JP2003521571A

JP2003521571A - 電子欠乏窒素複素環で置換したフルオレセイン色素

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Publication number: JP2003521571A
Application number: JP2001555887A
Authority: JP
Inventors: クリシュナウパダヤ，; スティーブンメンシェン，; ウェイグオツェン，
Original assignee: アプレラコーポレイション
Priority date: 2000-02-07
Filing date: 2001-02-05
Publication date: 2003-07-15
Also published as: AU772739B2; EP1196640B1; CA2368495A1; USRE39663E1; EP1196640A2; JP2007277565A; ES2211768T3; JP4942150B2; ATE258992T1; DE60101939D1; CA2368495C; AU3483901A; WO2001057264A2; DE60101939T2; JP2006070270A; JP2006257427A; WO2001057264A3; US6221604B1; JP2007277564A

Abstract

(57)【要約】本発明は、概して、分子プローブを調製するための標識試薬として有用な蛍光色素化合物に関する。より詳細には、本発明は、キサンテン環構造および電子欠乏窒素複素環式置換基を有するフルオレセインに関する。この電気欠乏窒素複素環として、ピリジン、キノリン、ピラジンなどが挙げられる。基質として、ポリヌクレオチド、ヌクレオシド、ヌクレオチド、ペプチド、炭水化物、およびリガンドが挙げられる。また、本発明は、多色蛍光検出に有用なスペクトル的に分解可能な蛍光標識のセットの作製に適切な、色素化合物に関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】（Ｉ．発明の分野）本発明は、概して、分子プローブを調製するための標識試薬として有用な蛍光
色素化合物に関する。より詳細には、本発明は、キサンテン環構造および電子欠
乏窒素複素環式置換基を有するフルオレセインに関する。

【０００２】（ＩＩ．背景）蛍光標識を使用する生物学的検体の非放射性検出は、現代の分析バイオテクノ
ロジーにおいて重要な技術である。放射性標識の必要性を除くことによって、安
全性が高められ、そして試薬の処分に伴う環境への影響およびコストは大いに減
少する。このような蛍光検出法を使用する例としては、自動ＤＮＡ配列決定法、
オリゴヌクレオチドプローブ法、ポリメラーゼ連鎖反応産物の検出、免疫アッセ
イなどが挙げられる。

【０００３】多くの重要な用途において、空間的にオーバーラップした複数の検体の独立し
た検出（すなわち、多重蛍光検出）を達成するために、スペクトル的に識別可能
な多数の蛍光標識を使用することは好都合である。多重蛍光検出を使用する方法
の例としては、単一チューブ多重ＤＮＡプローブアッセイ、ＰＣＲ、単一ヌクレ
オチド多形性、免疫アッセイ、および多色自動ＤＮＡ配列決定法が挙げられる。
反応容器の数は、実験プロトコルを単純化することによって、そして用途に特異
的な試薬キットの生成を容易化することによって、減少され得る。多色自動ＤＮ
Ａ配列決定法の場合、多重蛍光検出は、単一の電気泳動レーンにおいて多数のヌ
クレオチドの分析を可能にし、それによって単色法による処理量を増加し、そし
てレーン内での電気泳動度の変化に伴う不確定性を減少する。自動４色Ｓａｎｇ
ｅｒ型ＤＮＡ配列決定法は、ゲノム全体の分子レベルでの特徴付けを可能にした
。

【０００４】多重蛍光検出に有用でスペクトル的に識別可能な多数の蛍光標識のセットを組
み立てることは、問題を含む。多重蛍光検出は、特に、単一励起光源、電気泳動
分離、および／または酵素での処理（例えば、自動ＤＮＡ配列決定）を必要とす
る用途のための、蛍光色素標識成分の選択に対して少なくとも６つの制約を課す
。第１に、発光スペクトルがスペクトル的に分解される、構造的に類似した色素
のセットを見出すことは困難である。なぜなら、有機蛍光色素の代表的な発光バ
ンドの半値幅は４０〜８０ナノメーター（ｎｍ）だからである。第２に、たとえ
オーバーラップしない発光スペクトルが同定されたとしても、それぞれの蛍光量
子効率が低すぎる場合、このセットは、なお適切ではないかもしれない。第３に
、いくつかの蛍光色素が同時に使用される場合、同時励起は困難となる。なぜな
ら色素の吸収バンドは、通常、広く分離しているからである。第４に、電荷、分
子サイズ、および色素の構造は、検体の電気泳動度に悪影響を与えてはならない
。第５に、蛍光色素は、検体を作製または操作するために使用される化学物質（
例えば、ＤＮＡ合成の溶媒および試薬、緩衝液、ポリメラーゼ酵素、リガーゼ酵
素など）と的合成でなければならない。第６に、色素は、レーザー励起に耐える
に充分な光安定性を有さなければならない。

【０００５】４色自動ＤＮＡ配列決定の用途における使用に適切な、現在利用可能な複数の
色素セットは、セットを構成する全ての色素からの蛍光発光を十分に励起するた
めに、青色または青緑色のレーザー光（例えば、アルゴンイオンレーザー）を必
要とする。より低コストな赤色レーザーが入手可能になるにつれて、上記制約を
満たし、そして約５００ｎｍより大きな波長を有するレーザー光によって励起可
能な、蛍光色素化合物およびそれらの結合体の必要性が発生する。

【０００６】（ＩＩＩ．要旨）本発明は、多色蛍光検出に有用なスペクトル的に分解可能な蛍光標識のセット
の作製に適切な、色素化合物に関する。

【０００７】概して本発明の色素は、以下のフルオレセイン型キサンテン環構造Ｉ：

【０００８】

【化１９】を含み、ここで、この構造は、Ｒ¹、Ｒ²、Ｒ³、Ｒ⁵、またはＲ⁷で、フルオレセ
イン環系に連結した少なくとも１つの電子欠乏窒素複素環で置換されている。

【０００９】Ｒ¹は、単独の場合に、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキル、（Ｃ₁−Ｃ₆）
置換アルキル、（Ｃ₁−Ｃ₆）アルコキシ、スルホネート、スルホン、アミノ、イ
ミニウム（ｉｍｍｉｎｉｕｍ）、アミド、ニトリル、反応性連結基、フェニル、
アリール、置換アリール、または複素環であるか、あるいはＲ⁷一緒の場合に、
ベンゾまたは複素環である。

【００１０】Ｒ²は、単独の場合、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキル、（Ｃ₁−Ｃ₆）置
換アルキル、（Ｃ₁−Ｃ₆）アルコキシ、スルホネート、スルホン、アミノ、イミ
ニウム、アミド、ニトリル、反応性連結基、フェニル、アリール、置換アリール
、または複素環である。

【００１１】Ｒ³は、単独の場合、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキル、（Ｃ₁−Ｃ₆）置
換アルキル、（Ｃ₁−Ｃ₆）アルコキシ、スルホネート、スルホン、アミノ、イミ
ニウム、アミド、ニトリル、反応性連結基、フェニル、アリール、置換アリール
、または複素環である。

【００１２】Ｒ⁴は、単独の場合に、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキル、（Ｃ₁−Ｃ₆）
置換アルキル、（Ｃ₁−Ｃ₆）アルコキシ、スルホネート、スルホン、アミノ、イ
ミニウム、アミド、ニトリル、反応性連結基、フェニル、アリール、置換アリー
ル、または複素環であるか、あるいはＲ⁵一緒の場合に、ベンゾまたは複素環で
ある。

【００１３】Ｒ⁵は、単独の場合に、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキル、（Ｃ₁−Ｃ₆）
置換アルキル、（Ｃ₁−Ｃ₆）アルコキシ、スルホネート、スルホン、アミノ、イ
ミニウム、アミド、ニトリル、反応性連結基、フェニル、アリール、置換アリー
ル、または複素環であるか、あるいはＲ⁴一緒の場合に、ベンゾまたは複素環で
ある。

【００１４】Ｒ⁷は、単独の場合に、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキル、（Ｃ₁−Ｃ₆）
置換アルキル、（Ｃ₁−Ｃ₆）アルコキシ、スルホネート、スルホン、アミノ、イ
ミニウム、アミド、ニトリル、反応性連結基、フェニル、アリール、置換アリー
ル、または複素環であるか、あるいはＲ¹一緒の場合に、ベンゾまたは複素環で
ある。

【００１５】Ｒ⁶は、以下の式ＩＩを有する、（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキル、（Ｃ₂−Ｃ₆）アルケ
ン、（Ｃ₂−Ｃ₆）アルキン、シアノ、複素環式芳香族、フェニル、および置換フ
ェニルであり得：

【００１６】

【化２０】ここで、Ｘ¹、Ｘ²、Ｘ³、Ｘ⁴、またはＸ⁵は、別々に、Ｈ、Ｃｌ、Ｆ、（Ｃ₁−
Ｃ₆）アルキル、（Ｃ₂−Ｃ₆）アルケン、（Ｃ₂−Ｃ₆）アルキン、ＣＯ₂Ｈ、ＳＯ ₃ Ｈ、ＣＨ₂ＯＨ、または反応性連結基である。

【００１７】１つの局面において、本発明は、構造Ｉのフルオレセイン色素を有する基質を
標識する方法を提供し、ここでこの基質は、色素の反応性連結基と反応し、そし
て基質−色素結合体が形成する。適切な色素標識化結合体は、Ｉに従った電子欠
乏窒素複素環で置換されたフルオレセイン色素、および基質（すなわち、別の分
子または基質）を含む。この基質は、本発明の１つ以上の色素（同じであっても
良いし、異なっていても良い）で標識され得る。色素からの蛍光は、スペクトル
範囲にわたって検出可能なシグナルを提供し、これは、単一のサンプルまたは混
合物において別々に標識された基質の識別を可能にする。

【００１８】１つの実施形態において、電子欠乏窒素複素環で置換されたフルオレセイン色
素は、別の色素化合物に共有結合されて、エネルギー移動色素化合物を形成する
。

【００１９】別の実施形態において、電子欠乏窒素複素環で置換されたフルオレセイン色素
は、ヌクレオシド、ヌクレオチド、ヌクレオシドおよびヌクレオチドのアナログ
、ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドのアナログに共有結合されて、それ
らとの標識化結合体を形成する。

【００２０】さらに別の実施形態において、本発明は、本発明の電子欠乏窒素複素環で置換
されたフルオレセイン色素を含む、ホスホラミダイト試薬を提供する。

【００２１】別の局面において、本発明は、電子欠乏窒素複素環で置換されたフルオレセイ
ン色素で標識されたオリゴヌクレオチドを合成する種々の方法、および蛍光標識
化ポリヌクレオチドの検出のために色素を使用する種々の方法を提供する。

【００２２】別の局面において、本発明は、電子欠乏窒素複素環で置換されたフルオレセイ
ン色素、および分子を標識するために有用かつ／またはＤＮＡ配列決定およびＤ
ＮＡ増幅（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応）のようなアッセイを行うために有用
な試薬を含むキットを提供する。

【００２３】本発明の、電子欠乏窒素複素環で置換されたフルオレセイン色素は、現在公知
なフルオレセイン色素全般に対して有意な利点を提供する。

【００２４】（Ｖ．好ましい実施形態の詳細な説明）ここで、本発明の好ましい実施形態への言及が詳細になされ、これらの例は、
付随する図面に示される。本発明は好ましい実施形態と組み合わせて記載される
が、本発明をこれらの実施形態に限定することは意図されないことが理解される
。逆に、本発明は、添付の特許請求の範囲によって規定される本発明の範囲内に
含まれ得る、あらゆる変更、改変、および等価物を包含することを意図する。

【００２５】（Ｖ．１定義）他で述べられない限り、以下の用語および語句は、本明細書中で使用される場
合、以下の意味を有することが意図される：「核酸塩基」は、相補的な核酸塩基または核酸塩基アナログとワトソンクリッ
ク水素結合を形成し得る、窒素含有複素環部分（例えば、プリン、７−デアザプ
リン、またはピリミジン）を意味する。代表的な核酸塩基は、天然に存在する拡
散塩基であるアデニン、グアニン、シトシン、ウラシル、チミン、およびこれら
の天然に存在する核酸塩基のアナログ（例えば、７−デアザアデニン、７−デア
ザグアニン、イノシン、ネブラリン、ニトロピロール、ニトロインドール、２−
アミノ−プリン、２，６−ジアミノ−プリン、ヒポキサンチン、プソイドウリジ
ン、プソイドシチジン、プソイドイソシチジン、５−プロピニル−シチジン、イ
ソシチジン、イソグアニン、７−デアザ−グアニン、２−チオ−ピリミジン、６−チオ−グアニン、４−チオ−チミン、４−チオ−ウラシル、Ｏ⁶−メチル−
グアニン、Ｎ⁶−メチル−アデニン、Ｏ⁴−メチル−チミン、５，６−ジヒドロチ
ミン、５，６−ジヒドロウラシル、４−メチル−インドール、およびエテノアデ
ニン（Ｆａｓｍａｎ、ＰｒａｃｔｉｃａｌＨａｎｄｂｏｏｋｏｆＢｉｏｃ
ｈｅｍｉｓｔｒｙａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ、３８５〜３
９４頁、ＣＲＣＰｒｅｓｓ、ＢｏｃａＲａｔｏｎ、Ｆｌ（１９８９）））で
ある。

【００２６】「ヌクレオシド」は、リボース糖のＣ−１’炭素に連結した核酸塩基を含む化
合物を意味する。リボースは、置換されていても置換されていなくても良い。置
換リボース糖は、１つ以上の炭素原子、好ましくは３’炭素が１つ以上の同じか
または異なる−Ｒ基、−ＯＲ基、−ＮＲＲ基、またはハロゲン基（ここで各Ｒは
、独立して、−Ｈ、（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキル、または（Ｃ₅−Ｃ₁₄）アリールであ
る）で置換された、リボースを含むがこれらに限定されない。特定の好ましいリ
ボースは、リボース、２’−デオキシリボース、２’，３’−デオキシリボース
、３’−ハロリボース、３’−フルオロリボース、３’−クロロリボース、およ
び３’−アルキルリボースである。核酸塩基がＡまたはＧである場合、リボース
糖は核酸塩基のＮ⁹位置に結合している。核酸塩基がＣ、Ｔ、またはＵである場
合、ペントース糖は、核酸塩基のＮ¹位置に結合している（Ｋｏｒｎｂｅｒｇお
よびＢａｋｅｒ、ＤＮＡＲｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ、第２版、Ｆｒｅｅｍａｎ、
ＳａｎＦｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ、（１９９２））。

【００２７】「ヌクレオチド」は、モノマー単位としてか、またはポリヌクレオチド内の、
ヌクレオシドのリン酸エステルを意味する。ヌクレオチドは、時々、リボース糖
の構造上の特徴を特に示すために「ＮＴＰ」、または「ｄＮＴＰ」および「ｄｄ
ＮＴＰ」と記される。「ヌクレオチド５’−トリホスフェート」とは、５’位置
に三リン酸エステル基を有するヌクレオチドをいう。三リン酸エステル基は、種
々の酸素の硫黄置換（例えば、α−チオヌクレオチド５’− トリホスフェート
）を含み得る。

【００２８】本明細書中で使用される場合、「ポリヌクレオチド」または「オリゴヌクレオ
チド」は、ヌクレオシドまたはそのアナログを含む、任意のポリマー化合物を包
含する。交換可能に使用される「オリゴヌクレオチド」および「ポリヌクレオチ
ド」は、２’−デオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）およびリボヌクレオチド（
ＲＮＡ）を含む、ヌクレオチドモノマーの単鎖ポリマーおよび二重鎖ポリマーを
意味する。オリゴヌクレオチドは、ヌクレオチド間リン酸ジエステル結合または
ヌクレオチド間アナログおよび関連する対イオン（例えば、Ｈ⁺、ＮＨ₄ ⁺、トリ
アルキルアンモニウム、Ｍｇ²⁺、Ｎａ⁺など）によって連結された、デオキシリ
ボヌクレオチドのみからなるか、リボヌクレオチドのみからなるか、またはその
キメラ混合物からなり得る。オリゴヌクレオチドは、核酸塩基アナログおよび糖
アナログからなり得る。ポリヌクレオチドの大きさの範囲は、代表的に２〜３個
のモノマー単位からであり、それらが一般にオリゴヌクレオチドといわれる場合
は、例えば５〜４０個から数千個のモノマーヌクレオチド単位である。他に示さ
れない限りオリゴヌクレオチド配列が示されるときはいつでもヌクレオチドは左
から右へ５’〜３’の順序であること、および他に示されない限り「Ａ」はデオ
キシアデノシンを示し、「Ｃ」はデオキシシチジンを示し、「Ｇ」はデオキシグ
アノシンを示し、「Ｔ」はチミジンを示すことが理解される。

【００２９】用語「ワトソン／クリック塩基対」とは、一般に二重鎖ＤＮＡに見られる水素
結合した塩基対をいう。

【００３０】「結合部位」とは、リンカーが共有結合する部分（例えば、フルオレセイン色
素、ヌクレオチド、またはオリゴヌクレオチド）での部位をいう。

【００３１】「リンカー」とは、色素を基質（例えば、オリゴヌクレオチド）に連結するか
、または例えばエネルギー移動色素対において一方の色素を他方の色素に連結す
る、部分をいう。

【００３２】「アルキル」とは、親であるアルカン、アルケン、またはアルキンの１つの炭
素原子から１つの水素原子を除去することによって誘導される、飽和もしくは不
飽和な、直鎖状、分枝状、または環状の炭化水素ラジカルをいう。代表的なアル
キル基は、メチル、エチル、プロピル、ブチルなどを含むがこれらに限定されな
い。代表的なアルキル基は、以下を含むがこれらに限定されない：メチル（−Ｃ
Ｈ₃）；エタニル（−ＣＨ₂−ＣＨ₃）、エテニル（−ＣＨ＝ＣＨ₂）、エチニル（
−Ｃ≡ＣＨ）のようなエチル；プロパン−１−イル（−ＣＨ₂−ＣＨ₂−ＣＨ₃）
、プロパン−２−イル、シクロプロパン−１−イル、プロパ−１−エン−１−イ
ル（−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ₂）、プロパ−１−エン−２−イル、プロパ−２−エン
−１−イル（−ＣＨ₂−ＣＨ＝ＣＨ₂）、プロパ−２−エン−２−イル、シクロプ
ロパ−１−エン−１−イル；シクロプロパ−２−エン−１−イル、プロパ−１−
イン−１−イル（−Ｃ≡Ｃ−ＣＨ３）、プロパ−２−イン−１−イル（−ＣＨ₂
−Ｃ≡ＣＨ）などのようなプロピル；ブタン−１−イル（−ＣＨ₂−ＣＨ₂−ＣＨ ₂ −ＣＨ₃）、ブタン−２−イル、シクロブタン−１−イル、ブタ−１−エン−１
−イル（−ＣＨ＝ＣＨ₂−ＣＨ₂−ＣＨ₃）、ブタ−１−エン−２−イル、ブタ−
２−エン−１−イル（−ＣＨ₂−ＣＨ＝ＣＨ₂−ＣＨ₃）、ブタ−２−エン−２−
イル、ブタ−１，３−ジエン−１−イル（−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ＝ＣＨ₂）、ブタ
−１，３−ジエン−２−イル、シクロブタ−１−エン−１−イル、シクロブタ−
１−エン−３−イル、シクロブタ−１，３−ジエン−１−イル、ブタ−１−イン
−１−イル（−Ｃ≡Ｃ−ＣＨ₂−ＣＨ₃）、ブタ−１−イン−３−イル、ブタ−３
−イン−１−イル（−ＣＨ₂−ＣＨ₂−Ｃ≡ＣＨ）などのようなブチル；など。好
ましい実施形態において、アルキル基は（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキルであり、（Ｃ₁−
Ｃ₃）が特に好ましい。

