JP2006528235A - 糖尿病処置用相乗作用組成物 - Google Patents

Abstract

本発明は、糖尿病の処置の必要な患者（被験者）用の糖尿病処置用相乗作用組成物であって、２０〜３０％の範囲の濃度のトリゴネリン（Trigonelline）、２０〜６０％の範囲の濃度のアミノ酸、および１０〜６０％の範囲の濃度の可溶性繊維を、任意で医薬的に許容し得る添加物と共に、含有してなる組成物、その製造法、および糖尿病の処置方法に関する。

Description

本発明は糖尿病処置用相乗作用組成物および該相乗作用組成物の製造法に関する。

糖尿病は最も一般的な内分泌疾患である。この疾患はヒトの血中グルコースレベルの調整が不調であることを特徴とする。血中グルコースは基本的な細胞機能にとってのエネルギー源である。このグルコースは膵臓が分泌するインスリンにより細胞へ送り込まれる。糖尿病は、膵臓による不適切なインスリン分泌によるか、またはインスリン受容体が発生させるインスリンに対する抵抗により、起こる。従って、この疾患は代謝異常を特徴とする。糖尿病は、身体がインスリンを産生しないか、または適切に使用しない、主要な代謝疾病であり、高血糖、糖尿、高脂血症、負の窒素平衡および場合によりケトン血症を特徴とする。糖尿病は今日ヒトの集団に影響を与える最も一般的な疾患の一つである。

インドでは、ＷＨＯレポートによると、約６０００万人もの人々が、２０２５年までに糖尿病に罹患するであろうとされる。これは世界中で、この流行病の影響を受ける中でインドをＮｏ.１の国としたということである。都市部インド人の糖尿病は、１９９５年の１１.８％から２０００年には１３.２％に増加した。この疾病は一生の中の最も生産性の高い時期に人々に襲いかかる。最近実施され公開された研究に基づくと、この疾患は、疾患の遺伝的傾向よりも、ライフスタイルや食習慣により引き起こされることが明らかである。このことは都市部領域で特に顕著であり、都市部ではそのライフスタイルが人々に、運動不足と、より加工された即席食品を食する傾向をもたらす。このことがさらに肥満をもたらし、後には糖尿病の発症に導いている。

糖尿病は治癒できない。現在、この疾病は市場で入手し得る普及品薬物を服用することで管理する。これらの薬物は以下のカテゴリーに入る；−
ｉ．膵臓刺激剤：− このクラスの薬物は膵臓の刺激を助け、インスリンの分泌を増加させる。この薬物は不適切なインスリン分泌を原因とする糖尿病処理が対象である。

ii．インスリン増感剤：− このカテゴリーの薬物は、インスリンの存在に対する細胞の感受性を改善し、それによって細胞へのグルコース取り込みを改善し、良好な血糖値コントロールに導く。
iii．インスリン：− Ｉ型およびII型両方の糖尿病に罹患する人々の場合に、外部からこれを補完する。

すでに述べたように、糖尿病はライフスタイル疾患であり、治癒することができない。従って、現在利用し得る治療法は血糖管理のメカニズムを提供するだけである。糖尿病が慢性の長期間の疾患であるため、これらの薬物は維持することを基本として服用する必要がある。現在利用可能な合成薬は、長期間の使用を原因とする付随する副作用の問題がある。文献検索では、心臓血管性の死亡率は、食事と運動のみによる処置またはインスリンで処置した患者におけるよりも、経口血糖低下剤処置患者での方が高いことを示している。スルホニルウレアは副作用として低血糖を起こす。ビグアニドは乳酸アシドーシスを起こす。経口血糖低下剤もまたＧＩＴ刺激、体重増加、高血圧などを惹き起こす。継続的な一定の激しい活動により、糖尿病の人は膵臓疲労に陥り易い。さらに、既存の利用可能な薬物の多くは、長期間の使用により患者に薬物抵抗性を生じる。

すでに述べたように、糖尿病の長期合併症はより深刻である。これは日中、患者における血糖のスパイクにより惹き起こされる。たとえ短期間であっても、上昇した血糖はヘモ
グロビンの糖化を起こす。そして、糖化ヘモグロビンは、眼、腎臓、神経および血管に長期の不可逆的損傷を惹き起こす。

［糖尿病合併症］
広範囲の病理学的変化は、毛細管基底膜の肥厚、血管壁マトリックスの増加および細胞増殖であり、管腔狭窄、初期アテローム動脈硬化、糸球体毛細管の硬化、網膜症、神経障害および末梢血管不全などの血管性合併症に至る。また、糖尿病では糖化ヘモグロビン（ＨbＡlc）のレベルも上昇し、タンパク質糖化の指標とされる。糖化は２〜３ヶ月前の血糖を反映する。そういう次第で、糖尿病合併症の処置に利用し得る薬物はない。

従って、糖尿病患者の血糖管理の一助となり得る安全で有効な薬物を開発するには時間が掛かる。その薬物は副作用をもたず、また抵抗性を生ずることなく、長期の使用に適していなければならない。

［アーユルヴェーダ］
文献アーユルヴェーダ（Ayurveda）は、糖尿病の処置における多くの植物抽出物の有用性に言及している。一般に、過去５０年にわたる薬理学研究は、かかる血中グルコース低下剤の適切な有効性を明らかにしていない。しかし、アーユルヴェーダ、ウナニ（Unani）、およびシッダ（Siddha）を実践するインドの医師たちは、糖尿病の処置のために１００種以上ものインドの医療用植物の葉、花、果実、種子、木部、樹皮、根、またさらには全草の抽出物を使用する。

アーユルヴェーダでは、各薬草が多くの障害を抑制する性質を有する。従って、薬草の粗製の抽出物は単一の障害においては臨床的に有意な結果を与えることができなかった。特定の適応に関連性をもつ薬草の成分に関する包括的な研究を、この療法から有効な薬物を取得するために行う必要がある。

［別法／糖尿病の制御および管理のための治療法］
近年、糖尿病において努力は、膵島新生または膵臓再生の誘発を介してベータ細胞集団を増やすことに焦点が絞られている。このような状況において、薬草療法の役割は非常に重要である。アーユルヴェーダは根本的なレベルでこの疾患を処置することを目標とする。それ故、薬草から選択した純粋な成分の組成物の作用を、その膵臓生存度増強および新生の潜在能力について探求することは価値のあることである。

