JP2006502416A - Ｍｈｃクラスｉおよびクラスｉｉ結合ペプチドを検出するための方法およびシステム - Google Patents
Ｍｈｃクラスｉおよびクラスｉｉ結合ペプチドを検出するための方法およびシステム Download PDFInfo
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Abstract
本発明は、固体表面に固定されたMHCクラスI単量体およびクラスII単量体がなおも、適したMHC結合ペプチドと複合体を形成することができるという発見に基づく。HLA単量体に対するペプチドの結合を検出する方法、および二つのMHC結合ペプチドの結合の相対的な程度を測定する方法、ならびにMHC複合体からペプチドの解離速度を測定する方法を提供する。本発明はまた、本発明の方法を行うために有用なシステムおよびキットを提供する。
Description
関連出願の相互参照
本出願は、その全内容が参照として本明細書に組み入れられる、2002年10月11日に出願された米国特許出願第10/269,473号の一部継続出願である。
本出願は、その全内容が参照として本明細書に組み入れられる、2002年10月11日に出願された米国特許出願第10/269,473号の一部継続出願である。
発明の分野
本発明は全般的に、イムノアッセイの分野、特にMHC対立遺伝子に対するペプチドの結合を検出および測定するイムノアッセイを用いることに関する。
本発明は全般的に、イムノアッセイの分野、特にMHC対立遺伝子に対するペプチドの結合を検出および測定するイムノアッセイを用いることに関する。
発明の背景
クラスI組織適合性三元複合体は、非共有結合によって会合した三つの部分からなる。MHC重鎖と呼ばれる膜貫通タンパク質は、ほとんどが細胞表面に露出している。MHC重鎖の細胞表面ドメインはαヘリックスの二つのセグメントを含み、それらは二つの隆起を形成してそれらのあいだに溝が形成される。短いペプチドは、二つのαヘリックス間のこの溝に非共有結合によって結合し（「適合し」）、β-2ミクログロブリンの分子がMHC単量体の外側の二つのドメインに沿って非共有結合によって結合して、三元複合体を形成する。一つのMHCサブタイプ重鎖に非共有結合するペプチドは通常、もう一つのサブタイプに結合しないと考えられる。しかし、全てが同じタイプのβ-2ミクログロブリンに結合する。MHC分子は、体の細胞のほとんどによって合成され、示される。
クラスI組織適合性三元複合体は、非共有結合によって会合した三つの部分からなる。MHC重鎖と呼ばれる膜貫通タンパク質は、ほとんどが細胞表面に露出している。MHC重鎖の細胞表面ドメインはαヘリックスの二つのセグメントを含み、それらは二つの隆起を形成してそれらのあいだに溝が形成される。短いペプチドは、二つのαヘリックス間のこの溝に非共有結合によって結合し（「適合し」）、β-2ミクログロブリンの分子がMHC単量体の外側の二つのドメインに沿って非共有結合によって結合して、三元複合体を形成する。一つのMHCサブタイプ重鎖に非共有結合するペプチドは通常、もう一つのサブタイプに結合しないと考えられる。しかし、全てが同じタイプのβ-2ミクログロブリンに結合する。MHC分子は、体の細胞のほとんどによって合成され、示される。
ヒトにおいて、MHC分子は、HLA分子と呼ばれる。ヒトは、重鎖のみが異なるHLA-A、HLA-B、およびHLA-Cと命名される異なる三つのサブタイプのMHCクラスI分子を主に合成する。
MHCは、体から「非自己」または外来ウイルスタンパク質を除去するために、専門的なタイプのT細胞（細胞障害性T細胞）と協調して作用する。T細胞上の抗原受容体は、結合したペプチドと、それに隣接して溝を形成するαヘリックスの一部とのモザイクであるエピトープを認識する。外来タンパク質の切断によるペプチド断片の生成後、MHC分子によりペプチド断片が提示されることによって、MHC拘束細胞障害性T細胞が「非自己」または外来ウイルスタンパク質の発現に関して細胞を調査することができる。機能的T細胞は、T細胞が特異的である結合した抗原性ペプチドを含むMHC分子の認識に基づいて細胞障害性免疫応答を示すと思われる。
ヒトにおいてこれらの機能を実行する場合、HLA-A、BおよびC重鎖は、アミノ酸の長さが約8個〜約10個、おそらく約8個〜約11個、または約8個〜約12個の多数のペプチドと相互作用する。単量体が折り畳まれると、特定のペプチドのみがそれぞれのHLAクラスIサブタイプの重鎖における結合ポケットに結合するが、特定のサブタイプは交叉反応する。1995年までに、完全なコード領域配列がHLA-A対立遺伝子43個、HLA-B対立遺伝子89個、およびHLA-C対立遺伝子11個のそれぞれに関して決定されている（P. Parhamら、Immunology Review 143：141〜180、1995）。
クラスII組織適合性分子は、クラスI分子における溝のように、抗原性ペプチドと非共有結合によって会合する溝をその外側の末端で形成するように相互作用して二つの膜貫通ポリペプチドからなる。しかし、クラスII分子に結合した抗原性ペプチドは、その周辺から細胞が取り込んだ抗原に由来する。さらに、クラスII組織適合性分子に結合するペプチドは、アミノ酸の長さが約10個〜約30個、例えば約12〜約24個である（Marsh, S.G.E.ら（2000）「The HLA Facts Book」、Academic Press、58〜59頁）。
マクロファージ、樹状細胞、およびBリンパ球のような、細胞外液からの抗原の取り込みを専門とする細胞のみが、クラスII分子を発現する。
抗原断片はクラスI MHC拘束T細胞によって認識されるという発見によって、癌およびウイルス感染症に対する有効なワクチンを開発することができると長い間考えられてきた。アルゴリズムを用いてHLA-A、B、またはC-結合ペプチドのアミノ酸配列を予測する多くのアプローチが開発されており、いくつかはインターネット上で利用することができる。例えば、米国特許第6,037,135号は、任意の所定のHLA-A対立遺伝子に結合する可能性に関してペプチドを階級分けする行列に基づくアルゴリズムを記述している。同様に、ほとんどの予測法は、一組の対立遺伝子に限定されている。その結果、予測されるペプチドは、患者の全集団からのMHC単量体に結合しない可能性があり、このように全体として有効ではない可能性がある。EPIMATRIX、SYFPEITHI、TEPITOPE、PROPRED、およびEPIPREDICTのような、HLA-クラスII分子に関するアルゴリズムも同様に記述されている。
MHC結合ペプチドの同定に対するもう一つのアプローチは、競合に基づく結合アッセイを用いる。全ての競合的アッセイは、異なるペプチドの結合親和性の比較を生じる。しかし、そのようなアッセイは、用いた参照ペプチドに結果が依存することから、絶対的な解離定数を生じない。
MHC結合ペプチドを決定するために用いられるなおもう一つのアプローチは、古典的な再構成アッセイ、例えば「T2」細胞を用いるアッセイであり、このアッセイでは適当なMHC対立遺伝子を発現する細胞は、クラスI分子に関してはpH 2〜3で、およびクラスII分子に関してはpH 4.5〜5.5で短期間インキュベートすることによって、天然の結合ペプチドを「剥がされる」。次に、同じMHC対立遺伝子に関して推定のMHC結合ペプチドの結合親和性を決定するために、剥がされたMHC単量体を、推定のMHC結合ペプチド、クラスI単量体の場合にはβ-2ミクログロブリン、および立体配座依存的モノクローナル抗体と溶液中で混合する。標識後、例えば標識モノクローナル抗体によって直接、または経口標識二次抗体によって標識後、試験結合ペプチドの存在下および非存在下でインキュベートした細胞における蛍光強度の差を用いて、試験ペプチドの結合を決定することができる。しかし、低いpHで剥がした可溶性のMHC単量体は、即座に凝集して、ハイスループットアッセイにおいてそれらを用いることは困難で非現実的である。
現在、ドナーからの細胞を用いる一連のインビトロ細胞性免疫アッセイが存在する。アッセイには、細胞がドナーに由来する状況が含まれるが、多くのアッセイは、他の起源、例えばB細胞株からの抗原提示細胞源を提供する。これらのインビトロアッセイには、細胞障害性Tリンパ球アッセイ、リンパ増殖アッセイ、例えばトリチウム標識チミジン取り込み、タンパク質キナーゼアッセイ、イオン輸送アッセイ、およびリンパ球遊走阻害機能アッセイが含まれる(Hickling, J. K.ら、J. Virol., 61: 3463 (1987); Hengel, H.ら、J. Immunol., 139: 4196 (1987); Thorley-Lawson, D. A.ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84: 5384 (1987); Kadival, G. J.ら、J. Immunol., 139: 2447 (1987); Samuelson, L. E.ら、J. Immunol., 139: 2708 (1987); Cason, J.ら、J. Immunol. Meth., 102: 109 (1987); およびTsein, R. J.ら、Nature, 293: 68 (1982))。これらのアッセイは、細胞性免疫活性に対する真の特異性を欠損する可能性があるという点において不都合であり、それらは同じMHC型のAPCによる抗原のプロセシングおよび提示を必要とし、それらは遅く（時に数日間持続する）、いくつかは主観的であり、および／または放射性同位元素を用いる必要がある。
MHCクラスIまたはクラスII結合ペプチドを同定するためのさらにもう一つのアプローチはMHC四量体の形成を利用し、これはMHC単量体4個と、それに対して蛍光色素、例えばフィコエリスリンが結合するビオチンに対する四量体結合部位を有する分子であるストレプトアビジンとの複合体である。例えば、クラスI単量体の場合、β2-ミクログロブリンの可溶性サブユニット、推定のT細胞エピトープを含むペプチド断片、および対象ペプチド断片の予想MHCサブタイプに対応するMHC重鎖またはMHCの可溶性サブユニットは、宿主細胞におけるポリペプチドの発現によって得られる。MHC四量体に含まれる四つの単量体のそれぞれは、例えば、それぞれがβ2-ミクログロブリン、ペプチド断片、および対応するMHC重鎖を含む再構成単量体への可溶性単位の集合に都合がよい条件でこれらの可溶性サブユニットを再生することによって、単量体として産生される。MHC四量体は、単量体のビオチン化およびビオチン化再構成単量体を蛍光色素標識ストレプトアビジンにその後接触させることによって、単量体から構築される。被験者の末梢血リンパ球（PBL）の試料に含まれるような、多様なT細胞集団と接触させると、試料中のT細胞によって認識される再構成単量体を含むそれらの四量体は、マッチしたT細胞に結合するであろう。反応の内容物は、それに結合したMHC四量体を有するそれらのT細胞を決定、定量、および／または単離するために、蛍光フローサイトメトリーを用いて分析する（米国特許第5,635,363号を参照されたい）。
MHC四量体アッセイにおいてT細胞によって認識された試験ペプチドが、T細胞を活性化して免疫応答を生成するか否かを決定するためには、少なくとも一つの他の試験、いわゆる「機能的試験」が必要である。酵素結合イムノスポット（ELISpot）アッセイは、マイクロプレートにサイトカインまたはエフェクター分子に対して特異的なモノクローナル抗体を結合させることによって、特異的サイトカインまたは他のエフェクター分子を分泌する個々の細胞を検出するように適合されている。抗原によって刺激された細胞を、固定された抗体に接触させる。細胞および任意の未結合の基質を洗浄した後、同じサイトカインまたは他のエフェクター分子に対して特異的な、タグ標識ポリクローナル抗体またはよりしばしばモノクローナル抗体をウェルに加える。洗浄後、タグ標識抗体に結合する着色剤を加えると、濃藍色の沈殿物（またはスポット）がサイトカイン局在部位に形成される。スポットを手動で計数するか、または自動ELISpotリーダーシステムによって計数して、反応を定量することができる。試験ペプチドによるT細胞活性化の最終的な確認は、インビボ試験、例えばマウスモデルを必要としてもよい。このように、MHC-結合ペプチドの有効性を最終的に確認するための経路は、費用と時間がかかる。
MHCクラスII四量体の形成に関しても、α鎖およびβ鎖が大腸菌によって産生されるのではなく昆虫細胞において産生されることを除き、類似の技法に従う。昆虫細胞にα鎖およびβ鎖をトランスフェクトさせて、上清に分泌させる。分泌された分子は空であり、所望のMHC-結合ペプチドをローディングすることができる。ペプチドローディング後、単量体をビオチン化して、蛍光色素に結合させたストレプトアビジンによって四量体を形成させる。
