ES2211768T3 - Colorantes a base de fluorosceina sustituida por un heterociclo con nitrogeno pobre en electrones. - Google Patents
Colorantes a base de fluorosceina sustituida por un heterociclo con nitrogeno pobre en electrones.Info
- Publication number
- ES2211768T3 ES2211768T3 ES01907003T ES01907003T ES2211768T3 ES 2211768 T3 ES2211768 T3 ES 2211768T3 ES 01907003 T ES01907003 T ES 01907003T ES 01907003 T ES01907003 T ES 01907003T ES 2211768 T3 ES2211768 T3 ES 2211768T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- dye
- group
- substituted
- alkyl
- labeled
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
- C07D405/00—Heterocyclic compounds containing both one or more hetero rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms, and one or more rings having nitrogen as the only ring hetero atom
- C07D405/02—Heterocyclic compounds containing both one or more hetero rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms, and one or more rings having nitrogen as the only ring hetero atom containing two hetero rings
- C07D405/04—Heterocyclic compounds containing both one or more hetero rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms, and one or more rings having nitrogen as the only ring hetero atom containing two hetero rings directly linked by a ring-member-to-ring-member bond
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
- C07D405/00—Heterocyclic compounds containing both one or more hetero rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms, and one or more rings having nitrogen as the only ring hetero atom
- C07D405/14—Heterocyclic compounds containing both one or more hetero rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms, and one or more rings having nitrogen as the only ring hetero atom containing three or more hetero rings
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
- C09B—ORGANIC DYES OR CLOSELY-RELATED COMPOUNDS FOR PRODUCING DYES, e.g. PIGMENTS; MORDANTS; LAKES
- C09B11/00—Diaryl- or thriarylmethane dyes
- C09B11/04—Diaryl- or thriarylmethane dyes derived from triarylmethanes, i.e. central C-atom is substituted by amino, cyano, alkyl
- C09B11/06—Hydroxy derivatives of triarylmethanes in which at least one OH group is bound to an aryl nucleus and their ethers or esters
- C09B11/08—Phthaleins; Phenolphthaleins; Fluorescein
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
- Y10S436/80—Fluorescent dyes, e.g. rhodamine
Abstract
Compuesto que presenta la **fórmula** en la que: al menos uno de entre R1, R2, R3, R4, R5 o R7 es un heterociclo con nitrógeno pobre en electrones;cuando se considera solo, es H, F, Cl, alquilo (C1- C6), alquilo (C1-C6) sustituido, alcoxi (C1-C6), sulfonato, sulfona, amino, iminio, amido, nitrilo, grupo con enlace reactivo, fenilo, fenil sustituido, arilo, aril sustituido o heterociclo, o considerado junto con R7 es benzo o heterociclo y en la que X1, X2, X3, X4 y X5 considerados por separado son H, Cl, F, alquilo (C1-C6), alqueno (C2-C6), alquino (C2-C6), CO2H, SO3H, CH2OH o un grupo con enlace reactivo.
Description
Colorantes a base de fluorosceína sustituida por
un heterociclo con nitrógeno pobre en electrones.
La invención se refiere en general al campo de
los compuestos con colorante de fluorescente útiles como reactivos
de marcaje para preparar sondas moleculares. Más particularmente, la
presente invención se refiere a los colorantes de fluoresceína con
una estructura de anillo de xanteno y a los sustituyentes
heterocíclicos con nitrógeno deficientes en electrones.
La detección no radioactiva de analitos
biológicos utilizando marcadores fluorescentes es una tecnología
importante en la biotecnología analítica moderna. Al eliminar la
necesidad de marcadores radioactivos, se mejora la seguridad y el
impacto ambiental y se reducen en gran medida los costes asociados a
la deposición del reactivo. Ejemplos de procedimientos que utilizan
dichos procedimientos de detección fluorescente incluyen el
secuenciado automático del ADN, los procedimientos con sonda de
oligonucleótido, la detección de productos por reacción en cadena de
polimerasa, el inmunoanálisis y similares.
En muchas aplicaciones importantes, presenta
ventajas emplear múltiples marcadores fluorescentes distinguibles
espectralmente para conseguir la detección independiente de una
variedad de analitos que se solapan espacialmente, es decir,
detección fluorescente múltiple. Ejemplos de procedimientos que
utilizan la detección fluorescente múltiple incluyen los análisis
con sonda de ADN múltiple de un solo tubo, PCR, polimorfismos con un
solo nucleótido, inmunoanálisis y secuenciado multicolor automático
del ADN. El número de recipientes de reacción se puede reducir de
este modo simplificando los protocolos experimentales y facilitando
la producción de kits de reactivos específicos para la aplicación.
En el caso del secuenciado multicolor automático del ADN, la
detección fluorescente múltiple permite el análisis de múltiples
nucleótidos en una sola banda de electroforesis aumentando de este
modo en todos los procedimientos de un solo color y reduciendo las
incertidumbres asociadas con las variaciones de movilidad
electroforética entre bandas. El secuenciado automático del ADN de
tipo Sanger con cuatro colores ha permitido la caracterización
completa del genoma en el ámbito molecular.
El montaje de una serie de marcadores múltiples
fluorescentes distinguibles espectralmente útiles para la detección
fluorescente múltiple es problemático. La detección fluorescente
múltiple impone por lo menos seis limitaciones severas en la
selección de los componentes marcadores con colorante de
fluorescente, particularmente para aplicaciones que requieren un
solo foco de luz de excitación, una separación electroforética y/o
el tratamiento con enzimas, p. ej.: secuenciado automático del ADN.
En primer lugar, es dificil hallar una serie de colorantes
estructuralmente similares cuyos espectros de emisión se resuelvan
espectralmente, ya que la anchura media de la banda de emisión
típica para los colorantes fluorescentes orgánicos es
aproximadamente de 40 a 80 nanómetros (nm). En segundo lugar,
incluso si los colorantes con espectros de emisión no solapantes
están identificados, el conjunto puede no ser todavía adecuado si
las eficacias cuánticas fluorescentes respectivas son demasiado
bajas. En tercer lugar, cuando se utilizan varios colorantes
fluorescentes a la vez, la excitación simultánea llega a ser difícil
porque las bandas de absorción de los colorantes están normalmente
muy separadas. En cuarto lugar, la carga, tamaño molecular y
conformación de los colorantes no debe afectar desfavorablemente la
movilidad electroforética del analito. En quinto lugar, los
colorantes fluorescentes deben ser compatibles con la química
utilizada para crear o manipular el analito, p. ej.: disolventes y
reactivos de síntesis del ADN, tampones, enzimas polimerasa, enzimas
ligasa y similares. En sexto lugar, el colorante debe tener
suficiente fotoestabilidad para resistir la excitación del
láser.
Las series de colorantes múltiples disponibles
actualmente para su utilización en aplicaciones de secuenciado de
ADN automáticas con cuatro colores requieren luz de láser azul o
azul verdosa para excitar de forma adecuada las emisiones de
fluorescencia de todos los colorantes que componen la serie, p. ej.:
láseres iónicos con argón. A medida que los láseres rojos de coste
más bajo están disponibles, se desarrolla la necesidad de compuestos
colorantes fluorescentes y sus conjugados que satisfacen las
limitaciones anteriores y son excitables por la luz de láser que
tiene una longitud de onda superior a aproximadamente a 500 nm.
La presente invención se refiere a componentes de
colorantes adecuados para la creación de series de marcadores
fluorescentes que se resuelven espectralmente, útiles para la
detección fluorescente multicolor.
Generalmente los colorantes de la invención
comprenden una estructura I con anillo de xanteno, de tipo
fluoresceína:
sustituida con al menos un heterociclo con
nitrógeno pobre en electrones unido al sistema con anillo de
fluoresceína en R^{1}, R^{2}, R^{3}, R^{4}, R^{5} o
R^{7}.
R^{1}, cuando se considera solo, es H, F, Cl,
alquilo (C_{1}-C_{6}), alquilo
(C_{1}-C_{6}) sustituido, alcoxi
(C_{1}-C_{6}), sulfonato, sulfona, amino,
iminio, amido, nitrilo, grupo con enlace reactivo, fenilo, fenil
sustituido, arilo, aril sustituido o heterociclo, o considerado
conjuntamente con R^{7} es benzo o heterociclo.
R^{2}, cuando se considera solo, es H, F, Cl,
alquilo (C_{1}-C_{6}), alquilo
(C_{1}-C_{6}) sustituido, alcoxi
(C_{1}-C_{6}), sulfonato, sulfona, amino,
iminio, amido, nitrilo, grupo con enlace reactivo, fenilo, fenil
sustituido, arilo, aril sustituido o heterociclo.
R^{3}, cuando se considera solo, es H, F, Cl,
alquilo (C_{1}-C_{6}), alquilo
(C_{1}-C_{6}) sustituido, alcoxi
(C_{1}-C_{6}), sulfonato, sulfona, amino,
iminio, amido, nitrilo, grupo con enlace reactivo, fenilo, fenil
sustituido, arilo, aril sustituido o heterociclo.
R^{4}, cuando se considera solo, es H, F, Cl,
alquilo (C_{1}-C_{6}), alquilo
(C_{1}-C_{6}) sustituido, alcoxi
(C_{1}-C_{6}), sulfonato, sulfona, amino,
iminio, amido, nitrilo, grupo con enlace reactivo, fenilo, fenil
sustituido, arilo, aril sustituido o heterociclo, o considerado
conjuntamente con R^{5} es benzo o heterociclo.
R^{5}, cuando se considera solo, es H, F, Cl,
alquilo (C_{1}-C_{6}), alquilo
(C_{1}-C_{6}) sustituido, alcoxi
(C_{1}-C_{6}), sulfonato, sulfona, amino,
iminio, amido, nitrilo, grupo con enlace reactivo, fenilo, fenil
sustituido, arilo, aril sustituido o heterociclo, o considerado
conjuntamente con R^{4} es benzo o heterociclo.
R^{7}, cuando se considera solo, es H, F, Cl,
alquilo (C_{1}-C_{6}), alquilo
(C_{1}-C_{6}) sustituido, alcoxi
(C_{1}-C_{6}), sulfonato, sulfona, amino,
iminio, amido, nitrilo, grupo con enlace reactivo, fenilo, fenil
sustituido, arilo, aril sustituido o heterociclo, o considerado
conjuntamente con R^{1} es benzo o heterociclo.
R^{6} puede ser alquilo
(C_{1}-C_{6}), alqueno
(C_{2}-C_{6}), alquino
(C_{2}-C_{6}), ciano, aromático heterocíclico,
fenilo y fenil sustituido que tienen la estructura II:
en la que X^{1}, X^{2}, X^{3}, X^{4} y
X^{5} considerados por separado son H, Cl, F, alquilo
(C_{1}-C_{6}), alqueno
(C_{2}-C_{6}), alquino
(C_{2}-C_{6}), CO_{2}H, SO_{3}H, CH_{2}OH
o un grupo con enlace
reactivo.
En un aspecto, la invención proporciona un
procedimiento para marcar un sustrato con un colorante de
fluoresceína de estructura I, en el que el sustrato reacciona con el
grupo con enlace reactivo del colorante y se forma el conjugado
sustrato-colorante. Los conjugados del sustrato
marcados con colorante comprenden el colorante de fluoresceína
sustituido con heterociclo con nitrógeno suficiente en electrones,
según I, y un sustrato, es decir otra molécula o sustancia. El
sustrato puede estar marcado con uno o más colorantes de la
invención, que pueden ser iguales o diferentes. La fluorescencia de
los colorantes proporciona señales detectables en todo el intervalo
espectral, que permite la diferenciación de sustratos marcados de
forma diferente en una sola muestra o mezcla.
En una forma de realización, el colorante de
fluoresceína sustituido con heterociclo con nitrógeno pobre en
electrones se conjuga covalentemente con otro compuesto colorante
para formar un compuesto colorante por transferencia de energía.
En otra forma de realización, el colorante de
fluoresceína sustituido con heterociclo con nitrógeno pobre en
electrones está conjugado covalentemente con un nucleósido,
nucleótido, análogo de nucleósido y de nucleótido, análogo de
polinucleótido o polinucleósido para formar conjugados marcados con
los mismos.
En otro aspecto todavía, la invención proporciona
reactivos de fosforamidita incluyendo los colorantes de fluoresceína
sustituidos con heterociclo con nitrógeno pobre en electrones de la
invención.
En otro aspecto la invención proporciona varios
procedimientos para sintetizar oligonucleótidos marcados con
colorantes de fluoresceína sustituidos con heterociclo con nitrógeno
pobre en electrones y que emplean los colorantes para la detección
de polinucleótidos fluorescentes marcados.
En otro aspecto, la invención proporciona kits
que constan de colorantes de fluoresceína sustituidos con
heterociclo con nitrógeno pobre en electrones y reactivos útiles
para marcar moléculas y/o para realizar análisis tales como el
secuenciado y amplificación del ADN, p. ej.: la reacción en cadena
de polimerasa.
Los colorantes de fluoresceína sustituidos con
heterociclo con nitrógeno pobre en electrones de la invención
proporcionan ventajas significativas sobre los colorantes de
fluoresceína conocidos actualmente.
La Fig. 1 presenta las estructuras de los
compuestos 1 a 5.
La Fig. 2 presenta las estructuras de los
compuestos 6 a 12.
La Fig. 3 presenta las estructuras de los
compuestos 13 y 14.
La Fig. 4 presenta las estructuras de los
compuestos 15 y 16.
La Fig. 5 presenta las estructuras de los
compuestos 7 a 22.
La Fig. 6 presenta las estructuras de los
compuestos 23 a 25.
La Fig. 7 presenta las estructuras de los
compuestos 26 a 28.
La Fig. 8 presenta las estructuras de los
compuestos 29 a 33.
La Fig. 9 presenta las estructuras de los
compuestos 34 a 36.
La Fig. 10 presenta las estructuras de los
compuestos 37 a 41.
La Fig. 11 presenta una colección representativa
de heterociclos con nitrógeno pobres en electrones.
La Fig. 12 presenta barridos de fluorimetría del
compuesto 19; excitación máx. 530 nm, emisión máx. 554 nm, en 1X TBE
a temperatura ambiente.
La Fig. 13 presenta barridos de fluorimetría del
compuesto 22; excitación máx. 531,5 nm, emisión máx. 556 nm, en 1X
TBE a temperatura ambiente.
La Fig. 14 presenta un barrido de fluorimetría
del compuesto 25; emisión máx. 562,5 nm, en 1X TBE a temperatura
ambiente.
La Fig. 15 presenta barridos de fluorimetría del
compuesto 33; excitación máx. 545,5 nm, emisión máx. 571,5 nm, en 1X
TBE a temperatura ambiente.
La Fig. 16 presenta la detección fluorescente de
los fragmentos marcados de secuenciado procedente de ABI PRISM 310.
Zona de la base 183 a la base 276 de la secuencia de terminación en
G de la diana pGEM que utiliza el cebador avanzado -21M13.
Reactivos: medio POP6 de electroforesis, Taq FS polimerasa, 25
pmoles de mezcla de dNPT de cada dATP, dCTP, dITP, dTTP. Panel
superior: mezcla de dNTP y terminador
3'FddGTP-EO-13. Panel inferior:
mezcla de dNTP y
3'FddGTP-EO-6FAM-Bn-dR110
terminador con colorante por transferencia de energía.
Se hace referencia ahora con detalle a las formas
de realización preferidas de la invención, cuyos dibujos se ilustran
en los dibujos adjuntos. Mientras la invención se describe en los
dibujos adjuntos conjuntamente con las formas de realización
preferidas, se comprenderá que no se pretende limitar la invención a
estas formas de realización. Por el contrario, pretende cubrir todas
las alternativas, modificaciones y equivalentes que se puedan
incluir dentro del alcance de la presente invención, según se define
en las reivindicaciones adjuntas.
A menos que se indique de otra manera, los
siguientes términos y frases tal como se utilizan en la presente
memoria se pretende que tengan los significados siguientes:
"Nucleobase" significa un grupo
heterocíclico que contiene nitrógeno capaz de formar enlaces de
hidrógeno Watson-Crick con una nucleobase o análogo
de nucleobase complementario, p. ej.: una purina, una
7-desazapurina o una pirimidina. Las nucleobases
típicas son las nucleobases naturales adenina, guanina, citosina,
uracilo, timina y los análogos de las nucleobases naturales, p. ej.:
7-desazaadenina, 7-desazaguanina,
inosina, nebularina, nitropirrol, nitroindol,
2-amino-purina,
2,6-diamino-purina, hipoxantina,
pseudouridina, pseudocitidina, pseudoisocitidina,
5-propinil-citidina, isocitidina,
isoguanina, 7-desaza-guanina,
2-tio-pirimidina,
6-tio-guanina,
4-tio-timina,
4-tio-uracilo,
O^{6}-metil-guanina,
N^{6}-metil-adenina,
O^{4}-metil-timina,
5,6-dihidrotimina,
5,6-dihidrouracilo,
4-metil-indol y etenoadenina
(Fasman, Practical Handbook of Biochemistry and Molecular
Biology, págs. 385-394, CRC Press, Boca Raton,
Fl (1989)).
"Nucleósido" significa un compuesto que
comprende una nucleobase unida a un carbono C-1' del
azúcar ribosa. La ribosa puede estar sustituida o insustituida. Los
azúcares de ribosa sustituida incluyen, pero no están limitados a,
aquellas ribosas en las que uno o más de los átomos de carbono,
preferentemente el átomo de carbono en 3', está sustituido por uno o
más de los grupos -R, -OR, -NRR o grupos de halógeno iguales o
diferentes, en los que cada R es independientemente -H, alquilo
(C_{1}-C_{6}) o arilo
(C_{5}-C_{14}). Las ribosas particularmente
preferidas son ribosa, 2'-desoxirribosa,
2',3'-didesoxirribosa,
3'-halo-ribosa,
3'-fluoro-ribosa,
3'-cloro-ribosa y
3'-alquil-ribosa. Cuando la
nucleobase es A ó G, el azúcar ribosa se une en la posición N^{9}
de la nucleobase. Cuando la nucleobase es C, T ó U, el azúcar
pentosa está unido a la posición N^{1} de la nucleobase (Kornberg
y Baker, DNA Replication, 2ª Ed., Freeman, San Francisco, CA,
(1992)).
