JP5785959B2 - 酵素イムノアッセイを用いて自己抗体の濃度を測定する方法 - Google Patents
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Description
本発明は、医療、特に実験室における診断の分野に関し、ヒト由来の生物学的流体中の自然自己抗体濃度の定量的測定の効率及び信頼性を改善するために用いることができる。
固相の酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）を用いてヒト由来の生物学的流体における内因性タンパク質に対する自己抗体の濃度を定量的に測定する方法が知られている（特許文献１）。しかし、この方法は、ヒト由来の生物学的流体中における自然自己抗体の定量的測定には殆ど用いられていない。
物理的収着により固相に抗原を吸着させ、被験生物学的試料と共にインキュベートし、コンジュゲート含有溶液をインキュベートし、発色剤の吸光反応を分光光度分析することを含む酵素イムノアッセイ法が知られている（特許文献２）。
更に、物理的収着により固相に抗原を吸着させ、被験生物学的試料と共にインキュベートし、コンジュゲート含有溶液をインキュベートし、発色剤の吸光反応を分光光度分析することを含む、自然自己抗体の濃度を測定するための酵素イムノアッセイを実施する方法も知られている（ＢＭＳ２１７ＴＥＮ ヒト抗ＩＦＮ−αＥＬＩＳＡ、販売元：ＭｅｄＳｙｓｔｅｍｓ ＧｍｂＨ，Ａｕｓｔｒｉａ）。この方法は、簡便性、感受性、及び特異性は十分であるが、得られる結果が擬陽性である場合がある。この理由は、血清又は血漿中の様々な免疫グロブリンが、ＥＩＡプレートに吸着している抗原と非特異的に且つ低親和性で結合するためである。更に、自然抗体の範疇には属さない多重反応性免疫グロブリンが血中に存在することにより擬陽性の結果が引き起こされる場合もある。この理由は、前記多重反応性免疫グロブリンがＥＩＡプレートの成分に非特異的に結合するためである。更に、ＥＩＡでは遊離自然抗体画分しか検出されないが、殆どの自然自己抗体は、その抗原と結合している複合体として血中に存在している。
本発明の目的は、ＥＩＡ法を用いてヒト由来の生物学的流体中の自然自己抗体濃度を定量的に測定するための技術的に簡便で、感受性が高く、且つ特異的な方法を開発することにある。
上記課題は、酵素イムノアッセイを用いてヒト由来の生物学的流体中の自然自己抗体濃度を定量的に測定する方法であって、物理的収着用固相を抗原で処理し、被験生物学的試料を添加し、コンジュゲート含有溶液で前記固相を処理し、前記固相と液相とを分離させ、発色剤溶液の吸光反応を分光光度分析することを含む方法により解決される。本発明によれば、ストレプトアビジンでコーティングされている物理的収着用固相を物理的収着用固相として用いることができる。予めビオチン化されている抗原と、前記物理的収着用固相における非特異的結合部位をブロックするためのブロッキング剤としての標準的な手順に従ってビオチン化されたタンパク質を用いて前記物理的収着用固相を処理する。コンジュゲート含有溶液として、ヒト免疫グロブリンのアイソタイプのうちの１種若しくは全ての種類と反応するモノクローナル又はポリクローナルな酵素標識抗体を用いる。更に、物理的収着用固相の非特異的結合部位をブロックするために用いられるタンパク質と、加熱処理中に自然自己抗体が分解するのを防ぐ基質とを含有するバッファーで前記被験生物学的流体を予め希釈し、次いで、加熱処理する。各生物学的流体の被験試料に対して、ビオチン化抗原が固定化されていない対応する対照物理的収着用固相を用いる（即ち、固相のストレプトアビジンと結合する各生物学的流体の被験試料に対して、物理的収着用固相の非特異的結合部位をブロックするために用いられるタンパク質と同様のビオチン化対照タンパク質を用いることにより、自然自己抗体に対して特異的な分光学的シグナル及び非特異的な分光学的シグナルを測定することを可能にする）。そして、抗原に対するモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体に対して正規化された検量線を用いて自然自己抗体の数を求める。