このように、推定のMHCクラスIおよびクラスII結合ペプチドを同定する予備スクリーニングアッセイのための、ならびにHLA-A、B、CまたはD、DR、DP、またはDQのようなMHC対立遺伝子に対するペプチドの結合を測定するための、新規のよりよいシステムおよび方法、特に固相フォーマットでのインビトロアッセイが当技術分野においてなおも必要である。同様に、当技術分野において、MHC結合ペプチドのMHC結合親和性を決定するため、およびMHC分子からの結合ペプチドの解離速度を測定するための方法を開発することも必要である。
発明の概要
本発明は、MHCクラスIおよびクラスII単量体を固体に固定した場合に、なおも溶液からMHC結合ペプチドを取り込んで、MHC複合体を形成することができるという発見に基づくものである。
本発明は、MHCクラスIおよびクラスII単量体を固体に固定した場合に、なおも溶液からMHC結合ペプチドを取り込んで、MHC複合体を形成することができるという発見に基づくものである。
したがって、本発明の一つの態様において、本発明は、表面が一つもしくはそれ以上のMHCクラスIもしくはクラスII単量体、または改変MHCクラスIもしくはクラスII単量体に結合している、固体表面を含むシステムを提供する。クラスI単量体は、変性条件で変性して、再構成条件で結合ポケットにおいて適したMHC結合ペプチドを含む三元複合体を形成するように再構成される。MHCクラスII単量体は、pH4〜約8の範囲において溶液からのMHC結合ペプチドに結合する。もう一つの態様において、本発明のシステムを含むキットも同様に提供される。
もう一つの態様において、本発明は、MHCクラスI単量体または改変MHCクラスI単量体と、推定のMHC結合ペプチドのあいだの結合を決定する方法を提供し、この方法には、複数の予め変性させたMHCクラスI単量体または改変MHCクラスI単量体を結合させた固体表面を、推定のMHC結合ペプチドの存在下および非存在下で、単量体が再構成条件で再構成して適したMHC結合ペプチドを含む三元複合体を形成するように、再構成条件でインキュベートすることが含まれる。MHC複合体の解離成分には結合しないモノクローナル抗体が三元複合体に結合すれば、推定のMHC結合ペプチドと単量体とが結合していることを示している。もう一つのアプローチは、未知ペプチドがHLA分子との結合に関して蛍光標識ペプチドと競合することができるか否かを決定するために、蛍光標識ペプチドを用いることを含む。
さらにもう一つの態様において、本発明は、複数のMHC単量体または改変MHC単量体を結合させた固体表面を、推定のMHC結合ペプチドの存在下および非存在下で適したペプチドローディング条件でインキュベートして、適したMHC結合ペプチドを含む複合体を形成させる段階、ならびにMHC単量体と推定のMHC結合ペプチドとの結合を決定する段階によって、MHCクラスII単量体または改変MHCクラスII単量体と、推定のMHC結合ペプチドとの結合を決定する方法を提供する。
さらにもう一つの態様において、本発明は、固体表面に結合させた少なくとも一つのそのような変性MHC単量体または改変MHC単量体を、推定のMHC結合ペプチド、および対応する再構成MHC単量体を含む第一の複合体における立体配座エピトープには特異的に結合するが、MHC複合体の如何なる解離成分にも結合しないモノクローナル抗体と共に、再構成条件でインキュベートすること、ならびに推定のMHC結合ペプチドを含むMHC複合体に対するモノクローナル抗体の結合を、単量体と既知のMHC結合ペプチドとを含む対応する複合体に対するモノクローナル抗体の結合と比較することによって、推定のMHC結合ペプチドに対するMHCクラスI単量体または改変MHCクラスI単量体の結合親和性の程度を決定する方法を提供する。結合の差は、推定のMHC結合ペプチド対する再構成単量体の結合親和性の相対的な程度を示す。
さらにもう一つの態様において、本発明は、固体表面に結合させた少なくとも一つのMHCクラスII単量体または改変MHCクラスII単量体を、推定のMHC結合ペプチド、および単量体を含む第一の複合体における立体配座エピトープには特異的に結合するが、MHC複合体の如何なる解離成分にも結合しないモノクローナル抗体と共に、適したペプチドローディング条件でインキュベートすること、ならびに推定のMHC結合ペプチドを含むMHC複合体に対するモノクローナル抗体の結合を、単量体と既知のMHC結合ペプチドとを含む対応する複合体に対するモノクローナル抗体の結合と比較することによって、推定のMHC結合ペプチドに対するMHCクラスII単量体または改変MHCクラスII単量体の結合親和性の程度を決定する方法を提供する。結合の差は、推定のMHC結合ペプチド対する単量体の結合親和性の相対的な程度を示す。
さらにもう一つの態様において、本発明は、異なる温度、特に37℃での、推定のMHC結合ペプチドに関するMHC単量体または改変MHC単量体の安定性を決定する方法を提供する。この態様において、固体表面に結合させた少なくとも一つの変性MHC単量体または改変MHC単量体を、推定のMHC結合ペプチド、および変性単量体には存在しない対応する再構成MHC単量体の立体配座エピトープに特異的に結合するモノクローナル抗体と共に、再構成条件でインキュベートする。モノクローナル抗体と共に再構成三元複合体を異なる温度および異なる時間インキュベートする。異なる温度および異なる時間で得られたシグナルの差は、推定のMHC結合ペプチドに関する再構成単量体の相対的安定性を示す。
発明の詳細な説明
本発明は全般的に、推定のMHC結合ペプチドに対するMHCクラスIおよびクラスII単量体、特に表面上に固定されたMHCクラスIおよびクラスII単量体の結合親和性の検出および測定に向けられるイムノアッセイに関する。固体表面に固定されたMHC単量体および改変MHC単量体はなおも、溶液からの必要な結合親和性を有するMHC結合ペプチドに結合することによってMHC複合体を形成するように再生することができる。その上、そのような結合は、そのような再生または再構成されたMHC単量体を含むMHC複合体には特異的に結合するが、MHC複合体の解離成分には結合しない立体配座依存的モノクローナル抗体を利用するような、イムノアッセイフォーマットにおいて検出することができることは本発明の発見である。
本発明は全般的に、推定のMHC結合ペプチドに対するMHCクラスIおよびクラスII単量体、特に表面上に固定されたMHCクラスIおよびクラスII単量体の結合親和性の検出および測定に向けられるイムノアッセイに関する。固体表面に固定されたMHC単量体および改変MHC単量体はなおも、溶液からの必要な結合親和性を有するMHC結合ペプチドに結合することによってMHC複合体を形成するように再生することができる。その上、そのような結合は、そのような再生または再構成されたMHC単量体を含むMHC複合体には特異的に結合するが、MHC複合体の解離成分には結合しない立体配座依存的モノクローナル抗体を利用するような、イムノアッセイフォーマットにおいて検出することができることは本発明の発見である。
本明細書において用いられるように、MHCクラスI分子を指すために用いられる「MHC単量体」および「HLA単量体」という用語は、再生条件で適当なMHC結合またはHLA-結合ペプチドおよびβ2-ミクログロブリンとの三元複合体への構築能を維持するクラスI重鎖を意味する。これらの用語はまた、それぞれの複合体を変性条件に供して、単量体を変性させて、MHC結合ペプチドから（およびクラスI単量体の場合にはβ2-ミクログロブリンから）解離させることによって得られたクラスI単量体の変性型も指すために用いられる。MHCクラスII分子を指すために用いる場合、「MHC単量体およびHLA単量体」という用語は、適したペプチドローディング条件で溶液からの適当なMHC結合またはHLA結合ペプチドに結合するためにMHC複合体を形成するヘテロ二量体への構築能を維持するα鎖およびβクラスII鎖を意味する。クラスII単量体は、例えばpH約4〜約8の範囲で溶液中からのそのようなペプチドに結合するためにMHC結合ペプチドの存在下で変性および再生される必要はない。
本明細書において用いられるように、「改変MHC単量体」および「改変HLA単量体」という用語は、上記の、しかし下記のように改変を導入するように操作されているクラスI単量体およびクラスII単量体を指す。これらの用語はまた、再生条件で適当なMHC結合ペプチドまたはHLA結合ペプチド（およびクラスI単量体の場合にはβ2-ミクログロブリン）と共にMHC複合体への構築能、および変性条件で解離能を維持するMHC単量体の機能的断片も含む。例えば、機能的断片は、クラスI重鎖のα1、α2、α3ドメインのみ、またはα1、α2ドメインのみ、すなわち、三元複合体の形成に関与する細胞表面ドメインを含みうる。
MHCクラスII単量体は、それぞれが細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内テールを含む、二つの膜貫通ポリペプチド鎖からなる。細胞外ドメインは、互いに結合してMHC IIヘテロ二量体を形成する。これらのポリペプチドのそれぞれ（αおよびβとして知られる）は、折り畳まれて異なる二つの細胞外ドメイン：αポリペプチドに関してα-1およびα-2、およびβポリペプチドに関してβ-1およびβ-2を形成する。α-1およびβ-1ドメインのあいだには、底面のβプリーツシートおよび側面の二つのαヘリックスによって結合され、（非共有結合相互作用によって）MHC II結合ペプチドに結合することができる、結合ポケットまたは「溝」として知られる領域が存在する。このMHC II結合ペプチドは、TH細胞に「提示」され、TH細胞が認識する抗原「エピトープ」を定義する。改変MHC II単量体は、α鎖およびβ鎖の細胞外ドメインのみを含むヘテロ二量体となりうる。
もう一つの態様において、改変MHC単量体は、融合タンパク質または「一本鎖」分子に含まれるクラスI重鎖分子またはその機能的断片となり得、これにはさらに、単量体の細胞表面ドメイン間のリンカーとして、検出マーカーとして、または融合タンパク質においてリガンドが反応する第二のリガンドによってコーティングされた固体支持体に分子を結合させるためのリガンドとして機能するアミノ酸配列が含まれてもよい。その上、「改変MHC単量体」および「改変HLA単量体」という用語は、一つより多い種から、または一つより多いMHCクラスIもしくはクラスIIサブクラスからのMHCクラスIおよびクラスII分子のドメインを含むキメラを含むと意図される。本明細書における図9は、ヒトHLA-A2断片における三つのαドメインの一つをマウスH-2Kbドメインに置換することによるキメラの調製を説明する。そのような分子は、サブユニット間の選択的アミノ酸リンカーを有する一本鎖として、または当技術分野で既知である融合タンパク質として都合よく発現される。
もう一つの態様において、改変MHC単量体は、α鎖およびβ鎖の細胞外ドメインのみを含むクラスIIヘテロ二量体となりうる。それぞれのポリペプチド鎖は、さらにC末端にロイシンジッパー配列（例えば、FosまたはJun）を付加することができ、融合タンパク質のC末端でビオチン化タグとしてMHC II DR4β鎖において認められるBirA酵素の天然の認識部位を含むアミノ酸セグメントを付加するように、鎖の一つをさらに改変することができる。
単量体の調製
ヒトの第6染色体に存在するクラスI MHCは、三つの座、すなわちHLA-A、HLA-B、およびHLA-Cを有する。最初の二つの座は、アロ抗原をコードする多数の対立遺伝子を有する。これらは、44 kD重鎖サブユニットと、12 kDβ2ミクログロブリンサブユニットからなり、これらは全ての抗原特異性にとって共通であることが判明している。例えば、可溶性HLA-A2は、Turner, M.J.ら、J. Biol. Chem.（1977）252：7555〜7567によって記述されるように、ホモ接合ヒトリンパ芽球性細胞株J-Yから細胞質膜のパパイン消化後に精製することができる。パパインは、膜貫通領域の近位で44 kD重鎖を切断し、α1、α2、およびα3ドメインおよびβ2-ミクログロブリンを含む分子を生じる。
ヒトの第6染色体に存在するクラスI MHCは、三つの座、すなわちHLA-A、HLA-B、およびHLA-Cを有する。最初の二つの座は、アロ抗原をコードする多数の対立遺伝子を有する。これらは、44 kD重鎖サブユニットと、12 kDβ2ミクログロブリンサブユニットからなり、これらは全ての抗原特異性にとって共通であることが判明している。例えば、可溶性HLA-A2は、Turner, M.J.ら、J. Biol. Chem.（1977）252：7555〜7567によって記述されるように、ホモ接合ヒトリンパ芽球性細胞株J-Yから細胞質膜のパパイン消化後に精製することができる。パパインは、膜貫通領域の近位で44 kD重鎖を切断し、α1、α2、およびα3ドメインおよびβ2-ミクログロブリンを含む分子を生じる。