"Nucleótido" significa un éster fosfato de
un nucleósido, como unidad monómero o dentro de un polinucleótido.
Los nucleótidos se designan a veces como "NTP" o "dNTP" y
"ddNTP"para indicar particularmente las características
estructurales del azúcar ribosa. "5'-trifosfato de
nucleótido" se refiere a un nucleótido con un grupo éster
trifosfato en la posición 5'. El grupo éster trifosfato puede
incluir sustituciones de azufre para varios oxígenos, p. ej.:
5'-trifosfatos de
\alpha-tio-nucleótido.
Tal como se utilizan en la presente memoria, los
términos "polinucleótido" u "oligonucleótido" abarcan
cualquier compuesto de polímero constituido por nucleósidos,
nucleótidos o los análogos de los mismos. "Oligonucleótido" y
"polinucleótido", utilizados indistintamente, significan
polímeros de monómeros de nucleótido de una sola cadena y de doble
cadena, incluyendo 2'-desoxirribonucleótidos (ADN) y
ribonucleótidos (ARN). Un oligonucleótido puede estar compuesto en
su totalidad de desoxirribonucleótidos, en su totalidad de
ribonucleótidos o de mezclas híbridas de los mismos, unidos por
uniones de enlace fosfodiéster del internucleótido o análogos de
internucleótido y contraaniones asociados, p. ej.: H^{+},
NH_{4}^{+}, trialquilamonio, Mg^{2+}, Na^{+} y similares.
Los oligonucleótidos pueden estar compuestos de nucleobase y
análogos de azúcar. Los polinucleótidos oscilan típicamente de
tamaño desde unas pocas unidades monoméricas, p. ej.: 5 a 40 cuando
se denominan vulgarmente oligonucleótidos a varios miles de unidades
monoméricas de nucleótido. A menos que se indique de otro modo,
siempre que representa una secuencia de oligonucleótido, debe
entenderse que los nucleótidos están en orden 5' a 3' de izquierda a
derecha y que "A" significa desoxiadenosina, "C" significa
desoxicitidina, "G" significa desoxiguanosina y "T"
significa timidina, a menos que se indique de otro modo.
El término "emparejamiento de bases
Watson/Crick" se refiere al emparejamiento de bases por enlace de
hidrógeno observado frecuentemente en el ADN de doble cadena.
"Punto con enlace" se refiere a un punto en
un grupo, p. ej.: un colorante de fluoresceína, un nucleótido o un
oligonucleótido, al que se une covalentemente un conectador.
"Conectador" se refiere a un grupo que une
un colorante a un sustrato, p. ej.: colorante de fluoresceína o un
colorante a otro, p. ej.: en un par colorante por energía de
transferencia.
"Alquilo" se refiere a un radical de
hidrocarburo saturado o insaturado, de cadena lineal, ramificada o
cíclica procedente de la eliminación de un átomo de hidrógeno de un
solo átomo de carbono de un predecesor alcano, alqueno o alquino.
Los grupos alquilo típicos incluyen, pero no se limitan a metilo,
etilo, propilo, butilo y similares. Los grupos alquilo típicos
incluyen, pero no se limitan a metilo (-CH_{3}); etilos tales como
etanilo (-CH_{2}-CH_{3}), etenilo
(-CH=CH_{2}), etinilo (-CH=CH_{2}); propilos tales como
propan-1-ilo
(-CH_{2}-CH_{2}-CH_{3}),
propan-2-ilo,
ciclopropan-1-ilo,
prop-1-en-1-ilo
(-CH=CH-CH_{3}),
prop-1-en-2 ilo,
prop-2-en-1-ilo
(-CH_{2}-CH=CH_{2}),
prop-2-en-2-ilo,
cicloprop-1-en-1-ilo;
cicloprop-2-en-1-ilo,
prop-1-in-1-ilo
(-C=C-CH_{3}),
prop-2-in-1-ilo
(-CH_{2}-C=CH), etc.; butilos tales como
butan-1-ilo
(-CH_{2}-CH_{2}-CH_{2}-CH_{3}),
butan-2-ilo,
ciclobutan-1-ilo,
but-1-en-1-ilo
(-CH=CH-CH_{2}-CH_{3}),
but-1-en-2-ilo,
but-2-en-1-ilo
(-CH_{2}-CH=CH-CH_{3}),
but-2-en-2-ilo,
buta-1,3-dien-1-ilo
(-CH=CH-CH=CH_{2}),
buta-1,3-dien-2-ilo,
ciclobut-1-en-1-ilo,
ciclobut-1-en-3-ilo,
ciclobuta-1,3-dien-1-ilo,
but-1-in-1-ilo
(-C=C-CH_{2}-CH_{3}),
but-1-in-3-ilo,
but-3-in-1-ilo
(-CH_{2-}CH_{2}-C=CH), etc.; y similares. En
las formas de realización preferidas, los grupos alquilo son alquilo
(C_{1}-C_{6}), siendo particularmente preferido
(C_{1}-C_{3}).
"Alcoxi" significa -OR, en el que R es
alquilo (C_{1}-C_{6}).
"Alquildiilo" se refiere a un radical
hidrocarburo saturado o insaturado, de cadena lineal, ramificada o
cíclica de 10 a 12 átomos de carbono y que tiene dos centros de
radical monovalente procedentes de la eliminación de dos átomos de
hidrógeno del mismo o dos átomos de carbono diferentes de un
predecesor alcano, alqueno o alquino. Los radicales alquildiilo
típicos incluyen, pero no se limitan a, metano (-CH_{2}-);
1,2-etildiilo; 1,3-propildiilo,
1,4-butildiilo y similares.
"Arilo" se refiere a un radical hidrocarburo
aromático monovalente de 6 a 20 átomos de carbono procedente de la
eliminación de un sistema de anillo aromático predecesor. Los grupos
arilo típicos incluyen, pero no se limitan a, radicales procedentes
de benceno, benceno sustituido, naftaleno, antraceno, bifenilo y
similares.
"Arildiilo" se refiere a un radical
hidrocarburo insaturado cíclico o policíclico de 6 a 20 átomos de
carbono con un sistema conjugado de resonancia electrónica y al
menos dos centros de radical monovalente procedentes de la
eliminación de dos átomos de hidrógeno de dos átomos de carbono
diferentes de un compuesto arilo predecesor.
"Aril sustituido", "alquildiil
sustituido", "aril sustituido" y "arildiil sustituido"
se refieren a radicales alquilo, alquildiilo, arilo y arildiilo
respectivamente, en los que se han sustituido uno o más átomos de
hidrógeno independientemente por otro sustituyente. Los
sustituyentes típicos incluyen, pero no se limitan a, -X, -R,
-O^{-}, -OR, -SR, -S^{-}, -NRR, =NR, -CH_{3}, -CN, -OCN,
-SCN, -NCO, -NCS, -NO, -NO_{2}, =N_{2}, -N_{3},
-S(O)_{2}O^{-}, -S(O)_{2}OH,
-S(O)_{2}R, -P(O)(O^{-})_{2},
P(O)(OH)_{2}, -C(O)R,
-C(O)X, -C(S)R, -C(O)OR,
-C(O)O^{-}, -C(S)OR,
-C(O)SR, -C(S)SR,
-C(O)NNR, -C(S)NNR y
-C(NR)NRR, en los que cada X es independientemente un
halógeno y cada R es independientemente -H, alquilo, arilo o
heterociclo. Los sustituyentes particularmente preferidos son
halógeno, -OS(O)_{2}OR,
-S(O)_{2}OR, -S(O)_{2}R,
-S(O)_{2}NR, -S(O)R,
-OP(O)O_{2}RR, P(O)O_{2}RR,
-C(O)OR, -NRR, -NRRR, -NC(O)R,
-C(O)R, -C(O)NRR, -CN, -O y -OR, en
los que R se selecciona independientemente de entre el grupo
constituido por -H, alquilo, arilo, heteroarilo, heterociclo y un
grupo de enlace.
"Grupo con enlace reactivo" se refiere a un
grupo químicamente reactivo, p. ej.: un nucleófilo o electrófilo,
capaz de reaccionar con otra molécula para formar un enlace
covalente o una unión.
"Heterociclo" se refiere a una molécula con
un sistema de anillo en el que uno o más átomos del anillo se han
sustituido por un heteroátomo, p. ej.: nitrógeno, oxígeno y
azufre.
"Sustituyente heterociclo con nitrógeno pobre
en electrones" se refiere a un heterociclo monovalente con
nitrógeno pobre en electrones procedente de la eliminación de un
átomo de hidrógeno de un solo átomo del sistema del anillo para unir
el heterocíclico a los colorantes de fluoresceína de la invención
(Joule, et al., Heterocyclic Chemistry, 3ª ed., Stanley
Thornes Publisher, Ltd., Cheltenham, R.U. (1988); Acheson, R.,
Análisis Introduction to the Chemistry of Heterocyclic
Compounds, 2ª ed. Interscience Publishers, división de John
Wiley & Sons, Nueva York (1967)). En la Figura 1 se indican
varios heterociclos con nitrógeno pobres en electrones.
"Sustrato" es una entidad a la que se unen
los compuestos de la presente invención. Los sustratos incluyen,
pero no se limitan a (i) polinucleótido, (ii) nucleósido y
nucleótido, (iii) péptido y proteína, (iv) carbohidrato, (v) ligando
y (vi) cualquier análogo de los precedentes (i) a (v).
"Enzimáticamente incorporable" se refiere a
una propiedad de un nucleótido que es capaz de incorporarse
enzimáticamente en el terminal, p. ej.: 3', de una cadena de
polinucleótido naciente por acción de una enzima polimerasa.
"Terminador" significa un nucleótido
enzimáticamente incorporable que impide incorporaciones posteriores
de los nucleótidos a la cadena de polinucleótido resultante y de
este modo detiene la extensión de la polimerasa. Los terminadores
típicos carecen de un sustituyente 3'-hidroxilo e
incluyen 2',3'-didesoxirribosa,
2',3'-dideshidroxirribosa y
2',3'-didesoxi,3'-halo-ribosa,
p. ej.: 3'-flúor. Por otra parte, se podría utilizar
un análogo de ribofuranosa, tal como la arabinosa. Ejemplos de
terminadores de nucleótido incluyen
2',3'-didesoxi-\beta-D
ribofuranosilo,
\beta-D-arabinofuranosilo,
3'-desoxi-\beta-D
-arabinofuranosilo,
3'-amino-2',3'-didesoxi-\beta-D-ribofuranosilo
y
2',3'-didesoxi-3'-fluoro-\beta-D-ribofuranosilo
(Chidgeavadze et al. (1984) Nucleic Acids Res., 12:
1671-1686; y Chidgeavadze et al. (1985)
FEB. Lett., 183: 275-278). Los terminadores
de nucleótido también incluyen terminadores de nucleótido
reversibles (Metzker et al. (1994) Nucleic Acids Res.,
22(20): 4259).
"Enzimáticamente extensible" significa una
propiedad de un nucleótido que es enzimáticamente incorporable en el
terminal de un polinucleótido y el polinucleótido resultante
extendido puede experimentar incorporaciones posteriores de
nucleótidos o análogos de nucleótido.
"Análogo de internucleótido" significa un
análogo del éster de fosfato de oligonucleótidos que incluye, pero
no se limita a, alquilfosfonatos, metilfosfonatos, fosforamidatos,
fosfotriésteres, fosforotioatos, fosforoditioatos y fosforoamidatos.
Los análogos de internucleótido incluyen también análogos sin
fosfato en el que el grupo azúcar/fosfato está sustituido por
enlaces amida, tales como las unidades
2-aminoetilglicina, denominadas PNA (Nielsen, et
al., (1991) "Sequence selective recognition of DNA by strand
displacement with a thymidine-sustitued
polyamide", Science 254:1497-1500).
"Secuencia diana" significa un
polinucleótido, ADN o ARN, de una cadena o de doble cadena que es
objeto de hibridación con un cebador o una sonda, actividad
enzimática o detección.
"Espectralmente resoluble" significa, en
relación con un conjunto de colorantes fluorescentes, que las bandas
de emisión de fluorescencia de los respectivos colorantes son
suficientemente distintas, es decir, suficientemente no solapantes,
de los colorantes, bien solas o conjugadas con otros compuestos
(marcadas), son distinguibles una de otra en bases a sus señales de
fluorescencia utilizando sistemas de fotodetección estándar tales
como los fotodetectores que emplean una serie de filtros de paso de
banda y de tubos fotomultiplicadores, dispositivos acoplados con
carga (CCD), espectrógrafos, etc. (Wheeles et al., (1985)
Flow Cytometry: Instrumentation and Data Analysis, págs.
21-76. Academic Press, Nueva York). Preferentemente,
todos los colorantes que comprenden un conjunto de colorantes
resolubles espectralmente son excitables por un solo foco de
luz.
"Igualados en movilidad" se refiere a un
conjunto de colorantes fluorescentes que, cuando se utilizan para
marcar polinucleótidos de longitudes iguales, proporcionan
polinucleótidos marcados de forma diferente con movilidades
electroforéticas sustancialmente similares. Típicamente, las
movilidades electroforéticas relativas de los polinucleótidos
marcados con una sere de colorantes igualados en movilidad variará
en menos de aproximadamente medio nucleótido. Preferentemente, los
colorantes igualados en movilidad se resuelven espectralmente, tal
como se definió anteriormente.
"Fotoestabilidad relativa" significa la
estabilidad química de colorantes fluorescentes en comparación con
una referencia patrón, 5-carboxifluoresceína, medida
por exposición a la luz blanca de alta intensidad con medición de
las muestras de colorante restantes a su máxima absorción. Las
unidades de densidad óptica iguales del colorante de la prueba y la
referencia se someten en paralelo a la luz, como prueba correlativa
de estabilidad bajo la fluorescencia inducida por el láser común al
secuenciado automático del ADN y a las aplicaciones analíticas de
los fragmentos.
En un primer aspecto, la presente invención
comprende una nueva clase de compuestos con anillo de xanteno, de
tipo fluoresceína, según la estructura I:
sustituidos con al menos un heterociclo con
nitrógeno pobre en electrones unido al sistema de anillo de
fluoresceína en R^{1}, R^{2}, R^{3}, R^{4}, R^{5} ó
R^{7}. El heterociclo con nitrógeno pobre en electrones puede
estar unido al sistema del anillo de fluoresceína por un enlace
carbono-carbono o por un enlace
carbono-nitrógeno. Todas las estructuras moleculares
proporcionadas mediante esta descripción se pretende que abarquen no
solamente la estructura electrónica exacta presentada, sino que
incluyan además todas las estructuras resonantes, tautómeros,
enantiómeros, diastereoisómeros y los estados de protonación de las
mismas.
R^{1}, cuando se considera solo, es H, F, Cl,
alquilo (C_{1}-C_{6}), alquilo
(C_{1}-C_{6}) sustituido, alcoxi
(C_{1}-C_{6}), sulfonato, sulfona, amino,
iminio, amido, nitrilo, grupo con enlace reactivo, fenilo, fenil
sustituido, arilo, aril sustituido o heterociclo o cuando se
considera conjuntamente con R^{7} es benzo o heterociclo.
R^{2}, cuando se considera solo, es H, F, Cl,
alquilo (C_{1}-C_{6}), alquilo
(C_{1}-C_{6}) sustituido, alcoxi
(C_{1}-C_{6}), sulfonato, sulfona, amino,
iminio, amido, nitrilo, grupo con enlace reactivo, fenilo, fenil
sustituido, arilo, aril sustituido o heterociclo.
R^{3}, cuando se considera solo, es H, F, Cl,
alquilo (C_{1}-C_{6}), alquilo
(C_{1}-C_{6}) sustituido, alcoxi
(C_{1}-C_{6}), sulfonato, sulfona, amino,
iminio, amido, nitrilo, grupo con enlace reactivo.
R^{4}, cuando se considera solo, es H, F, Cl,
alquilo (C_{1}-C_{6}), alquilo
(C_{1}-C_{6}) sustituido, alcoxi
(C_{1}-C_{6}), sulfonato, sulfona, amino,
iminio, amido, nitrilo, grupo con enlace reactivo, fenilo, fenil
sustituido, arilo, aril sustituido o heterociclo o cuando se
considera conjuntamente con R^{5} es benzo o heterociclo.
R^{5}, cuando se considera solo, es H, F, Cl,
alquilo (C_{1}-C_{6}), alquilo
(C_{1}-C_{6}) sustituido, alcoxi
(C_{1}-C_{6}), sulfonato, sulfona, amino,
iminio, amido, nitrilo, grupo con enlace reactivo, fenilo, fenil
sustituido, arilo, aril sustituido o heterociclo o cuando se
considera conjuntamente con R^{4} es benzo o heterociclo.
R^{7}, cuando se considera solo, es H, F, Cl,
alquilo (C_{1}-C_{6}), alquilo
(C_{1}-C_{6}) sustituido, alcoxi
(C_{1}-C_{6}), sulfonato, sulfona, amino,
iminio, amido, nitrilo, grupo con enlace reactivo, fenilo, fenil
sustituido, arilo, aril sustituido o heterociclo o cuando se
considera conjuntamente con R^{1} es benzo o heterociclo.
R^{6} se selecciona de entre el grupo
constituido por alquilo (C_{1}-C_{6}), alqueno
(C_{1}-C_{6}), alquino
(C_{1}-C_{6}), aromático heterocíclico, fenilo y
fenil sustituido con la estructura II:
en la que X^{1}, X^{2}, X^{3}, X^{4} y
X^{5} considerados por separado son H, Cl, F, alquilo
(C_{1}-C_{6}), alqueno
(C_{2}-C_{6}), alquino
(C_{2}-C_{6}), CO_{2}H, SO_{3}H, CH_{2}OH
o un grupo con enlace
reactivo.
Los colorantes particularmente preferidos según I
incluyen cuando R^{4} considerado junto con R^{5} forma un
anillo fusionado, p. ej.: benzo. Asimismo se prefiere cuando R^{1}
considerado conjuntamente con R^{7} forma un anillo fusionado, p.
ej.: benzo.