更に、加熱処理を行う前に、物理的収着用固相の非特異的結合部位をブロックするために用いられるタンパク質と、加熱処理中に自然自己抗体が分解するのを防ぐ基質とを含有するバッファーで希釈した被験生物学的流体を、鉄含有酸化剤で更に処理する。
抗原を直接固定化すると抗原のエピトープの立体構造の変化及び分解が生じるので、ＥＩＡ法の感受性が低下するが、本発明の方法では、ストレプトアビジンでコーティングした物理的収着用固相とビオチン化された被験試料を用いることにより、固定化されている抗原の全てのエピトープが自然自己抗体に結合可能な状態で保たれるので、感受性が高い。更に、ヒト免疫グロブリンのアイソタイプのうちの１種又は全ての種類と反応する酵素標識抗体を適用することにより、自然自己抗体の特定のアイソタイプ又は全てのアイソタイプの濃度を測定することが可能になるので、本発明の方法は適用範囲が広い。物理的収着用固相における非特異的結合部位をブロックするために用いられるタンパク質を含有するバッファーで被験試料を予め希釈することにより、被験試料中の抗体とタンパク質が固定化されている固相との非特異的結合の可能性を最小化できる。これも、本発明の方法の特異性及び感受性を高める。
鉄含有酸化剤の添加及び被験試料の加熱処理により、自然自己抗体と抗原及び抗イディオタイプ抗体との複合体を破壊したり、様々なデマスキング作用により抗体パラトープによる抗原エピトープの利用可能性を確保したりすることが可能になる。被験試料をバッファーで予め希釈することにより、加熱処理中に自然自己抗体が分解されるのを防ぐことができ、自然自己抗体の総濃度（即ち、遊離型及び抗原結合型の自然自己抗体、又はパラトープがブロックされている自然抗体の総濃度）を測定することが可能になるので、擬陽性の結果が生じる可能性を低減し、且つ本発明の方法の感受性、効率、及び機能を高めることができる。
各生物学的流体の被験試料について、固定化されている場合、ビオチン化ブロッキングタンパク質を備える個々の対照物理的収着用固相を用いると、自然自己抗体に対して特異的及び非特異的な分光学的シグナルを推定することが可能になるので、これも擬陽性が生じる可能性を低減し、且つ本発明の方法の感受性を高める。
更に、本発明の本質的な特徴を組み合わせることにより、自然自己抗体の濃度の定量的測定の可能性を広げ、且つ本発明の課題を解決する技術的手段の範囲を広げることができる。
ヒト由来の生物学的流体中の自然自己抗体濃度を定量的に測定するための本発明の方法は、以下の通り実施される。
標準的なウェルプレートの物理的収着用固相（ウェル）をストレプトアビジン又はそのアナログ（例えば、アビジン等）でコーティングし、前記物理的収着用固相をブロッキング剤でブロッキングし、自然自己抗体の濃度を求めるために必要なビオチン化されている被験試料と共に、又は非特異的結合の対照であるビオチン化されているブロッキングタンパク質（例えば、ウシ血清アルブミン、オボアルブミン、ヒト血清アルブミン、ウサギ血清アルブミン、ゼラチン等）（対照ウェル）と共にインキュベートする。最小量のビオチン（例えば、Ｄ−ビオチニル−ε−アミノカプロン酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）（抗原のビオチンに対するモル比１：２）で抗原をビオチン化して、エピトープの破壊を最小限に抑える。