【００３３】「アルコキシ」は、−ＯＲを意味し、ここでＲは（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキルである
。

【００３４】「アルキルジイル」とは、１〜１２個の炭素原子の飽和もしくは不飽和な、分
枝状、直鎖状、または環状の炭化水素ラジカルをいい、そして親であるアルカン
、アルケン、またはアルキンの２つの同じかまたは異なる炭素原子の除去によっ
て誘導される、２つの一価ラジカル中心を有する。代表的なアルキルジイルラジ
カルとしては、メタノ（−ＣＨ₂−）；１，２−エチルジイル；１，３−プロピ
ルジイル；１，４−ブチルジイル；などが挙げられるがこれらに限定されない。

【００３５】「アリール」とは、親である芳香環系の１つの炭素原子から１つの水素原子を
除去することによって誘導される、６〜２０個の炭素原子の一価芳香族炭化水素
ラジカルをいう。代表的なアリール基としては、ベンゼン、置換ベンゼン、ナフ
タレン、アントラセン、ビフェニルなどから誘導されるラジカルが挙げられるが
、これらに限定されない。

【００３６】「アリールジイル」とは、６〜２０個の炭素原子の不飽和な環式または多環式
の炭化水素ラジカルをいい、共役共鳴電子系、および親であるアリール化合物の
２つの異なる炭素原子から２つの水素原子を除去することによって誘導される少
なくとも２つの一価ラジカル中心を有する。

【００３７】「置換アルキル」、「置換アルキルジイル」、「置換アリール」、および「置
換アリールジイル」とは、それぞれ、１つ以上の水素原子が各々独立して別の置
換基で置換されている、アルキルラジカル、アルキルジイルラジカル、アリール
、およびアリールジイルをいう。代表的な置換基としては、以下が挙げられるが
これらに限定されない：−Ｘ、−Ｒ、−Ｏ^-、−ＯＲ、−ＳＲ、−Ｓ^-、−ＮＲＲ
、＝ＮＲ、−ＣＸ₃、−ＣＮ、−ＯＣＮ、−ＳＣＮ、−ＮＣＯ、−ＮＣＳ、−Ｎ
Ｏ、−ＮＯ₂＝Ｎ₂、−Ｎ₃、−Ｓ（Ｏ）₂Ｏ^-、−Ｓ（Ｏ）₂ＯＨ、−Ｓ（Ｏ）₂Ｒ
、−Ｐ（Ｏ）（Ｏ^-）₂、−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）₂、−Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｃ（Ｏ）Ｘ、
−Ｃ（Ｓ）Ｒ、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−Ｃ（Ｏ）Ｏ^-、−Ｃ（Ｓ）ＯＲ、−Ｃ（Ｏ）
ＳＲ、−Ｃ（Ｓ）ＳＲ、−Ｃ（Ｏ）ＮＲＲ、−Ｃ（Ｓ）ＮＲＲ、および−Ｃ（Ｎ
Ｒ）ＮＲＲ、ここで、各Ｘは、独立してハロゲンであり、そして各Ｒは、独立し
て−Ｈ、アルキル、アリール、または複素環である。特に好ましい置換基は、以
下である：ハロゲン、−ＯＳ（Ｏ）₂ＯＲ、−Ｓ（Ｏ）₂ＯＲ、−Ｓ（Ｏ）₂Ｒ、
−Ｓ（Ｏ）₂ＮＲ、−Ｓ（Ｏ）Ｒ、−ＯＰ（Ｏ）Ｏ₂ＲＲ、−Ｐ（Ｏ）Ｏ₂ＲＲ、
−Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−ＮＲＲ、−ＮＲＲＲ、−ＮＣ（Ｏ）Ｒ、−Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｃ
（Ｏ）ＮＲＲ、−ＣＮ、−Ｏ、および−ＯＲ、ここでＲは、−Ｈ、アルキル、ア
リール、ヘテロアリール、複素環、および連結基からなる群より独立して選択さ
れる。

【００３８】「反応性連結基」とは、別の分子と反応して共有結合または連結（ｌｉｎｋａ
ｇｅ）を形成し得る、化学的に反応性な部分（例えば、求核剤または求電子剤）
をいう。

【００３９】「複素環」とは、１つ以上の環原子がヘテロ原子（例えば、窒素、酸素、およ
び硫黄）で置換されている、環系を有する分子をいう。

【００４０】「電子欠乏窒素複素環式置換基」とは、環系の１つの原子から１つの水素原子
を除去して、複素環を本発明のフルオレセイン色素に結合させることによって誘
導される、一価の電子欠乏窒素複素環をいう（Ｊｏｕｌｅら、Ｈｅｔｅｒｏｃｙ
ｃｌｉｃＣｈｅｍｉｓｔｒｙ、第３版、ＳｔａｎｌｅｙＴｈｏｒｎｅｓＰ
ｕｂｌｉｓｈｅｒ、Ｌｔｄ．、Ｃｈｅｌｔｅｎｈａｍ、Ｕ．Ｋ．（１９９８）；
Ａｃｈｅｓｏｎ、Ｒ．、ＡｎＩｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎｔｏｔｈｅＣｈ
ｅｍｉｓｔｒｙｏｆＨｅｔｅｒｏｃｙｃｌｉｃＣｏｍｐｏｕｎｄｓ、第２
版。ＩｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅＰｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ
＆Ｓｏｎｓの部、ＮｅｗＹｏｒｋ（１９６７））。いくつかの例示的な電
子欠乏窒素複素環が図１１に示される。

【００４１】「基質」は、本発明の色素化合物が結合される実体である。基質としては、以
下が挙げられるがこれらに限定されない：（ｉ）ポリヌクレオチド、（ｉｉ）ヌ
クレオシドおよびヌクレオチド、（ｉｉｉ）ペプチドおよびタンパク質、（ｉｖ
）炭水化物、（ｖ）リガンド、および（ｖｉ）上記（ｉ）〜（ｖ）の任意のアナ
ログ。

【００４２】「酵素的に組み込み可能な」とは、新生ポリヌクレオチド鎖の末端（例えば、
３’）上にポリメラーゼ酵素の作用を介して酵素的に組み込まれ得る、ヌクレオ
チドの性質をいう。

【００４３】「ターミネーター」は、得られたポリヌクレオチド鎖に対するヌクレオチドの
引き続く組み込みを妨げ、それによってポリメラーゼ伸長を停止する、酵素的に
組み込み可能なヌクレオチドを意味する。代表的なターミネーターには、３’ヒ
ドロキシル置換基がなく、そして２’，３’−ジデオキシリボース、２’，３’
−ジヒドロキシリボース、および２’，３’−ジデオキシ，３’−ハロリボース
（例えば、３’−フルオロ）が挙げられる。あるいは、リボフラノースアナログ
（例えば、アラリボース）が使用され得る。例示的なヌクレオチドターミネータ
ーとしては、２’，３’−ジデオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル、β−Ｄ−アラ
ビノフラノシル、３’−デオキシ−β−Ｄ−アラビノフラノシル、３’−アミノ
− ２’，３’−ジデオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル、および２’，３’−ジ
デオキシ− ３’−フルオロ−β−Ｄ−リボフラノシル（Ｃｈｉｄｇｅａｖａｄ
ｚｅら（１９８４）ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．、１２：１６７１−
１６８６；およびＣｈｉｄｇｅａｖａｄｚｅら、（１９８５）ＦＥＢ．Ｌｅｔｔ
．、１８３：２７５−２７８）。ヌクレオチドターミネーターはまた、可逆ヌク
レオチドターミネーターを含む（Ｍｅｔｚｋｅｒら（１９９４）Ｎｕｃｌｅｉｃ
ＡｃｉｄｓＲｅｓ．、２２（２０）：４２５９）。

【００４４】「酵素的に伸長可能な」は、ヌクレオチドがポリヌクレオチドの末端で酵素的
に組み込み可能であり、そして得られた伸長ポリヌクレオチドが、ヌクレオチド
またはヌクレオチドアナログの引き続く組み込みを行い得る、ヌクレオチドの性
質を意味する。

【００４５】「ヌクレオチド間アナログ」は、オリゴヌクレオチドのリン酸エステルアナロ
グを意味し、これには以下が挙げられるがこれらに限定されない：アルキルホス
ホネート、メチルホスホネート、ホスホルアミデート、ホスホトリエステル、ホ
スホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロアミデート。ヌクレオチド
間アナログはまた、糖／リン酸基が、アミド結合（例えば、２−アミノエチルグ
リシン単位）によって置換されている非リン酸アナログ（ＰＮＡといわれる）を
含む（Ｎｉｅｌｓｅｎら、（１９９１）“Ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｓｅｌｅｃｔｉｖ
ｅｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎｏｆＤＮＡｂｙｓｔｒａｎｄｄｉｓｐｌ
ａｃｅｍｅｎｔｗｉｔｈａｔｈｙｍｉｄｉｎｅ−ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ
ｐｏｌｙａｍｉｄｅ”Ｓｃｉｅｎｃｅ２５４：１４９７−１５００）。

【００４６】「標的配列」は、プライマーもしくはプローブとのハイブリダイゼーション、
酵素的活性、または検出の対象である、一本鎖または二本鎖のポリヌクレオチド
（ＤＮＡもしくはＲＮＡ）を意味する。

【００４７】「スペクトル的に分解可能」は、蛍光色素のセットに関して、それぞれの色素
の蛍光発光バンドが十分に明瞭であり（すなわち、十分に非オーバーラップであ
り）、色素が、単独かまたは他の化合物に結合体化された（標識された）場合の
いずれかで、一連の帯域通過フィルターおよび光電子倍増管、荷電結合デバイス
（ＣＣＤ）、分光写真器などを用いる標準的な光検出システム（例えば、光検出
器）を使用して、蛍光シグナルに基づいて、互いに識別可能であることを意味す
る（Ｗｈｅｅｌｅｓｓら、（１９８５）ＦｌｏｗＣｙｔｏｍｅｔｒｙ：Ｉｎｓ
ｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎａｎｄＤａｔａＡｎａｌｙｓｉｓ、２１−７６
頁、ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ、ＮｅｗＹｏｒｋ）。おそらく、スペクト
ル的に分解可能な色素のセットを含む全ての色素は、単一光源によって励起可能
である。

【００４８】「易動度一致」とは、等しい長さのポリヌクレオチドを標識するために使用さ
れる場合に、実質的に類似の電気泳動易動度を有する、別個に標識されたポリヌ
クレオチドを生じる、蛍光色素のセットをいう。代表的に、易動度一致色素のセ
ットで標識されたポリヌクレオチドの相対的な電気泳動易動度は、ヌクレオチド
の約１／２未満だけ異なる。好ましくは、易動度一致色素は、上記で定義された
ようにスペクトル的に分解可能である。

【００４９】「相対的光安定性」は、吸収極大における残存色素のサンプリング測定を用い
て、強度の白色光への曝露によって測定される場合の、標準（５−カルボキシフ
ルオレセイン）に対する蛍光色素の化学的安定性を意味する。自動ＤＮＡ配列決
定およびフラグメント分析用途に共通のレーザー誘導性蛍光の下での安定性の相
関性試験として、等しい光密度単位の試験色素および基準が同時に光に供される
。

【００５０】（Ｖ．２色素）第１の局面において、本発明は、以下の構造Ｉに従う新しいクラスのフルオレ
セイン型キサンテン環化合物：

【００５１】

【化２１】を含み、ここで、この構造は、Ｒ¹、Ｒ²、Ｒ³、Ｒ⁴、Ｒ⁵、またはＲ⁷で、フルオ
レセイン環系に連結した少なくとも１つの電子欠乏窒素複素環で置換されている
。電子欠乏窒素複素環は、炭素−炭素結合または炭素−窒素結合を介してフルオ
レセイン環系に結合され得る。本開示の全体にわたって提供される全ての分子構
造は、提示されるそのままの電子構造を含むだけでなく、その共鳴構造、互変異
体、鏡像異性体、ジアステレオマー、およびプロトン化状態の全てを含むことが
意図される。

【００５２】Ｒ¹は、単独の場合に、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキル、（Ｃ₁−Ｃ₆）
置換アルキル、（Ｃ₁−Ｃ₆）アルコキシ、スルホネート、スルホン、アミノ、イ
ミニウム、アミド、ニトリル、反応性連結基、フェニル、置換フェニル、アリー
ル、置換アリール、または複素環であるか、あるいはＲ⁷と一緒の場合に、ベン
ゾまたは複素環である。

【００５３】Ｒ²は、単独の場合、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキル、（Ｃ₁−Ｃ₆）置
換アルキル、（Ｃ₁−Ｃ₆）アルコキシ、スルホネート、スルホン、アミノ、イミ
ニウム、アミド、ニトリル、反応性連結基、フェニル、置換フェニル、アリール
、置換アリール、または複素環である。

【００５４】Ｒ³は、単独の場合、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキル、（Ｃ₁−Ｃ₆）置
換アルキル、（Ｃ₁−Ｃ₆）アルコキシ、スルホネート、スルホン、アミノ、イミ
ニウム、アミド、ニトリル、反応性連結基、フェニル、置換フェニル、アリール
、置換アリール、または複素環である。

【００５５】Ｒ⁴は、単独の場合に、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキル、（Ｃ₁−Ｃ₆）
置換アルキル、（Ｃ₁−Ｃ₆）アルコキシ、スルホネート、スルホン、アミノ、イ
ミニウム、アミド、ニトリル、反応性連結基、フェニル、置換フェニル、アリー
ル、置換アリール、または複素環であるか、あるいはＲ⁵と一緒の場合に、ベン
ゾまたは複素環である。

【００５６】Ｒ⁵は、単独の場合に、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキル、（Ｃ₁−Ｃ₆）
置換アルキル、（Ｃ₁−Ｃ₆）アルコキシ、スルホネート、スルホン、アミノ、イ
ミニウム、アミド、ニトリル、反応性連結基、フェニル、置換フェニル、アリー
ル、置換アリール、または複素環であるか、あるいはＲ⁴と一緒の場合に、ベン
ゾまたは複素環である。

【００５７】Ｒ⁷は、単独の場合に、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキル、（Ｃ₁−Ｃ₆）
置換アルキル、（Ｃ₁−Ｃ₆）アルコキシ、スルホネート、スルホン、アミノ、イ
ミニウム、アミド、ニトリル、反応性連結基、フェニル、置換フェニル、アリー
ル、置換アリール、または複素環であるか、あるいはＲ¹と一緒の場合に、ベン
ゾまたは複素環である。

【００５８】Ｒ⁶は、（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキル、（Ｃ₂−Ｃ₆）アルケン、（Ｃ₂−Ｃ₆）アルキ
ン、シアノ、複素環式芳香族、フェニル、および以下の式ＩＩを有する置換フェ
ニルからなる群より選択され：

【００５９】

【化２２】ここで、Ｘ¹、Ｘ²、Ｘ³、Ｘ⁴、およびＸ⁵は、別々に、Ｈ、Ｃｌ、Ｆ、（Ｃ₁−
Ｃ₆）アルキル、（Ｃ₂−Ｃ₆）アルケン、（Ｃ₂−Ｃ₆）アルキン、ＣＯ₂Ｈ、ＳＯ ₃ Ｈ、ＣＨ₂ＯＨ、または反応性連結基である。

【００６０】Ｉに従った特に好ましい色素は、Ｒ⁴がＲ⁵と一緒に融合環（例えば、ベンゾ）
を形成する色素を含む。Ｒ¹がＲ⁷と一緒に融合環（例えば、ベンゾ）を形成する
色素も同様に好ましい。

【００６１】好ましい色素は、Ｒ¹、Ｒ²、Ｒ³、およびＲ⁴が、各々別々に、フェニルおよび
置換フェニル、ナフチル、置換ナフチル、フルオロ、クロロ、２−ピリジル、３
−ピリジル、２−キノリル、または３−キノリルである、色素を含む。Ｒ⁵およ
びＲ⁷は、好ましくは水素である。

【００６２】ＩＩに従った特に好ましい色素の別のクラスは、置換フェニルが以下の構造Ｉ
Ｉａ：

【００６３】

【化２３】を有する色素を含む。

【００６４】ＩＩａの好ましい実施形態では、Ｘ³およびＸ⁴の１つが反応性連結基であり、
そしてその他が水素である。ＩＩａの特に好ましい実施形態では、Ｘ³およびＸ⁴ の１つがカルボキシルであり、そしてその他が水素である。

【００６５】上記発明の種々の局面は、多重蛍光検出に有用な公知の蛍光色素化合物につい
ての以下の重要な利点のうち１つ以上を可能にする：（１）対象色素化合物の発
光スペクトルは、電子欠乏窒素複素環および／またはアリール置換基の型および
に位置における小さな変化によって調節され得、このことは、類似の吸収特性で
あるがスペクトル的に分解可能な蛍光発光スペクトルを有する色素セットの作製
を可能にする；（２）対象色素化合物は、その好ましい蛍光特性を損なうことな
く、容易に基質に結合し得る；（３）対象色素化合物は、狭い発光バンド幅を有
する、すなわち発光バンド幅は、約４５ｎｍより低い半値全幅（ＦＷＨＭ）発光
強度を有する；（４）対象色素化合物は、高い量子収量を維持しながら緩衝水溶
液に非常に溶解性である；（５）対象色素化合物は、比較的光安定性である；そ
して（６）対象色素化合物は、比較的大きな（すなわち、約５０，０００より大
きい）吸光率を有する（Ｂｅｎｓｏｎら“Ａｒｏｍａｔｉｃ−ｓｕｂｓｔｉｔｕ
ｔｅｄｘａｎｔｈｅｎｅｄｙｅｓ”、１９９９年１２月２８日発行の米国特
許第６，００８，３７９号）。ＦＷＨＭによって例示されるような狭い発光バン
ド幅は、１つ（１セット）以上の蛍光色素で標識された基質の混合物中でのスペ
クトル分解を容易にするものとして望ましい。光安定性は、本発明の色素で標識
された基質（例えば、ポリヌクレオチド）が強いレーザー光に供されて検出のた
めの蛍光を誘導し得るという点で、重要な特性である。光退色または他の化学的
分解機構は、最適より低い光安定性の色素で標識された基質の検出を減少または
阻害する。

【００６６】図１１は、本発明のフルオレセイン色素上の置換基として使用され得る電子欠
乏窒素複素環の代表的なサンプルを示す。これらの複素環置換基は、蛍光色素の
重要なスペクトル特性に対して直接的な影響を有する。これらの影響は、以下の
ような本発明のフルオレセイン色素のスペクトル特性によって例示される：（ｉ
）励起、発光、ならびに吸収極大および吸収スペクトル、（ｉｉ）光安定性、（
ｉｉｉ）量子効率、ならびに（ｉｖ）エネルギー移動効率。

【００６７】電子欠乏窒素複素環は、環に１つ以上の窒素原子を保持する５員環または６員
環を有し得る（図１１）。５員環または６員環は、第２の芳香族環（例えば、ベ
ンゾ環、または置換ベンゾ環）または飽和環（例えば、シクロペンチルまたはシ
クロヘキシル）に融合され得る。複素環は、環系に他のヘテロ原子（例えば、酸
素または硫黄）を有し得る。