Los colorantes preferidos incluyen cuando
R^{1}, R^{2}, R^{3} y R^{4}, considerados cada uno por
separado, son fenilo y fenil sustituido, naftilo, naftil sustituido,
flúor, cloro, 2-piridilo,
3-piridilo, 2-quinolilo ó
3-quinolilo. R^{5} y R^{7}son preferentemente
hidrógeno.
Otra clase de colorantes particularmente
preferidos según II incluye aquellos en los que el fenil sustituido
tiene la estructura IIa:
Una forma de realización preferida de IIa es
cuando uno de X^{3} y X^{4} es un grupo con enlace reactivo y el
otro es hidrógeno. Una forma de realización particularmente
preferida de IIa es cuando uno de X^{3} y X^{4} es carboxilo y
el otro es hidrógeno.
Varios aspectos de la invención descritos
anteriormente permiten una o más de las importantes ventajas
siguientes sobre los compuestos colorantes fluorescentes conocidos
útiles para la detección fluorescente múltiple: (1) los espectros de
emisión de los compuestos de colorante del asunto se pueden modular
mediante variaciones menores en el tipo y situación de los
sustituyentes heterocíclico y/o arilo, permitiendo la creación de
series de colorantes con características similares, sin embargo
espectros de emisión de fluorescencia resolubles espectralmente; (2)
los compuestos colorantes del asunto se pueden unir facilmente a
sustratos sin comprometer sus propiedades de fluorescencia
favorables; (3) los compuestos colorantes del asunto tienen una
anchura de banda estrecha, es decir, la anchura de la banda de
emisión presenta una anchura total a la mitad de la intensidad de
emisión máxima (FWHM) inferior a aproximadamente 45 nm; (4) los
compuestos colorantes del asunto son muy solubles en la solución
acuosa tamponada a la vez que conservan un alto rendimiento
cuántico; (5) los compuestos colorantes del asunto son relativamente
fosfatables; y (6) los compuestos colorantes del asunto tienen
coeficientes de extinción relativamente grandes, es decir, mayores
de aproximadamente 50.000 (Benson et al.
"Aromatic-substituted xanthene dyes", patente
U.S. nº 6.008.379, concedida el 28 de dic. de 1999). Las anchuras de
la banda de emisión próxima, ejemplificadas por FWHM, son deseables
en la medida que facilitan la resolución espectral en una mezcla de
sustancias marcada con más de un (una serie) colorante
fluorescente. La fotoestabilidad es una propiedad importante en
estos sustratos, p. ej.: los polinucleótidos, marcados con los
colorantes de la invención pueden estar sometidos a luz de láser
intensa para producir fluorescencia para la detección. El
fotoblanqueamiento u otros mecanismos de degradación química
disminuyen o impiden la detección de sustratos marcados con
colorantes con menos de la fotoestabilidad óptima.
La Figura 11 presenta una muestra representativa
de heterociclos con nitrógeno pobres en electones que se pueden
utilizar como sustituyentes en los colorantes de fluoresceína de la
invención. Estos sustituyentes con heterociclo presentan efectos
directos en importantes propiedades espectrales de los colorantes de
fluoresceína de la presente invención tales como: (i) excitación,
emisión y absorción máxima y espectros, (ii) fotoestabilidad, (iii)
eficacia cuántica y (iv) eficacia en la transferencia de
energía.
Los heterociclos con nitrógeno pobres en
elctrones pueden tener un anillo con 5 ó 6 elementos que lleva uno o
más átomos de nitrógeno en el anillo (Figura 11). El anillo de 5 ó 6
elementos puede estar fusionado a un segundo anillo aromático, p.
ej.: un anillo benzo o benzo-sustituido o un anillo
saturado, p. ej.: ciclopentilo o ciclohexilo. El heterociclo puede
llevar otros heteroátomos, p. ej.: oxígeno o azufre en el sistema
del anillo.
Los heterociclos con nitrógeno con electrones
pobres incluyen, pero no se limitan a los de la Figura 11 y
2-piridilo, 3-piridilo,
4-piridilo, 2-quinolilo,
3-quinolilo, 4-quinolilo,
2-imidazol, 4-imidazol,
3-pirazol, 4-pirazol, piridazina,
pirimidina, pirazina, cinolina, ftalazina, quinazolina,
quinoxalina, 3-(1,2,4-N)-triazolilo,
5-(1,2,4-N)-triazolilo,
5-tetrazolilo, 4-(1-O,
3-N)-oxazol,
5-(1-O,3-N)-oxazol,
4-(1-S,3-N)-oxazol, 5-(1-S,
3-N)-oxazol, 2-benzoxazol,
2-benzotiazol, benzotriazol,
4-(1,2,3-N)-benzotriazina y benzimidazol. El
heterociclo puede estar unido al sistema de anillo de xanteno
directamente mediante un enlace con un átomo de carbono del anillo
de heterociclo. Por otra parte, el heterociclo puede estar unido al
sistema del anillo de xanteno mediante un conectador insaturado que
extiende la deslocalización de la aromaticidad entre el heterociclo
y el sistema de anillo de xanteno. Los conectadores que permiten la
deslocalización electrónica extensiva incluyen, pero no se limitan
a: (i) olefínicos; -CR=CR-, (ii) poliolefínicos;
-(CR=CR)_{n}- en el que n es 2 a 10, (iii) acetilénico;
-C\equivC-, (iv) poliacetilénico; -(C\equivC)_{n}- en
la que n es 2 a 10, (v) escuarina, y (vi) otros conectadores
conjugados cíclicos. R se selecciona de entre el grupo constituido
por, alquilo (C_{1}-C_{6}), halógeno, flúor,
cloro, CN, CF_{3}, arilo y aril sustituido. La geometría de los
enlaces olefínicos puede ser cis o trans, E ó Z.
En otro aspecto, la presente invención comprende
compuestos colorantes por transferencia de energía que incorporan
compuestos colorantes de fluoresceína de estructura I sustituidos
con heterociclo con nitrógeno pobre en electrones. En general, los
colorantes por transferencia de energía de la presente invención
incluyen un colorante donante que absorbe luz en una primera
longitud de onda y emite energía de excitación en respuesta, un
colorante aceptor que es capaz de absorber la energía de excitación
emitida por el colorante donante y que fluorece en respuesta en una
segunda longitud de onda y un conectador que une el colorante
donante al colorante aceptor, siendo eficaz el conectador para
facilitar una transferencia de energía eficaz entre los colorantes
donante y aceptor y para mantener un rendimiento cuántico de emisión
elevado del colorante aceptor (Lee, et al. "Energy transfer
dyes with enhanced fluorescence", patente U.S. nº 5.800.996,
concedida el 1 de septiembre de 1998; Lee, et al. "Energy
transfer dyes with enhanced fluorescence", patente U.S. nº
5.945.526, concedida el 31 de agosto de 1999; Mathies et al.
"Fluorescents labels and their use in separations", patente
U.S. nº 5.654.419, concedida el 5 de agosto de 1997). En el
colorante por transferencia de energía de la invención, al menos uno
de los colorantes aceptores del donante es un colorante de
fluoresceína sustituido con heterociclo con nitrógeno pobre en
electrones.
Los colorantes por transferencia de energía
presentan ventajas para su utilización en la detección simultánea de
sustratos marcados múltiples en una mezcla, tal como el secuenciado
del ADN. Se puede utilizar un solo colorante donante en una serie de
colorantes por transferencia de energía de modo que cada par de
colorantes tenga una fuerte absorción a una longitud de onda común.
Variando a continuación el colorante aceptor en la serie por
transferencia de energía, los colorantes aceptores se pueden
resolver espectralmente por su respectiva emisión máxima. Los
colorantes por transferencia de energía también proporcionan un
desplazamiento de Stokes eficaz mayor que los colorantes sin
transferencia de energía. El desplazamiento de Stokes es la
diferencia entre la excitación máxima, la longitud de onda a la que
el colorante donante absorbe la máxima cantidad de luz y la emisión
máxima, la longitud de onda a la que el aceptor emite la máxima
cantidad de luz.
En una forma de realización preferida, el
conectador entre el colorante donante y el colorante aceptor incluye
un grupo funcional que da al conectador cierto grado de rigidez
estructural, tal como un alqueno, dieno, alquino, un anillo con
cinco y seis elementos con al menos un enlace insaturado o una
estructura en anillo fusionada. El colorante donante y el colorante
aceptor del colorante por transferencia de energía pueden estar
unidos por conectadores que poseen las estructuras:
\vskip1.000000\baselineskip
en las que n es 1 ó
2.
Los puntos con enlace del conectador entre el
colorante donante y el colorante aceptor de un colorante por
transferencia de energía pueden estar en cualquier posición R^{1}
a R^{7}, en la que uno o ambos colorantes donador y aceptor es un
colorante de la presente invención. Los puntos de enlace preferidos
incluyen R^{2}, R^{3}, X^{3} y X^{4}.
El compuesto colorante por transferencia de
energía está unido covalentemente a un sustrato mediante un
conectador. El conectador puede ser alquildiilo
(C_{1}-C_{12}) o arildiilo
(C_{6}-C_{20}) y que lleva grupos funcionales
incluyendo amida, carbamato, urea, tiourea, fosfato, fosforotioato y
similares. Los conectadores preferidos incluyen
1,2-etildiilo y 1,6-etildiilo. Los
puntos de enlace del conectador entre el colorante por transferencia
de energía y el sustrato pueden estar en cualquier posición R^{1}
a R^{7} en el colorante por transferencia de energía en el que uno
o ambos de los colorantes donador y acertador es un colorante de la
presente invención. Los puntos de enlace preferidos incluyen
R^{2}, R^{3}, X^{3} y X^{4}. Cuando el sustrato es un
nucleósido o nucleótido, un punto de enlace preferido está en la
nucleobase. Cuando el sustrato es un oligonucleótido, los puntos de
enlace preferidos incluyen los terminales 3' y 5'. Cuando el
sustrato es un péptido o proteína, los puntos de enlace preferidos
incluyen los terminales amino y carboxilo.
Varios procedimientos de síntesis están
disponibles para la síntesis de los colorantes de fluoresceína de la
invención. Un procedimiento preferido de síntesis de productos
intermedios es mediante la reacción de acoplamiento del boronato de
Suzuki catalizada por paladio por la que un ácido aril bórico se
acopla con un haluro de arilo para dar un producto de biarilo con
regioselectividad (Zhang, et al. (1998) "Base and cation
effects on the Suzuki cross-coupling of bulky
arilboronic acid with halopyridines: synthesis of
pyridilphenols", J. Org. Chem. 63:6886-90;
Martin et al. (1993) "Palladium-catalysed
cross coupling reactions of organoboronic acids with organic
electrophiles", Acta Chemica Scan.
47:221-30; Aliplantis et al. (1994)
"Observation of catalytic intermediates in the Suzuki reaction by
electrospray mass spectrometry", J. Am. Chem. Soc.
116:6985-86; Thompson et al. (1984) "A
general synthesis of 5-arylnicotinates", J.
Org. Chem. 49:5237-43).
En la Figura 1 se sintetiza el sustrato de
ciclación 5. La reacción de Suzuki se itera, en primer lugar por
acoplamiento del ácido
1,3-dimetoxifen-2-il
bórico con 2-bromotolueno con catalizador
tetrakis(trifenilfosfina) paladio para dar el compuesto 1
bifenilo. La bromación regioselectiva de 1 dio 2, seguida de la
reacción de Suzuki con el ácido
piridina-3-bórico en catalizador de
paladio para dar 3. La desmetilación de 3 con ácido hidrobrómico y
ácido acético dio 4, seguida de acilación con anhídrido
2,5-diclorotrimelítico para dar 5.
El compuesto 8 naftilo bromado sirve de producto
intermedio común para la síntesis de los productos intermedios de
ciclación 11 y 12, ilustrada en la Figura 2. El acoplamiento de
Suzuki del ácido piridina-3-bórico y
del ácido tol-2-il bórico dio 9 y
10 respectivamente, que se desmetilaron con 11 y 12.
La ciclación de una mezcla equimolar de los
productos intermedios 5 y 11 en ácido metansulfónico a 100ºC dió un
rendimiento del 30% del colorante 13 (Figura 3) después de la
cromatografía (Ejemplo 13). Asimismo, se formó 14 por cristalización
de 5 con 12 (Ejemplo 14). El colorante 15 (Figura 4) se formó por
cristalización de 5 y
2-fluoro-1,3-dihidroxinaftaleno
(Benson et al. "Asymmetric benzoxanthene dyes", patente
U.S. nº 5.840.999, concedida el 24 de noviembre de 1998). El
colorante 16 simétrico (Figura 4) se sintetizó por doble ciclación
de dos equivalentes molares de 4 y un equivalente molar de anhídrido
2,5-diclorotrimelítico (Ejemplo 16).
Se sintetizaron por los mismos procedimientos,
los colorantes de fluoresceína 19, 22 (Figura 5), 25 (Figura 6), 28
(Figura 7), 33 (Figura 8), 36 (Figura 9) y 41 (Figura 10) (Ejemplos
17 a 41) sustituidos con heterociclo con nitrógeno pobre en
electrones.
La presente invención comprende reactivos
marcadores en los que los colorantes de fluoresceína sustituidos con
heterociclo con nitrógeno pobre en electrones están en forma
reactiva para reaccionar con los sustratos. En otro aspecto, la
presente invención comprende sustratos marcados o conjugados con los
colorantes de fluoresceína de la invención, es decir, de estructura
I. Las sustancias pueden ser prácticamente cualquier molécula o
sustancia con la que se puedan conjugar los colorantes de la
invención, incluyendo a título de ejemplo y no de limitación,
proteínas, polipéptidos, polisacáridos, nucleósidos, nucleótidos,
polinucleótidos, lípidos, soportes sólidos, polímeros orgánicos e
inorgánicos y combinaciones y montajes de los mismos, tales como
cromosomas, núcleos, células vivas (p. ej.: bacterias u otros
microorganismos, células de mamíferos, tejidos, etc.), y similares.
Los colorantes se conjugan con el sustrato mediante un conectador
opcional por varios medios, incluyendo la atracción hidrófoba,
atracción iónica y enlace covalente. Preferentemente, los colorantes
se conjugan con el sustrato mediante enlace covalente.
El marcaje procede normalmente de mezclar un
colorante fluorescente reactivo apropiado y un sustrato que se debe
conjugar en un disolvente adecuado en el que ambos son solubles,
utilizando procedimientos bien conocidos en la técnica (Harmanson,
Bioconjugate Technics, Academic Press, San Diego, CA. págs.
40-55, 643-71, (1996)), seguido de
separación del conjugado de cualquiera de los materiales de partida
o de subproductos indeseables. El conjugado del colorante se puede
almacenar seco o en solución para su utilización posterior.
Los colorantes de fluoresceína de la invención
pueden incluir un grupo conectador reactivo en una de las posiciones
del sustituyente, R^{1} a R^{5}, R^{7}, X^{1} a X^{5}, o
enlace covalente del colorante con otra molécula, es decir, un
sustrato. Los grupos con enlace reactivo son grupos en el colorante
y en el sustrato que son capaces de formar un enlace covalente.
Típicamente el colorante tiene grupo(s) funcional(es)
electrófilo(s) capaces de reaccionar con grupo(s)
funcional(es) nucleófilo(s) en el sustrato. Ejemplos
de sustratos nucleófilos incluyen alcoholes, alcóxidos, aminas,
hidroxilaminas y tioles. La selección de los grupos que se unen al
reactivo utilizada para unir el colorante al sustrato depende
típicamente del grupo funcional complementario en el sustrato que se
ha de conjugar. Ejemplos de grupos con enlace reactivos electrófilos
incluyen el éster succinimidílico, isotiocianato, cloruro de
sulfonilo, éster de sulfonato, haluro de sililo,
2,6-diclorotriazinilo, éster de pentafluorofenilo,
fosforamidita, maleimida, haloacetilo, epóxido, haluro de alquilo,
haluro de alilo, aldehído, cetona, acilazida, anhídrido y
yodoacetamida. En el sustrato puede estar disponible un solo grupo
con enlace reactivo (típico en los polisacáridos) o puede haber
varios grupos (p. ej.: aminas, tioles, alcoholes, fenoles), como es
típico en las proteínas. Un sustrato conjugado puede estar conjugado
con más de un colorante, que puede ser igual o diferente, o con un
sustrato que está además modificado por un hapteno. Aunque se puede
obtener alguna selectividad mediante control cuidadoso de las
condiciones de reacción, la selectividad del marcaje se obtiene
mejor por selección de un colorante reactivo apropiado.
Un grupo con enlace reactivo preferido es el
éster N-hidroxisuccininidílico (NHS) de un grupo
carboxilo sustituyente del colorante de fluoresceína. La forma éster
NHS del colorante es un reactivo de marcaje preferido. El éster NHS
del colorante se puede formar previamente, aislar, purificar y/o
caracterizar, o se puede formar in situ y reaccionar con un
grupo nucleófilo de un sustrato, tal como un oligonucleótido, un
nucleótido, un péptido o similares. Típicamente, la forma carboxilo
de los colorantes de la presente invención, p. ej.: los compuestos
colorantes de la Tabla 1, reaccionan con un reactivo de
carbodiimida, p. ej.: diciclohexilcarbodiimida,
diisopropilcarbodiimida o un reactivo de uronio, p. ej.: HBTU
(O-benzotriazol-1-il)-hexafluorofosfato
de N, N, N', N'-tetrametiluronio) o HATU
(O-(7-azabenzotriazol-1-il)-hexafluorofosfato
de N, N, N', N'-tetrametiluronio) y un activador tal
como 1-hidroxibenzotriazol (HOBt) y
N-hidroxi-succinimida para dar el
éster NHS del colorante.
Las posiciones preferidas del sustituyente para
los ésteres NHS en los colorantes de fluoresceína de la invención
son X^{3} y X^{4} (Ia). Un ejemplo representativo de un éster
NHS es la estructura Ib:
Otro grupo preferido con enlace reactivo es una
forma de fosforamidita de los colorantes de la presente invención.