加熱処理中に自然自己抗体が分解されるのを防ぐためにタンパク質（例えば、ウシ血清アルブミン、オボアルブミン、ヒト血清アルブミン、ウサギ血清アルブミン、ゼラチン等）、保存剤（例えば、チメロサール等）、界面活性物質（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００等）を含有するブロッキングバッファー溶液で（５０倍〜２００，０００倍に）希釈することにより、アッセイ用生物学的流体（例えば、血清、血漿等）を調製し、得られた生物学的流体溶液を５０℃〜８０℃の温度で加熱処理する。
加熱処理前に、被験生物学的流体を鉄含有酸化剤（例えば、塩化鉄（ＩＩＩ）［ＦｅＣｌ３］）で更に処理することを推奨する。
次いで、加熱処理した被験生物学的流体溶液を、検量線をプロットするために用いた特異的抗体と同じウェルに入れる。検量線のプロットには、既知の濃度の抗原に対するモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体を使用する。形成される免疫複合体（抗原−自然抗体）を検出するために、特定の若しくは全てのヒト免疫グロブリンの軽鎖に対するモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体（例えば、ヤギポリクローナル抗体、ヒツジポリクローナル抗体、マウスモノクローナル抗体等）と酵素（例えば、アルカリホスファターゼ、セイヨウワサビペルオキシダーゼ等）とのコンジュゲートを用いる。酵素（例えば、アルカリホスファターゼ等）により分解される際に基質から分離される発色剤の量に依存して色が変化する発色剤溶液の吸光反応を用いて自然自己抗体の濃度を求める。前記基質は、特定の波長で色の特徴を分光学的に測定することができる可溶性生成物を生成する。
実施例１
ヒトのガンマインターフェロン（ＩＦＮ−γ）に対する自然自己抗体の濃度を定量的に測定することで本発明の方法を実施しながら技術的な効果が得られる可能性を確認するために、インターフェロン療法を受けていない２０人の健常ドナーから血清試料を採取した。したがって、前記ドナーの血清は、ヒトのＩＦＮ−γに対する自己抗体は含有していないが、前記ドナーの血清中にはヒトのＩＦＮ−γに対する自然自己抗体は存在している。
ヒトのガンマインターフェロン（ＩＦＮ−γ）に対する自然自己抗体の濃度を定量的に測定することで本発明の方法を実施しながら技術的な効果が得られる可能性を確認するために、インターフェロン療法を受けていない２０人の健常ドナーから血清試料を採取した。したがって、前記ドナーの血清は、ヒトのＩＦＮ−γに対する自己抗体は含有していないが、前記ドナーの血清中にはヒトのＩＦＮ−γに対する自然自己抗体は存在している。
Ｇｒｅｉｎｅｒ ｂｉｏ−ｏｎｅ ＧｍｂＨ製のストレプトアビジンでコーティングされている９６ウェルプレート（カタログ番号６５５９９０）のウェルの一部に、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ製の組換え型ヒトガンマインターフェロン（ヒトＩＦＮ−γ、カタログ番号３４−８３１９−８５）１００μＬを接種し、前記ウェルの他の部分（被験試料に対する対照ウェル）に、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ製のウシ血清アルブミン（カタログ番号Ａ−３８０３）を接種した。これらは両方共、湿度１００％にて１００μＬ／ウェルの割合でＵ−ＣｙＴｅｃｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｃｏｍｐａｎｙの標準的な手順（標準操作手順番号ＵＣＴ−１２７）に従ってビオチン化した（標識の原理は、安定なアミド結合を形成することにより、タンパク質の遊離アミノ基をＤ−ビオチニル−ε−アミノカプロン酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＮＨＳ−ビオチン）と反応させ（抗原のビオチンに対するモル比１：２）（反応は、穏やかに撹拌しながら室温で２時間インキュベートしている間に生じる）；次いで、ビオチン化されたタンパク質をリン酸バッファー溶液で透析して、未反応のＮＨＳ−ビオチンを除去するというものである）。