MHC単量体は、適当な細胞から単離することができ、または例えば、Paulら、「Fundamental Immunology」第二版、W.E. Paul編、Ravens Press、ニューヨーク、1989、第16〜18章に記述されるように、組換えによって産生することができ、下記のように容易に改変することができる。
本明細書においてMHC単量体に適用される「単離された」という用語は、その天然の状態以外の、例えば通常MHCを発現する細胞の細胞膜に会合していないMHCクラスIまたはクラスIIのMHC糖タンパク質を指す。この用語は、完全長のサブユニット鎖と共に、MHC単量体の機能的断片を含む。機能的断片は、抗原結合部位と、適当なT細胞受容体によって認識されるために必要な配列とを含む断片である。これは典型的に、完全長の鎖の配列の少なくとも約60％〜約80％、典型的に90％〜95％を含む。本明細書に記述するように、「単離された」MHCサブユニット成分は、組換えによって産生、または適当な細胞源から可溶化されてもよい。
「成熟」MHC糖タンパク質単量体の天然型は、配列における一つまたはそれ以上のアミノ酸の欠失、置換、および挿入または付加のために、長さが幾分異なると考えられる。このように、MHC単量体は、実質的に天然の改変を受けるが、それでもなおその機能を保持することができる。改変タンパク質鎖はまた、当業者に周知であって、下記に詳細に記述される様々な組換えDNA技術を利用して容易に設計および製造することができる。例えば、鎖は、アミノ酸置換、付加、欠失等によって一次構造レベルで天然に存在する配列とは異なりうる。これらの改変は、最終的に改変されたタンパク質鎖を産生するために多くの組み合わせで用いることができる。
一般的に、MHC単量体をコードする遺伝子の改変は、部位特異的変異誘発のような多様な周知の技術によって容易に行ってもよい。任意の特定の改変の影響は、所望の特徴に関する適したアッセイにおける日常的なスクリーニングによって評価することができる。例えば、サブユニットの免疫学的特徴の変化は、適当な抗体による競合的イムノアッセイによって検出することができる。単量体のT細胞活性化能に及ぼす改変の影響は、標準的なインビトロ細胞アッセイまたは下記の実施例の章に説明する方法を用いて試験することができる。酸化還元もしくは熱安定性、疎水性、タンパク質溶解に対する感受性、または凝集傾向のような他の特性の改変は全て、標準的な技術に従ってアッセイされる。
本発明は、抗原性ペプチドおよび／またはT細胞受容体のサブユニットの親和性を増加させること、サブユニットの安定性、精製、および調製を容易にすることを含む、様々な目的を抱いて調製されるMHC単量体のアミノ酸配列改変を提供する。単量体はまた、本発明の複合体を治療的に用いる際の、血漿半減期を改変する、治療有効性を改善する、または副作用の重症度もしくは発生を弱めるために改変してもよい。サブユニットのアミノ酸配列改変は通常、天然には認められない既定の変種、または天然に存在する対立遺伝子である。変種は典型的に、天然に存在する類似体と同じ生物活性（例えば、MHCペプチド結合）を示す。
本発明の挿入改変は、一つまたはそれ以上のアミノ酸残基がMHC単量体における既定の部位へ導入され、既存の残基と置換する改変である。例えば、挿入改変は、サブユニットのアミノまたはカルボキシ末端との異種タンパク質またはポリペプチドの融合体となりうる。
他の改変には、異種シグナル配列を有する単量体の融合体、または当技術分野で既知の免疫グロブリン鎖もしくはその断片のような増強された血漿半減期（通常、＞約20時間）を有するポリペプチドと単量体との融合体が含まれる。
置換的改変は、少なくとも一つの残基が除去されて異なる残基がその場に挿入されている改変である。非天然アミノ酸（すなわち、天然のタンパク質には通常認められないアミノ酸）のみならず等配電子類似体（アミノ酸またはそれ以外）も同様に、本発明において用いるために適している。
機能または免疫学的同一性における実質的な変化は、ポリペプチド骨格の構造（例えば、シートまたは螺旋状立体配座）、標的部位での分子の電荷または疎水性、または側鎖のかさを維持することに対する作用が異なる置換残基を選択することによって行われる。一般的に機能に最大の変化を生じると期待される置換は、（a）疎水性残基、例えばロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、バリン、もしくはアラニンが、親水性残基、例えばセリンもしくはトレオニンに置換される（または親水性残基が疎水性残基に置換される）；（b）任意の他の残基が、システインもしくはプロリンに置換される（またはシステインもしくはプロリンが、任意の他の残基に置換される；（c）陰電荷を有する残基、例えばグルタミンまたはアスパラギンが、陽電荷側鎖を有する残基、例えばリジン、アルギニン、またはヒスチジンに置換される（または陽電荷側鎖を有する残基が陰電荷を有する残基に置換される）；または（d）側鎖を有しない残基、例えばグリシンが、かさの大きい側鎖を有する残基、例えばフェニルアラニンに置換される（またはかさの大きい側鎖を有する残基が、側鎖を有しない残基に置換されるものであると考えられる。
単量体の置換的改変にはまた、他のタンパク質の機能的に相同な（少なくとも約70％の相同性を有する）ドメインが、通常の方法によって一つまたはそれ以上のMHCサブユニットドメインの代わりに置換されている改変が含まれる。この目的のために特に好ましいタンパク質は、本明細書に記載の図9に示されるようにマウス種のような他の種由来のドメインである。
もう一つのクラスの改変は欠失改変である。欠失は、MHC単量体配列から一つまたはそれ以上のアミノ酸残基が除去されていることを特徴とする。典型的に、膜貫通および細胞質ドメインが欠失される。システインまたは他の不安定残基の欠失も同様に、例えばMHC複合体の酸化的安定性を増加させる場合には望ましい可能性がある。可能性があるタンパク質溶解部位、例えばArgArgの欠失または置換は、塩基性残基の一つを欠失させる、またはこれをグルタミニルもしくはヒスチジル残基によって置換することによって行われる。
好ましいクラスの置換または欠失改変は、サブユニットの膜貫通領域を含む改変を含む。MHC単量体の膜貫通領域は、細胞膜の脂質二重層に及ぶ適当な大きさの非常に疎水性または親油性ドメインである。それらは、細胞膜にMHC分子を繋ぐと考えられている。典型的に膜貫通ドメインのヒドロキシル残基の欠失または置換によって膜貫通ドメインを不活化させると、その細胞のまたは膜脂質親和性を低下させて、その水溶性を改善することによって回収および製剤化が容易となるであろう。または、膜貫通および細胞質ドメインは、おそらく免疫原性のエピトープの導入を回避するために欠失させることができる。膜結合機能の不活化は、この部位で実質的に親水性のハイドロパシープロフィールを生じるために十分な残基を欠失させることによって、または異種残基による置換によって行われ、いずれも同じ結果を生じる。
膜貫通不活化MHC単量体の主な利点は、組換え型宿主の培養培地にそれが放出される可能性があるという点である。この変種は、血液のような体液に溶解性であり、細胞膜脂質に対して認識可能な親和性を有さないので、組換え型細胞培養からの回収はかなり単純となる。典型的に、本発明の改変MHC単量体は、機能的膜貫通ドメインを有さず、好ましくは機能的細胞質配列を有しないであろう。そのような改変MHC単量体は、本質的にMHC単量体の細胞外ドメインの有効な部分からなるであろう。状況によって、単量体は、溶解性が有意に影響を受けない限り、膜貫通領域（約10個までのアミノ酸）からの配列を含む。
例えば、膜貫通ドメインは、任意のアミノ酸配列、例えば概して親水性のハイドロパシープロフィールを示す、セリン、トレオニン、リジン、アルギニン、グルタミン、アスパラギン酸等の親水性残基約5個〜約50個の無作為配列または既定配列によって置換してもよい。欠失（切断）単量体と同様に、これらの単量体は、組換え宿主の培養培地に分泌される。
グリコシル化変種は本発明の範囲に含まれる。それらには、グリコシル化を完全に欠損する変種（非グリコシル化）および天然型より少なくとも一つ少ないグリコシル化部位を有する変種（脱グリコシル化）と共に、グリコシル化が変化している変種が含まれる。脱グリコシル化および非グリコシル化アミノ酸配列変種、天然の非改変アミノ酸配列を有する脱グリコシル化および非グリコシル化サブユニットが含まれる。例えば、置換または挿入変異誘発を用いて、サブユニットのN-またはO-結合グリコシル化部位を消失させる、例えばアスパラギン残基を欠失、またはリジンまたはヒスチジンのようなもう一つの塩基性残基に置換する。または、たとえアスパラギン残基が不変のままであっても、グリコシル化認識部位を消失させることによってグリコシル化を予防するために、グリコシル化部位を構成する隣接残基を置換または欠失する。さらに、原核細胞はグリコシル化をポリペプチドに導入することができないことから、天然の単量体のアミノ酸配列を有する非グリコシル化MHC単量体を、組換え型原核細胞培養物において産生させる。
グリコシル化変種は、適当な宿主細胞を選択することによって、またはインビトロ法によって簡便に産生される。例えば酵母は、哺乳類系のそれとは有意に異なるグリコシル化を導入する。同様に、MHC起源とは異なる種（例えば、ハムスター、マウス、昆虫、ブタ、ウシ、もしくはヒツジ）または組織起源（例えば、肺、肝臓、リンパ様、間葉、または上皮）を有する哺乳類細胞が、例えばマンノースのレベルの上昇、またはマンノース、フコース、シアル酸、および哺乳類の糖タンパク質において典型的に認められる他の糖の多様な比を特徴とする変種グリコシル化の導入能に関して日常的にスクリーニングされている。サブユニットのインビトロプロセシングは典型的に、酵素的加水分解、例えばノイラミニダーゼ消化によって行われる。
本発明において用いるために適したMHC糖タンパク質は、パパイン処理、3 M KClによる処理、および洗浄剤による処理による可溶化を含む多様な技術を用いて、多数の細胞から単離されている。例えば、クラスIタンパク質の洗浄剤抽出の後にアフィニティ精製を用いることができる。次に、洗浄剤を透析または選択的に結合するビーズによって除去することができる。分子は、任意のMHC Iを有する細胞から、例えば標的癌またはウイルス疾患を有する個体からの単離によって得ることができる。
単離されたMHC糖タンパク質からの個々の重鎖の単離は、当業者に既知の標準的な技法を用いて容易に行われる。例えば、重鎖は、SDS/PAGEおよびゲルからの重鎖の電気的溶出を用いて分離することができる（例えば、Dornmairら、上記およびHunkapillerら、Methods in Enzymol. 91：227〜236（1983）を参照されたい）。MHC分子からの異なるサブユニットも同様に、Gorgaら、J. Biol. Chem. 262：16087〜16094（1987）およびDornmairら、Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 54：409〜416（1989）に記述されるように、SDS/PAGEの後に電気的溶出を用いて単離される。当業者は、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、またはアフィニティクロマトグラフィーのような分子を分離する他の多くの標準的な方法を用いることができることを認識すると思われる。
または、多数のMHC単量体タンパク質のアミノ酸配列が既知であり、遺伝子がクローニングされている；したがって、単量体は、組換え法を用いて発現させることができる。これらの技術によって、上記のようにMHC単量体の多くの改変を行うことができる。例えば、組換え技術は、疎水性膜貫通ドメインを欠失するカルボキシ末端の切断法を提供する。カルボキシ末端はまた、例えば分子にシステインおよび／またはリジン残基を導入することによってリガンドまたは標識の結合を容易にするために任意に選択することができる。合成遺伝子には典型的に、発現ベクターへの挿入および遺伝子配列の操作を助けるために制限部位が含まれるであろう。次に適当な単量体をコードする遺伝子を発現ベクターに挿入し、大腸菌、酵母、昆虫、または他の適した細胞のような適当な宿主において発現させて、組換え型タンパク質を得る。
遺伝子の利用率によって配列の容易な操作が可能となることから、第二世代の構築には、例えば図9に示されるキメラ構築物が含まれる。クラスI重鎖のα1、α2、α3ドメインは、MHC複合体を安定化させるために、典型的にβ2-ミクログロブリンと共にクラスIのα3ドメインに結合して同時発現される。クラスI遺伝子の膜貫通および細胞内ドメインも同様に任意で含めることができる。
