JP2007222171A - 植物細胞の再生方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】発現用の有益な遺伝子で安定に形質転換したプロトプラストから再生した、植物の提供。
【解決手段】p34cdc2をコードする配列、サイクリン関連キナーゼ機能を有するp34cdc2様蛋白をコードする配列、およびp34cdc2もしくはp34cdc2様分子と相互作用し、p34cdc2もしくはp34cdc2様分子のレベルを調節する調節要素よりなる群から選択される少なくとも1つで形質転換させたトランスジェニック植物または植物細胞であって、ここに、該調節要素は、p13SUC1、サイクリン、cdc25、またはnim-1、wee-1およびmik-1遺伝子の産物よりなる群から選択されることを特徴とする該トランスジェニック植物または植物細胞。
【選択図】図2
【解決手段】p34cdc2をコードする配列、サイクリン関連キナーゼ機能を有するp34cdc2様蛋白をコードする配列、およびp34cdc2もしくはp34cdc2様分子と相互作用し、p34cdc2もしくはp34cdc2様分子のレベルを調節する調節要素よりなる群から選択される少なくとも1つで形質転換させたトランスジェニック植物または植物細胞であって、ここに、該調節要素は、p13SUC1、サイクリン、cdc25、またはnim-1、wee-1およびmik-1遺伝子の産物よりなる群から選択されることを特徴とする該トランスジェニック植物または植物細胞。
【選択図】図2
Description
本発明は、一般に、植物細胞成長の制御方法に関する。さらに詳しくは、本発明は、細胞周期制御蛋白レベルを調節するか、あるいは植物細胞に作用する酵素レベルを変更することによりその活性を調節することによる植物細胞の増殖および分化の制御に指向される。
植物体の形成は、分裂周期による新しい細胞の生成および特殊化した構造および代謝のそれらにおける発育を含む。特殊化には、穀類のごとき単子葉植物の細胞において特別な迅速性をもって減衰する分裂能の減少が伴う。
酵母では、cdc2遺伝子機能が2つの主要制御点を通過する進行に必要であり、その時点で、細胞周期は細胞サイズおよび栄養が満たされるまで遅延させ得る(1;2)。これらの地点の制御は、cdc2遺伝子産物のp34cdc2と刺激要素および抑制要素との相互作用によって行われる(3;4)。
発育の間の細胞分裂を制御するためのp34cdc2レベルの変化の可能な寄与はいずれの生物体においてもほとんど研究されていない。
本発明の目的は、再生植物における発現用の有益な遺伝子で安定に形質転換したプロトプラストから植物を再生させることにある。
本発明では、今回、穀類植物の葉において、p34cdc2の同族体が細胞の分裂および発育の制御に寄与することが判明した。この蛋白の発現および/または活性の調節により、細胞の増殖および分化の制御が可能となり、植物の再生および発育のごときプロセスは容易であろう。
従って、本発明の1の態様は、細胞分裂を修飾するかまたは制御するのに十分な時間および条件下で植物における細胞周期制御蛋白のレベルおよび/または触媒活性を調節することを特徴とする植物細胞成長を制御する方法である。
本発明のこの態様において、「植物細胞」とは、単一の細胞または細胞群あるいはカルスとして培養に存在するいずれの細胞も意味する。また、該細胞は培養において発育している植物におけるものであってもよく、あるいは天然で成長している植物におけるものであってもよい。植物細胞は天然に存在するもの、あるいは植物体から単離してもの、あるいは組換え、突然変異その他誘導化された植物細胞もしくは細胞群であってもよい。植物は双子葉植物または単子葉植物いずれでもよく、後者の場合、細胞周期遺伝子はさらにプロトプラスト細胞からの再生を助ける初期相で使用することもできる。分裂の回復を助けるこのさらなる技術は、小麦、大麦、オート麦、トウモロコシ、米その他の作物に適用する場合に特に価値がある。
単子葉植物については、本発明は二重の利益がある:(1)いずれかの有益遺伝子の導入後におけるより容易なプロトプラストからの再生作業;および(2)細胞周期遺伝子の植物遺伝子型への付加。双子葉植物については、すでに容易に再生可能であるので、利点(2)が特にあてはまる。
好ましくは、細胞周期制御蛋白はその誘導体、同族体および機能的アナログを含めたp34cdc2である。この蛋白は制御されるべき植物細胞に同種、すなわち該細胞において天然に存在するものであるか、あるいは該細胞に対して異種、すなわち該蛋白またはその遺伝子配列が同植物起源でない源からの当該細胞に導入され得るものである。例えば、制御蛋白はもう1つの植物からのものであってよく、あるいはもう1つの酵母細胞のごとき真核生物からものであってもよい。該p34cdc2蛋白またはp34cdc2様分子は、分子のハイブリッドであってもよく、および/または、ハイブリッド遺伝子配列によってコードされるものでもよい。本明細書中で用いる「p34cdc2またはp34cdc2様分子」なる語の使用は同種または異種誘導体、同族体および機能的アナログすべてを含む。本発明は、他の細胞周期制御蛋白まで及び、それらはp34cdc2と同様に機能し、あるいはp34cdc2活性を制御するので、そのような用語使用とする。かかる蛋白は、p34cdc2とは別にあるいはそれと一緒に、p13SUCl、サイクリン(cyclin)、cdc25、およびnim-1、wee-1およびmik-1の産物またはその組合せを包含する。
p34cdc2の「誘導体」とは、誘導体化前に天然に存在する分子における配列と比較して、少なくとも1個のアミノ酸が異なるアミノ酸配列を有するいずれの蛋白分子も意味する。加えて、該用語は組換えもしくは合成分子および単一もしくは複数のアミノ酸の置換、欠失および/または付加あるいは炭水化物またはリピド部位のごとき関連分子のいずれかの置換、欠失および/または付加を担う分子をいう。
便宜には、p34cdc2のレベルはcdc2遺伝子プロモーター(またはその同等物)を操作することによって遺伝子レベルで制御できる。例えば、異なるプロモーターを挿入することができ、それは発育段階で調節でき、あるいはいくつかの他の手段によって調節できる。異なるプロモーターの使用は、促進された発現および/または大いに制御された発現の機会を与え得る。別法として、適当な制御下にある同種または異種cdc2遺伝子の多重コピーを挿入して発現レベルを増加させることができる。また、cdc2遺伝子の発現を助力し、あるいは調節する制御遺伝子または遺伝子部位を操作することが可能であろう。当業者ならば、抑制的遺伝子の発現を減少させるアンチセンス剤またはルボザイム剤の使用のごとき同種および/または異種cdc2遺伝子のin vivoにての発現を制御する種々の手段、ならびにそのようなすべての手段が本発明の範囲内に入ることを直ちに認識するであろう。例えば、p34cdc2のごとき細胞周期蛋白は細胞周期蛋白に対して作用する酵素の活性レベルで制御することができる。
また、p34cdc2レベルは蛋白レベルで制御することもできる。かかる制御はin vitroでの細胞の成長に対しより多く適用されるが、本発明は、必ずしもそのように限定されるものではない。本発明のこの態様において、例えば、細胞周期制御蛋白を培養に添加し、エレクトロポレーションのごとき種々の手法によって細胞に浸透させることができる。適当な形態への蛋白の精製は記載されている(12)。量としては、細胞成長を調節するのに十分な時間および条件下にて使用される。
植物成長を制御する方法に関し、これは、初期の種子発育中におけるとか分裂組織におけるごとく適当な部位および時期に発現できるプロモーターの制御下にて植物ゲノムへの細胞周期遺伝子の安定な組み込みを含み得る。これは、アグロバクテリウムの使用のごとき形質転換の常法によって双子葉植物作物行うことができる。また、それは、胚形成カルス由来の細胞に遺伝子を導入し、続いて再生させるためのバイオリスティック(biolistic)マイロプロジェクタイル衝撃のごとき公表された方法を用いて単子葉植物で行うこともできる。