血清試料を２０倍に希釈し（即ち、１％のＴｒｉｔｏｎ−Ｘ１００及び０．００２％のチメロサールを含有するリン酸バッファー１，９００μＬで血清１００μＬを希釈し）、７５℃で２０分間インキュベートした。
次いで、インキュベートした溶液を更に５倍に希釈し（即ち、１％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、１％のＴｒｉｔｏｎ−Ｘ１００、及び０．００２％のチメロサールを含有するリン酸緩衝生理食塩水４００μＬでインキュベートした溶液１００μＬを希釈し）、プレートのウェルに接種するために用いた（１ウェル当たり１００μＬ）。
検量線をプロットするために、１６単位／ｍＬ〜０．５単位／ｍＬの濃度の標準抗体溶液を調製した（ヒトＩＦＮ−γに対するマウスモノクローナル抗体、クローンＭＤ−２）。本明細書では、１００ｐｇ／ｍＬのマウスモノクローナル抗体を１単位／ｍＬと定義した。
調製した標準抗体、ネガティブコントロールとして用いた溶液（１％のＢＳＡ、１％のＴｒｉｔｏｎ−Ｘ１００、及び０．００２％のチメロサールを含有するリン酸バッファー）、及び被験試料溶液を、表１に示す通りプレートのウェルに接種し、３７℃で２時間インキュベートした。インキュベート後、デカンテーションによりプレートから流体を除去し、標準洗浄溶液（０．０５％のＴｗｉｎ−２０及び０．０１％のチメロサールを含有するリン酸バッファー）でプレートをすすいだ。
表１は、プレートのウェルと接種した試料とのチャートを示す。
次いで、全てのプレートのウェルに、アルカリホスファターゼとコンジュゲートしているヒトのＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＧに対するヤギ抗体の混合物（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ；カタログ番号Ａ−３３１３）又はアルカリホスファターゼとコンジュゲートしているマウスのＩｇＧに対するヤギ抗体（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ；カタログ番号Ａ−３５６２）を１００μＬずつ接種した。アルカリホスファターゼとコンジュゲートしているマウスのＩｇＧに対するヤギ抗体は、検量線をプロットするために用いるヒトＩＦＮ−γに対するモノクローナル抗体（ＭＤ−２）の濃度を測定するために使用するものである。次いで、前記プレートを３７℃で１時間インキュベートした。インキュベート後、デカンテーションによりプレートのウェルから流体を除去し、標準洗浄溶液（０．０５％のＴｗｉｎ−２０及び０．０１％のチメロサールを含有するリン酸バッファー）でプレートを５回すすいだ。
コンジュゲート含有溶液のインキュベートが終了する１５分間前に、基質バッファー１錠とＳｉｇｍａ Ｃｏｍｐａｎｙ製の基質（パラニトロフェニルホスフェート）（カタログ番号Ｎ−２７７０）１錠とを蒸留水２０ｍＬに溶解させることにより発色剤溶液を調製した。
調製した発色剤溶液１００μＬを各プレートのウェルに接種し、前記プレートを３７℃で３０分間インキュベートした。
インキュベート後、全てのプレートのウェルにＭｅｒｃｋ ＫｇａＡ製の停止溶液（３Ｎの水酸化ナトリウム）（カタログ番号１．０６４９５）を接種し、標準的な光度計を用いて４０５ｎｍの波長における吸光度を測定した。
得られた測定結果を用いて、ＩＦＮ−γに対する自然自己抗体の濃度を計算した。この目的のために、標準抗体の光学密度（ＯＤ）の真の値、及び被験試料の真の値を以下の通り求めた：
