JP2006522018A

JP2006522018A - マクロライド系の結晶化及び精製

Info

Publication number: JP2006522018A
Application number: JP2006501251A
Authority: JP
Inventors: ケリー，ビルモス; チョルバシ，アンドレア
Original assignee: テバジョジセルジャールザ−トケルエンムケドレ−スベニュタ−ルシャシャ−グ
Priority date: 2003-03-31
Filing date: 2004-03-31
Publication date: 2006-09-28
Anticipated expiration: 2024-03-31
Also published as: WO2004089958A2; EP1513847A2; TW200504079A; DE04758730T1; ES2229975T1; JP4468943B2; WO2004089958B1; TR200500302T3; US7232486B2; WO2004089958A3; US20040226501A1; IL170331A; KR20050114262A

Abstract

マクロライド、例えばタクロリムス、シロリムス、ピメクロリムス、又はエベロリムスの結晶化及び精製のための方法であり、当該方法はマクロライド、及び極性溶媒、双極性非プロトン性溶媒、又は炭化水素溶媒を7以上のｐHで組合せることを提供するステップを含んで成る。

Description

本発明はマクロライド系、特にタクロリムス、シロリムス（ラパマイシン）、ピメクロリムス、及びエベロリムスの結晶化及び精製に関する。

発明の概要
本発明はマクロライド系、特にタクロリムス、シロリムス、ピメクロリムス、及びエベロリムスの結晶化及び精製のための方法に関し、以下のステップ：マクロライド出発原料；極性溶媒、特にアルカン酸、アルコール、エーテル、脂肪族ケトン、脂肪族ニトリルのアルキルエステルである極性溶媒、又は双極性非プロトン性溶媒；炭化水素溶媒、特に非環式もしくは環式脂肪族炭化水素、又は芳香族炭化水素(例えばトルエン)；及び水；の組合せを提供し；約7以上、特に約8以上のｐHで；約-15℃から約50℃の間の温度で、好適には約-5℃から約40℃で、最適には約-2℃から約35℃の温度で、少なくとも１時間、好適には約48から約100時間、当該組合せを維持し；そして結晶性マクロライドを単離すること、を含んで成る。

他の観点では、本発明はマクロライド、特にタクロリムス、シロリムス、ピメクロリムス、又はエベロリムスの結晶化及び精製のための方法に関し、以下のステップ：極性溶媒、特にアルカン酸、アルコール、エーテル、脂肪族ケトン、脂肪族ニトリルのアルキルエステルである極性溶媒、又は双極性非プロトン性溶媒中で、マクロライド含有生体物質（biomatter）の全培養液(whole-broth)抽出物由来の濃縮残留物を提供し；任意の順序で、水と炭化水素溶媒、特に非環式もしくは環式の脂肪族炭化水素、又は芳香族性炭化水素(例えば、トルエン)の溶液を組合せ、ここでpHは約7以上であり、特に約8以上であり；結晶化時間での結晶化温度で、当該組合せを維持し；そして結晶性マクロライドを単離すること、を含んで成る。

更なる観点では、本発明はマクロライド、特にタクロリムス、シロリムス、ピメクロリムス、又はエベロリムスの結晶化及び精製のための方法に関し、以下のステップ：任意の順序で、マクロライド含有生体物質を抽出することにより得た溶液を濃縮することによって得た濃縮物であるオイルを、疎水性抽出溶媒（例えば酢酸ブチル）；極性溶媒、特にアルカン酸、アルコール、エーテル、脂肪族ケトン、脂肪族ニトリルのアルキルエステルである極性溶媒、又は双極性非プロトン性溶媒；炭化水素溶媒、特に非環式もしくは環式脂肪族炭化水素、又は芳香族炭化水素(例えばトルエン)；及び水；と組合せ、ここでのpHは約7以上であり、特に8以上であり；第一の結晶化時間での第一の結晶化温度で当該組合せを維持し；そして結晶性マクロライドを単離すること、を含んで成る。

