JP2005535330A - 4−置換3−ヒドロキシ酪酸誘導体の生成のための酵素的プロセス - Google Patents
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Abstract
Description
本願は、米国特許法第119条第(e)項の元で、2002年8月9日に出願されたU.S.S.N.60/402,436(これは、その全体が本明細書中に参考として援用される)の利益を主張する。
本特許文献の開示の一部分は、著作権の対象である題材を含む。著作権者は、特許商標張の特許ファイルまたは記録に明らかであるように、特許文書または特許開示のいずれによっても、ファクシミリでの複写に対する拒絶を有さず、どのようなものでも全ての著作権を保有する。
本発明は、4−置換3−ヒドロキシ酪酸誘導体を調製するための、新規な酵素的方法および組成物に関する。
4−置換3−ヒドロキシ酪酸誘導体は、薬学的物質の合成において、市場で重要な中間体である。非ラセミ体のキラルな4−置換3−ヒドロキシ酪酸エステルは、HMG−CoAレダクターゼインヒビター(例えば、アトルバスタチン、フルバスタチン、ロスバスタチン、およびイタバスタチン)の合成において利用され得る。例えば、(R)−4−シアノ−3−ヒドロキシ酪酸のエステルは、コレステロール低下剤であるアトルバスタチンの生成のための重要な中間体である。特定の4−置換3−ヒドロキシ酪酸エステルを生成するための方法が、記載されている。Isbellら、Carbohydrate Res.,72:301(1979)は、スレオニンのカルシウム塩の一水和物と臭化水素とを反応させて、スレオニンのジブロモ誘導体を生成し、次いで、この誘導体をビシナルブロモヒドリンに転換することによる、(R)4−シアノ−3−ヒドロキシ酪酸エステルの合成のための方法を報告する。このブロモヒドリンのヒドロキシル基は、シアン化ナトリウムとの反応の前に、保護される。同書。
1つの局面において、本発明は、4−シアノ−3−ヒドロキシ酪酸のエステルまたはアミドを、4−ハロ−3−ヒドロキシ酪酸のエステルまたはアミドから生成するための方法に関し、この方法は、以下:
(a)4−ハロ−3−ヒドロキシ酪酸のエステルまたはアミドを提供する工程であって、ここで、このハロ置換基は、塩素、臭素、およびヨウ素から選択される、工程;ならびに
(b)4−ハロ−3−ヒドロキシ酪酸のエステルまたはアミドを、ハロヒドリンデハロゲナーゼおよびシアン化物と、4−ハロ−3−ヒドロキシ酪酸のエステルまたはアミドを、4−シアノ−3−ヒドロキシ酪酸のエステルまたはアミドに転換するための反応混合物を形成するために充分な条件下で接触させる工程、
を包含する。
4−ハロ−3−ケト酪酸のエステルまたはアミドを提供する工程であって、ここで、このハロ置換基は、塩素、臭素、およびヨウ素からなる群から選択される、工程;ならびに
4−ハロ−3−ケト酪酸のエステルまたはアミドを、ケトレダクターゼ、補因子、および補因子再生系と、4−ハロ−3−ケト酪酸のエステルまたはアミドを4−ハロ−3−ヒドロキシ酪酸のエステルまたはアミドに転換するための反応混合物を形成するために充分な条件下で、接触させる工程、
を包含する方法によって、提供される。
(a)4−ハロ−3−ケト酪酸エステルを提供する工程であって、ここで、このハロ置換基は、塩素、臭素、およびヨウ素からなる群から選択される、工程;ならびに
(b)−ハロ−3−ケト酪酸エステルを、ケトレダクターゼ、補因子、補因子再生系、シアン化物、およびハロヒドリンデヒドロゲナーゼと接触させて、4−ハロ−3−ケト酪酸エステルを4−シアノ−3−ヒドロキシ酪酸エステルに転換させるための反応混合物を形成する工程、
を包含する。