１． ネガティブコントロールの平均ＯＤ（ウェル１Ｇ、１Ｈ、２Ｇ、２ＨのＯＤの算術平均値）を計算した。
２． 標準抗体の平均ＯＤ（それぞれの標準Ｐ１〜Ｐ６のウェルにおけるＯＤの算術平均値）を計算した。
３． 標準抗体のＯＤの平均値とネガティブコントロールのＯＤの平均値との差として、標準抗体のＯＤの真の値を計算した。
計算結果を表２に示す。
４． 得られた標準抗体の真のＯＤ値を用いて、検量線をプロットした（図１を参照されたい）。グラフ中、縦軸（ｙ軸）は、ＯＤ値であり、横軸（ｘ軸）はＩＦＮ−γに対する抗体の濃度である。プロットした検量線は、以下の等式：ｙ＝−０．００５２ｘ２＋０．１７７ｘ＋０．０１７２により表すことができる。
５． ビオチン化ＩＦＮ−γが固定化されているプレートのウェル（表１の列３、５、７、９、１１）、及びビオチン化ＢＳＡが固定化されているプレートのウェル（表１の列４、６、８、１０、１２）における被験試料の平均ＯＤ値を計算した。例えば、被験試料Ｓ１の場合、それぞれウェルＡ３、Ｂ３、及びＡ４、Ｂ４について平均ＯＤ値を計算した。
６． ビオチン化ＩＦＮ−γが固定化されているプレートのウェルにおいて測定された被験試料の平均ＯＤ値と、ビオチン化ＢＳＡが固定化されているプレートのウェルにおいて測定された被験試料の平均ＯＤ値との差として、被験試料の真のＯＤ値を計算した。例えば、被験試料Ｓ１の場合、プレートのウェルＡ３、Ｂ３で測定された平均ＯＤ値から、プレートのウェルＡ４、Ｂ４で測定された平均ＯＤ値を減じた。
７． 検量線（図１）を用いて、被験試料におけるヒトＩＦＮ−γに対する希釈自然自己抗体の濃度を求めた。被験試料におけるヒトＩＦＮ−γに対する自然自己抗体の濃度の真の値を得るために、得られた結果に試料の希釈係数を乗じた（即ち、１００を乗じた）。
８． 結果を表３に示す。
１． ネガティブコントロールの平均ＯＤ（ウェル１Ｇ、１Ｈ、２Ｇ、２ＨのＯＤの算術平均値）を計算した。
２． 標準抗体の平均ＯＤ（それぞれの標準Ｐ１〜Ｐ６のウェルにおけるＯＤの算術平均値）を計算した。
３． 標準抗体のＯＤの平均値とネガティブコントロールのＯＤの平均値との差として、標準抗体のＯＤの真の値を計算した。
計算結果を表２に示す。
５． ビオチン化ＩＦＮ−γが固定化されているプレートのウェル（表１の列３、５、７、９、１１）、及びビオチン化ＢＳＡが固定化されているプレートのウェル（表１の列４、６、８、１０、１２）における被験試料の平均ＯＤ値を計算した。例えば、被験試料Ｓ１の場合、それぞれウェルＡ３、Ｂ３、及びＡ４、Ｂ４について平均ＯＤ値を計算した。
６． ビオチン化ＩＦＮ−γが固定化されているプレートのウェルにおいて測定された被験試料の平均ＯＤ値と、ビオチン化ＢＳＡが固定化されているプレートのウェルにおいて測定された被験試料の平均ＯＤ値との差として、被験試料の真のＯＤ値を計算した。例えば、被験試料Ｓ１の場合、プレートのウェルＡ３、Ｂ３で測定された平均ＯＤ値から、プレートのウェルＡ４、Ｂ４で測定された平均ＯＤ値を減じた。
７． 検量線（図１）を用いて、被験試料におけるヒトＩＦＮ−γに対する希釈自然自己抗体の濃度を求めた。被験試料におけるヒトＩＦＮ−γに対する自然自己抗体の濃度の真の値を得るために、得られた結果に試料の希釈係数を乗じた（即ち、１００を乗じた）。
８． 結果を表３に示す。
実施例２
ヒトＩＦＮ−γに対する自然自己抗体の濃度が増加している感染性単核症の患者２０人から血清試料を採取した。
ヒトＩＦＮ−γに対する自然自己抗体の濃度が増加している感染性単核症の患者２０人から血清試料を採取した。
被験試料を１，０００倍に希釈し、ヒト血清アルブミンをブロッキング剤として使用し、５６℃でインキュベートを行ったことを除いて、ヒトＩＦＮ−γに対する自然自己抗体の濃度を求めるための工程は全て実施例１に記載した手順と同様であった。