上述の任意の観点において、当該組合せを、第二の結晶化時間での第二の結晶化温度で維持することができるが、維持する必要はない。

発明の詳細な説明
本明細書において実測値との関連で用いられる「約」とは、測定及び実験を行い、又は測定及び実験を説明する、測定の目的及び使用される測定設備の精度に対応したレベルで注意を払う当業者により予測されるような実測値の中での変動を意味する。

本明細書において用いられる周囲温度とは、約18℃から約25℃の温度を言う。

本明細書において用いられる「RN」とは、Chemical Abstracts Service, Columbus OH, USAの化合物に指定された登録番号を言う。

本発明の方法は、マクロライド含有出発原料由来のマクロライド系の結晶化及び精製に応用される。マクロライド系は置換基として、１個以上のデオキシ糖を有する多員ラクトン環である。エリスロマイシン、アジスロマイシン、及びクラリスロマイシンは、静菌及び／又は殺菌活性を有するマクロライド系である。マクロライド系のタクロリムス(FK506)及びシロリムス（ラパマイシン）は、本発明の実施において使用するために好適なマクロライド系である。マクロライド系のピメクロリムス(アスコマイシンの33-エピクロロ誘導体；RN=137071-32-0)及びエベロリムス(40-O-(2-ヒドロキシエチル)-ラパマイシン；RN=159351-69-6)も、本発明の実施において使用するために好適なマクロライド系である。

マクロライド系は、いくつかの合成経路が公知であるが、典型的に発酵により得られる。本発明の実施において使用するためのマクロライド出発原料は、任意の起源由来であることができる。マクロライド含有生体物質由来の全発酵培養("全培養液方法")の抽出物を濃縮することによる濃縮残留物は、本発明のマクロライド出発原料として使用できる。濃縮溶液を得るための、当該抽出物中での疎水性抽出溶媒の使用は、１つのステップで菌糸体を除去することにより、隠れた最も水に溶けやすい不純物を除去して効率的な抽出収率をもたらす。減圧下、T＞25℃での濃縮及び減圧は、マクロライドを沈殿又は分解させず、溶媒の高速な蒸発をもたらし、そして本発明の実施において使用するためのマクロライド出発原料を提供する。本発明の実施においてマクロライド出発原料として使用するための濃縮残留物は、米国特許出願10/366,266、米国2003/01666924A1としての公開において発表されたように得ることができ、そして参考文献によりその全体が本明細書中に組み入れられている。

マクロライド生産方法からの油性残留物は、出発マクロライド原料として使用することもできる。

好適なマクロライド含有生体物質は、本発明の実施のためのマクロライド出発原料の起源であることができ、タクロリムス含有生体物質、特にタクロリムス生産微生物を使用する発酵により得られる発酵培養液、例えば、本明細書中に参考文献として組み入れられる全ての米国特許No.4,894,366、5,116,756、5,624,842、5,496,727、及び5,622,866中に記載されたような、Streptomyces tsukubaensis、それらの新規及び突然変異株、Streptomyces hygroscopicus、並びにStreptomyces lividansを含む。シロリムス含有(ラパマイシン含有)生体物質も好適なマクロライド含有生体物質である。シロリムス(ラパマイシン)は、本明細書中に参考文献により導入された米国特許3,993,749中に記載されたようなStreptomyces hygroscopicus、NRRL 5491の発酵により生産され得る。ピメクロリムス含有生体物質及びエベロリムス含有生体物質も、本発明の方法の実施に使用するための好適なマクロライド含有生体物質の例である。アスコマイシン含有生体物質は本発明の実施において使用される好適なマクロライド含有生体物質でもある。

本発明の方法は、特に極性溶媒、炭化水素溶媒、及び塩基類（アルカリ）を使用する。

極性溶媒は、通常周囲温度で液体である有機化合物であり、マクロライド、特にタクロリムス、シロリムス、ピメクロリムス、又はエベロリムスを溶かす。本発明の実施に有用である極性溶媒は、エステル類、アルコール類、脂肪族ニトリル類、非環式及び環式脂肪族エーテル類、脂肪族ケトン類、及び双極性非プロトン性溶媒を含む。