コロハ（fenugreek）はインドの伝統的な医療慣行において、糖尿病、偏頭痛、アレルギーおよび上昇コレステロールの処置に使用される。アーユルヴェーダと自然療法の古代インドの慣行によると、コロハの種子は伝統的に血糖コントロール用に、粉末形状か、水で煮沸するか、または出芽した種子として取得する。インドのコロハは、料理用スパイスとしても、また医療用薬草としても使用されることに注目しなければならない。一般に、医療目的に使用される品種は、料理目的に使用される品種に比較して、小型の粒子で、暗褐色で、苦味を有する。現在、医療目的に使用される品種のより良好な医薬的性質についての文献的証明はない。また、コロハ種子の消費により得られる血糖コントロールの医薬的効果は多様であり、血糖コントロール用の信頼できる薬剤としては信用できないことが明らかである。

［臨床研究］
コロハ種子は脱脂粉末として使用した場合、約５０％の食物繊維を含有する。グアーガム同様に、該種子に存在する繊維は胃内での移動時間を遅延しうる。腸管でのグルコース吸収速度と度合いの遅延が、血糖低下のための唯一のメカニズムであるとは思えない。ソウベイル（Sauvaire）らは、グルコース誘発インスリン放出を増加するコロハ種子に存在
するアミノ酸（４−ヒドロキシイソロイシン）を単離した。コロハ種子は血糖低下作用を有するアルカロイド、トリゴネリンを含有する。

以下のヒトでの研究は、１型および２型糖尿病治療におけるコロハの役割について述べている。マダー（Madar）ら（特許文献１）は、２型糖尿病患者２１名の内１７名が、１５グラムの摩砕コロハ種子を投与した後、食後２時間の血清グルコースが平均３０ｍｇ／ｄＬ低下することを見出した（これらは図面から解釈した近似値である；数値データは示されなかった）。食後のグルコース測定では、４名の患者に有意な変化はなかった。

シャーマ（Sharma）ら（非特許文献１）は、興味深い送達方式を用い、１型および２型の患者におけるコロハについて研究した。コロハ粉末を処理して慣れ親しんだ味を除去し、等用量に２分割し、パン種を含まないタイプのパンであるチャパティに取り込んだ。チャパティは昼食時と夕食時に供した。交差実験として、６０名の２型患者につきプラセボ対照治験において、処置群はチャパティとして１２.５ｍｇの脱脂コロハ粉末を昼食時と夕食時に摂取し、これを２４週間等熱量食事とした。この治験では処置群において、血中グルコース濃度曲線の下面積に４０.６％の有意な低下を見出した。二重盲検での研究は、脱脂コロハ粉末を含むか、または含まない等熱量食事を用い、１型糖尿病患者１０名について、１０日間の研究を２期間実施した。患者の内の５名は最初の１０日間コロハを摂取し、残りは第２の期間それを摂取した。コロハ食は空腹時血清グルコースレベルを２７１.８±４.２ｍｇ／ｄＬから１９６.２±４９.５ｍｇ／ｄＬに有意に低下させた。負荷グルコースの摂取後、処置群における血清グルコースレベルは低下し、血中グルコース濃度曲線の下面積は１８.７％有意に低下した。コロハの使用に伴う、総コレステロールおよびトリグリセリドの有意な低下は文献でも証明されている。

ロンドン、ゴーワー街（Gower Street）のユニバーシティカレッジ（University College）、植物・微生物学部門の、ホウデン（Lessly Fowden）、エンプラット（Helen Empratt）およびスミス（Alfred Smith）はコロハ種子について非常に詳細な研究を行い、コロハ種子中にアミノ酸、４−ヒドロキシイソロイシンを同定した。彼らはその知見を発表した（非特許文献２）。この報文ではコロハ種子からの４−ヒドロキシイソロイシンの抽出と精製について詳細な方法を説明している。彼らはまたこのアミノ酸の同定法についても説明している。彼らは摩砕した種子からアミノ酸をエチルアルコールと水で抽出し、次いでイオン交換分離することを示唆した。この粗製の抽出物は、彼らの方法によりさらに精製し、結晶化して４−ヒドロキシイソロイシンの純化合物とした。その構造解明についても上記文献で説明した。

１９８９年、ウォリック大学、化学部門のアルコック（Alcock）らは、詳細な報文を公表した（非特許文献３）。彼らはホウデン（Lessly Fowden）が使用した抽出法を用いて４−ヒドロキシイソロイシンの純品化合物を得た。彼らはその構造を正確に解明した。

ソウベイル（Sauvaire）らによる「非インスリン依存性糖尿病の処置」と題する特許文献２（１９９５年）は４−ヒドロキシイソロイシンについて、糖尿病患者のインスリン分泌を増加させると記載している。同時に、該特許文献に使用されている抽出と精製法は、先行技術として１９７３年にホウデン（Lessly Fowden）が発表した方法と同じである。しかし、この特許は膵臓を刺激し、インスリン分泌を増加させる４−ヒドロキシイソロイシンの特定の性質を開示している。この特許は４−ヒドロキシイソロイシンの作用について、動物においてのみ研究している。彼らはインビトロではラットの膵臓での、インビボでは実験用ラット、実験用イヌおよびマウスでの研究を開示している。糖尿病に罹患する患者で実施した研究はない。

［アミノ酸摂取］
「タンパク質混合物はII型糖尿病に応答してインスリン分泌の有意な増大に導く」（オランダのマーストリヒト大学（Maastricht University）のファン エル（Dr. Luc J.C. Van L）による非特許文献４）。II型糖尿病での炭水化物消費に対するインスリン応答は、遊離アミノ酸／タンパク質混合物を投与することにより増強される。研究者達は糖尿病患者における遊離のロイシンとタンパク質を含有する混合物のインスリン分泌促進能について試験する。彼らは炭水化物摂取のみと比較して、アミノ酸タンパク質混合物の同時摂取が、II型糖尿病の間で有意なインスリン分泌応答に導くことを見出す。これが該研究によると３倍となる。

ガーティ（Garti）らの特許文献３（１９９８年）、標題「ガラクトマンナン製品、同品を含む組成物」は、コロハのガラクトマニン単離方法および食後グルコース、インスリン応答およびコレステロールレベルの低下における天然医薬としての用途を特許請求の範囲とする。彼らはこの請求項のために２２名の被験者について１週間の研究結果を引用している。コロハ由来ガラクトマニンの被験者への投与量は１０グラムであった。

