JP2006504087A - 抗原を検出するための方法およびキット - Google Patents
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Abstract
本発明は抗原の検出方法に関し、ここで抗原は水酸化アルミニウムの存在下にあり、また前記方法を実施するために好適な説明書および構成要素を含むキットに関する。
Description
本発明は、抗原の検出のための方法およびキットに関する。
ある種の抗原は、その抗原を何らかの方法で追加の構成要素(成分)と共に製剤化した後にその検出および/または定量が必要となることがある。例えばある種のB型肝炎ワクチンの場合、B型肝炎表面抗原は水酸化アルミニウムと共に製剤化される。しかしながら、水酸化アルミニウムが存在すると、抗体に基づく(例えばELISA)検出法において抗原と抗体の結合を何らかの意味で(直接または間接的に)妨害するようであるので、このような水酸化アルミニウムを含む製剤は抗原構成要素の定量に問題を引き起こす。
製剤中の水酸化アルミニウムによる妨害の問題を回避するアッセイ系を確立する必要が依然として存在する。
本発明は、この要求に対処する。
第1の態様において、本発明はサンプル中の抗原の検出方法に関する。ここで抗原は水酸化アルミニウムと組み合わせられており、前記方法は以下の工程を含む。
1 サンプルを、固体の支持体の存在下、塩基性バッファーの存在下で、免疫グロブリンまたはそのフラグメントと接触させて、サンプル中の抗原と免疫グロブリンまたはそのフラグメントとを結合させる工程、
2 遮断剤を添加する工程、
3 抗原と抗体の結合を検出する工程。
2 遮断剤を添加する工程、
3 抗原と抗体の結合を検出する工程。
ここでこれらの工程はこの順番で行われるが、必ずしも連続的に行われなくともよい。
本発明はまた、水酸化アルミニウムと組み合わせられた抗原の検出のためのキットに関し、このキットは、上述の方法を詳述した説明小冊子、ならびに抗原に特異的な抗体および塩基性バッファーから選択される少なくとも1つの構成要素を含んでなる。
本発明は一般に、固体の支持体上で抗原と抗体を結合させ、その後第2の抗体の結合によって検出するELISA検出法に基づいている。ELISA法は当分野で公知である(例えば、Belanger ら、Clin. Chim. Acta 48, 1973, 15-18ページを参照のこと)。したがって、一般に本発明は抗体またはそのフラグメントを用いた抗原の検出方法に関する。好適にはこの方法はELISAアッセイである。
本発明の方法は水酸化アルミニウムと組み合わせた抗原の検出に関する。好ましくは、この水酸化アルミニウムと組み合わさっている抗原は、水酸化アルミニウムに吸着されているかまたは別の意味で直接水酸化アルミニウムと複合体を形成しているかもしくは水酸化アルミニウムと会合している。しかし、本発明はまた、抗原自体が水酸化アルミニウムと直接吸着または複合体を形成していないものの、水酸化アルミニウムも存在する混合物もしくは組成物中にある抗原の検出にも関する。水酸化アルミニウムは、遊離であってもよく、または、アッセイで検出しようとする抗原と同一ではない抗原に結合していてもよい。
好ましくは、抗原は肝炎抗原であり、好ましくはB型肝炎抗原であり、最も好ましくはB型肝炎表面抗原である。
すなわち、好ましくは本発明の方法は、水酸化アルミニウム上に吸着されたB型肝炎表面抗原の検出および/または定量のためのものである。
本発明はまた、水酸化アルミニウムに吸着されているかまたは会合している別の抗原と組み合わされた、アルミニウム塩(好ましくはリン酸アルミニウム)に吸着されているかまたは会合しているB型肝炎抗原の検出および/または定量に関する。誤解を避けるために述べると、ある抗原が別の抗原と「組み合わせられている」場合、これは単にその抗原が別の抗原「の存在下にある」ことを意味するにすぎず、必ずしもその2つの抗原の間の何らかの直接の物理的な相互作用を意味するわけではない。具体的には検出は、水酸化アルミニウム上に吸着されたパータクチン(pertactin)とリン酸アルミニウム上に吸着されたB型肝炎表面抗原とを組み合わせたB型肝炎抗原の検出であり得る。このような場合、本発明はパータクチン構成要素の検出にも適用される。
他に好ましいのは、ジフテリア(D)破傷風(T)および無細胞性百日咳(Pa)(「DTPa」)構成要素を含有する組み合わせ(例:GlaxoSmithKline Pediarix(商標)ワクチン)中でのB型肝炎抗原の検出である。
水酸化アルミニウムに強く結合するヘモフィルス インフルエンザエ(Haemophilus influenzae)B型精製ポリリボシル-リビトール-リン酸(PRP)の検出および/または定量における本発明の使用もまた好ましい。
好ましくは、本発明の方法は、対象とする抗原の検出および/または定量に、水酸化アルミニウムの干渉が存在しないかまたは最小限しかないようなものである。