発現ベクターの構築および適当なDNA配列からの組換えによる産生は、当技術分野で既知の方法によって行われる。DNAおよびRNAの単離、増幅、およびクローニングに関して標準的な技術が用いられる。一般的に、DNAリガーゼ、DNAポリメラーゼ、制限エンドヌクレアーゼ等を含む酵素反応は、製造元の説明書に従って行われる。これらの技術および様々な他の技術は、一般的にSambrookら、「Molecular Cloning - A Laboratory Manual」、Cold Spring Harbor Laboratory、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク、1989に従って行われる。その中に含まれる技法は当技術分野で周知であると考えられている。
発現は原核または真核細胞系において行うことができる。適した真核細胞系には、誘導型プロモーターでのショウジョウバエ発現ベクターのような酵母、植物および昆虫系が含まれる。原核細胞の最も頻繁に用いられる代表は様々な株の大腸菌である。しかし、桿菌、例えば枯草菌（Bacillus subtilis）、様々な種のシュードモナス（Pseudomonas）、または他の細菌株のような他の微生物株も同様に用いてもよい。そのような原核細胞系において、複製部位および宿主と適合性である種に由来する制御配列を含むプラスミドベクターが用いられる。例えば、大腸菌は、典型的に、Bolivarら、Gene（1977）2：95による大腸菌種に由来するプラスミドであるpBR322の誘導体を用いて形質転換される。一般的に用いられる原核細胞制御配列は、本明細書において、β-ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）および乳糖（lac）プロモーターシステム（Changeら、Nature（1977）198：1056）、トリプトファン（trp）プロモーターシステム（Goeddelら、Nucleic Acids Res.（1980）8：4057）、ならびにラムダ由来PLプロモーターおよびN遺伝子リボソーム結合部位（Shimatakeら、Nature（1981）292：128）のような一般的に用いられるプロモーターを含む、任意で、オペレーター、リボソーム結合部位配列と共に転写開始のためのプロモーターが含まれると定義される。原核細胞と適合性である利用できる任意のプロモーターシステムを用いることができる。
真核細胞宿主において有用な発現系は、適当な真核細胞遺伝子に由来するプロモーターを含む。例えば、酵母において有用なクラスのプロモーターには、3-ホスホグリセレートキナーゼ（Hitzemanら、J. Biol. Chem.（1980）255：2073）のプロモーターを含む、糖分解酵素の合成のためのプロモーターが含まれる。他のプロモーターには、例えばエノラーゼ遺伝子（Holland, M.J.ら、J. Biol. Chem.（1981）256：1385）またはYEp13から得られるLeu2遺伝子（Broach, J.ら、Gene（1978）8：121）が含まれる。誘導型プロモーターにおけるショウジョウバエ発現系（インビトロジェン（Invitrogen）、サンディエゴ、カリフォルニア州）も同様に用いることができる。
適した哺乳類プロモーターには、SV40からの初期および後期プロモーター（Fiersら、Nature（1978）273：113）またはポリオーマ、アデノウイルスII、ウシ乳頭腫ウイルス、もしくはトリ肉腫ウイルスに由来するプロモーターのような他のウイルスプロモーターが含まれる。適したウイルスおよび哺乳類エンハンサーは先に引用されている。
発現系は、当技術分野で十分に理解される標準的なライゲーションおよび制限技術を用いる標準的な方法を用いてMHC配列に機能的に結合した前述の制御要素から構築される。単離されたプラスミド、DNA配列、または合成されたオリゴヌクレオチドを、望ましい形で切断、適合、および再ライゲーションする。
部位特異的DNA切断は、当技術分野で一般的に理解される条件で、適した制限酵素（または酵素）によって処置することによって行われ、その詳細はこれらの市販の制限酵素の製造元によって明記されている。一般的に、プラスミドまたはDNA配列約1 μgを緩衝溶液約20 μl中で酵素1単位によって切断する。DNA基質の完全な消化を保証するために過剰量の制限酵素を用いてもよい。各インキュベーション後、タンパク質をフェノール／クロロホルムによる抽出によって除去して、その後にエーテル抽出を行ってもよく、エタノール沈殿後にセファデックスG-50スピンカラムに適用することによって水性分画から核酸を回収する。望ましければ、切断された断片のサイズ分離を行ってもよい。
制限切断断片は、四つのデオキシヌクレオチド三燐酸（dNTP）の存在下で大腸菌DNAポリメラーゼIの大きな（クレノウ）断片と処理することによって平滑末端にしてもよい。クレノウによって処理した後、混合物をフェノール／クロロホルムによって抽出して、エタノール沈殿した後、セファデックスG-50スピンカラムに適用する。
合成オリゴヌクレオチドは、市販の自動オリゴヌクレオチド合成機を用いて調製する。しかし、本発明のタンパク質では、合成遺伝子が都合よく用いられる。遺伝子の設計には、コード配列部分をこれらのコード類似体に置換するための遺伝子の容易な操作を可能にする制限部位が含まれうる。
プラスミド構築のためのライゲーションが正確であるか否かは、まず大腸菌遺伝子保存センターCGSC#6135から得られる大腸菌株MM294、または他の適した宿主をライゲーション混合物によって形質転換することによって確認することができる。成功した形質転換体を、アンピシリン、テトラサイクリンもしくは他の抗生物質耐性によって、または当技術分野で理解されるようにプラスミド構築の様式に応じた他のマーカーを用いることによって選択することができる。任意で、クロラムフェニコール増幅後に形質転換体からのプラスミドを調製する。単離されたDNAを制限酵素切断によって分析して、および／またはMessingら、Nucleic Acids Res.（1981）9：309によってさらに記述されるSanger, F.ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA（1977）74：5463のジデオキシ法によって、またはMaxamら、Methods in Enzymology（1980）65：499の方法によってシークエンシングする。
次に、構築されたベクターをタンパク質産生のための適した宿主に形質転換する。用いる宿主細胞に応じて、そのような細胞に適当な標準的な技術を用いて形質転換を行う。Cohen, S.N.、Proc. Natl. Acad. Sci. USA（1972）69：2110によって記述される塩化カルシウムを用いるカルシウム処置、Maniatisら、「Molecular Cloning：A Laboratory Manual」（1982）Cold Spring Harbor Laboratory Press、254頁に記述されるRbCl法は、実質的な細胞壁障壁を含む原核細胞または他の細胞のために用いられる。そのような細胞壁を有しない哺乳類細胞の場合、Graham and van der Eb、Virology（1978）52：546の燐酸カルシウム沈殿法または電気穿孔が好ましい。酵母への形質転換は、Van Solingen, P.ら、J. Bacter.（1977）130：946およびHsiao, C.L.ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA（1979）76：3829の方法に従って行われる。
次に形質転換された細胞をMHC配列の発現に都合のよい条件で培養して、組換えによって産生されたタンパク質を培養物から回収する。
MHC結合ペプチド
抗原提示細胞（APCs）の表面上のMHC糖タンパク質による抗原の提示は、抗原性タンパク質のより小さいペプチド単位へのタンパク質分解後に起こると考えられる。抗原性タンパク質内のこれらのより小さいセグメントの位置は、経験的に決定することができる。クラスI MHC結合ペプチドは、長さが約8〜約10残基、おそらく約8〜約11残基、または約8〜約12残基であると考えられる。クラスII MHC結合ペプチドは、アミノ酸の長さが約10個〜約30個、例えば約12個〜約24個であると考えられる。これらのペプチドは、アグレトープ（MHC分子によって認識される）およびエピトープ（T細胞上のT細胞受容体によって認識される）の双方を含む。エピトープは、抗原特異的T細胞受容体によって認識されるアミノ酸約5個〜6個の連続または非連続配列である。アグレトープは、ペプチドとMHCクラスI糖タンパク質との結合に関与する隣接または非隣接配列である。本発明は、そのような断片がMHC単量体または改変MHC単量体との三元複合体に組み入れられうるか否かを決定するために推定のMHC結合ペプチドを評価するためのシステム、キット、およびアッセイを提供する。
抗原提示細胞（APCs）の表面上のMHC糖タンパク質による抗原の提示は、抗原性タンパク質のより小さいペプチド単位へのタンパク質分解後に起こると考えられる。抗原性タンパク質内のこれらのより小さいセグメントの位置は、経験的に決定することができる。クラスI MHC結合ペプチドは、長さが約8〜約10残基、おそらく約8〜約11残基、または約8〜約12残基であると考えられる。クラスII MHC結合ペプチドは、アミノ酸の長さが約10個〜約30個、例えば約12個〜約24個であると考えられる。これらのペプチドは、アグレトープ（MHC分子によって認識される）およびエピトープ（T細胞上のT細胞受容体によって認識される）の双方を含む。エピトープは、抗原特異的T細胞受容体によって認識されるアミノ酸約5個〜6個の連続または非連続配列である。アグレトープは、ペプチドとMHCクラスI糖タンパク質との結合に関与する隣接または非隣接配列である。本発明は、そのような断片がMHC単量体または改変MHC単量体との三元複合体に組み入れられうるか否かを決定するために推定のMHC結合ペプチドを評価するためのシステム、キット、およびアッセイを提供する。
このように、本発明は、診断アッセイ、ワクチン、およびその他の治療様相において用いるための候補ペプチドのスクリーニングにおいて用いられるシステム、キット、およびスクリーニング法を提供する。本発明の方法において用いられる推定のMHC結合タンパク質は、当技術分野で既知の任意の方法を用いて生成することができ、最も簡便なものは、アミノ酸の長さが8個〜12個の断片に関するペプチド合成である。
したがって、一つの態様において、本発明は、単量体が変性条件で変性して、再構成条件で適したMHC結合ペプチドを含む機能的結合ポケットを形成するように再構成される、一つまたはそれ以上のMHC単量体または改変MHC単量体をそれに結合させた固体表面を含むシステムを提供する。例えば、複数の単量体を単一の表面に結合させることができる。システムの表面は、任意の固体、ポリマー、膜、合成表面等が含まれるがこれらに限定されない任意の既知のまたは後に発見された固体表面となりうる。例えば、本発明のシステムの固体表面は、マイクロタイタープレートのウェルのようなマイクロタイタープレート、およびアガロースAビーズのようなビーズ等となりうる。一つの局面において、本発明のシステムの固体表面は、ハイスループットスキャンシステムにおいて用いるために適しており、例えば表面は、ハイスループットシステムと適合性であるか、または蛍光測定フローサイトメトリーのように、ハイスループットで表面に関連する実体をシステムに処理させる。
最近、ストレプタクチン(StrepTactin)と呼ばれる変異ストレプトアビジン分子のビオチン結合部位に対して結合親和性（Kd〜1×10-6 M）を示す短いペプチド配列（Strep TagII（商標））が同定されている。ストレプタクチンに対してより高い親和性で結合する（Kd〜1×10-13 M）分子であるd-ビオチンは、結合部位に対してStrepTagIIと有効に競合する(Knabel, M., Franz, T. J., Schiemann, M., Wulf, A., Villmow, B., Schmidt, B., Bernhard, H., Wagner, H., Busch, D. H. (2002) 「Reversible MHC multimer staining for functional isolation of T-cell populations and effective adoptive transfer. 」Nature Medicine Vol. 8 No. 6, June 2002. pp: 631-637)。MHC単量体の固体表面への結合は、当技術分野で既知の任意の方法によって得ることができる。例えば、固体表面をアビジンのような第一の結合リガンドによってコーティングして、次に単量体をビオチンのような第二の結合リガンドと共に提供する。ここで、上記第一のリガンドは第二のリガンドに特異的に結合する。第二の結合リガンドは任意で、C末端によって単量体に結合してもよい。固体表面に対する一つまたはそれ以上の単量体の結合は、任意で可逆的または切断可能である。例えば、第Xa因子、プレシジョンプロテアーゼ（PreScission Protease）およびトロンビンのような切断可能な結合複合体が、アマシャムバイオサイエンスバイオサイエンス（Amersham Bioscience Bioscience、オルセー、フランス）から市販されている。これらのプロテアーゼは全て、pGEX-Tベクターを用いて発現されるタンパク質からGSTアフィニティタグと共に用いることができる。