本発明のもう1つの態様は、長期懸濁培養を行う必要をなくすることによって、形質転換できる単子葉植物の数およびいずれの単子葉植物も形質転換できる容易性を増加させるために細胞周期遺伝子を用いることである。
関連する植物細胞に応じ、細胞膜は処理されたものである必要があれ、および/または、蛋白自身が標的細胞への侵入を容易にするために誘導体化されている必要がある。別法として、周期制御蛋白の活性の阻害剤、拮抗剤または作動剤を用いることもできる。さらに、かかる手法の組合せを用いることもできる。1つの特別の態様において、p34cdc2をオーキシンと組み合わせて使用することもできる。
従って、本発明においては、p34cdc2の量は植物組織における細胞分裂につき限定的であることが判明した。特殊化された機能の発育につき分裂の停止が必要な場合、これは、この鍵細胞周期制御蛋白の低レベルへの減少によって決定する。細胞分裂を回復できる組織においては、この蛋白を分裂に先立って誘導する(12)。さらに、本発明者らは、植物p34cdc2は、酵母p34cdc2の活性を制御する役割を果す分裂酵母からの調節サブユニットp13SUClと相互作用することを見い出した。p13SUClの植物同族体が今回見い出された。p13SUClの機能は分裂酵母における有糸分裂の完成に必要である。植物p34cdc2蛋白が1つの調節サブユニットと関連するという事実は、酵母で遺伝子的に同定されている他の調節相互作用が植物で作動できこと、および酵母からまず採取された調節遺伝子を植物細胞分裂を制御するのに使用し得ることを意味する。従って、本発明はp34cdc2レベルの制御に向けられるのみならず、間接的にp34cdc2活性の調節となるp13SUCl、wee-1、mik-1、nim-1およびcdc25のごとき調節要素の制御まで拡大される。
本発明は植物の再生で特に有用である。例えば、小麦葉の成熟細胞から、DNAの導入に非常に適する健全なプロトプラストが得られるがそれは、植物へ再生するのが非常に困難である。今回、これらの細胞は低レベルのp34cdc2を有し、これらのレベルを増加できないことが判明した。これは、単子葉植物と双子葉植物の間の組織の基本的な相違であろう。後者の群において、成長は先端で起こり、傷をつけると新しい組織を回復できる新しい分裂組織が生成される。しかしながら、単子葉植物では、末端分裂組織はなく、成長は基部分裂組織の継続的分裂による。傷をつけた結果、局在分裂組織は生じない。従って、p34cdc2のレベルを上昇させることによって、単一細胞または細胞群の植物へのp34cdc2再生を容易とできる。
特別の適用は、細胞が従前に懸濁培養で長期増殖を受けていない場合における、その分裂を促進するための形質転換単子葉植物プロトプラストにおける分裂活性の影響である。この目的で、分裂に対する影響は、一過性のものであれば足り、非組込型遺伝的形質転換、または蛋白の導入が適当であろう。この使用は単子葉植物へのいずれかの有益遺伝子の導入を容易にするであろう。
細胞のプロトプラスト化後における分裂の回復を容易にするための細胞周期蛋白またはそれをコードする遺伝子配列の使用は、ゲノムに安定に組み込まれるべき遺伝子の単子葉植物への導入を可能とする。導入された遺伝子は、成長のための温度範囲の増大、病気耐性、水利用、穀類サイズおよび悪条件下における成長を改良するものを含む。
後者に関しては、また、本発明は、植物がその成長を修飾するのに十分な時間および条件下で植物において分裂できる1またはそれを超える植物細胞において細胞周期蛋白のレベルを調節することを特徴とする1またはそれを超える環境条件の存在下で植物成長挙動を修飾する方法に関する。。好ましくは、該植物は小麦、大麦、オート麦、トウモロコシ、米または同様の作物のごとき単子葉植物であり、細胞周期蛋白はp34cdc2またはp34cdc2様分子である。「環境条件」なる語は、高温または低温下での成長、病気への暴露および水もしくは他の栄養物の過剰または不足のごとき条件を含めるようその最も広義で使用する。
穀類サイズおよび成長に関し、安定な組込のために導入される遺伝子は細胞周期制御遺伝子を包含する。この場合、分裂を促進する遺伝子を、全部プロセスの間に2つの方法で用いることができる:1.分裂を再開するために、プロトプラスト化の後の分裂の回復期の間に、コードする蛋白の遺伝子の一過性発現、またはその蛋白の導入を用いる;2.再生後の植物で分裂活性を修飾するために、さらに、Acのごとき転移性要素およびneoのごとき選択可能マーカーも含有するDNAに導入された細胞周期遺伝子を安定に組み込み、また、それを用いる。安定に組み込まれた細胞分裂遺伝子は選択した組織または環境条件下で細胞分裂特性を改良するであろう。
さらに、穀物への根粒の誘導の困難性の一部は必要な局在化細胞分裂を誘導できないという可能性がある。本発明では、例えば、p34cdc2遺伝子のさらなるコピーを酵母からおよび/または植物から穀物へ導入できる。p34cdc2の高レベルは酵母でテストした場合に細胞分裂に対して抑制的でなかったので、導入された遺伝子は構成的プロモーターの制御下にあり得る。誘導可能なプロモーターも使用することができ、それは、p34cdc2の基礎レベルを上昇させることから予測されない困難性があれば、形質転換細胞の再生の間のみ誘導できる。p34cdc2の基礎レベルが上昇した、あるいはリゾビウムの感染の時点でレベルが上昇する植物は窒素固定用根粒を形成できるであろう。
しかしながら、植物細胞増殖を抑制する必要があるかも知れない。例えば、冬季の雨に続いて有限量の水を利用できる場合がしばしばそうであり、作物成長の価値ある部分が発育してしまう前に水源を消費しないように植物成長を抑制するのは有利である。冬季の雨の後に播種した小麦は、土壌水が消費される前に実を結ばなくてはならない。野菜植物の成長および特に水の蒸散は抑制されなければならない。蒸散を減少させる化学薬剤は引き続いての成長に逆の副作用を有することが判明した。本発明は、p34cdc2の発現または活性の減少により毒性副作用なくして成長減少を達成できることを提案する。p34cdc2の発現または活性の減少は前記したごとき多数の方法で達成できる。かかる方法の1つにおいて、p34cdc2の活性を抑制する優性作用用量依存性遺伝子を用いることができる。これらは分裂酵母のwee-1およびmil-1遺伝子である。その制御された発現は水源を考慮するために作物の成長を調節するのに使用される。これには、矮化品種を創製するためには構成的に、あるいは水が限定的になる恐れがあれば誘導剤の適用によって矮化を誘導できるよう誘導的にwee-1および/またはmik-1を導入する必要がある。
また、本発明は、植物成長の制御の他の領域で有用である。例えば、植物器官の最終サイズが発育の臨界的段階における細胞数によって決定されるというのがしばしばその場合である。これは、穀類、豆類およびリンゴのごとき多くの重要な作物に適用される。本発明は収穫を増加させるためにこの段階で細胞分裂を刺激するのに使用できる。
さらに、被覆を形成する草冠成長の刺激は植物が休眠している間の土壌からの蒸発による水の喪失を減少でき、それにより、春に成長が回復した場合により多くの水が利用できる。これは、特に、秋蒔小麦に適用される。
さらに、農夫により表面下方で利用可能なことが知られている水を植物が利用できるように土壌の根貫入を促進するのが望ましい。また、農夫が将来の水供給を提案する場合は、水が限定されるときには苗条成長を遅延させないことが望ましい。植物における制御は、水ストレスの最初の検出時において、かつ、これが収穫を制限するかも知れない農業的状況において、成長の保存的制限を生じる。本発明は、分裂活性を刺激し、p34cdc2に影響を与えることによって作用する優性作用用量依存性遺伝子のコピーを導入するのに使用できる。2つの候補遺伝子はnim-1およびcdc25である。他の戦略は、活性の抑制的調節に応答しないcdc2の突然変異体のコピーを導入することである。2つの突然変異体は