検量線を図２に示し、得られた結果を表４に示す。
実施例３
ヒトＩＦＮ−γに対する自然自己抗体の濃度を定量的に測定するための本発明の方法を実施したときに技術的な効果が得られる可能性を検証するために、加熱処理を行う前に、被験生物学的流体を鉄含有酸化剤で更に処理した。インターフェロン療法を受けていない２０人の健常ドナーから血清試料を採取した。したがって、血清中にヒトのＩＦＮ−γに対する自己抗体は存在しないが、ヒトのＩＦＮ−γに対する自然自己抗体は存在している。
ヒトＩＦＮ−γに対する自然自己抗体の濃度を定量的に測定するための本発明の方法を実施したときに技術的な効果が得られる可能性を検証するために、加熱処理を行う前に、被験生物学的流体を鉄含有酸化剤で更に処理した。インターフェロン療法を受けていない２０人の健常ドナーから血清試料を採取した。したがって、血清中にヒトのＩＦＮ−γに対する自己抗体は存在しないが、ヒトのＩＦＮ−γに対する自然自己抗体は存在している。
Ｇｒｅｉｎｅｒ ｂｉｏ−ｏｎｅ ＧｍｂＨ製のストレプトアビジンでコーティングされている９６ウェルプレート（カタログ番号６５５９９０）のウェルの一部に、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ製の組換え型ヒトＩＦＮ−γ（カタログ番号３４−８３１９−８５）１００μＬを接種し、前記ウェルの他の部分（被験試料に対する対照ウェル）に、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ製のウシ血清アルブミン（カタログ番号Ａ−３８０３）を接種した。これらは両方共、湿度１００％にて１００μＬ／ウェルの割合でＵ−ＣｙＴｅｃｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｃｏｍｐａｎｙの標準的な手順（標準操作手順番号ＵＣＴ−１２７）に従ってビオチン化した（標識の原理は、安定なアミド結合を形成することにより、タンパク質の遊離アミノ基をＤ−ビオチニル−ε−アミノカプロン酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＮＨＳ−ビオチン）と反応させ（反応は、穏やかに撹拌しながら室温で２時間インキュベートしている間に生じる）；次いで、ビオチン化されたタンパク質をリン酸バッファー溶液で透析して、未反応のＮＨＳ−ビオチンを除去するというものである）。
血清試料を１０倍に希釈し（即ち、１％のＴｒｉｔｏｎ−Ｘ１００及び０．００２％のチメロサールを含有するリン酸バッファー９０μＬで血清１０μＬを希釈し）、２ｍＭのＦｅＣｌ３で処理し、５６℃で４０分間インキュベートした。
次いで、インキュベートした溶液を更に５倍に希釈し（即ち、１％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、１％のＴｒｉｔｏｎ−Ｘ１００、及び０．００２％のチメロサールを含有するリン酸バッファー４００μＬでインキュベートした溶液１００μＬを希釈し）、プレートのウェルに接種するために用いた（１ウェル当たり１００μＬ）。
検量線をプロットするために、１６単位／ｍＬ〜０．５単位／ｍＬの濃度の標準抗体溶液を調製した（ヒトＩＦＮ−γに対するマウスモノクローナル抗体、クローンＭＤ−２）。本明細書では、１００ｐｇ／ｍＬのマウスモノクローナル抗体を１単位／ｍＬと定義した。
調製した標準抗体、ネガティブコントロールとして用いた溶液（１％のＢＳＡ、１％のＴｒｉｔｏｎ−Ｘ１００、及び０．００２％のチメロサールを含有するリン酸バッファー）、及び被験試料溶液を、表５に示す通りプレートのウェルに接種し、３７℃で２時間インキュベートした。インキュベート後、デカンテーションによりプレートから流体を除去し、標準洗浄溶液（０．０５％のＴｗｉｎ−２０及び０．０１％のチメロサールを含有するリン酸バッファー）でプレートを５回すすいだ。
