JP2006507811A5

JP2006507811A5 -

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Publication number: JP2006507811A5
Application number: JP2004536287A
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Filing date: 2003-09-12
Publication date: 2006-11-02
Anticipated expiration: 2023-09-12

Description

開示された発明を実施するために適切な組換えＰＨＡ産生株を開発するための遺伝子および技術は、一般に、当業者に公知である（ＭａｄｉｓｏｎおよびＨｕｉｓｍａｎ，１９９９，ＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙＲｅｖｉｅｗｓ，６３：２１−５３；ＰＣＴＷＯ９９／１４３１３）。

分解速度を改変するためのその後の改変に適切なＰＨＡポリマーを産生するために用いられ得る方法は、例えば、以下に記載されている：Ｈｏｌｍｅｓらに対する米国特許第４，９１０，１４５号；Ｂｙｒｏｍ，「ＭｉｓｃｅｌｌａｎｅｏｕｓＢｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ」，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ（Ｂｙｒｏｍ編），３３３−５９頁（ＭａｃＭｉｌｌａｎＰｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｌｏｎｄｏｎ１９９１）；ＨｏｃｋｉｎｇおよびＭａｒｃｈｅｓｓａｕｌｔ，「Ｂｉｏｐｏｌｙｅｓｔｅｒｓ」，ＣｈｅｍｉｓｔｒｙａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙｏｆＢｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅＰｏｌｙｍｅｒ（Ｇｒｉｆｆｉｎ編），４８−９６頁（ＣｈａｐｍａｎおよびＨａｌｌ，Ｌｏｎｄｏｎ１９９４）；Ｈｏｌｍｅｓ，「ＢｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙＰｒｏｄｕｃｅｄ（Ｒ）−３−ｈｙｄｒｏｘｙａｌｋａｎｏａｔｅＰｏｌｙｍｅｒｓａｎｄＣｏｐｏｌｙｍｅｒｓ」，ＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓｉｎＣｒｙｓｔａｌｌｉｎｅＰｏｌｙｍｅｒｓ（Ｂａｓｓｅｔｔ編），第２巻，１−６５頁（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｌｏｎｄｏｎ１９８８）；Ｌａｆｆｅｒｔｙら，「ＭｉｃｒｏｂｉａｌＰｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆＰｏｌｙ−ｂ−ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｙｒｉｃａｃｉｄ」，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＲｅｈｍおよびＲｅｅｄ編）第６６巻，１３５−７６頁（Ｖｅｒｌａｇｓｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ１９８８）；ＭｕｌｌｅｒおよびＳｅｅｂａｃｈ，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３２：４７７−５０２（１９９３）；Ｓｔｅｉｎｂｕｅｃｈｅｌ，「ＰｏｌｙｈｙｄｒｏｘｙａｌｋａｎｏｉｃＡｃｉｄｓ」，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ（Ｂｙｒｏｍ編），１２３−２１３頁（ＭａｃＭｉｌｌａｎＰｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｌｏｎｄｏｎ１９９１）；ＷｉｌｌｉａｍｓおよびＰｅｏｐｌｅｓ，ＣＨＥＭＴＥＣＨ，２６：３８−４４，（１９９６）；ＳｔｅｉｎｂｕｅｃｈｅｌおよびＷｉｅｓｅ，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，３７：６９１−６９７（１９９２）；米国特許第５，２４５，０２３号；同第５，２５０，４３０号；同第５，４８０，７９４号；同第５，５１２，６６９号；および同第５，５３４，４３２号；Ａｇｏｓｔｉｎｉら，Ｐｏｌｙｍ．Ｓｃｉ．，第Ａ−１部，９：２７７５−８７（１９７１）；Ｇｒｏｓｓら，Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，２１：２６５７−６８（１９８８）；Ｄｕｂｏｉｓら，Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，２６：４４０７−１２（１９９３）；ＬｅＢｏｒｇｎｅおよびＳｐａｓｓｋｙ，Ｐｏｌｙｍｅｒ，３０：２３１２−１９（１９８９）；ＴａｎａｈａｓｈｉおよびＤｏｉ，Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，２４：５７３２−３３（１９９１）；Ｈｏｒｉら，Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，２６：４３８８−９０（１９９３）；Ｋｅｍｎｉｔｚｅｒら，Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，２６：１２２１−２９（１９９３）；Ｈｏｒｉら，Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，２６：５５３３−３４（１９９３）；Ｈｏｃｋｉｎｇら，Ｐｏｌｙｍ．Ｂｕｌｌ．，３０：１６３−７０（１９９３）；Ｘｉｅら，Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，３０：６９９７−９８（１９９７）；Ｈｕｂｂｓに対する米国特許第５，５６３，２３９号；Ｎｏｄａらに対する米国特許第５，４８９，４７０号および同第５，５２０，１１６号。これらの方法に由来するＰＨＡは、任意の形態（ラテックスまたは固体形態が挙げられる）であり得る。

