシドトリホスフェートが取り込まれるまで、
    該デオキシヌクレオシドトリホスフェートにより該プライマーを伸長する工程、 該伸長したプライマーの混合物を分離する工程、及び、 該分離された伸長したプライマーの混合物に結びついた該蛍光標識ジデオキシ
    ヌクレオチドを検出することにより、該核酸配列の配列を決定する工程、 を含み、 該蛍光標識ジデオキシヌクレオシドトリホスフェートは、 ジデオキシヌクレオシドトリホスフェート、及び、 該ジデオキシヌクレオシドトリホスフェートに結びついたエネルギー移動蛍
    光色素であって、 ２５０〜４５０ｎｍの波長に吸収極大を有する供与体色素、及び、 該供与体色素より放出される励起エネルギーを吸収し、かつ、これに応答
    して発光することができる受容体色素であって、５００ｎｍよりも大きい発光極
    大を有する受容体色素、 を含むエネルギー移動蛍光色素、 を含んでいることを特徴とする方法。
  4. 【請求項４】 核酸配列の配列を決定する方法であって、 核酸配列とプライマーとを、デオキシヌクレオシドトリホスフェート、少なく
    とも１種の蛍光標識ジデオキシヌクレオシドトリホスフェート及びＤＮＡポリメ
    ラーゼの存在下でハイブリダイズすることにより、伸長したプライマーの混合物
    を形成する工程であって、該ＤＮＡポリメラーゼは、該プライマーの伸長を終結
    させる蛍光標識ジデオキシヌクレオシドトリホスフェートが取り込まれるまで、
    該デオキシヌクレオシドトリホスフェートにより該プライマーを伸長する工程、 該伸長したプライマーの混合物を分離する工程、及び、 該分離された伸長したプライマーの混合物に結びついた該蛍光標識ジデオキシ
    ヌクレオチドを検出することにより、該核酸配列の配列を決定する工程、 を含み、 該蛍光標識ジデオキシヌクレオシドトリホスフェートは、 ジデオキシヌクレオシドトリホスフェート、及び、 該ジデオキシヌクレオシドトリホスフェートに結びついたエネルギー移動蛍
    光色素であって、 クマリン又はピレン環構造を有する色素のクラスのメンバーである供与体
    色素、及び、 該供与体色素より放出される励起エネルギーを吸収し、かつ、これに応答
    して発光することができる受容体色素であって、５００ｎｍよりも大きい発光極
    大を有する受容体色素、 を含むエネルギー移動蛍光色素、 を含んでいることを特徴とする方法。
  5. 【請求項５】 前記供与体色素が、約３００〜４５０ｎｍの波長に吸収極大
    を有する、請求項１に記載の方法。
  6. 【請求項６】 前記供与体色素が、約３５０〜４００ｎｍの波長に吸収極大
    を有する、請求項１に記載の方法。
  7. 【請求項７】 前記受容体色素が、約５５０ｎｍよりも大きい波長に発光極
    大を有する、請求項１に記載の方法。
  8. 【請求項８】 前記受容体色素が、約５００〜７００ｎｍの波長に発光極大
    を有する、請求項１に記載の方法。
  9. 【請求項９】 前記受容体色素が、前記供与体色素の吸収極大よりも少なく
    とも約１５０ｎｍ大きい波長に発光極大を有する、請求項１に記載の方法。
  10. 【請求項１０】 前記受容体色素が、フルオレセイン、ローダミン、不斉性
    ベンゾキサンテン、キサンテン、シアニン、フタロシアニン及びスクアライン色
    素からなる群より選ばれる色素のクラスのメンバーである、請求項１に記載の方
    法。
  11. 【請求項１１】 前記受容体色素が、４，７−ジクロロフルオレセイン色素
    、不斉性ベンゾキサンテン色素、ローダミン、４，７−ジクロロローダミン色素
    、カルボキシローダミン、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルカルボキシローダ
    ミン、カルボキシＲ１１０、カルボキシＲ６Ｇ、カルボキシ−Ｘ−ローダミン及
    びＣｙ５からなる群より選ばれる、請求項１に記載の方法。
  12. 【請求項１２】 前記受容体色素が、Ｒ１１０、ＲＧ６、ＴＡＭＲＡ及びＲ
    ＯＸからなる群より選ばれる、請求項１に記載の方法。
  13. 【請求項１３】 前記エネルギー転移色素が、前記供与体色素を前記受容体
    色素へ結びつけるリンカーを更に含んでいる、請求項１に記載の方法。
  14. 【請求項１４】 前記供与体色素が、クマリン、ピレン及びピレンスルホネ
    ートからなる群より選ばれる、請求項１に記載の方法。
  15. 【請求項１５】 前記供与体色素が、約３００〜４５０ｎｍの波長に吸収極