本発明のシステムは、結合したMHCクラスIまたはクラスII単量体を有する固体支持体を含む。MHCクラスI単量体が結合した固体支持体は、好ましくは本明細書において記述されるように、結合ポケットにおいてMHC結合ペプチドを含むMHCクラスI単量体とのMHC複合体の形成を引き起こすことによって、再生状態で保存される。MHCクラスI単量体に関して、MHC複合体は、それに結合したβ2-ミクログロブリンをさらに含む三元複合体である。
固体支持体に結合したMHCクラスI単量体または改変MHCクラスI単量体を含むMHC複合体の形成は、本明細書において「再生」と呼ばれ、当技術分野で既知であり、本明細書において記述されるように再生条件で行われる。例えば、再生条件には典型的に、単量体に関して適したMHC結合ペプチドが存在すること、およびクラスI MHC単量体に関してはpH約7〜約8.5を有する適した再生緩衝液が存在することが含まれる。クラスI MHC単量体の場合、適した再生条件にはまた、β2-ミクログロブリンの存在が含まれる。適した再生緩衝液を本明細書の実施例に示し、これは当技術分野で既知である。保存のためのさらなる調製において、MHC単量体が結合した固体支持体を、例えば糖を含む緩衝液への曝露によって乾燥させることができる（クラスI単量体に関しては再生状態でありながら）。推定のMHC結合ペプチドを調べるために本発明のシステムの固体支持体を用いるための調製において、固体支持体および複合体における結合MHCクラスI単量体を、単量体の解離および変性を引き起こすために変性条件に曝露する。例えば、変性条件は、固体支持体および結合単量体を、単量体に損傷を与えることなく単量体の複合体の解離を引き起こすために十分な時間、pH約2〜約4に曝露することを含みうる。
MHCクラスI単量体とは異なり、クラスII単量体に関するペプチドローディングは、pH約5〜約8の範囲で起こり、ローディングされるペプチドの存在下で単量体を変性および再生させる必要なく溶液から行うことができる。
任意で、本発明のシステムは、下記により詳細に記述するように、MHC複合体に存在するが、そのようなMHC複合体の解離成分には存在しない立体配座エピトープに対して特異的に結合するモノクローナル抗体をさらに含んでもよい。例えば、立体配座エピトープは、システムにおいて用いられる再構成MHC単量体または改変MHC単量体において形成されるが、変性単量体には存在しなくてもよい。または、モノクローナル抗体は、MHC結合ペプチドに結合した単量体とそうでない単量体とを区別してもよい。本発明のシステムは、β2-ミクログロブリンの供給をさらに含んでもよい。
本発明のシステムおよび方法において用いられるMHC単量体は、任意のMHC単量体または改変MHC単量体、例えば本明細書に記述のMHC結合ペプチドに結合することができるクラスI重鎖となりうる。MHC単量体は、ヒトおよびマウス種、ならびにそのキメラを含むがこれらに限定されない、任意の種、サブタイプ、またはその組み合わせからの任意の部分的または完全長の改変または非改変MHC遺伝子配列によってコードされうる。好ましいMHCコード遺伝子配列は、任意のHLA対立遺伝子遺伝子型およびその任意の変種または多形をコードする配列である。例えば、本発明のシステムおよび方法において利用されるMHC単量体は、変性条件でHLA結合ペプチド、すなわちHLA-A、HLA-B、HLA-C、またはHLA-Dの任意のサブタイプまたは対立遺伝子に結合する任意の部分的または完全長のHLA単量体となりうる。
例えば、一つの態様において、MHC単量体は、切断によってHLAクラスI重鎖のα1、α2、およびα3ドメイン、およびHLAクラスII単量体のα1、α2、およびβ1、β2ドメインのみを含むように改変され、これは互いに結合してMHC IIヘテロ二量体を形成する。さらにもう一つの態様において、MHC単量体は、これらのMHCドメインおよびアンカードメインを含む融合タンパク質のようなキメラとなりえて、MHCドメインは本明細書に記述するようにMHC結合ペプチドに結合するが、アンカードメインはMHC単量体を表面に固定するために適している。アンカードメインは、HLAドメインと融合して融合タンパク質を形成するポリペプチドとなり得て、または当技術分野で既知の任意の適した手段によってHLAドメインに共役させた任意の実体、例えばビオチン化MHC単量体となりうる。
MHC単量体は、当技術分野で任意の適した手段によって固体表面に結合させることができる。例えば、MHC単量体は、接着または結合実体を通して直接または間接的に表面に固定することができる。一つの態様において、本発明のシステムの固体表面は、MHC単量体に結合したまたは単量体内の第二のリガンドと、例えば共有または非共有結合によって結合するまたは相互作用する第一のリガンド実体によってコーティングされる。もう一つの態様において、表面は、アビジンまたはその誘導体、例えばストレプトアビジンによってコーティングされ、MHC単量体はビオチンまたはその誘導体をそのアンカードメインとして含む。本発明の一つの態様において、MHC単量体の固体表面に対する結合は可逆的または切断可能である。
固体表面にコーティングまたは固定したMHC単量体は、変性させる、例えば変性条件で剥がすまたは解離させることができ、その後再生、例えば適当なMHC結合ペプチドに結合するように非変性または再生条件で変性型から再生させることができる。一つの態様において、本発明によって提供されるMHC単量体をコーティングした表面を乾燥させて、後に使用するために保存することができる。好ましくは、保存は約4℃で行う。
MHC単量体をコーティングした表面の他に、本発明のシステムにはさらに、モノクローナル抗体およびペプチドが含まれうる。ペプチドは、HLA単量体に結合する任意のペプチド、例えばMHC結合ペプチドとなりうる。一つの態様において、ペプチドは、MHC単量体に対して高い親和性を有し、例えばHBc高親和性ペプチドである。
本発明のシステムおよび方法において用いられるモノクローナル抗体は、MHC単量体の複合体のみに存在してMHC複合体の解離成分には存在しないエピトープに特異的に結合する任意のモノクローナル抗体となりうる。例えば、クラスI MHC単量体複合体に関して、モノクローナル抗体は、三元複合体に組み入れられた場合に限ってβ2-ミクログロブリンに存在する立体配座エピトープに結合することができる。または、モノクローナル抗体は、特定の本発明のシステムまたは方法において用いられるMHC単量体または改変MHC単量体に存在する立体配座エピトープを認識することができる。モノクローナル抗体は、MHC単量体に対して種がマッチしてもよく、例えば、固体支持体にHLAクラスI単量体が結合している場合、モノクローナル抗体は、マウス、ヒト、またはヒト化抗MHCクラスIモノクローナル抗体である。しかし、改変MHC単量体が一つより多い種からのドメインを含むキメラである場合、抗MHCモノクローナル抗体はドメインの一つのみに存在するエピトープ（例えば、立体配座エピトープ）に結合するように選択することができる。例えば、図9に示すように、HLA-A2重鎖のα-1およびα2ドメインと、H-2 Kbのマウスα-3ドメインとを含むキメラである改変MHC単量体を含む三元複合体は、マウスα-3ドメインにおける立体配座ドメインに結合するマウスモノクローナル抗体によって検出することができる。
MHC単量体がHLA単量体である場合、モノクローナル抗体は、三元複合体における任意のサブクラスのHLA単量体、すなわちHLA-A、HLA-B、またはHLA-Cを認識する任意の抗MHCクラスIモノクローナル抗体となりうる。本発明のシステムおよび方法において用いるための好ましい抗MHCクラスIモノクローナル抗体は、特許手続の目的およびその規則に関する微生物の寄託に関する国際認識に関するブダペスト条約（ブダペスト条約）の条項に基づいて、登録番号CNCM I-2941として、Collection Nationale de Cultures de Microorganismes（CNCM）、Institut Pasteur, 25, Rue du Docteur Roux, F75724 Paris Cedex 15 Franceにおいて寄託されているハイブリドーマB9.12.1によって産生されたマウスIgG2a立体配座依存的抗HLAモノクローナル抗体である。これは、寄託日から30年間、培養物を生存して維持することを保証する。生物は、ブダペスト条約の合意によってCNCMから公的に入手でき、そして関連する米国特許の発布、または任意の米国特許もしくは外国の特許出願の公開のいずれか早いほうに基づいて、培養物の子孫の永久的で制限されない公的な利用を保証し、35U.S.C.第122項および特許庁長官の規則（特に886 OG 638を参照して37CFR第1.14項を含む）の遵守に従って、米国特許商標庁長官によって、権利を有すると決定された人に対する子孫の利用を保証する。
一つの態様において、本発明のシステムおよび方法において用いられるモノクローナル抗体は、検出可能な標識と共に、すなわち当技術分野で既知の検出可能なシグナルを産生する標識と共に提供される。標識は、当技術分野で既知の多様な任意の技法を用いて抗体に結合させてもよい。または、抗体は、放射活性アミノ酸のような標識を含めるように産生することができる。本発明のシステム、キットおよび方法において用いるために適した標識には、放射性同位元素、蛍光色素、酵素、ビオチンおよび電子密度の高い分子が含まれるがこれらに限定されない。モノクローナル抗体が結合すれば、単量体に対するMHC結合ペプチドの結合によって三元複合体が形成されたことを示し、未結合抗体およびシステムの他の成分を洗浄した後、シグナルの実質によって産生されるシグナルを検出することによって容易に検出および／または定量することができる。現在好ましい検出可能な標識は蛍光標識、例えばFITCである。固体支持体上の蛍光標識抗体の結合は、蛍光光度計または蛍光決定フローサイトメトリーによって容易に決定することができる。
適したMHC結合ペプチドに対する単量体の結合を決定するためにモノクローナル抗体を用いる代わりとして、当業者は、ゲル分離または電気泳動のような重量または電子的特性に基づいて複合体を分離する任意の方法を用いて、クラスIまたはクラスII単量体がMHC結合ペプチドに結合するか否かを決定することができることを理解するであろう。
本発明のシステムは、もう一つのシステムの一部としてまたはキットのいずれかとして提供することができる。MHC単量体または改変単量体をコーティングした、例えば乾燥型のマイクロタイタープレートをキットにおいて提供することができ、これには任意でさらに、異なるバイアルまたは容器において、本明細書に記述される抗MHCモノクローナル抗体または抗β2-ミクログロブリン抗体、および固体支持体に結合させた単量体に特異的に結合する対照ペプチドが含まれうる。一つの態様において、キットには、イムノアッセイを行うシステムを使用するための手順、例えば本発明によって提供される方法を説明する説明書が含まれる。キットにはまた任意で、以下の任意のものまたは全てのものが含まれうる：変性または再生緩衝液、MHC単量体の対照、ペプチド、またはモノクローナル抗体。
もう一つの態様において、本発明は、MHC単量体または改変MHC単量体と、単量体との結合に関して試験すべき推定のMHC結合ペプチドの結合を決定するための方法を提供する。推定のMHC結合ペプチドの結合をアッセイするこの方法において、複数のMHC単量体または改変MHC単量体が結合した固体表面を、推定のMHC結合ペプチドの存在下および非存在下でインキュベートする。好ましくは固体表面は、本発明のシステムまたはキットに属する表面であり、本明細書に記述されるように調製する。アッセイ手順の開始時に固体支持体に結合させたMHC単量体が再構成型である場合、MHC単量体は、本明細書に記述の変性条件に曝露することによって、例えばpH約2〜約4の範囲に曝露することによって、または約37℃より高い温度に一晩曝露することによって、アッセイ用に調製される。変性後、未結合MHC結合ペプチドを洗浄して除去する。