チャン（Peter Chang）による特許文献４（１９９９年）は、コロハ種子の分画方法および可溶性食物繊維、脱臭コロハ種子、高タンパク質コロハ食などの種々フラクションの抽出について記載する。糖尿病の処置については何らの言及もない。

ラオ（Rao）らによる特許文献５（２００２年）は、コロハ種子から実質的に純粋な固定油、オレオレジンおよび食物繊維を得る方法につき記載している。これらの化合物による糖尿病の処置については言及していない。

コロハ種子のアルカロイド、トリゴネリンの低血糖作用については、非特許文献５に解説されている。
米国特許第５８４７１０９号明細書 米国特許第５４７０８７９号明細書 米国特許第５８４７１０９号明細書 米国特許第５９９７８７７号明細書 米国特許第６４９５１７５号明細書 シャーマ（Sharma）ら、European J. of Clinic Nutr、1990年、第44巻、p.301, 306 ホウデン（Lessly Fowden）、エンプラット（Helen Empratt）およびスミス（Alfred Smith）、「トリゴネラ・フォエヌム・グラエクム種子からの４−ヒドロキシイソロイシン（4 Hydroxy Iso Leucine from seeds of Trigonella Foenum Graecum）」、Phytochemistry、1973年、第12巻、p.1707-1711 アルコック（N.W. Alcock）、エイチ（David H）、グロセット（G Grocet）ら、「トリゴネラ・フォエヌム・グラエクムからの４−ヒドロキシイソロイシンの立体化学（Stereochemistry for the 4 Hydroxy Iso Leucine from Trigonella Foenum Graecum）」、Phytochemistry、1989年、第23巻、p.1835-1841 ファン エル（Dr. Luc J.C. Van L）「タンパク質混合物はII型糖尿病に応答してインスリン分泌の有意な増大に導く（Protein Mixture leads to a significant increase in the insulin secretion response to Type II Diabetes）」、Diabetes Care、2003年、第26巻、p.625-630 ケイワイジェイ（Mishkins KYJ）、ビー（Joseph B）、エフジー（Suleman FG）ら、「トリゴネリンの低血糖作用（Hypoglycemic effect of trygonelline）」、LANCET、1967年、2 [7529]、p.1311-2

本発明の主目的は糖尿病処置用の相乗作用組成物を開発することにある。
本発明のもう一つの主目的は、糖尿病を処置するためのコロハ種子からの相乗作用組成物の製造法を開発することにある。
本発明のなおもう一つの目的は、コロハ種子から得られる相乗作用組成物を使用しての糖尿病の処置法を開発することにある。
本発明のさらにもう一つの目的は、トリゴネリンを使用する糖尿病の処置法を開発することにある。

本発明は、糖尿病の処置の必要な患者（被験者）用の糖尿病処置用相乗作用組成物であって、２０〜３０％の範囲の濃度のトリゴネリン（Trigonelline）、２０〜６０％の範囲の濃度のアミノ酸、および１０〜６０％の範囲の濃度の可溶性繊維を、任意で医薬的に許容し得る添加物と共に、含有してなる組成物、その製造法、糖尿病の処置方法に関する。

従って、本発明は、糖尿病の処置の必要な患者（被験者）用の糖尿病処置用相乗作用組成物であって、２０〜３０％の範囲の濃度のトリゴネリン、２０〜６０％の範囲の濃度のアミノ酸、および１０〜６０％の範囲の濃度の可溶性繊維を、任意で医薬的に許容し得る添加物と共に、含有してなる組成物、その製造法、糖尿病の処置方法に関する。

本発明のなおもう一つの態様において、本発明は、糖尿病の処置の必要な患者用（被験者）の糖尿病処置用相乗作用組成物であって、２０〜３０％の範囲の濃度のトリゴネリン、２０〜６０％の範囲の濃度のアミノ酸、および１０〜６０％の範囲の濃度の可溶性繊維を、任意で医薬的に許容し得る添加物と共に、含有してなる組成物に関する。

本発明のなおもう一つの態様において、該アミノ酸はＬ−アルギニン、ロイシン、イソロイシン、および４−ヒドロキシイソロイシンを含む群より選択される。
本発明のなおもう一つの態様において、該可溶性繊維はガラクトマンナンである。
本発明のなおもう一つの態様において、該添加物はガラクトマンナンを含有する群を含む同じコロハから抽出されるものである。

本発明のなおもう一つの態様において、糖尿病はII型糖尿病である。
本発明のなおもう一つの態様において、該組成物は植物コロハから得られる。
本発明のなおもう一つの態様において、該組成物は有害作用を有しない。

本発明のなおもう一つの態様において、本発明は、２０〜３０％の範囲の濃度のトリゴネリン、２０〜６０％の範囲の濃度のアミノ酸、および１０〜６０％の範囲の濃度の可溶性繊維を、任意で医薬的に許容し得る添加物と共に、含有してなる、植物コロハからの相乗作用組成物の製造法であって、
・ コロハの種子を薄片化する工程；
・ 薄片化種子を水性アルコールで抽出する工程；
・ 抽出物を減圧下に濃縮してアルコールを除去する工程；
・ 濃縮物をｎ−ヘキサンで抽出し、脂肪と脂質を除去する工程；
・ 脱脂濃縮物を希釈する工程；
・ 希釈した抽出物を濾過し、不溶物を濾去して生成物を得る工程；
・ 生成物をカラムクロマトグラフィーにより濾過して、アミノ酸とトリゴネリンを溶出する工程；および
・ アミノ酸とトリゴネリンにコロハの繊維を加え、該相乗作用組成物を得る工程；
からなる方法に関する。

本発明のなおもう一つの態様においては、抽出を２０〜７０℃の範囲の温度、好ましくは３５℃で実施する。
本発明のなおもう一つの態様においては、該薄片は約１５ｍｍのサイズのものである。
本発明のなおもう一つの態様においては、水性アルコールが等量比のイソプロピルアルコールと水である。

本発明のなおもう一つの態様においては、抽出を３〜２４時間の範囲の期間、好ましくは１２時間実施する。
本発明のなおもう一つの態様において、該アミノ酸はＬ−アルギニン、ロイシン、イソロイシン、および４−ヒドロキシイソロイシンを含む群より選択される。
本発明のなおもう一つの態様において、該カラムクロマトグラフィーはイオン交換クロマトグラフィーである。
本発明のなおもう一つの態様において、該繊維はガラクトマンナンである。