本発明の実施おいて有用なエステル類は、一般式R₁-C(O)O-R₂を有し、式中R₁はH又は直鎖もしくは分岐したC₁-₆アルキルであり、並びにR₂は直鎖もしくは分岐したC₁-₆アルキルである。エステル類の例は、酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸n-プロピル、酢酸イソプロピル、酢酸n-ブチル、酢酸イソブチル、ギ酸メチル、ギ酸n-プロピル、ギ酸イソプロピル、ギ酸n-ブチル、及びギ酸イソブチルを含む、ごくわずかを言う。本発明の実施に有用であるアルコール類(アルカノール類、グリコール類、及び芳香族アルコール類)は、メタノール、エタノール、n-プロパノール、イソプロパノール、エチレングリコール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、アミルアルコール及びベンジルアルコールを含む、ごくわずかを言う。

本発明の実施において有用である脂肪族ケトン類は、一般式R_l-C(O)-R₂を有し、式中R₁及びR₂は独立して直鎖もしくは分岐したアルキル基であり、それぞれ1個から4個の炭素原子を有する。脂肪族ケトン類の例はアセトン、メチルエチルケトン、及びメチルイソブチルケトンを含む、わずか３つを言う。

本発明の実施において有用である脂肪族ニトリル類の例は、アセトニトリル、プロピオニトリル、及びブチロニトリルを含む、わずか３つを言う。

本発明の実施において有用なエーテル類は、非環式及び環式脂肪族エーテル類の両方を含む。非環式脂肪族エーテル類は、一般式R_l-O-R₂を有し、式中R₁及びR₂は上記定義の通りである。非環式脂肪族エーテル類の例は、ジエチルエーテル、ジ-n-プロピルエーテル、及びエチルn-プロピルエーテルを含む、ごくわずかを言う。テトラヒドロフランとジオキサン類は本発明の実施において有用である環式脂肪族エーテル類の例である。

双極性非プロトン性溶媒は、当業者に周知である。ジメチルアセトアミド(DMAC)、ジメチルホルムアミド(DMF)、N-メチル-2-ピロリドン(NMP)、アセトアミド、ジオキサン及びジオキサレン(dioxalane)は、本発明の実施において有用な双極性非プロトン性溶媒の例である。

炭化水素溶媒は、通常周囲温度で液体である有機化合物であり、マクロライド系の貧溶媒である。炭化水素溶媒は、脂肪族炭化水素溶媒であることができ、又はそれらは芳香族性溶媒であり得る。

脂肪族性炭化水素溶媒は、非環式であることができ、又はそれらは環式であり得る。非環式炭化水素溶媒は、直鎖又は分岐されてよく、且つ一般式C_nH_2n+2を有し、ここでのnは約5から約10である。n-ヘキサン、n-ヘプタン、オクタン及びイソオクタンは、好適な非環式炭化水素溶媒の例である。シクロヘキサン及びメチルシクロヘキサンは環式脂肪族炭化水素溶媒の例である。芳香族炭化水素溶媒の例は、ベンゼン、トルエン、キシレン類、及びテトラリン類を含む、ごくわずかを言う。

有機又は無機の任意の塩基は、本発明の実施において使用することができる。無機塩基類の例は、アンモニア、アルカリ及びアルカリ土類金属の水酸化物類、重炭酸塩類及び炭酸塩類を含む、ごくわずかを言う。アミン類は有機塩基類の例であり、本発明の実施において使用することができる。

本発明はマクロライド、好適にはタクロリムス、シロリムス、ピメクロリムス、又はエベロリムスの結晶化及び精製方法を提供し、以下のステップ：マクロライド出発原料、極性溶媒、炭化水素溶媒、及び水の組合せを結晶化容器中に供すことを含んで成り、それによって水富裕相を形成する。水富裕相は、溶媒の大部分が水である相であり、他の溶媒及び溶質を含むことができる。水富裕相のｐHは約７以上であり、又は約７以上になるように調整され、好適には約8以上であり、又は約８以上になるように調整される。pHは塩基の付加により調整され得る。