アッセイに関して、変性MHC単量体または改変MHC単量体を結合させた固体支持体を、複合体を形成させるために適した期間、再構成条件で推定のMHC結合ペプチドと共にインキュベートする。再構成条件にはまた、約-18℃〜約37℃、例えば約4℃〜約8℃の範囲の温度が含まれてもよい。MHCクラスI単量体の場合、再構成条件には、MHC単量体を飽和するためにβ2-ミクログロブリン（または三元複合体形成の結合を増加させるまたは安定化させるように改変されたβ2-ミクログロブリン）の十分量が存在することが含まれるであろう。例えば、β2-ミクログロブリンは、三元複合体形成を安定化させるために、ロイシンジッパー等のような安定化分子をそれに結合させることによって改変してもよいと企図される。推定のMHC結合ペプチドまたはβ2-ミクログロブリンとのインキュベーションは典型的に、複合体を形成させるために約12時間または一晩〜約48時間を必要とするであろう。
再構成インキュベーション後、MHC単量体に対する推定のMHC結合ペプチドの結合は、MHC複合体のみに存在する立体配座エピトープ、例えばクラスI三元複合体の再生されたMHC単量体には存在するが、変性MHC単量体には存在しない立体配座エピトープに結合するモノクローナル抗体に、固体支持体上のMHC単量体を接触させることによって決定される。固体支持体に結合させたMHC複合体と抗体との結合は、推定のMHC結合ペプチドが、アッセイにおいて用いられるMHC単量体または改変されたMHC単量体に対して特異的なMHC結合ペプチドであることを示している。推定のMHC結合ペプチドの結合と、標準的なMHC結合ペプチドの結合とを比較する目的で、単量体を用いて同時平行アッセイ（例えば、同じ再構成条件、同じ単量体、および同じモノクローナル抗体の存在下で）行ってもよい。標準的なMHC結合ペプチドを含む三元複合体に対する同時平行アッセイにおけるモノクローナル抗体の結合を、当技術分野で既知のコンピューター法を用いて推定のMHC結合ペプチドの結合効率を決定するために役立つように、試験アッセイにおける対応する複合体に対するモノクローナル抗体の結合と比較することができる。
なおもう一つの態様において、本発明は、推定のMHC結合ペプチドに関してMHC単量体または改変MHC単量体の結合親和性の程度を決定する方法を提供する。この態様において、固体表面に結合した少なくとも一つの変性MHC単量体または改変MHC単量体を、推定のMHC結合ペプチド、およびMHC複合体の如何なる解離成分にも存在しない、対応する再構成MHC単量体を含む複合体の形成によって作製された立体配座エピトープに対して特異的に結合するモノクローナル抗体と共にインキュベートする。そのように形成されたMHC複合体に対するモノクローナル抗体の結合を、同じMHC単量体または改変MHC単量体および既知のMHC結合ペプチドを含む対応する複合体に対するモノクローナル抗体の結合と比較する。結合の差は、推定のMHC結合ペプチドに関する再構成MHC単量体または改変MHC単量体の結合親和性の相対的な程度を示している。MHCクラスI単量体の再構成に関して、アッセイにおいて単量体の全量が複合体を形成するために適した量のβ2-ミクログロブリンが存在しなければならない。ペプチドの結合親和性を決定するために、それぞれの同時平行試験において異なるペプチド濃度を用いて試験を複数回行う。本発明の方法の実践において、MHC単量体は、マウスおよびヒト、または種もしくはサブタイプの組み合わせからの単量体サブユニットを含むキメラが含まれるがこれらに限定されない、それに対して適当なクラスI結合ペプチドの決定が望まれる任意の種に属してもよい。
様々な容易に入手できる手段を用いて、再構成されたMHC単量体を含むMHC複合体に対するモノクローナル抗体の特異的結合を決定することができる。例えば、結合は、検出可能な標識、すなわち検出可能なシグナルを産生する標識によってモノクローナル抗体を直接標識して、シグナルを検出することによって、または検出可能に標識され、アッセイにおいて用いられるMHC単量体を含むMHC複合体に結合するモノクローナル抗体を認識する二次抗体によって、検出することができる。この目的のために用いることができる適した検出可能な標識は当技術分野で周知であり、この中には、放射性同位元素、蛍光色素、酵素、ビオチン、電子密度の高い分子等からなる群より選択される標識が含まれる。蛍光色素または蛍光標識は、蛍光光度計に固体支持体を供することによって結合を容易に検出できることから、現在、それらが好ましい。例えば、固体支持体が96ウェルマイクロタイタープレートのようなプレート、またはアガロースAもしくはアガロースGビーズのようなビーズである場合、アッセイは、当技術分野で既知の任意の方法を用いてハイスループット蛍光スキャニングを利用することができる。
以下の実施例は、本発明を如何なる方法、形状、または形態においても、説明するためのものあって、明示または暗示的にも制限しないと意図される。それらは、用いてもよい方法の典型であるが、当業者に既知である他の技法、方法論、または技術をまたは用いてもよい。
実施例1
正確に折り畳まれたHLA重鎖単量体の検出
本実験は、固体支持体に結合させたMHC単量体が、三元複合体を形成するように再構成できること、および立体配座依存的抗MHCモノクローナル抗体によって認識され、特異的に結合されうることを証明する。言い換えれば、固体支持体に結合したMHC単量体は正確に折り畳まれて、MHC結合ペプチドに結合するであろう。下記の表1は、ペプチド結合の際に正確に折り畳まれたHLA単量体を検出する主要な段階を要約している（図1も参照のこと）。
正確に折り畳まれたHLA重鎖単量体の検出
本実験は、固体支持体に結合させたMHC単量体が、三元複合体を形成するように再構成できること、および立体配座依存的抗MHCモノクローナル抗体によって認識され、特異的に結合されうることを証明する。言い換えれば、固体支持体に結合したMHC単量体は正確に折り畳まれて、MHC結合ペプチドに結合するであろう。下記の表1は、ペプチド結合の際に正確に折り畳まれたHLA単量体を検出する主要な段階を要約している（図1も参照のこと）。
実施例2
抗HLA-FITC抗体の較正
本実施例において、BSA-ビオチン-アビジンコーティング96ウェルマイクロタイタープレートを蛍光測定アッセイに用いるために調製した。結合ペプチドMart-1 26-35Lとの三元複合体におけるHLA-A2m単量体を、様々な濃度の抗HLA-ABC-FITCまたは濃度0、0.25、0.5、1、2、および4 μg/mlの抗HLA-FITCモノクローナル抗体と共にインキュベートした。特に、それぞれの抗体濃度に関して、HLA単量体を濃度0、0.0078、0.0156、0.3125、0.0625、0.125、0.25、および0.5 μg/mlで加えた。
抗HLA-FITC抗体の較正
本実施例において、BSA-ビオチン-アビジンコーティング96ウェルマイクロタイタープレートを蛍光測定アッセイに用いるために調製した。結合ペプチドMart-1 26-35Lとの三元複合体におけるHLA-A2m単量体を、様々な濃度の抗HLA-ABC-FITCまたは濃度0、0.25、0.5、1、2、および4 μg/mlの抗HLA-FITCモノクローナル抗体と共にインキュベートした。特に、それぞれの抗体濃度に関して、HLA単量体を濃度0、0.0078、0.0156、0.3125、0.0625、0.125、0.25、および0.5 μg/mlで加えた。
本実験において、HLA重鎖および抗HLA-FITC抗体を、振とうさせながら室温で40分間共にインキュベートした。未結合抗体を除去するためにプレートを洗浄する前に総蛍光を読み取った。次に、プレートを3回洗浄して未結合抗体を除去して、結合した単量体の蛍光を読み取った。
図2に示すように、抗体濃度が0.25 μg/mlおよび0.5 μg/mlに達すると、飽和が起こった。しかし、抗体を1 μg/ml、2 μg/mlおよび4 μg/mlで加えると蛍光シグナルは増加した。この知見は、抗体を0.5 μg/mlおよび0.25 μg/mlで加えた場合、抗体が二つのMHC単量体に結合することを示している。対照的に、1 μg/ml、2 μg/ml、または4 μg/mlでインキュベートすると、抗体は一つのみのHLA単量体に結合する。このことは、シグナルの増加、例えば1 μg/ml抗体および0.5 μg/ml HLA重鎖では600 FUであるのに対し、0.5 μg/mlの抗体および0.5 μg/mlのHLA重鎖では300蛍光単位（FU）であることを説明する。もう一つの知見は、抗体濃度2 μg/mlおよび4 μg/mlでは、シグナルは一定であることであった。したがって、2 μg/ml 抗HLA-FITC mAbは、アッセイに用いるための適当な飽和濃度であると決定された。
実施例3
抗HLA-FITCモノクローナル抗体の特異性
A．立体配座特異性
抗HLA-クラスI-FITC抗体から産生されたシグナルが、強調されたHLA単量体の解離の程度の関数として異なるか否かを決定するために実験を計画した。実験のために用いられる特定のHLA単量体は、三元複合体において結合ペプチドMart1 27-35を含むHLA重鎖単量体HLA-A*0201であった。
抗HLA-FITCモノクローナル抗体の特異性
A．立体配座特異性
抗HLA-クラスI-FITC抗体から産生されたシグナルが、強調されたHLA単量体の解離の程度の関数として異なるか否かを決定するために実験を計画した。実験のために用いられる特定のHLA単量体は、三元複合体において結合ペプチドMart1 27-35を含むHLA重鎖単量体HLA-A*0201であった。
濃度10 μg/mlの三元複合体を含む異なる溶液を調製して、温度37℃、30℃、25℃、または4〜8℃で一晩インキュベートした。実施例2において先に記述した抗体結合実験を、固体支持体に結合させた三元複合体において残っているHLA単量体を検出可能に標識するために、2 μg/ml 抗HLA-FITC結合体を用いて行った。濃度640 μg/mlのHLA単量体およびMart1 27-35の三元複合体を含む溶液を、対照として-18℃でインキュベートした。濃度640 μg/mlのHLA単量体とMart1 27-35の三元複合体を含む、-18℃で保存した試料からの溶液を、他の試料と同じ濃度に希釈して対照として含めた。
図3に示すように、最高温度で固体支持体に結合させた三元複合体のインキュベーションは、最も弱い蛍光シグナルを生成したことが判明し、このことは、温度が増加するとHLA重鎖単量体の三元複合体が徐々に解離したことを示している。一つの点において、抗HLA-FITC結合体は、三元複合体の解離の程度および蛍光シグナルがそれに従って減少することから、HLA単量体をもはや認識することができず、このことは、抗HLA-FITC結合体が正確に折り畳まれた再構成HLA単量体を特異的に認識するが、変性単量体は認識しないことを示している。
B．重鎖単量体の特異性
表2に示すように、ヒト対立遺伝子A2、A3、A11、B7、B8に関する異なるHLA重鎖単量体と共に一つのマウス対立遺伝子Kdを抗HLA-クラスI-FITC抗体と共にインキュベートした。
表2に示すように、ヒト対立遺伝子A2、A3、A11、B7、B8に関する異なるHLA重鎖単量体と共に一つのマウス対立遺伝子Kdを抗HLA-クラスI-FITC抗体と共にインキュベートした。
抗体結合実験は上記のように行った。用いた抗HLA-クラスI-FITC抗体の濃度は2 μg/mlであった。
図4に示すように、再構成された全てのHLA-Aおよび-B単量体は、抗HLA-クラスIモノクローナル抗体によって検出可能であった。予想されるように、マウス対立遺伝子（H-2Kd/Flu）を含む三元複合体をプレートに結合させてもシグナルは検出されず、ヒトHLAに対する抗体の特異性を確認した。異なる対立遺伝子間のシグナルの変動はおそらく、HLA単量体の濃度の精度および保存条件、例えば凍結融解等による可能性があった。
プレートへのMHC重鎖単量体のコーティング、プレートの保存、および再構成
濃度5 μg/mlのMart1 27-35ペプチドとの三元複合体におけるビオチン結合MHC単量体を、アビジンコーティングプレートに結合させた。プレートを糖含有緩衝液によって4℃〜8℃で一晩飽和した後、プレートを30℃および湿度19％で一晩乾燥させた。プレートをこれらの条件で乾燥させた後、HLA単量体は、三元複合体から解離したことが判明した。したがって、結合アッセイにおいてプレートを用いるための調製の際に低いpHで単量体からMHC結合ペプチドを剥離させる必要がなかった。
濃度5 μg/mlのMart1 27-35ペプチドとの三元複合体におけるビオチン結合MHC単量体を、アビジンコーティングプレートに結合させた。プレートを糖含有緩衝液によって4℃〜8℃で一晩飽和した後、プレートを30℃および湿度19％で一晩乾燥させた。プレートをこれらの条件で乾燥させた後、HLA単量体は、三元複合体から解離したことが判明した。したがって、結合アッセイにおいてプレートを用いるための調製の際に低いpHで単量体からMHC結合ペプチドを剥離させる必要がなかった。
抗体結合アッセイの場合、10 nM〜100 μM HBc高親和性ペプチド（親和性は1.8×10-7 Mとして計算することができる）を、10 μg/ml β2-ミクログロブリンと共にインキュベートして、単量体コーティングプレートを以下に示す成分を含む異なる三つの緩衝液の一つと共にインキュベートした：