Los reactivos del colorante fosforamidita son particularmente útiles
para la síntesis automática de oligonucleótidos marcados con los
colorantes de la invención. Los oligonucleótidos se sintetizan
generalmente sobre soportes sólidos por el procedimiento de la
fosforamidita utilizando reactivos de nucleósido de fosforamidita
(Caruthers, M. y Beaucage, S. "Phosphoramidite compounds and
processes", patente U.S. nº 4.415.732, concedida el 15 de
noviembre de 1983; Caruthers, M. y Matteucci, M. "Process for
preparing polynucleotides", patente U.S. nº 4.458.066, concedida
el 3 de julio de 1984; Beaucage, S. y Iyer, R. (1992) "Advances in
the synthesisof oligonucleotides by the phosphoramidite
approach", Tetraedron 48:2223-2311). Los
reactivos del colorante fosforamidita pueden ser nucleosídicos o no
nucleosídicos y se pueden utilizar convenientemente para marcar
polinucleótidos sintéticos o análogos de polinucleótido en su
terminal 3', terminal 5' y/o en una o más posiciones internas. Las
formas no nucleosídicas de los reactivos del colorante fosforamidita
presentan la estructura general III
en la que DYE es una forma protejida o no
protejida del colorante I, incluyendo el colorante por transferencia
de energía. L es un conectador. R^{11} y R^{12} considerados
por separado son alquilo (C_{1}-C_{12}) alqueno,
arilo y cicloalquilo que contienen hasta 10 átomos de carbono, o
R^{11} y R^{12} considerados conjuntamente con el átomo de
nitrógeno forman un heterociclo con nitrógeno saturado. R^{13} es
un grupo protector con éster de fosfito que impide la extensión
indeseada del oligonucleótido. En general, R^{13} es estable a las
condiciones de síntesis del oligonucleótido pero es capaz de ser
eliminado de un producto oligonucleótido sintético con un reactivo
que no afecta desfavorablemente la totalidad del oligonucleótido o
del colorante. Varios grupos de éster de fosfito con estas
características son bien conocidos en la técnica. Preferentemente,
R^{13} es metilo; 2-cianoetilo,
-CH_{2}CH_{2}CN y 2-(4-nitrofenil)etilo,
-CH_{2}CH_{2}(p-NO_{2}Ph). Las formas de realización
preferidas de los reactivos con colorante de fosforamidita son
cuando: (i) R^{11} y R^{12} son cada uno isopropilo, (ii)
R^{11} y R^{12} considerados conjuntamente son morfolino,
(iii) L es alquilo (C_{1}-C_{12}), (iv) R^{13}
es 2-cianoetilo y (v) DYE está unido a
R^{6}mediante un conectador. Los reactivos con colorante de
fosforamidita III efectúan el marcaje de un sustrato con un solo
colorante fluorescente de la invención. Cuando el sustrato es un
oligonucleótido, el colorante se unirá al terminal 5' del
oligonucleótido, como consecuencia de la dirección 3' a 5' de la
síntesis. Otros reactivos con colorante de fosforamidita,
nucleosídicos y no nucleosídicos permiten el marcaje en otros puntos
de un oligonucleótido, p. ej.: terminal 3', nucleobase, enlace
internucleótido, azúcar. El marcaje en los puntos de la nucleobase,
el enlace internucleótido y el azúcar permite el marcaje interno y
múltiple con colorantes
fluorescentes.
Cuando reacciona con un grupo hidroxilo, p. ej.:
el terminal OH en 5' de un enlace oligonucleótido a un soporte
sólido y en activación ácida suave, el reactivo III del colorante de
fosforamidita reacciona para formar un grupo fosfito de
internucleótido que se oxida a continuación a un grupo fosfato de
internucleótido. En algunos casos, el colorante puede contener
grupos funcionales, p. ej.: oxígenos fenólicos como en la estructura
I, que requiere protección bien durante la síntesis del reactivo del
colorante de fosforamidita o durante su utilización posterior en
moléculas marcadas tales como oligonucleótidos. El/los
grupo(s) protector(es) utilizado(s)
dependerá(n) de la naturaleza de los grupos funcionales y será
evidente para los expertos en la técnica (Greene, T. y Wuts, P.
Protective Groups in Organic Synthesis, 2ª ed. John Wiley
& Sons, Nueva York, 1991). En general, los grupos protectores
utilizados deberían ser estables en condiciones ácidas (p. ej.:
ácido tricloroacético, ácido dicloroacético) empleados generalmente
en la síntesis del oligonucleótido para eliminar los grupos
protectores 5'-hidroxilo (p. ej.:
dimetoxitritilo) y lábiles en condiciones básicas (hidróxido de
amonio, metilamina acuosa) utilizados para desproteger y/o escindir
oligonucleótidos sintéticos de los soportes sólidos.
Los reactivos estables del colorante de
fosforamidita se pueden formar por protección inicial de los
oxígenos del anillo de xanteno de estructura I, típicamente
esterificación, p. ej.: acilación como ésteres de pivalato
(R=tBu) o benzoato (R=Ph). La esterificación produce
lactonización de estructuras Ia que da el reactivo en estado
protegido, no fluorescente, p. ej.: estructura Ic:
Cuando uno de X^{3} y X^{4} es hidrógeno y el
otro es carboxilo, el colorante se puede transformar en un reactivo
no nucleosídico de marcaje con colorante de fosforamidita, p. ej.:
Id, mediante reacciones conocidas, tal como la activación del
carboxilo, amidación con 6-amino,
1-hexanol y fosfitación de hidroxilo con fosfito de
(diisopropilamino)-cianoetilo (Theisen et al.
(1992) "Fluorescent dye phosphoramidite labelling of
oligonucleotides", en Nucleic Acid Symposium Series nº 27,
Oxford University Press, Oxford, págs. 99-100).
Los colorantes de la invención se pueden unir
también covalentemente a soportes sólidos para la síntesis
automática de oligonucleótidos (Mullah, B. y Andrus, A. "Solid
support reagents for the direct synthesis of
3'-labelled polynucleotides", patente U.S. nº
4.458.066, concedida el 3 de julio de 1984). En una forma de
realización, el colorante está unido a un conectador que tiene una
unión a un soporte sólido, p. ej.: vidrio poroso controlado (Nelson,
et al. (1992) "Oligonucleotide labeling methods 3. Direct
labeling of oligonucleotides employing a novel,
non-nucleosidic,
2-aminobutyl-1,3-prppanediol
backbone", Nucl. Acids Res. 20:6253-59;
Nelson P. "Multifunctional controlled pore glass reagent for solid
phase oligonucleotide synthesis", patente U.S. nº 5.141.813,
concedida el 25 de agosto de 1992) o a poliestireno (Andrus, et
al. "Automated system for polynucleotide synthesis and
purification", patente U.S. nº 5.047.524, concedida el 10 de
septiembre de 1991 y patente U.S. nº 5.262.530. concedida el 16 de
noviembre de 1993) y el grupo funcional inestable en ácido para la
extensión con reactivos de nucleósido de fosforamidita. Después de
la escisión y de la desprotección, el oligonucleótido marcado puede
llevar un colorante de la presente invención en el terminal 3'.
Una clase preferida de sustratos marcados incluye
los conjugados de nucleósidos y nucleótidos que están marcados con
los colorantes de fluoresceína de la invención. Dichos nucleósidos y
nucleótidos marcados son particularmente útiles para marcar los
polinucleótidos formados en la síntesis enzimática, p. ej.: los
5'-trifosfatos de nucleótido marcados utilizados en
el contexto de la amplificación por PCR, el secuenciado del
polinucleótido de tipo Sanger y las reacciones de traducción por
cortes.
El colorante se puede conjugar bien con el azúcar
o con la nucleobase. En una forma de realización preferida, el
compuesto es un
ribonuclósido-5'-trifosfato de
terminación, "terminador", en el que el colorante se une
covalentemente al grupo nucleobase. Cuando se utilizan
conjuntamente con los
2'-desoxirribonucleosido-5'-trifosfatos,
"dNTP" o los ribonucleosido- 5'-trifosfatos,
"NTP", las enzimas polimerasas apropiadas y los polinucleótidos
diana cebados, tales como los terminadores se pueden utilizar para
generar series de fragmentos de polinucleótido terminados, marcados
con colorante de fluoresceína sustituido con heterociclo con
nitrógeno pobre en electrones mediante síntesis enzimática mediada
por la diana para aplicaciones tales como el secuenciado del ADN.
Los nucleósidos y los nucleótidos se pueden marcar en puntos en el
azúcar o en los grupos de nucleobases. Los puntos del marcaje de la
nucleobase preferidos incluyen el C-8 de una
nucleobase de purina, el C-7 o el
C-8 de una nucleobases de desazapurina y la posición
5 de una nucleobase de pirimidina. Entre un nucleósido o un
nucleótido y un colorante, se puede unir un conectador a un
colorante en cualquiera de las posiciones R^{1} a R^{7}.
El nucleósido o nucleótido marcado puede ser
enzimáticamente incorporable y enzimáticamente extensible. Los
nucleósidos o nucleótidos marcados con colorantes de la presente
invención pueden presentar la estructura IV:
en la que DYE es una forma protegida o no
protegida de un colorante I, incluyendo el colorante por
transferencia de energía. B es una nucleobase, p. ej.: uracilo,
timina, citosina, adenina, 7-desazaadenina, guanina
y 8-desazaguanosina. R^{8} es H, monofosfato,
difosfato, trifosfato, tiofosfato o análogo de fosfato. R^{9} y
R^{10}, cuando se consideran por separado, son cada uno
independientemente H, F y un grupo que bloquea la polimerización
dirigida a la diana mediada por polimerasa o cuando se consideran
conjuntamente forman
2'-3'-dideshidroxirribosa.
El conectador L puede ser:
---C\equivC---CH_{2}---(OCH_{2}CH_{2})_{n}---NH---
\uelm{C}{\uelm{\dpara}{O}}---
en el que n es 0, 1 ó
2.
Otra clase preferida de sustratos marcados
incluyen los conjugados de los oligonucleótidos que están marcados
con los colorantes de fluoresceína de la presente invención. Dichos
polinucleótidos o análogos marcados son útiles en numerosos
contextos importantes, incluyendo como cebadores de secuenciado de
ADN, cebadores de PCR, sondas de hibridación de oligonucleótido,
sondas de ligadura de oligonucleótido, sondas de
5'-exonucleasa marcada dos veces (TaqMan^{TM}) y
similares (Fung, et al. "Amino-derivatized
phosphite and phosphate linking agents, phosphoramidite precursors,
and useful conjugated thereof", patente U.S. nº 4.757.141,
concedida el 12 de julio de 1988; Andrus, A. "Chemical methods for
5' non-isotopic labelling of PCR probes and
primers" (1995) en PCR 2: A Practical Approach, Oxford
University Press, Oxford, págs. 39-54; Hermanson,
(1996) Bioconjugate Techniques, Academic Press, San Diego,
CA. págs. 40-55, 643-71). Un
oligonucleótido marcado puede presentar la estructura V:
en la que el oligonucleótido comprende 2 a 100
nucleótidos. DYE es un colorante fluorescente I, que incluye el
colorante por transferencia de energía. B es una nucleobase, p. ej.:
uracilo, timina, citosina, adenina, 7-desazaadenina,
guanina y 8-desazaguanosina. L es un conectador.
R^{10} es H, OH, haluro, azida, amina, alquilamina, alquil
(C_{1}-C_{6}), alilo, alcoxi
(C_{1}-C_{6}), OCH_{3} o OCH_{2}CH=CH_{2}.
R^{15} es H, fosfato, fosfodiéster de internucleótido o análogo de
internucleótido. R^{16} es H, fosfato, fosfodiéster de
internucleótido o análogo de internucleótido. En esta forma de
realización, la estructura V, el oligonucleótido marcado con la
nucleobase puede llevar colorantes múltiples de la invención unidos
por las
nucleobases.
El oligonucleótido V marcado con la nucleobase
puede estar formado por: (i) incorporación enzimática de reactivos
IV de nucleótido incorporable enzimáticamente, en los que R^{8} es
trifosfato, por una ADN polimerasa o ligasa y (ii) acoplamiento del
reactivo VI de nucleósido con colorante de fosforamidita mediante
síntesis automática.
En general, si el oligonucleótido marcado se
prepara por síntesis enzimática, se puede utilizar el procedimiento
siguiente. Se desnaturaliza un ADN diana y se hibrida con con el ADN
diana. Se añade a la diana cebada una mezcla de nucleótidos o
análogos de nucleótido capaces de soportar la extensión continua
enzimática dirigida a la diana de la diana cebada (p. ej.: una
mezcla que incluye dGTP, dATP, dCTP y dTTP o dUTP). Al menos una
fracción de los nucleótidos está marcada con un colorante I o son
terminadores marcados, tal como se describió anteriormente. A
continuación, se añade un enzima polimerasa a la mezcla en
condiciones en que la enzima polimerasa es activa. Se forma un
oligonucleótido marcado por incorporación de los nucleótidos
marcados o de los terminadores durante la síntesis de la cadena
mediada por polimerasa.
En un procedimiento de síntesis enzimático
alternativo, se utilizan dos cebadores en lugar de uno: uno
complementario a la cadena (+) de la secuencia diana y otro
complementario a la cadena (-) de la secuencia diana, la polimerasa
es una polimerasa termoestable y la temperatura de reacción está en
ciclo entre una temperatura de desnaturalización y una temperatura
de extensión, amplificando exponencialmente de este modo un
complemento marcado a la secuencia diana por PCR (Innis, et
al. (1990) PCR Protocols, eds., Academic Press). Uno o
ambos cebadores puede estar marcado con un colorante de la
invención. Por otra parte, uno o más de los
5'-trifosfatos de nucleótido pueden estar marcados
con un colorante de la invención. Cada esquema de marcaje produce un
producto de amplificación de ADN que lleva uno o más colorantes de
la invención.
El marcaje interno de oligonucleótidos con
colorantes fluorescentes de la invención se puede realizar con
reactivos de colorante de fosforamidita nucleósido de estructura
general VI:
en la que DYE es una forma protegida o
no-protegida de colorante I. Las aminas exocíclicas
y otros grupos funcionales de la nucleobase B pueden necesitar
protección durante la síntesis del reactivo de colorante de
fosforamidita nucleósido y/o durante su posterior utilización para
sintetizar oligonucleótidos marcados. El/los grupo(s)
protector(es)
particular(es) seleccionado(s) dependerá(n) de la identidad de la nucleobase o del análogo de nucleobase y será evidente para los expertos en la técnica. Por ejemplo, las aminas exocíclicas de la adenina y citosina se pueden proteger con benzoilo (bz) y la amina exocíclica de la guanina se puede proteger con dimetilformamida (dmf) o isobutirilo (ibu) utilizando procedimientos convencionales. Preferentemente, la nucleobase se protege con grupos que se eliminan fácilmente en condiciones básicas suaves. Por ejemplo, los oligonucleótidos sintetizados con dA^{bz}, dC^{bz}, dG^{dmf} y T nucleósidos de fosforamidita T (y sus correspondientes soportes sólidos de 3' nucleósido) se pueden escindir y desproteger en 60 minutos en hidróxido de amonio concentrado a 65ºC (Beaucage, S. y Iyer, R. (1992) "Advances in the synthesis of oligonucleotides by the phosphoramidite approach", Tetrahedron 48:2223-2311).
particular(es) seleccionado(s) dependerá(n) de la identidad de la nucleobase o del análogo de nucleobase y será evidente para los expertos en la técnica. Por ejemplo, las aminas exocíclicas de la adenina y citosina se pueden proteger con benzoilo (bz) y la amina exocíclica de la guanina se puede proteger con dimetilformamida (dmf) o isobutirilo (ibu) utilizando procedimientos convencionales. Preferentemente, la nucleobase se protege con grupos que se eliminan fácilmente en condiciones básicas suaves. Por ejemplo, los oligonucleótidos sintetizados con dA^{bz}, dC^{bz}, dG^{dmf} y T nucleósidos de fosforamidita T (y sus correspondientes soportes sólidos de 3' nucleósido) se pueden escindir y desproteger en 60 minutos en hidróxido de amonio concentrado a 65ºC (Beaucage, S. y Iyer, R. (1992) "Advances in the synthesis of oligonucleotides by the phosphoramidite approach", Tetrahedron 48:2223-2311).
R^{11} y R^{12} considerados por separado se
seleccionan de entre el grupo constituido por alquilo
(C_{1}-C_{6}), alqueno, arilo y cicloalquilo que
contiene hasta 10 átomos de carbono, p. ej.: isopropilo, o R^{11}
y R^{12} considerados conjuntamente con el átomo de nitrógeno
forman un heterociclo con nitrógeno saturado, p. ej.: morfolino.
R^{13} es un grupo protector de éster fosfito, p. ej.: metilo,
2-cianoetilo y
2-(4-nitrofenil)-etilo. R^{14} es
un grupo protector hidroxilo escindible por ácido, p. ej.:
dimetoxitritilo, que permite el posterior acoplamiento del
monómero.
El conectador L de VI puede ser
---(CH_{2})_{n}---
\uelm{N}{\uelm{\dpara}{O}}H---C---
en el que n oscila entre 2 y
10;
---C\equivC---CH_{2}---(OCH_{2}CH_{2})_{n}---NH---
\uelm{C}{\uelm{\dpara}{O}}---
en el que n es 0, 1 ó 2;
y
---(CH_{2}CH_{2}O)_{n}---CH_{2}CH_{2}---NH---
\uelm{C}{\uelm{\dpara}{O}}---
en el que n oscila entre 1 y
10.
Los reactivos IV y VI son eficaces para preparar
oligonucleótidos V marcados con los colorantes de la invención I.
Otra forma de realización de oligonucleótido marcado es el terminal
5' marcado según la estructura VII:
en la que X es O, NH ó S, L alquildiilo
(C_{1}-C_{12}) o el modificador por movilidad y
el oligonucleótido marcado lleva solo un DYE. Los conectadores del
modificador de movilidad efectúan la movilidad electroforética o las
propiedades hidrófobas del oligonucleótido. Los ejemplos del
conectador del modificador de movilidad incluyen unidades etilenoxi,
-(CH_{2}CH_{2}O)_{n}-, en las que n puede estar
comprendida entre 1 y 100 (Grossman, et al. "Method of DNA
sequencing employing in a mixed DNA-polymer chain
probe", patente U.S. nº 5.624.800, concedida el 29 de abril de
1997). Preferentemente, n es de 2 a 20. El oligonucleótido marcado
VII se puede producir por síntesis automática con los reactivos de
fosforamidita III, en particular por ejemplo Id. Por otra parte, los
oligonucleótidos marcados VII se pueden producir haciendo reaccionar
una forma del grupo con enlace reactivo de un colorante de la
presente invención, p. ej.: Ib, con un
5'-aminoalquil
oligonucleótido.