当該組合せは、好適には撹拌しながら供され、そして約-15℃から約50℃の間、好適には約-5℃から約40℃の間、最適には約-2℃から約35℃の間の温度で、少なくとも１時間、好適には約48から約100時間維持され、それによりマクロライド富裕相が形成される。

当該供された組合せを集合させる方法は、本発明の実施とは無関係である。当該組合せの成分は、任意の順序で集合させることができ、或いはそれらを同時に集合させることができる。

マクロライド、極性溶媒、炭化水素溶媒、及び水の組合せは、撹拌器が備わった結晶化容器中(結晶化空間)で供される。結晶化容器のデザイン及び固有の特徴は重要でなく、そして当業者は当該結晶化容器と撹拌器を、特に組合せの容積及び方法の可変性を基に選定することを知っているであろう。

第一の結晶化の開始時では、当該供された組合せは、少なくとも１つが水富裕性である２以上の相を含むであろう。水富裕相のpHは約7以上であり、好適には約8以上である。水富裕相のpHは、ｐHが常に少なくとも約７以上である限り、総結晶化時間を通して不変であることができ、或いは結晶化時間の過程で可変となり得る。

所望されるpHは任意の利用可能な無機又は有機塩基の使用により確立され、そして所望されるpHは任意の方法又は順番で確立され得る。例えば、当該組合せを集合させるために使用される水のpHは、当該組合せの集合前に、無機又は有機塩基により調整され得る。従って、供される組合せと関連して本明細書において使用される”水”は、無機又は有機塩基（例えばN/10 NaOHaq、N/10 KOH、N/10 Ca(OH)₂、N/10 NH₃aq、N/10 (C₂H₅)₃Naq、N/10ジエチルアミン又はトリエチルアミン、N/10ピリジン等）の希釈水性溶液(水溶液) を含むと理解されるであろう。塩基は、例えば低沸点アミン（例えばメチルアミン）を与えることにより水富裕相が確立される前に、水を導入する前に、付加することができる。当業者は所望される水富裕相のｐＨを確立するための選択的過剰量を認識するであろう。

pHは、無機塩基をそのまま付加することにより当該組合せを集合させた後、特にガスとして、又は例えば水のような適切な溶媒中の溶液中で調整することができる。当該pHは段階的に調整することができる。例えば当該組合せを集合させるために使用される水のpHは、当該組合せが集合する前、そして集合後に、例えば、約7に調整することができ、水富裕相のpHは更に、塩基をそのまま、又は水溶液中に付加することにより、例えばpH8に調整することができる。

総結晶化時間の過程において、少なくとも１つのマクロライド富裕相が発達し、そこから実質的に不純物が存在しないマクロライドが結晶化する。総結晶化時間の終わりに、結晶性マクロライドは任意の一般的な方法（例えば濾過（重量又は減圧補助）又は遠心分離のわずか２つのいずれかを言う）により単離される。単離した結晶性マクロライドの精製は、マルチプルパスクロマトグラフィーにより精製されるマクロライドに匹敵する。

１つの態様では、当該供される組合せは、極性溶媒中でマクロライドの溶液、或いはマクロライド抽出物由来の濃縮物であるマクロライド出発原料、好適にはタクロリムス、シロリムス、ピメクロリムス、又はエベロリムスを供し、そして当該溶液を任意の順序で炭化水素溶媒及び水と組合せるステップにより集合させる。

当該供される溶液は、任意の手段又は方法により作製することができる。当該供される溶液の濃度は、重要でなく、そして一般的に約0.05g/mL(極性溶媒ｍLあたりのマクロライドのグラム)から約0.3/mLの間であろう。当該マクロライドは任意の起源から由来することができ、そして固形、半-固形、又はオイル(特にマクロライド含有生体物質の全培養液抽出物由来の抽出濃縮物からの残留物であるオイル)であり得る。

