ES2300630T3 - Procedimiento y kit para detectar antigenos. - Google Patents
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Abstract
Un procedimiento para la detección de un antígeno, estando el antígeno en combinación con hidróxido de aluminio, comprendiendo el procedimiento las etapas de: (i) poner en contacto el antígeno con una inmunoglobulina, o fragmento de la misma, en el contexto de un soporte sólido y en presencia de un tampón básico, para permitir la unión del antígeno con la inmunoglobulina o fragmento de la misma; (ii) añadir un agente de bloqueo; y (iii) detectar la unión de anticuerpo al antígeno, en el que las etapas 1, 2 y 3 se llevan a cabo secuencialmente pero no necesariamente de modo consecutivo.
Description
Procedimiento y kit para detectar antígenos.
La presente invención se refiere a
procedimientos para la detección de antígenos. Puede que se requiera
la detección y/o cuantificación de ciertos antígenos después de que
se haya formulado el antígeno de alguna manera con componentes
adicionales. Por ejemplo, en el caso de ciertas vacunas de hepatitis
B, el antígeno de superficie de la hepatitis B se formula con
hidróxido de aluminio. Sin embargo, dicha formulación con hidróxido
de aluminio tiene problemas para la cuantificación del componente
de antígeno, pues la presencia de hidróxido de aluminio parece que
interfiere de alguna manera (ya sea directa o indirectamente) con la
unión antígeno-anticuerpo en los procedimientos de
detección basados en anticuerpos, tales como el análisis de
inmunoabsorción con enzimas ligadas (ELISA).
Yamamoto y col. (Biologicals (1997) 25,
373-380) describen la cuantificación de antígeno de
grupo específico a en vacunas de hepatitis B mediante
anticuerpos monoclonales anti-HBs/a. El
documento EP-A-0339667 describe un
procedimiento para determinar el título del antígeno HAV en una
vacuna combinada de hepatitis A/B. Katz J B y col. (Journal of
Virological Methods, 25 (1989) 101-108) describen
una evaluación in vitro del contenido de antígeno viral en
vacunas inactivadas con coadyuvante de hidróxido de aluminio.
La presente invención se refiere a un
procedimiento para la detección de un antígeno en una muestra,
estando el antígeno en combinación con hidróxido de aluminio,
comprendiendo el procedimiento las etapas de:
- 1
- poner en contacto la muestra con una inmunoglobulina, o fragmento de la misma, en el contexto de un soporte sólido y en presencia de un tampón básico, para permitir la unión del antígeno de la muestra con la inmunoglobulina o fragmento de la misma;
- 2
- añadir un agente de bloqueo; y
- 3
- detectar la unión del anticuerpo al antígeno,
en el que las etapas se realizan en ese orden,
pero no necesariamente de modo consecutivo.
La presente invención se basa generalmente en
los procedimientos de detección ELISA, en los que la unión de un
antígeno a un anticuerpo en el contexto de un soporte sólido se
detecta posteriormente mediante la unión de un segundo anticuerpo.
Los procedimientos ELISA son bien conocidos en la técnica (véase,
por ejemplo, Belanger y col., Clin. Chim. Acta 48, páginas
15-18). Generalmente, la invención se refiere así a
un procedimiento para detección de un antígeno usando un anticuerpo
o fragmento del mismo. Adecuadamente, el procedimiento es un
análisis ELISA.
El procedimiento de la invención se refiere a la
detección de un antígeno en combinación con hidróxido de aluminio.
Preferiblemente, un antígeno que está en combinación con hidróxido
de aluminio se adsorbe, o se compleja o se asocia directamente de
otra manera con hidróxido de aluminio. Sin embargo, la invención
también se refiere a la detección de un antígeno que no está él
mismo directamente adsorbido o complejado con hidróxido de
aluminio, sino que está en una mezcla o composición en la que
también está presente hidróxido de aluminio. El hidróxido de
aluminio puede estar libre o unido a un antígeno que no es el mismo
que el antígeno que se ha de detectar mediante el análisis.
Preferiblemente, el antígeno es un antígeno de
la hepatitis, preferiblemente, un antígeno de la hepatitis B, Lo
más preferible, antígeno de superficie de la hepatitis B.