En un procedimiento preferido de marcaje químico
después de la síntesis se marca un oligonucleótido de la forma
siguiente. Se disuelve o se pone en suspensión en DMSO un colorante
según la estructura Ib y se añade en exceso (10 -20 \times) a un
5'-aminohexil oligonucleótido en tampón de
bicarbonato/carbonato 0,25 M a aproximadamente pH 9 y se deja
reaccionar durante, p. ej., 6 horas. Patente U.S. nº 4,757.141. El
oligonucleótido VII marcado con colorante se puede separar del
colorante sin reaccionar mediante el paso a través de una columna
cromatográfica de exclusión de tamaño eluyendo con tampón, p. ej.:
acetato de trietilamina (TEAA) 0,1 molar. La fracción que contiene
el oligonucleótido VII en bruto marcado, en la que L es
-(CH_{2})_{6}-, se purifica además por HPLC en fase
inversa empleando elución en gradiente.
La invención comprende kits que están
constituidos por colorantes de fluoresceína sustituidos con
heterocíclico con nitrógeno pobre en electrones de la invención y/o
sus conjugados marcados. En una forma de realización, los kits
sirven para la conjugación de los colorantes de la invención a otras
moléculas, es decir sustratos. Dichos kits generalmente constan de
un colorante de la invención que incluye un grupo con enlace
opcional y reactivos, enzimas, tampones, disolventes, etc. adecuados
para conjugar el colorante a otra molécula o sustancia.
En una forma de realización, los kits sirven para
marcar enzimáticamente oligonucleótidos y polinucleótidos
sintetizados con los colorantes de la invención. Dichos kids
comprenden generalmente un nucleótido o análogo de nucleótido
marcado incorporable enzimáticamente según la invención, una mezcla
de nucleótidos o análogos de nucleótido incorporables
enzimáticamente capaces de soportar la extensión continua del
cebador y una enzima polimerasa. Preferentemente, el nucleótido o
análogo de nucleótido marcado incorporable enzimáticamente es un
compuesto según la estructura IV, más preferentemente un terminador
marcado. Las polimerasas preferidas son termoestables, tal como
AMPLITAQ® ADN polimerasa FA (PE Biosystems, Foster City, CA).
En otra forma de realización, los kits sirven
para marcar oligonucleótidos sintéticos con los reactivos del
colorante fosforamidita, otros reactivos de síntesis, y/o soportes
sólidos opcionalmente para realizar la síntesis del oligonucleótido
(Andrus, et al. "Automated system for polynucleotide
sinthesis and purification" Patente U.S. nº 5.262.530, concedida
el 16 de noviembre de 1993).
Los colorantes y reactivos de la presente
invención se adecúan bien a cualquier procedimiento que utilice
detección fluorescente, particularmente los procedimientos que
requieren la detección simultánea de múltiples analitos que se
solapan espacialmente (Menchen, et al.
"4,7-dichlorofluorescein dyes as molecular
probes", patente U.S. nº 5.188.934, concedida el 23 de febrero de
1993. Los colorantes y reactivos de la invención son muy adecuados
para identificar clases de polinucleótidos que han sido sometidos al
procedimiento de separación bioquímica, tal como electroforesis o
que han sido distribuidos entre posiciones en una matriz de
hibridación dirigible espacialmente.
Estas aplicaciones incluyen la utilización de
oligonucleótidos marcados, cebadores marcados en 5' de la reacción
en cadena de polimerasa (PCR), sondas de hibridación y sondas del
ensayo de ligadura. Las aplicaciones de PCR incluyen la utilización
de oligonucleótidos marcados para el genotipado por repetición en
serie del número variable (VNTR), repetición corta en serie (STR) y
procedimientos microsatélite de amplificación de zonas de repetición
de ADN de doble cadena que contienen copias múltiples adyacentes de
una secuencia determinada, siendo variable el número de unidades de
repetición. Preferentemente, en dichos procedimientos de genotipado
por PCR, el cebador PCR se marca con un colorante de la
invención.
En una forma de realización particularmente
preferida, los colorantes de fluoresceína de la invención pueden
utilizarse en procedimientos cuantitativos y los reactivos que
proporcionan mediciones en tiempo real o del punto final de los
productos de amplificación durante la PCR (Gelfand, et al.
"Homogeneous assay system using the nuclease activity of a nucleic
acid polimerase", patente nº U.S. 5.210.215, concedida el 9 de
mayo de 1993; Livak, et al. "Method for Detecting Nucleic
Acid Amplification Using Self-Quenching Fluorescence
Probe", patente U.S. nº 5,538.848, concedida el 23 de julio de
1996). El análisis de exonucleasa (Taqman®) empleando sondas de
colorante fluorescente-extintor (Livak, et
al. "Self-quenching fluorescence probe",
patente U.S. nº 5.723.591, concedida 3 de marzo de 1998; Mullah
et al. (1998) "Efficient synthesis of double
dye-labelled oligodeoxyribonucleotide probes and
their application in a real time PCR assay", Nucl. Acids
Res. 26:1026-1031) proporciona detección directa
de los productos de la reacción en cadena de polimerasa (PCR) en un
sistema en tubo cerrado, sin tratamiento de la muestra más allá del
requerido para llevar a cabo la PCR. En el análisis Taqman, la
polimerasa que realiza la extensión del cebador y que amplifica el
polinucleótido también desplaza y escinde una sonda hibridada para
dirigir la secuencia mediante la actividad de la exonucleasa de 5' a
3'. En un análisis de tipo Taqman, la sonda se autoextingue, se
marca con colorante fluorescente y los grupos extintores,
cualesquiera de los cuales pueden ser colorantes de la invención. El
solapamiento espectral permite una eficaz transferencia de energía
(FRET) cuando la sonda está intacta (Clegg, R. (1992)
"Fluorescence resonance energy transfer and nucleis acids",
Meth. Enzymol. 211:353-388). Cuando se
hibrida una secuencia diana, la sonda se escinde durante la PCR para
liberar una señal fluorescente que es proporcional a la cantidad de
híbrido diana-sonda presente (Livak, et al.
"Method for Detecting Nucleic Acid Amplification Using
Self-Quenching Fluorescence Probe", patente U.S.
nº 5,538.848, concedida el 23 de julio de 1996; Livak, et al.
"Self-quenching fluorescence probe", patente
U.S. nº 5.723.591, concedida 3 de marzo de 1998).
En otro aspecto todavía, la invención proporciona
procedimientos para utilizar los colorantes de fluoresceína de la
invención sustituidos con heterociclo con nitrógeno pobre en
electrones para obtener la secuencia de un polinucleótido diana. El
procedimiento comprende generalmente la formación de una serie de
polinucleótidos de tamaño diferente marcados con un colorante de la
invención, la separación de las series de polinucleótidos de tamaño
diferente marcados basadas en el tamaño y la detección de los
polinucleótidos marcados separados basada en la fluorescencia del
colorante.
Las series de polinucleótido de diferente tamaño
marcados se pueden generar oportunamente extendiendo enzimáticamente
una secuencia diana cebada según procedimientos bien conocidos
(Sanger, et al., (1977) "DNA sequencing with
chain-terminating inhibitors", Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 74:5463-5467; Hunkapiller, et
al. "Real time scanning electrophoresis apparatus for DNA
sequencing", patente U.S. nº 4.811.218, concedida el 7 de marzo
de 1989; PE Corp., enero 1995, ABI PRISM^{TM} 377 DNA Sequencer
User's Manual, Rev. A, capítulo 2 (P/N 903433, PE Corporation,
Foster City, CA). Se pueden obtener, por ejemplo, series de
polinucleótidos marcados utilizando un cebador marcado y una
secuencia diana que se extiende enzimáticamente cebada con la diana
marcada en presencia de una polimerasa, dNTP, y por lo menos un
terminador (p. ej.:
2',3'-didesoxirribonucleosido-5'-trifosfato).
Por otra parte, se pueden obtener series de polinucleótidos marcados
extendiendo enzimáticamente una diana cebada sin marcar en presencia
de una polimerasa, dNTP y al menos un terminador marcado (Bergot,
et al. "Spectrally resolvable rhodamine dyes for nucleic
acid sequence determination", patente U.S. nº 5.366.860,
concedida el 22 de noviembre de 1994). En cualquiera de las dos
formas de realización, la polimerasa sirve para extender el cebador
con dNTP hasta que se incorpore el terminador, que termina la
reacción de extensión. Una vez terminada, se separan las series de
polinucleótidos basándose en el tamaño y se detectan los
polinucleótidos separados basándose en la fluorescencia de las
marcas del colorante.
En una forma de realización particularmente
ventajosa de este procedimiento, se utilizan cuatro terminadores
diferentes marcados por fluorescencia, en la que cada nucleótido
está marcado con un fluoróforo diferente que se puede resolver
espectralmente y al menos uno de los fluoróforos es un colorante de
fluoresceína sustituido con heterociclo con nitrógeno pobre en
electrones según la invención de modo que la serie de fluoróforos
sea de "movilidad igualada". Según esta forma de realización,
la secuencia diana cebada se extiende enzimáticamente en presencia
de una polimerasa, dNTP y de los cuatro terminadores diferentes
marcados por fluorescencia. Después de la separación basada en el
tamaño, se obtiene una serie de polinucleótidos marcados separados
en la que las propiedades de emisión del colorante fluorescente
ponen de manifiesto la identidad del nucleótido con terminal en 3'.
En una forma de realización particularmente preferida, todos los
colorantes fluorescentes de la serie de movilidad igualada son
excitables utilizando un solo foco de luz.
En una categoría de procedimientos preferida
denominada en la presente memoria procedimientos de "análisis del
fragmento" o "análisis genético", las secuencias marcadas de
polinucleótido o "fragmentos" se generan por síntesis
enzimática dirigida a la diana utilizando cebadores o nucleótidos
marcados, p. ej.: por ligadura o extensión del cebador dirigida a la
polimerasa; se someten los fragmentos a un procedimiento de
separación en función del tamaño, p. ej.: electroforesis o
cromatografía; y se identifican los fragmentos separados después de
la separación, p. ej.: fluorescencia producida por láser
(Hunkapiller, et al. "Real time scanning electrophoresis
apparatus for DNA sequencing", patente U.S. nº 4.811.218,
concedida el 7 de marzo de 1989). En una forma de realización
particularmente preferida, se separan múltiples clases de
polinucleótidos simultáneamente y se distinguen las diferentes
clases mediante marcas que se pueden resolver espectralmente.
En un procedimiento de análisis del fragmento
particularmente preferido, los fragmentos marcados con colorantes de
la invención se identifican por el tamaño relativo. La
correspondencia entre el tamaño del fragmento y la secuencia se
establece por incorporación de las cuatro bases posibles de la
terminación ("terminadores") y de los elementos de una serie de
colorantes que se pueden resolver espectralmente. Dichas series se
montan fácilmente en los colorantes de la invención midiendo la
emisión y la absorciónde las anchuras de banda con espectrofotómetos
disponibles en el comercio. Preferentemente, se emplean los
procedimientos de terminación de la cadena del secuenciado del ADN,
a saber el secuenciado de didesoxi ADN o el secuenciado de tipo
Sanger y el análisis del framento. Cada uno de los terminadores
lleva un colorante fluorescente diferente y en conjunto los
terminadores del experimento llevan un conjunto de colorantes que
incluyen uno o más colorantes de la invención.
Los colorantes fluorescentes de la invención que
se pueden resolver espectralmente son también útiles en experimentos
de genotipado tras la amplificación por PCR de la diana. En
particular, una serie de oligonucleótidos de cebador, marcados en el
terminal 5', cada uno con colorantes diferentes, pueden amplificar
múltiples locus y discriminar los polimorfismos de nucleótido
aislados (SNP). La separación electroforética de los productos de
amplificación marcados por el colorante, con patrones de tamaño,
establece un perfil o serie de datos característicos que indica un
determinado genotipo que depende de la serie de secuencias del
cebador.
La unión covalente de las sondas de
polinucleótido por los enzimas ligasa es una de las herramientas más
útiles disponibles por los biólogos moleculares. Cuando dos sondas
se hibridan en una secuencia diana en la que las dos sondas están
adyacentes y sin intervenir los huecos, se puede formar un enlace
fosfodiéster entre un terminal en 5' de una sonda y el terminal en
3' de la otra sonda por un enzima ligasa (Whiteley, et al.
"Detection of specific sequences in nucleic acids", patente
U.S. nº 4.883.750, concedida en 1989; Landegren et al. (1988)
"A ligase mediated gene detection technique", Science
241:1077-80; Nickerson, et al. (1990)
"Automated DNA diagnostics using análisis
ELISA-based oligonocleotide assay" Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 87:8923-27). Los análisis de
ligadura de oligonucleótido detectan la presencia de secuencias
específicas en una muestra diana. Cuando una o ambas sondas están
marcadas con un colorante de la invención, el producto de ligadura
se puede detectar por fluorescencia (Grossman, et al. (1994)
"High-density multiplex detection of nucleis acids
sequences: oligonucleotide ligation assay and sequence coded
separation", Nucl. Acids Res.
22:4527-34).
El secuenciado de tipo Sanger implica la síntesis
de una cadena de ADN polimerasa in vitro utilizando una diana
ADN de cadena única o de doble cadena cuya secuencia se ha de
determinar. La síntesis se inicia en un punto definido basado en
donde un cebador de oligonucleótido se hibrida con la diana. La
reacción de síntesis se termina por la incorporación de un análogo
de nucleótido que no soportará la elongación continuada del ADN.
Ejemplos de análogos de nucleótido de terminación de la cadena
incluyen los 5'-trifosfatos de
2',3'-didesoxinucleosido (ddNTP) que caracen del
grupo 3'-OH necesario para la elongación de la
cadena de ADN 3' a 5'. Cuando se utilizan proporciones adecuadas de
dNTP
(2'-desoxinuclesido-5'-trifosfatos)
y uno de los cuatro ddNTP, la polimerización catalizada por el
enzima se terminará en una fracción de la población de cadenas en
cada punto en que se incorpora ddNTP. Si se utilizan cebadores
fluorescentes marcados con colorante o ddNTP marcados para cada
reacción, la información de la secuencia se puede detectar por
fluorescencia después de la separación por electroforesis de alta
resolución. En el procedimiento de terminación de la cadena, los
colorantes de la invención pueden unirse a cualquier cebador de
secuenciado o a didesoxinucleótidos. Los colorantes se pueden unir a
un grupo funcional complementario en el terminal 5' del cebador
(Fung, et al. "Amino-derivatized phosphite
and phosphate linking agents, phosphoramidite precursors, and useful
conjugates thereof", patente U.S. nº 4.757.141, concedida el 12
de julio de 1988), en la nucleobase de un cebador; o en la
nucleobase de un didesoxinucleotido. p. ej.: mediante grupos con
enlace alquilamino (Khan, et al. "Substituted
propargylethoxyamido nucleosides, oligonucleotides and methods for
using same", patente U.S. nº 5.770.716, concedida el 23 de junio
de 1998 y patente U.S. nº 5.821.356 concedida el 13 de octubre de
1988; Hobbs, F. y Trainor, G.
"Alkynilamino-nucleotides", patente U.S. nº
5.151.507, concedida el 29 de septiembre de 1992).
Una prueba típica de secuenciado se ilustra en la
Figura 16, en la que el terminador 3'-flúor está
marcado con el compuesto colorante 13 mediante un conectador
propargiletoxiamido (EO):
3'FddGTP-EO-13:
En los procedimientos anteriores de análisis del
fragmento, se separan polinucleótidos marcados mediante
procedimientos cromatográficos, de afinidad o electroforéticos
(Rickwood y Hames, eds., Gel Electrophoresis of Nucleic Acids: A
Practical Approach, Press Limited, Londres, 1981). El tipo
preferido de matriz electroforética es poliacrilamida reticulada o
sin reticular u otro polímero que contenga amida, con una
concentración (peso a volumen) comprendida aproximadamente entre 2 y
20 por ciento en peso (Madabhushi, et al. "Polímers for
separation of biomolecules by capillary electrophoresis", patente
U.S. nº 5.552.028, concedida el 3 de septiembre de 1996). La matriz
electroforética puede estar configurada en un gel en pastilla o en
formato capilar (Mathies et al. "Capillary array confocal
fluorescence scanner and method", patente U.S. nº 5.274.240,
concedida el 28 de diciembre de 1993). Más preferentemente, la
concentración de poliacrilamida está comprendida aproximadamente
entre 4 y 8 por ciento. Preferentemente en el contexto del
secuenciado del ADN en particular, la matriz de la electroforesis
incluye un agente desnaturalizante, p. ej.: urea, formamida y
similares (Maniatis et al., Molecular Cloning: A
Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Nueva York,
págs. 179-185 (1982); PE Corp., ABI PRISM^{TM}
377 DNA Sequencer User's Manual, Rev. A, capítulo 2 (P/N 903433,
PE Corporation, Foster City, CA) enero 1995). Las condiciones
óptimas de la electroforesis, p. ej.: polímero, concentración de
polímero, pH, temperatura, concentración de agente desnaturalizante,
empleadas en una separación determinada depende de muchos factores,
incluyendo el intervalo de tamaño de los polinucleótidos que se han
de separar, sus composiciones de base, de que sean de una sola
cadena o de cadena doble y de la naturaleza de las clases cuya
información se busca por electroforesis (Grossman, et al.