【００６８】好ましい電子欠乏窒素複素環としては、以下が挙げられるがこれらに限定され
ない：図１１中の複素環、ならびに２−ピリジル、３−ピリジル、４−ピリジル
、２−キノリル、３−キノリル、４−キノリル、２−イミダゾール、４−イミダ
ゾール、３−ピラゾール、４−ピラゾール、ピリダジン、ピリミジン、ピラジン
、シノリン、フタラジン（ｐｔｈａｌａｚｉｎｅ）、キナゾリン、キノキサリン
、３−（１，２，４−Ｎ）−トリアゾリル、５−（１，２，４−Ｎ）−トリアゾ
リル、５−テトラゾリル、４−（１−Ｏ，３−Ｎ）−オキサゾール、５−（１−
Ｏ，３−Ｎ）−オキサゾール、４−（１−Ｓ，３−Ｎ）−チアゾール、５−（１
−Ｓ，３−Ｎ）−チアゾール、２−ベンゾキサゾール、２−ベンゾチアゾール、
ベンゾトリアゾール、４−（１，２，３−Ｎ）−ベンゾトリアゾール、およびベ
ンズイミダゾール。複素環は、複素環式環の炭素原子との結合によって直接的に
、キサンテン環系に結合され得る。あるいは複素環は、複素環とキサンテン環系
との間の芳香族性の非局在化を広げる不飽和リンカーを介して、キサンテン環系
に結合され得る。広範な電子の非局在化を可能にするリンカーとしては、以下が
挙げられるがこれらに限定されない：（ｉ）オレフィン型；−ＣＲ＝ＣＲ−、（
ｉｉ）ポリオレフィン型；−（ＣＲ＝ＣＲ）_n−、ここで、ｎは２〜１０である
（ｉｉｉ）アセチレン型；−Ｃ≡Ｃ−、（ｉｖ）ポリアセチレン型；−（Ｃ≡Ｃ
）_n−、ここで、ｎは２〜１０である（ｖ）スクアリン（ｓｑｕａｒｉｎｅ）お
よび（ｖｉ）他の結合体型リンカー。Ｒは、水素、（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキル、ハロ
ゲン、フッ素、塩素、ＣＮ、ＣＦ₃、アリール、および置換アリールからなる群
より選択される。オレフィン結合の形状は、シスまたはトランス、ＥまたはＺで
あり得る。

【００６９】（Ｖ．２Ａエネルギー移動色素）別の局面において本発明は、電子欠乏窒素複素環で置換された構造Ｉのフルオ
レセイン色素化合物を組み込んでいるエネルギー移動色素化合物を含む。一般に
、本発明のエネルギー移動色素は、ドナー色素（第１波長で光を吸収し、そして
それに応じて励起エネルギーを発する）、アクセプター色素（ドナー色素によっ
て発せられた励起エネルギーを吸収し得、そしてそれに応じて第２波長で蛍光を
発し得る）およびリンカー（ドナー色素をアクセプター色素に結合する。このリ
ンカーは、ドナー色素とアクセプター色素との間の効果的なエネルギー移動を容
易にするために有効であり、そしてアクセプター色素の高い発光量子収量を維持
する）を含む。（Ｌｅｅら“Ｅｎｅｒｇｙｔｒａｎｓｆｅｒｄｙｅｓｗｉ
ｔｈｅｎｈａｎｃｅｄｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ”、１９９８年９月１日発
行の米国特許第５，８００，９９６号；Ｌｅｅら“Ｅｎｅｒｇｙｔｒａｎｓｆ
ｅｒｄｙｅｓｗｉｔｈｅｎｈａｎｃｅｄｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ”、
１９９９年８月３１日発行の米国特許第５，９４５，５２６号；Ｍａｔｈｉｅｓ
ら“Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｌａｂｅｌｓａｎｄｔｈｅｉｒｕｓｅｉ
ｎｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ”１９９７年８月５日発行の米国特許第５，６５４
，４１９号）。本発明のエネルギー移動色素において、少なくとも１つのドナー
アクセプター色素は、電子欠乏窒素複素環で置換されたフルオレセイン色素であ
る。

【００７０】エネルギー移動色素は、混合物中の多重標識された基質の同時検出（例えば、
ＤＮＡ配列決定）での使用のための利点を有する。１つのドナー色素が、エネル
ギー移動色素のセットにおいて使用され得、その結果、各色素対は共通の波長で
の強い吸収を有する。次いで、エネルギー移動セット中のアクセプター色素を変
化させることによって、アクセプター色素は、それぞれの発光極大によってスペ
クトル的に分解され得る。エネルギー移動色素はまた、非エネルギー移動色素よ
りも大きな有効ストークスシフトを与える。ストークスシフトは、励起極大（ド
ナー色素が最大に光を吸収する波長）と発光極大（アクセプターが最大に光を発
光する波長）との間の差異である。

【００７１】好ましい実施形態において、ドナー色素とアクセプター色素との間のリンカー
は、リンカーに、ある程度の構造的剛性を与える官能基（例えば、アルケン、ジ
エン、アルキン、少なくとも１つの不飽和結合または融合環構造を有する５員環
および６員環）を含む。エネルギー移動色素のドナー色素およびアクセプター色
素は、以下の構造を有するリンカーによって結合され得：

【００７２】

【化２４】ここで、ｎは１または２である。

【００７３】エネルギー移動色素のドナー色素とアクセプター色素との間のリンカーの結合
部位は、任意の位置Ｒ¹−Ｒ⁷であり得、ここでドナー色素およびアクセプター色
素の１つまたは両方は本発明の色素である。好ましい結合部位としては、Ｒ²、
Ｒ³、Ｘ³、およびＸ⁴が挙げられる。

【００７４】エネルギー移動色素化合物は、リンカーを介して基質に共有結合される。この
リンカーは、アルキルジイル（Ｃ₁〜Ｃ₁₂）またはアリールジイル（Ｃ₆〜Ｃ₂₀）
であり得、そして受容官能基としては、アミド、カルバメート、尿素、チオ尿素
、ホスフェート、ホスホロチオエートなどが挙げられる。好ましいリンカーとし
ては、１，２−エチルジイルおよび１，６−ヘキシルジイルが挙げられる。ドナ
ー色素およびアクセプター色素の片方または両方が、本発明の色素である場合、
エネルギー移動色素と基質との間のリンカーの結合部位は、そのエネルギー移動
色素における任意のＲ¹〜Ｒ⁷位で有り得る。好ましい結合部位としては、Ｒ²、
Ｒ³、Ｘ³およびＸ⁴が挙げられる。この基質が、ヌクレオシドまたはヌクレオチ
ドである場合、好ましい結合部位は、核酸塩基上にある。基質がオリゴヌクレオ
チドである場合、好ましい結合部位としては、３’および５’末端が挙げられる
。基質が、ペプチドまたはタンパク質である場合、好ましい結合部位としては、
アミノ末端またはカルボキシ末端が挙げられる。

【００７５】（Ｖ．３合成方法）いくつかの合成方法が、本発明の蛍光色素の合成のために利用可能である。中
間体の合成の好ましい方法は、白金触媒Ｓｕｚｕｋｉボロネートカップリング反
応を介し、これにより、アリールボロン酸がハロゲン化アリールとカップリング
され、位置選択性を伴ってビアリール生成物が得られる（Ｚｈａｎｇら（１９９
８）「ＢａｓｅａｎｄｃａｔｉｏｎｅｆｆｅｃｔｓｏｎｔｈｅＳｕ
ｚｕｋｉｃｒｏｓｓ−ｃｏｕｐｌｉｎｇｏｆｂｕｌｋｙａｒｔｌｂｏｒ
ｏｎｉｃａｃｉｄｗｉｔｈｈａｌｏｐｙｒｉｄｉｎｅｓ：ｓｙｓｔｈｅｓ
ｉｓｏｆｐｙｒｉｄｙｌｐｈｅｎｏｌｓ」，Ｌ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６３：
６８８６−９０；Ｍａｒｔｉｎら（１９９３）「Ｐａｌｌａｄｉｕｍ−ｃａｔａ
ｌｙｚｅｄｃｒｏｓｓ−ｃｏｕｐｌｉｎｇｒｅａｃｔｉｏｎｓｏｆｏｒ
ｇａｎｏｂｏｒｏｎｉｃａｃｉｄｓｗｉｔｈｏｒｇａｎｉｃｅｌｅｃｔ
ｒｏｐｈｉｌｅｓ」，ＡｃｔａＣｈｅｍｉｃａＳｃａｎ．４７：２２１−３
０；Ａｌｉｐｒａｎｔｉｓら（１９９４）「Ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎｏｆｃ
ａｔａｌｙｔｉｃｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅｓｉｎｔｈｅＳｕｚｕｋｉ
ｒｅａｃｔｉｏｎｂｙｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙｍａｓｓｓｐｅｃｔ
ｒｏｍｅｔｒｙ」，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１６：６９８５−８６；Ｔ
ｈｏｍｐｓｏｎら（１９８４）「Ａｇｅｎｅｒａｌｓｙｎｔｈｅｓｉｓｏ
ｆ５−ａｒｙｌｎｉｃｏｔｉｎａｔｅｓ」，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．４９：５
２３７−４３）。

【００７６】環化基質５は、図１において合成される。Ｓｕｚｕｋｉ反応は、繰り返され、
初めに、テトラキス（トリフェニルホスフィン）白金触媒を用いて１，３−ジメ
トキシフェン−２−イルボロン酸と２−臭化トルエンをカップリングすることに
よりビフェニル化合物１が得られる。１の位置選択的な臭素化により、２が得ら
れ、続く白金触媒下のピリジン−３−ボロン酸とのＳｕｚｕｋｉ反応は、３を生
成した。臭化水素および酢酸での３の脱メチルにより、４が得られ、続く無水２
，５−ジクロロトリメリト酸とフリーデル‐クラフツアシル化は５を生成した。

【００７７】臭素化したナフチル化合物８は、図２に例示すように、環化中間体１１および
１２の合成のための共通の中間体として機能する。ピリジン−３−ボロン酸およ
びトル−２−イルボロン酸のＳｕｚｕｋｉカップリングにより、各々９および１
０が得られ、これらを、脱メチルし、１１および１２にした。

【００７８】１００℃でのメタンスルホン酸中での中間体５および１１の等モル混合物の環
化により、クロマトグラフィー後に、色素１３（図３）の３０％収率を得た（実
施例１３）。同様に、１４を１２との５の環化により形成した（実施例１４）。
色素１５（図４）を、５および２−フルオロ−１，３−ジヒドロキシナフタレン
の環化により形成した（１９９８年１１月２４日に発行された、Ｂｅｎｓｏｎら
「Ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃｂｅｎｚｏｘａｎｔｈｅｎｅｄｙｅｓ」、米国特許
第５，８４０，９９９号）。対称色素１６（図４）を、２モル等量の４および１
モル等量の無水２，５−ジクロロトリメリト酸の二重環化により合成した（実施
例１６）。

【００７９】同じ方法により、電子欠乏窒素複素環式置換フルオレセイン色素１９、２２（
図５）、２５（図６）、２８（図７）、３３（図８）、３６（図９）および４１
（図１０）を合成した（実施例１７〜４１）。

【００８０】（Ｖ．４本色素の標識試薬）本発明は、標識試薬を含み、ここで、電子欠乏窒素複素環置換フルオレセイン
色素は、基質と反応するための反応性形態である。別の局面において、本発明は
、本発明（すなわち、構造Ｉ）のフルオレセイン色素で標識または結合体化され
た基質を含む。基質は、実質的に、本発明の色素が結合体化され得る任意の分子
または物質であり得、例えば、タンパク質、ポリペプチド、多糖、ヌクレオシド
、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、脂質、固体支持体、有機および無機ポリマ
ー、ならびにその組み合わせおよびアセンブリ（例えば、染色体、核、生細胞（
例えば、細菌または他の微生物、哺乳動物細胞、組織など）などが挙げられるが
これらに限定されない。この色素は、種々の手段によって任意のリンカー（疎水
性引力、イオン性引力、および共有結合が挙げられる）を介して基質と結合体化
される。好ましくは、この色素は、共有結合を介して基質に結合体化される。

【００８１】標識化は、代表的に、当該分野で周知の方法（Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｂｉｏｃ
ｏｎｊｕｇａｔｅＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，Ｓ
ａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ．４０〜５５頁、６４３〜７１頁、（１９９６））を用
いて、両方が可溶である適切な溶媒中で結合される適切な反応性フルオレセイン
色素と基質とを混合し、続いて、任意の結合体化されてない出発物質または不要
な副生成物からこの結合体を分離することによって得られる。この色素結合体は
、後の使用のために乾燥保存され得るかまたは溶液中で保存され得る。

【００８２】本発明のフルオレセイン色素は、置換基の位置（Ｒ¹〜Ｒ⁵、Ｒ⁷、Ｘ¹〜Ｘ⁵）
の１つにおいて反応性結合基を含むか、または別の分子（すなわち、基質）への
色素の共有結合を含み得る。反応性結合基は、色素および共有結合を形成し得る
基質上の部分である。代表的に、この色素は、基質上の求核性官能基と反応し得
る求電子性官能基を有する。基質求核試薬の例としては、アルコール、アルコキ
シド、アミン、ヒドロキシルアミン、およびチオールが挙げられる。色素を基質
に結合体化させるために使用される反応性結合基の選択は、代表的に、結合され
る基質上の相補的な官能性に依存する。求電子反応性結合基の例としては、スク
シンイミジルエステル、イソチオシアネート、塩化スルホニル、スルホネートエ
ステル、ハロゲン化シリル、２，６−ジクロロトリアジニル、ペンタフルオロフ
ェニルエステル、ホスホルアミダイト、マレイミド、ハロアセチル、エポキシド
、アルキルハライド、ハロゲン化アリル、アルデヒド、ケトン、アシルアジド、
無水物およびヨウ化アセトアミドが挙げられる。単一の型の反応性結合基は、基
質（代表的に多糖）に関して利用可能であり得、または、種々の基（例えば、ア
ミン、チオール、アルコール、フェノール）は、タンパク質について代表的であ
るように、利用可能であり得る。結合される基質は、１より多い色素（この色素
は、同一であっても異なってもよい）、またはハプテンによってさらに修飾され
る基質に結合化され得る。いくらかの選択性は、反応条件の注意深い制御によっ
て得られるが、標識の選択性は、適切な反応色素の選択によって最も良好に得ら
れる。

【００８３】好ましい反応性結合基は、フルオレセイン色素のカルボキシル基置換基のＮ−
ヒドロキシスクシンイミジルエステル（ＮＨＳ）である。この色素のＮＨＳエス
テル形態は、好ましい標識試薬である。この色素のＮＨＳエステルは、予め形成
され、単離され、精製され、そして/または特徴付けされ得るか、あるいはイン
サイチュで形成され得、そして基質の求核性基（例えば、オリゴヌクレオチド、
ヌクレオチド、ペプチド、など）と反応し得る。代表的に、本発明の色素のカル
ボキシル形態（例えば、表１の色素化合物）は、カルボジイミド試薬（例えば、
ジシクロヘキシルカルボジイミド、ジイソプロピルカルボジイミド）、またはウ
ロニウム試薬（例えば、ＨＢＴＵ（Ｏ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，
Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート）または
ＨＡＴＵ（Ｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ
’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート）、および活性化剤（
例えば、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）、ならびにＮ−ヒドロ
キシスクシンイミドと反応して、この色素のＮＨＳエステルが生じる。

【００８４】本発明のフルオレセイン色素上のＮＨＳエステルについての好ましい置換基の
位置は、Ｘ³およびＸ⁴（Ｉａ）である。ＮＨＳエステルの代表的な例は、構造Ｉ
ｂ：

【００８５】

【化２５】である。

【００８６】別の好ましい反応性結合基は、本発明の色素のホスホルアミダイト形態である
。ホスホルアミダイト色素試薬は、本発明の色素で標識されたオリゴヌクレオチ
ドの自動合成のために特に有用である。オリゴヌクレオチドは、通常ホスホルア
ミダイトヌクレオシド試薬を用いるホスホルアミダイト方法（Ｃａｒｕｔｈｅｒ
ｓ，Ｍ．およびＢｅａｕｃａｇｅ，Ｓ．「Ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅｃ
ｏｍｐｏｕｎｄｓａｎｄｐｒｏｃｅｓｓｅｓ」、米国特許第４，４１５，７
３２号、１９８３年、１１月１５日発行；Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ，Ｍ．およびＭａ
ｔｔｅｕｃｃｉ，Ｍ．「Ｐｒｏｃｅｓｓｆｏｒｐｒｅｐａｒｉｎｇｐｏｌ
ｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ」、米国特許第４，４５８，０６６号、１９８４年、
７月３日発行；Ｂｅａｕｃａｇｅ，Ｓ．およびＩｙｅｒ，Ｒ．（１９９２）「Ａ
ｄｖａｎｃｅｓｉｎｔｈｅｓｙｎｔｈｅｓｉｓｏｆｏｌｉｇｏｎｕｃ
ｌｅｏｔｉｄｅｓｂｙｔｈｅｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅａｐｐｒ
ｏａｃｈ」，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ４８：２２２３−２３１１）によって固
体支持体上でに合成される。このホスホルアミダイト色素試薬は、ヌクレオシド
または非ヌクレオシドであり得、そしてそれらの３’末端、５’末端および／ま
たは１以上の内部位置で合成的ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドアナロ
グを標識するために都合よく使用され得る。ホスホルアミダイト色素試薬の非ヌ
クレオシド形態は、一般構造ＩＩＩ：

【００８７】

【化２６】を有し、ここで、ＤＹＥは、色素Ｉの保護形態または非保護形態であり、エネル
ギー移動色素を含む。Ｌは、リンカーである。別々であるＲ¹¹およびＲ¹²は、ア
ルキル（Ｃ₁〜Ｃ₁₂）、アルケン、アリール、および１０炭素原子までを含むシ
クロアルキルであるか、またはＲ¹¹およびＲ¹²は、窒素原子形態と共に一緒にな
って飽和窒素複素環を形成する。Ｒ¹³は、亜リン酸エステル保護基であり、オリ
ゴヌクレオチドの不要な伸長を妨げる。一般的に、Ｒ¹³は、オリゴヌクレオチド
合成条件に対して安定であるが、このオリゴヌクレオチドまたは色素の完全性に
不利に影響を与えない試薬を用いて合成的オリゴヌクレオチド生成物から取り除
かれ得る。これらの特徴を有する種々の亜リン酸エステル基は、当該分野で周知
である。好ましくは、Ｒ¹³は、メチル；２−シアノエチル、−ＣＨ₂ＣＨ₂ＣＮ；
および２−（４−ニトロフェニル）エチル、−ＣＨ₂ＣＨ₂（ｐ−ＮＯ₂Ｐｈ）で
ある。ホスホルアミダイト色素試薬の好ましい実施形態は、以下である：（ｉ）
Ｒ¹¹およびＲ¹²が各々イソプロピルであり、（ｉｉ）一緒になったＲ¹¹およびＲ ¹² がモルホリノであり、（ｉｉｉ）Ｌが、アルキル（Ｃ₁〜Ｃ₁₂）であり、（ｉ
ｖ）Ｒ¹³が、２−シアノエチルであり、そして（ｖ）ＤＹＥがリンカーによって
Ｒ⁶で結合される。ホスホルアミダイト色素試薬ＩＩＩは、本発明の単一のフル
オレセイン色素による基質の標識を行う。基質がオリゴヌクレオチドである場合
、この色素は、オリゴヌクレオチドの５’末端で結合され、結果として、３’か
ら５’の方向で合成される。他のホスホルアミダイト色素試薬（ヌクレシドおよ
び非ヌクレオシド）は、オリゴヌクレオチドの他の部位（例えば、３’末端、核
酸塩基、ヌクレオチド間結合、糖）で標識可能にする。核酸塩基、ヌクレオチド
間結合、および糖部位での標識は、フルオレセイン色素を用いて内部標識および
複数の標識を可能にする。