(a)4−ハロ−3−ヒドロキシ酪酸のエステルまたはアミドを提供する工程であって、ここで、このハロ置換基は、塩素、臭素、およびヨウ素からなる群より選択される、工程;ならびに
(b)4−ハロ−3−ヒドロキシ酪酸のエステルまたはアミドを、ハロヒドリンデハロゲナーゼおよび求核試薬と、4−ハロ−3−ヒドロキシ酪酸のエステルまたはアミドを、4−求核剤置換−3−ヒドロキシ酪酸またはアミドに転換するための反応混合物を形成するために適切な条件下で接触させる工程、
を包含する。
(a)4−ハロ−3−ケト酪酸のエステルまたはアミドを提供する工程であって、ここで、このハロ置換基は、塩素、臭素、およびヨウ素からなる群より選択される、工程;ならびに
(b)4−ハロ−3−ケト酪酸のエステルまたはアミドを、ケトレダクターゼ、補因子、補因子再生系、求核試薬、およびハロヒドリンデハロゲナーゼと接触させて、4−ハロ−3−ケト酪酸のエステルまたはアミドを、4−求核剤置換−3−ヒドロキシ酪酸のエステルまたはアミドに転換するための反応混合物を形成する工程、
を包含する。
(a)ハロヒドリンデハロゲナーゼ;
(b)求核試薬;および
(c)4−ハロ−3−ヒドロキシ酪酸のエステルまたはアミド、
を含有する組成物に関する。
本発明は、対応する4−ハロ−3−ヒドロキシ酪酸エステル基質および4−ハロ−3−ヒドロキシ酪酸アミド基質に由来する種々の4−置換された3−ヒドロキシ酪酸エステルおよび4−置換された3−ヒドロキシ酪酸アミドを生成するための酵素的方法を提供する。
本発明は、4−ハロ−3−ヒドロキシ酪酸エステルまたは4−ハロ−3−ヒドロキシ酪酸アミドに由来する4−求核剤置換−3−ヒドロキシ酪酸エステルまたは4−求核剤置換−3−ヒドロキシ酪酸アミドを生成するための方法を提供し、この方法は、以下の工程を包含する:
(a)4−ハロ−3ヒドロキシ酪酸エステルまたは4−ハロ−3ヒドロキシ酪酸アミドを提供する工程であって、
ここで、そのハロ置換基が、塩素、臭素およびヨウ素からなる群から選択される、工程;ならびに
(b)その4−ハロ−3−ヒドロキシ酪酸エステルまたは4−ハロ−3−ヒドロキシ酪酸アミドを、4−求核剤置換−3−ヒドロキシ酪酸エステルまたは4−求核剤置換−3−ヒドロキシ酪酸アミドに変換するための反応混合物を形成するために適切な条件下で、4−ハロ−3−ヒドロキシ酪酸エステルまたは4−ハロ−3−ヒドロキシ酪酸アミドを、ハロヒドリンデハロゲナーゼおよび求核剤と接触させる工程。重要なことには、本発明の方法は、4−置換3−ヒドロキシ酪酸エステルおよび4−置換3−ヒドロキシ酪酸アミドの製造のためのプロセスを提供し、この方法において、副生成物形成は、最小にされる。
(a)4−ハロ−3−ヒドロキシ酪酸エステルまたは4−ハロ−3−ヒドロキシ酪酸アミドを提供する工程であって、
ここで該ハロ置換基は、塩素、臭素、およびヨウ素からなる群より選択される、工程;ならびに
(b)その4−ハロ−3−ヒドロキシ酪酸エステルまたは4−ハロ−3−ヒドロキシ酪酸アミドを、4−シアノ−3−ヒドロキシ酪酸エステルまたは4−シアノ−3−ヒドロキシ酪酸アミドに変換するための反応混合物を形成するために適した条件下で、その4−ハロ−3−ヒドロキシ酪酸エステルまたは4−ハロ−3−ヒドロキシ酪酸アミドと、ハロヒドリンおよびデハロゲナーゼおよびシアニドとを接触させる工程。
R1、R2、R3、R4およびR6は、それぞれ独立して、水素、フッ素、必要に応じて置換された低級アルキル、必要に応じて置換されたシクロアルキル、必要に応じて置換された低級アルケニル、必要に応じて置換されたアリール、必要に応じて置換されたアリールアルキル、アミノ、必要に応じて置換された低級アルキルアミノ、必要に応じて置換されたシクロアルキルアミノ、必要に応じて置換された低級アルコキシ、必要に応じて置換されたシクロアルコキシ、必要に応じて置換されたアリールオキシ、および必要に応じて置換されたアリールアルコキシからなる群より選択され;そして