"Method of DNA sequencing employing in a mixed
DNA-polymer chain probe", patente U.S. nº
5.624.800, concedida el 29 de abril de 1997). Preferentemente, n es
de 2 a 20. Los polinucleótidos marcados con colorante de
fluoresceína que se marcan de forma específica con marcas
adicionales de polietilenoxi de tamaño discreto y conocido permiten
otra dimensión de la separación y de la detección por
electroforesis, independiente del número de nucleótidos en el
polinucleótido. Esto es, los polinucleótidos de la misma longitud
pueden ser discrminados sobre la base de las marcas de colorante que
se pueden resolver espectralmente y de las marcas que modifican la
movilidad. Los polinucleótidos que llevan tanto marcas de colorante
como marcas que modifican la movilidad se pueden formar
enzimáticamente por ligadura o extensión de la polimerasa de los
constituyentes del polinucleótido o del nucleótido con una sola
marca. Por otra parte, los oligonucleótidos sintéticos pueden llevar
marcas de colorantes de la presente invención y modificadores de
movilidad que se incorporan durante la síntesis automática, p. ej.:
reactivos de fosforamidita, o por acoplamiento después de la
síntesis, p. ej.: acoplamiento de la marca NHS a amino- o
tiol-oligonucleótidos.
Después de la separación electroforética, se
detectan los conjugados de colorante-polinucleótido
midiendo la emisión de fluorescencia procedente de los
polinucleótidos marcados por el colorante. Para efectuar dicha
detección, se iluminan los polinucleótidos marcados por los medios
habituales, p. ej.: lámparas de vapor de mercurio de alta
intensidad, láseres, o similares. Preferentemente el medio de
iluminación es un láser con un rayo de iluminación a una longitud de
onda por encima de 450 nm. Más preferentemente, los polinucleótidos
con colorante se iluminan con luz de láser generada por un láser de
argón-ión o de He-Ne o un láser de
diodo en estado sólido. Se detecta a continuación la fluorescencia
mediante un detector sensible a la luz, p. ej.: un tubo
fotomultiplicador, un dispositivo cargado acoplado o similares.
Ejemplos de sistemas de detección por electroforesis se describen en
otro lugar (Hoff, et al. "Real-time
scanning fluorescence electrophoresis apparatus for the analysis of
polynucleotide fragments", patente U.S. nº 5.543.026, concedida
el 6 de agosto de1996; (Mathies et al. "Capillary array
confocal fluorescence scanner and method", patente U.S. nº
5.274.240, concedida el 28 de diciembre de 1993; Hunkapiller, et
al. "Real time scanning electrophoresis apparatus for DNA
sequencing", patente U.S. nº 4.811.218, concedida el 7 de marzo
de 1989).
La invención se ilustra además mediante los
siguientes ejemplos, que se pretende que sean puramente ejemplares
de la presente invención y no limiten su alcance en modo alguno.
Ácido
1,3-dimetoxifen-2-il
bórico:
(10 g, 54,95 mmol, Frontier Scientific, Inc),
2-bromotolueno (18,81 g, 110 mmol), diéter de glicol
(200 ml) y tetrakis(trifenilfosfina) paladio,
(Ph_{3}P)_{4}Pd^{0} (4 g, 3,46 mmol) se agitaron
durante 15 minutos seguido de adición de 8 g de carbonato de potasio
en 35 ml de agua (ref). Después de calentar a reflujo durante 6 h,
se vertió la mezcla de reacción en 800 ml de mezcla de agua y
acetato de etilo 1:1. Se lavó la capa orgánica con agua (300 ml
\times 2) y salmuera (200 ml \times 1), se eliminó el disolvente
y se purificó el producto en bruto por cromatografía en gel de
sílice eluyendo con hexano y acetato de etilo (hexano, 0% a 10% de
acetato de etilo) dando 10,5 g (84%) de 1 (Figura 1).
1,3-dimetoxi-2-(tol-2-il)-benceno
1 (10 g, 43,86 mmol), N-bromosuccinimida (8,26 g,
46,4 mmol) y ácido perclórico (70%, 0,5 ml) se mezclaron en
diclorometano (200 ml) y se agitó durante 4 h a temperatura
ambiente. La mezcla de reacción se enfrió bruscamente con solución
de bicarbonato de sodio (5%, 100 ml), se lavó la capa de
diclorometano con agua (100 ml), salmuera (100 ml) y se eliminó el
disolvente. Se purificó el producto en bruto por cromatografía en
gel de sílice eluyendo con hexano y acetato de etilo (0% a 10% de
acetato de etilo) dando 10,8 g (80%) de 2.
Ácido
piridin-3-bórico (5,81 g, 47,27
mmol, Frontier Scientific, Inc),
1,3-dimetoxi-2-(tol-2-il)-4-bromobenceno
(2) (10,7 g, 34,8 mmol), diéter de glicol (200 ml) y
tetrakis(trifenilfosfina) paladio,
(Ph_{3}P)_{4}Pd^{0} (4 g, 3,46 mmol) se agitaron
durante 15 minutos seguido de adición de carbonato de potasio (16 g
en 70 ml de agua). Después de calentar a reflujo durante 10 h, se
vertió la mezcla de reacción en 800 ml de mezcla de agua y acetato
de etilo 1:1. Se lavó la capa orgánica con agua (300 ml \times 2)
y salmuera (200 ml), se eliminó el disolvente y se purificó el
producto en bruto por cromatografía en gel de sílice eluyendo con
hexano y acetato de etilo (10% al 25% de acetato de etilo) dando 8,8
g (83%) de 3.
1,3-dimetoxi-2-(tol-2-il)-4-(pirid-3-il)-benceno
3 (3,5 g, 11,46 mmol), ácido acético (30 ml) y ácido bromhídrico
(48%) (15 ml) se calentaron a reflujo durante 24 h. Después de
enfriar la mezcla de reacción, se eliminó la mayor parte del
reactivo a presión reducida; el ácido residual se eliminó mezclando
el concentrado con solución de bicarbonato de sodio (5%) (100 ml).
Se extrajo el producto en acetato de etilo (100 ml), se lavó con
agua (100 ml \times 2) y salmuera (100 ml) y se evaporó el acetato
de etilo. Se purificó el producto en bruto por cromatografía en gel
de sílice eluyendo con diclorometano y acetona (0% a 10'% de
acetona) dando 2,8 g (90%) de 4.
2-(tol-2-il)-4-(pirid-3-il)-1,3-dihidroxibenceno
4 (630 mg, 2,25 mmol), anhídrido
2,5-diclorotrimelítico:
(Menchen, S. et al.
"4,7-dichlorofluorescein dyes as molecular
probes", patente U.S. nº 5.885.778, concedida el 23 de marzo de
1999) (590 mg, 2,25 mmol), nitrobenceno (20 ml) y cloruro de
aluminio en nitrobenceno (12 ml, 1M) se agitaron a temperatura
ambiente durante 24 h. La mezcla de reacción se vertió en una mezcla
de agua con hielo (50 ml), acetato de etilo (100 ml) y
n-butanol (20 ml), seguido de la adición de HCl al 10% (50
ml) para disolver las sales de aluminio. Se lavó la capa orgánica
con agua (50 ml \times 2) y salmuera (50 ml) y se evaporó el
disolvente para dar el producto como una mezcla de isómeros 5a y 5b.
La separación por cromatografía en gel de sílice con metanol en
diclorometano (10% al 30% de metanol) y ácido acético (1%) dio 380
mg (31%) del isómero 5b de movilidad lenta deseado, que se cree que
tiene la estructura mostrada en la Figura 1.
A 1,3-dihidroxinaftaleno (15 g,
93,6 mmol) y carbonato de potasio (20 g, 144,7 mmol) en acetona (200
ml) se añadió sulfato de dimetilo (21 ml, 222 mmol). Después de
agitar toda la noche la mezcla de reacción se mezcló con hidróxido
de sodio al 10% (100 ml) y se extrajo con acetato de etilo (200 ml
\times 2). Se lavó la capa orgánica con agua (100 ml \times 2),
se evaporó y se agitó el residuo con hidróxido de amonio (50 ml)
durante 2 h hasta enfriar bruscamente cualquier resto de sulfato de
dimetilo sin reaccionar. Se extrajo el producto con acetato de
etilo (200 ml) y se lavó con agua (100 ml \times 2) y salmuera
(100 ml). Se evaporó el disolvente dando 15 g (85%) de 6.
1,3-dihidroxinaftaleno (6) (7,1
g, 37,73 mmol) se disolvió en THF anhidro (60 ml), se enfrió a
-70ºC y se añadió tetrametiletilendiamina (0,2 ml) seguido de
n-butil-litio (26 ml, 1,6 M en
hexano). Después de agitar la solución fría durante 30 minutos y a
temperatura ambiente durante 1 h, se volvió a enfriar la solución a
-20ºC y se añadió de dicloruro de dimetilestaño, SnMe_{2}Cl_{2}
(5,05 g en 20 ml THF). Se agitó la mezcla de reacción a temperatura
ambiente durante 2 h, se vertió en agua (100 ml), salmuera (50
ml)y se evaporó. Se cristalizó el residuo en hexano (50 ml),
para dar 6,8 g (69%) de 7.
Se enfrió a -30ºC
bis-(1,3-dihidroxinaft-2-il)-dimetilestaño
7 (11 g, 21 mmol) en THF (500 ml) y se añadió
N-bromosuccinimida (8 g, 45 mmol). Después de agitar
a -30ºC durante 2 h se enfrió bruscamente la mezcla de reacción con
agua (200 ml) y acetato de etilo (200 ml). Se lavó la fase orgánica
con ácido clorhídrico al 10% (100 ml), agua (100 ml \times 2),
salmuera (100 ml) y se evaporó. Se purificó el producto en bruto por
cromatografía en gel de sílice, eluyendo con
hexano-acetato de etilo (0% a 10% de acetato de
etilo) para dar 9 g (80%) de 8.
Ácido
piridin-3-bórico (5,94 g, 32 mmol,
Frontier Scientific, Inc),
1,3-dimetoxi-2-bromobenceno
8 (6,6 g, 24,7 mmol), diéter de glicol (200 ml) y
tetrakis(trifenilfosfina) paladio,
(Ph_{3}P)_{4}Pd^{0} (3 g, 2,7 mmol) se agitaron
durante 15 minutos seguido de adición de carbonato de potasio (11,4
g en 50 ml de agua). Después de calentar a reflujo toda la noche, se
vertió la mezcla de reacción en 800 ml de agua y acetato de etilo
1:1. Se lavó la capa orgánica con agua (300 ml \times 2) y
salmuera (200 ml), se eliminó el disolvente y se purificó el
producto en bruto por cromatografía en gel de sílice eluyendo con
diclorometano y acetona (0% al 5% de acetona) dando 5,1 g (84%) de
9.
Este compuesto se preparó esencialmente por el
mismo procedimiento utilizado en el Ejemplo 9 utilizando 8 y ácido
tol-2-il bórico (Frontier Scientific
Inc.).
Este compuesto se preparó por el mismo
procedimiento utilizado en el Ejemplo 4 utilizando
2-(pirid-3-il)-1,3-dimetoxinaftaleno
9 para dar 11.
Este compuesto se preparó por el mismo
procedimiento utilizado en el Ejemplo 4 utilizando
2-(tol-2-il)-1,3-dimetoxinaftaleno
10 para dar 12.
Se mezclaron la cetona 5b (250 ml, 0,45 mmol) y
2-(pirid-3-il)-1,3-dihidroxinaftaleno
11 (109 mg, 0,45 mmol) con ácido metansulfónico (7 ml) y se agitó a
100ºC durante 1 h. Se enfrió la solución a temperatura ambiente y a
continuación se vertió en agua con hielo (50 ml). Se extrajo el
colorante en n-butanol (50 ml \times 2) y se lavó
con agua (20 ml \times 2). Se evaporó el disolvente al vacío y se
purificó el colorante por cromatografía en gel de sílice en fase
inversa (50% de metanol) para dar 103 mg (30%) de 13 (Figura
13).
Este colorante se preparó por el mismo
procedimiento utilizado en el Ejemplo 13 utilizando
2-(tol-2-il)-1,3-dihidroxinaftaleno
12 y 5.
Este colorante se preparó por el mismo
procedimiento utilizado en el Ejemplo 13 utilizando
2-flúor-1,3-dihidroxinaftaleno
(Benson, et al. "Asymmetric benzoxanthene dyes", patente
U.S. nº 5.840.999, concedida el 24 de noviembre de 1998) y 5.
2-(tol-2-il)-4-(pirid-3-il)-1,3-dihidroxibenceno
4 (52 mg, 0,28 mmol), anhídrido
2,5-diclorotrimelítico (Menchen, S. et al.
"4,7-dichlorofluorescein dyes as molecular
probes", patente U.S. nº 5.885.778, concedida el 23 de marzo de
1999), (35,5 mg, 14 mmol) y ácido metansulfónico,(1 ml), se
calentaron y se agitaron a 130-135ºC durante dos h.
Se enfrió la solución a temperatura ambiente y a continuación se
vertió en agua con hielo (50 ml). Se extrajo el colorante en bruto
con n-butanol (50 ml \times 2) y se lavó el
extracto con agua (20 ml \times 2). Se evaporó el disolvente al
vacío para dar el colorante en bruto como una mezcla de dos
isómeros. Se separaron los isómeros por cromatografía en capa fina
de preparación (gel de sílice; diclorometano:metanol:ácido
acético/100:10:2 (v:v:v) fase móvil) para dar 24 mg (30%) del
isómero 16 deseado de movilidad más lenta.
Ácido
2,4-dimetoxifenil-4-il
bórico (0,9 g, 4,97 mmol, Frontier Scientific Inc.),
3-bromopiridina (0,82 g, 5 mmol),
tetrakis(trifenilfosfina) paladio,
(Ph_{3}P)_{4}Pd^{0} (0,65 g, 0,56 mmol),
N,N-dimetilformamida (20 ml) y trietilamina (2,1 ml)
se mezclaron y se agitaron a 110-120ºC durante 16 h.
Se vertió la mezcla de reacción en 100 ml de una mezcla de agua y
acetato de etilo 1:1 y se lavó la capa orgánica con agua (50 ml
\times 2) y salmuera (50 ml). Después de la eliminación del
disolvente se purificó el producto en bruto por cromatografía en gel
de sílice (acetona de 0% a 10% en diclorometano) dando 0,45 g
(42,5%) de 17.
Este compuesto se preparó por el mismo
procedimiento utilizado en el Ejemplo 4 utilizando
2,3-dimetoxi-4-(pirid-3-il)benceno
17 para dar 18.
Este colorante se preparó por el mismo
procedimiento utilizado en el Ejemplo 16 utilizando
4-(pirid-3-il)-1,3-dihidroxibenceno
18 y anhídrido 2,5- diclorotrimelítico.
Este compuesto se preparó por el mismo
procedimiento utilizado en el Ejemplo 17 utilizando ácido
2,4-dimetoxifenil-4-il
bórico y 2-bromopiridina para dar 20.
Este compuesto se preparó por el mismo
procedimiento utilizado en el Ejemplo 4 utilizando
2,3-dimetoxi-4-(pirid-2-il)benceno
20 para dar 21.
Este colorante se preparó por el mismo
procedimiento utilizado en el Ejemplo 16 utilizando
4-(pirid-3-il)-1,3-dihidroxibenceno
21 y anhídrido 2,5-diclorotrimelítico.
Este compuesto se preparó por el mismo
procedimiento utilizado en el Ejemplo 17 utilizando ácido
1,3-dimetoxifen-4-il
bórico y 3-bromoquinolina para dar 23.
Este compuesto se preparó por el mismo
procedimiento utilizado en el Ejemplo 4 utilizando
1,3-dimetoxi-4-(quinon-3-il)benceno
23 para dar 24.
Este colorante se preparó por el mismo
procedimiento utilizado en el Ejemplo 16 utilizando
1,3-dihidroxi-4-(quinon-3-il)benceno
24 y anhídrido 2,5-diclorotrimelítico.
Este compuesto se preparó por el mismo
procedimiento utilizado en el Ejemplo 17 utilizando
1,3-dimetoxifen-4-il
bórico y 2-bromoquinolina para dar 26.
Este compuesto se preparó por el mismo
procedimiento utilizado en el Ejemplo 4 utilizando
1,3-dimetoxi-4--(quinon-2-il)benceno
26 para dar 27.
Este colorante se preparó por el mismo
procedimiento utilizado en el Ejemplo 16 utilizando
1,3-dihidroxi-4-(quinon-2-il)benceno
27 y anhídrido 2,5-diclorotrimelítico.
Este compuesto se preparó por el mismo
procedimiento utilizado en el Ejemplo 1 utilizando ácido
1,3-dimetoxifen-2-il
bórico y 3-bromopiridina para dar 29.
Este compuesto se preparó por el mismo
procedimiento utilizado en el Ejemplo 2 utilizando
1,3-dimetoxi-2-(pirid-3-il)benceno
29 y N-bromosuccinimida para dar 30.
Este compuesto se preparó por el mismo
procedimiento utilizado en el Ejemplo 3 utilizando
1,3-dimetoxi-2-(pirid-3-il)-4-bromobenceno
30 y ácido fenil bórico para dar 31.
Este compuesto se preparó por el mismo
procedimiento utilizado en el Ejemplo 4 utilizando
1,3-dimetoxi-2-(pirid-3-il)-4-fenilbenceno
31 para dar 32.
Este colorante se preparó por el mismo
procedimiento utilizado en el Ejemplo 16 utilizando
1,3-dihidroxi-4-fenilbenceno
32 y anhídrido 2,5-diclorotrimelítico.
Este compuesto se preparó por el mismo
procedimiento utilizado en el Ejemplo 3 utilizando
1,3-dimetoxi-2-(tol-2-il)-4-bromobenceno
2 y ácido fenil bórico para dar 34.
Este compuesto se preparó por el mismo
procedimiento utilizado en el Ejemplo 4 utilizando
1,3-dimetoxi-2-(tol-2-il)-4-fenilbenceno
34 para dar 35.
\newpage
Este colorante se preparó por el mismo
procedimiento utilizado en el Ejemplo 16 utilizando
1,3-dihidroxi-2-(tol-2-il)-4-fenilbenceno
35 y anhídrido 2,5-diclorotrimelítico.
Este compuesto se preparó por el mismo
procedimiento utilizado en el Ejemplo 1 utilizando ácido
1,3-dimetoxifen-2-il
bórico y 2-bromopiridina para dar 37.
Este compuesto se preparó por el mismo
procedimiento utilizado en el Ejemplo 2 utilizando
1,3-dimetoxi-2-(pirid-2-il)benceno
27 y N-bromosuccinimida para dar 38.