    大を有する、請求項３に記載の方法。
  16. 【請求項１６】 前記供与体色素が、約３５０〜４００ｎｍの波長に吸収極
    大を有する、請求項３に記載の方法。
  17. 【請求項１７】 前記受容体色素が、約５５０ｎｍよりも大きい波長に発光
    極大を有する、請求項３に記載の方法。
  18. 【請求項１８】 前記受容体色素が、約５００〜７００ｎｍの波長に発光極
    大を有する、請求項３に記載の方法。
  19. 【請求項１９】 前記受容体色素が、前記供与体色素の吸収極大よりも少な
    くとも約１５０ｎｍ大きい波長に発光極大を有する、請求項３に記載の方法。
  20. 【請求項２０】 前記受容体色素が、フルオレセイン、ローダミン、不斉性
    ベンゾキサンテン、キサンテン、シアニン、フタロシアニン及びスクアライン色
    素からなる群より選ばれる色素のクラスのメンバーである、請求項３に記載の方
    法。
  21. 【請求項２１】 前記受容体色素が、４，７−ジクロロフルオレセイン色素
    、不斉性ベンゾキサンテン色素、ローダミン、４，７−ジクロロローダミン色素
    、カルボキシローダミン、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルカルボキシローダ
    ミン、カルボキシＲ１１０、カルボキシＲ６Ｇ、カルボキシ−Ｘ−ローダミン及
    びＣｙ５からなる群より選ばれる、請求項３に記載の方法。
  22. 【請求項２２】 前記受容体色素が、Ｒ１１０、ＲＧ６、ＴＡＭＲＡ及びＲ
    ＯＸからなる群より選ばれる、請求項３に記載の方法。
  23. 【請求項２３】 前記エネルギー転移色素が、前記供与体色素を前記受容体
    色素へ結びつけるリンカーを更に含んでいる、請求項３に記載の方法。
  24. 【請求項２４】 前記供与体色素が、クマリン、ピレン及びピレンスルホネ
    ートからなる群より選ばれる、請求項３に記載の方法。
  25. 【請求項２５】 核酸配列の配列を決定する方法であって、 核酸配列と蛍光標識オリゴヌクレオチドプライマーとを、デオキシヌクレオシ
    ドトリホスフェート、少なくとも１種のジデオキシヌクレオシドトリホスフェー
    ト及びＤＮＡポリメラーゼの存在下でハイブリダイズすることにより、伸長した
    標識プライマーの混合物を形成する工程であって、該ＤＮＡポリメラーゼは、該
    プライマーの伸長を終結させるジデオキシヌクレオシドトリホスフェートが取り
    込まれるまで、該デオキシヌクレオシドトリホスフェートにより該プライマーを
    伸長する工程、 該伸長したプライマーの混合物を分離する工程、及び、 形成した該伸長したプライマーの混合物を蛍光的に測定することにより、該核
    酸配列の配列を決定する工程、 を含み、 該蛍光標識オリゴヌクレオチドプライマーは、 配列を決定する核酸配列の一部に相補的であり、かつ、ポリメラーゼにより
    伸長可能な３’端を有するオリゴヌクレオチド配列、及び、 ＤＹＥ１０２、ＤＹＥ１０４、ＤＹＥ１０６、ＤＹＥ１０８、ＤＹＥ１１８
    及びＤＹＥ１２０からなる群より選ばれるエネルギー移動蛍光色素、 を含んでいることを特徴とする方法。
  26. 【請求項２６】 核酸配列の配列を決定する方法であって、 核酸配列とプライマーとを、デオキシヌクレオシドトリホスフェート、少なく
    とも１種の蛍光標識ジデオキシヌクレオシドトリホスフェート及びＤＮＡポリメ
    ラーゼの存在下でハイブリダイズすることにより、伸長したプライマーの混合物
    を形成する工程であって、該ＤＮＡポリメラーゼは、該プライマーの伸長を終結
    させる蛍光標識ジデオキシヌクレオシドトリホスフェートが取り込まれるまで、
    該デオキシヌクレオシドトリホスフェートにより該プライマーを伸長する工程、 該伸長したプライマーの混合物を分離する工程、及び、 該分離された伸長したプライマーの混合物に結びついた該蛍光標識ジデオキシ
    ヌクレオチドを検出することにより、該核酸配列の配列を決定する工程、 を含み、 該蛍光標識ジデオキシヌクレオシドトリホスフェートは、 ジデオキシヌクレオシドトリホスフェート、及び、 ＤＹＥ１０２、ＤＹＥ１０４、ＤＹＥ１０６、ＤＹＥ１０８、ＤＹＥ１１８
    及びＤＹＥ１２０からなる群より選ばれるエネルギー移動蛍光色素、 を含んでいることを特徴とする方法。
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