本方法の第1段階においては、抗原を固体の支持体の存在下で免疫グロブリンまたはそのフラグメントと接触させる。抗原と免疫グロブリンとの接触は、一方または他方が適当な固体の支持体に結合していて起こるのが適切である。好ましくは免疫グロブリンまたはそのフラグメントを固体の支持体に結合する。固体の支持体は好ましくはプラスチック製の固体の支持体であり、好適にはマイクロタイタープレートまたはELISA型分析に適した他のプレートである。最も好ましいのはポリスチレン製マイクロタイタープレートであり、好ましくは96ウェルマイクロタイタープレート、例えばNunc MaxisorbTM平底マイクロタイタープレートである。
好ましくは免疫グロブリンまたはそのフラグメントを固体の支持体に固定し、次にこの固定された免疫グロブリンまたはそのフラグメントを抗原と接触させる。
最も好ましくは、当技術分野の公知の方法に従い、プラスチック製のマイクロタイタープレートを適当な免疫グロブリンでコーティングする。
好ましくは、免疫グロブリン構成要素は抗原に特異的に結合する能力を有する抗体またはそのフラグメントである。所定の抗原に特異的に結合する活性を保持する抗体の好適なフラグメントは当技術分野で公知であり、例えば、Fc領域不在下の抗体Fv領域、または、適当な単鎖免疫グロブリンを挙げることができる。「抗体」という用語は本明細書において、ELISAまたはELISA型検出系において使用できるようにある抗原に対する適当な特異的結合を有するあらゆる適当な免疫グロブリンおよびそのフラグメントを表すために用いる。好ましくは抗体はポリクローナル抗体であり、最も好ましくはウサギポリクローナル抗体であり、B型肝炎に対するウサギ抗体が最も好ましい。好ましくは抗体はIgG分子である。
B型肝炎表面抗原の検出のための抗体の生産およびキャラクタリゼーションは公知であり、例えば次の文献に記載されている[Wandsら、Gastroenterology 80, 225-232, 1981, Drouetら、Med Lab Science 38, 341-348, 1981およびShih JW-Kら、J Virol methods, 1, 257-273, 1983。
抗原サンプルと抗体の混合は、7よりも大きいpHを有する任意の適当なバッファーである塩基性バッファーの存在下で行う。好ましくは、バッファーは8よりも大きいpHを有し、より好ましくは8.5よりも大きいpHを有し、最も好ましくは実質的に9であるpHを有する。好ましくはpHは7〜12であり、より好ましくは8〜11であり、最も好ましくは8〜10である。このpHは、本方法を最適化するために、試験する特定の抗原を考慮に入れて調節することができる。本方法の最適化とはすなわち、アッセイにおける結合を最適化するおよび/またはアッセイにおける水酸化アルミニウムの影響を最小化することである。好ましくはバッファーは1% Tweenまたはそれと機能的に等価なものを含有する。最も好ましくはバッファーは1% Tweenを添加したpH9の0.2 M DEA、0.2 M HClであり、好ましくはB型肝炎表面抗原の検出において使用する。
好適には、試験しようとする抗原を塩基性バッファーと混合または希釈した後、固体の支持体に固定された抗体と接触させる。
好ましくは抗原と抗体のインキュベーションは撹拌しながら行う。
抗原抗体結合の後、固体の支持体上の抗原抗体の組み合わせを遮断剤で処理する。遮断剤とは、抗原抗体複合体と、固体の支持体上の抗原抗体複合体を検出するために使用する任意の検出系との間の非特異的な相互作用を最小化する任意の適当な作用剤である。適当な遮断剤は当技術分野で公知であり、例えばウシ胎児血清(FCS)またはウシ血清アルブミン(BSA)であり、好ましい遮断剤は1% BSAを含有するPBSである。
抗原と抗体の組合せの検出は、任意の適当な検出手段で行うことができ、これらはELISA法に関する当技術分野では公知である。適当な方法の例を実施例1に示す。
好ましくは、抗原抗体の組合せを、遮断後、抗原に特異的に結合する第2の抗体と接触させる。第2の抗体の結合は、適切にはサンプル中に存在する抗原の量を評価するために、直接または間接的に検出することができる。例えば、第2の抗体は検出可能な標識に直接結合されていてもよいし、または、別の標識化した抗体を添加することにより検出可能になってもよい。当技術分野では、直接および間接的な検出方法の両方が公知である。
RF-1モノクローナル抗体(Goodhall AHら、1981, Medical Laboratory Sciences 38, 349-354、EPも参照のこと)は検出に使用するのに適しており、他のモノクローナル抗体と組み合わせて使用するのがが好ましい。好ましい抗体は、B型肝炎表面抗原の111〜126番目のアミノ酸のエピトープを認識するモノクローナル抗体である。しかしながら、検出抗体の選択は本発明に決定的に重要ではなく、適当な抗体の生産方法は当技術分野では公知である。