cdc2-1wおよびcdc2-3wである。すべての3種の遺伝子については、発育の適当な段階で誘導すれば発現は最も効果的であろう。1つの可能性はニトレートレダクターゼプロモーターを使用することであり、希薄ニトレート含有栄養の適用によってその発現を誘導する。
cdc2-1wおよびcdc2-3wである。すべての3種の遺伝子については、発育の適当な段階で誘導すれば発現は最も効果的であろう。1つの可能性はニトレートレダクターゼプロモーターを使用することであり、希薄ニトレート含有栄養の適用によってその発現を誘導する。
また、この栄養は誘導されたさらなる成長を有利に支持するであろう。他の誘導剤を利用することができ、すべて本発明に含まれる。
双子葉植物および単子葉植物を共に含めた作物植物の経済的に価値ある部分において成長および発育を促進するために細胞周期制御遺伝子を使用することができる。この第2の分類群において、その再生性を改善するための細胞周期制御遺伝子もしくは蛋白のさらなる一過性使用は有利であるが、胚形成カルスのバイオリスティック(biollistic)形質転換も遺伝子の導入についての可能な経路であろう。
経済的に価値ある組織の最終収穫に細胞数が影響する場合は、発育の数段階で細胞分裂挙動に影響を与えるために細胞周期制御遺伝子を使用できる。特別の例は穀粒における胚乳発育の多核段階における多数繰返核分裂である。
また、本発明は、単子葉植物におけるp34cdc2またはp34cdc2様分子のごとき人工的に制御された細胞周期蛋白を担うトランスジェニック植物もしくは植物細胞に指向され、かかる植物は小麦、大麦、オート麦、トウモロコシ、米または他の作物を含む。かかる人工的制御は高構成もしくは誘導プロモーター、多重遺伝子反復および他の同様な手法および技術を含む。
単子葉植物の再生に関しては、単子葉プロトプラストにつき好ましい1の具体例は、例えば、DNAの2の調製を用いるエレクトロポレーションによって、再生植物における発現用の有益遺伝子(例えば、菌類または害虫に対する耐性または凍結耐性用遺伝子、および分裂挙動を修飾する遺伝子)で安定に形質転換されることである。1のものは、少なくともp34cdc2様分子をコードする遺伝子を担い、恐らく、要すれば、さらに、構成的に発現される35Sまたはその複合pEMUのごときプロモーターの制御下にあって、かつ組込を刺激するトランスポゾン要素およびDNAのこの種の残存性を強化する選択マーカーを欠くサイクリンをコードする遺伝子を担うものである。このDNAは分裂の数回の繰返を促進し、(プロトプラスト化の後に起こるごとく、単子葉植物の単一の細胞ではそうではないが、単子葉植物からの分裂する細胞の組織ではそうであるごとく)分裂が継続するミクロカルスに導くのに十分なくらい長く存在するであろう。同時に導入すべき他のDNAは選択可能マーカー、および再生植物に安定に導入され発現される新しく望ましい特性を付与する遺伝子に隣接するAc遺伝子を含有するものである。安定な形質転換のための遺伝子は、病気および害虫耐性用の遺伝子を包含するが、前記したごとき分裂挙動を改善するための遺伝子も包含できる。単子葉植物の場合、それは葉分裂組織特異的プロモーターの胚乳の制御下で発現されるであろう。
ミクロカルスは、オーキシンホルモン(2,4−D)を含有する固体培地に形質転換細胞を平板培養させることによって生きた状態で得られる。次いで、ミクロカルスを(例えば、カナマイシン型の抗生物質を含有する)選択培地に移して、非形質転換細胞を殺す。生き残るクローンを、オーキシン型ホルモン(2,4-D NAA)ならびにサイトカイン型ホルモン(カイネチン、BAP)および苗条と根の再生のためのABAを含有する培地に移し、次いで、暫時寒気にあてて強くし、育種のために地面に植える。この手法は、トウモロコシおよび恐らくは米のいくつかの株に適用される別の手法よりも優れた2つの利点を有する。別の手法では、懸濁培養にて、(胚形成カルスに由来する)細胞の集塊を衝撃し、次いで、新しい遺伝情報を摂取した細胞を殺すことを試みる。なぜなら、それは、カナマイシンまたは関連抗生物質に対する耐性を欠くものであり、その耐性は安定に組み込まれるべき遺伝子を担うDNAと一緒に導入されるからである。新しいDNAを有しない各集塊におけるすべての細胞を殺すのは困難であるので、キメラ植物が生じる。しかしながら、概説した手法では、個々のプロトプラストとして十分分散され、かくして、キメラは回避される。第2の利点は、プロトプラストが、サテライトDNAへではなくて、核ゲノムへの真性で安定な組込の高い機会を与え、従って、新しい特性を各世代に伝達できる真性育種作物の発育を容易とすることである。
再生植物における発現用の有益な遺伝子で安定に形質転換したプロトプラストから植物が再生される。
以下の図面および実施例を参照し、本発明をさらに詳しく説明する。
図1は、EGV抗体でプローブすることによる小麦葉の細胞分裂領域からの蛋白のウェスタンブロットでp34cdc2同族体の検出を示す写真である。抗体溶液を分け、添加なしで(O)、20nM EGVペプチドEGVPSTAIREISLLKEを添加して(V)、または第13位および第14位に置換を有する改変ペプチドEGTPSTAIREISLMKEの200nMを添加して(T)プレインキュベートした。マーカーの位置およびサイズは右側に示す。
図2は、前記条件下における8日間の発芽の後に採取した小麦の90mm長実生葉において、(A)分析用に採取した葉セグメントおよび(B)分裂の有糸分裂期の細胞の出現率の分布を示すグラフである。葉基部から0および20mm間とこの上部で、10mm間隔で隣接して4mm長セグメントを採取した。図中に試料番号を入れたのは、各セグメントの中心を示す。有糸分裂指標は、4:1エタノール/酢酸で固定し、アセトカルミンで染色した試料で決定した。分裂組織領域における分裂の高出現率は、分裂周期のこの短時間の期間における細胞の検出によって示される。
図3は、図2Aに示したごとく切断した葉セグメントで検出された、p34cdc2同族体レベルにおける細胞分化の間の変化を示す写真である。蛋白50μgを含有する試料をPAGEによって分離し、ニトロセルロースに移し、PonceauSで染色し、次いで、p34cdc2をアフィニティー精製したEGV抗体でプローブし、125I−標識抗−ウサギIgGF(ab')2を用いて検出した。
図4は葉細胞発育の間のp34cdc2同族体および合計蛋白の量の変化のグラフである。(A)蛋白の50μg試料におけるp34cdc2蛋白のレベル、(B)細胞における合計蛋白の濃度(1グラムの組織新鮮塊当たりの合計蛋白)、(C)細胞当たりの平均合計蛋白含量、(D)細胞当たりのp34cdc2同族体の量。図1におけるごとく作成した抽出物における合計蛋白は、オボアルブミン標準を用い、80倍希釈の後に、染料結合によって見積もった。細胞当たりの蛋白は、Bに示した蛋白濃度に、細胞数と同一条件下(5)にて本実験で作成した新鮮な塊との初期測定から得られ、かつこれらの試料で細胞の大きさの測定から確認した平均細胞新鮮塊を乗ずることによって計算した。ウェスタンブロットでのp34cdc2同族体の定量はEGV抗体でプローブすることによって行い、第2抗体をヨウ素化した。完全なセットの試料をニトロセルロースの単一のパネルにて処理したので、直接的比較が可能である。
図5は生トラデスカンティア(Tradescantia)雄しべ毛細胞における有糸分裂核へのp13SUCl蛋白の局在化を示す写真である。
該p13SUCl蛋白は共有結合蛍光基(FLUOS)の励起によって直接検出された。100mM KCl中の0.5mg/ml蛋白を含有する細胞容量の1%と同等の容量のマイクロインジェクションによって該蛋白を導入した。該蛋白は分裂酵母suc1遺伝子によってコードされ、イー・コリで過剰発現され、蛍光標識前に均質精製された標品p13SUClであった。
分裂酵母でp13SUClの有糸分裂活性の制御に必要なp13SUCl蛋白は、有糸分裂の前期に入るに従い核に濃縮されるのが観察された。鮮やかな核が細胞の上部の1/3を占めるのが観察され、暗色染色体がp13SUCl蛍光のバックグラウンドに対して観察された。
図6はツィンニア(Zinnia)根先端細胞にp34cdc2様蛋白が存在することを示す写真である。