ＰＨＡ代謝の一部となるためには、プロピオン酸は、補酵素Ａによって活性化されなければならない。それゆえ、活性なＣｏＡトランスフェラーゼまたはＣｏＡシンテターゼが細胞中に存在すべきである。Ｅ．ｃｏｌｉでは、この機能は、ａｔｏ系によって実施される。ＡｔｏＤＡ複合体は、プロピオネートの取り込みおよびプロピオネートへのＣｏＡ輸送の両方を担うようである（ＪｅｎｋｉｎｓおよびＮｕｎｎ，１９８７，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６９：４２−５２）。従って、プロピオネートをＰＨＢＶ産生Ｅ．ｃｏｌｉに供給する場合、ａｔｏ系のポジティブレギュレーターであるａｔｏＣ（ＪｅｎｋｉｎｓおよびＮｕｎｎ，１９８７，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６９：２０９６−２１０２）を構成的に発現する株を用いることは有用である。プロピオニル−ＣｏＡは、アセチル−ＣｏＡと縮合して、３−ヒドロキシバレリル−ＣｏＡを生じる。３−ヒドロキシバレリル−ＣｏＡは、ＰＨＡシンターゼによって取り込まれるべき活性化モノマーである。

ＣｏＡ依存性アルデヒドデヒドロゲナーゼは、プロピオンアルデヒドをプロピオニル−ＣｏＡへと直接的に変換することに作用し得、従って別のＣｏＡシンテターゼまたはＣｏＡトランスフェラーゼについての必要性を軽減し得、細胞質における遊離プロピオン酸の存在を回避し得る。次いで、プロピオニル−ＣｏＡは、β−ケトチオラーゼによってアセチル−ＣｏＡと縮合してβ−ケトアシル−ＣｏＡを形成し、これは次いでレダクターゼ酵素によって還元されてＤ−β−ヒドロキシアシル−ＣｏＡとなり、３ＨＶを含むコポリマーの産生に必要な３ＨＶモノマー単位を提供する。

Ｅ．ｃｏｌｉによってコードされるこのＣｏＡ依存性アルデヒドデヒドロゲナーゼのホモログは、他の生物体中に存在する。酵素アッセイによって決定され得る、配列相同性によって、同じ型の活性を有し得る候補酵素を見出し得る。このような遺伝子の例は、以下である：ＳａｌｍｏｎｅｌｌａｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍｅｕｔＥ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｕ１８５６０）、ＬｉｓｔｅｒｉａｉｎｎｏｃｕａｅｕｔＥ（ＡＬ５９６１６７）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ補酵素Ａ−アシル化アルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＡＦ１５７３０６）、ＳａｌｍｏｎｅｌｌａｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍｐｄｕＰ（ＡＦ０２６２７０）、Ｖｉｂｒｉｏｃｈｏｌｅｒａｅアルコールデヒドロゲナーゼ／アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＡＥ００４２７７）、Ｅ．ｃｏｌｉａｄｈＥのアルデヒドデヒドロゲナーゼセグメント（Ｍ３３５０４）、Ｙｅｒｓｉｎｉａｐｅｓｔｉｓアルデヒド−アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＪ４１４１５１）、鉄を含有するＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｎｅｕｍｏｎｉａｅＴＩＧＲ４アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＥ００７４９１）、ＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｋｌｕｙｖｅｒｉＣｏＡ依存性コハク酸半アルデヒドデヒドロゲナーゼ（Ｌ２１９０２）およびＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓｌａｃｔｉｓアルコール−アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＡＪ００１００８）。多くの他の候補物は、アライメント技術およびデータベース（例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／におけるＧｅｎＢａｎｋ）を用いることによって見出され得る。

プロピオンアルデヒドは、前駆体基質（例えば、１−プロパノールまたはプロピレングリコール）から作製され得、そしてブチルアルデヒドは、ブタノールから産生され得る。これらの変換を触媒し得る酵素の例は、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒｆｒｅｕｎｄｉｉ、またはいくつかの他の生物体のうちの１つ由来の、ジオールオキシドレダクターゼ（ＪｏｈｎｓｏｎおよびＬｉｎ，１９８７，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６９：２０５０−２０５４；Ｄａｎｉｅｌら，１９９５，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７７：２１５１−２１５６）およびグリセロールデヒドラターゼまたはジオールデヒドラターゼ（ＰｏｚｎａｎｓｋａｙａおよびＫｏｒｓｏｖａ，１９８３，Ｂｉｏｋｈｉｍｉｙａ４８：５３９−５４３；Ｔｏｂｉｍａｔｓｕら，１９９６，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：２２３５２−２２３５７）である。これらの酵素は、グリセロールを１，３−プロパンジオールへと変換し得る生物体中に見出されるが、ホモログは、配列決定された遺伝子およびゲノムのデータベースを検索することにより、他の生物体中に見出され得る。グリセロールまたはジオールデヒドラターゼは、補酵素Ｂ_１２依存性反応においてプロピレングリコールをプロピオンアルデヒドへと変換し得る；ジオールオキシドレダクターゼは、ＮＡＤ^＋依存性反応において１−プロパノールをプロピオンアルデヒドへと変換し得る。