Preferiblemente, el procedimiento de la
invención es así para la detección y/o cuantificación de un antígeno
de superficie de la hepatitis B adsorbido sobre hidróxido de
aluminio.
La invención también se refiere a la detección
y/o cuantificación de un antígeno de la hepatitis B adsorbido o
asociado con una sal de aluminio, preferiblemente, fosfato de
aluminio, en combinación con otro antígeno adsorbido o asociado con
hidróxido de aluminio. Para evitar dudas cuando se dice que un
antígeno está "en combinación con" otro antígeno, esto
significa simplemente que un antígeno está "en presencia de"
otro antígeno, y no necesariamente implica interacción física
directa alguna entre los dos. En particular la detección puede ser
de antígeno de la hepatitis B en una combinación de antígeno de
superficie de la hepatitis B adsorbido sobre fosfato de aluminio
con pertactina adsorbida sobre hidróxido de aluminio. En tal caso se
apreciará que la invención también se aplica a la detección del
componente de pertactina.
También se prefiere la detección de un antígeno
de la hepatitis B en una combinación que contiene componentes de
difteria (D), tétanos (T) y tosferina acelular (Pa)("DTPa"),
tales como la vacuna Pediarix® de GlaxoSmithKline.
También se prefiere el uso de la invención en la
detección y/o cuantificación de
polirribosil-ribitol-fosfato (PRP)
purificado de Haemophilus Influenzae tipo B que se une
fuertemente a hidróxido de aluminio.
Preferiblemente, el procedimiento de la
invención es tal que no hay interferencia, o esta es mínima, del
hidróxido de aluminio en la detección/cuantificación del antígeno
de interés.
En la primera etapa del procedimiento se pone en
contacto un antígeno con una inmunoglobulina o fragmento de la
misma en el contexto de un soporte sólido. El contacto de antígeno
con inmunoglobulina sucede adecuadamente cuando uno u otro está
unido a un soporte sólido apropiado. Preferiblemente, la
inmunoglobulina o fragmento de la misma está unida al soporte
sólido. El soporte sólido es preferiblemente, un soporte sólido de
material plástico, adecuadamente una placa de microvaloración u
otra placa apropiada para un análisis de tipo ELISA. La más
preferida es una placa de microvaloración de poliestireno,
preferiblemente, una placa de microvaloración de 96 pocillos, por
ejemplo la placa de microvaloración de fondo plano Nunc
Maxisorb®.
Preferiblemente, la inmunoglobulina o fragmento
de la misma se fija al soporte sólido y posteriormente esta
inmunoglobulina o fragmento de la misma fijada se pone en contacto
con el antígeno.
Lo más preferible, una placa de microvaloración
de material sintético se reviste con una inmunoglobulina adecuada
según procedimientos bien conocidos en la técnica.
Preferiblemente, el componente de
inmunoglobulina es un anticuerpo o fragmento del mismo capaz de
unirse específicamente al antígeno. Los fragmentos de anticuerpos
adecuados que retienen actividad de unión específica para un
antígeno dado son bien conocidos en la técnica y pueden incluir
regiones Fv de anticuerpo en ausencia de regiones Fc, o pueden
incluir inmunoglobulinas de cadena única adecuadas. El término
"anticuerpo" se usará en este documento para describir todas
las inmunoglobulinas adecuadas y fragmentos de las mismas que tienen
una unión específica adecuada con un antígeno que permita su uso en
un sistema de detección ELISA o tipo ELISA. Preferiblemente, el
anticuerpo es un anticuerpo policlonal, Lo más preferible, un
anticuerpo policlonal de conejo, siendo el más preferido un
anticuerpo de conejo frente a hepatitis B. Preferiblemente, el
anticuerpo es una molécula de IgG.
La producción y caracterización de anticuerpos
para la detección del antígeno de superficie de la hepatitis B son
bien conocidas, por ejemplo, como se describe en Wands y col.,
Gastroenterology 80, 225-232, 1981, Drouet y col.,
Med Lab Science 38, 341-348, 1981 y Shih
JW-K y col., J Virol Methods, 1,
257-273, 1983.
La mezcla de la muestra de antígeno con el
anticuerpo se lleva a cabo en presencia de un tampón básico, que es
cualquier tampón adecuado que tenga un pH mayor de 7.