p34cdc2に関連するすべての細胞周期制御蛋白で完全に保存されているペプチドEGVPSTAIREISLLKEに対して生起したアフィニティー精製ポリクローナル抗体を用いて蛋白を検出した。
プレ前期バンド(PPB)でのp34cdc2様蛋白の濃度を検出した(矢印)。
図7は、再生可能および再生不能ニコチアナ・プルンバギニフォリア(Nicotiana plumbaginifolia)細胞の懸濁培養における同調的細胞分裂の間のp34cdc2様蛋白(PSTAIR蛋白)のレベルを示すグラフである。該再生可能細胞系は固体培地へ移した際に完全な植物を再生させることができ、該再生不能細胞は懸濁培養における長期増殖の間にこの能力を喪失した。2の細胞系を平行で増殖させ、各々からの蛋白試料を共電気泳動に付し、同一のウェスタンブロットでp34cdc2様蛋白のレベルを見積もった。
各時点で採取した試料の対において、左側のは再生不能細胞系に由来する。
S期に細胞を揃えるアフィジコリン(aphidicolin)ブロックからの放出の後、間隔を置いて、各培養をサンプリングし、無阻害剤培地へ移して同調細胞分裂が得られた。再生不能細胞系は再生可能細胞系の5倍のp34cdc2様蛋白の構成的レベルを有していた。
S期に細胞を揃えるアフィジコリン(aphidicolin)ブロックからの放出の後、間隔を置いて、各培養をサンプリングし、無阻害剤培地へ移して同調細胞分裂が得られた。再生不能細胞系は再生可能細胞系の5倍のp34cdc2様蛋白の構成的レベルを有していた。
同調分裂が両培養で起こっている場合、15〜23時間の間におけるプレ前期バンド頻度の測定は、再生可能細胞系における400細胞のうち59が隔膜形成体を有し、63が隔膜形成体および将来の横断壁の位置を決定するプレ前期バンド(PPB)を有することを示した。対照的に、292隔膜形成体の検出は分裂する細胞がサンプリングされていることを示したが、再生不能細胞系からの2000細胞の大量の試料は、PPBの不存在を示した。PPBの欠如は、懸濁培養の間の変性変化が分裂の面、従って、新しい細胞が形成される方向を決定する機構を排除したことを示す。かかる方向はカルスではなく細胞への成長に必要であり、その不存在はこの培養に再生性が無いことを説明する。本発明の鍵となる特徴は、形質転換細胞におけるp34cdc2活性の制御された一過的上昇の利点を診断することである。これは、プロトプラスト化後に分裂の回復能を得るための懸濁培養における細胞の長期前増殖の必要性を回避するであろう。懸濁培養間におけるp34cdc2のランダムな上昇は予測できず、通常、制御されない分裂および植物再生能力の喪失に至りかねない。
図8は、アッセイ前に14日間2,4−Dを含有する固体培地へ移した後測定した、実生小麦葉セグメントにおけるp34cdc2様蛋白のレベルを示すグラフである。
無菌的に成長させた実生からの葉をセグメント化し、SDS−PAGEによって蛋白を分画し、前記したごとくにアフィニティー精製抗体によってp34cdc2様蛋白を見積もった(11)。
分裂組織細胞分裂領域よりなる葉の基部から採取した組織における細胞を、
2,4−Dによって刺激してp34cdc2様蛋白の合成を継続させ、分裂を継続させた。葉の他の箇所からの細胞は分化してしまっており、2,4−Dに対しては反応せず、p34cdc2様蛋白を合成せず、分裂しなかった。これらの成熟細胞はプロトプラスト化で生き残り、細胞壁を再生できる。それは、一過性発現についての細胞周期遺伝子の導入によって細胞分裂を回復するよう刺激できれば、形質転換に適するであろう。
2,4−Dによって刺激してp34cdc2様蛋白の合成を継続させ、分裂を継続させた。葉の他の箇所からの細胞は分化してしまっており、2,4−Dに対しては反応せず、p34cdc2様蛋白を合成せず、分裂しなかった。これらの成熟細胞はプロトプラスト化で生き残り、細胞壁を再生できる。それは、一過性発現についての細胞周期遺伝子の導入によって細胞分裂を回復するよう刺激できれば、形質転換に適するであろう。
図9Aは、発芽後1、2、4および11日にてのニンジン子葉から抽出した蛋白のウェスタンブロットにおけるp34cdc2様蛋白の検出を示す例示的なグラフである。図9Bは、発芽後種々の日の子葉におけるp34cdc2様蛋白の相対量を示す例示的なグラフである。子葉および発育の段階は各サンプリング時間にて描写的に示されている。相対的ユニットは文献12に記載されている。
実施例1 材料および方法
植物
植物は本実験では先の実験で記載したごとくに正確に成長させた(10)。
蛋白抽出、電気泳動およびブロッティング
液体窒素中で破砕し、洗剤Tween20ならびにプロテアーゼおよびフォスファターゼの阻害剤を含有するRIPA緩衝液と0℃で激しく混合することによって蛋白を抽出した(6)。蛋白50μgを含有する試料を10−15%グラジエントゲル上のSDS−PAGEによって分離した。該蛋白をニトロセルロースに移し、マウスp34cdc2融合蛋白に対する抗体のアフィニティー精製(8)後に、先に記した(6;7)抗−EGVPSTAIREISLLKE抗体(EGB抗体)でプローブした。p34cdc2を含まない対照の精製は反応抗体を与えなかった。結合抗体は前記したごとく(6)アルカリ性フォスファターゼで検出するか、あるいは24時間オートラジオグラフィー暴露を使用する0.5mCi/lにおける125I−標識抗−ウサギIgGF(ab')2(アメルスハム(Amersham)、IM1340)で検出した。
植物
植物は本実験では先の実験で記載したごとくに正確に成長させた(10)。
蛋白抽出、電気泳動およびブロッティング
液体窒素中で破砕し、洗剤Tween20ならびにプロテアーゼおよびフォスファターゼの阻害剤を含有するRIPA緩衝液と0℃で激しく混合することによって蛋白を抽出した(6)。蛋白50μgを含有する試料を10−15%グラジエントゲル上のSDS−PAGEによって分離した。該蛋白をニトロセルロースに移し、マウスp34cdc2融合蛋白に対する抗体のアフィニティー精製(8)後に、先に記した(6;7)抗−EGVPSTAIREISLLKE抗体(EGB抗体)でプローブした。p34cdc2を含まない対照の精製は反応抗体を与えなかった。結合抗体は前記したごとく(6)アルカリ性フォスファターゼで検出するか、あるいは24時間オートラジオグラフィー暴露を使用する0.5mCi/lにおける125I−標識抗−ウサギIgGF(ab')2(アメルスハム(Amersham)、IM1340)で検出した。
p34 cdc2 同族体の定量
p34cdc2同族体はEGV抗体およびヨウ素化第2抗体でプローブすることによってウェスタンブロットで定量した。完全な試料セットをニトロセルロースの単一パネル上で加工し、従って、直接比較可能である。オートラジオグラフィーを用いてp34バンドを位置付けし、次いで、それを放射能活性計数のために切断し、各トラックで測定した低バックグランドで修正した(図3B参照)。
p34cdc2同族体はEGV抗体およびヨウ素化第2抗体でプローブすることによってウェスタンブロットで定量した。完全な試料セットをニトロセルロースの単一パネル上で加工し、従って、直接比較可能である。オートラジオグラフィーを用いてp34バンドを位置付けし、次いで、それを放射能活性計数のために切断し、各トラックで測定した低バックグランドで修正した(図3B参照)。
実施例2 植物細胞における細胞周期制御蛋白の検出
p34 cdc2 同族体の検出
図1は、酵母とヒトの間ではp34cdc2で完全に保存されているが他の蛋白キナーゼにおいては保存されていないEGVPSTAIREISLLKE配列(EGVペプチド)に対して生起した抗体を用いて、小麦葉の細胞分裂領域からの抽出物中にp34cdc2の同族体が検出されたことを示す。哺乳動物p34cdc2に結合させることによるアフィニティー精製の後、該抗体は分子量34×103の小麦蛋白を認識した。認識は保存されたEGVペプチド領域に対し特異的であった。というのは、それは20nM EGVペプチドとの競合によって見積もったからである(図1)。cdc2と同様性を有するが細胞分裂には影響しない、PH085遺伝子によってコードされる相同ペプチド(9)は競合せず、これは、EGV抗体は、細胞周期機能に特異的である最大の完全保存領域内のコンフィギュレーションを認識したことを示す。