適切な治療剤および予防剤の例としては、治療活性、予防活性または診断活性を有する、合成無機化合物および合成有機化合物、タンパク質およびペプチド、多糖および他の糖、脂質、ならびにＤＮＡ核酸配列およびＲＮＡ核酸配列が挙げられる。核酸配列としては、遺伝子、相補性ＤＮＡに結合して転写を阻害するアンチセンス分子、およびリボザイムが挙げられる。広範囲の分子量（例えば、１モルあたり１００グラムと５００，０００グラムとの間またはより大きい）を有する化合物が、カプセル化され得る。特定の例としては、以下が挙げられる：タンパク質（例えば、レセプターリガンド、抗体、酵素、血液凝固因子、インヒビターまたは凝血溶解剤（例えば、ストレプトキナーゼおよび組織プラスミノーゲンアクチベーター）；免疫のための抗原；ホルモンおよび増殖因子；ペプチド（例えば、接着ペプチド））、多糖（例えば、ヘパリン）；オリゴヌクレオチド（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドおよびリボザイムならびに遺伝子治療において使用するためのレトロウイルスベクター）。このポリマーもまた、細胞および組織をカプセル化するために用いられ得る。代表的診断剤は、Ｘ線、蛍光、磁気共鳴画像化、放射能、超音波、断層撮影（ＣＴ）および陽電子断層撮影（ＰＥＴ）によって検出可能な薬剤である。超音波診断剤は、代表的には、気体（例えば、空気またはペルフルオロカーボン）である。

医療用デバイスを製造する好ましい方法としては、溶媒成型（ｓｏｌｖｅｎｔｃａｓｔｉｎｇ）、溶融加工（ｍｅｌｔｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ）、押出し成型、射出成型および圧縮成型、ならびに噴霧乾燥が挙げられる。粒子は好ましくは、当該分野で利用可能な方法を用いて、発酵ベースのプロセスから、または溶媒エバポレーション技術、二重エマルジョン技術もしくはマイクロフルイダイゼーションによって、直接的に調製され得る（Ｋｏｏｓｈａ，Ｆ．Ｐｈ．Ｄ．Ｄｉｓｓｅｒｔａｔｉｏｎ，１９８９，Ｕｎｉｖ．Ｎｏｔｔｉｎｇｈａｍ，ＵＫ．，Ｄｉｓｓ．Ａｂｓｔｒ．Ｉｎｔ．Ｂ５１：１２０６（１９９０）；Ｂｒｕｈｎ，Ｂ．Ｗ．ａｎｄＭｕｅｅｌｌｅｒ，Ｂ．Ｗ．Ｐｒｏｃｅｅｄ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｓｙｍｐ．Ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｒｅｌ．Ｂｉｏａｃｔ．Ｍａｔｅｒ．１８：６６８−６９（１９９１）；Ｃｏｎｔｉ，Ｂ．ら，Ｊ．Ｍｉｃｒｏｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ，９：１５３−１６６（１９９２）；Ｏｇａｗａ，Ｙ．ら，Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．，３６：１０９５−１０３（１９８８）；Ｍａｔｈｉｏｗｉｔｚ，Ｅ．およびＬａｎｇｅｒ，Ｒ．「Ｐｏｌｙａｎｈｙｄｒｉｄｅｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓａｓｄｒｕｇｄｅｌｉｖｅｒｙｓｙｓｔｅｍｓ」，Ｍ．Ｄｏｎｂｒｏｗ編，「ＭｉｃｒｏｃａｐｓｕｌｅｓＮａｎｏｐａｒｔ．ＭｅｄＰｈａｒｍ．」，ＣＲＣ，ＢｏｃａＲａｔｏｎ，Ｆｌｏｒｉｄａ，１９９２，Ｃｈ．５，９９−１２３頁）。

別の好ましい方法は、適切なＰＨＡを適切な鋳型中に溶融加工または溶媒加工し、そしてレーザーまたは他の手段を用いてこの材料を穿孔して所望の多孔度を達成することを含む。また好ましいのは、圧縮成型ＰＨＡシートをループになるように巻き、そしてヒートシールすることを含む方法である。このＰＨＡシートは、必要に応じて、別の材料（例えば、第２の生分解性ポリマー）とともに巻かれ得る。例えば、この後者の材料は、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、またはグリコール酸と乳酸とのコポリマーの不織物であり得る。このような手順は、新たな血管、管およびチューブの操作において使用するために適切な積層チューブを提供すべきである。このＰＨＡはまた、他の組織操作骨格をコーティングするために用いられ得る。このような材料は、他の分解性ポリマー由来であり得る。コーティングは、例えば、溶媒ベースの溶液を用いて、または溶融技術によって、またはＰＨＡラテックスを用いて、実施され得る。

本明細書中に記載されるＰＨＡコポリマーは、他のデバイスおよび材料をコーティングするために用いられ得る。このようなコーティングは、医療用適用のためのそれらの特性を改善し得る（例えば、生体適合性、機械的特性を改善し得、そしてそれらの分解および制御放出プロフィールを調整し得る）。本明細書中で記載されるＰＨＡコポリマーは、上記の製造手順を用いて他のデバイス上にコーティングされ得る。コーティングの厚さは、コーティングの重量または濃度を変化させることによって、ならびに／またはオーバーコーティングすることによって、特定の適用の必要に応じて調節され得る。