− 緩衝液1：トリス、アルギニン、EDTA、GSH、GSSGおよびBSA
− 緩衝液2：トリス、NaCl、EDTA、NaN3、BSAおよび0.05％TWEEN 20（登録商標）洗浄剤
− 緩衝液3：トリス、NaCl、EDTA、NaN3、BSAおよび0.05％NONIDET（登録商標）P40洗浄剤。
− 緩衝液1：トリス、アルギニン、EDTA、GSH、GSSGおよびBSA
− 緩衝液2：トリス、NaCl、EDTA、NaN3、BSAおよび0.05％TWEEN 20（登録商標）洗浄剤
− 緩衝液3：トリス、NaCl、EDTA、NaN3、BSAおよび0.05％NONIDET（登録商標）P40洗浄剤。
ペプチド結合および単量体の再構成は、二つの温度、すなわち4℃〜8℃と室温で起こることが判明した。
HLA単量体の再生を、2 μg/ml 抗HLA-クラスI-FITC結合体と共に24時間および48時間インキュベートした後に調べた。図5に示すように、FITCシグナルはペプチド濃度の関数として増加した。この結果は、HLA単量体が三元複合体に組み入れられることによって再生されること、およびMHC単量体の再生は、抗HLA-クラスI-FITC抗体によって有効に検出できることを示している。最もよい再生緩衝液は、TWEEN 20（登録商標）を含む緩衝液2であることが判明した。興味深いことに、緩衝液1では再生は測定されなかった。
本明細書において調べた条件において、抗体結合アッセイにとって最もよい温度は、4℃〜8℃であり、再生させるために最もよいインキュベーション期間は、24時間であった。
材料および方法
A．試薬
特に明記していなければ、精製化学薬品をメルク（Merck、ダームスタット、ドイツ）およびカルロエルバ（Carlo Erba、ロデノ、イタリア）から得た。ビオチン化BSAと共にアビジンは、イムノテック（Immunotech、マルセイユ、フランス）から得た。LUMITRAC-600白色96ウェルマイクロタイタープレートは、グライナー（Greiner、PN 655074 LUMITRAC 600（フリッケンハウゼン、ドイツ））から得た。SA-PEと共にHLA-A*0301/EBV HLA重鎖は、イムノミクス（Immunomics、サンディエゴ、カリフォルニア州）から得た。FITCを結合させた抗HLA-クラスI-モノクローナル抗体（クローン：B9.12.1）は、イムノテック抗体製造サービス（Antibody Manufacturing Services of Immunotech）から得た。パート番号：IM1838。この抗体は、マウスIgG2aモノクローナル抗体である。
A．試薬
特に明記していなければ、精製化学薬品をメルク（Merck、ダームスタット、ドイツ）およびカルロエルバ（Carlo Erba、ロデノ、イタリア）から得た。ビオチン化BSAと共にアビジンは、イムノテック（Immunotech、マルセイユ、フランス）から得た。LUMITRAC-600白色96ウェルマイクロタイタープレートは、グライナー（Greiner、PN 655074 LUMITRAC 600（フリッケンハウゼン、ドイツ））から得た。SA-PEと共にHLA-A*0301/EBV HLA重鎖は、イムノミクス（Immunomics、サンディエゴ、カリフォルニア州）から得た。FITCを結合させた抗HLA-クラスI-モノクローナル抗体（クローン：B9.12.1）は、イムノテック抗体製造サービス（Antibody Manufacturing Services of Immunotech）から得た。パート番号：IM1838。この抗体は、マウスIgG2aモノクローナル抗体である。
B．アビジンコーティング96ウェルマイクロタイタープレートの調製
白色96ウェルマイクロタイタープレートの各ウェルを5 μg/mlビオチン化BSAのPBS溶液200μlによってコーティングして、プレートを4℃で16時間インキュベートした。プレートを洗浄して、5 μg/mlアビジン溶液200μl/ウェルを加えた。次に、プレートを4℃でさらに16時間インキュベートした。その後、プレートを洗浄して、ブロッキング乾燥溶液を加えた。プレートを再度さらに16時間インキュベートした。その後、溶液を捨てて、プレートをペーパータオルの上でたたいて水分を除去した。次に、プレートを特殊な乾燥室に24時間入れた。その後、プレートを使用するまで個々に自動ロックバッグに入れた。
白色96ウェルマイクロタイタープレートの各ウェルを5 μg/mlビオチン化BSAのPBS溶液200μlによってコーティングして、プレートを4℃で16時間インキュベートした。プレートを洗浄して、5 μg/mlアビジン溶液200μl/ウェルを加えた。次に、プレートを4℃でさらに16時間インキュベートした。その後、プレートを洗浄して、ブロッキング乾燥溶液を加えた。プレートを再度さらに16時間インキュベートした。その後、溶液を捨てて、プレートをペーパータオルの上でたたいて水分を除去した。次に、プレートを特殊な乾燥室に24時間入れた。その後、プレートを使用するまで個々に自動ロックバッグに入れた。
C．単量体イムノアッセイ技法
アッセイ技法は以下の通りであった。HLA単量体を三元複合体において0.25 μg/mlで含み、トリス10 mM、NaCl 150 mM、EDTA 0.5 mM、NaN3 0.1％、BSA 0.2％において希釈した各試料200μl/ウェルを、アビジンコーティングプレートのウェルにローディングして、軌道を描くシェーカーにおいて室温の暗所で1時間インキュベートした。次に、ウェルを、0.05％TWEEN 80（登録商標）を含む9 g/l NaCl溶液300μlを用いて自動洗浄機（SLT、ザルツブルグ、オーストリア）によって3回すすいだ。次に、2 μg/ml FITC-結合抗HLA-クラスI抗体200 μl/ウェルを加えた。プレートを軌道を描くシェーカーにおいて室温の暗所で45分間インキュベートして、3回洗浄し、トリス10 mM、NaCl 150 mM、EDTA 0.5 mM、NaN3 0.1％、BSA 0.2％を200 μl/ウェル加えた。FITC蛍光は、これらのパラメータに従って、パーキンエルマーLS-50B蛍光光度計によって測定した：
励起＝405 nm
放射＝525 nm
放射フィルター＝515 nm
帯域（励起、放射）＝5.15 nm
0.5秒／ウェル
アッセイ技法は以下の通りであった。HLA単量体を三元複合体において0.25 μg/mlで含み、トリス10 mM、NaCl 150 mM、EDTA 0.5 mM、NaN3 0.1％、BSA 0.2％において希釈した各試料200μl/ウェルを、アビジンコーティングプレートのウェルにローディングして、軌道を描くシェーカーにおいて室温の暗所で1時間インキュベートした。次に、ウェルを、0.05％TWEEN 80（登録商標）を含む9 g/l NaCl溶液300μlを用いて自動洗浄機（SLT、ザルツブルグ、オーストリア）によって3回すすいだ。次に、2 μg/ml FITC-結合抗HLA-クラスI抗体200 μl/ウェルを加えた。プレートを軌道を描くシェーカーにおいて室温の暗所で45分間インキュベートして、3回洗浄し、トリス10 mM、NaCl 150 mM、EDTA 0.5 mM、NaN3 0.1％、BSA 0.2％を200 μl/ウェル加えた。FITC蛍光は、これらのパラメータに従って、パーキンエルマーLS-50B蛍光光度計によって測定した：
励起＝405 nm
放射＝525 nm
放射フィルター＝515 nm
帯域（励起、放射）＝5.15 nm
0.5秒／ウェル
アッセイ技法は以下の表3にさらに要約する。
抗HLA-クラスI-FITC抗体の較正
様々な濃度のHLA-A*0201/Mart1再構成単量体を、抗HLA-クラスI-FITC mAbの様々な濃度と共にインキュベートした。図6に示すように、全てのHLA重鎖単量体濃度に関して1〜2 μg/mlの抗HLA-クラスI mAb濃度で平衡に達した。
様々な濃度のHLA-A*0201/Mart1再構成単量体を、抗HLA-クラスI-FITC mAbの様々な濃度と共にインキュベートした。図6に示すように、全てのHLA重鎖単量体濃度に関して1〜2 μg/mlの抗HLA-クラスI mAb濃度で平衡に達した。
再構成された単量体の様々な濃度での用量反応曲線を抗HLA-ABC mAbを用いてプロットした。図7Aおよび図7Bに示すように、再構成されたHLA単量体の0.5 μg/mlを用いるまで、濃度を増加させてもシグナルは直線のままであった。0.5 μg/mlより高い再構成HLA単量体濃度は、平衡に非常に近いシグナルを提供した。図7Aおよび図7Bに要約したデータは、最善の結果を得るためには、アッセイ条件には、0.25 μg/ml再構成HLA単量体および2 μg/ml抗HLAクラスI FITC mAbが含まれなければならないことを証明している。これらのデータからまた、アッセイの感度が再構成HLA単量体の約4〜6 ng/mlであることも示された。
特異性
三元複合体におけるHLA単量体に関する抗HLA-クラスI-FITC抗体の特異性を異なるヒト対立遺伝子に対して調べた。以下のHLA単量体／ペプチド三元複合体のそれぞれに関して上記のように用量反応曲線を調製した。
− HLA-A*0201/Mart1 2635L
− HLA-A*0301/EBV
− HLA-B*0702/HIV
− HLA-B*0801/HIV
− HLA-A*1101/EBV
− H-2Db/HA1
三元複合体におけるHLA単量体に関する抗HLA-クラスI-FITC抗体の特異性を異なるヒト対立遺伝子に対して調べた。以下のHLA単量体／ペプチド三元複合体のそれぞれに関して上記のように用量反応曲線を調製した。
− HLA-A*0201/Mart1 2635L
− HLA-A*0301/EBV
− HLA-B*0702/HIV
− HLA-B*0801/HIV
− HLA-A*1101/EBV
− H-2Db/HA1
図8に示すように、全てのヒト対立遺伝子は、同じ抗HLA-クラスI-FITC抗体によって非常に良好に認識された。ヒト対立遺伝子をマウス対立遺伝子に置換した場合、シグナルは得られず、用いた抗体は、ヒトクラスI対立遺伝子に対して特異的であって、ヒト対立遺伝子を含むアッセイに限って用いるべきであることを示している。立体配座抗マウスH-2抗体は、マウスHLA単量体を含むアッセイにおいて用いるために適していることが判明した。
実施例4
ペプチド-MHC オフ率の測定
有効なCD8+ T細胞反応を得るためには、クラスI MHC分子は、長期間にわたって十分な量で多様な配列の多くのペプチドに結合しなければならない。多くの腫瘍細胞は、抗原性ペプチドがそれらを提示するクラスI MHC分子に対して十分に結合しないために、免疫応答を逃れるように思われる。ペプチドがMHC分子に対して効率よく結合しない場合、循環中のT細胞は、MHC三元複合体を認識せず、それらを提示する細胞は消失しないであろう。
ペプチド-MHC オフ率の測定
有効なCD8+ T細胞反応を得るためには、クラスI MHC分子は、長期間にわたって十分な量で多様な配列の多くのペプチドに結合しなければならない。多くの腫瘍細胞は、抗原性ペプチドがそれらを提示するクラスI MHC分子に対して十分に結合しないために、免疫応答を逃れるように思われる。ペプチドがMHC分子に対して効率よく結合しない場合、循環中のT細胞は、MHC三元複合体を認識せず、それらを提示する細胞は消失しないであろう。
免疫優性ペプチドの典型的な半減期は、37℃で20時間より長い（Stuberら、（1994）、Eur. J. Immunol. 24：765〜768、およびPogueら（1995）、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92：8166〜8170）。この証拠から、異なる温度での様々な複合体の安定性を決定するため、およびこのようにペプチドのオフ率を計算するために本発明の固相アッセイを用いるための試験が開発された。このパラメータは、免疫応答を誘発する目的のためにペプチドをワクチン接種に用いる時期を知るために非常に貴重である。
ペプチドのオフ率の測定：単量体HLA-A*0201/Mart-1 2635Lを、異なる四つの96ウェルアビジンコーティングプレートにローディングした。プレートを室温で振とうさせながら2時間インキュベートした。pH 3.2のクエン酸燐酸緩衝液によって洗浄および剥離した後、単量体を高親和性ペプチドHbVコア、Mart-1 2635L、中間の親和性ペプチドMart-1 26-35と共に、低親和性のペプチドMart-1 27-35によって再構成した。遊離のβ2ミクログロブリンと共に抗HLA-ABC-FITCモノクローナル抗体をペプチドと同時に加えた。プレートを振とうさせながら21℃で一晩インキュベートした。その後、プレートを洗浄して、蛍光レベルを測定した。BSAを含むこのトリス緩衝液を各ウェルに加えて、プレートを異なる温度で再度インキュベートした後、一つのプレートを4℃、一つを21℃、一つを32.5℃、および最後の一つを37℃でそれぞれインキュベートした。各プレートのいくつかの小片を異なる時間、4時間、24時間、および48時間目に洗浄して、異なる時間での蛍光を決定した。