p34 cdc2 同族体の検出
図1は、酵母とヒトの間ではp34cdc2で完全に保存されているが他の蛋白キナーゼにおいては保存されていないEGVPSTAIREISLLKE配列(EGVペプチド)に対して生起した抗体を用いて、小麦葉の細胞分裂領域からの抽出物中にp34cdc2の同族体が検出されたことを示す。哺乳動物p34cdc2に結合させることによるアフィニティー精製の後、該抗体は分子量34×103の小麦蛋白を認識した。認識は保存されたEGVペプチド領域に対し特異的であった。というのは、それは20nM EGVペプチドとの競合によって見積もったからである(図1)。cdc2と同様性を有するが細胞分裂には影響しない、PH085遺伝子によってコードされる相同ペプチド(9)は競合せず、これは、EGV抗体は、細胞周期機能に特異的である最大の完全保存領域内のコンフィギュレーションを認識したことを示す。
葉における分布
実生葉(図2A)の基部から先端にかけてセグメントを採取し、細胞分裂はより低い12mmにおいてのみ検出され(図2B)、これは、核DNAへのチミジンの取り込みの領域と一致する。分化の間の蛋白の量の変化(図3A)は、基部から28mmを超えるところのRUBISCOの分子量55×103サブユニットの出現によって説明され、これはクロロプラスト数の増加および光合成の開始と相関する。p34cdc2同族体の電気泳動移動度は、いずれの富蛋白のそれとも合致せず、他の蛋白のそれに対するそのレベルは活性な細胞分裂の領域を外れるとシャープに減衰した(図3B)。図4Aで定量化される相対レベルでのこの減衰は、分化する細胞がサイズ、蛋白濃度(図4B)および、従って合計蛋白含量(図4C)を増加させるに伴う他の蛋白の蓄積のためである。細胞当たりのp34cdc2同族体の量(図4D)は、どれくらいの数の細胞が図3Bおよび4Aでプローブされた蛋白を生成したかを記す細胞当たりの蛋白含量を用いることによって求めた。分化の間にp34cdc2の有意な正味の分解は起こらず、その蓄積の停止によって94%相対減衰が計算された一方、他の蛋白の大々的な合成が分化の間に起こる。
実生葉(図2A)の基部から先端にかけてセグメントを採取し、細胞分裂はより低い12mmにおいてのみ検出され(図2B)、これは、核DNAへのチミジンの取り込みの領域と一致する。分化の間の蛋白の量の変化(図3A)は、基部から28mmを超えるところのRUBISCOの分子量55×103サブユニットの出現によって説明され、これはクロロプラスト数の増加および光合成の開始と相関する。p34cdc2同族体の電気泳動移動度は、いずれの富蛋白のそれとも合致せず、他の蛋白のそれに対するそのレベルは活性な細胞分裂の領域を外れるとシャープに減衰した(図3B)。図4Aで定量化される相対レベルでのこの減衰は、分化する細胞がサイズ、蛋白濃度(図4B)および、従って合計蛋白含量(図4C)を増加させるに伴う他の蛋白の蓄積のためである。細胞当たりのp34cdc2同族体の量(図4D)は、どれくらいの数の細胞が図3Bおよび4Aでプローブされた蛋白を生成したかを記す細胞当たりの蛋白含量を用いることによって求めた。分化の間にp34cdc2の有意な正味の分解は起こらず、その蓄積の停止によって94%相対減衰が計算された一方、他の蛋白の大々的な合成が分化の間に起こる。
実施例3 p34 cdc2 およびP13 SUCl 間の相互作用
p34cdc2の細胞周期制御蛋白様と考えられる植物蛋白は、酵母p34cdc2蛋白と機能的に非常によく似ている。この重要性は、p34cdc2の細胞分裂制御機能および植物蛋白の同様性につき、酵母における決定的な遺伝的証拠があることであり、従って、同様の分裂制御機能がそれらに存在する可能性を支持する。
p34cdc2の細胞周期制御蛋白様と考えられる植物蛋白は、酵母p34cdc2蛋白と機能的に非常によく似ている。この重要性は、p34cdc2の細胞分裂制御機能および植物蛋白の同様性につき、酵母における決定的な遺伝的証拠があることであり、従って、同様の分裂制御機能がそれらに存在する可能性を支持する。
かかる証拠は以下のことを含む:
a)34kDaの同一サイズを有し、抗体によって認識されるアミノ酸配列
EGVPSTAIREISLLKE(PSTAIR)を含有する植物p34cdc2様蛋白もまた、標品酵母p34cdc2に結合する酵母p13SUSlサブユニットに結合する。該結合植物蛋白はカルシウムまたは環状AMPを要しないH1ヒストンに向けられたプロテインキナーゼ活性を有し、これらの点で、標品酵母p34cdc2と同一である。
a)34kDaの同一サイズを有し、抗体によって認識されるアミノ酸配列
EGVPSTAIREISLLKE(PSTAIR)を含有する植物p34cdc2様蛋白もまた、標品酵母p34cdc2に結合する酵母p13SUSlサブユニットに結合する。該結合植物蛋白はカルシウムまたは環状AMPを要しないH1ヒストンに向けられたプロテインキナーゼ活性を有し、これらの点で、標品酵母p34cdc2と同一である。
b)植物は、分裂酵母からの蛋白と同一サイズであって酵母p13SUClに対する抗体によって認識されるp13SUClの同族体を含有する。点(a)および(b)は、一緒に、植物p34cdc2は酵母酵素と同様に調節蛋白との相互作用につき同一の能力を保持することを示す。p13SUClは酵母において成長に必要であり、有糸分裂における後期の完了に必要である。p13SUClと相同な植物蛋白の存在および標品p13SUClへの植物p34cdc2様蛋白の結合の意味するところは、植物p34cdc2は、本発明者らが我々の特許で提案したごとく酵母でまず特徴付けられたネットワークの他の蛋白との相互作用によって調節されるということである。
これらの結果はジョン(John)ら(11)によって開示されており、ここに参照のために挙げる。
実施例4
本実施例は(i)p34cdc2と相互作用する蛋白の細胞内の位置および(ii)可能な標的蛋白に対するp34cdc2の細胞内位置は植物細胞周期におけるp34cdc2の機能と一致するか否かの実験に指向される。
本実施例は(i)p34cdc2と相互作用する蛋白の細胞内の位置および(ii)可能な標的蛋白に対するp34cdc2の細胞内位置は植物細胞周期におけるp34cdc2の機能と一致するか否かの実験に指向される。
a)分裂酵母の13kD蛋白p13SUClをイー・コリ(E. coli)で過剰発現させ、均質に精製し、蛍光染料5(6)−カルボキシフルオレセイン−N−ヒドロキシスクシンイミドエステルで共有結合的に標識し、活性に分裂していた生トラデスカンティア(Tradescantia)雄しべ毛細胞に0.5mg/mlにて微量注射した。該蛋白は有糸分裂前期の核で濃縮され(図5)、これは、p34cdc2は植物における有糸分裂で機能し、p13SUClのごとき調節サブユニットとの協同によって調節されるという提案と合致する。
b)p34cdc2様蛋白の位置は、分裂植物細胞における抗体結合および免疫蛍光顕微鏡によって決定した。該蛋白は細胞質および核に位置するが、初期の有糸分裂では、微小管のプレ前記バンド(PPB)と呼ばれる細胞骨格構造である分裂の配位の主要決定要素に局在するようになる(図6参照)。該PPBは新しい(娘)細胞を分離する横断壁の配位の部位をマークし、それ故、成長が起こる方向を決定する。調節可能なp34cdc2レベルおよびPPB形成能は共に培養細胞から植物を再生する能力において鍵となる要素である。導入された遺伝情報を作物の改良で利用する場合、かかる再生が必要である。p34cdc2レベルおよびPPB成形能という二重の要件は、共に、培養細胞から植物を再生させる能力において鍵となる要素である。導入された遺伝情報を作物の改良で利用する場合、かかる再生が必要である。p34cdc2調節およびPPB形成という二重の要件は2つの要素の共局在によって強調される。