移植前に、生体吸収可能なポリマー物品は、レシピエントの疾患および感染を予防するために滅菌されなければならない。滅菌は、ポリマーデバイスに細胞を播種する前に実施される。ＰＨＡ含有物品の加熱滅菌はしばしば非実用的である。なぜなら、熱処理は、（特に、ＰＨＡが、加熱滅菌処理に必要とされる温度よりも低い溶融温度を有する場合）物品を変形させ得るからである。この問題は、冷エチレンオキシドガスを滅菌剤として用いて克服され得る。移植前のＰＨＡ含有物品のエチレンオキシド蒸気への曝露は、物品を滅菌して、これを移植に適切にする。冷エチレンオキシドガスを用いた滅菌の間に、このＰＨＡ含有物品は、その形状を保持する。この型の処理は理想的に、成型物品または形成前の物品の滅菌に適切であり、この物品の形状は、その適切な機能において重要な役割を果たす。

ＭＢＸ１３３５を、２５μｇ／ｍＬクロラムフェニコールを補充したＬＢ培地中で一晩増殖させた。この培養物を用いて、種々の濃度のプロピオネートまたは１−プロパノールを補充した最少培地の３ｍＬ培養物のいくつかを接種した。これらの３ｍＬ培養物中の基本培地は、１リットルあたり、以下を含んでいた：５ｇグルコース；１ｍｍｏｌＭｇＳＯ_４；１０ｍｇチアミン；２５．５ｍｍｏｌＮａ_２ＨＰＯ_４；３３．３ｍｍｏｌＫ_２ＨＰＯ_４；２７．２ｍｍｏｌＫＨ_２ＰＯ_４；２．７８ｍｇＦｅＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ；１．９８ｍｇＭｎＣｌ_２・４Ｈ_２Ｏ；２．８１ｍｇＣｏＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ；０．１７ｍｇＣｕＣｌ_２・２Ｈ_２Ｏ；１．６７ｍｇＣａＣｌ_２・２Ｈ_２Ｏ；０．２９ｍｇＺｎＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ；０．１ｇカゼイン加水分解物；および２５μｇクロラムフェニコール。この培地はまた、プロピオン酸ナトリウム（ｐＨ７）もしくは１−プロパノールのいずれかを含んでいたか、または基質を何も添加しなかった。用いたプロピオネート濃度および１−プロパノール濃度は、２、５、および１０ｇ／Ｌであった。それぞれの場合の各々についての実験を、三連で行った。図２は、各々の場合について決定した増殖曲線を示す。明確には、プロピオネートは、増殖速度を１−プロパノールよりも実質的に大きく阻害する。

株ＭＢＸ１５７９およびＭＢＸ１５８０を、１リットルあたり以下を含む２ｍＬの培地中で振盪しながら３７℃にて一晩増殖させた：５ｇグルコース；１ｍｍｏｌＭｇＳＯ_４；１０ｍｇチアミン；２５．５ｍｍｏｌＮａ_２ＨＰＯ_４；３３．３ｍｍｏｌＫ_２ＨＰＯ_４；２７．２ｍｍｏｌＫＨ_２ＰＯ_４；２．７８ｍｇＦｅＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ；１．９８ｍｇＭｎＣｌ_２・４Ｈ_２Ｏ；２．８１ｍｇＣｏＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ；０．１７ｍｇＣｕＣｌ_２・２Ｈ_２Ｏ；１．６７ｍｇＣａＣｌ_２・２Ｈ_２Ｏ；０．２９ｍｇＺｎＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ；および２５μｇクロラムフェニコール。次いで、これらの培養物を上記と同じ５０ｍＬの培地に添加し、そして１５ｍＬの２×ＹＴ培地（Ｄｉｆｃｏ；Ｄｅｔｒｏｉｔ，Ｍｉｃｈ．）を各々に、合計体積が６５ｍＬになるように添加した。これらの培養物を、２５０ｍＬ三角フラスコ中で振盪しながら３７℃にて１６時間インキュベートした。この期間の最後に、細胞を、２０００×ｇにて１０分間の遠心分離によって培地から取り出した。次いで、これらを、１リットル当り以下を含む５０ｍＬの培地中に再懸濁した：５ｇグルコース；０または５ｇの１−プロパノール；７．７５ｇの２×ＹＴ粉末；１ｍｍｏｌＭｇＳＯ_４；１０ｍｇチアミン；２５．５ｍｍｏｌＮａ_２ＨＰＯ_４；３３．３ｍｍｏｌＫ_２ＨＰＯ_４；２７．２ｍｍｏｌＫＨ_２ＰＯ_４；２．７８ｍｇＦｅＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ；１．９８ｍｇＭｎＣｌ_２・４Ｈ_２Ｏ；２．８１ｍｇＣｏＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ；０．１７ｍｇＣｕＣｌ_２・２Ｈ_２Ｏ；１．６７ｍｇＣａＣｌ_２・２Ｈ_２Ｏ；０．２９ｍｇＺｎＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ；および２５μｇクロラムフェニコール。この期間の最後に、細胞を、上記の通りの遠心分離によって培地から取り出し、水で洗浄し、再度遠心分離し、そして凍結乾燥した。各フラスコからの約１５ｍｇの凍結乾燥細胞塊を、（体積で）９０％１−ブタノールおよび１０％濃塩酸を含む２ｍＬの混合物中での１１０℃にて３時間の同時抽出およびブタノール溶解（ｂｕｔａｎｏｌｙｓｉｓ）に供した（２ｍｇ／ｍＬ安息香酸を内部標準として添加した）。得られた混合物の水溶性成分を、３ｍＬ水での抽出によって除去した。有機相（２ｍＬ／分の全体流量において１：５０の分割比で１μＬ）を、以下の温度プロフィールを用いて、ＳＰＢ−１縮合シリカキャピラリーＧＣカラム（３０ｍ；０．３２ｍｍＩＤ；０．２５μｍフィルム；Ｓｕｐｅｌｃｏ；Ｂｅｌｌｅｆｏｎｔｅ，Ｐａ．）において分析した：８０℃、２分間；２５０℃まで１分間当り１０℃；２５０℃、２分間。用いた標準的は、ＰＨＢＶ（ＡｌｄｒｉｃｈＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ．；Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，Ｗｉｓ．）であった。各培養物についてのポリマー含有量および組成を表１に示す。