水と炭化水素溶媒の溶液の相対容積は重要でない。典型的に、炭化水素溶媒の容積に対する溶液の容積率は、約1：2及び約1:10の間であろう。水の容積に対する溶液の容積率は、典型的に約1：8から約1：25の間であろう。

水富裕相のpHは調整することができ、そして当該組合せは上記の通り取り扱われる。

他の態様では、当該供される組合せは、マクロライド出発原料（好適にはタクロリムス、シロリムス、ピメクロリムス、又はエベロリムス出発原料）、炭化水素溶媒、極性溶媒、及び水を任意の順番で組合せることにより集合させる。ここでタクロリムス出発原料は油相にあり、マクロライド含有生体物質を、疎水性抽出溶媒で抽出することにより得られる溶液を濃縮することにより得られる濃縮物である。特にここでの疎水性抽出溶媒は、酢酸又はギ酸のC2-C6直鎖及び分岐したエステル類、C3-C6直鎖又は分岐した脂肪族ケトン類、ハロゲン化メタン類、及び芳香族炭化水素類から成る群から選定され、25℃で液体であり、そして常圧で約150℃未満で沸点を有する。ここでの抽出は、約2℃から約70℃の温度で、特に約30℃から約70℃の間の温度で、そして約5.5から約13の間のｐHで、特に約7.5から約13の間のｐHで行い、疎水性抽出溶媒中でマクロライドの溶液を得る。

オイル(マクロライド出発原料)は極性溶媒又は炭化水素溶媒又は水と最初に組合せることができる。その順序は本発明の実施とは無関係である。所望されるｐHを確立するために要求される塩基は、任意の時点で、又は結晶化前のいくつかの時点で、もしくは結晶化時間中のいくつかの時点で導入することができる。当該塩基はそのまま、又は溶液として（例えば水中の溶液）導入することができる。

本発明の一定の態様を、以下の限定的でない実施例により説明する。

抽出：
タクロリムス(3.42kg)を含む発酵培養液(22.2m³)を6.4m³の酢酸イソブチルにより、9.0-9.5のｐHで抽出した。酢酸イソブチル溶液を6.0-8.0のｐHの水で洗浄した。洗浄した酢酸イソブチル相を、減圧下で40-45℃の温度で、オイル様残留物へ濃縮した。

オイル様残留物を酢酸イソブチルに溶かし、31 Lの容積にした。この濃縮物を167.5 Lのメタノール及び18.6 Lの水で希釈した。当該水-メタノール溶液を139.6 Lのn-ヘキサンで洗浄した。水-メタノール相を減圧下で濃縮し、44 Lの容積にし、そして当該濃縮物を44 Lの水で希釈した。

得られた混合物を88 L酢酸エチルで抽出した。酢酸エチル抽出物を濃縮し、22.4 Lにした。

結晶化：
酢酸エチル抽出物の本濃縮物を158.4Lの0.1Mの水性トリエチルアミン溶液と67.3 Lのn-ヘキサンとを組合せた。当該混合物を20-25℃で3時間撹拌した。当該混合物を0-25℃で、48時間放置した(１時間ごとに１分間撹拌)。

当該形成した結晶を濾過により単離し、そして最初に83Lの0.1M水性トリエチルアミン溶液中で懸濁させ、そして次に、83Lのn-ヘキサン中で懸濁させた。当該結晶を濾過により単離した。

当該結晶を40℃で、減圧下で乾燥させた。乾燥した粗タクロリムスはアッセイで83％を有した。粗産物は1.9 kgのタクロリムスを含む。

当該結晶化ステップの収率は91％であった。

実施例によれば、マクロライド含有生体物質の全培養液抽出から由来する油性濃縮物としてのマクロライド(タクロリムス)を、極性溶媒、炭化水素溶媒、及び塩基を有する水と組合せた。当該組合せを、トータルの結晶化時間での結晶化温度で保持した。トータルの結晶化時間の最後に、当該結晶化マクロライドを単離した。成分比、方法の可変性、及び結果を表Ｉに集計した。