関連系列の調査は、他の界におけるp34cdc2機能に必要な他の蛋白が植物に存在するか否かを確立することを追及してきた。ポリメラーゼ鎖反応(PCR)技術を用いて細胞周期制御遺伝子と相同な植物遺伝子の領域を増幅させた。小麦においては、p34cdc2様蛋白および、G1期でp34cdc2と複合体化するサイクリンのGクラス様蛋白をコードできる遺伝情報が検出されており、細胞周期のG1期でその機能を活性化させることが示唆された。G1サイクリン遺伝子のこの部分の存在およびプローブとしてPCR増幅断片を用いて単子葉植物サイクリンをクローン化するのにそれを使用する能力は重要である。というのは、単子葉植物細胞は共通に細胞周期のG1期を妨げ、適当なサイクリンは分裂を刺激するのを助力するからである。
植物細胞の懸濁培養で起こる再生能の喪失の分子的基礎を直接調べるためにもう1つのアプローチを試みた。
懸濁液中における植物細胞の長期培養は、新鮮な培地での反復希釈および非天然条件下でより迅速に分裂する細胞の暫時の優勢化を含む。本発明者らは、ニコチニア・プルムバギニフォリア(Nicotiana plumbaginifolia)の懸濁培養で、培養を希釈する毎に不可避的に起こるより迅速な分裂細胞についての継続選択の結果、p34cdc2レベルが増加し、プレ前記バンドが喪失したことを観察した(図7に詳細を説明する)。
成熟穀物葉細胞で調べた細胞分裂の抑制は鍵細胞分裂蛋白p34cdc2を誘導できないことによる。2,4−Dを含有する培地で無菌的に培養する場合、組織は活性に分裂する(分裂組織)領域から採取したにも拘わらず、細胞は分裂を支持できるレベルでp34cdc2様蛋白を保持し(図9参照)、一方、低レベルのp34cdc2様蛋白と共に成熟細胞を含有する葉の他の箇所から採取した組織はp34cdc2のレベルを上昇させることができず(図8参照)、また、細胞分裂を開始させることができなかった。細胞分裂を容易に継続する分裂組織は形質転換源としては不適当である。なぜならば、それは細胞壁を再生せず、また、遺伝物質の導入後に細胞分裂を回復できないプロトプラストを生じるからである。成熟細胞は細胞壁を再生できるが、長期懸濁培養に付されたものでない場合、成熟細胞における分裂の主要抑制はp34cdc2蛋白の低レベルのその保持である。
文献
1.ナース・ピイおよびビセット・ワイ(Nurse,P. and Bisset,Y.)、ネイチャー(Nature)292:558−560、1981
2.ナース・ピイおよびファンテス・ピイ(Nurse,P. and Fantes,P.)、ザ・セル・サイクル(The Cell Cycle)、85−98、1981
3.ラッセル・ピイおよびナース・ピイ(Russell,P. and Nurse P.)、セル
(Cell)、49:569−576、1987
4.モレノ・エス、ナース・ピイおよびラッセル・ピイ(Moreno,S.,Nurse,P.and Rissell,P.)、ネイチャー(Nature)344:549−552、1990
5.ウェルニッケ・ダブリューおよびミルコビィッツ・エル(Wernicke,W.and Milkovits,L.)、フィジオロジア・プル(Physiologia Pl.)69 23−28、1987b
6.ジョン・ピイ・シイ・エル、セク・エフ・ジェイおよびリー・ジイ・エム(John,P.C.L.,Sek,F.J. and Lee,G.M.)プラント・セル(Plant Cell)1:1185−1193、1989
1.ナース・ピイおよびビセット・ワイ(Nurse,P. and Bisset,Y.)、ネイチャー(Nature)292:558−560、1981
2.ナース・ピイおよびファンテス・ピイ(Nurse,P. and Fantes,P.)、ザ・セル・サイクル(The Cell Cycle)、85−98、1981
3.ラッセル・ピイおよびナース・ピイ(Russell,P. and Nurse P.)、セル
(Cell)、49:569−576、1987
4.モレノ・エス、ナース・ピイおよびラッセル・ピイ(Moreno,S.,Nurse,P.and Rissell,P.)、ネイチャー(Nature)344:549−552、1990
5.ウェルニッケ・ダブリューおよびミルコビィッツ・エル(Wernicke,W.and Milkovits,L.)、フィジオロジア・プル(Physiologia Pl.)69 23−28、1987b
6.ジョン・ピイ・シイ・エル、セク・エフ・ジェイおよびリー・ジイ・エム(John,P.C.L.,Sek,F.J. and Lee,G.M.)プラント・セル(Plant Cell)1:1185−1193、1989
7.リー・エム・ジイおよびナース・ピイ(Lee,M.G. and Nurse,P.)、ネイチャー(Nature)327:31−35、1987
8.スニダー・エム、エレッジ・エス、スウェーツェル・デイ、ヤング・アール・エイおよびデイビス・アール・ダブリュー(Snyder,M.,Elledge,S.,Sweetser,D.,Young,D.,Young,R.A. and Davis,R.W.)、メス・エンザイム(Meth.Enzym.)154:107−128、1987
9.トー・イー・エイ、タナカ・ケイ、ウエソノ・ワイおよびウイックナー・アール・ビイ(Toh-E.,A.,Tanaka,K.,Uesono,Y. and Wickner,R.B.)、サッカロミセス・セレビシエ・モレク・ジェン・ジェネト(Saccharomyces Cerevisiae
Molec.Gen.Genet.)214:162−164、1988
10.ウィルニッケ・ダブリューおよびミルコヴィッツ・エル(Wernicke,W. and Milkovits,L.)、フィジオロジア・プル(Physiologia Pl.)69:16−22、1987
11.ジョン・ピイ・シイ・エル、セク・エフ・ジェイおよびハイレス・ジェイ(John,P.C.L.,Sek,F.J. and Hayles,J.)、プロトプラズマ(J.Protolasma)
161:70−74、1991
12.コルスト・ジェイ・アール、セク・エフ・ジェイおよびジョン・ピイ・シイ・エル(Corst.J.R.,F.J. and John,P.C.L.)、プランタ(Planta)185:304−310、1991
8.スニダー・エム、エレッジ・エス、スウェーツェル・デイ、ヤング・アール・エイおよびデイビス・アール・ダブリュー(Snyder,M.,Elledge,S.,Sweetser,D.,Young,D.,Young,R.A. and Davis,R.W.)、メス・エンザイム(Meth.Enzym.)154:107−128、1987
9.トー・イー・エイ、タナカ・ケイ、ウエソノ・ワイおよびウイックナー・アール・ビイ(Toh-E.,A.,Tanaka,K.,Uesono,Y. and Wickner,R.B.)、サッカロミセス・セレビシエ・モレク・ジェン・ジェネト(Saccharomyces Cerevisiae
Molec.Gen.Genet.)214:162−164、1988
10.ウィルニッケ・ダブリューおよびミルコヴィッツ・エル(Wernicke,W. and Milkovits,L.)、フィジオロジア・プル(Physiologia Pl.)69:16−22、1987
11.ジョン・ピイ・シイ・エル、セク・エフ・ジェイおよびハイレス・ジェイ(John,P.C.L.,Sek,F.J. and Hayles,J.)、プロトプラズマ(J.Protolasma)
161:70−74、1991
12.コルスト・ジェイ・アール、セク・エフ・ジェイおよびジョン・ピイ・シイ・エル(Corst.J.R.,F.J. and John,P.C.L.)、プランタ(Planta)185:304−310、1991
Claims (5)