１−プロパノールを提供した場合、ＭＢＸ１５７９は、いくつかの３ＨＶ単位をポリマー中に取り込み得るが、ＭＢＸ１５８０は、構成的アルコールデヒドロゲナーゼを用いて、３ＨＶ組成物に関してポリマーの重量百分率に基づいて約６倍多くを取り込み得る。ＭＢＸ１５７９およびＭＢＸ１５８０は、大部分同じ遺伝子バックグラウンドを有し、従って、ａｄｈＥ遺伝子産物がこの増加を少なくとも部分的に担うようである。

（実施例４．プラスミドに基づく株を用いた、グルコースおよび１−プロパノールからのＰＨＢＶ）
プラスミドｐＭＳ７２は、Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅｄｈａＴ遺伝子およびＥ．ｃｏｌｉｅｕｔＥ遺伝子の両方をＩＰＴＧ誘導性プロモーターの制御下に含む。ｐＭＳ７２を、ｅｕｔＥ遺伝子をｐＴＣ４２（Ｓｋｒａｌｙら，１９９８，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６４：９８−１０５）中に挿入することによって構築した。このｅｕｔＥ遺伝子を、ＢｇｌＩＩおよびＳｐｅＩでの消化によってｐＭＳ３５から取り出した。このフラグメントを、ＢｇｌＩＩおよびＮｈｅＩ（これは、ＮｈｅＩと適合性の粘着末端を共有する）で消化したｐＴＣ４２中に連結した。

Ｅ．ｃｏｌｉ株ＭＢＸ１３３５を、ｐＭＳ７２で形質転換して、この構築物がグルコースおよび１−プロパノールをＰＨＢＶへと変換し得るか否かを評価した。ｐＭＳ７２を誘導したベクターであるｐＴｒｃＮで形質転換したＭＢＸ１３３５をコントロールとして用いた。各株を、培養チューブ中で１００μｇ／ｍＬアンピシリンを補充した最少グルコース培地中で３ｍＬの体積で、２００ｒｐｍにて振盪しながら３７℃にて一晩増殖させた。最少培地は、１リットルあたり以下を含んでいた：２５．５ｍｍｏｌＮａ_２ＨＰＯ_４；３３．３ｍｍｏｌＫ_２ＨＰＯ_４；２７．２ｍｍｏｌＫＨ_２ＰＯ_４；２．７８ｍｇＦｅＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ；１．９８ｍｇＭｎＣｌ_２・４Ｈ_２Ｏ；２．８１ｍｇＣｏＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ；０．１７ｍｇＣｕＣｌ_２・２Ｈ_２Ｏ；１．６７ｍｇＣａＣｌ_２・２Ｈ_２Ｏ；０．２９ｍｇＺｎＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ；１ｍｍｏｌＭｇＳＯ_４；１０ｍｇチアミン；１００ｍｇアンピシリン；および５ｇグルコース。この培養物（０．１ｍＬ）を用いて、５０ｍＬの同じ培地を含む２００ｍＬの四角のガラス瓶を接種した。各培養物に添加したのは、１５ｍＬの２×ＹＴ培地（Ｄｉｆｃｏ；Ｄｅｔｒｏｉｔ，Ｍｉｃｈ．）であった。これらの６５ｍＬ培養物を、３７℃にて２００ｒｐｍにて振盪しながら６時間インキュベートした。この期間の最後に、この細胞を、２０００×ｇにて１０分間の遠心分離によって培地から取り出した。次いで、これらを、５ｇ／Ｌ１−プロパノール；０．５×ＹＴ；１００μｇ／ｍＬアンピシリン；および０、０．０１または０．０５ｍＭＩＰＴＧを補充した上記の５０ｍＬの最少グルコース培地中に再懸濁した。３０℃にて９０時間のインキュベーション後、これらの細胞を上記の通りに遠心分離し、水で１回洗浄し、再度遠心分離し、そして凍結乾燥した。乾燥した細胞塊を、上記の通りのブタノール溶解に供し、そしてＧＣの結果は表２に列挙した通りである。