【００８８】ヒドロキシル基（例えば、固体支持体に結合されたオリゴヌクレオチドの５’
末端ＯＨ）と穏やかな酸活性化で反応する場合、ホスホルアミダイト色素試薬Ｉ
ＩＩは、反応してヌクレオチド間ホスファイト基を形成し、次いでこのホスファ
イトは、ヌクレオチド間ホスフェート基に酸化される。幾らかの例において、こ
の色素は、官能基（例えば、構造Ｉにおけるようなフェノール酸素）を含み得、
これは、ホスホルアミダイト色素試薬の合成の間かまたはオリゴヌクレオチドの
ような分子を標識するためのその後の使用の間のいずれかの間で、保護を必要と
する。使用される保護基（単数または複数）は、官能基の性質に依存し、そして
当業者に明らかである（Ｇｒｅｅｎ，ＴおよびＷｕｔｓ，Ｐ．Ｐｒｏｔｅｃｔｉ
ｖｅＧｒｏｕｐｓｉｎＯｒｇａｎｉｃＳｙｎｔｈｅｓｉｓ，第２版、Ｊ
ｏｈｎＷｉｌｅｙおよびＳｏｎｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ，１９９１）。一般的に
、使用される保護基は、５’−ヒドロキシル保護基（例えば、ジメトキシトリチ
ル）を取り除くために、オリゴヌクレオチド合成において通常使用される酸性条
件下（例えば、トリクロロ酢酸、ジクロロ酢酸）で安定であるべきであり、そし
て固体支持体から合成的オリゴヌクレオチドを脱保護および／または切断するた
めに使用される塩基性条件下（水酸化アンモニウム、メチルアミン水溶液）で不
安定であるべきである。

【００８９】安定なホスホルアミダイト色素試薬は、構造Ｉのキサンテン環酸素の最初の保
護（代表的に、エステル化（例えば、ピバレート（Ｒ＝ｔＢｕ）またはベンゾエ
ート（Ｒ＝Ｐｈ）エステルのようなアシル化））によって形成され得る。エステ
ル化は、構造Ｉａのラクトン化を引き起こし、ラクトン化は、非蛍光性の保護状
態（例えば、以下：

【００９０】

【化２７】構造Ｉｃ）の試薬を所与し、ここで、Ｘ³およびＸ⁴の１つは、水素であり、そし
てその他は、カルボキシルであり、この色素は、公知の反応（例えば、カルボキ
シルの活性化、６−アミノ、１−ヘキサノールを用いるアミド化およびビス（ジ
イソプロピルアミノ）シアノエチルホスファイトを用いるヒドロキシルのホスフ
ァイト化（Ｔｈｅｉｓｅｎ，ｅｔａｌ（１９９２））「Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ
ｄｙｅｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅｌａｂｅｌｌｉｎｇｏｆｏｌ
ｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ」，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＳｙｍｐｏｓｉ
ｕｍＳｅｒｉｅｓＮｏ．２７，ＯｘｆｏｒｄＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＰｒ
ｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，９９〜１００頁）により、非ヌクレオシドのホスホルア
ミダイト色素標識試薬（例えば、以下：

【００９１】

【化２８】Ｉｄ）に転換される。

【００９２】本発明の色素はまた、オリゴヌクレオチドの自動合成のために、固体支持体に
共有結合され得る（Ｍｕｌｌａｈ，Ｂ．およびＡｎｄｒｕｓ，Ａ．「Ｓｏｌｉｄ
ｓｕｐｐｏｒｔｒｅａｇｅｎｔｓｆｏｒｔｈｅｄｉｒｅｃｔｓｙｎ
ｔｈｅｓｉｓｏｆ３’−ｌａｂｅｌｌｅｄｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ
ｓ」、米国特許第５，７３６，６２６号（１９９８年４月７日発行）；Ｃａｒｕ
ｔｈｅｒｓ，Ｍ．およびＭａｔｔｅｕｃｃｉ，Ｍ．「Ｐｒｏｃｅｓｓｆｏｒ
ｐｒｅｐａｒｉｎｇｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ」、米国特許第４，４５
８，０６６号（１９８４年７月３日発行）。１つの実施形態において、この色素
は、固体支持体（例えば、制御された細孔ガラス（Ｎｅｌｓｏｎ，ｅｔａｌ（１
９９２）「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｌａｂｅｌｉｎｇｍｅｔｈｏｄ
ｓ３．Ｄｉｒｅｃｔｌａｂｅｌｉｎｇｏｆｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔ
ｉｄｅｓｅｍｐｌｏｙｉｎｇａｎｏｖｅｌ，ｎｏｎ−ｎｕｃｌｅｏｓｉｄ
ｉｃ，２−ａｍｉｎｏｂｕｔｙｌ−１，３−ｐｒｏｐａｎｅｄｉｏｌｂａｃｋ
ｂｏｎｅ」，Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄＲｅｓ．２０：６２５３−５９；Ｎｅｌｓｏ
ｎ，Ｐ．「Ｍｕｉｔｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄｐｏｒｅ
ｇｌａｓｓｒｅａｇｅｎｔｆｏｒｓｏｌｉｄｐｈａｓｅｏｌｉｇｏ
ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」、米国特許第５，１４１，８１３
号（１９９２年８月２５日発行））またはポリスチレン（Ａｎｄｒｕｓ，ｅｔａ
ｌ「Ａｕｔｏｍａｔｅｄｓｙｓｔｅｍｆｏｒｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄ
ｅｓｙｎｔｈｅｓｉｓａｎｄｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ」、米国特許第５
，０４７，５２４（１９９１年９月１０日発行）および米国特許第５，２６２，
５３０号（１９９３年１１月１６日発行））への結合、およびホスホルアミダイ
トヌクレオシド試薬を用いる伸長について酸に不安定な官能性を有するリンカー
に結合される。切断および脱保護の後、標識されたオリゴヌクレオチドは、３’
末端において本発明の色素を有し得る。

【００９３】（Ｖ．４Ａヌクレオチド標識）好ましいクラスの標識された基質は、本発明のフルオレセイン色素を用いて標
識されるヌクレオシドおよびヌクレオチドの結合体を含む。このような標識され
たヌクレオシドおよびヌクレオチドは、酵素合成（例えば、ＰＣＲ増幅の状況に
おいて使用される標識されたヌクレオチド５’−トリホスフェート、Ｓａｎｇｅ
ｒ型ポリヌクレオチド配列決定、およびｎｉｃｋ翻訳反応）によって形成される
ポリヌクレオチドを標識するために特に有用である。

【００９４】この色素は、糖または核酸塩基のいずれかに結合体化され得る。好ましい実施
形態において、この化合物は、末端リボヌクレオシド−５’−トリホスフェート
（「ターミネーター」）であり、ここで、この色素は、核酸塩基部分に共有結合
される。２’−デオキシリボヌクレオシド−５’−トリホスフェート（「ｄＮＴ
Ｐ」）またはリボヌクレオシド−５’−トリホスフェート（「ＮＴＰ」）、適切
なポリメラーゼ酵素および初回刺激をうけた標的ポリヌクレオチドとの結合にお
いて使用される場合、このようなターミネーターは、ＤＮＡ配列決定のような適
用のために標的媒介酵素合成を介して、一連の末端化電子欠乏窒素複素環置換フ
ルオレセイン色素を標識したポリヌクレオチドフラグメントを生成するために使
用され得る。ヌクレオシドおよびヌクレオチドは、糖または核酸塩基部分上の部
位で標識され得る。好ましい核酸塩基標識部位は、プリン核酸塩基の８−Ｃ、７
−デアザプリン核酸塩基の７−Ｃまたは８−Ｃ、およびピリミジン核酸塩基の５
位置を含む。ヌクレオシドまたはヌクレオチドと色素との間でリンカーは位置Ｒ ¹ 〜Ｒ⁷の任意の１つで色素に結合し得る。

【００９５】標識されたヌクレオシドまたはヌクレオチドは、酵素的に組み込み可能であり
かつ酵素的に伸長可能であり得る。本発明の色素で標識されたヌクレオシドまた
はヌクレオチドは、構造ＩＶ：

【００９６】

【化２９】を有し得、ここで、ＤＹＥは、色素Ｉ（エネルギー移動色素を含む）の保護形態
または脱保護形態である。Ｂは、核酸塩基（例えば、ウラシル、チミン、シトシ
ン、アデニン、７−デアザアデニン、グアニン、および８−デアザグアノシン）
である。Ｒ⁸は、Ｈ、モノホスフェート、ジホスフェート、トリホスフェート、
チオホスフェート、またはホスフェートアナログである。Ｒ⁹およびＲ¹⁰は、単
独の場合、各々の独立してＨ、ＨＯ、Ｆである。標識されたヌクレオシドまたは
ヌクレオチドが、ターミネーターである場合、Ｒ⁹およびＲ¹⁰は、ポリメラーゼ
媒介標的指向重合をブロックするように選択される。ターミネーターのヌクレオ
チドにおいて、Ｒ⁹およびＲ¹⁰は、単独の場合、各々独立してＨ、Ｆおよびポリ
メラーゼ媒介標的指向重合をブロックする部分であるか、または一緒になる場合
、２’−３’−ジデヒドロリボースを形成する。

【００９７】リンカーＬは、

【００９８】

【化３０】であり得、ここで、ｎは、０、１、または２である。

【００９９】（Ｖ．４Ｂオリゴヌクレオチド標識）別の好ましいクラスの標識された基質は、本発明のフルオレセイン色素で標識
されるオリゴヌクレオチドの結合体を含む。このような標識されたポリヌクレオ
チドまたはアナログは、多くの重要な状況において有用であり、ＤＮＡ配列決定
プライマーとして、ＰＣＲプライマー、オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーシ
ョンプローブ、オリゴヌクレオチド連結プローブ、二重標識された５’−エキソ
ヌクレアーゼ（ＴａｑＭａｎ^TM）プローブなどを含む（Ｆｕｎｇ，ｅｔａｌ．「
Ａｍｉｎｏ−ｄｅｒｉｖａｔｉｚｅｄｐｈｏｓｐｈｉｔｅａｎｄｐｈｏｓ
ｐｈａｔｅｌｉｎｋｉｎｇａｇｅｎｔｓ，ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ
ｓｐｒｅｃｕｒｓｏｒｓ，ａｎｄｕｓｅｆｕｌｃｏｎｊｕｇａｔｅｓｔ
ｈｅｒｅｏｆ」，米国特許第４，７５７，１４１号（１９９８年７月１２日発行
）；Ａｎｄｒｕｓ，Ａ．「Ｃｈｅｍｉｃａｌｍｅｔｈｏｄｓｆｏｒ５’ｎ
ｏｎ−ｉｓｏｔｏｐｉｃｌａｂｅｌｌｉｎｇｏｆＰＣＲｐｒｏｂｅｓ
ａｎｄｐｒｉｍｅｒｓ」（１９９５）ＰＣＲ２：ＡＰｒａｃｔｉｃａｌＡ
ｐｐｒｏａｃｈ，ＯｘｆｏｒｄＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＰｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏ
ｒｄ，３９〜５４頁；Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，（１９９６）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａ
ｔｅＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，ＳａｎＤｉｅ
ｇｏ，ＣＡ．４０〜５５頁、６４３〜７１頁）。標識されたオリゴヌクレオチド
は、構造Ｖ：

【０１００】

【化３１】を有し得、ここで、このオリゴヌクレオチドは、２〜１００個のヌクレオチドを
含む。ＤＹＥは、フルオレセイン色素Ｉであり、エネルギー移動色素を含む。Ｂ
は、核酸塩基（例えば、ウラシル、チミン、シトシン、アデニン、７−デアザア
デニン、グアニン、および８−デアザグアノシン）である。Ｌは、リンカーであ
る。Ｒ¹⁰は、Ｈ、ＯＨ、ハロゲン化物、アジド、アミン、アルキルアミン、アル
キル（Ｃ₁〜Ｃ₆）、アリル、アルコキシ（Ｃ₁〜Ｃ₆）、ＯＣＨ₃、またはＯＣＨ₂ ＣＨ＝ＣＨ₂である。Ｒ¹⁵は、Ｈ、ホスフェート、ヌクレオチド間ホスホジエス
テル、またはヌクレオチド間アナログである。Ｒ¹⁶は、Ｈ、ホスフェート、ヌク
レオチド間ホスホジエステルまたはヌクレオチド間アナログである。本実施形態
において、構造Ｖの核酸塩基標識オリゴヌクレオチドは、核酸塩基を通して結合
された本発明の複数の色素を有し得る。

【０１０１】核酸塩基標識オリゴヌクレオチドＶは、（ｉ）ＤＮＡポリメラーゼまたはリガ
ーゼによる酵素的に組み込み可能なヌクレオチド試薬ＩＶ（Ｒ⁸は、トリホスフ
ェートである）の酵素学的組み込み、および（ｉｉ）自動合成によるホスホルア
ミダイト色素ヌクレオシド試薬ＶＩのカップリング、によって形成され得る。

【０１０２】一般的に、標識されたヌクレオチドが、酵素的合成によって作製される場合、
以下の手順が使用され得る。標的ＤＮＡは、変性され、そしてオリゴヌクレオチ
ドプライマーは、標的ＤＮＡにアニールされる。初回刺激を受けた標的の連続し
た標的指向酵素的伸長を支持し得る、酵素的に組み込み可能なヌクレオチドまた
はヌクレオチドアナログの混合物（例えば、ｄＧＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、お
よびｄＴＴＰまたはｄＵＴＰを含む混合物）は、初回刺激を受けた標的に添加さ
れる。少なくともヌクレオチドのフラクションは、色素Ｉで標識されるか、また
は上記のように標識されたターミネーターである。次に、ポリメラーゼ酵素は、
ポリメラーゼ酵素が活性である条件下で混合物に添加される。標識されたオリゴ
ヌクレオチドは、ポリメラーゼ媒介鎖合成の間に標識されたヌクレオチドまたは
ターミネーターの組み込みによって形成される。

【０１０３】代替の酵素的合成方法において、２つのプライマー：標的配列の（＋）鎖に相
補的な１つのプライマーおよび標的配列の（−）鎖に相補的な別のプライマーは
、１つの代わりに使用され、ポリメラーゼは、熱安定性のポリメラーゼであり、
そして反応温度は、変性温度と伸長温度との間で循環され、それによってＰＣＲ
によって標的配列に対する標識された相補体を急激に増幅する（Ｉｎｎｉｓ，ｅ
ｔａｌ（１９９０）ＰＣＲＰｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ
Ｐｒｅｓｓ）。１つまたは両方のプライマーは、本発明の色素で標識され得る
。あるいは、１以上のヌクレオチドの５’−トリホスフェートは、本発明の色素
で標識され得る。各標識スキームは、本発明の１以上の色素を有するＤＮＡ増幅
産物を生じる。

【０１０４】本発明のフルオレセイン色素でのオリゴヌクレオチドの内部標識は、一般構造
ＶＩ：

【０１０５】

【化３２】のヌクレオシドホスホルアミダイト色素試薬で実施され得、ここで、ＤＹＥは、
色素Ｉの保護形態または非保護形態である。環外のアミンおよび核酸塩基Ｂの他
の官能性は、ヌクレオシドホスホルアミダイト色素試薬の合成の間および／また
は標識されたオリゴヌクレオチドを合成するためのその後の使用の間、保護を必
要とし得る。選択される特定の保護基は、核酸塩基または核酸塩基アナログの同
一性に依存し、そして当業者に明らかである。例えば、アデニンおよびシトシン
の環外アミンは、ベンゾイル（ｂｚ）で保護され得、そしてグアニンの環外アミ
ンは、従来の手順を用いてジメチルホルムアミド（ｄｍｆ）またはイソブチリル
（ｉｂｕ）で保護され得る。好ましくは、核酸塩基は、穏やかな塩基性条件下で
容易に取り除かれる基で保護される。例えば、ｄＡ^bz、ｄＣ^bz、ｄＧ^dmfおよび
Ｔホスホルアミダイトヌクレオシドを用いて合成されたオリゴヌクレオチド（な
らびにそれらの対応する３’ヌクレオシド固体支持体）は、６５℃にて濃縮され
た水酸化アンモニウム中で６０分にわたって切断および脱保護され得る（Ｂａｕ
ｃａｇｅ，Ｓ．およびＩｙｅｒ，Ｒ．（１９９２）「Ａｄｖａｎｃｅｓｉｎ
ｔｈｅｓｙｎｔｈｅｓｉｓｏｆｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓｂｙ
ｔｈｅｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅａｐｐｒｏａｃｈ」，Ｔｅｔｒａ
ｈｅｄｒｏｎ４８：２２２３−２３１１）。

【０１０６】別々にとられるＲ¹¹およびＲ¹²は、アルキル（Ｃ₁〜Ｃ₆）、アルケン、アリー
ル、およびシクロアルキル（１０個までの炭素原子を含む）、からなる群から選
択される（例えば、イソプロピル）か、または、窒素原子と一緒になってＲ¹¹お
よびＲ¹²が、飽和窒素複素環（例えば、モルホリノ）を形成する。Ｒ¹³は、亜リ
ン酸エステル保護基（例えば、メチル、２−シアノメチル、および２−（４−ニ
トロフェニル）エチル）である。Ｒ¹⁴は、酸切断可能ヒドロキシル保護基（例え
ば、ジメトキシトリチル）であり、これは、引き続くモノマーカップリングを可
能にする。

【０１０７】ＶＩのリンカーＬは、

【０１０８】

【化３３】（ここで、ｎは、２〜１０の範囲である）；

【０１０９】

【化３４】（ここで、ｎは、０、１または２である）；および

【０１１０】

【化３５】（ここで、ｎは、１〜１０の範囲である）であり得る。

【０１１１】試薬ＩＶおよびＶＩは、本発明Ｉの色素を用いて標識されるオリゴヌクレオチ
ドＶを調製する際に効果的である。標識されたオリゴヌクレオチドの別の実施形
態は、構造ＶＩＩ