- p34cdc2をコードする配列、サイクリン関連キナーゼ機能を有するp34cdc2様蛋白をコードする配列、およびp34cdc2もしくはp34cdc2様分子と相互作用し、p34cdc2もしくはp34cdc2様分子のレベルを調節する調節要素よりなる群から選択される少なくとも1つで形質転換させたトランスジェニック植物または植物細胞であって、ここに、該調節要素は、p13SUC1、サイクリン、cdc25、またはnim-1、wee-1およびmik-1遺伝子の産物よりなる群から選択されることを特徴とする該トランスジェニック植物または植物細胞。
- 増強されたレベルのp34cdc2もしくはp34cdc2−様蛋白を発現する請求項1記載のトランスジェニック植物または植物細胞。
- 単子葉植物である請求項1または2記載のトランスジェニック植物または植物細胞。
- 双子葉植物である請求項1または2記載のトランスジェニック植物または植物細胞。
- 該単子葉植物がトラデスカンティア(Tradescantia)、小麦、大麦、オート麦、トウモロコシまたは米である請求項3記載のトランスジェニック植物または植物細胞。
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US6166293A (en) * | 1996-07-18 | 2000-12-26 | The Salk Institute For Biological Studies | Method of increasing growth and yield in plants |
US6252139B1 (en) | 1996-07-18 | 2001-06-26 | The Salk Institute For Biological Studies | Method of increasing growth and yield in plants |
JP2001516217A (ja) * | 1997-03-14 | 2001-09-25 | クロップデザイン エヌ.ブイ. | 植物の細胞周期タンパク質の調節方法および手段、ならびに植物の細胞増殖制御におけるその使用 |
EA003425B1 (ru) | 1997-03-26 | 2003-04-24 | Кембридж Юниверсити Текникал Сервисиз Лимитед | Химерный ген, обеспечивающий экспрессию в растениях циклина d-типа, и способ получения растений с измененными ростовыми свойствами при использовании указанного гена |
AU733681B2 (en) | 1997-03-26 | 2001-05-24 | Imperial College Innovations Ltd. | Anticoagulant fusion protein anchored to cell membrane |
AU754804B2 (en) * | 1997-09-05 | 2002-11-28 | Cropdesign N.V. | Method and means for modulating plant cell cycle proteins and their use in controlling plant cell growth |
US6710227B1 (en) | 1998-09-16 | 2004-03-23 | Cropdesign N.V. | Cyclin-dependent kinase inhibitors and uses thereof |
WO1999014331A2 (en) * | 1997-09-16 | 1999-03-25 | Cropdesign Nv | Cyclin-dependent kinase inhibitors and uses thereof |
US7265267B1 (en) | 1997-09-16 | 2007-09-04 | Cropdesign N.V. | Cyclin-dependent kinase inhibitors and uses thereof |
EP1025232A1 (en) * | 1997-10-24 | 2000-08-09 | CropDesign N.V. | A novel mitogenic cyclin and uses thereof |
EP1063979A2 (en) * | 1998-03-23 | 2001-01-03 | E.I. Du Pont De Nemours And Company | Plant cell cyclin genes |
JP2002512040A (ja) * | 1998-04-21 | 2002-04-23 | クロップデザイン エヌ.ブイ. | ストレス耐性植物 |
CA2256121A1 (en) * | 1998-06-08 | 1999-12-08 | Hong Wang | Cyclin-dependent kinase inhibitors as plant growth regulators |
WO1999066055A2 (en) * | 1998-06-15 | 1999-12-23 | Cropdesign N.V. | Plant pathogen inducible control sequences operably linked to cell cycle genes and the uses thereof |
US6518487B1 (en) * | 1998-09-23 | 2003-02-11 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Cyclin D polynucleotides, polypeptides and uses thereof |
WO2000037645A2 (en) * | 1998-12-23 | 2000-06-29 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Cell cycle nucleic acids, polypeptides and uses thereof |
US20030172404A1 (en) * | 1999-02-26 | 2003-09-11 | John Peter Crook Lloyd | Method of modifying plant characters by the targeted expression of a cell cycle control protein |
CA2263067A1 (en) * | 1999-02-26 | 2000-08-26 | The Australian National University | Method of modifying plant morphology, biochemistry and physiology |
WO2000056905A2 (en) * | 1999-03-19 | 2000-09-28 | Cropdesign N.V. | Method for enhancing and/or improving plant growth and/or yield or modifying plant architecture |
AU4459100A (en) * | 1999-04-22 | 2000-11-10 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Cell cycle genes and methods of use |
US7230089B1 (en) * | 1999-05-14 | 2007-06-12 | Fred Hutchinson Cancer Research Center | Methods for increasing plant cell proliferation by functionally inhibiting a plant cyclin inhibitor gene |