従って、ｐＭＳ７２は、ＭＢＸ１３３５に、このプラスミドなしのものよりもずっと効率的にグルコースおよび１−プロパノールからＰＨＢＶを合成させ得る。

このプラスミドｐＦＳ８３を、ｅｕｔＥ遺伝子をＸｂａＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントとしてｐＭＳ３５から得て、このフラグメントを、ＳｐｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断したｐＦＳ４４Ｂに連結することによって構築した。プラスミドｐＦＳ４４Ｂを、ｄｈａＢ遺伝子を含むｐＴＣ５３（Ｓｋｒａｌｙら，１９９８，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６４：９８−１０５）のＳａｌＩ−ＮｈｅＩフラグメントを、同じ制限酵素で消化したベクターｐＳＥ３８０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）に連結することによって構築した。
（実施例６．組み込まれた株を用いた、グルコースおよび１−プロパノールからのＰＨＢＶ）
いくつかのＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ株を、Ｔｎ１０由来のｔｅｔＡ遺伝子とともにＫ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅｄｈａＴおよびＥ．ｃｏｌｉｅｕｔＥ遺伝子の、ＭＢＸ１３３５の染色体への組み込みによって構築した。組み込みは、ｐＵＴＨｇ（Ｈｅｒｒｅｒｏら，１９９０，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７２：６５５７−６５６７）の誘導体であるプラスミドｐＵＴ−ｅｕｔＥ−ｄｈａＴ−ｔｅｔＡを用いて達成した。ｐＵＴ−ｅｕｔＥ−ｄｈａＴ−ｔｅｔＡを構築するために、最初のｔｅｔＡ遺伝子を、以下のオリゴヌクレオチドプライマーを用いてＴｎ１０からＰＣＲによって増幅した：
５’−ＧＧＴＣＣＴＡＧＧＴＴＡＡＧＡＧＧＡＧＧＴＴＴＴＴＡＴＧＡＡＴＡＧＴＴＣＧＡＣＡＡＡＧＡＴＣＧＣ−３’（ｔｅｔＡ５’ＡｖｒＩＩ）
５’−ＧＧＴＡＣＴＡＧＴＣＴＡＡＧＣＡＣＴＴＧＴＣＴＣＣＴＧＴＴＴＡＣ−３’（ｔｅｔＡ３’ＳｐｅＩ）。
このｔｅｔＡＰＣＲ産物を、ＡｖｒＩＩおよびＳｐｅＩで消化し、そしてＡｖｒＩＩで消化したｐＵＴＨｇに連結した（ＡｖｒＩＩおよびＳｐｅＩは、適合性の粘着性末端を生じる）。これにより、プラスミドｐＵＴ−ｔｅｔＡが得られた。ｅｕｔＥ遺伝子およびｄｈａＴ遺伝子を、ＳａｌＩおよびＳｐｅＩでの消化によってｐＭＳ７２から得て、そしてＳａｌＩおよびＸｂａＩで消化したｐＵＣ１８Ｓｆｉ（Ｈｅｒｒｅｒｏら，同書）に連結した。これによって、プラスミドｐＭＳ７７が得られた。次いで、ｅｕｔＥ−ｄｈａＴフラグメントを、ＡｖｒＩＩでの消化によってｐＭＳ７７から得て、そしてこれをＡｖｒＩＩで消化したｐＵＴ−ｔｅｔＡに連結して、ｐＵＴ−ｅｕｔＥ−ｄｈａＴ−ｔｅｔＡを形成した。結合体化後、ドナー−レシピエント混合物を、１５ｇ／ｍＬテトラサイクリンおよび２５ｇ／ｍＬクロラムフェニコールを補充したＬＢ中で、３７℃にて連続的に培養することにより、約４０世代にわたって直ちに増殖させた。この富化した集団を、同じ抗生物質を補充したＬＢ寒天上にプレーティングした。

異なる組み込み株は、１−プロパノールを供給した場合に３ＨＶをポリマー中に組み込む異なる能力を有しており、そしてこれらの能力は、プロピオニル−ＣｏＡへの１−プロパノールの変換を担う２つの酵素であるＥｕｔＥおよびＤｈａＴの活性とほぼ対応した。

（実施例７．組み込み株を用いた、グルコースおよび１，２−プロパンジオールからのＰＨＢＶ）
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ株ＭＢＸ１６４８を、Ｔｎ１０由来のｔｅｔＡ遺伝子と一緒でのＫ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅｄｈａＢ遺伝子およびＥ．ｃｏｌｉｅｕｔＥ遺伝子の、ＭＢＸ１３３５染色体への組み込みによって構築した。組み込みを、ｐＵＴＨｇ（Ｈｅｒｒｅｒｏら，１９９０，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７２：６５５７−６５６７）の誘導体であるプラスミドｐＵＴ−ｄｈａＢ−ｅｕｔＥ−ｔｅｔＡを用いて達成した。ｐＵＴ−ｄｈａＢ−ｅｕｔＥ−ｔｅｔＡを構築するために、最初のｔｅｔＡ遺伝子を、上記の実施例の通りにＴｎ１０からＰＣＲによって増幅した。ｔｅｔＡＰＣＲ産物を、ＡｖｒＩＩおよびＳｐｅＩで消化し、そしてＡｖｒＩＩで消化したｐＵＴＨｇに連結した（ＡｖｒＩＩおよびＳｐｅＩは、適合性の粘着性末端を生じる）。これにより、プラスミドｐＵＴ−ｔｅｔＡが得られた。ｄｈａＢ遺伝子およびｅｕｔＥ遺伝子を、ＳａｌＩおよびＳｐｅＩでの消化によってｐＭＳ８２（ＡｖｒＩＩで消化し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼによってフィルインし、そして自己連結させてＡｖｒＩＩ部位を除去したｐＦＳ８３）から得て、そしてＳａｌＩおよびＸｂａＩ（これは、ＳｐｅＩと適合性の粘着性末端を共有する）で消化したｐＵＣ１８Ｓｆｉ（Ｈｅｒｒｅｒｏら，同書）に連結した。これによって、プラスミドｐＭＳ８３が得られた。次いで、ｅｕｔＥ−ｄｈａＢフラグメントを、ＡｖｒＩＩでの消化によってｐＭＳ８３から得て、そしてこれをＡｖｒＩＩで消化したｐＵＴ−ｔｅｔＡに連結して、ｐＵＴ−ｄｈａＢ−ｅｕｔＥ−ｔｅｔＡを形成した。結合体化後、ドナー−レシピエント混合物を、１５μｇ／ｍＬテトラサイクリンおよび２５μｇ／ｍＬクロラムフェニコールを補充したＬＢ中で、３７℃にて連続的に培養することにより、約４０世代にわたって直ちに増殖させた。この富化した集団を、同じ抗生物質を補充したＬＢ寒天上にプレーティングした。ＭＢＸ１６４８は、このプレーティングから単離された１つのコロニーであった。