好ましくは、抗原抗体複合体の検出は、非特異的相互作用を最小化するためにやはり、相対的に高濃度のタンパク質(例えばBSA)を含有するバッファー中で行われる。好ましくは検出は、少なくとも0.05%の遮断タンパク質(例えばBSA)、より好ましくは0.05%〜0.5%の遮断タンパク質、より好ましくは0.1〜0.3%の遮断タンパク質、最も好ましくは約0.2%の遮断タンパク質を含有するバッファー中で行われる。最も好ましくは検出バッファーは、B型肝炎表面抗原のアッセイに使用のに好適なPBS、0.2% BSA、0.1% Tweenおよび4% 新生仔牛血清を含む。
最も好ましい実施形態において本発明は、サンプル中のB型肝炎表面抗原の検出方法に関し、該肝炎抗原は水酸化アルミニウムに吸着されており、該方法は以下の工程を順に含む。
1 B型肝炎表面抗原に特異的な抗体と試験するサンプルとを接触させる。ここで抗体は固体の支持体に結合されており、接触は抗原と抗体を結合させるために撹拌しながら塩基性バッファーの存在下で行い、バッファーは9のpHを有するかまたは約pH9を有する。
2 1% BSAまたは約1% BSAを含む遮断剤を添加する。
3 抗体の抗原への結合を検出する。
好ましくは固体の支持体はマイクロタイターディッシュである。
本発明はさらに、上述の検出方法に使用するためのキットに関し、該キットは請求項1に記載の方法またはその他上述の実施形態を実施するための説明書、ならびに、本検出方法で使用するのに適当な塩基性バッファーおよび対象とする抗原の検出に適当な抗体から選択される少なくとも1つの構成要素を含む。適当なキットはまた、抗体および塩基性バッファーの両方を含み、最も好ましくは説明書付きである。本方法を機能させるためのキットの他の構成要素(例えば検出バッファー)もまた、場合により追加することができる。
本発明の方法およびキットは、ワクチン生産のための品質制御目的のために好適に使用される。さらに、該方法およびキットは一般に抗原識別、抗原性の測定および定量化に使用することができる。
本発明を以下の実施例によって例証するが、それらの例は本発明を束縛するものではない。
実施例1 サンプル中の水酸化アルミニウムに吸着されたB型肝炎表面抗原の検出
1 マイクロタイタープレートを抗HBsウサギポリクローナル抗血清でコーティングした。
1 マイクロタイタープレートを抗HBsウサギポリクローナル抗血清でコーティングした。
2 定量化するHBs/Al(OH)3サンプルを、0.2M DEA、0.2M HCl、1% Tween、pH9に希釈し(2倍希釈)、撹拌しながら37℃で2時間プレートとともにインキュベートした。試験したサンプルはGlaxoSmithKlineからのEngerix(商標)(B型肝炎)ワクチンであった。
3 洗浄工程(150mM NaCl、0.05% Tween中)の後に、固相をPBS 1% BSAバッファー中37℃で1時間かけて遮断し、次にNaCl 150mM + 0.05% Tween 20溶液で洗浄した。
4 次に抗HBs/HBsAg複合体の検出を、以下の方法で行った。すなわち、PBS、0.2% BSA、0.1% Tweenおよび4%新生仔牛血清中に1μg/mlに希釈した3つの抗HBsマウスモノクローナル抗体のプールを添加し、その後37℃で1時間インキュベートした。過剰な抗体は洗浄により除去し、次にプレートをビオチンコンジュゲート抗マウスIg(Prosan(商標)より)とともに撹拌しながら、室温(RT)で30分間インキュベートした。洗浄後、AmdexTMストレプトアビジンホースラディッシュペルオキシダーゼ複合体(AmershamTMより)をウェルに添加した(室温で30分間、撹拌しながら)。次にプレートを洗浄し、0.04% o-フェニレンジアミン(SigmaTM)、0.03% H2O2、0.1% Tween 20、0.05M クエン酸バッファーpH4.5の溶液とともに20分間撹拌しながらインキュベートした。反応を2NのH2SO4で停止させ、490nmおよび630nmを測定した。490nmで得られたシグナルから630nmで得られたシグナルを引いたシグナルは、SoftmaxPro(μg/mlで濃度表示)による標準との関係からサンプル中のHBsAg濃度を計算するために使用できる。
上述の複数の工程は本発明において、適切にはB型肝炎表面抗原の検出に使用するために、それぞれ個別に好ましい。個々の工程は、他の工程とは別々に、本発明の一般的な方法に組み込むことができる。
得られた結果を、現在好適な市販キットである市販のAuszymeTMキット(Abbot, Delkenheim, Germany)を用いたEnergixTMサンプルから得られた結果と比較した。本発明の方法では、AuszymeTMキットの結果と本質的に同じ結果が得られる。変動係数(CV)は10%未満であり、本方法の再現性が高いことを示している。