B0は、ゼロ時間で測定した蛍光である。ゼロ時間は、単量体を再構成した後プレートを洗浄して、プレートを異なる温度に入れた瞬間に対応する。Bは各時間で得られた蛍光である。その後、時間の関数としてN1（蛍光の放射）をプロットした。直線回帰を計算して、半減期を曲線のT1/2＝0.69／勾配として計算した。または、データを一相指数関数的減衰およびゼロに等しいプラトーを適用する非直線回帰を用いてデータを等しく十分に適合させることができる。
これらのアッセイの結果を下記表4に示す：
HBVコアおよびMart-1 27-35のような高親和性ペプチドは、37℃および32.5℃で非常に良好な安定性を有することが認められた。対照的に、ペプチドMart-1 26-35およびペプチドMart-1 27-35は、37℃で非常に高いオフ率を示した。複合体を21℃でインキュベートした場合にも差が認められた。これらの結果は、MHC三元複合体からのペプチドのオフ率を決定するためにアッセイを用いることができることを示している（図10を参照されたい；図10A〜Dは、再生したペプチドに関する解離曲線のグラフを示す。図10E〜Hは、ペプチドのオフ率のグラフを示す。図10Iは、単量体の解離に及ぼす温度の影響を示す）。
本発明は、現在好ましい態様を参照して記述してきたが、様々な改変を行ってもよく、それらも本発明の趣旨に含まれると理解すべきである。したがって、本発明は、請求の範囲に限って制限される。
Claims (67)
- 表面に一つまたはそれ以上のMHC単量体または改変MHC単量体が結合し、該単量体が、溶液から適したMHC結合ペプチドを組み入れる、固体表面を含むシステム。
- 単量体がMHCクラスIであって、から単量体が再構成条件でMHC結合ペプチドを組み入れる、請求項1記載のシステム。
- 固体表面がビーズである、請求項1記載のシステム。
- 固体表面がマイクロタイタープレートに存在する、請求項1記載のシステム。
- 固体表面がハイスループットシステムでのスクリーニングに適している、請求項1記載のシステム。
- 固体表面に対する単量体の結合が可逆的である、請求項1記載のシステム。
- 固体表面に対する単量体の結合が切断可能である、請求項1記載のシステム。
- 固体表面が第一の結合リガンドによってコーティングされ、単量体のC末端に第二の結合リガンドが提供され、第一のリガンドが第二のリガンドに特異的に結合する、請求項1記載のシステム。
- 第一の結合リガンドが、アビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジン(neutravidin)、ストレプタクチン(StrepTactin)および単量体アビジンから選択され、第二の結合リガンドがビオチンである、請求項7記載のシステム。
- 第二の結合リガンドがC末端を通して単量体に結合している、請求項8記載のシステム。
- 単量体がMHCクラスI単量体であって、かつ単量体が変性条件で変性し、再生条件でMHC結合ペプチドを組み入れるように再構成される、請求項1記載のシステム。
- 変性条件がpH約2〜約4を含む、請求項11記載のシステム。
- 再構成単量体には存在するが変性単量体には存在しない立体配座エピトープに対して特異的に結合する抗MHC抗体をさらに含む、請求項1記載のシステム。
- 再構成条件がpH約7〜約8.5を含む、請求項1記載のシステム。
- β2-ミクログロブリンをさらに含む、請求項1記載のシステム。
- 単量体がHLAクラスIである、請求項14記載のシステム。
- 再構成された単量体には特異的に結合するが、変性単量体には結合しない、抗MHCクラスIモノクローナル抗体をさらに含む、請求項15記載のシステム。
- システムがβ2-ミクログロブリンおよび約8個〜約12個のアミノ酸の適したHLA結合ペプチドをさらに含み、再構成された単量体が再構成条件でβ2-ミクログロブリンおよび適したペプチドに結合する、請求項17記載のシステム。
- モノクローナル抗体がハイブリドーマB9.12.1によって産生される、請求項17記載のシステム。
- 単量体がHLAクラスIIである、請求項1記載のシステム。
- MHC結合ペプチドに結合した単量体と、MHC結合ペプチドを欠損する単量体とを区別するモノクローナル抗体をさらに含む、請求項20記載のシステム。
- 単量体がHLAクラスIIであって、システムが約10〜約30個のアミノ酸の適したHLA結合ペプチドを含み、再構成された単量体が再構成条件で適したペプチドに結合する、請求項21記載のシステム。
- 単量体によってコーティングされた固体表面が乾燥型である、請求項1、17、または22記載のシステム。
- 請求項1、17、または22記載のシステムを含むキット。
- 説明書をさらに含む、請求項23記載のキット。
- MHC単量体が再構成型で結合する対照ペプチドをさらに含む、請求項24記載のキット。
- 以下の段階を含む、MHCクラスI単量体または改変MHCクラスI単量体と、その推定のMHC結合ペプチドとの結合を決定する方法：
複数のMHC単量体または改変MHC単量体が結合した固体表面を推定のMHC結合ペプチドの存在下および非存在下で再構成条件でインキュベートする段階であって、該単量体が変性され、再構成条件で適したMHC結合ペプチドを含む複合体を形成するように再構成される段階、ならびに
MHC複合体に結合するが、MHC複合体の解離した成分には結合しないモノクローナル抗体に接触させた後のMHC単量体に対する結合を決定して、該抗体の結合により、単量体と推定のMHC結合ペプチドとが結合していることが示される段階。 - 変性条件がpH約2〜約4の範囲を含む、請求項27記載の方法。
- モノクローナル抗体の存在下で再構成条件で単量体に関する標準的なMHC結合ペプチドと共に単量体を別々にインキュベートすることをさらに含み、測定段階が、標準的なペプチドによって引き起こされた抗体の結合を、推定のMHC結合ペプチドによって引き起こされた抗体の結合と比較することをさらに含む、請求項27記載の方法。
- 単量体がHLAクラスIであって、モノクローナル抗体が抗MHC-クラスI抗体であって、かつ再構成条件が、単量体の再構成のために十分なβ2-ミクログロブリンが存在することを含む、請求項29記載の方法。
- 単量体がHLAサブクラスA、B、またはCである、請求項30記載の方法。
- 以下の段階を含む、MHCクラスII単量体または改変MHCクラスII単量体と、その推定のMHC結合ペプチドとの結合を決定する方法：
推定のMHC結合ペプチドの存在下および非存在下で複数のMHC単量体または改変MHC単量体が結合した固体表面を、適したペプチドローディング条件でインキュベートして、適したMHC結合ペプチドを含む複合体を形成する段階、ならびに
MHC単量体と推定のMHC結合ペプチドとの結合を決定する段階。 - 単量体がHLAクラスIIであって、決定段階が、MHC単量体と推定のMHC結合ペプチドとの結合を決定するモノクローナル抗体に複合体を接触させることを含む、請求項32記載の方法。
- 抗体が、MHC結合ペプチドに結合した単量体と、MHC結合ペプチドに結合していない単量体とを区別する、請求項32記載の方法。
- 適したペプチドローディング条件がpH約4〜約8の範囲を含む、請求項32記載の方法。
- 適した条件で、単量体と、単量体に関する標準的なMHC結合ペプチドとを別々にインキュベートする段階をさらに含み、決定段階が、標準的なペプチドの結合を、推定のMHC結合ペプチドによって引き起こされた結合と比較することを含む、請求項32記載の方法。
- 単量体がHLAサブクラスD、DR、DP、またはDQである、請求項32記載の方法。
- モノクローナル抗体が検出可能な標識と共に提供され、決定段階が、検出可能な標識を検出する段階を含む、請求項27または33に記載の方法。
- 検出可能な標識がペルオキシダーゼである、請求項38記載の方法。
- 検出可能な標識が、モノクローナル抗体に対して特異的に結合する二次抗体である、請求項38記載の方法。
- 検出可能な標識が蛍光である、請求項40記載の方法。
- 固体表面がマイクロタイタープレートのウェルまたはビーズであって、決定段階が、蛍光光度計によって蛍光を読み取ることを含む、請求項27または33に記載の方法。
- 検出段階が、ハイスループットスキャニングを用いて蛍光を検出することをさらに含む、請求項42記載の方法。
- 固体表面がアビジンによってコーティングされ、かつ単量体がビオチン化されて固体表面に結合している、請求項27または32に記載の方法。
- 固体表面に対する単量体の結合が可逆的である、請求項27または21に記載の方法。
- 固体表面に対する単量体の結合が切断可能である、請求項27または32に記載の方法。
- 以下の段階を含む、推定のMHC結合ペプチドに関するMHCクラスI単量体または改変MHCクラスI単量体の結合親和性の程度を決定する方法：
固体表面に結合した少なくとも一つの変性MHC単量体または改変MHC単量体を、推定のMHC結合ペプチド、および対応する再構成MHC単量体を含む第一の複合体における立体配座エピトープに特異的に結合するが、MHC複合体の解離成分には結合しないモノクローナル抗体と共にインキュベートする段階であって、インキュベーションが再構成条件で行われる段階；ならびに
推定のMHC結合ペプチドを含むMHC複合体に対するモノクローナル抗体の結合を、単量体と既知のMHC結合ペプチドとを含む対応する複合体に対するモノクローナル抗体の結合と比較する段階。 - 再構成条件が温度約4℃〜約37℃の範囲を含む、請求項47記載の方法。
- 再構成条件が温度約4℃〜約8℃の範囲を含む、請求項47記載の方法。
- 再構成条件がpH約7〜約8.5の範囲を含む、請求項47記載の方法。
- 再構成条件が適した再構成緩衝液が存在することを含む、請求項47記載の方法。
- 単量体が、再構成条件でβ2-ミクログロブリンにさらに結合し、かつモノクローナル抗体が抗MHCクラスIモノクローナル抗体である、請求項47記載の方法。
- 単量体が、HLA-A、HLA-B、およびHLA-Cから選択される、請求項51記載の方法。
- モノクローナル抗体がハイブリドーマB9.12.1によって産生される、請求項53記載の方法。
- 以下の段階を含む、推定のMHC結合ペプチドに関するMHCクラスII単量体または改変MHCクラスII単量体の結合親和性の程度を決定する方法：
固体表面に結合させた少なくとも一つの変性MHCクラスII単量体または改変MHCクラスII単量体を、推定のMHC結合ペプチド、および単量体を含む第一の複合体におけるエピトープに特異的に結合するが、MHC複合体の解離成分には結合しないモノクローナル抗体と共に、適した結合条件でインキュベートする段階；ならびに
推定のMHC結合ペプチドを含むMHC複合体に対するモノクローナル抗体の結合を、単量体と既知のMHC結合ペプチドとを含む対応する複合体に対するモノクローナル抗体の結合と比較して、結合の差によって、推定のMHC結合ペプチドに関する単量体の結合親和性の相対度が示される段階。 - 結合条件がpH約4〜約8の範囲を含む、請求項55記載の方法。
- インキュベート段階が約12時間〜約48時間の間である、請求項47または55に記載の方法。
- 抗体が検出可能な標識と共に提供され、かつ結合の比較が、抗体の結合に起因する検出可能な標識によって産生されるそれぞれのシグナルの差を検出することを含む、請求項47または55に記載の方法。
- 抗体が蛍光標識によって標識され、かつ結合の比較が、抗体の結合に起因するそれぞれの蛍光の差を検出することを含む、請求項58記載の方法。
- 蛍光標識がフルオレセインイソチオシアネート（FITC）である、請求項59記載の方法。
- 固体表面がマイクロタイタープレートのウェルまたはビーズであり、かつ検出段階が、蛍光光度計によって蛍光を読み取ることを含む、請求項47または55に記載の方法。
- 検出段階が、ハイスループットスキャニングを用いて蛍光を検出することをさらに含む、請求項61記載の方法。
- 単量体がHLA-D、DR、DP、またはDQサブクラスから選択される、請求項55記載の方法。
- 単量体がキメラである、請求項47または55に記載の方法。
- 推定のMHC結合ペプチドを含むMHC複合体と既知のペプチドとを、推定のMHC結合ペプチドの相対的解離速度を示すために十分な期間、解離-試験温度を含む条件でインキュベートした後に、結合の差を比較する、請求項47または55に記載の方法。
- 解離-試験温度が約4℃〜約37℃の範囲である、請求項65記載の方法。
- 期間が約2時間〜約48時間である、請求項65記載の方法。
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