本発明のなおもう一つの態様において、本発明は糖尿病の処置の必要な患者（被験者）用の糖尿病の処置方法であって、２０〜３０％の範囲の濃度のトリゴネリン、２０〜６０％の範囲の濃度のアミノ酸、および１０〜６０％の範囲の濃度の可溶性繊維を、任意で医薬的に許容し得る添加物と共に、含有してなる組成物の医薬的に許容し得る量を患者に投与する段階を含む方法に関する。

本発明のなおもう一つの態様においては、該相乗作用組成物を５０〜２０００ｍｇ／ｋｇ体重の範囲の投与量で投与する。
本発明のなおもう一つの態様においては、該方法が約５０％の血糖低下作用を示す。
本発明のなおもう一つの態様においては、該方法が膵島生存度 約３００％の増加を示す。
本発明のなおもう一つの態様においては、該方法が膵臓細胞の形態を維持する。

本発明のなおもう一つの態様においては、該相乗作用組成物を経口投与する。
本発明のなおもう一つの態様においては、該相乗作用組成物がカリウムチャンネル仲介インスリン分泌を介して膵臓に作用する。
本発明のなおもう一つの態様において、本発明は糖尿病の処置の必要な患者（被験者）用の糖尿病の処置方法であって、医薬的に許容し得る量の、トリゴネリン、アミノ酸、およびガラクトマンナン繊維を、任意で医薬的に許容し得る添加物と共に、患者に投与する段階を含む方法に関する。

本発明のなおもう一つの態様においては、該添加物がガラクトマンナンを含有する群を含む同じコロハから抽出される。
本発明のなおもう一つの態様においては、糖尿病がII型糖尿病である。
本発明のなおもう一つの態様において、該組成物は有害作用を有しない。
本発明のなおもう一つの態様においては、本発明は該相乗作用組成物を５０〜２０００ｍｇ／ｋｇ体重の範囲の投与量で投与することに関する。

本発明のなおもう一つの態様においては、該方法が約３５％の血糖低下作用を示す。
本発明のなおもう一つの態様においては、該方法が膵島生存度について約３００％の増加を示す。
本発明のなおもう一つの態様においては、該方法が膵臓細胞の形態を維持する。
本発明のなおもう一つの態様においては、該トリゴネリン、アミノ酸およびガラクトマンナン繊維を経口投与する。
本発明のなおもう一つの態様においては、トリゴネリン、アミノ酸およびガラクトマンナン繊維がカリウムチャンネル仲介インスリン分泌を介して膵臓に作用する。

本発明は新規であるのみならず、本質的に進歩性がある。コロハ種子粉末（全体）と本出願の組成物との比較結果を以下に示し、本出願の進歩性を確立する。

上記の表は、本発明者がコロハの選択成分の正しい組合わせに到達し得たことを明瞭に示している。さらに、この正しい組合わせはさらに該組成物の３種の成分それぞれの適切な濃度範囲を使用することによる進歩性によって支持される。このことが本発明を新規かつ本質的に進歩性のあるものとする。

さらに、コロハの成分すべての活性分析は非常に興味深いデータを示した。この活性は唯一組の成分に限定された。また、相乗作用は該組成物の３種の成分の選択的組合せにより観察された。同じことを以下に示す実験データの助けにより詳細に述べる。

上記の結果は組成物の相乗作用を明瞭に確立している。その活性は個々の成分の単なる相加作用よりもかなり高い。むしろ、非活性成分は活性成分の活性を低下させるというデータに非常に明瞭に反映されている。従って、不活性成分を除去することが全体の活性を有意に上昇させた。

本発明にて観察される相乗作用とは別に、該組成物は被験者の膵臓のベータ細胞集団の増加に導く。これは本発明の新しい側面である。他には我々の知識により利用し得るデータはないが、ベータ細胞集団の増加が達成された。このことは本組成物の生理学的な意味を示すものである。さらに、膵島の生存度において約３００％の増加がある。従って、被験者に全体的な有益性を提供するために必要な生理学的変化をさらに補う。

従って、該組成物は糖尿病の新規症例に有効であるのみならず、他の型の１、２、および３の薬物に抵抗性の患者の管理にも有効であろう。

従って、新規性、進歩性、および有用性の特許性要件を満足する。糖尿病における血糖管理の現行法は、副作用のため長期間の使用に適さない。長期の糖尿病合併症も周知であり、それに有効な治療法もない。それ故、血糖管理用の新規化合物を開発する必要性は常に存在する。

コロハ種子が抗コレステロール活性および抗糖尿病活性を有することは既知である。しかし、有効な抗糖尿病性を担う化合物は明確には解明されておらず、ヒト被験者において詳細に研究されていた。コロハ種子は取分け以下の数種の化合物を含む：
１．アミノ酸群
２．揮発性芳香化合物
３．固定油
４．ガラクトマンナンなどの可溶性繊維
５．トリゴネリン
６．種々のサポニン

明らかに、これら化合物のあるものは組み合わせで抗糖尿病の性質を担い、また他のものはその組合せで脂質低下性を担う。
本特許に言及引用した初期の研究では、種子粉末と種子繊維を大量に投与し、ある種の血糖コントロールを得ていた。しかし、論証されているコントロールレベルでは、２型糖
尿病に罹患する被験者が利用し得る臨床的に有意な血糖コントロールを提供するには十分ではない。

種子に見出されるアミノ酸（４−ヒドロキシイソロイシン）は、グルコース仲介方式でインスリン分泌を上昇させる性質を有する。これは動物で広範に試験されている。しかし、この２型糖尿病の管理におけるこのアミノ酸の影響と、長期投与の安全性を首肯するための、２型糖尿病に罹患するヒト被験者（患者）で実施した研究はない。

公表された研究からは、ロイシンなどのある種アミノ酸が２型糖尿病でインスリン分泌応答を改善することが知られる。彼らは今のところ主流の薬剤の役割を想定していない。恐らく、この分枝鎖アミノ酸（４−ヒドロキシイソロイシン）はロイシンと同様の方式で挙動する。