アスコマイシンを含む発酵培養液を実施例１に従って進めた。当該方法では、60％の収率の粗アスコマイシンが得られた。

Claims

マクロライド出発原料からマクロライドを結晶化する方法であって、以下のステップ：
ａ）マクロライド出発原料、極性溶媒、炭化水素溶媒、及び水を組合せることにより、少なくとも２つの相を形成し、その内の少なくとも１つが水富裕相であり、そしてここでの当該水富裕相のｐＨは、少なくとも約７であり、
ｂ）少なくとも１時間当該組合せを維持することにより、当該マクロライドを結晶化するマクロライド富裕相を形成すること、
を含んで成る方法。
前記結晶化するマクロライドを単離するステップを更に含んで成る、請求項１に記載の方法。
前記ステップｂの組合せを約-15℃から約50℃の温度で維持する、請求項１に記載の方法。
前記ステップｂの組合せを約-5℃から約40℃の温度で維持する、請求項３に記載の方法。
前記ステップｂの組合せを約-2℃から約35℃の温度で維持する、請求項４に記載の方法。
前記ステップｂの組合せを48から100時間維持する、請求項１に記載の方法。
前記極性溶媒が、アルコール類、エステル類、ニトリル類、及びエーテル類から成る群から選定される、請求項１に記載の方法。
前記極性溶媒が、酢酸エチル、アセトニトリル、メタノール、エタノール、n-プロパノール、イソプロパノール、n-ブタノール、イソブタノール、アセトン、ジイソプロピルエーテル、ジメチルホルムアミド、及びジメチルアセトアミドから成る群から選定される、請求項７に記載の方法。
前記極性溶媒が酢酸エチルである、請求項８に記載の方法。
前記炭化水素溶媒が、n-ヘキサン、n-ヘプタン、オクタン、イソオクタンシクロヘキサン、メチルシクロヘキサン、ベンゼン、トルエン、及びキシレンから成る群から選定される、請求項１に記載の方法。
前記炭化水素溶媒が、n-ヘキサンである、請求項１０に記載の方法。
前記水富裕相のｐHが約8以上である、請求項１に記載の方法。
前記水がNaOH、KOH、Ca(OH)₂、NH₃、Et₃N、ジエチルアミン及びピリジンから選定される塩基を含んで成る、請求項１に記載の方法。
前記マクロライドがタクロリムス、シロリムス、ピメクロリムス、エベロリムス、及びアスコマイシンから成る群から選定される、請求項１に記載の方法。
マクロライド出発原料からマクロライドを結晶化する方法であって、以下のステップ：
ａ）極性溶媒中で、マクロライド含有生体物質（biomatter）の全培養液(whole-broth)抽出物由来の濃縮残留物を、炭化水素溶媒、及び水と組合せることによって、少なくとも２相を形成し、その内の少なくとも１つが水富裕相であり、そしてここでの水富裕相のｐＨは、少なくとも約７であり、
ｂ）少なくとも１時間当該組合せを維持することにより、当該マクロライドを結晶化するマクロライド富裕相を形成すること、
を含んで成る方法。
前記結晶化するマクロライドを単離するステップを更に含んで成る、請求項１５に記載の方法。
前記ステップｂの組合せを約-15℃から約50℃の温度で維持する、請求項１５に記載の方法。
前記ステップｂの組合せを約-5℃から約40℃の温度で維持する、請求項１７に記載の方法。
前記ステップｂの組合せを約-2℃から約35℃の温度で維持する、請求項１８に記載の方法。
前記ステップｂの組合せを48から100時間維持する、請求項１５に記載の方法。
前記極性溶媒が、アルコール類、エステル類、ニトリル類、及びエーテル類から成る群から選定される、請求項１５に記載の方法。