Abbott Auszyme キット 本発明の方法
回収量 25.2μg 24.7μg
CV intra* 7.7% 5.9%
CV inter** 6.4% 8.6%
*同じ日に試験した同じサンプル間の変動
**異なる日に試験した異なるサンプル間の変動。
実施例2 組み合わせワクチン(Pediarix TM )中の肝炎表面抗原の検出
PediarixTMはB型肝炎表面抗原DTPaおよびIPVを含んでなる。PediarixTMサンプル中のB型肝炎の検出は以下の通り行った。
・コーティング:マイクロタイタープレートを、4℃で抗HBsウサギポリクローナル抗血清(1/8000希釈)で一晩(O/N)コーティングした。
・サンプル:定量しようとするサンプルを、0.2 M DEA、0.2 M HCl、1% Tween、pH9(2倍希釈)に希釈し、撹拌しながらプレートとともに37℃で2時間インキュベートした。
・ブロッキングはPBS 1%BSAとともに37℃で1時間行った。
・次に抗HBs/HBsAg複合体を検出するために、PBS、1% BSA、0.1% Tween 20および4%新生仔牛血清中に1μg/mlで希釈した3つの抗HBsマウスモノクローナル抗体のプールを添加し、その後37℃で1時間インキュベートした。過剰な抗体を洗浄することにより取り除き、次にプレートをPBS 1% BSA 0.1% Tween 20中に希釈したビオチンコンジュゲート抗マウスIg(ProsanTMより)とともに撹拌しながら室温(RT)で30分間インキュベートした。洗浄後、AmdexTMストレプトアビジンホースラディッシュペルオキシダーゼ複合体(AmershamTMより)をウェルに添加し、PBS 1% BSA 0.1% Tween 20に(RTで30分間撹拌しながら)希釈した。次にプレートを洗浄し、0.04% o-フェニレンジアミン(SigmaTM)、0.03% H2O2、0.1% Tween 20、0.05M クエン酸バッファーpH4.5の溶液とともに20分間撹拌しながらインキュベートした。反応を2NのH2SO4で停止させ、490nmおよび630nmで読み取った。サンプル中のHBsAg濃度を、SoftmaxProにより基準から計算し、μg/mlで表した。
上述の複数の工程は本発明において、適切にはB型肝炎表面抗原の検出に使用するために、それぞれ個別に好ましい。個々の工程は、他の工程とは別々に、本発明の一般的な方法に組み込むことができる。
Pediarixサンプルについて得られた結果もまた、Auszymeキットを用いて得られた結果と合致した。
Claims (8)
- 水酸化アルミニウムと組み合わせられた抗原の検出方法であって、
(i) 抗原を、固体の支持体の存在下、塩基性バッファーの存在下で、免疫グロブリンまたはそのフラグメントと接触させて、抗原を免疫グロブリンまたはそのフラグメントと結合させ、
(ii) 遮断剤を添加し、
(iii) 抗原と抗体の結合を検出する
工程を含んでなり、工程(i)、(ii)および(iii)は順次行うが必ずしも連続的に行う必要はない、前記方法。 - 抗原がB型肝炎表面抗原である、請求項1に記載の方法。
- 工程(i)を撹拌しながら行う、請求項1または2に記載の方法。
- 検出工程(iii)を0.2% BSAの存在下で行う、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- (i) B型肝炎表面抗原に特異的であり固体の支持体に結合している抗体と、試験するサンプルとを、約9のpHを有する塩基性バッファーの存在下で撹拌しながら接触させて、抗原と抗体を結合させ、
(ii) 約1%のBSAを含む遮断剤を添加し、
(iii) 0.2%のBSAの存在下で抗体と抗原の結合を検出する
工程を含んでなる、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。 - 水酸化アルミニウムの存在下にある抗原を検出するためのキットであって、請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法を実施するための説明書、ならびに、抗原に特異的な抗体および塩基性バッファーから選択される少なくとも1つの構成要素を含んでなる、前記キット。
- 請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法を実施するための説明書、抗原に特異的な抗体、および塩基性バッファーを含む、請求項6に記載のキット。
- 塩基性バッファーが実質的にpH9である、請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法またはキット。
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