Este compuesto se preparó por el mismo
procedimiento utilizado en el Ejemplo 3 utilizando
1,3-dimetoxi-2-(pirid-2-il)-4-bromobenceno
38 y ácido naft-2-il bórico para dar
39.
Este compuesto se preparó por el mismo
procedimiento utilizado en el Ejemplo 4, desmetilando
1,3-dimetoxi-2-(pirid-2-il)-4-(naft-2-il)benceno
39 para dar 40.
Este colorante se preparó por el mismo
procedimiento utilizado en el Ejemplo 16 utilizando
1,3-dihidroxi-2-(pirid-2-il)-4-(naft-2-il)benceno
40 y anhídrido 2,5-diclorotrimelítico.
Se midieron determinadas propiedades de algunos
de los colorantes de fluoresceína de la presente invención.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
| ^{a} emisión máxima de la forma ácido del colorante |
| ^{b} anchura total, máxima media |
| ^{c} referida a 5-carboxifluoresceína (5-FAM) |
Todas las publicaciones y solicitudes de patente
están incorporadas en la presente memoria en la misma medida como si
cada publicación individual o solicitud de patente estuviese
indicada específica e individualmente para ser incorporada como
referencia.
Aunque determinadas formas de realización se han
descrito con detalle anteriormente, los expertos en la materia
comprenderán evidentemente que son posibles muchas modificaciones en
las formas de realización preferidas sin apartarse de sus
enseñanzas. Todas estas modificaciones se pretende que estén
abarcadas en las reivindicaciones siguientes.
Claims (57)
1. Compuesto que presenta la fórmula:
en la
que:
al menos uno de entre R^{1}, R^{2}, R^{3},
R^{4}, R^{5} o R^{7} es un heterociclo con nitrógeno pobre en
electrones;
R^{1}, cuando se considera solo, es H, F, Cl,
alquilo (C_{1}-C_{6}), alquilo
(C_{1}-C_{6}) sustituido, alcoxi
(C_{1}-C_{6}), sulfonato, sulfona, amino,
iminio, amido, nitrilo, grupo con enlace reactivo, fenilo, fenil
sustituido, arilo, aril sustituido o heterociclo, o considerado
junto con R^{7} es benzo o heterociclo;
R^{2}, cuando se considera solo, es H, F, Cl,
alquilo (C_{1}-C_{6}), alquilo
(C_{1}-C_{6}) sustituido, alcoxi
(C_{1}-C_{6}), sulfonato, sulfona, amino,
iminio, amido, nitrilo, grupo con enlace reactivo, fenilo, fenil
sustituido, arilo, aril sustituido o heterociclo;
R^{3}, cuando se considera solo, es H, F, Cl,
alquilo (C_{1}-C_{6}), alquilo
(C_{1}-C_{6}) sustituido, alcoxi
(C_{1}-C_{6}), sulfonato, sulfona, amino,
iminio, amido, nitrilo, grupo con enlace reactivo, fenilo, fenil
sustituido, arilo, aril sustituido o heterociclo;
R^{4}, cuando se considera solo, es H, F, Cl,
alquilo (C_{1}-C_{6}), alquilo
(C_{1}-C_{6}) sustituido, alcoxi
(C_{1}-C_{6}), sulfonato, sulfona, amino,
iminio, amido, nitrilo, grupo con enlace reactivo, fenilo, fenil
sustituido, arilo, aril sustituido o heterociclo, o considerado
junto con R^{5} es benzo o heterociclo;
R^{5}, cuando se considera solo, es H, F, Cl,
alquilo (C_{1}-C_{6}), alquilo
(C_{1}-C_{6}) sustituido, alcoxi
(C_{1}-C_{6}), sulfonato, sulfona, amino,
iminio, amido, nitrilo, grupo con enlace reactivo, fenilo, fenil
sustituido, arilo, aril sustituido o heterociclo, o considerado
junto con R^{4} es benzo o heterociclo;
R^{7}, cuando se considera solo, es H, F, Cl,
alquilo (C_{1}-C_{6}), alquilo
(C_{1}-C_{6}) sustituido, alcoxi
(C_{1}-C_{6}), sulfonato, sulfona, amino,
iminio, amido, nitrilo, grupo con enlace reactivo, fenilo, fenil
sustituido, arilo, aril sustituido o heterociclo, o considerado
junto con R^{1} es benzo o heterociclo; y
R^{6} se selecciona de entre el grupo
constituido por alquilo (C_{1}-C_{6}), alqueno
(C_{2}-C_{6}), alquino
(C_{2}-C_{6}), ciano, aromático heterocíclico,
fenilo y fenil sustituido que tienen la estructura:
en la que X^{1}, X^{2}, X^{3}, X^{4} y
X^{5} considerados por separado son H, Cl, F, alquilo
(C_{1}-C_{6}), alqueno
(C_{2}-C_{6}), alquino
(C_{2}-C_{6}), CO_{2}H, SO_{3}H, CH_{2}OH
o un grupo con enlace
reactivo.
2. Colorante de fluoresceína según la
reivindicación 1, en el que el heterociclo pobre en electrones se
selecciona de entre el grupo constituido por
2-piridilo, 3-piridilo,
4-piridilo, 2-quinolilo,
3-quinolilo, 4-quinolilo,
2-imidazol, 4-imidazol,
3-pirazol, 4-pirazol, piridazina,
pirimidina, pirazina, cinolina, ftalazina, quinazolina,
quinoxalina, 3-(1,2,4-N)-triazolilo,
5-(1,2,4-N)-triazolilo,
5-tetrazolilo, 4-(1-O,
3-N)-oxazol, 5-(1-O,
3-N)-oxazol, 4-(1-S,
3-N)-tiazol, 5-(1-S,
3-N)-tiazol, 2-benzoxazol,
2-benzotiazol,
4-(1,2,3-N)-benzotriazol y benzimidazol.
3. Colorante de fluoresceína según la
reivindicación 1, en el que R^{4} considerado conjuntamente con
R^{5} es benzo.
4. Colorante de fluoresceína según la
reivindicación 1, en el que R^{1} considerado conjuntamente con
R^{7} es benzo.
5. Colorante de fluoresceína según la
reivindicación 1, en el que R^{6} es un fenilo sustituido con la
estructura:
6. Colorante de fluoresceína según la
reivindicación 5, en el que uno de X^{3} y X^{4} es carbonilo y
el otro es hidrógeno.
7. Colorante de fluoresceína según la
reivindicación 1, en el que R^{1}, R^{2}, R^{3} y R^{4}
considerados cada uno independientemente son fenilo o fenil
sustituido o naftil o naftil sustituido.
8. Colorante de fluoresceína según la
reivindicación 1, en el que R^{2} y R^{3} considerados cada uno
independientemente son flúor, cloro, 2-piridilo,
3-piridilo, 2-quinolilo ó
3-quinolilo.
9. Colorante de fluoresceína según la
reivindicación 1, en el que R^{5} y R^{7} son hidrógeno.
10. Colorante de fluoresceína según la
reivindicación 1, en el que el grupo con enlace reactivo se
selecciona de entre el grupo constituido por éster succinimidílico,
isotiocianato, cloruro de sulfonilo,
2,6-diclorotriazinilo, éster de pentafluorofenilo,
fosforamidita, maleimida, haloacetilo y yodoacetamida.
11. Colorantes de fluoresceína según la
reivindicación 1, que tienen las estructuras:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
12. Procedimiento para marcar un sustrato con un
colorante de fluoresceína según la reivindicación 1, que comprende
la etapa de hacer reaccionar el sustrato con el grupo con enlace
reactivo en el que del colorante de fluoresceína en el que se forma
un conjugado sustrato-colorante.
13. Procedimiento según la reivindicación 12, en
el que el grupo con enlace reactivo es
N-hidroxisuccinimida.
14. Procedimiento según la reivindicación 12, en
el que el grupo con enlace reactivo es fosforamidita.
15. Procedimiento según la reivindicación 12, en
el que el sustrato se selecciona de entre el grupo constituido por
un polinucleótido, un nucleótido, un nucleósido, un péptido, una
proteína, un carbohidrato, un ligando, una partícula y una
superficie.
16. Procedimiento según la reivindicación 15, en
el que la partícula se selecciona de entre el grupo constituido por
una nanopartícula, una microesfera, una bolita y un liposoma.
17. Procedimiento según la reivindicación 15, en
el que la superficie es vidrio.
18. Compuesto colorante por transferencia de
energía, que comprende:
un colorante donante que absorbe luz a una
primera longitud de onda y emite energía de excitación en respuesta
unido por un conectador a un colorante aceptor capaz de absorber la
energía de excitación emitida por el colorante donante y que
fluorece en respuesta en una segunda longitud de onda;
en el que al menos uno de entre el colorante
donante y el colorante aceptor es un colorante de fluoresceína según
la reivindicación 1.
19. Colorante por transferencia de energía según
la reivindicación 18, en el que el conectador presenta la estructura
de fórmula:
ó
en el que n es 1 ó
2.
20. Nucleósido marcado o nucleótido que presenta
la fórmula:
en la que DYE es un colorante de fluoresceína
según la reivindicación 1 o un colorante por transferencia de
energía según la reivindicación
18;
B es una nucleobase;
R^{8} es H, monofosfato, difosfato, trifosfato,
tiofosfato o análogo de fosfato.
R^{9} y R^{10}, cuando se consideran por
separado, son cada uno independientemente H, HO, F y un grupo que
bloquea la polimerización dirigida a la diana mediada por polimerasa
o cuando se consideran conjuntamente forman
2'-3'-dideshidrorribosa; y
L es un conectador.
21. Nucleósido o nucleótido marcado según la
reivindicación 20, en los que B se selecciona de entre el grupo
constituido por uracilo, timina, citosina, adenina,
7-desazaadenina, guanina y
8-desazaguanosina.
22. Nucleósido o nucleótido marcado según la
reivindicación 20, en los que L es:
---C\equivC---CH_{2}---(OCH_{2}CH_{2})_{n}---NH---
\uelm{C}{\uelm{\dpara}{O}}---en la que n es 0, 1 ó
2.
23. Nucleósido o nucleótido marcado según la
reivindicación 20, que es susceptible de ser incorporado
enzimáticamente.
24. Nucleósido o nucleótido marcado según la
reivindicación 20, que es un terminador.
25. Nucleótido terminador según la reivindicación
24, que presenta la estructura:
en la que DYE es un colorante de
fluoresceína;
B es una nucleobase;
R^{8} es trifosfato,
\alpha-tiotrifosfato o análogo de trifosfato.
R^{9} y R^{10}, cuando se consideran por
separado, son cada uno independientemente H, F y un grupo que
bloquea la polimerización dirigida a la diana mediada por polimerasa
o cuando se consideran conjuntamente forman
2'-3'-dideshidrorribosa; y
L es un conectador.
26. Nucleósido o nucleótido marcado según la
reivindicación 20, que es susceptible de ser ampliado
enzimáticamente.
27. Oligonucleótido marcado que presenta la
fórmula:
en la que el oligonucleótido comprende 2 a 100
nucleótidos;
DYE es el colorante de fluoresceína según la
reivindicación 1 o un colorante por transferencia de energía según
la reivindicación 18;
B es una nucleobase;
L es un conectador;
R^{10} es H, OH, haluro, azida, amina,
alquilamina, alquil (C_{1}-C_{6}), alilo, alcoxi
(C_{1}-C_{6}), OCH_{3} u
OCH_{2}CH=CH_{2};
R^{15} es H, fosfato, fosfodiéster de
internucleótido o análogo de internucleótido; y
R^{16} es H, fosfato, fosfodiéster de
internucleótido o análogo de internucleótido.
28. Oligonucleótido marcado que presenta la
fórmula:
en la que el oligonucleótido comprende 2 a 100
nucleótidos;
DYE es el colorante de fluoresceína según la
reivindicación 1;
X es O, NH o S;
B es una nucleobase;
L es un conectador;
R^{10} es H, OH, haluro, azida, amina,
alquilamina, alquilo (C_{1}-C_{6}), alilo,
alcoxi (C_{1}-C_{6}), OCH_{3} u
OCH_{2}CH=CH_{2}; y
R^{15} es fosfodiéster de internucleótido o
análogo de internucleótido.
29. Oligonucleótido marcado según la
reivindicación 28, en el que L es alquildiilo
(C_{1}-C_{12}) o un modificador de movilidad que
comprende -(CH_{2}CH_{2}O)_{n}-, en el que n está
comprendido entre 1 y 100.
30. Compuesto de fosforamidita, que presenta la
fórmula:
en la que DYE es un colorante de fluoreseína
según la reivindicación 1 o un colorante por transferencia de
energía según la reivindicación
18;
L es un conectador;
R^{11} y R^{12} considerados por separado se
seleccionan de entre el grupo constituido por alquilo
(C_{1}-C_{12}), alqueno, arilo y cicloalquilo
que contienen hasta 10 átomos de carbono; o R^{11} y R^{12}
considerados conjuntamente con el átomo de nitrógeno forman un
heterociclo con nitrógeno saturado; y
R^{13} es un grupo protector con éster de
fosfito.
31. Compuesto de fosforamidita según la
reivindicación 30, en el que R^{13} se selecciona de entre el
grupo constituido por metilo; 2-cianoetilo, y
2-(4-nitrofenil)etilo.
32. Compuesto de fosforamidita según la
reivindicación 30, en el que R^{11} y R^{12} son cada uno
isopropilo o en el que R^{11} y R^{12} considerados
conjuntamente son morfolino.
33. Compuesto de fosforamidita según la
reivindicación 30, en el que L es alquildiilo
(C_{1}-C_{12}).
34. Compuesto de fosforamidita según la
reivindicación 30, en el que el colorante de fluoresceína se une a
R^{6} mediante un conectador.
35. Compuesto de fosforamidita de estructura:
en la que DYE es un colorante de fluoresceína
según la reivindicación
1.
36. Compuesto de fosforamidita que presenta la
fórmula:
en la que DYE es un colorante de fluoresceína
según la reivindicación 1 o un colorante por transferencia de
energía según la reivindicación
18;
B es una nucleobase;
L es un conectador;
R^{11} y R^{12} considerados por separado se
seleccionan de entre el grupo constituido por alquilo
(C_{1}-C_{12}), alqueno, arilo y cicloalquilo
que contienen hasta 10 átomos de carbono; o R^{11} y R^{12}
considerados conjuntamente con el átomo de nitrógeno forman un
heterociclo con nitrógeno saturado;
R^{13} es un grupo protector con éster de
fosfito; y
R^{14} es un grupo protector hidroxilo
escindible en ácido.
37. Compuesto de fosforamidita según la
reivindicación 36, en el que R^{13} se selecciona de entre el
grupo constituido por metilo, 2-cianoetilo y
2-(4-nitrofenil)-etilo.
38. Compuesto de fosforamidita según la
reivindicación 36, en el que R^{11} y R^{12} son cada uno
isopropilo o en el que R^{11} y R^{12} considerados
conjuntamente son morfolino.
39. Compuesto según la reivindicación 36, en el
que L se selecciona de entre el grupo constituido por
---(CH_{2})_{n}---
\uelm{N}{\uelm{\dpara}{O}}H---C---en el que n oscila entre 2 y
10;
---C\equivC---CH_{2}---(OCH_{2}CH_{2})_{n}---NH---
\uelm{C}{\uelm{\dpara}{O}}---en el que n es 0, 1 ó 2;
y
---(CH_{2}CH_{2}O)_{n}---CH_{2}CH_{2}---NH---
\uelm{C}{\uelm{\dpara}{O}}---en el que n varía de 1 a
10.
40. Compuesto según la reivindicación 30, en el
que que B se selecciona de entre el grupo constituido por uracilo,
timina, citosina, adenina, 7-desazaadenina, guanina
y 8-desazaguanosina.
41. Procedimiento de síntesis de un
oligonucleótido marcado que comprende la etapa de acoplamiento de un
compuesto de fosforamidita según la reivindicación 30 a un
oligonucleótido en un soporte sólido.
42. Procedimiento de síntesis de un
oligonucleótido marcado que comprende la etapa de acoplamiento de un
reactivo de nucleósido fosforamidita a un soporte sólido, en el que
el soporte sólido está marcado con un colorante según la
reivindicación 1 o un compuesto por transferencia de energía según
la reivindicación 18.
43. Procedimiento de generación de un producto de
extensión del cebador marcado, que comprende la etapa de extender
enzimáticamente un híbrido de cebador-diana en
presencia de una mezcla de nucleótidos extensibles enzimáticamente
capaces de soportar la extensión continua del cebador y un
terminador, en el que dicho cebador o dicho terminador se marca con
un colorante según la reivindicación 1 o un compuesto por
transferencia de energía según la reivindicación 18.
44. Procedimiento de ligadura de un
oligonucleótido, que comprende las etapas siguientes:
hibridación de dos sondas a una secuencia diana
y
formación de un enlace fosfodiéster entre el
terminal 5' de una sonda y el terminal 3' de la otra sonda;
en el que una o ambas sondas están marcadas con
un colorante según la reivindicación 1 o un compuesto por
transferencia de energía según la reivindicación 18.
45. Procedimiento de análisis del fragmento, que
comprende las etapas siguientes:
someter fragmentos de polinucleótido, estando
marcados los fragmentos con un colorante de fluoresceína según la
reivindicación 1 o con un compuesto por transferencia de energía
según la reivindicación 18, a un proceso de separación que depende
del tamaño; y
detectar el fragmento de polinucleótido marcado
después del proceso de separación.
46. Procedimiento según la reivindicación 45, en
el que los fragmentos están marcados con una señal que modifica la
movilidad.
47. Procedimiento según la reivindicación 45, en
el que los fragmentos se producen por ligadura.
48. Procedimiento según la reivindicación 45, en
el que el proceso de separación dependiente del tamaño es la
electroforesis y el fragmento de polinucleótido marcado se detecta
por fluorescencia.
49. Procedimiento de amplificación, que comprende
las etapas siguientes:
hibridación de dos o más sondas a una secuencia
de ADN diana y
extensión de los cebadores mediante polimerasa y
mezcla de nucleótidos extensibles enzimáticamente;
en el que un cebador o un nucleótido están
marcados con un colorante según la reivindicación 1.