Preferiblemente, el tampón tiene un pH mayor de 8, más
preferiblemente, tiene un pH mayor de 8,5 y Lo más preferible, tiene
sustancialmente un pH de 9. Preferiblemente, el pH está entre 7 y
12, más preferiblemente, entre 8 y 11, Lo más preferible, entre 8 y
10. El pH se puede ajustar para tener en cuenta el antígeno
específico que está siendo ensayado, para optimizar el procedimiento
-esto es, para optimizar la unión y/o minimizar el efecto del
hidróxido de aluminio en el análisis-. Preferiblemente, el tampón
contiene Tween al 1% o un equivalente funcional del mismo. Lo más
preferible, el tampón es DEA 0,2 M, HCl 0,2 M a pH 9 con Tween al
1% añadido, preferiblemente, para uso en la detección del antígeno
de superficie de la
hepatitis B.
hepatitis B.
Adecuadamente, el antígeno que se ha de ensayar
se mezcla o se diluye en un tampón básico y posteriormente se pone
en contacto con un anticuerpo fijado al soporte sólido.
Preferiblemente, la incubación del antígeno y el
anticuerpo se lleva a cabo con agitación.
La unión antígeno-anticuerpo va
seguida por el tratamiento de la combinación
antígeno-anticuerpo sobre el soporte sólido con un
agente de bloqueo. El agente de bloqueo es cualquier agente adecuado
que minimice las interacciones no específicas entre el complejo
anticuerpo-antígeno y cualquier sistema de detección
que se use para detectar el complejo
anticuerpo-antígeno sobre el soporte sólido. Los
agentes de bloqueo adecuados son bien conocidos en la técnica,
tales como suero fetal de ternera (FCS) o albúmina de suero bovino
(BSA), siendo un agente de bloqueo preferido PBS que contenga BSA
al 1%.
La detección de la combinación
antígeno-anticuerpo se puede llevar a cabo usando
cualquier medio de detección adecuado, y éstos son bien conocidos
en la técnica del procedimiento ELISA. Un ejemplo de un
procedimiento adecuado se da en el Ejemplo 1.
Preferiblemente, la combinación
anticuerpo-antígeno, después del bloqueo, se pone en
contacto con un segundo anticuerpo que se une específicamente al
antígeno. La unión del segundo anticuerpo puede ser detectada
directa o indirectamente, de manera adecuada para evaluar la
cantidad de antígeno presente en la muestra. Por ejemplo, el
segundo anticuerpo puede unirse directamente a un marcador
detectable o se puede detectar mediante la adición de un anticuerpo
marcado adicionalmente. Ambos procedimientos de detección directa e
indirecta son bien conocidos en la técnica.
Para uso en detección es adecuado el anticuerpo
monoclonal RF-1 (Goodhall AH y col., 1981, Medical
Laboratory Sciences 38, 349-354), preferiblemente,
en combinación con otros anticuerpos monoclonales. Los anticuerpos
preferidos son los anticuerpos monoclonales que reconocen el epitopo
de los aminoácidos 111-126 del antígeno de
superficie de la hepatitis B. Sin embargo, la elección de anticuerpo
de detección no es crítica para la presente invención, y los
procedimientos para la producción de anticuerpos adecuados son bien
conocidos en la técnica.
Preferiblemente, la detección del complejo
anticuerpo-antígeno se lleva a cabo en un tampón con
una concentración relativamente alta de proteína, tal como BSA,
para minimizar de nuevo interacciones no específicas.
Preferiblemente, la detección se lleva a cabo en un tampón con al
menos un 0,05% de proteína de bloqueo, tal como BSA, más
preferiblemente, entre un 0,05-0,5% de proteína de
bloqueo, más preferiblemente, entre un 0,1-0,3% de
proteína de bloqueo y Lo más preferible, aproximadamente un 0,2% de
proteína de bloqueo. Lo más preferible, el tampón de detección
comprende PBS, BSA al 0,2%, Tween al 1% y suero de ternera recién
nacida al 4%, adecuadamente para uso en un análisis para antígeno
de superficie de la hepatitis B.