本発明は２型糖尿病の症例に有益な作用を有するコロハ種子の個々の化合物の同定に関する。本発明は、コロハ種子から化合物を抽出し、それが連携して相乗的に作用し、２型糖尿病に罹患する被験者の血糖を有効に制御する特定化合物の組合わせとする方法について説明する。本発明はコロハ種子由来の抽出物の組成物について説明する。

マウスで高い生物活性を有する品種を同定し、存在する個々の化合物を理解するために抽出に付す。これらの品種は以下のものに富むことが判明している：
１．アミノ酸
２．トリゴネリン
３．可溶性繊維ガラクトマンナン。

この種子に見出されるアミノ酸は、Ｌ−アルギニン、ロイシン、イソロイシンおよび４−ヒドロキシイソロイシンである。最適な活性について選抜した種子で検討することを決定した。アミノ酸とトリゴネリンを選抜するために、薄層クロマトグラフィー法を開発した。可溶性繊維をチェックするために定量法を開発した。
アミノ酸含量とトリゴネリン含量をＴＬＣ法により確立した後、種子のどの比率が最適であるかを検討することを決定した。

種子を薄片化に付し、２０℃〜７０℃の範囲の温度で、アルコール組成範囲を５０％〜９０％とし（残部は脱ミネラル水）、３時間〜２４時間の範囲、好ましくは約１２時間、水性アルコール抽出した。澄明な濾過抽出液を既定の容量まで濃縮してアルコールを最大限除去し、既定の容量まで水で希釈する。得られる溶液を微細濾過に付し、次いでイオン交換クロマトグラフィーに付す。先行技術上既知のイオン交換クロマトグラフィーの方法を用いたが、イオン交換樹脂の選択は例外として、トリゴネリンならびにアミノ酸両方に完全に結合し得るものとし、樹脂の選択は該化合物がほんのわずかでも樹脂上に残ることのなく、同じ媒体で溶出されるようにした。

溶出液はＨ⁺型の別の弱酸性カチオン交換樹脂に再度導通し、単離、濃縮および溶出工程に際して形成された代謝産物および不純物を選択的に除去した。この部分では４−ヒドロキシイソロイシンと４−ヒドロキシ吉草酸ケト−メチルとの悪臭のある環化産物をもっぱら除去する。

得られた溶出液はアミノ酸とトリゴネリンのみを含んでいた。得られた液体はディスク噴霧器を有する並流装置上で、３０,０００ｒｐｍの速度で噴霧乾燥した。得られた粉末は微細な顆粒の形状であり、標準化した後に容易に製剤化し得るものであった。

上記の工程において、当初の形状、すなわち種子に存在する活性生体分子の比は、完成
品に充分に維持された。これは当該組成物の活性にとって重要な基準であった。
適切な担体（好ましくは担体としてのコロハ繊維）と混合した後、当該製剤を非常に高い糖化ヘモグロビン値をもつ糖尿病被験体における動物およびヒトでの研究に付した。

［実験例１］
総アミノ酸とトリゴネリンの存在について、予め被覆したシリカゲルＴＬＣプレート上の薄層クロマトグラフィーにより、ｎ−ブタノール：酢酸：水（比率１２：８：２）を用いて種子をスクリーニングした後、トリゴネリンの存在については、２５４ｎｍのＵＶにより初期走査した。総アミノ酸の存在については、ニンヒドリン呈色反応を用いた。

選定した種子１ｋｇを内部のコアと接触させるためにフレーカー中に容れ薄片化し、、平均１５ｍｍのサイズの薄片とした。次いで、これらの薄片をイソプロピルアルコール：水（比率５０：５０）混合物６リットルにより、３５℃で１２時間、水性アルコール抽出に付した。得られた液体（約５５００ｍｌ）を、減圧下に４５〜５０℃で最終容量１５０ｍｌまで濃縮した。この液体をｎ−ヘキサン（３×５０ｍｌ）で抽出し、脂肪と脂質を除去した。脱脂濃縮物を脱ミネラル水で希釈して最終容量５００ｍｌとした。次いで、この液体を２００メッシュサイズのスクリーンでの微細濾過に付し、不溶物を除去した。

次いで、濾過した液体は、３％ＨＣＬ水６００ｍｌで新たに再生し、次いで中性ｐＨとなるまで洗浄したＨ⁺型の強酸性カチオン交換樹脂１００ｍｌを容れた長さ５００ｍｍ×２５ｍｍ径のガラスカラムを通過させた。該液体を通過させた後、カラムを脱ミネラル水で中性のｐＨとなるまで洗浄した。負荷したアミノ酸とトリゴネリンを０.５Ｎアンモニア溶液２００ｍｌで溶出した。約８.０の安定なｐＨとなるまで、アンモニア液をカラムに循環させる。

次いで、得られた溶液を新たに再生したゲル形状の弱酸性カチオン樹脂２００ｍｌを容れた長さ８００ｍｍ×２５ｍｍ径のガラスカラムを通過させた。このカラムからの溶出液は、母体の種子同様の比率で存在するアミノ酸およびトリゴネリンなどの化合物のみを有する無色中性の液体である。この産物は以下の条件で噴霧乾燥する：−
気流 ： 並流
入口温度 ： １６５℃
出口温度 ： ８５℃
噴霧器回転数 ： ３０,０００ｒｐｍ

噴霧乾燥工程から得られた顆粒は自由流動性であり、製剤化に適していることが判明した。
得られた粉末はＵＶによるＤＮＦＢ（ジニトロフルオロベンゼン）とトリゴネリンを用いる誘導化法により、アミノ酸用ＨＰＬＣで選抜する。このものは総アミノ酸を２０〜６０％の比率で、トリゴネリンを２０〜３０％の比率、また可溶性繊維（ガロクトマンネン）を１０〜６０％の比率で含有する。

［実験例２］
実験例１にて説明したコロハの噴霧乾燥抽出物を採る。これを添加剤と混合した後、００サイズのカプセルに充填する。該添加剤はコロハ種子から抽出した繊維である。該繊維は総アミノ酸とトリゴネリンを含有する化合物の抽出後のコロハ種子の廃棄物から抽出する。繊維の抽出手法は以下のとおりである：−