前記極性溶媒が、酢酸エチル、アセトニトリル、メタノール、エタノール、n-プロパノール、イソプロパノール、n-ブタノール、イソブタノール、アセトン、ジイソプロピルエーテル、ジメチルホルムアミド、及びジメチルアセトアミドから成る群から選定される、請求項２１に記載の方法。
前記極性溶媒が、酢酸エチルである、請求項２２に記載の方法。
前記炭化水素溶媒が、n-ヘキサン、n-ヘプタン、オクタン、イソオクタンシクロヘキサン、メチルシクロヘキサン、ベンゼン、トルエン、及びキシレンから成る群から選定される、請求項１５に記載の方法。
前記炭化水素溶媒が、n-ヘキサンである、請求項２４に記載の方法。
前記水富裕相のｐHが約8以上である、請求項１５に記載の方法。
前記水がNaOH、KOH、Ca(OH)₂、NH₃、Et₃N、ジエチルアミン及びピリジンから選定される塩基を含んで成る、請求項１５に記載の方法。
前記マクロライドがタクロリムス、シロリムス、ピメクロリムス、エベロリムス、及びアスコマイシンから成る群から選定される、請求項１５に記載の方法。
マクロライド出発原料からマクロライドを結晶化する方法であって、以下のステップ：
ａ）約20°から約25℃の温度で、マクロライド出発原料、酢酸エチル、n-ヘキサン、及びNaOH、KOH、Ca(OH)₂、NH₃、(C₂H₅)₃N、ジエチルアミン、及びピリジンから選定される塩基の水溶液を組合せることにより、少なくとも２相を形成し、その内の１つが水富裕相であり、ここでの当該水富裕相のｐＨは＞約７であり、
ｂ）約20℃から約25℃の温度で、少なくとも１時間当該組合せを維持することにより、マクロライドを結晶化するマクロライド富裕相を形成し、
ｃ）約0℃から約20℃の温度で、少なくとも約１時間当該組合せを維持し、そして
ｄ）結晶化する当該マクロライドを回収すること、
を含んで成る方法。
前記マクロライドが、タクロリムス、シロリムス、ピメクロリムス、エベロリムス、及びアスコマイシンから成る群から選定される、請求項２９に記載の方法。
前記水富裕相のｐHが約8以上である、請求項２９に記載の方法。
マクロライド出発原料からマクロライドを結晶化する方法であって、以下のステップ：
ａ）約20°から約25℃の温度で、酢酸エチル、n-ヘキサン、及びNaOH、KOH、Ca(OH)₂、NH₃、(C₂H₅)₃N、ジエチルアミン、及びピリジンから選定される塩基の水溶液中で、マクロライド含有生体物質の全培養液抽出物由来の濃縮残留物を組合せることにより、少なくとも２相を形成し、その内の１つが水富裕相であり、ここでの当該水富裕相のｐＨは＞約７であり、
ｂ）約20℃から約25℃の温度で、少なくとも１時間当該組合せを維持することにより、マクロライドを結晶化するマクロライド富裕相を形成し、
ｃ）約0℃から約20℃の温度で、少なくとも１時間当該組合せを維持し、そして
ｄ）結晶化する当該マクロライドを回収すること、
を含んで成る方法。
前記マクロライドがタクロリムス、シロリムス、ピメクロリムス、エベロリムス、及びアスコマイシンから成る群から選定される、請求項３２に記載の方法。
前記水富裕相のｐHが約８以上である、請求項３２に記載の方法。
マクロライド出発原料からマクロライドを結晶化する方法において、マクロライド出発原料、極性溶媒、炭化水素溶媒、及び水を組合せるステップにより、少なくとも２相を形成し、その内の少なくとも１つが水富裕であり、ここでの当該水富裕相のｐＨは、少なくとも約７である方法。
極性溶媒中のマクロライド含有生体物質の全培養液抽出物由来の濃縮残留物からマクロライドを結晶化する方法において、当該極性溶媒、炭化水素溶媒、及び水の中で、マクロライド濃縮物を組合せるステップにより、少なくとも２相を形成し、その内の少なくとも１つが水富裕であり、ここでの当該水富裕相のｐＨは、少なくとも約７である方法。