En una realización más preferida, la presente
invención se refiere a un procedimiento para la detección de un
antígeno de superficie de la hepatitis B en una muestra, estando el
antígeno de la hepatitis adsorbido sobre hidróxido de aluminio,
comprendiendo el procedimiento las etapas, en orden, de:
- 1
- poner en contacto un anticuerpo específico para el antígeno de superficie de la hepatitis B con una muestra que se ha de ensayar, estando el anticuerpo unido a un soporte sólido, realizándose el contacto en presencia de un tampón básico, con agitación, para permitir la unión del antígeno al anticuerpo, en la que el tampón tiene un pH de 9 o aproximadamente pH 9;
- 2
- añadir un agente de bloqueo que comprende BSA al 1% o BSA aproximadamente al 1%; y
- 3
- detectar la unión del anticuerpo al antígeno.
Preferiblemente, el soporte sólido es una placa
de microvaloración.
El procedimiento de la presente invención se usa
adecuadamente para fines de control de calidad en producción de
vacunas. Además, el procedimiento se puede usar generalmente para la
identificación de antígenos, medición de la capacidad antigénica y
cuantificación.
La presente invención se ilustra en este
documento mediante los siguientes ejemplos que no son limitantes de
la presente invención.
Ejemplo
1
- 1.
- Se revistieron placas de microvaloración con un antisuero policlonal de conejo anti-HBs.
- 2.
- Se diluyeron muestras de HBs/Al(OH)_{3} que se habían de cuantificar en DEA 0,2 M, HCl 0,2 M, Tween al 1%, pH 9 (dilución doble) y se incubaron con las placas durante 2 horas a 37ºC con agitación. Las muestras ensayadas fueron las vacunas Engerix® (hepatitis B) de GlaxoSmithKline.
- 3.
- Después de una etapa de lavado (en NaCl 150 mM, Tween al 0,05%) se bloqueó la fase sólida con tampón PBS con BSA al 1% durante 1 hora a 37ºC, se lavó posteriormente con NaCl 150 mM + solución de Tween 20 al 0,05%.
- 4.
- La detección del complejo anti-HBs/HBsAg se realizó posteriormente mediante adición de una combinación de 3 anticuerpos monoclonales de ratón anti-HBs diluidos a 1 \mug/ml en PBS, BSA al 0,2%, Tween al 1% y de suero de ternera recién nacida al 4% y se incubaron posteriormente durante 1 hora a 37ºC. El exceso de anticuerpos se retiró mediante lavado y las placas se incubaron posteriormente con una Ig anti-ratón conjugada con biotina (de Prosan®) durante 30 min. a temperatura ambiente (TA) con agitación. Después de lavar, se añadió a los pocillos el complejo de estreptavidina conjugada con peroxidasa de rábano picante Amdex® (de Amersham®) (30 min. a TA con agitación). Se lavaron posteriormente las placas y se incubaron con una solución de o-fenilendiamina (Sigma®) al 0,04%, H_{2}O_{2} al 0,03%, Tween 20 al 1%, tampón de citrato 0,05M, pH 4,5 durante 20 min. con agitación. La reacción se detuvo con H_{2}SO_{4} 2N y se leyó a 490 y 630 nm. La señal obtenida a 630 nm se resta de la obtenida a 490 nm y se puede usar para calcular las concentraciones de HBsAg en la muestra a través de la referencia a un patrón mediante SoftmaxPro (concentración expresada en \mug/ml).
Las etapas anteriores se prefieren
individualmente y por separado en la presente invención,
adecuadamente para la detección del antígeno de superficie de la
hepatitis B. Cada etapa específica se puede incorporar al
procedimiento general de la invención por separado de las otras
etapas.
Los resultados obtenidos se compararon con los
obtenidos con muestras de Engerix® usando el kit comercialmente
disponible Auszyme® (Abbot, Delkenheim, Alemania), el kit
comercialmente disponible preferido actualmente. El procedimiento
de la invención da esencialmente el mismo resultado que el kit
Auszyme®. El coeficiente de variación (CV) es inferior al 10%, lo
que indica alta reproducibilidad del procedimiento.