表５は、プレートのウェルと接種した試料とのチャートを示す。
次いで、全てのプレートのウェルに、アルカリホスファターゼとコンジュゲートしているヒトのＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＧに対するヤギ抗体の混合物（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ；カタログ番号Ａ−３３１３）又はアルカリホスファターゼとコンジュゲートしているマウスのＩｇＧに対するヤギ抗体（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ；カタログ番号Ａ−３５６２）を１００μＬずつ接種した。アルカリホスファターゼとコンジュゲートしているマウスのＩｇＧに対するヤギ抗体は、検量線をプロットするために用いるヒトＩＦＮ−γに対するモノクローナル抗体（ＭＤ−２）の濃度を測定するために使用するものである。次いで、前記プレートを３７℃で１時間インキュベートした。インキュベート後、デカンテーションによりプレートのウェルから流体を除去し、標準洗浄溶液（０．０５％のＴｗｉｎ−２０及び０．０１％のチメロサールを含有するリン酸バッファー）でプレートを５回すすいだ。
コンジュゲート含有溶液のインキュベートが終了する１５分間前に、基質バッファー１錠とＳｉｇｍａ Ｃｏｍｐａｎｙ製の基質（パラニトロフェニルホスフェート）（カタログ番号Ｎ−２７７０）１錠とを蒸留水２０ｍＬに溶解させることにより発色剤溶液を調製した。
調製した発色剤溶液１００μＬを各プレートのウェルに接種し、前記プレートを３７℃で３０分間インキュベートした。
インキュベート後、全てのプレートのウェルにＭｅｒｃｋ ＫｇａＡ製の停止溶液（３Ｎの水酸化ナトリウム）（カタログ番号１．０６４９５）を接種し、標準的な光度計を用いて４０５ｎｍの波長における吸光度を測定した。
得られた測定結果を用いて、ＩＦＮ−γに対する自然自己抗体の濃度を計算した。この目的のために、標準抗体の光学密度（ＯＤ）の真の値、及び被験試料のＯＤの真の値を以下の通り求めた：
１． ネガティブコントロールの平均ＯＤ（ウェル１Ｇ、１Ｈ、２Ｇ、２ＨのＯＤの算術平均値）を計算した。
２． 標準抗体の平均ＯＤ（それぞれの標準Ｐ１〜Ｐ６のウェルにおけるＯＤの算術平均値）を計算した。
３． 標準抗体のＯＤの平均値とネガティブコントロールのＯＤの平均値との差として、標準抗体のＯＤの真の値を計算した。
計算結果を表６に示す。
４． 得られた標準抗体の真のＯＤ値を用いて、検量線をプロットした（図３を参照されたい）。グラフ中、縦軸（ｙ軸）は、ＯＤ値であり、横軸（ｘ軸）はＩＦＮ−γに対する抗体の濃度である。プロットした検量線は、以下の等式：ｙ＝−０．００４９ｘ２＋０．１８０７ｘ＋０．０１８４により表すことができる。
５． ビオチン化ＩＦＮ−γが固定化されているプレートのウェル（表５の列３、５、７、９、１１）、及びビオチン化ＢＳＡが固定化されているプレートのウェル（表５の列４、６、８、１０、１２）における被験試料の平均ＯＤ値を計算した。例えば、被験試料Ｓ１の場合、それぞれウェルＡ３、Ｂ３、及びＡ４、Ｂ４について平均ＯＤ値を計算した。
６． ビオチン化ＩＦＮ−γが固定化されているプレートのウェルにおいて測定された被験試料の平均ＯＤ値と、ビオチン化ＢＳＡが固定化されているプレートのウェルにおいて測定された被験試料の平均ＯＤ値との差として、被験試料の真のＯＤ値を計算した。例えば、被験試料Ｓ１の場合、プレートのウェルＡ３、Ｂ３で測定された平均ＯＤ値から、プレートのウェルＡ４、Ｂ４で測定された平均ＯＤ値を減じた。