R5は、必要に応じて置換された低級アルキル、必要に応じて置換されたシクロアルキル、必要に応じて置換されたアリール、および必要に応じて置換されたアリールアルキルからなる群より選択され;そして
R7およびR8は、各々独立して、水素、必要に応じて置換された低級アルキル、必要に応じて置換されたシクロアルキル、必要に応じて置換されたアリール、および必要に応じて置換されたアリールアルキルからなる群より選択される。
本発明は、さらに、以下による、4−ハロ−3−ヒドロキシ酪酸エステルまたはアミドを作製するための酵素方法を提供する:
(a)4−ハロ−3−ケト酪酸エステルまたはアミドを提供する工程であって、ここで、このハロ置換基が、塩素、臭素、およびヨウ素からなる群より選択される、工程;および
(b)4−ハロ−3−ケト酪酸エステルまたはアミドを4−ハロ−3−ヒドロキシ酪酸エステルまたはアミドに変換するための反応混合物を形成するのように適切な条件下で、この4−ハロ−3−ケト酪酸エステルまたはアミドをケトレダクターゼ、補因子、および補因子再生系と接触させる、工程。
(1988)29:2453)、Thermoanaerobium brockii(JACS(1985)107:4028)、またはSulfolobus solfataricus(Biotechnol.Lett.(1991)13:31)またはPseudomonas sp.(米国特許第5,385,833号;J.Org.Chem.(1992)57:1526)由来のアルコールデヒドロゲナーゼ(ADH)の使用を記載する。
される:
本発明は、単一の反応容器内での、4−ハロ−3−ケト酪酸エステルおよびアミドの、対応する4−求核性置換−3−ヒドロキシ酪酸エステルおよびアミドへの変換を行うための方法を提供し、この方法は、4−ハロ−3−ケト酪酸エステルまたはアミドを、ケトレダクターゼ、補因子、補因子再生系、求核性、およびハロヒドリンデハロゲナーゼと接触させて、4−ハロ−3−ケト酪酸エステルまたはアミドを4−求核性置換−3−ヒドロキシ酪酸エステルまたはアミドへ変換するための反応混合物を形成する工程を包含する。
本発明はさらに、4−ハロ−3−ヒドロキシ酪酸エステルまたはアミドの4−求核性置換−3−ヒドロキシ酪酸エステルまたはアミドへの酵素的変換に有用な組成物を提供する。これらの組成物は、ハロヒドリンデハロゲナーゼ、4−ハロ−3−ヒドロキシ酪酸エステルまたはアミド、および、求核電子を含む。好ましい組成物において、求核電子は、シアニドである。
本明細書中に記載される特定の酵素およびポリヌクレオチドに加えて、当業者は、公知の技術が、本発明の実施における用途に適する酵素をコードする、天然に存在するポリヌクレオチドおよび天然に存在しないポリヌクレオチドの両方の発見に、容易に適用され得ることを認識する。例えば、以下を参照のこと:
例えば、BergerおよびKimmel、「Guide to Molecular Cloning Techniques」Methods in Enzymology,Volume 152,Academic Press,Inc.,San Diego,CA;Sambrookら「Molecular Cloning A Laboratory Manual」第2版、Vol.1〜3,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,New York,1989;ならびに「Current Protocols in Molecular Biology」F.M.Ausubelら編、Current Protocols、Greene Publishing Associates,Inc.とJohn Wiley & Sons,Inc.との間のジョイントベンチャー(1999から補遺)を参照のこと。酵素を作製するための方法は、実施例1および2に例示される。