【０１１２】

【化３６】に従って標識された５’末端であり、ここで、Ｘは、Ｏ、ＮＨ、またはＳであり
、Ｌは、アルキルジイル（Ｃ₁〜Ｃ₁₂）または易動度改変因子であり、そして標
識されたオリゴヌクレオチドは、１つのＤＹＥのみを保有する。易動度改変因子
リンカーは、オリゴヌクレオチドの電気泳動易動度または疎水的性質に影響する
。易動度改変因子リンカーの例としては、エチレンオキシユニット、−（ＣＨ₂
ＣＨ₂Ｏ）_n−が挙げられ、ここで、ｎは、１〜１００であり得る（Ｇｒｏｓｓｍ
ａｎら、「ＭｅｔｈｏｄｏｆＤＮＡｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇｅｍｐｌｏｙ
ｉｎｇａｍｉｘｅｄＤＮＡ−ｐｏｌｙｍｅｒｃｈａｉｎｐｒｏｂｅ」
、米国特許第５，６２４，８００号、１９９７年４月２９日発行）。好ましくは
、ｎは、２〜２０である。標識されたオリゴヌクレオチドＶＩＩは、ホスホラミ
ダイト試薬ＩＩＩ（特に例えばＩｄ）を用いて自動化合成によって形成され得る
。あるいは、標識されたオリゴヌクレオチドＶＩＩは、本発明の色素の反応性連
結基形態（例えば、Ｉｂ）を、５’−アミノアルキルオリゴヌクレオチドと反応
させることによって形成され得る。

【０１１３】１つの好ましい合成後化学標識方法において、オリゴヌクレオチドは、以下の
ように標識される。構造Ｉｂに従う色素は、ＤＭＳＯ中に溶解されるかまたは懸
濁され、約ｐＨ９の０．２５Ｍ重炭酸塩／炭酸塩緩衝液中の５’−アミノヘキシ
ルオリゴヌクレオチドに、過剰（１０〜２０倍）で加えられ、６時間反応させら
れる（例えば、米国特許第４，７５７，１４１号）。色素標識オリゴヌクレオチ
ドＶＩＩは、緩衝液（例えば、０．１モル濃度のトリエチルアミンアセテート（
ＴＥＡＡ））を用いて溶出するサイズ排除クロマトグラフィーカラムを通過させ
ることによって未反応の色素から分離され得る。粗製の標識オリゴヌクレオチド
ＶＩＩを含む画分（ここで、Ｌは、−（ＣＨ₂）₆−である）は、勾配溶出を使用
する逆相ＨＰＬＣによってさらに精製される。

【０１１４】（Ｖ．５キット）本発明は、本発明の電子欠乏性窒素複素環置換蛍光色素および／またはそれら
の標識された結合体を含むキットを包含する。１つの実施形態において、キット
は、本発明の色素を他の分子（すなわち基質）に結合するのに有用である。この
ようなキットは、一般的に最適な連結部分を含む本発明の色素および別の分子ま
たは基質に対して色素を結合するのに適切な試薬、酵素、緩衝液、溶媒などを含
む。

【０１１５】１つの実施形態において、キットは、酵素的に合成されたオリゴヌクレオチド
およびポリヌクレオチドを、本発明の色素を用いて標識するのに有用である。こ
のようなキットは、一般的に、連続プライマー伸長およびポリメラーゼ酵素を支
持し得る、本発明に従う標識された酵素的に組み込み可能なヌクレオチドまたは
ヌクレオチドアナログ、酵素的に組込み可能なヌクレオチドまたはヌクレオチド
アナログの混合物を含む。好ましくは、標識された酵素的に組込み可能なヌクレ
オチドまたはヌクレオチドアナログは、構造ＩＶに記載の化合物、最も好ましく
は、標識されたターミネーターである。好ましいポリメラーゼは、ＡＭＰＬＩＴ
ＡＱ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼＦＡ（ＰＥＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏ
ｓｔｅｒＣｉｔｙ、ＣＡ）のように、熱安定である。

【０１１６】別の実施形態において、キットは、本発明のホスホラミダイト試薬を用いて合
成オリゴヌクレオチドを標識するのに有用である。このようなキットは、一般的
に、オリゴヌクレオチド合成を行うために任意にホスホラミダイト色素試薬、他
の合成試薬、および／または支持体を含む（Ａｎｄｒｕｓら、「Ａｕｔｏｍａｔ
ｅｄｓｙｓｔｅｍｆｏｒｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓｙｎｔｈｅｓ
ｉｓａｎｄｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ」米国特許第５，２６２，５３０号、
１９９３年１１月１６日発行）。

【０１１７】（Ｖ．６標識された試薬を用いる方法）本発明の色素および試薬は、蛍光検出を利用する任意の方法、特に、複数の空
間的に重なる分析物の同時検出を必要とする方法によく適する（Ｍｅｎｃｈｅｎ
ら、「４，７−ｄｉｃｈｌｏｒｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎｄｙｅｓａｓｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒｐｒｏｂｅｓ」、米国特許第５，１８８，９３４号、１９９
３年２月２３日発行）。本発明の色素および試薬は、生化学分離手順（例えば、
電気泳動）に供されるポリヌクレオチドのクラス、または空間的にアドレス可能
なハイブリダイゼーションアレイにおける位置の中に分布しているポリヌクレオ
チドのクラスを同定するために特によく適する。

【０１１８】これらの用途には、５’標識配列決定プライマー、５’標識ポリメラーゼ連鎖
反応（ＰＣＲ）プライマー、ハイブリダイゼーションプローブ、およびライゲー
ションアッセイプローブのような標識オリゴヌクレオチドの使用が挙げられる。
ＰＣＲ用途には、可変数（ｖａｒｉａｂｌｅｎｕｍｂｅｒ）タンデムリピート
（ＶＮＴＲ）、ショートタンデムリピート（ＳＴＲ）および特定の配列の隣接複
数コピーを含む二重鎖ＤＮＡの反復領域の増幅のマイクロサテライト方法による
遺伝型決定のための標識されたオリゴヌクレオチドの使用が挙げられ、繰り返し
ユニットの数が可変である。好ましくは、このようなＰＣＲ遺伝型決定方法にお
いて、ＰＣＲプライマーは、本発明の色素を用いて標識される。

【０１１９】特に好ましい実施形態において、本発明のフルオレセイン色素は、ＰＣＲの間
の増幅産物のリアルタイムまたは終点測定を提供する定量的方法および試薬にお
いて使用され得る（Ｇｅｌｆａｎｄら、「Ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓａｓｓａｙ
ｓｙｓｔｅｍｕｓｉｎｇｔｈｅｎｕｃｌｅａｓｅａｃｔｉｖｉｔｙ
ｏｆａｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ」、米国特許第５
，２１０，０１５号、１９９３年５月９日発行）；Ｌｉｖａｋら、「Ｍｅｔｈｏ
ｄｆｏｒＤｅｔｅｃｔｉｎｇＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＡｍｐｌｉｆｉ
ｃａｔｉｏｎＵｓｉｎｇＳｅｌｆ−ＱｕｅｎｃｈｉｎｇＦｌｕｏｒｅｓｃ
ｅｎｃｅＰｒｏｂｅ」、米国特許第５，５３８，８４８号、１９９６年７月２
３日発行）。蛍光色素−クエンチャープローブを使用するエキソヌクレアーゼア
ッセイ（Ｔａｑｍａｎ（登録商標））（Ｌｉｖａｋら、「Ｓｅｌｆ−ｑｕｅｎｃ
ｈｉｎｇｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｐｒｏｂｅ」、米国特許第５，７２３，
５９１号、１９９８年３月３日発行；Ｍｕｌｌａｈら、（１９９８）「Ｅｆｆｉ
ｃｉｅｎｔｓｙｓｔｈｅｓｉｓｏｆｄｏｕｂｌｅｄｙｅ−ｌａｂｅｌｌ
ｅｄｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｐｒｏｂｅｓａ
ｎｄｔｈｅｉｒａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｉｎａｒｅａｌｔｉｍｅ
ＰＣＲａｓｓａｙ」、Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．２６：１０２６〜１０
３１）は、閉鎖チューブシステムにおけるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）生成
物の直接検出を与え、これには、ＰＣＲを行うために必要とされるサンプルプロ
セシングを超えるサンプルプロセシングはない。Ｔａｑｍａｎアッセイにおいて
、プライマー伸長を行いそしてポリヌクレオチドを増幅するポリメラーゼはまた
、５’〜３’エキソヌクレアーゼ活性によって標的配列にアニールされるプロー
ブを置換および切断する。Ｔａｑｍａｎ型アッセイにおいて、プローブは、自己
クエンチし、蛍光色素およびクエンチャー部分（これらのいずれもが本発明の色
素であり得る）を用いて標識される。スペクトルの重なりは、プローブがインタ
クトである場合、効率的なエネルギー移動（ＦＲＥＴ）を可能にする（Ｃｌｅｇ
ｇ，Ｒ（１９９２）「Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｒｅｓｏｎａｎｃｅｅｎｅ
ｒｇｙｔｒａｎｓｆｅｒａｎｄｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄｓ」、Ｍｅｔｈ
．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１１：３５３〜３８８）。標的配列にハイブリダイズされ
る場合、プローブは、ＰＣＲの間に、標的−プローブハイブリッドの存在する量
に比例した蛍光シグナルを放出するために切断される（Ｌｉｖａｋら、「Ｍｅｔ
ｈｏｄｆｏｒＤｅｔｅｃｔｉｎｇＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＡｍｐｌｉ
ｆｉｃａｔｉｏｎＵｓｉｎｇＳｅｌｆ−ＱｕｅｎｃｈｉｎｇＦｌｕｏｒｅ
ｓｃｅｎｃｅＰｒｏｂｅ」、米国特許第５，５３８，８４８号、１９９６年７
月２３日発行；Ｌｉｖａｋら、「Ｓｅｌｆ−ｑｕｅｎｃｈｉｎｇｆｌｕｏｒｅ
ｓｃｅｎｃｅｐｒｏｂｅ」、米国特許第５，７２３，５９１号、１９９８年３
月３日発行）。

【０１２０】なお別の局面において、本発明は、標的ポリヌクレオチドを配列決定するため
に、本発明の電子欠乏性窒素複素環置換フルオレセイン色素を使用する方法を提
供する。この方法は、一般的に、本発明の色素を用いて標識された一連の異なる
サイズのポリヌクレオチドを形成する工程、サイズに基づいて一連の異なるサイ
ズの標識されたポリヌクレオチドを分離する工程、および色素の蛍光に基づいて
分離された標識されたポリヌクレオチドを検出する工程を包含する。

【０１２１】一連の異なるサイズの標識されたポリヌクレオチドは、周知の方法（Ｓａｎｇ
ｅｒら、（１９７７）「ＤＮＡｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇｗｉｔｈｃｈａｉｎ
−ｔｅｍｉｎａｔｉｎｇｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ」、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７４：５４６３〜５４６７；Ｈｕｎｋａｐｉｌｌｅｒら
、「Ｒｅａｌｔｉｍｅｓｃａｎｎｉｎｉｇｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉ
ｓａｐｐａｒａｔａｔｕｓｆｏｒＤＮＡｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ」米国特
許第４，８１１，２１８号、１９８９年３月７日発行；ＰＥＣｏｒｐ．、Ｊａ
ｎｕａｒｙ１９９５、ＡＢＩＰＲＩＳＭ^TM ３７７ＤＮＡＳｅｑｕｅｎ
ｃｅｒＵｓｅｒ’ｓＭａｎｕａｌ、Ｒｅｖ．Ａ、Ｃｈａｐｔｅｒ２（Ｐ／
Ｎ９０３４３３、ＰＥＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙ、
ＣＡ）に従って、プライムされた標的配列を酵素的に伸長することによって、便
利に生成され得る。例えば、一連の標識されたポリヌクレオチドは、標識された
プライマーを使用し、そしてポリメラーゼ、ｄＮＴＰ、および少なくとも１つの
ターミネーター（例えば、２’，３’−ジデオキシリボヌクレオシド−５’−ト
リホスフェート）の存在下において標識された標的を用いてプライムされた標的
配列を酵素的に伸長して得られ得る。あるいは、一連の標識されたポリヌクレオ
チドは、ポリメラーゼ、ｄＮＴＰ、および少なくとも１つの標識されたターミネ
ーターの存在下で標識されていないプライムされた標的を酵素的に伸長すること
によって得られ得る（Ｂｅｒｇｏｔら、「Ｓｐｅｃｔｒａｌｌｙｒｅｓｏｌｖ
ａｂｌｅｒｈｏｄａｍｉｎｅｄｙｅｓｆｏｒｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄ
ｓｅｑｕｅｎｃｅｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ」、米国特許第５，３６６，
８６０号、１９９４年１１月２２日発行）。いずれの実施形態においても、この
ポリメラーゼは、ターミネーターが組み込まれる（これは、伸長反応を終了させ
る）までｄＮＴＰを用いてプライマーを伸長するのに役立つ。いったん終結する
と、一連の標識されたポリヌクレオチドは、サイズに基づいて分離され、そして
分離されたポリヌクレオチドが色素標識の蛍光に基づいて検出される。

【０１２２】この方法の特に有利な実施形態において、４つの異なる蛍光的に標識されたタ
ーミネーターが使用され、ここで、それぞれのヌクレオシドが異なるスペクトル
的に分解され得るフルオロホアを用いて標識され、そして少なくとも１つのフル
オロホアが本発明に従う電子欠乏性窒素複素環置換フルオレセイン色素であり、
その結果、フルオロホアのセットが「易動度一致」される。この実施形態に従っ
て、プライムされた標的配列が、ポリメラーゼ、ｄＮＴＰおよび４つの異なる蛍
光的に標識されたターミネーターの存在下で酵素的に伸長される。サイズに基づ
いた分離に続いて、一連の分離され標識されたポリヌクレオチドが得られ、ここ
で、蛍光色素の発光性質は、３’−末端ヌクレオチドの同一性を明らかにする。
特に好ましい実施形態において、易動度一致されたセットの蛍光色素のすべてが
、単一光源を使用して励起され得る。

【０１２３】本明細書中において、「フラグメント分析」または「遺伝子分析」方法として
呼ばれる方法の好ましいカテゴリーにおいて、標識されるポリヌクレオチド配列
、または「フラグメント」は、例えば、ライゲーションまたはポリメラーゼ指向
プライマー伸長によって、標識されたプライマーまたはヌクレオチドを使用して
標的指向酵素合成によって生成され；フラグメントが、サイズ依存分離プロセス
（例えば、電気泳動またはクロマトグラフィー）に供され；そして分離されたフ
ラグメントは、例えば、レーザー誘導蛍光によって分離に続いて検出される（Ｈ
ｕｎｋａｐｉｌｌｅｒら、「Ｒｅａｌｔｉｍｅｓｃａｎｎｉｎｇｅｌｅｃ
ｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓａｐｐａｒａｔｕｓｆｏｒＤＮＡｓｅｑｕｅｎ
ｃｉｎｇ」、米国特許第４，８１１，２１８号、１９８９年３月７日発行）。特
に好ましい実施形態において、複数のクラスのポリヌクレオチドが、同時に分離
され、異なるクラスがスペクトル分解され得る標識によって区別される。

【０１２４】特に好ましいフラグメント分析方法において、本発明の色素を用いて標識され
るフラグメントが、相対的サイズによって同定される。フラグメントサイズと配
列との間の対応は、４つの可能な終結塩基（「ターミネーター」）およびスペク
トル的に分解され得る色素のセットのメンバーの組み込みによって確立される。
このようなセットは、市販の分光光度計を用いて発光および吸収バンド幅を測定
することによって本発明の色素から容易に組み立てられる。好ましくは、ＤＮＡ
配列決定（すなわち、ジデオキシＤＮＡ配列決定またはＳａｎｇｅｒ型配列決定
）の連鎖終結方法およびフラグメント分析が使用される。ターミネーターのそれ
ぞれが異なる蛍光色素を有し、そして集合的に実験のターミネーターが、本発明
の色素から１つ以上を含む色素のセットを有する。

【０１２５】本発明のスペクトル的に分解可能な蛍光色素はまた、標的のＰＣＲ増幅の後に
、遺伝子型決定実験に有用である。詳細には、それぞれ異なる色素で５’末端で
標識されるプライマーのオリゴヌクレオチドのセットが、複数の座を増幅し得、
そして単一ヌクレオチド多形成（ＳＮＰ）を識別する。サイズ基準での、色素標
識増幅生成物の電気泳動分離は、プライマー配列のセットに依存する特定の遺伝
型を示すプロフィールまたは特徴的データセットを確立する。

【０１２６】リガーゼ酵素によるポリヌクレオチドプローブの共有結合は、分子生物学者に
利用可能な最も有用なツールの１つである。２つのプローブが標的配列にアニー
ルされ、ここで、２つのプローブが、隣接しそして介在するギャップなしである
場合、ホスホジエステル結合が１つのプローブの５’末端と他のプローブの３’
末端との間に、リガーゼ酵素によって形成され得る（Ｗｈｉｔｅｌｅｙら、「Ｄ
ｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｓｐｅｃｉｆｉｃｓｅｑｕｅｎｃｅｓｉｎｎｕ
ｃｌｅｉｃａｃｉｄｓ」、米国特許第４，８８３，７５０号、１９８９年発行
；Ｌａｎｄｅｇｒｅｎら、（１９８８）「Ａｌｉｇａｓｅｍｅｄｉａｔｅｄ
ｇｅｎｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｔｅｃｈｎｉｑｕｅ」、Ｓｃｉｅｎｃｅ２４
１：１０７７〜８０；Ｎｉｃｋｅｒｓｏｎら（１９９０）「Ａｕｔｏｍａｔｅｄ
ＤＮＡｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓｕｓｉｎｇａｎＥＬＩＳＡ−ｂａｓｅ
ｄｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅａｓｓａｙ」Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ｉｄ．ＳｃｉＵＳＡ８７：８９２３〜２７）。オリゴヌクレオチドライゲーシ
ョンアッセイは、標的サンプル中の特定の配列の存在を検出する。１つまたは両
方のプローブが、本発明の色素を用いて標識される場合、ライゲーション産物は
、蛍光によって検出され得る（Ｇｒｏｓｓｍａｎら、（１９９４）「Ｈｉｇｈ−
ｄｅｎｓｉｔｙｍｕｌｔｉｐｌｅｘｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｎｕｃｌｅ
ｉｃａｃｉｄｓｅｑｕｅｎｃｅｓ：ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｌｉ
ｇａｔｉｏｎａｓｓａｙａｎｄｓｅｑｅｎｃｅ−ｃｏｄｅｄｓｅｐａｒ
ａｔｉｏｎ」、Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．２２：４５２７〜３４）。

