SU1746318A1 - Способ определени концентрации белка Е вируса клещевого энцефалита в препаратах вакцины, сорбированных на гидроокиси алюмини - Google Patents

Abstract

Изобретение относитс  к иммунохими- ческим методам измерени  содержани  антигена в вакцинах против клещевого энцефалита (КЭ). Целью изобретени   вл етс  повышение чувствительности определени . Количество вирусного антигена определ ют иммуноферментным методом (ИФМ) в вакцинах против КЭ, сорбированных на гидроокиси алюмини . Реакцию взаимодействи  исследуемого антигена со специфическими антителами провод т при 20-22°С в течение 2-3 ч при посто нном перемешивании в растворе при оптимальной концентрации антител . При этом процесс образовани  комплексов антиген - антитело происходит в растворе, а не на поверхности панели, тем самым устран етс  возможное неблагопри тное механическое воздействие частиц гидроокиси алюмини  на подложку антител и на процесс образовани  иммунных комплексов . С этой же целью дл  определени  в ИФМ количества не св завшихс  с антигеном антител их отдел ют в составе надоса- дочной жидкости от частиц гидроокиси алюмини . Концентрацию белка Е в исследуемом препарате вакцины, обратно пропорциональную концентрации не св завшихс  с антигеном антител, вычисл ют по калибровочной кривой относительно стандартного образца белка Е. Положительный эффект изобретени  заключаетс  в повышении чувствительности способа в 40 раз. (Л С

Description

Изобретение относитс  к области медицинской вирусологии, а именно к изучению способов стандартизации вакцин против клещевого энцефалита (КЭ), сорбированных на гидроокиси алюмини , по количеству измер емого в них антигена (иммунногенного белка Е).

Целью изобретени   вл етс  повышение чувствительное и определени  сорбированного антигена.

Способ осуществл етс  следующим образом .

В лунках панели дл  постановки серологических реакций (или инсулиновых флаконах , пробирках) готов т трехкратные разведени  исследуемого препарата на рабочем буфере (0,01 М фосфатный буфер рН 7,5. 0,13 М хлористый натрий, 10%-на  нормальна  лошадина  сыворотка, 0 1%-ный твин 80) в объеме 200-400 мкл В эти же лунки внос т специфические антитела в объеме 100-200 мкл того же буфера в разведении, обеспечивающим 60%-ное максимальное св зывание исследуемого антигена (оптимальна  концентраци ) Смесь инкубируют при 20-22°С в течение 23ч при посто нном перемешивании По окончании инкубации смесь выдерживают

XI

О OJ

со

15-20 мин без перемешивани  дл  осаждени  частиц гидроокиси алюмини  (в случае использовани  дл  инкубации пробирок или флаконов этот этап можно ускорить центрифугированием при 1000 об/мин 3-5 мин). Надосадочную прозрачную жидкость, содержащую несв завшиес  с исследуемым антигеном антитела, внос т в панель дл  ИФМ с сорбированным на ней стандартным антигеном (подложкой)- белком Е или инак- тивированным формалином вирусом КЭ. Формирование подложки в панели осуществл ют путем инкубации стандартного антигена в концентрации 1-2 мкг/мл в 0,01 М фосфатном буфере рН 7,5 при 4°С в течение 17 ч (в течение ночи), или при 37°С в течение 1-2 ч. Количество св завшихс  с подложкой специфических антител вы вл ют с помощью пероксидазного коньюгата антиви- довых антител. Количество вирусного антитела в исследуемом препарате рассчитывают по калибровочной кривой стандартного раствора антигена. .

Пример 1.В лунки панели дл  постановки реакции гемагглютинации (панель 1) внос т по 200 мкл рабочего буфера. Автоматической пипеткой объемом 100 мкл раститровывают в лунках исследуемый препарат инактивированной культуральной вакцины против КЭ, сорбированный на гидроокиси алюмини . В лунки с раститрован- ным образцом внос т в объеме 100 мкл рабочего буфера кроличьи антитела к белку Е в оптимальной концентрации. Панель укрепл ют на вибраторе, устанавливают режим вибрации, не допуска  выплескивани  смеси из лунок, инкубируют при 20°С в течение 2 ч. В панель дл  ИФМ (панель 2) внос т по 100 мкл белка Е в 0,01 М фосфатном буфере рН 7,5 в концентрации 1 мкг/мл и инкубируют при 37°С 1-2 ч. Панель 1 снимают с вибратора, выдерживают 15 мин до осаждени  гидроокиси алюмини . Панель 2 трижды отмывают отмывочным раствором (0,01 М фосфатный буфер рН 7,5. 0,13 М хлористый натрий; 0.05%-ный твин 80). По 100 мкл надосадочной прозрачной жидкости, не взмучива  осадка гидроокиси алюмини  из панели 1 перенос т в лунки панели 2, инкубируют 1 ч при 37°С. По окончании инкубации панель 2 отмывают, как указано, в лунки внос т по 100 мкл пероксидазного конъюгата антикроличьих антител в избыточной концентрации. Инкубируют 30 мин при 37°С. Панель трижды отмывают отмывочным раствором, затем однократно 0,01 М .фосфатным буфером

рН 7,5 без детергента.Внос твлункипо 100 мкл раствора субстрата (4 мг ортофенилен- диамина в 10 мл ацетатного буфера рН 5,5 с 0,03%-ным На02). Реакцию останавливают через 20 мин добавлением в лунки по 50 мкл 5%-ной серной кислоты. Измерение оптической плотности провод т при 492 нм.

В предлагаемом способе сорбированный на гидроокиси алюмини  антиген и специфические антитела взаимодействуют один с другим в растворе во взвешенном состо нии и, таким образом, частицы гидроокиси алюмини  не оказывают неблагопри тное механическое воздействие на процесс образовани  иммунных комплексов , что происходит в известном способе, когда антитела фиксированы на поверхности панели. С этой же целью устранени 

механического воздействи  частиц гидроокиси алюмини  на подложку стандартного антигена при измерении иммунофермент- ным методом количества не св завшихс  с исследуемым антигеном антител последние предварительно отдел ют от частиц гидроокиси алюмини  и сорбированных на этих частицах иммунных комплексов. В результате предлагаемый способ позвол ет в 40 раз .повысить чувствительность огфеделени  антигена в сорбированных вакцинах по сравнению с известным способом и с одинаковой эффективностью определ ть антиген в вакцинах как до, так и после сорбировани  их на гидроокиси алюмини .

Claims (1)

1. Формула изобретени  Способ определени  .концентрации белка Е вируса клещевого энцефалита в препаратах вакцины, сорбированных на гидроокиси алюмини , включающий инкубацию сорбированного на гидроокиси алюмини  вирусного антигена со специфическими антителами при посто нном перемешивании с последующим измерением количества не

   св завшихс  с антигеном антител иммуно- ферментным методом, отличающийс  тем, что, с целью повышени  чувствительности способа, реакцию взаимодействи  исследуемого антигена со специфическими

   антителами осуществл ют в растворе при концентрации специфических антител, обеспечивающей 50% максимальное св зывание антигена, далее не св завшиес  с антигеном антитела отдел ют в составе

   надосадочной жидкости от частиц гидроокиси алюмини  с последующим определением их концентрации.