Ejemplo
2
Pediarix® comprende el antígeno de superficie de
la hepatitis B, DTPa e IPV. La detección de hepatitis B en muestras
de Pediarix® se llevó a cabo como sigue:
- \bullet
- Revestimiento: Se revistieron placas de microvaloración con un antisuero policlonal de conejo anti-HBs (diluido 1/8000) O/N a 4ºC.
- \bullet
- Muestras: Se diluyeron las muestras que se habían de probar en DEA 0,2 M, HCl 0,2 M, Tween al 1%, pH 9 (dilución doble) y se incubaron con las placas durante 2 horas a 37ºC con agitación.
- \bullet
- Se llevó a cabo el bloqueo con PBS BSA al 1% durante 1 h. a 37ºC.
- \bullet
- La detección de complejo anti-HBs/HBsAg se realizó posteriormente mediante adición de una combinación de 3 anticuerpos monoclonales de ratón anti-HBs diluidos a 1 \mug/ml en PBS, BSA al 1%, Tween 20 al 1% y suero de ternera recién nacida al 4% y se incubaron posteriormente durante 1 hora a 37ºC. El exceso de anticuerpos se retiró mediante lavado y las placas se incubaron posteriormente con una Ig anti-ratón conjugada con biotina (de Prosan®) diluida en PBS, BSA al 1%, Tween 20 al 1% durante 30 min. a temperatura ambiente (TA) con agitación. Después de lavar, se añadió a los pocillos el complejo de estreptavidina conjugada con peroxidasa de rábano Amdex® (de Amersham®) diluido en PBS, BSA al 1%, Tween 20 al 1% (30 min. a TA con agitación). Se lavaron posteriormente las placas y se incubaron con una solución de de o-fenilendiamina al 0,04% (Sigma®), de H_{2}O_{2} al 0,03%, Tween 20 al 1%, tampón de citrato 0,05 M, pH 4,5 durante 20 min. con agitación. La reacción se detuvo con H_{2}SO_{4} 2N y se leyó a 490 y 630 nm. Las concentraciones de HBsAg en las muestras se calcularon a partir de una referencia mediante SoftmaxPro y se expresaron en \mug/ml.
Las etapas anteriores se prefieren
individualmente y por separado en la presente invención,
adecuadamente para la detección del antígeno de superficie de la
hepatitis B. Cada etapa específica se puede incorporar al
procedimiento general de la invención por separado de las otras
etapas.
Los resultados obtenidos sobre muestras de
Pediarix fueron coherentes de nuevo con los resultados obtenidos
usando el kit Auszyme.
Claims (6)
1. Un procedimiento para la detección de un
antígeno, estando el antígeno en combinación con hidróxido de
aluminio, comprendiendo el procedimiento las etapas de:
- (i)
- poner en contacto el antígeno con una inmunoglobulina, o fragmento de la misma, en el contexto de un soporte sólido y en presencia de un tampón básico, para permitir la unión del antígeno con la inmunoglobulina o fragmento de la misma;
- (ii)
- añadir un agente de bloqueo; y
- (iii)
- detectar la unión de anticuerpo al antígeno,
en el que las etapas 1, 2 y 3 se llevan a cabo
secuencialmente pero no necesariamente de modo consecutivo.
2. Un procedimiento según la reivindicación 1 en
el que el antígeno es antígeno de superficie de la hepatitis B.
3. Un procedimiento según la reivindicación 1 ó
2 en el que la etapa (i) se lleva a cabo con agitación.
4. Un procedimiento según cualquier
reivindicación precedente en el que la etapa de detección (iii) se
lleva a cabo en presencia de de albúmina de suero bovino (BSA) al
0,2%.
5. Un procedimiento según cualquier
reivindicación precedente que comprende las siguientes etapas:
- (i)
- poner en contacto un anticuerpo específico para antígeno de superficie de la hepatitis B con una muestra que se ha de probar, estando el anticuerpo unido a un soporte sólido, realizándose el contacto en presencia de un tampón básico, con agitación, para permitir la unión del antígeno al anticuerpo, en la que el tampón tiene un pH entre 8 y 10;
- (ii)
- añadir un agente de bloqueo que comprende BSA al 1%; y
- (iii)
- detectar la unión de anticuerpo a antígeno en presencia de BSA al 0,2%.
6. Un procedimiento según cualquier
reivindicación precedente, en el que el tampón básico tiene pH
9.
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