【０１２７】Ｓａｎｇｅｒ型配列決定は、配列が決定されるべき一本鎖ＤＮＡ標的または二
本鎖ＤＮＡ標的を使用して、インビトロでのＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ鎖
の合成を含む。合成は、オリゴヌクレオチドプライマーが標的にアニールする場
所に基づいて規定された部位において開始される。合成反応は、継続したＤＮＡ
伸長を支持しないヌクレオチドアナログの組み込みによって終結される。例示的
な連鎖終結ヌクレオチドアナログには、３’〜５’ＤＮＡ連鎖伸長に必要な３’
−ＯＨ基を欠く２’，３’−ジデオキシヌクレオシド５’トリホスフェート（
ｄｄＮＴＰ）を含む。適切な比率のｄＮＴＰ（２’−デオキシヌクレオシド５
’−トリホスフェート）および４つのｄｄＮＴＰの１つが使用される場合、酵素
触媒重合が、ｄｄＮＴＰが組み込まれる各部位において連鎖の集団の画分におい
て終結される。蛍光色素標識プライマーまたは標識ｄｄＮＴＰが各反応に使用さ
れる場合、配列情報が高分解能電気泳動による分離の後に蛍光によって検出され
得る。連鎖終結方法において、本発明の色素が、配列決定プライマーまたはジデ
オキシヌクレオチドのいずれかに接続し得る。色素は、プライマーの核酸塩基上
の、プライマーの５’末端上の相補的な官能性に連結され得る（Ｆｕｎｇら、「
Ａｍｉｎｏ−ｄｅｒｉｖａｔｉｚｅｄｐｈｏｓｐｈｉｔｅａｎｄｐｈｏｓ
ｐｈａｔｅｌｉｎｋｉｎｇａｇｅｎｔｓ、ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ
ｐｒｅｃｕｒｓｏｒｓ、ａｎｄｕｓｅｆｕｌｃｏｎｊｇｕａｔｅｓｔｈ
ｅｒｅｏｆ」、米国特許第４，７５７，１４１号、１９８８年７月１２日発行）
か；あるいは、例えば、アルキニルアミノ連結基を介してジデオキシヌクレオチ
ドの核酸塩基上に連結され得る（Ｋｈａｎら、「Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄｐｒ
ｏｐａｒｇｙｌｅｔｈｏｘｙａｍｉｄｏｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ、ｏｌｉｇｏ
ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅａｎｄｍｅｔｈｏｄｓｆｏｒｕｓｉｎｇｓａｍ
ｅ」米国特許第５，７７０，７１６号、１９９８年６月２３日発行、および米国
特許第５，８２１，３５６号、１９９８年１０月１３日発行；Ｈｏｂｂｓ，Ｆお
よびＴｒａｉｎｏｒ，Ｇ．「Ａｌｋｙｎｙｌａｍｉｎｏ−ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ
」、米国特許第５，１５１，５０７号、１９９２年９月２９日発行）。

【０１２８】代表的な配列決定試験は、図１６に示され、ここで、３’−フルオロターミネ
ーターは、色素化合物１３を用いて、プロパルギルエトキシアミドリンカー（Ｅ
Ｏ）：３’ＦｄｄＧＴＰ−ＥＯ−１３を介して標識される：

【０１２９】

【化３７】上記フラグメント分析方法において、標識されたポリヌクレオチドは、クロマ
トグラフィー、アフィニティー、または電気泳動手順によって分離される。好ま
しくは、この分離は、電気泳動である（ＲｉｃｋｗｏｏｄおよびＨａｍｅｓ編、
ＧｅｌＥｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓｏｆＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ
：ＡＰｒａｃｔｉｃａｌＡｐｐｒｏａｃｈ、ＩＲＬＰｒｅｓｓＬｉｍｉ
ｔｅｄ、Ｌｏｎｄｏｎ、１９８１）。好ましいタイプの電気泳動マトリクスは、
架橋ポリアクリルアミドまたは非架橋ポリアクリルアミド、あるいは他のアミド
含有ポリマーであり、これは、約２〜２０重量パーセントの濃度（体積に対する
重量）を有する（Ｍａｄａｂｈｕｓｈｉら、「Ｐｏｌｙｍｅｒｓｆｏｒｓｅ
ｐａｒａｔｉｏｎｏｆｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓｂｙｃａｐｉｌｌａｒ
ｙｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｅｓｉｓ」米国特許第５，５５２，０２８号、１９９
６年９月３日発行）。電気泳動マトリクスは、スラブ（ｓｌａｂ）ゲルまたはキ
ャピラリー形式で構成され得る（Ｍａｔｈｉｅｓら、「Ｃａｐｉｌｌａｒｙａ
ｒｒａｙｃｏｎｆｏｃａｌｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｓｃａｎｎｅｒａ
ｎｄｍｅｔｈｏｄ」、米国特許第５，２７４，２４０号、１９９３年１２月２
８日発行）。より好ましくは、ポリアクリルアミドの濃度は、約４〜８％の間で
ある。好ましくは、特にＤＮＡ配列決定において、電気泳動マトリクスは、変性
剤（例えば、尿素、ホルムアミドなど）を含む（Ｍａｎｉａｔｉｓら、Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ、Ｃｏ
ｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ、ＮｅｗＹｏｒｋ
、１７９〜１８５頁（１９８２）；ＰＥＣｏｒｐ．、ＡＢＩＰＲＩＳＭ^TM
３７７ＤＮＡＳｅｑｕｅｎｃｅｒＵｓｅｒ’ｓＭａｎｕａｌ、Ｒｅｖ．Ａ
，Ｃｈａｐｔｅｒ２（Ｐ／Ｎ９０３４３３、ＰＥＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ
、ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙ、ＣＡ）Ｊａｎｕａｒｙ１９９５）。最適電気泳動
条件（例えば、特定の分離に使用される、ポリマー、ポリマー濃度、ｐＨ、温度
、変性剤の濃度）は、分離されるべきポリヌクレオチドのサイズ範囲、それらの
塩基組成（それらは一本鎖または二本鎖であるか否かにかかわらない）、および
情報が電気泳動によって探索される分類の性質を含む多くの因子に依存する（Ｇ
ｒｏｓｓｍａｎ，Ｐ．「ＨｉｇｈｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎＤＮＡｓｅｑｕｅ
ｎｃｉｎｇｍｅｔｈｏｄｕｓｉｎｇｌｏｗｖｉｓｃｏｓｉｔｙｍｅｄ
ｉｕｍ」、米国特許第５，３７４，５２７号、１９９４年１２月２０日発行）。
従って、本発明の用途は、特定の分離のために条件を最適化するために標準的な
予備的試験を必要とし得る。

【０１３０】本発明の色素を用いて標識されるポリヌクレオチドはまた、電気泳動易動の割
合を影響する部分（すなわち、易動度改変標識）を用いて標識され得る。易動度
改変標識には、エチレンオキシ単位、−（ＣＨ₂ＣＨ₂Ｏ）_n−のポリマー（ここ
で、ｎは、１〜１００であり得る）が挙げられる（Ｇｒｏｓｓｍａｎｎら、「Ｍ
ｅｔｈｏｄｏｆＤＮＡｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇｅｍｐｌｏｙｉｎｇａ
ｍｉｘｅｄＤＮＡ−ｐｏｌｙｍｅｒｃｈａｉｎｐｒｏｂｅ」、米国特許第
５，６２４，８００号、１９９７年４月２９日発行）。好ましくは、ｎは、２〜
２０である。具体的には、フルオレセイン色素標識ポリヌクレオチドを、別個の
既知のサイズのポリエチレンオキシのさらなる標識を用いて標識することによっ
て、ポリヌクレオチドにおけるヌクレオチドの数に独立して、電気泳動および検
出による別次元の分離を可能にする。すなわち、同じ長さのポリヌクレオチドが
、スペクトル的に分解可能な色素標識および易動度改変標識に基づいて識別され
得る。色素標識と易動度改変標識の両方を有するポリヌクレオチドは、単一標識
ポリヌクレオチドまたはヌクレオチド組成のライゲーションまたはポリメラーゼ
伸長によって酵素的に形成され得る。あるいは、合成オリゴヌクレオチドは、本
発明の色素の標識および易動度改変因子を有し得、これらは、自動化合成の間に
（例えば、ホスホラミダイト試薬）、またはアミノ−またはチオール−オリゴヌ
クレオチドに合成後カップリング（例えば、ＮＨＳ標識カップリング）によって
組み込まれる。

【０１３１】電気泳動分離に続いて、色素ポリヌクレオチド結合体は、色素標識ポリヌクレ
オチドからの蛍光発光を測定することによって検出される。このような検出を実
施するために、標識ポリヌクレオチドは、標準的手段（例えば、高強度水銀蒸気
ランプ、レーザーなど）によって照射される。好ましくは、照射手段は、約４５
０ｎｍより上の波長での照射ビームを有するレーザーである。より好ましくは、
色素−ポリヌクレオチドは、アルゴンイオンまたはＨｅ−Ｎｅガスレーザーある
いは固体状態ダイオードレーザーによって生成されるレーザー光によって照射さ
れる。次いで、蛍光は、光感受性検出器（例えば、光電子増倍管、電荷結合デバ
イスなど）によって検出される。例示的な電気泳動検出システムは、別に記載さ
れる（Ｈｏｆｆら、「Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅｓｃａｎｎｉｎｇｆｌｕｏｒｅｓ
ｃｅｎｃｅｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓａｐｐａｒａｔｕｓｆｏｒ
ｔｈｅａｎａｌｙｓｉｓｏｆｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｆｒａｇｍ
ｅｎｔｓ」、米国特許第５，５４３，０２６号、１９９６年８月６日発行；Ｍａ
ｔｈｉｅｓら、「Ｃａｐｉｌｌａｒｙａｒｒａｙｃｏｎｆｏｃａｌｆｌｕ
ｏｒｅｓｃｅｎｃｅｓｃａｎｎｅｒａｎｄｍｅｔｈｏｄ」、米国特許第５
，２７４，２４０号、１９９３年１２月２８日発行；Ｈｕｎｋａｐｉｌｌｅｒら
、「Ｒｅａｌｔｉｍｅｓｃａｎｎｉｎｇｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ
ａｐｐａｒａｔｕｓｆｏｒＤＮＡｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ」、米国特許第
４，８１１，２１８号、１９８９年３月７日発行）。

【０１３２】（ＶＩ．７実施例）本発明は、以下の実施例によってさらに実施され得る。これは、本発明の純粋
な例示であり、いずれの方法においても本発明の範囲を限定しないことを意図す
る。

【０１３３】（実施例１）（１，３−ジメトキシ−２−（トール−２−イル）−ベンゼン１の合成）１，３−ジメトキシフェン−２−イルボロン酸：

【０１３４】

【化３８】（１０ｇ、５４．９５ｍｍｏｌ、ＦｒｏｎｔｉｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉ
ｎｃ．）、２−ブロモトルエン（１８．８１ｇ、１１０ｍｍｏｌ）、グリム（ｇ
ｌｙｍｅ）（２００ｍｌ）、およびテトラキス（トリフェニルホスフィン）パラ
ジウム（Ｐｈ₃Ｐ）₄Ｐｄ⁰（４ｇ、３．４６ｍｍｏｌ）を、１５分間攪拌し、次
いで、８ｇの炭酸カリウム（３５ｍｌ、水（ｒｅｆ）中）を添加した。６時間還
流後、この反応混合物を、水と酢酸エチルの１：１混合物８００ｍｌ中に注いだ
。有機層を水（３００ｍｌ×２）、およびブライン（２００×１）によって洗浄
し、溶媒を除去し、そして粗生成物を、シリカゲルクロマトグラフィー（ヘキサ
ン、酢酸エチル０％〜１０％）によって精製し、１を１０．５ｇ（８４％）で得
た（図１）。

【０１３５】（実施例２）（１，３−ジメトキシ−２−（トール−２−イル）−４−ブロモベンゼン２の
合成）１，３−ジメトキシ−２−（トール−２−イル）−ベンゼン１（１０ｇ、４３
．８６ｍｍｏｌ）、Ｎ−ブロモスクシンイミド（８．２６ｇ、４６．４ｍｍｏｌ
）、および過塩素酸（７０％、０．５ｍｌ）を、ジクロロメタン（２００ｍｌ）
中で混合し、そして室温で４時間攪拌させた。この反応混合物を、重炭酸ナトリ
ウム溶液（５％、１００ｍｌ）でクエンチし、ジクロロメタン層を、水（１００
ｍｌ）、ブライン（１００ｍｌ）で洗浄し、そしてこの溶媒を除去した。この粗
生成物を、ヘキサンおよび酢酸エチル（０％〜１０％の酢酸エチル）で溶出する
シリカゲルクロマトグラフィーによって精製し、２を１０．８ｇ（８０％）で得
た。

【０１３６】（実施例３）（１，３−ジメトキシ−２−（トール−２−イル）−４−（ピリド−３−イル
）−ベンゼン３の合成）ピリジン−３−ボロン酸（５．８１ｇ、４７．２７ｍｍｏｌ、Ｆｒｏｎｔｉｅ
ｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．）、１，３−ジメトキシ−２−（トール−
２−イル）−４−ブロモベンゼン（２）（１０．７ｇ、３４．８ｍｍｏｌ）、グ
リム（２００ｍｌ）、およびテトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム
（Ｐｈ₃Ｐ）₄Ｐｄ⁰（４ｇ、３．４６ｍｍｏｌ）を、１５分間攪拌し、次いで、
炭酸カリウム（１６ｇ、７０ｍｌの水中）を添加した。１０時間還流後、この反
応混合物を、水と酢酸エチルの１：１混合物８００ｍｌ中に注いだ。有機層を水
（３００ｍｌ×２）、およびブライン（２００ｍｌ）によって洗浄し、溶媒を除
去し、そして粗生成物を、ヘキサンおよび酢酸エチル（１０％〜２５％の酢酸エ
チル）で溶出するシリカゲルクロマトグラフィーによって精製し、３を８．８ｇ
（８３％）で得た。

【０１３７】（実施例４）（２−（トール−２−イル）−４−（ピリド−３−イル）−１，３−ジヒドロ
キシベンゼン４の合成）１，３−ジメトキシ−２−（トール−２−イル）−４−（ピリド−３−イル）
−ベンゼン３（３．５ｇ、１１．４６ｍｍｏｌ）、酢酸（３０ｍｌ）、および臭
化水素酸（４８％）（１５ｍｌ）を、２４時間還流した。この反応混合物を冷却
後、この試薬のほとんどを減圧下で除去し、この残留の酸を、重炭酸ナトリウム
溶液（５％）（１００ｍｌ）とこの濃縮物を混合することによって除去した。こ
の生成物を、酢酸エチル（１００ｍｌ）で抽出し、水（１００ｍｌ×２）および
ブライン（１００ｍｌ）で洗浄し、そしてこの酢酸エチルをエバポレートした。
この粗生成物を、ジクロロメタンおよびアセトン（０％〜１０％のアセトン）で
溶出するシリカゲルクロマトグラフィーによって精製し、４を２．８ｇ（９０％
）で得た。

【０１３８】（実施例５）（ケトン５の合成）（２−（トール−２−イル）−４−（ピリド−３−イル）−１，３−ジヒドロ
キシベンゼン４（６３０ｍｇ、２．２５ｍｍｏｌ）、２，５−ジクロロトリメリ
ト酸無水物：

【０１３９】

【化３９】（Ｍｅｎｃｈｅｎら、Ｓ．”４，７−ｄｉｃｈｌｏｒｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ
ｄｙｅｓａｓｍｏｌｅｃｕｌａｒｐｒｏｂｅｓ”、米国特許第５，８８
５，７７８号、１９９９年３月２３日発行）（５９０ｍｇ、２．２５ｍｍｏｌ）
、ニトロベンゼン（２０ｍｌ）、および塩化アルミニウム（ニトロベンゼン中）
（１２ｍｌ、１Ｍ）を、室温で２４時間攪拌した。この反応混合物を、氷水（５
０ｍｌ）、酢酸エチル（１００ｍｌ）、およびｎ−ブタノール（２０ｍｌ）の混
合物中に注ぎ、次いで、１０％のＨＣｌ（５０ｍｌ）を添加して、このアルミニ
ウム塩を溶解させた。有機層を、水（５０ｍｌ×２）およびブライン（５０ｍｌ
）で洗浄し、そしてこの溶媒をエバポレートして、異性体５ａおよび５ｂの混合
物として生成物を得た。ジクロロメタン中のメタノール（１０％〜３０％のメタ
ノール）、および酢酸（１％）を用いるシリカゲルカラムクロマトグラフィーに
よる分離によって、所望の遅く移動する異性体５ｂ（３８０ｍｇ、３１％）を得
た。これは、図１に示される構造を有すると考えられる。

【０１４０】（実施例６）（１，３−ジメトキシナフタレン６）１，３−ジヒドロキシナフタレン（１５ｇ、９３．６ｍｍｏｌ）および炭酸カ
リウム（２０ｇ、１４４．７ｍｍｏｌ）（アセトン（２００ｍｌ）中）に、ジメ
チルスルフェート（２１ｍｌ、２２２ｍｍｏｌ）を添加した。一晩攪拌後、この
反応混合物を、１０％の水酸化ナトリウム（１００ｍｌ）と混合し、酢酸エチル
（２００ｍｌ×２）で抽出した。有機層を、水（１００ｍｌ×２）で洗浄し、エ
バポレートし、そして任意の未反応ジメチルスルフェートをクエンチするために
、この残渣を、水酸化アンモニウム（５０ｍｌ）で２時間攪拌させた。生成物を
、酢酸エチル（２００ｍｌ）で抽出し、そして水（１００ｍｌ×２）およびブラ
イン（１００ｍｌ）で洗浄した。この溶媒をエバポレートして、６を１５ｇ（８
５％）で得た。

【０１４１】（実施例７）（Ｂｉｓ−（１，３−ジメトキシナフト−２−イル）−ジメチルスズ７）１，３−ジメトキシナフタレン（６）（７．１ｇ、３７．７３ｍｍｏｌ）を、
無水ＴＨＦ（６０ｍｌ）に溶解させ、−７０℃まで冷却させ、テトラメチルエチ
レンジアミン（０．２ｍｌ）を添加し、次いで、ｎ−ブチルリチウム（２６ｍｌ
、１．６Ｍ（ヘキサン中））を添加した。この溶液を、冷却状態で３０分間、そ
して周囲温度で１時間攪拌した後、この溶液を再び−２０℃まで冷却させ、そし
て２塩化ジメチルスズ、ＳｎＭｅ₂Ｃｌ₂（５．０５ｇ（２０ｍｌＴＨＦ中））
を添加した。この反応混合物を、周囲温度で２時間攪拌させ、水（１００ｍｌ）
に注ぎ、そして酢酸エチル（１００ｍｌ）で抽出させた。有機層を、水（５０ｍ
ｌ）、ブライン（５０ｍｌ）で洗浄し、そしてエバポレートした。残渣を、ヘキ
サン（５０ｍｌ）より再結晶し、７を６．８ｇ（６９％）で得た。

【０１４２】（実施例８）（１，３−ジメトキシ−２−ブロモナフタレン８）Ｂｉｓ−（１，３−ジメトキシナフト−２−イル）−ジメチルスズ７（１１ｇ
、２１ｍｍｏｌ）（ＴＨＦ（５００ｍｌ）中）を、−３０℃まで冷却し、そして
Ｎ−ブロモスクシンイミド（８ｇ、４５ｍｍｏｌ）を添加した。−３０℃で２時
間攪拌させた後、この反応混合物を、水（２００ｍｌ）および酢酸エチル（２０
０ｍｌ）でクエンチした。有機層を、１０％塩化水素酸（１００ｍｌ）、水（１
００ｍｌ×２）、ブライン（１００ｍｌ）で洗浄し、そしてエバポレートした。
この粗生成物を、ヘキサン−酢酸エチル（０％〜１０％の酢酸エチル）で溶出さ
せるシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製し、８を９ｇ（８０％）
で得た。

【０１４３】（実施例９）（２−（ピリド−３−イル）−１，３−ジメトキシナフタレン９）ピリジン−３−ボロン酸（３．９４ｇ、３２ｍｍｏｌ、ＦｒｏｎｔｉｅｒＳ
ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．）、１，３−ジメトキシ−２−ブロモナフタレン
８（６．６ｇ、２４．７ｍｍｏｌ）、グリム（２００ｍｌ）、およびテトラキ
ス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（Ｐｈ₃Ｐ）₄Ｐｄ（３ｇ、２．７ｍｍ
ｏｌ）を、１５分間攪拌し、次いで、炭酸カリウム（１１．４ｇ、水（５０ｍＬ
）中）を添加した。一晩還流後、この反応混合物を、水と酢酸エチルの１：１（
８００ｍｌ）中に注いだ。有機層を水（３００ｍｌ×２）、およびブライン（２
００ｍｌ）によって洗浄し、溶媒を除去し、そして粗生成物を、ジクロロメタン
およびアセトン（０％〜５％のアセトン）を用いて溶出するシリカゲルクロマト
グラフィーによって精製し、９を５．１ｇ（８４％）で得た。