コロハ種子の廃棄物はその５〜１０倍の容量の脱ミネラル水と２〜３時間、７０〜８０℃の温度で沸騰させる。これをキメの粗い濾過と微細な濾過に付す。濾過した液体を活性
炭素で処理して着色物質を除去する。この液体をその当初の容積の１／３まで減圧濃縮する。これにアルコールを加えて繊維を沈殿させる。沈殿を濾過し、繊維残渣を得る。この繊維残渣を乾燥し、摩砕して微粉末とする。粉末化した繊維は主として種子からの複合糖をガラクトマンナンの形状で含む。

添加剤と実験例１にて抽出した活性薬物を、総アミノ酸が２０〜６０％の比率、トリゴネリンを２０〜３０％、および可溶性繊維（ガロクトマンネン）を１０〜６０％の比率で含む組成物を生じるような方法で混合する。

［実験例３］
試験薬物についての用量応答の研究を体重約１００〜１５０ｇの健常ウィスターラットで実施した。９６匹のラットを等しく６群に分割し、試験薬物を２５０ｍｇ／ｋｇ、５００ｍｇ／ｋｇ、１０００ｍｇ／ｋｇおよび２０００ｍｇ／ｋｇの範囲の異なる用量で与え、１群には試験薬物を与えず対照ラットとした。この実験に基づき、試験薬物５００ｍｇ／ｋｇ、１ｇ／ｋｇおよび２ｇ／ｋｇの単回用量投与が血糖低下作用を生じることが判明した。作用の発現は試験薬物５００ｍｇ／ｋｇ投与の４時間後、１ｇ／ｋｇ投与の３時間後、および２ｇ／ｋｇ投与の１時間後であった。作用持続時間は５００ｍｇ／ｋｇの場合４時間、薬物１ｇ／ｋｇの場合７時間、また薬物用量２ｇ／ｋｇの場合２４時間であった。この実験は、該薬物が健常ウイスターラットの場合、１ｇ／ｋｇの用量で約２０％の良好な血糖低下作用を有することを示した。また、試験薬物１ｇ／ｋｇを１５日間投与すると、血糖レベルが９６.３３から７８ｍｇパーセント低下させることを示した。血中脂質プロフィールに顕著な変化はなかった。

［実験例４］
この試験薬物の亜急性毒性は、体重１５０〜２５０ｇのオス・メス両方のスイス・ウイスターラットで実施した。４群８匹の動物それぞれについて、１群を対照とし、残りの群は投与量レベル１ｇ／ｋｇ体重、２ｇ／ｋｇ体重、および４ｇ／ｋｇ体重の薬物で処置した。

１．これらの群に薬物を１５日間連続して投与し、以下についてモニターした：−
・体重
・食餌消費
２．試験終末点で、それら動物を殺し、その臓器 肝臓、腎臓、肺、脾臓および胃を組織病理用と臓器重量チェック用に取り出した。
３．腎機能および肝機能試験などの試験をすべての動物について実施した。

４．血液学パラメータ、例えば、ヘモグロビン、ＲＢＣ数、ＷＢＣ数、好中球、リンパ球、好酸球および赤血球沈降速度などに対する薬物の影響を実施した。
５．上記の研究に基づくと、薬物処置動物の正味の体重増加は、対照と同様であることが観察されている。薬物処置群の食餌消費は対照群に匹敵した。

６．該薬物の投与は、対照群に比較して、血液学パラメータに何らの有意な差を示さなかった。
７．３段階レベルの投与すべてで、該薬物はラットで何らの腎毒性をも示さなかった。
８．肝機能試験は正常な肝機能であることを示した。
９．臓器重量は何らの変動を示さず、対照群のものに匹敵した。

１０．内臓の組織病理は、肝臓、腎臓、脾臓、胃および肺において異常を示さなかった。この毒性研究に基づき、該薬物は投与した用量でラットでは安全であると結論した。

［実験例５］
マウス１６匹にアロキサンを投与して糖尿病を誘発した。これらの動物に対して血液試験を実施することにより、動物が高い血糖レベルを有することを確認した。糖尿病誘発の確認後、動物を試験薬物により、２ｇ／ｋｇ体重の用量で２１〜２６日間処置した。この期間はマウスの尿中糖含量から逆に決定した。尿の糖含量は毎日試験した。試験したマウスは当初陽性であった。２１日目〜２６日目までに、尿中の血糖は薬物での処置期間、試験結果陰性であった。処置の終末点で、動物を殺し、膵臓を摘出してさらなる研究用とした。この時点で、血糖チェックのために血液サンプルも採取した。膵臓は標準手法により大規模の膵島分離に付した；標準手法は文献「成熟マウス膵臓の組織培養“大規模膵島分離”」（Y.M. Shewade、M. Umrani、R.R. Bhonde、Transplantation Proceedinsに発表、1999年、31、p.1721-1723）に説明されている。分離した膵島はその生存度をチェック検討した。この実験に基づき、マウスの血糖レベルはアロキサン投与後３日目までに３００〜３２０上昇することが判明した。薬物を与えなかった対照群では、１５日目までに４８０の血糖値を示した。この群の多くのマウスは研究期間中に死亡した。一方、２ｇ／ｋｇ体重の用量で薬物処置した動物は、血糖レベルが２１０ｍｇまでの低下を示した。該手法に従い、膵島の分離と組織培養後、膵島の生存度が２２％から８１％に上昇することが観察された。観察結果を以下の表に示す：−

１．膵島はアロキサン群のマウスで完全にゆがみ、損傷している。
２．対照マウス（アロキサンも薬物も投与せず）では、膵島が成熟しており、大きく、ほぼ不透明である。
３．アロキサンおよび薬物群では膵島サイズがより小さい。膵島は半透明であって、修復と新生の存在することを示している。

この実験は、薬物の連続投与がアロキサンで糖尿病を誘発したマウスの場合に、糖尿病を逆転させることを証明する。薬物はベータ細胞の生存度を改善に導く。この作用メカニズムは２型糖尿病の損傷した膵臓の生存度を修復する一助となり得る。膵臓の生存度上昇と膵臓の新生潜在能力をこの実験で説明する。

［実験例６］
実験例１および２に従って調製した組成物ならびにカラムクロマトグラフィーにより分離したそれらの個々の成分の作用について、体重２５〜３０ｇのＧＴＴ用正常スイス・アルビノマウス（オス）により検討した。動物は以下の方法で飼育した。