US6800791B1 (en) * | 1999-05-19 | 2004-10-05 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Method for delivery of proteins to plant cells |
CA2374431A1 (en) * | 1999-09-27 | 2001-04-05 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Enhanced stress tolerance in maize via manipulation of cell cycle regulatory genes |
GB9925634D0 (en) * | 1999-10-29 | 1999-12-29 | Cropdesign Nv | Modification of plants |
US7534933B2 (en) * | 2000-08-18 | 2009-05-19 | University Of Connecticut | Transgenic plants overexpressing a plant vacuolar H + -ATPase |
US8697950B2 (en) * | 1999-11-10 | 2014-04-15 | University Of Connecticut | Vacuolar pyrophosphatases and uses in plants |
US20020178464A1 (en) * | 1999-11-10 | 2002-11-28 | Whitehead Institute For Biomedical Research | Proton transporters and uses in plants |
AU2007201513C1 (en) * | 2000-05-12 | 2014-01-16 | Cropdesign N.V. | Nucleic acid molecules encoding plant cell cycle proteins and uses therefor |
ATE498013T1 (de) * | 2000-05-12 | 2011-02-15 | Cropdesign Nv | Für zellzyklusproteine kodierende nukleinsäure und deren verwendung |
EP1301532B1 (en) * | 2000-07-14 | 2011-02-02 | CropDesign N.V. | Plant cyclin-dependent kinase inhibitors |
GB0018305D0 (en) * | 2000-07-27 | 2000-09-13 | Univ Cambridge Tech | Synchronised arabidopsis cell suspension and uses thereof |
CA2444836C (en) | 2001-04-19 | 2012-03-27 | Adhesives Research, Inc. | Hydrophilic diagnostic devices for use in the assaying of biological fluids |
GB0117600D0 (en) * | 2001-07-19 | 2001-09-12 | Trikon Holdings Ltd | Semiconductor structure |
CN1678748B (zh) * | 2002-09-05 | 2011-11-16 | 作物培植股份有限公司 | 发育被改变的植物以及制备这种植物的方法 |
WO2004061122A2 (en) | 2002-12-26 | 2004-07-22 | Syngenta Participations Ag | Cell proliferation-related polypeptides and uses therefor |
CN104178511A (zh) * | 2004-07-31 | 2014-12-03 | 梅坦诺米克斯有限公司 | 制备具有更快生长和/或更高产量的生物 |
CN101296613B (zh) | 2005-07-29 | 2016-02-10 | 目标栽培公司 | 显性失活突变体krp蛋白保护活性细胞周期蛋白-cdk复合物不受野生型krp抑制 |
KR101316597B1 (ko) | 2010-12-20 | 2013-10-16 | 대한민국 | 벼에서 분리된 유전자를 이용하여 식물의 생장을 조절하는 방법 |
RU2017129844A (ru) | 2011-04-11 | 2019-02-06 | Таргетед Гроус, Инк. | Идентификация и применение мутантных krp у растений |
WO2012142116A2 (en) | 2011-04-11 | 2012-10-18 | Targeted Growth, Inc. | Identification and use of krp mutants in wheat |
Family Cites Families (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
IL81737A (en) * | 1986-03-28 | 1992-11-15 | Calgene Inc | Regulation of gene expression in plant cells |
US5187073A (en) * | 1986-06-30 | 1993-02-16 | The University Of Toledo | Process for transforming gramineae and the products thereof |
US5015580A (en) * | 1987-07-29 | 1991-05-14 | Agracetus | Particle-mediated transformation of soybean plants and lines |
SE461359B (sv) * | 1987-06-30 | 1990-02-05 | Global Security Ab | Saett och anordning foer osynlig maerkning av sedlar eller vaerdehandlingar |
DE3810286A1 (de) * | 1988-03-25 | 1989-10-12 | Max Planck Gesellschaft | Transgene pflanze mit modifizierter physiologie, morphologie und modifiziertem hormonmetabolismus, gewebekulturen dieser pflanze und verfahren zu ihrer herstellung |
DE68929340T2 (de) * | 1988-08-18 | 2002-07-25 | Calgene Llc Davis | Pflanzenverlängerungsfaktor, promotoren, kodierende sequenzen und verwendungen |
US5225341A (en) * | 1990-07-19 | 1993-07-06 | The Regents Of The University Of California | Biologically safe plant transformation system using a ds transposon |
-
1991
- 1991-11-29 WO PCT/AU1991/000556 patent/WO1992009685A1/en active IP Right Grant
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