【０１４４】（実施例１０）（２−（トール−２−イル）−１，３−ジメトキシナフタレン１０）この化合物を、８およびトール−２−イルボロン酸（ＦｒｏｎｔｉｅｒＳｃ
ｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．）を使用して、本質的に実施例９と同じ手順によっ
て調製した。

【０１４５】（実施例１１）（２−（ピリド−３−イル）−１，３−ジヒドロキシナフタレン１１の合成）この化合物を、２−（ピリド−３−イル）−１，３−ジメトキシナフタレン９
を使用して、実施例４に使用したのと同じ手順によって調製し、１１を得た。

【０１４６】（実施例１２）（２−（トール−２−イル）−１，３−ジヒドロキシナフタレン１２の合成）この化合物を、２−（トール−２−イル）−１，３−ジメトキシナフタレン１
０を使用して、実施例４に使用したのと同じ手順によって調製し、１２を得た。

【０１４７】（実施例１３）（色素１３の合成）ケトン５ｂ（２５０ｍｇ、０．４５ｍｍｏｌ）および２−（ピリド−３−イル
）−１，３−ジヒドロキシナフタレン１１（１０９ｍｇ、０．４５ｍｍｏｌ）を
、メタンスルホン酸（７ｍｌ）と混合し、そして１００℃で１時間攪拌した。こ
の溶液を、室温まで冷却し、次いで氷水（５０ｍｌ）に注いだ。色素を、ｎ−ブ
タノール（５０ｍｌ×２）で抽出し、そして水（２０ｍｌ×２）で洗浄した。こ
の溶媒を、減圧下でエバポレートし、そして色素を逆相シリカゲルクロマトグラ
フィー（５０％のメタノール）により精製し、１３を１０３ｍｇ（３０％）で得
た（図３）。

【０１４８】（実施例１４）（色素１４の合成）この色素を、２−（トール−２−イル）−１，３−ジヒドロキシナフタレン
１２および５を使用して、実施例１３に使用したのと同じ手順によって調製した
。

【０１４９】（実施例１５）（色素１５の合成）この色素を、２−フルオロ−１，３−ジヒドロキシナフタレン（Ｂｅｎｓｏｎ
ら、”Ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃｂｅｎｚｏｘａｎｔｈｅｎｅｄｙｅｓ”、米国
特許第５，８４０，９９９号（１９９８年１１月２４日発行））および５を使用
して、実施例１３に使用したのと同じ手順によって調製した。

【０１５０】（実施例１６）（色素１６の合成）２−（トール−２−イル）−４−（ピリド−３−イル）−１，３−ジヒドロベ
ンゼン４（５２ｍｇ、０．２８ｍｍｏｌ）、２，５−ジクロロトリメリト酸無水
物（Ｍｅｎｃｈｅｎら、”４，７−ｄｉｃｈｌｏｒｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ
ｄｙｅｓａｓｍｏｌｅｃｕｌａｒｐｒｏｂｅｓ”、米国特許第５，８８５
，７７８号、１９９９年３月２３日発行））（３６．５ｍｇ、１４ｍｍｏｌ）、
およびメタンスルホン酸（１ｍｌ）を加熱し、そして１３０〜１３５℃で２時間
攪拌した。この溶液を室温まで冷却し、次いで氷水（５０ｍｌ）に注いだ。この
粗色素を、ｎ−ブタノール（５０ｍｇ×２）で抽出し、そいてこの抽出物を水（
２０ｍｌ×２）で洗浄した。溶媒を、減圧下でエバポレートし、２つの異性体の
混合物として粗色素を得た。この異性体を、分取薄層クロマトグラフィー（シリ
カゲル；ジクロロメタン：メタノール；酢酸／１００：１０：２（ｖ：ｖ：ｖ）
移動相）によって分離し、所望の遅く移動する異性体１６を２４ｍｇ（３０％）
で得た。

【０１５１】（実施例１７）（２，３−ジメトキシ−４−（ピリド−３−イル）ベンジル１７の合成）２，４−ジメトキシフェニル−４−イルボロン酸（０．９ｇ、４．９７ｍｍｏ
ｌ、ＦｒｏｎｔｉｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．）、３−ブロモピリジ
ン（０．８２ｇ、５ｍｍｏｌ）、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジ
ウム（Ｐｈ₃Ｐ）₄Ｐｄ⁰（０．６５ｇ、０．５６ｍｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ−ジメチル
ホルムアミド（２０ｍｌ）、およびトリエチルアミン（２．１ｍｌ）を混合し、
１１０〜１２０℃で１６時間攪拌した。この反応混合物を、水および酢酸エチル
の混合物１：１（１００ｍｌ）に注ぎ、そして有機層を、水（５０ｍｌ×２）お
よびブライン（５０ｍｌ）で洗浄した。溶媒を取り除いた後、粗生成物を、シリ
カゲルクロマトグラフィー（０％〜１０％のアセトン（ジクロロメタン中））に
よって精製し、１７を０．４５ｇ（４２．５％）で得た。

【０１５２】（実施例１８）（４−（ピリド−３−イル）−１，３−ジヒドロキシベンゼン１８の合成）この化合物を、２，３−ジメトキシ−４−（ピリド−３−イル）ベンジル１７
を使用して、実施例４で使用されるのと同じ手順によって調製し、１８を得た。

【０１５３】（実施例１９）（色素１９の合成）この色素を、４−（ピリド−３−イル）−１，３−ジヒドロキシベンゼン１８
および２，５−ジクロロトリメリト酸無水物を使用して、実施例１６で使用され
るのと同じ手順によって調製した。

【０１５４】（実施例２０）（２，３−ジメトキシ−４−（ピリド−２−イル）ベンゼン２０の合成）この化合物を、２，４−ジメトキシフェニル−４−イルボロン酸および２−ブ
ロモピリジンを使用して、実施例１７で使用されるのと同じ手順によって調製し
、２０を得た。

【０１５５】（実施例２１）（２，３−ジヒドロキシ−４−（ピリド−２−イル）ベンゼン２１の合成）この化合物を、２，３−ジメトキシ−４−（ピリド−２−イル）ベンゼン２０
を使用して、実施例４で使用されるのと同じ手順によって調製し、２１を得た。

【０１５６】（実施例２２）（色素２２の合成）この化合物を、４−（ピリド−３−イル）−１，３−ジヒドロベンゼン２１お
よび２，５−ジクロロメリト酸無水物を使用して、実施例１６で使用されるのと
同じ手順によって調製した。

【０１５７】（実施例２３）（１，３−ジメトキシ−４−（キノン−３−イル）ベンゼン２３の合成）この化合物を、１，３−ジメトキシフェン−４−イルボロン酸および３−ブロ
モキノリンを使用して、実施例１７で使用されるのと同じ手順を使用して調製し
、２３を得た。

【０１５８】（実施例２４）（１，３−ジヒドロキシ−４−（キノン−３−イル）ベンゼン２４の合成）この化合物を、１，３−ジメトキシ−４−（キノン−３−イル）ベンゼン２３
を使用して、実施例４で使用されるのと同じ手順によって調製し、２４を得た。

【０１５９】（実施例２５）（色素２５の合成）この色素を、１，３−ジヒドロキシ−４−（キノン−３−イル）ベンゼン２４
および２，５−ジクロロメリト酸無水物を使用して、実施例１６で使用されるの
と同じ手順によって調製した。

【０１６０】（実施例２６）（１，３−ジメトキシ−４−（キノン−２−イル）ベンゼン２６の合成）この化合物を、１，３−ジヒドロキシフェン−４−ボロン酸および２−ブロモ
キノリンを使用して、実施例１７で使用されるのと同じ手順を使用して調製し、
２６を得た。

【０１６１】（実施例２７）（１，３−ジヒドロキシ−４−（キノン−２−イル）ベンゼン２７の合成）この化合物を、１，３−ジメトキシ−４−（キノン−２−イル）ベンゼン２６
を使用して、実施例４で使用されるのと同じ手順によって調製し、２７を得た。

【０１６２】（実施例２８）（色素２８の合成）この色素を、１，３−ジヒドロキシ−４−（キノン−２−イル）ベンゼン２７
および２，５−ジクロロメリト酸無水物を使用して、実施例１６で使用されるの
と同じ手順によって調製した。

【０１６３】（実施例２９）（１，３−ジメトキシ−２−（ピリド−３−イル）ベンゼン２９の合成）この化合物を、１，３−ジメトキシフェン−２−イルボロン酸および３−ブロ
モピリジンを使用して、実施例１で使用されるのと同じ手順によって調製し、２
９を得た。

【０１６４】（実施例３０）（１，３−ジメトキシ−２−（ピリド−３−イル）−４−ブロモベンゼン３０
の合成）この化合物を、１，３−ジメトキシ−２−（ピリド−３−イル）ベンゼン２９
およびＮ−ブロモスクシンイミドを使用して、実施例２で使用されるのと同じ手
順によって調製し、３０を得た。

【０１６５】（実施例３１）（１，３−ジメトキシ−２−（ピリド−３−イル）−４−フェニルベンゼン
３１の合成）この化合物を、１，３−ジメトキシ−２−（ピリド−３−イル）−４−ブロモ
ベンゼン３０およびフェニルボロン酸を使用して、実施例３で使用されるのと同
じ手順によって調製し、３１を得た。

【０１６６】（実施例３２）（１，３−ジメトキシ−２−（ピリド−３−イル）−４−フェニルベンゼン３
２の合成）この化合物を、１，３−ジメトキシ−２−（ピリド−３−イル）−４−フェニ
ルベンゼン３１を使用して、実施例４で使用されるのと同じ手順によって調製し
、３２を得た。

【０１６７】（実施例３３）（色素３３の合成）この色素を、１，３−ジメトキシ−２−（ピリド−３−イル）−４−フェニル
ベンゼン３２および２，５−ジクロロメリト酸無水物を使用して、実施例１６で
使用されるのと同じ手順によって調製した。

【０１６８】（実施例３４）（１，３−ジメトキシ−２−（トール−２−イル）−４−フェニルベンゼン３
４の合成）この化合物を、１，３−ジメトキシ−２−（トール−２−イル）−４−ブロモ
ベンゼン２およびフェニルボロン酸を使用して、実施例３で使用されるのと同じ
手順によって調製し、３４を得た。

【０１６９】（実施例３５）（１，３−ジヒドロキシ−２−（トール−２−イル）−４−フェニルベンゼン
３５の合成）この化合物を、１，３−ジメトキシ−２−（トール−２−イル）−４−フェニ
ルベンゼン３４を使用して、実施例４で使用されるのと同じ手順によって調製し
て、３５を得た。

【０１７０】（実施例３６）（色素３６の合成）この色素を、１，３−ジヒドロキシ−２−（トール−２−イル）−４−フェニ
ルベンゼン３５および２，５−ジクロロメリト酸無水物を使用して、実施例１６
で使用されるのと同じ手順によって調製した。

【０１７１】（実施例３７）（１，３−ジメトキシ−２−（ピリド−２−イル）ベンゼン３７の合成）この化合物を、１，３−ジメトキシフェン−２−イルボロン酸および２−ブロ
モピリジンを使用して、実施例１で使用されるのと同じ手順によって調製し、３
７を得た。

【０１７２】（実施例３８）（１，３−ジメトキシ−２−（ピリド−２−イル）−４−ブロモベンゼン３８
の合成）この化合物を、１，３−ジメトキシ−２−（ピリド−２−イル）ベンゼン３７
およびＮ−ブロモスクシンイミドを使用して、実施例２で使用されるのと同じ手
順によって調製し、３８を得た。

【０１７３】（実施例３９）（１，３−ジメトキシ−２−（ピリド−２−イル）−４−（ナフト−２−イル
）ベンゼン３９の合成）この化合物を、１，３−ジメトキシ−２−（ピリド−２−イル）−４−ブロモ
ベンゼン３８およびナフト−２−イルボロン酸を使用して、実施例３で使用され
るのと同じ手順によって調製し、３９を得た。

【０１７４】（実施例４０）（１，３−ジヒドロキシ−２−（ピリド−２−イル）−４−（ナフト−２−イ
ル）ベンゼン４０の合成）この化合物を、１，３−ジメトキシ−２−（ピリド−２−イル）−４−（ナフ
ト−２−イル）ベンゼン３９を脱メチル化して、実施例４で使用されるのと同じ
手順によって調製し、４０を得た。

【０１７５】（実施例４１）（色素４１の合成）この色素を、１，３−ジヒドロキシ−２−（ピリド−２−イル）−４−（ナフ
ト−２−イル）ベンゼン４０および２，５−ジクロロメリト酸無水物を使用して
、実施例１６で使用されるのと同じ手順によって調製した。

【０１７６】（実施例４２）（色素の性質）本発明のフルオレセイン色素のいくつかの特定の性質を、測定した（表１）。

【０１７７】

【表１】表１．色素の性質^a 色素の酸形態の発光最大^b 半波高全幅値^c ５−カルボキシフルオレセイン（５−ＦＡＭ）との比較各個々の刊行物または特許出願が、特異的および個々に参考として援用される
と示される場合と同程度まで、全刊行物および特許出願は、本明細書中において
参考として援用される。

【０１７８】特定の実施形態が上に詳細に記載されるが、当業者は、多くの改変がその技術
から逸脱することなく好ましい実施形態において可能であることを明瞭に理解す
る。このような改変の全ては、以下の発明の詳細な説明内に含まれることが意図
される。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、化合物１〜５の構造を示す。

【図２】図２は、化合物６〜１２の構造を示す。

【図３】図３は、化合物１３および１４の構造を示す。

【図４】図４は、化合物１５および１６の構造を示す。

【図５】図５は、化合物１７〜２２の構造を示す。

【図６】図６は、化合物２３〜２５の構造を示す。

【図７】図７は、化合物２６〜２８の構造を示す。

【図８】図８は、化合物２９〜３３の構造を示す。

【図９】図９は、化合物３４〜３６の構造を示す。

【図１０】図１０は、化合物３７〜４１の構造を示す。

【図１１】図１１は、電子欠乏窒素複素環の代表的な収集を示す。

【図１２】図１２は、化合物１９の蛍光定量走査を示す；１ＸＴＢＥ中、室温で、励起
最大値５３０ｎｍ、発光最大値５５４ｎｍ。

【図１３】図１３は、化合物２２の蛍光定量走査を示す；１ＸＴＢＥ中、室温で、励起
最大値５３１．５ｎｍ、発光最大値５５６ｎｍ。

【図１４】図１４は、化合物２５の蛍光定量走査を示す；１ＸＴＢＥ中、室温で、発光
最大値５６２．５ｎｍ。

【図１５】図１５は、化合物３３の蛍光定量走査を示す；１ＸＴＢＥ中、室温で、励起
最大値５４５．５ｎｍ、発光最大値５７１．５ｎｍ。

【図１６】図１６は、ＡＢＩＰＲＩＳＭ３１０由来の標識化連鎖フラグメントの蛍光
検出を示す。ｐＧＥＭ標的のＧ末端配列からの塩基１８３〜塩基１７６の領域、
−２１Ｍ１３前方プライマーを使用。試薬：ＰＯＰ６電気泳動培地、ＴａｑＦ
Ｓポリメラーゼ、ｄＮＴＰ混合物各２５ｐｍｏｌのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＩ
ＴＰ、ｄＴＴＰ。トップパネル：ｄＮＴＰ混合物およびターミネーター３’Ｆｄ
ｄＧＴＰ−ＥＯ−１３。ボトムパネル：ｄＮＴＰ混合物およびエネルギー移動色
素ターミネーター３’ＦｄｄＧＴＰ−ＥＯ−６ＦＡＭ−Ｂｎ−ｄＲ１１０。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ０７Ｄ 405/14 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者メンシェン，スティーブンアメリカ合衆国カリフォルニア 94536，フレモント，バンダウェイ 768 (72)発明者ツェン，ウェイグオアメリカ合衆国カリフォルニア 94404，フォスターシティー，フォアファイルコート 350 Ｆターム(参考） 4B024 AA11 CA09 HA14 4B063 QA18 QQ42 QQ52 QR56 QR62 QR66 QS25 QS34 QS36 QX02 4C063 AA01 AA03 CC79 DD12 EE10 4H056 BA02 BB05 BD01 BD03 BF04 BF04E BF09F BF38 BF38E