(1)ハロヒドリンデハロゲナーゼ(HHDH)
ハロヒドリンデハロゲナーゼについての遺伝子は、Agrobacterium種由来のハロヒドリンデハロゲナーゼのアミノ酸配列に基づいて、E.coliにおいて発現するためにコドン最適化した。この遺伝子を、60マーのオリゴマーを使用して合成し、T5プロモーターの制御下で、発現ベクターpCK110700(図2に示す)にクローニングした。このベクターをE.coli TOP10(Invitrogene,Carlsbad,CA)に形質転換し、このE.coliから、標準的な方法を使用してプラスミドDNAを調製した。次いで、プラスミドDNAを、標準的な方法を使用して、E.coli BL21(Stratagene,La Jolla,CA)(発現宿主)に形質転換した。いくつかのクローンが、活性なHHDHを発現する発現ライブラリーにおいて見出された。これらのクローンからの遺伝子を配列決定した(配列番号13(HHDH.1)、15(HHDH.2)、および17(HHDH.16)を参照のこと)、これらは、それぞれ、配列番号14、16および18のポリペプチド配列をコードする)。
ケトレダクターゼについての遺伝子は、Candida magnoliaeに由来するケトレダクターゼのアミノ酸配列に基づいて、E.coliにおける発現のためにコドン最適化した。この遺伝子を、60マーのオリゴマーを使用して合成し、lacプロモーターおよびlacIリプレッサー遺伝子の制御下で、発現ベクターpCK110900(図3に示す)にクローニングした。この発現ベクターは、p15A複製起点およびクロラムフェニコール耐性遺伝子を含む。このプラスミドを、標準的な方法を使用して、E.coli発現宿主に形質転換した。いくつかのクローンが、活性なケトレダクターゼを発現することが見出され、それらの遺伝子を、配列決定して、DNA配列を確認した(配列番号1(ケトレダクターゼ1)、3(ケトレダクターゼ2)、5(ケトレダクターゼ3)および7(ケトレダクターゼ4)(これらは、それぞれ、配列番号2、4、6および8のポリペプチド配列をコードする)を参照のこと)。
グルコースデヒドロゲナーゼについての遺伝子を、Bacillus subtilisおよびBacillus megaterium由来のゲノムDNA調製物からのポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を使用して増幅した。増幅反応のためのプライマーを、公開されているB.subtilisおよびB.megateriumのグルコースデヒドロゲナーゼ遺伝子配列を使用して設計し、これらは、以下の通りであった:
葉酸デヒドロゲナーゼについての遺伝子を、Pseudomonas種株101(タンパク質データベース登録番号2NAD_A)およびCandida boidinii(Genbank登録番号CAA09466)由来の葉酸デヒドロゲナーゼのアミノ酸配列に基づいて、E.coliにおける発現のためにコドン最適化した。これらの遺伝子を、60マーのオリゴマーを使用して合成し、lacプロモーターおよびlacIリプレッサー遺伝子の制御下で、発現ベクターpCK110900(図3に示す)のSfiIクローニング部位にクローニングした。この発現ベクターは、p15A複製起点およびクロラムフェニコール耐性遺伝子を含む。このプラスミドを、標準的な方法を使用して、E.coli発現宿主に形質転換した。いくつかのクローンが、活性な葉酸デヒドロゲナーゼを発現することが見出され、その遺伝子を、配列決定してDNA配列を確認した(配列番号69および71(これらは、それぞれ、配列番号70および72のポリペプチド配列をコードする)。
(1)HHDH酵素:
通気撹拌した発酵槽において、0.528g/L 硫酸アンモニウム;7.5g/Lのリン酸水素二カリウム三水和物;3.7g/Lのリン酸二水素カリウム;2g/LのTastone−154酵母エキス;0.05g/L 硫酸鉄;および3ml/Lの微量元素溶液(2g/Lの塩化カルシウム二水和物、2.2g/Lの硫酸亜鉛七水和物、0.5g/L 硫酸マンガン一水和物、1g/L 硫酸銅六水和物および0.1g/l ホウ酸ナトリウム十水和物を含有する)および0.5g/L EDTAを含有する10.0Lの増殖培地を、30℃の温度にした。発酵槽を、実施例1に記載したように、HHDHポリヌクレオチドを含有するプラスミドを備えたEscherchia coli BL21(Stratagene,La Jolla,CA)の最指数的培養物で接種し、次いで、LB、1%グルコース(Sigma Chemical Co.,St.Louis,MO)および30μg/ml クロラムフェニコール(Sigma Chemical Co.,St.Louis,MO)を含有する振盪フラスコ中で、0.5〜2.0の600nmでの開始光学濃度(OD600)まで増殖させた。発酵槽を、500〜1500rpmで撹拌し、1.0〜15.0L/分にて発酵容器に空気を補充し、30%以上の飽和溶解酸素レベルを維持した。20%v/vの水酸化アンモニウムを添加することによって、培養物のpHを7.0に調整した。培養物が、40のOD600に到達した後、温度を25℃まで下げ、ハロヒドリンデハロゲナーゼの発現を、イソプロピル−β−ジチオガラクトシド(IPTG)(Sigma Chemical Corp.,St.Louis,MO)により、1mMの最終濃度まで誘導した。培養物をさらに15時間増殖させた。誘導後、遠心分離により細胞を回収し、10mM リン酸カリウム緩衝液(pH7.0)で洗浄した。細胞ペーストを、下流の回収プロセスにおいて直接使用するか、または、使用まで−80℃にて保存した。
通気攪拌発酵槽において、0.528g/Lの硫酸アンモニウム、7.5g/Lのリン酸水素二カリウム三水和物、3.7g/Lのリン酸二水素カリウム、2g/LのTastone−154酵母抽出物、0.05g/Lの硫酸鉄(II)、および3ml/Lの微量元素溶液(2g/Lの塩化カルシウム二水和物、2.2g/Lの硫酸亜鉛七水和物、0.5g/Lの硫酸マンガン一水和物、1g/Lの硫酸銅(II)七水和物、0.1g/Lホウ酸ナトリウム十水和物および0.5g/LのEDTAを含む)を含む、10.0Lの増殖培地を、温度30℃にした。
通気攪拌発酵槽において、0.528g/Lの硫酸アンモニウム、7.5g/Lのリン酸水素二カリウム三水和物、3.7g/Lのリン酸二水素カリウム、2g/LのTastone−154酵母抽出物、0.05g/Lの硫酸鉄(II)、および3ml/Lの微量元素溶液(2g/Lの塩化カルシウム二水和物、2.2g/Lの硫酸亜鉛七水和物、0.5g/Lの硫酸マンガン一水和物、1g/Lの硫酸銅(II)七水和物、0.1g/Lホウ酸ナトリウム十水和物および0.5g/LのEDTAを含む)を含む、10.0Lの増殖培地を、温度30℃にした。
通気攪拌発酵槽において、3.5g/LのNaNH4HPO4/4H2O、7.5g/LのK2HPO4・3H2Oおよび3.7g/LのKH2PO4(Lageveenら、1988、Appl.Environ.Microbiol.54:2924(1988)参照)、2g/LのNH4Cl、0.528g/Lの(NH4)2SO4、pH7.0、5ml/LのR2微量元素(Reisenbergら、Appl.Microbiol.Biotechnol 1990 34:77参照)、20ml/Lの10%酵母抽出物水溶液、5ml/L 1M MgSO4、および40ml/Lの50%グルコース水溶液を含む、10.0Lのオートクレーブ済み最小培地を、添加した。この培地の温度を、温度30℃にした。