ＭＢＸ１６４８を、グルコースおよび１，２−プロパンジオールからＰＨＢＶを合成する能力について試験した。ＭＢＸ１３３５（これから誘導した）をコントロールとして用いた。各株を、培養チューブ中で、３ｍＬの体積で、２００ｒｐｍにて振盪しながら、２５μｇ／ｍＬクロラムフェニコールを補充したＬＢ培地中で３７℃にて８時間増殖させた。この培養物（０．１ｍＬ）を用いて、１リットル当り以下を含む５０ｍＬの培地を含む２５０ｍＬ三角フラスコを接種した：２５．５ｍｍｏｌＮａ_２ＨＰＯ_４；３３．３ｍｍｏｌＫ_２ＨＰＯ_４；２７．２ｍｍｏｌＫＨ_２ＰＯ_４；２．７８ｍｇＦｅＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ；１．９８ｍｇＭｎＣｌ_２・４Ｈ_２Ｏ；２．８１ｍｇＣｏＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ；０．１７ｍｇＣｕＣｌ_２・２Ｈ_２Ｏ；１．６７ｍｇＣａＣｌ_２・２Ｈ_２Ｏ；０．２９ｍｇＺｎＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ；１０ｇグルコース；１ｍｍｏｌＭｇＳＯ_４；１０ｍｇチアミン；０．１ｇカゼイン加水分解物；２５ｍｇクロラムフェニコール；ならびに以下の表５に示した通りの種々の量の補酵素Ｂ−１２および１，２−プロパンジオール。これらの５０ｍＬ培養物を、２００ｒｐｍで振盪しながら３０℃にて４６時間インキュベートした。この期間の最後に、これらの細胞を、２０００×ｇにて１０分間の遠心分離によって培地から取り出した。これらを水で１回洗浄し、再度遠心分離し、そして凍結乾燥した。乾燥した細胞塊を上記の通りのブタノール溶解に供した。そしてＧＣの結果は、表５において列挙した通りである。