50. Procedimiento de amplificación, que comprende
las etapas siguientes:
hibridación de dos o más cebadores y una sonda
colorante de fluorescente-extintor a una secuencia
de ADN diana, y
extensión de los cebadores mediante polimerasa y
mezcla de nucleótidos extensibles enzimáticamente;
en el que la sonda está marcada con un colorante
según la reivindicación 1.
51. Kit para marcar un oligonucleótido, que
comprende un colorante que incluye un grupo conectador reactivo
según la reivindicación 1 y un oligonucleótido.
52. Kit para marcar un oligonucleótido, que
comprende un compuesto de fosforamidita según la reivindicación 30 y
un oligonucleótido.
53. Kit para generar un producto de extensión del
cebador marcado, que comprende nucleótidos extensibles
enzimáticamente capaces de soportar la extensión continua del
cebador, un terminador y un cebador, en el que dicho cebador o dicho
terminador están marcados con un colorante según la reivindicación
1.
54. Kit para generar un producto de extensión del
cebador marcado, que comprende nucleótidos extensibles
enzimáticamente capaces de soportar la extensión continua del
cebador, un terminador y un cebador, en el que dicho cebador o dicho
terminador están marcados con un colorante por transferencia de
energía según la reivindicación 18.
55. Kit para generar un producto de extensión del
cebador marcado, que comprende nucleótidos extensibles
enzimáticamente capaces de soportar la extensión continua del
cebador, un terminador y un cebador, en el que dicho cebador o dicho
terminador están marcados con un colorante según la reivindicación
11.
56. Kit según la reivindicación 55, en el que el
terminador es un conjunto de cuatro terminadores diferentes, uno que
termina en una diana A, uno que termina en una diana G, uno que
termina en una diana C y uno que termina en una diana T o U.
57. Kit según la reivindicación 56, en el que el
conjunto de cuatro terminadores diferentes es un conjunto de
terminadores de igual movilidad.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US498702 | 2000-02-07 | ||
| US09/498,702 US6221604B1 (en) | 2000-02-07 | 2000-02-07 | Electron-deficient nitrogen heterocycle-substituted fluorescein dyes |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2211768T3 true ES2211768T3 (es) | 2004-07-16 |
Family
ID=23982139
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES01907003T Expired - Lifetime ES2211768T3 (es) | 2000-02-07 | 2001-02-05 | Colorantes a base de fluorosceina sustituida por un heterociclo con nitrogeno pobre en electrones. |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US6221604B1 (es) |
| EP (1) | EP1196640B1 (es) |
| JP (5) | JP2003521571A (es) |
| AT (1) | ATE258992T1 (es) |
| AU (1) | AU772739B2 (es) |
| CA (1) | CA2368495C (es) |
| DE (1) | DE60101939T2 (es) |
| ES (1) | ES2211768T3 (es) |
| WO (1) | WO2001057264A2 (es) |
Families Citing this family (53)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6221604B1 (en) * | 2000-02-07 | 2001-04-24 | Pe Corporation | Electron-deficient nitrogen heterocycle-substituted fluorescein dyes |
| JP4741170B2 (ja) * | 2000-10-11 | 2011-08-03 | アプライド バイオシステムズ リミテッド ライアビリティー カンパニー | アニオン性リンカーを有する蛍光核酸塩基結合体 |
| US6887690B2 (en) * | 2001-06-22 | 2005-05-03 | Pe Corporation | Dye-labeled ribonucleotide triphosphates |
| US8569516B2 (en) * | 2001-09-07 | 2013-10-29 | Elitech Holding B.V. | Compounds and methods for fluorescent labeling |
| US6972339B2 (en) | 2001-09-07 | 2005-12-06 | Epoch Biosciences, Inc. | Compounds and methods for fluorescent labeling |
| AU2002347981A1 (en) * | 2001-11-07 | 2003-05-19 | Applera Corporation | Universal nucleotides for nucleic acid analysis |
| US20030148284A1 (en) * | 2001-12-17 | 2003-08-07 | Vision Todd J. | Solid phase detection of nucleic acid molecules |
| US7026166B2 (en) * | 2002-01-22 | 2006-04-11 | Chiron Corporation | Fluorogenic dyes |
| US7074597B2 (en) * | 2002-07-12 | 2006-07-11 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Multiplex genotyping using solid phase capturable dideoxynucleotides and mass spectrometry |
| US7704756B2 (en) * | 2003-01-21 | 2010-04-27 | Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. | Fluorogenic dyes |
| JP4782668B2 (ja) | 2003-03-31 | 2011-09-28 | エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲー | 日本脳炎ウィルス血清グループのメンバーを包含する一定のフラビウィルスを検出するための組成物及び方法 |
| US7399639B2 (en) * | 2003-05-04 | 2008-07-15 | Massachusetts Institute Of Technology | Sensors, and methods of making and using the same |
| US20060029948A1 (en) * | 2003-09-19 | 2006-02-09 | Gary Lim | Sealing cover and dye compatibility selection |
| US7417726B2 (en) * | 2003-09-19 | 2008-08-26 | Applied Biosystems Inc. | Normalization of data using controls |
| US7570443B2 (en) | 2003-09-19 | 2009-08-04 | Applied Biosystems, Llc | Optical camera alignment |
| US7541454B2 (en) * | 2003-10-24 | 2009-06-02 | Epoch Biosciences, Inc. | Compounds and methods for fluorescent labeling |
| WO2005056613A2 (en) * | 2003-12-08 | 2005-06-23 | The Research Foundation Of State University Of New York | Site selectively tagged and templated molecularly imprinted polymers for sensor applications |
| JP4127204B2 (ja) * | 2003-12-17 | 2008-07-30 | セイコーエプソン株式会社 | 液晶表示装置の製造方法 |
| US7598087B2 (en) * | 2004-01-07 | 2009-10-06 | The Research Foundation Of State University Of New York | Protein imprinted polymers with integrated emission sites |
| US20050186606A1 (en) * | 2004-02-11 | 2005-08-25 | Schroeder Benjamin G. | Methods and compositions for detecting nucleic acids |
| US7939251B2 (en) | 2004-05-06 | 2011-05-10 | Roche Molecular Systems, Inc. | SENP1 as a marker for cancer |
| US20050255485A1 (en) * | 2004-05-14 | 2005-11-17 | Livak Kenneth J | Detection of gene duplications |
| JP5128277B2 (ja) | 2004-05-28 | 2013-01-23 | ユニジェン・インコーポレーテッド | 二核酵素の強力な阻害剤としてのジアリールアルカン類 |
| WO2006020947A2 (en) | 2004-08-13 | 2006-02-23 | Epoch Biosciences, Inc. | Phosphonate fluorescent dyes and conjugates |
| US7767834B2 (en) * | 2004-08-13 | 2010-08-03 | Elitech Holding B.V. | Phosphonylated fluorescent dyes and conjugates |
| US20060252079A1 (en) * | 2005-05-03 | 2006-11-09 | Applera Corporation | Fluorescent detection system and dye set for use therewith |
| AU2008326309C1 (en) * | 2007-11-21 | 2015-03-12 | Decode Genetics Ehf | Biaryl PDE4 inhibitors for treating pulmonary and cardiovascular disorders |
| KR102107460B1 (ko) * | 2008-07-21 | 2020-05-08 | 유니젠, 인크. | 일련의 피부-화이트닝(라이트닝) 화합물 |
| KR101718994B1 (ko) * | 2009-09-16 | 2017-03-23 | 포항공과대학교 산학협력단 | 무기 및 유기수은종을 형광을 통하여 감지하는 화학량계의 개발 |
| WO2011155435A1 (ja) | 2010-06-07 | 2011-12-15 | コニカミノルタホールディングス株式会社 | 近接場増強蛍光センサチップ |
| US9134235B2 (en) | 2010-08-17 | 2015-09-15 | Konica Minolta, Inc. | SPFS sensor equipped with mechanism purifying non-specifically adsorptive contaminants |
| WO2012092403A1 (en) | 2010-12-29 | 2012-07-05 | Life Technologies Corporation | Ddao compounds as fluorescent reference standards |
| AU2012231008B2 (en) | 2011-03-24 | 2017-05-11 | Unigen, Inc. | Compounds and methods for preparation of diarylpropanes |
| EP2714939B1 (en) | 2011-05-24 | 2015-04-15 | Elitech Holding B.V. | Detection of methicillin-resistant staphylococcus aureus |
| CN102321063B (zh) * | 2011-07-19 | 2015-07-01 | 华东理工大学 | 一种制备不对称罗丹明的方法 |
| US20140170772A1 (en) | 2011-07-28 | 2014-06-19 | Konica Minolta Inc | Method for Measuring Amount of Analyte and Device for SPFS |
| CN103012354A (zh) * | 2012-12-24 | 2013-04-03 | 广州医药研究总院 | 5（6）-羧基荧光素异构体的制备方法 |
| EP2971106B1 (en) | 2013-03-11 | 2020-02-26 | ELITechGroup, Inc. | Methods for true isothermal strand displacement amplification |
| ES2654631T3 (es) | 2013-05-13 | 2018-02-14 | Elitechgroup B.V. | PCR digital en gotas con sondas cortas de ranura menor |
| CN103508941B (zh) * | 2013-10-29 | 2015-07-22 | 郑州大学 | 2,4-二苯基-5,6-二吡啶基-苯酚及其制备方法 |
| JP2017538418A (ja) | 2014-12-12 | 2017-12-28 | エリテックグループ・ベスローテン・フェンノートシャップＥｌｉｔｅｃｈｇｒｏｕｐ Ｂ．Ｖ． | 抗生物質耐性細菌を検出する方法および組成物 |
| WO2016094162A1 (en) | 2014-12-12 | 2016-06-16 | Elitechgroup B.V. | Methods and compositions for detecting antibiotic resistant bacteria |
| CN107636165A (zh) | 2015-01-12 | 2018-01-26 | 生命科技公司 | 用于核酸文库质量控制和定量的方法、系统和其组合物 |
| WO2016133218A1 (ja) * | 2015-02-20 | 2016-08-25 | 国立大学法人名古屋大学 | ホスファフルオレセイン化合物若しくはその塩、又はそれを用いた蛍光色素 |
| US11549940B2 (en) | 2017-10-02 | 2023-01-10 | Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd. | Method for detecting analyte |
| WO2020132487A1 (en) | 2018-12-20 | 2020-06-25 | Life Technologies Corporation | Modified rhodamine dye and use thereof in biological assays |
| EP3898841A1 (en) | 2018-12-20 | 2021-10-27 | Life Technologies Corporation | Asymmetric rhodamine dye and use thereof in biological assays |
| WO2021080629A1 (en) | 2019-10-23 | 2021-04-29 | Elitechgroup, Inc. | Methods for true isothermal strand displacement amplification |
| US20220407014A1 (en) * | 2019-11-08 | 2022-12-22 | The University Of North Carolina At Charlotte | Asymmetric donor-acceptor molecular dyes |
| EP4079752A4 (en) | 2019-12-06 | 2024-03-20 | Otsuka Pharma Co Ltd | STANDARD SUBSTANCE FOR PSA QUANTIFICATION, PREPARATION METHOD THEREFOR, STANDARD SOLUTION FOR PSA QUANTIFICATION AND PSA QUANTIFICATION METHOD |
| EP4185858A2 (en) | 2020-07-23 | 2023-05-31 | Life Technologies Corporation | Compositions, systems and methods for biological analysis using dyes |
| CN116075597A (zh) | 2020-07-23 | 2023-05-05 | 生命技术公司 | 在生物测定中使用的能量转移染料缀合物 |
| CN113563360A (zh) * | 2021-08-16 | 2021-10-29 | 中国科学技术大学 | 一种两亲性荧光染料及其合成方法和应用 |
Family Cites Families (18)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4318846A (en) | 1979-09-07 | 1982-03-09 | Syva Company | Novel ether substituted fluorescein polyamino acid compounds as fluorescers and quenchers |
| CA1340806C (en) | 1986-07-02 | 1999-11-02 | James Merrill Prober | Method, system and reagents for dna sequencing |
| US5047519A (en) | 1986-07-02 | 1991-09-10 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Alkynylamino-nucleotides |
| US5188934A (en) | 1989-11-14 | 1993-02-23 | Applied Biosystems, Inc. | 4,7-dichlorofluorescein dyes as molecular probes |
| US5654442A (en) * | 1989-11-14 | 1997-08-05 | The Perkin-Elmer Corporation | 4,7-dichlorofluorescein dyes as molecular probes |
| DE69324494T2 (de) | 1992-09-03 | 1999-09-23 | Perkin Elmer Corp | 4,7-dichlorofluoroszein-farbestoffe als molekulare sonden |
| US5538848A (en) | 1994-11-16 | 1996-07-23 | Applied Biosystems Division, Perkin-Elmer Corp. | Method for detecting nucleic acid amplification using self-quenching fluorescence probe |
| US5654419A (en) | 1994-02-01 | 1997-08-05 | The Regents Of The University Of California | Fluorescent labels and their use in separations |
| US5453505A (en) | 1994-06-30 | 1995-09-26 | Biometric Imaging, Inc. | N-heteroaromatic ion and iminium ion substituted cyanine dyes for use as fluorescence labels |
| US6020481A (en) * | 1996-04-01 | 2000-02-01 | The Perkin-Elmer Corporation | Asymmetric benzoxanthene dyes |
| US5863727A (en) | 1996-05-03 | 1999-01-26 | The Perkin-Elmer Corporation | Energy transfer dyes with enhanced fluorescence |
| US5945526A (en) | 1996-05-03 | 1999-08-31 | Perkin-Elmer Corporation | Energy transfer dyes with enhanced fluorescence |
| US5800996A (en) * | 1996-05-03 | 1998-09-01 | The Perkin Elmer Corporation | Energy transfer dyes with enchanced fluorescence |
| US5821356A (en) | 1996-08-12 | 1998-10-13 | The Perkin Elmer Corporation | Propargylethoxyamino nucleotides |
| US5770716A (en) | 1997-04-10 | 1998-06-23 | The Perkin-Elmer Corporation | Substituted propargylethoxyamido nucleosides, oligonucleotides and methods for using same |
| US6130101A (en) * | 1997-09-23 | 2000-10-10 | Molecular Probes, Inc. | Sulfonated xanthene derivatives |
| US6008379A (en) | 1997-10-01 | 1999-12-28 | The Perkin-Elmer Corporation | Aromatic-substituted xanthene dyes |
| US6221604B1 (en) * | 2000-02-07 | 2001-04-24 | Pe Corporation | Electron-deficient nitrogen heterocycle-substituted fluorescein dyes |
-
2000
- 2000-02-07 US US09/498,702 patent/US6221604B1/en not_active Ceased
-
2001
- 2001-02-05 EP EP01907003A patent/EP1196640B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2001-02-05 ES ES01907003T patent/ES2211768T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2001-02-05 AT AT01907003T patent/ATE258992T1/de not_active IP Right Cessation
- 2001-02-05 DE DE60101939T patent/DE60101939T2/de not_active Expired - Lifetime
- 2001-02-05 CA CA002368495A patent/CA2368495C/en not_active Expired - Lifetime
- 2001-02-05 JP JP2001555887A patent/JP2003521571A/ja active Pending
- 2001-02-05 WO PCT/US2001/003772 patent/WO2001057264A2/en active IP Right Grant
- 2001-02-05 AU AU34839/01A patent/AU772739B2/en not_active Expired
-
2004
- 2004-04-06 US US10/819,078 patent/USRE39663E1/en not_active Expired - Lifetime
-
2005
- 2005-09-02 JP JP2005255770A patent/JP2006070270A/ja not_active Withdrawn
-
2006
- 2006-03-20 JP JP2006077798A patent/JP4942150B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
2007
- 2007-05-08 JP JP2007124004A patent/JP2007277564A/ja active Pending
- 2007-05-08 JP JP2007124005A patent/JP2007277565A/ja active Pending
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| AU772739B2 (en) | 2004-05-06 |
| JP4942150B2 (ja) | 2012-05-30 |
| WO2001057264A2 (en) | 2001-08-09 |
| CA2368495A1 (en) | 2001-08-09 |
| EP1196640A2 (en) | 2002-04-17 |
| AU3483901A (en) | 2001-08-14 |
| JP2003521571A (ja) | 2003-07-15 |
| JP2006257427A (ja) | 2006-09-28 |
| WO2001057264A3 (en) | 2002-02-21 |
| JP2006070270A (ja) | 2006-03-16 |
| JP2007277564A (ja) | 2007-10-25 |
| US6221604B1 (en) | 2001-04-24 |
| JP2007277565A (ja) | 2007-10-25 |
| USRE39663E1 (en) | 2007-05-29 |
| ATE258992T1 (de) | 2004-02-15 |
| DE60101939D1 (de) | 2004-03-11 |
| CA2368495C (en) | 2009-09-29 |
| EP1196640B1 (en) | 2004-02-04 |
| DE60101939T2 (de) | 2005-01-05 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| ES2211768T3 (es) | Colorantes a base de fluorosceina sustituida por un heterociclo con nitrogeno pobre en electrones. | |
| ES2329562T3 (es) | Procedimiento para analizar la secuencia de un acido que utiliza colorantes de 4,7-dicloro-rodomina. | |
| US7038063B2 (en) | Atropisomers of asymmetric xanthene fluorescent dyes and methods of DNA sequencing and fragment analysis | |
| ES2225468T3 (es) | Colorantes a base de cianina que modifican la movilidad. | |
| JP2015057478A (ja) | 芳香族置換キサンテン色素 | |
| US7238789B2 (en) | Sulfonated [8,9] benzophenoxazine dyes and the use of their labelled conjugates | |
| EP2179996A1 (en) | Sulfonated diarylrhodamine dyes | |
| CN101258220A (zh) | 荧光染料化合物，共轭物及其应用 | |
| KR20230121556A (ko) | 긴 스토크스 이동 크로메노퀴놀린 염료 및 서열분석 응용에서의 용도 | |
| AU2001259351A1 (en) | Sulfonated (8,9)benzophenoxazine dyes and the use of their labelled conjugates | |
| ES2319648T3 (es) | Composicion atenuadora que comprende restos de antraquinona. | |
| KR20230121555A (ko) | 알킬피리디늄 쿠마린 염료 및 서열분석 응용에서의 용도 |