１） グルコース２ｇ／ｋｇを腹膜間に投与
２） 薬物の投与（経口）
・ 総アミノ酸 １０ｍｇ／ｋｇ
・ トリゴネリン ７５ｍｇ／ｋｇ
・ 血糖低下剤（グリブリド） １０ｍｇ／ｋｇ
・ 実験例１および２由来の組成物 ３０ｍｇ／ｋｇ

３） ０分および１時間目でのＢＳＬ測定
４） １時間目血液除去後、直ちに動物を尾部フリッキングにより殺し、膵臓を取出し、トリスバッファーでホモジネートとした。遠心分離後、このホモジネートを薄層クロマトグラフィーにより、またバイオライトアナライザーによるＫ⁺イオンについて特性化した。以下は観察結果である：

上記の実験は、個々の生物活性に比較して、該実験により調製された組成物の活性が上昇していることを明瞭に示している。これは該組成物の作用が相乗性であることを説明するものである。この実験はまた該組成物について可能な作用メカニズムも説明する。

カリウム・チャンネル
イオン・チャンネルは膜を被う水充満細孔を形成するように設計されたタンパク質分子から構成され、開放状態と閉鎖状態との間でスイッチとなり得る。イオン・チャンネルは選択的であり、門扉の性質を有する；すなわち、そのメカニズムは該チャンネルの開放状態と閉鎖状態との間の遷移を制御する。

多くの薬物はイオンを介して作用する。スルホニルウレアなどの経口抗糖尿病薬は、膵臓からのインスリン放出を刺激する。該抗糖尿病薬は膵臓のβ細胞膜上の受容体に作用する。スルホニルウレアと受容体の組合せの結果として、脱分極が起こるが、これはＡＴＰ感受性Ｋ⁺チャンネルの伝道度を低下させることにより、細胞の膜透過ポテンシャルを逆転変化させることを意味する。これがＣａ²⁺流入を増加させ、膵臓β細胞の脱顆粒を生じる（図１）。

それによって、いずれのグルコース濃度においてもインスリンの分泌速度を上げる。
低下したＫ⁺イオン濃度はＡＴＰ依存性のＩ_K-ATPとして再分極作用を示す（図２）。

［実験例７］
インスリン処置中のII型糖尿病患者において、実験例１および２に由来する（試験薬物）組成物の有効性と安全性を評価するための予測的非制御パイロット研究。この型の患者はマウスでの研究において示された生存度上昇／新生ポテンシャルにより選択した。

目的：
本研究の主目的は、インスリンで処置中のII型糖尿病患者の空腹時血糖レベル（ＢＳＬ）に対する試験薬物の効果を評価し、その安全性を評価することであった。第二の目的は、食後のＢＳＬ、糖化Ｈｂに対する試験薬物の効果をチェックし、試験薬物投与後にインスリンの投与量を低下させ得るかどうかを証明することであった。

研究設計：
この臨床治験は予測的非制御多施設研究であった。
研究母集団：
・ 患者３０名
・ II型糖尿病
・ 空腹時ＢＳＬ：１００〜１４０ｍｇ／ｄｌ
・ 少なくともこれまでの６ヶ月間インスリン投与
・ これまでの８週間安定なＢＳＬ
・ これまでの８週間安定用量のインスリン

方法論：
患者は−２週および０週目で適格選別した。適格患者には試験薬物のカプセルを投与した。処置期間は２４週とした。臨床的および実験室的評価は、０、＋２、＋４、＋６、＋８、＋１２、＋１６および＋２４週目に実施した。

処置詳細：
・ 製品：試験薬物
・ 医薬形状：カプセル
・ 被験者は１日に６カプセルを３回に分けて服用することを要求される。各カプセル重量は７００ｍｇ

有効性評価基準：
試験薬物の有効性は、空腹時およびＰＰ（食後） ＢＳＬの低下、糖化Ｈｂ、２回の連続来診間の低血糖発作の回数、基線レベルと比較した試験薬物投与後のインスリン用量に基づいて評価した。
安全性評価基準：
安全性基準は、有害反応、実験室パラメータ、生命兆候、理学的検査およびＥＣＧ検査統計方法：
異なる来診時の平均血糖レベルは、対応のあるｔ検定を用いて基線と比較した。

有効性の結果：
１．空腹時血糖および食後血糖は、投与したインスリンが低下した後にも、安定であった。
２．糖化ＨｂレベルをＶ４（来診４週）、Ｖ６およびＶ８に基線と比較した。統計的に有意な低下がＶ６とＶ８に観察された。
３．数回の来診時のインスリン平均必要量（１日あたり消費した単位で表記）を基線と比較した。インスリン必要量の統計的に有意な低下がすべての来診時に観察された。
４．２回の連続来診間の低血糖発作を最初の２回の来診時基線と比較した。低血糖発作回数の統計的に有意な増加がＶ３とその先で観察された。

安全性の結果：
深刻な有害反応はなかった。
６ヶ月間の本研究に基づき、本薬物は経口血糖低下剤に反応しない２型糖尿病患者において、非常に効果的に血中グルコースレベルを制御することができると規定される。本薬物はまた２型糖尿病患者における糖化ヘモグロビン含量の制御にも有効である。このことは長期の糖尿病合併症の管理に有効な制御手段であることを意味する。

該組成物はベータ細胞集団を増加させ、インスリンを分泌するベータ細胞を刺激する性質を有し、それによってベータ細胞の生存度を増大させ、疾患膵臓の活性を上昇させる。
該組成物は相乗作用的に共に作用して、個々の成分の作用に比較して、より良好に血糖を制御する性質を有する。
該組成物はカリウムチャンネル仲介インスリン分泌を介して膵臓で作用する。

該組成物は、経口血糖低下剤に反応せず、かつインスリンで安定化する２型糖尿病患者において、空腹時血糖を制御する。
該組成物は、経口血糖低下剤に反応せず、かつインスリンで安定化する２型糖尿病患者において、食後血糖を制御する。
該組成物は、経口血糖低下剤に反応せず、かつインスリンで安定化する２型糖尿病患者において、インスリン投与量を減少させることができる。
該組成物は、経口血糖低下剤に反応せず、かつインスリンで安定化する２型糖尿病患者において、糖化ヘモグロビンを制御する。

糖化ヘモグロビン、空腹時血糖、食後の血糖、膵臓ベータ細胞集団の増加およびベータ細胞生存度増加の性質を有する該組成物は、血糖の良好な制御に導き、それによって経口血糖低下剤に反応せず、かつインスリンで安定化する２型糖尿病患者における網膜症、腎症および神経障害などの長期糖尿病合併症の発症を遅延させる。