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】以下の式を有する化合物であって：【化１】ここで：Ｒ¹、Ｒ²、Ｒ³、Ｒ⁴、Ｒ⁵、またはＲ⁷の少なくとも１つが、電子欠乏窒素複素
環であり；Ｒ¹は単独の場合、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、（Ｃ₁〜Ｃ₆）アルキル、（Ｃ₁〜Ｃ₆）置換
アルキル、（Ｃ₁〜Ｃ₆）アルコキシ、スルホネート、スルホン、アミノ、イミニ
ウム、アミド、ニトリル、反応性連結基、フェニル、置換フェニル、アリール、
置換アリール、もしくは複素環であり、またはＲ¹はＲ⁷と一緒になって、ベンゾ
または複素環であり；Ｒ²は単独の場合、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、（Ｃ₁〜Ｃ₆）アルキル、（Ｃ₁〜Ｃ₆）置換
アルキル、（Ｃ₁〜Ｃ₆）アルコキシ、スルホネート、スルホン、アミノ、イミニ
ウム、アミド、ニトリル、反応性連結基、フェニル、置換フェニル、アリール、
置換アリール、もしくは複素環であり；Ｒ³は単独の場合、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、（Ｃ₁〜Ｃ₆）アルキル、（Ｃ₁〜Ｃ₆）置換
アルキル、（Ｃ₁〜Ｃ₆）アルコキシ、スルホネート、スルホン、アミノ、イミニ
ウム、アミド、ニトリル、反応性連結基、フェニル、置換フェニル、アリール、
置換アリール、もしくは複素環であり；Ｒ⁴は単独の場合、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、（Ｃ₁〜Ｃ₆）アルキル、（Ｃ₁〜Ｃ₆）置換
アルキル、（Ｃ₁〜Ｃ₆）アルコキシ、スルホネート、スルホン、アミノ、イミニ
ウム、アミド、ニトリル、反応性連結基、フェニル、置換フェニル、アリール、
置換アリール、もしくは複素環であり、またはＲ⁴はＲ⁵と一緒になって、ベンゾ
または複素環であり；Ｒ⁵は単独の場合、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、（Ｃ₁〜Ｃ₆）アルキル、（Ｃ₁〜Ｃ₆）置換
アルキル、（Ｃ₁〜Ｃ₆）アルコキシ、スルホネート、スルホン、アミノ、イミニ
ウム、アミド、ニトリル、反応性連結基、フェニル、置換フェニル、アリール、
置換アリール、もしくは複素環であり、またはＲ⁵はＲ⁴と一緒になって、ベンゾ
または複素環であり；Ｒ⁷は単独の場合、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、（Ｃ₁〜Ｃ₆）アルキル、（Ｃ₁〜Ｃ₆）置換
アルキル、（Ｃ₁〜Ｃ₆）アルコキシ、スルホネート、スルホン、アミノ、イミニ
ウム、アミド、ニトリル、反応性連結基、フェニル、置換フェニル、アリール、
置換アリール、もしくは複素環であり、またはＲ⁷はＲ¹と一緒になって、ベンゾ
または複素環であり；そしてＲ⁶は、（Ｃ₁〜Ｃ₆）アルキル、（Ｃ₂〜Ｃ₆）アルケン、（Ｃ₂〜Ｃ₆）アルキ
ン、シアノ、複素環式芳香族、フェニル、および以下：【化２】の構造を有する置換フェニルからなる群から選択され、ここで、Ｘ¹、Ｘ²、Ｘ³、Ｘ⁴およびＸ⁵は、独立して、Ｈ、Ｃｌ、Ｆ、（Ｃ₁〜Ｃ ₆ ）アルキル、（Ｃ₂〜Ｃ₆）アルケン、（Ｃ₂〜Ｃ₆）アルキン、ＣＯ₂Ｈ、ＳＯ₃
Ｈ、ＣＨ₂ＯＨ、または反応性連結基である、化合物。
【請求項２】請求項１に記載のフルオレセイン色素であって、前記電子欠
乏複素環が、２−ピリジル、３−ピリジル、４−ピリジル、２−キノリル、３−
キノリル、４−キノリル、２−イミダゾール、４−イミダゾール、３−ピラゾー
ル、４−ピラゾール、ピリダジン、ピリミジン、ピラジン、シンノリン、フタラ
ジン、キナゾリン、キノキサリン、３−（１，２，４−Ｎ）−トリアゾリル、５
−（１，２，４−Ｎ）−トリアゾリル、５−テトラゾリル、４−（１−Ｏ，３−
Ｎ）−オキサゾール、５−（１−Ｏ，３−Ｎ）−オキサゾール、４−（１−Ｓ，
３−Ｎ）−チアゾール、５−（１−Ｓ，３−Ｎ）−チアゾール、２−ベンゾキサ
ゾール、２−ベンゾチアゾール、４−（１，２，３−Ｎ）−ベンゾトリアゾール
、およびベンズイミダゾールからなる群から選択される、フルオレセイン色素。
【請求項３】請求項１に記載のフルオレセイン色素であって、Ｒ⁴がＲ⁵と
一緒になってベンゾである、フルオレセイン色素。
【請求項４】請求項１に記載のフルオレセイン色素であって、Ｒ¹がＲ⁷と
一緒になってベンゾである、フルオレセイン色素。
【請求項５】請求項１に記載のフルオレセイン色素であって、Ｒ⁶が以下
：【化３】の構造を有する置換フェニルである、フルオレセイン色素。
【請求項６】請求項５に記載のフルオレセイン色素であって、Ｘ³および
Ｘ⁴の一方がカルボキシルであり、他方が水素である、フルオレセイン色素。
【請求項７】請求項１に記載のフルオレセイン色素であって、Ｒ¹、Ｒ²、
Ｒ³およびＲ⁴が各々独立して、フェニルまたは置換フェニルである、フルオレセ
イン色素。
【請求項８】請求項１に記載のフルオレセイン色素であって、Ｒ¹、Ｒ²、
Ｒ³およびＲ⁴が各々独立して、ナフチルまたは置換ナフチルである、フルオレセ
イン色素。
【請求項９】請求項１に記載のフルオレセイン色素であって、Ｒ²および
Ｒ³がそれぞれ独立して、フルオロまたはクロロである、フルオレセイン色素。
【請求項１０】請求項１に記載のフルオレセイン色素であって、Ｒ²およ
びＲ³がそれぞれ独立して、２−ピリジルまたは３−ピリジルである、フルオレ
セイン色素。
【請求項１１】請求項１に記載のフルオレセイン色素であって、Ｒ²およ
びＲ³がそれぞれ独立して、２−キノリルまたは３−キノリルである、フルオレ
セイン色素。
【請求項１２】請求項１に記載のフルオレセイン色素であって、Ｒ⁵およ
びＲ⁷が水素である、フルオレセイン色素。
【請求項１３】請求項１に記載のフルオレセイン色素であって、前記反応
性連結基が、スクシンイミジルエステル、イソチオシアネート、塩化スルホニル
、２，６−ジクロロトリアジニル、ペンタフルオロフェニルエステル、ホスホル
アミダイト、マレイミド、ハロアセチル、およびヨードアセトアミドからなる群
から選択される、フルオレセイン色素。
【請求項１４】以下：【化４】の構造を有する、フルオレセイン色素。
【請求項１５】請求項１に記載のフルオレセイン色素で基質を標識する方
法であって、該方法が、該基質を該フルオレセイン色素の反応性連結基と反応さ
せ、基質−色素結合体が形成される工程を包含する、方法。
【請求項１６】前記反応性連結基が、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドであ
る、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】前記反応性連結基が、ホスホルアミダイトである、請求項
１５に記載の方法。
【請求項１８】前記基質が、ポリヌクレオチド、ヌクレオチド、ヌクレオ
シド、ペプチド、タンパク質、炭水化物、リガンド、粒子、および表面からなる
群から選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】前記粒子が、ナノ粒子、ミクロスフィア、ビーズ、および
リポソームである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】前記表面が、ガラスである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】エネルギー移動色素化合物であって、以下：第１波長で光を吸収し得、そしてドナー色素によって発せられる励起エネルギ
ーを吸収し得るアクセプター色素にリンカーによって連結され、応答の際に励起
エネルギーを発し、そして応答の際に第２波長で蛍光発光する、ドナー色素、を含み、ここで、該ドナー色素およびアクセプター色素の少なくとも１つが、請求項１
に記載のフルオレセイン色素である、エネルギー移動色素化合物。
【請求項２２】前記リンカーが、以下：【化５】の構造を有する、請求項２１に記載のエネルギー移動色素。
【請求項２３】前記リンカーが、以下：【化６】の構造を有する、請求項２１に記載のエネルギー移動色素。
【請求項２４】前記リンカーが、以下：【化７】の構造を有し、ここで、ｎが１または２である、請求項２１に記載のエネルギー
移動色素。
【請求項２５】以下の式を有する、標識したヌクレオシドまたはヌクレオ
チドであって：【化８】ここで、ＤＹＥが請求項１に記載のフルオレセイン色素であるか、または請求
項２３に記載のエネルギー移動色素であり；Ｂが核酸塩基であり；Ｒ⁸がＨ、モノホスフェート、ジホスフェート、トリホスフェート、チオフォ
スフェート、またはホスフェートアナログであり；Ｒ⁹およびＲ¹⁰が単独の場合、各々独立して、Ｈ、ＨＯ、Ｆ、およびポリメラ
ーゼ媒介標的指向重合を阻止する部分であるか、またはＲ⁹およびＲ¹⁰が一緒に
なって、２’−３’−ジデヒドロリボースを形成し；そしてＬがリンカーである、標識したヌクレオシドまたはヌクレオチド。
【請求項２６】請求項２５に記載の標識したヌクレオシドまたはヌクレオ
チドであって、Ｂが、ウラシル、チミン、シトシン、アデニン、７−デアザアデ
ニン、グアニン、および８−デアザグアノシンからなる群から選択される、標識
したヌクレオシドまたはヌクレオチド。
【請求項２７】請求項２５に記載の標識したヌクレオシドまたはヌクレオ
チドであって、Ｌが以下：【化９】であり、ここで、ｎが０、１、または２である、標識したヌクレオシドまたはヌ
クレオチド。
【請求項２８】酵素的に組み込み可能である、請求項２５に記載の標識し
たヌクレオシドまたはヌクレオチド。
【請求項２９】ターミネーターである、請求項２５に記載の標識したヌク
レオシドまたはヌクレオチド。
【請求項３０】以下の構造を有する、請求項２９に記載のターミネーター
ヌクレオチドであって：【化１０】ここで、ＤＹＥがフルオレセイン色素であり；Ｂが核酸塩基であり；Ｒ⁸がトリホスフェート、α−チオトリホスフェート、またはトリホスフェー
トアナログであり；Ｒ⁹およびＲ¹⁰が単独の場合、各々独立して、Ｈ、Ｆ、およびポリメラーゼ媒
介標的指向重合を阻止する部分であるか、またはＲ⁹およびＲ¹⁰が一緒になって
、２’−３’−ジデヒドロリボースを形成し；そしてＬがリンカーである、ターミネーターヌクレオチド。
【請求項３１】酵素的に伸長可能である、請求項２５に記載の標識したヌ
クレオシドまたはヌクレオチド。
【請求項３２】以下の式を有する、標識したオリゴヌクレオチドあって：【化１１】ここで、該オリゴヌクレオチドが２〜１００個のヌクレオチドを含み；ＤＹＥが請求項１に記載のフルオレセイン色素であるか、または請求項２１に
記載のエネルギー移動色素であり；Ｂが核酸塩基であり；Ｌがリンカーであり；Ｒ¹⁰がＨ、ＯＨ、ハライド、アジド、アミン、アルキルアミン、アルキル（Ｃ ₁ 〜Ｃ₆）、アリル、アルコキシ（Ｃ₁〜Ｃ₆）、ＯＣＨ₃、またはＯＣＨ₂ＣＨ＝Ｃ
Ｈ₂であり；Ｒ¹⁵がＨ、ホスフェート、ヌクレオチド間ホスホジエステル、またはヌクレオ
チド間アナログであり；そしてＲ¹⁶がＨ、ホスフェート、ヌクレオチド間ホスホジエステル、またはヌクレオ
チド間アナログである、標識したオリゴヌクレオチド。
【請求項３３】以下の式を有する、標識したオリゴヌクレオチドあって：【化１２】ここで、該オリゴヌクレオチドが２〜１００個のヌクレオチドを含み；ＤＹＥが請求項１に記載のフルオレセイン色素であり；ＸがＯ、ＮＨ、またはＳであり；Ｂが核酸塩基であり；Ｌがリンカーであり；Ｒ¹⁰がＨ、ＯＨ、ハライド、アジド、アミン、アルキルアミン、アルキル（Ｃ ₁ 〜Ｃ₆）、アリル、アルコキシ（Ｃ₁〜Ｃ₆）、ＯＣＨ₃、またはＯＣＨ₂ＣＨ＝Ｃ
Ｈ₂であり；そしてＲ¹⁵がヌクレオチド間ホスホジエステルまたはヌクレオチド間アナログである
、標識したオリゴヌクレオチド。
【請求項３４】請求項３３に記載の標識したオリゴヌクレオチドであって
、Ｌがアルキルジイル（Ｃ₁〜Ｃ₁₂）である、標識したオリゴヌクレオチド。
【請求項３５】請求項３３に記載の標識したオリゴヌクレオチドであって
、Ｌが−（ＣＨ₂ＣＨ₂Ｏ）_n−を含む易動度改変因子であり、ここでｎが１〜１
００である、標識したオリゴヌクレオチド。
【請求項３６】以下の式を有する、ホスホルアミダイト化合物であって：【化１３】ここで、ＤＹＥが請求項１に記載のフルオレセイン色素であるか、または請求
項２１に記載のエネルギー移動色素であり；Ｌがリンカーであり；Ｒ¹¹およびＲ¹²が独立して、アルキル（Ｃ₁〜Ｃ₁₂）、アルケン、アリール、
および１０個までの炭素原子を含むシクロアルキルからなる群から選択され；ま
たはＲ¹¹およびＲ¹²が窒素原子と一緒になって、飽和した窒素複素環を形成し；
そしてＲ¹³が亜リン酸エステル保護基である、ホスホルアミダイト化合物。
【請求項３７】Ｒ¹³が、メチル、２−シアノエチル、および２−（４−ニ
トロフェニル）エチルからなる群から選択される、請求項３６に記載のホスホル
アミダイト化合物。
【請求項３８】Ｒ¹¹およびＲ¹²が、それぞれイソプロピルである、請求項
３６に記載のホスホルアミダイト化合物。
【請求項３９】Ｒ¹¹およびＲ¹²が、一緒になってモルホリノである、請求
項３６に記載のホスホルアミダイト化合物。
【請求項４０】Ｌが、アルキルジイル（Ｃ₁〜Ｃ₁₂）である、請求項３６
に記載のホスホルアミダイト化合物。
【請求項４１】前記フルオレセイン色素が、Ｒ⁶でリンカーによって結合
される、請求項３６に記載のホスホルアミダイト化合物。
【請求項４２】以下の構造のホスホルアミダイト化合物であって：【化１４】ここで、ＤＹＥが請求項１に記載のフルオレセイン色素である、ホスホルアミ
ダイト化合物。
【請求項４３】以下の式を有する、ホスホルアミダイト化合物であって：【化１５】ここで、ＤＹＥが請求項１に記載のフルオレセイン色素であるか、または請求
項２１に記載のエネルギー移動色素であり；Ｂが核酸塩基であり；Ｌがリンカーであり；Ｒ¹¹およびＲ¹²が独立して、アルキル（Ｃ₁〜Ｃ₆）、アルケン、アリール、お
よび１０個までの炭素原子を含むシクロアルキルからなる群から選択され；また
はＲ¹¹およびＲ¹²が窒素原子と一緒になって、飽和した窒素複素環を形成し；Ｒ¹³が亜リン酸エステル保護基であり；そしてＲ¹⁴が酸−切断可能なヒドロキシ保護基である、ホスホルアミダイト化合物。
【請求項４４】請求項４３に記載のホスホルアミダイト化合物であって、
ここで、Ｒ¹³が、メチル、２−シアノエチル、および２−（４−ニトロフェニル
）エチルからなる群から選択される、ホスホルアミダイト化合物。
【請求項４５】請求項４３に記載のホスホルアミダイト化合物であって、
ここで、Ｒ¹¹およびＲ¹²が、それぞれイソプロピルである、ホスホルアミダイト
化合物。
【請求項４６】請求項４３に記載のホスホルアミダイト化合物であって、
Ｒ¹¹およびＲ¹²が一緒になって、モルホリノである、ホスホルアミダイト化合物
。
【請求項４７】請求項４３に記載の化合物であって、ここで、Ｌが以下：【化１６】であり、そしてｎが２〜１０の範囲である、化合物。
【請求項４８】請求項４３に記載の化合物であって、ここで、Ｌが以下：【化１７】であり、そしてｎが０、１、または２である、化合物。
【請求項４９】請求項４３に記載の化合物であって、ここで、Ｌが以下：【化１８】であり、そしてｎが１〜１０の範囲である、化合物。
【請求項５０】請求項４３に記載の化合物であって、Ｂが、ウラシル、チ
ミン、シトシン、アデニン、７−デアザアデニン、グアニン、および８−デアザ
グアノシンからなる群から選択される、化合物。
【請求項５１】標識したオリゴヌクレオチドを合成する方法であって、請
求項３６のホスホルアミダイト化合物を固体支持体上のオリゴヌクレオチドにカ
ップリングする工程を包含する、方法。
【請求項５２】標識したオリゴヌクレオチドを合成する方法であって、ヌ
クレオシドホスホルアミダイト試薬を固体支持体にカップリングする工程を包含
し、ここで、該固体支持体が、請求項１に記載の色素または請求項２１に記載の
エネルギー移動化合物で標識される、方法。
【請求項５３】標識したプライマー伸長産物を産生する方法であって、連
続プライマー伸長を支持し得る酵素的に伸長可能なヌクレオチドおよびターミネ
ーターの混合物の存在下で、プライマー−標的ハイブリッドを酵素的に伸長する
工程を包含し、ここで、該プライマーまたは該ターミネーターが、請求項１に記
載の色素または請求項２１に記載のエネルギー移動化合物で標識される、方法。
【請求項５４】オリゴヌクレオチド連結の方法であって、該方法は以下：２つのプローブを標的配列にアニーリングする工程；および一方のプローブの５’末端と他方のプローブの３’末端との間のホスホジエス
テル結合を形成する工程；を包含し、ここで、１つまたは両方のプローブが、請求項１に記載の色素または請求項２
１に記載のエネルギー移動化合物で標識される、方法。
【請求項５５】フラグメント分析の方法であって、該方法は以下：ポリヌクレオチドフラグメントをサイズ依存分離プロセスに供する工程であっ
て、該フラグメントが請求項１に記載のフルオレセイン色素または請求項２１に
記載のエネルギー移動化合物で標識される、工程；および該分離プロセスの後に、該標識したポリヌクレオチドフラグメントを検出する
工程、を包含する、方法。
【請求項５６】前記フラグメントが、易動度改変標識で標識される、請求
項５５に記載の方法。
【請求項５７】前記フラグメントが、連結によって形成される、請求項５
５に記載の方法。
【請求項５８】請求項５５に記載の方法であって、前記サイズ依存分離プ
ロセスが電気泳動であり、そして該標識したポリヌクレオチドフラグメントが蛍
光によって検出される、方法。
【請求項５９】増幅の方法であって、該方法が以下：２つ以上のプライマーを標的ＤＮＡ配列にアニーリングする工程；およびポリメラーゼ、および酵素的に伸長可能なヌクレオチドの混合物によって該プ
ライマーを伸長する工程；を包含し、ここで、該プライマーまたはヌクレオチドが請求項１に記載の色素で
標識される、方法。
【請求項６０】増幅の方法であって、該方法が以下：２つ以上のプライマーおよび蛍光色素−クエンチャープローブを標的ＤＮＡ配
列にアニーリングする工程；およびポリメラーゼ、および酵素的に伸長可能なヌクレオチドの混合物によって該プ
ライマーを伸長する工程；を包含し、ここで、該プローブが請求項１に記載の色素で標識される、方法。
【請求項６１】オリゴヌクレオチドを標識するためのキットであって、請
求項１に記載の反応性連結基を含む色素およびオリゴヌクレオチドを含む、キッ
ト。
【請求項６２】オリゴヌクレオチドを標識するためのキットであって、請
求項３６に記載のホスホルアミダイト化合物およびオリゴヌクレオチドを含む、
キット。
【請求項６３】標識したプライマー伸長産物を産生するためのキットであ
って、該キットは、連続プライマー伸長を支持し得る酵素的に伸長可能なヌクレ
オチド、ターミネーターおよびプライマーを含み、ここで、該プライマーまたは
該ターミネーターが請求項１に記載の色素で標識される、キット。
【請求項６４】標識したプライマー伸長産物を産生するためのキットであ
って、該キットは、連続プライマー伸長を支持し得る酵素的に伸長可能なヌクレ
オチド、ターミネーターおよびプライマーを含み、ここで、該プライマーまたは
該ターミネーターが請求項２１に記載のエネルギー移動色素で標識される、キッ
ト。
【請求項６５】標識したプライマー伸長産物を産生するためのキットであ
って、該キットは、連続プライマー伸長を支持し得る酵素的に伸長可能なヌクレ
オチド、ターミネーターおよびプライマーを含み、ここで、該プライマーまたは
該ターミネーターが請求項１４に記載の色素で標識される、キット。
【請求項６６】請求項６５に記載のキットであって、前記ターミネーター
が一組の４つの異なるターミネーターであって、該ターミネーターの１つは標的
Ａで終結し、該ターミネーターの１つは標的Ｇで終結し、該ターミネーターの１
つは標的Ｃで終結し、そして該ターミネーターの１つは標的ＴまたはＵで終結す
る、キット。
【請求項６７】請求項６６に記載のキットであって、前記一組の４つの異
なるターミネーターが、一組の、易動度が一致したターミネーターである、キッ
ト。