Claims

ポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）ポリマーを産生する方法であって、該ポリマーは、３−ヒドロキシプロピオネート、３−ヒドロキシバレレート、４−ヒドロキシブチレート、４−ヒドロキシバレレート、５−ヒドロキシバレレート、および３−ヒドロキシヘキサノエートからなる群より選択される少なくとも１つのモノマーを含み、該方法は、ポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）シンターゼおよびＣｏＡ依存性アルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を生物体中で発現させる工程であって、ここで少なくとも１つの遺伝子は、異種遺伝子である、工程、ならびに該生物体が、該ＣｏＡ依存性アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を含む経路によって、該少なくとも１つの選択されたモノマーを変換して、該少なくとも１つの選択されたモノマーを含む該ポリヒドキシアルカノエートを産生するように、該生物体にアルコールを供給する工程を包含する、方法。
前記ＰＨＡポリマーが、３−ヒドロキシブチレートをさらに含む、請求項１に記載の方法。
前記ＰＨＡポリマーが、ポリ−３−ヒドロキシブチレート−ｃｏ−３−ヒドロキシバレレート、ポリ−３−ヒドロキシブチレート−ｃｏ−３−ヒドロキシプロピオネート、ポリ−３−ヒドロキシブチレート−ｃｏ−４−ヒドロキシブチレート、ポリ−３−ヒドロキシブチレート−ｃｏ−３−ヒドロキシヘキサノエートからなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
前記アルコールが、１−プロパノール、１，２−プロパンジオール、および１−ブタノールからなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
前記遺伝子が、アシル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、アシル−ＣｏＡシンテターゼ、β−ケトチオラーゼ、アセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼからなる群より選択される酵素をさらにコードする、請求項１に記載の方法。
前記生物体が、酵母、細菌、真菌、および植物からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
前記ＰＨＡシンターゼが、ポリ（３−ヒドロキシアルカノエート）シンターゼである、請求項１に記載の方法。
前記ＰＨＡシンターゼが、ポリ（４−ヒドロキシアルカノエート）シンターゼである、請求項１に記載の方法。
前記ＰＨＡシンターゼが、ポリ（４−ヒドロキシブチレート）シンターゼである、請求項８に記載の方法。
前記生物体が、細菌である、請求項１に記載の方法。
前記生物体が、Ｅ．ｃｏｌｉである、請求項１０に記載の方法。
前記生物体が、Ｅ．ｃｏｌｉｅｕｔＥ遺伝子を発現するＥ．ｃｏｌｉである、請求項１に記載の方法。
請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法によって形成された、ポリマー。
請求項１３に記載のポリマーから形成された物品であって、フィルム、ラテックス、コーティング、接着剤、繊維、結合剤、樹脂および医療用デバイスからなる群より選択される、物品。
前記物品が、治療剤、予防剤または診断剤の制御放出、薬物送達、組織操作骨格、細胞カプセル化；標的化送達、生体適合性コーティング、生体適合性インプラント、組織再生誘導、創傷包帯、整形外科デバイス、プロテーゼおよび骨セメント、ならびに診断剤からなる群より選択されるデバイスである、請求項１４に記載の物品。
細菌、酵母、真菌および植物からなる群より選択される組換え生物体であって、ＣｏＡ依存性アルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする異種遺伝子を含む、組換え生物体。
ＰＨＡシンターゼをコードする遺伝子をさらに含む、請求項１６に記載の組換え生物体。
アシル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、アシル−ＣｏＡシンテターゼ、β−ケトチオラーゼ、アセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼからなる群より選択される酵素をコードする遺伝子をさらに含む、請求項１７に記載の組換え生物体。
前記遺伝子の１以上が、前記組換え生物体に対して内因性である、請求項１８に記載の組換え生物体。
前記アシル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、アシル−ＣｏＡシンテターゼ、β−ケトチオラーゼ、アセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼからなる群より選択される酵素をコードする遺伝子のうちの１以上が、前記組換え生物体に対して異種である、請求項１８に記載の組換え生物体。
前記遺伝子が、Ｅ．ｃｏｌｉのｅｕｔＥである、請求項１６に記載の組換え生物体。
細菌である、請求項１６に記載の組換え生物体。
植物である、請求項１６に記載の組換え生物体。
ポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）ポリマーを産生する方法であって、該ポリマーは、３−ヒドロキシプロピオネート、３−ヒドロキシバレレート、４−ヒドロキシブチレート、４−ヒドロキシバレレート、５−ヒドロキシバレレート、および３−ヒドロキシヘキサノエートからなる群より選択される少なくとも１つのモノマーを含み、該方法は、ＣｏＡ依存性アルデヒドデヒドロゲナーゼおよびＰＨＡシンターゼを発現するように遺伝子操作された細菌、酵母、真菌および植物からなる群より選択される生物体を選択する工程、ならびに該生物体が、該ＣｏＡ依存性アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を含む経路によって、該少なくとも１つの選択されたモノマーを変換して、該少なくとも１つの選択されたモノマーを含む該ポリヒドキシアルカノエートを産生するように、該生物体にアルコールを供給する工程を包含する、方法。
前記ＰＨＡポリマーが、３−ヒドロキシブチレートをさらに含む、請求項２４に記載の方法。
前記ＰＨＡポリマーが、ポリ−３−ヒドロキシブチレート−ｃｏ−３−ヒドロキシバレレート、ポリ−３−ヒドロキシブチレート−ｃｏ−３−ヒドロキシプロピオネート、ポリ−３−ヒドロキシブチレート−ｃｏ−４−ヒドロキシブチレート、ポリ−３−ヒドロキシブチレート−ｃｏ−３−ヒドロキシヘキサノエートからなる群より選択される、請求項２４に記載の方法。
前記アルコールが、１−プロパノール、１，２−プロパンジオール、および１−ブタノールからなる群より選択される、請求項２４に記載の方法。
前記生物体が、アシル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、アシル−ＣｏＡシンテターゼ、β−ケトチオラーゼ、アセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼからなる群より選択される酵素をコードする遺伝子を含む、請求項２４に記載の方法。
前記生物体が、細菌および植物からなる群より選択される、請求項２４に記載の方法。
前記ＰＨＡシンターゼが、ポリ（３−ヒドロキシアルカノエート）シンターゼである、請求項２４に記載の方法。
前記ＰＨＡシンターゼが、ポリ（４−ヒドロキシアルカノエート）シンターゼである、請求項２４に記載の方法。
前記ＰＨＡシンターゼが、ポリ（４−ヒドロキシブチレート）シンターゼである、請求項３１に記載の方法。
前記生物体が、細菌である、請求項２４に記載の方法。
前記生物体が、Ｅ．ｃｏｌｉである、請求項３３に記載の方法。
前記生物体が、Ｅ．ｃｏｌｉｅｕｔＥ遺伝子を発現するＥ．ｃｏｌｉである、請求項２４に記載の方法。
請求項２４〜３５のいずれか１項に記載の方法によって形成された、ポリマー。
請求項３６に記載のポリマーから形成された物品であって、該物品が、フィルム、ラテックス、コーティング、接着剤、繊維、結合剤、樹脂および医療用デバイスからなる群より選択される、物品。
前記物品が、治療剤、予防剤または診断剤の制御放出、薬物送達、組織操作骨格、細胞カプセル化；標的化送達、生体適合性コーティング、生体適合性インプラント、組織再生誘導、創傷包帯、整形外科デバイス、プロテーゼおよび骨セメント、ならびに診断剤からなる群より選択される医療用デバイスである、請求項３７に記載の物品。