細胞の膜透過ポテンシャルの逆転変化を説明するグラフである。 細胞膜と、ナトリウム、カルシウム、カリウムとの関係を説明する図である。

Claims (37)

1. 糖尿病の処置の必要な患者（被験者）用の糖尿病処置用相乗作用組成物であって、２０〜３０％の範囲の濃度のトリゴネリン（Trigonelline）、２０〜６０％の範囲の濃度のアミノ酸、および１０〜６０％の範囲の濃度の可溶性繊維を、任意で医薬的に許容し得る添加物と共に、含有してなる組成物。
2. 上記アミノ酸が、Ｌ−アルギニン、ロイシン、イソロイシン、および４−ヒドロキシイソロイシンを含む群より選択される請求項１記載の相乗作用組成物。
3. 上記可溶性繊維がガラクトマンナンである請求項１記載の相乗作用組成物。
4. 上記添加物がガラクトマンナンを含有する群を含む同じコロハ（fenugreek）から抽出されるものである請求項１記載の相乗作用組成物。
5. 上記糖尿病がII型の糖尿病である請求項１記載の相乗作用組成物。
6. 上記組成物が植物コロハから得られるものである請求項１記載の相乗作用組成物。
7. 上記組成物が有害作用を有しない請求項１記載の相乗作用組成物。
8. ２０〜３０％の範囲の濃度のトリゴネリン（Trigonelline）、２０〜６０％の範囲の濃度のアミノ酸、および１０〜６０％の範囲の濃度の可溶性繊維を、任意で医薬的に許容し得る添加物と共に、含有してなる、植物コロハからの相乗作用組成物の製造法であって、
   ａ．コロハの種子を薄片化する工程；
   ｂ．薄片化種子を水性アルコールで抽出する工程；
   ｃ．抽出物を減圧下に濃縮してアルコールを除去する工程；
   ｄ．濃縮物をｎ−ヘキサンで抽出し、脂肪と脂質を除去する工程；
   ｅ．脱脂濃縮物を希釈する工程；
   ｆ．希釈した抽出物を濾過し、不溶物を濾去して生成物を得る工程；
   ｇ．生成物をカラムクロマトグラフィーにより濾過して、アミノ酸とトリゴネリンを溶出する工程；および
   ｈ．アミノ酸とトリゴネリンにコロハの繊維を加え、相乗作用組成物を得る工程；
   からなる方法。
9. 上記抽出を２０〜７０℃の範囲の温度、好ましくは３５℃で実施する請求項８記載の方法。
10. 上記薄片が約１５ｍｍのサイズのものである請求項８記載の方法。
11. 水性アルコールが等量比のイソプロピルアルコールと水である請求項８記載の方法。
12. 上記抽出を３〜２４時間の範囲の期間、好ましくは１２時間実施する請求項８記載の方法。
13. 上記アミノ酸が、Ｌ−アルギニン、ロイシン、イソロイシン、および４−ヒドロキシイソロイシンを含む群より選択される請求項８記載の方法。
14. 上記カラムクロマトグラフィーがイオン交換クロマトグラフィーである請求項８記載の方法。
15. 上記繊維がガラクトマンナンである請求項８記載の方法。
16. 糖尿病の処置の必要な患者（被験者）用の糖尿病の処置方法であって、２０〜３０％の範囲の濃度のトリゴネリン（Trigonelline）、２０〜６０％の範囲の濃度のアミノ酸、および１０〜６０％の範囲の濃度の可溶性繊維を、任意で医薬的に許容し得る添加物と共に、含有してなる組成物の医薬的に許容し得る量を患者に投与する段階を含んでなる方法。
17. 上記アミノ酸が、Ｌ−アルギニン、ロイシン、イソロイシン、および４−ヒドロキシイソロイシンを含む群より選択される請求項１６記載の処置方法。
18. 上記可溶性繊維がガラクトマンナンである請求項１６記載の処置方法。
19. 上記添加物がガラクトマンナンを含有する群を含む同じコロハ（fenugreek）から抽出されるものである請求項１６記載の処置方法。
20. 上記糖尿病がII型の糖尿病である請求項１６記載の処置方法。
21. 上記組成物が有害作用を有しない請求項１６記載の処置方法。
22. 上記相乗作用組成物を５０〜２０００ｍｇ／ｋｇ体重の範囲の投与量で投与する請求項１６記載の方法。
23. 上記方法が約５１％の血糖低下作用を示す請求項１６記載の方法。
24. 上記方法が膵島生存度約３００％の増加を示す請求項１６記載の方法。
25. 上記方法が膵臓細胞の形態を維持する請求項１６記載の方法。
26. 上記相乗作用組成物を経口投与する請求項１６記載の方法。
27. 上記相乗作用組成物がカリウムチャンネル仲介インスリン分泌を介して膵臓に作用する請求項１６記載の方法。
28. 糖尿病の処置の必要な患者（被験者）用の糖尿病の処置方法であって、医薬的に許容し得る量のトリゴネリン（Trigonelline）、アミノ酸、およびガラクトマンナン繊維を、任意で医薬的に許容し得る添加物と共に、患者に投与する段階を含んでなる方法。
29. 上記添加物がガラクトマンナンを含有する群を含む同じコロハ（fenugreek）から抽出されるものである請求項２８記載の処置方法。
30. 上記糖尿病がII型の糖尿病である請求項２８記載の処置方法。
31. 上記組成物が有害作用を有しない請求項２８記載の処置方法。
32. 上記相乗作用組成物を５０〜２０００ｍｇ／ｋｇ体重の範囲の投与量で投与する請求項２８記載の処置方法。
33. 上記方法が約３５％の血糖低下作用を示す請求項２８記載の処置方法。
34. 上記方法が膵島生存度について約３００％の増加を示す請求項２８記載の処置方法。
35. 上記方法が膵臓細胞の形態を維持する請求項２８記載の処置方法。
36. 上記トリゴネリン、アミノ酸およびガラクトマンナン繊維を経口投与する請求項２８記載の処置方法。
37. 上記トリゴネリン、アミノ酸およびガラクトマンナン繊維がカリウムチャンネル仲介インスリン分泌を介して膵臓に作用する請求項２８記載の方法。