７． 検量線（図３）を用いて、被験試料におけるヒトＩＦＮ−γに対する希釈自然自己抗体の濃度を求めた。被験試料におけるヒトＩＦＮ−γに対する自然自己抗体の濃度の真の値を得るために、得られた結果に試料の希釈係数を乗じた（即ち、１００を乗じた）。
８． 結果を表７に示す。
１． ネガティブコントロールの平均ＯＤ（ウェル１Ｇ、１Ｈ、２Ｇ、２ＨのＯＤの算術平均値）を計算した。
２． 標準抗体の平均ＯＤ（それぞれの標準Ｐ１〜Ｐ６のウェルにおけるＯＤの算術平均値）を計算した。
３． 標準抗体のＯＤの平均値とネガティブコントロールのＯＤの平均値との差として、標準抗体のＯＤの真の値を計算した。
計算結果を表６に示す。
５． ビオチン化ＩＦＮ−γが固定化されているプレートのウェル（表５の列３、５、７、９、１１）、及びビオチン化ＢＳＡが固定化されているプレートのウェル（表５の列４、６、８、１０、１２）における被験試料の平均ＯＤ値を計算した。例えば、被験試料Ｓ１の場合、それぞれウェルＡ３、Ｂ３、及びＡ４、Ｂ４について平均ＯＤ値を計算した。
６． ビオチン化ＩＦＮ−γが固定化されているプレートのウェルにおいて測定された被験試料の平均ＯＤ値と、ビオチン化ＢＳＡが固定化されているプレートのウェルにおいて測定された被験試料の平均ＯＤ値との差として、被験試料の真のＯＤ値を計算した。例えば、被験試料Ｓ１の場合、プレートのウェルＡ３、Ｂ３で測定された平均ＯＤ値から、プレートのウェルＡ４、Ｂ４で測定された平均ＯＤ値を減じた。
７． 検量線（図３）を用いて、被験試料におけるヒトＩＦＮ−γに対する希釈自然自己抗体の濃度を求めた。被験試料におけるヒトＩＦＮ−γに対する自然自己抗体の濃度の真の値を得るために、得られた結果に試料の希釈係数を乗じた（即ち、１００を乗じた）。
８． 結果を表７に示す。
したがって、ヒトのＩＦＮ−γに対する自然自己抗体を含有する血清に本発明を適用した実施例により、本発明の特徴を組み合わせて実施した際のヒトＩＦＮ−γに対する自然自己抗体の濃度の定量的測定の効率及び信頼性が証明された。また、実施例３の通り、被験生物学的流体を更に処理すると本発明の方法の効率が高まる。
Claims (1)
- 酵素イムノアッセイによりヒト由来の生物学的流体における自然自己抗体を定量的に測定する方法であって；物理的収着用固相を抗原で処理し、被験生物学的試料を添加し、コンジュゲート含有溶液で前記固相を処理し、前記固相と液相とを分離し、前記固相に添加した発色剤溶液の吸光度を分光光度分析することを含み；前記物理的収着用固相としてストレプトアビジンでコーティングされている物理的収着用固相を用いること；予めビオチン化されている抗原及び前記物理的収着用固相における非特異的結合部位をブロックするためのブロッキング剤としての標準的な手順に従ってビオチン化されたタンパク質のそれぞれで、前記物理的収着用固相の異なる部分を処理すること；酵素で標識されており、且つヒト免疫グロブリンのアイソタイプのうちの１種若しくは全てと反応するモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体を前記コンジュゲート含有溶液として用いること；前記物理的収着用固相の非特異的結合部位をブロックするために用いられるタンパク質と、加熱処理中に前記自然自己抗体が分解するのを防ぐ基質とを含有するバッファーで前記被験生物学的流体を予め希釈した後、前記被験生物学的流体を鉄含有酸化剤で処理し、次いで、前記被験生物学的流体を加熱処理すること；各生物学的流体の被験試料に対して、ビオチン化抗原が固定化されていない対照物理的収着用固相を用いること；及び抗原に対するモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体を使用してプロットした検量線を用いて前記自然自己抗体の数を求めることを特徴とする方法。
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