((1)ケトレダクターゼ)
細胞ペーストを、1容量の湿重量の細胞ペーストを3容量の100mM Tris/硫酸(pH7.2)中に懸濁し、その後、Sorval 12BP中で5000gにて40分間遠心分離することによって、洗浄した。洗浄した細胞ペーストを、2容量の100mM Tris/硫酸(pH7.2)中に懸濁した。細胞内KREDを、最初の通過のために圧力14,000psigを使用し2回目の通過のために圧力8,000psigを使用してこの懸濁物をホモジナイザーに2回通過させることにより、細胞から放出させた。溶解物を室温まで加温し、その後、10%w/vのポリエチレンイミン(PEI)溶液(pH7.2)を、最終PEI濃度0.75%まで溶解物に添加し、30分間攪拌した。処理したホモジネートを、Beckman実験室遠心機中で10,000rpmにて60分間遠心分離した。上清をデカントし、浅い容器中に分配し、−20℃にて凍結し、そして凍結乾燥した。
細胞ペーストを、1容量の湿重量の細胞ペーストを3容量の100mM Tris/硫酸(pH7.2)中に懸濁し、その後、Sorval 12BP中で5000gにて40分間遠心分離することによって、洗浄した。洗浄した細胞ペーストを、2容量の100mM Tris/硫酸(pH7.2)中に懸濁した。細胞内HHDHを、最初の通過のために圧力14,000psigを使用し2回目の通過のために圧力8,000psigを使用してこの懸濁物をホモジナイザーに2回通過させることにより、細胞から放出させた。ホモジネートを、Beckman実験室遠心機中で10,000rpmにて60分間遠心分離した。上清をデカントし、浅い容器中に分配し、−20℃にて凍結し、そして凍結乾燥した。
細胞ペーストを、1容量湿重量の細胞ペーストを3容量の100mM Tris/硫酸(pH7.2)中に懸濁し、その後、Sorval 12BP中で5000gにて40分間遠心分離することによって、洗浄した。洗浄した細胞ペーストを、2容量の100mM Tris/硫酸(pH7.2)中に懸濁した。細胞内HHDHを、最初の通過のために圧力14,000psigを使用し2回目の通過のために圧力8,000psigを使用してこの懸濁物をホモジナイザーに2回通過させることにより、細胞から放出させた。細胞溶解物を、ホモジナイザーを通す通過の間に4℃まで冷却させた。ホモジネートを、Beckman実験室遠心機中で10,000rpmにて60分間遠心分離した。上清をデカントし、浅い容器中に分配し、−20℃にて凍結し、そして凍結乾燥した。
発現したギ酸デヒドロゲナーゼを含む細胞溶解物を、1容量の100mMトリエタノールアミン(pH7.0)中に細胞ペーストを4℃にてホモジナイゼーションすることによって、調製した。細胞溶解物を、ホモジナイザーを通す間に4℃まで冷却させた。細胞溶解物を、4℃にて遠心分離によって清澄化した。清澄化した溶解物を、実施例4に記載したようにアッセイした。
(ケトレダクターゼ(KRED))
100mMリン酸カリウム緩衝液(pH7.0)中のエチル−4−クロロ−3−ケト酪酸エステルの溶液に、同じ緩衝液中に予め溶解した溶液としてケトレダクターゼ酵素を添加した。この反応を、NADPH(最終1mM)を添加することにより開始し、反応の経過を、340nmでの吸光度の減少を測定することにより追跡した。この吸光度は、NADPH濃度に対応する。結果を、吸光度単位(NADPH) 対 時間としてプロットし、プロットの傾き(吸光度単位/分)を決定した。吸光度 対 時間 プロットの傾きを、NADPHの吸光係数を使用して濃度単位へと変換し、ケトレダクターゼの活性を、μmol(生成したNADPH)/分/mg(総ケトレダクターゼ触媒)にて決定した。この測定はまた、NADPHについて340nmの励起を使用する蛍光検出を使用して実施し得、放出を455nmにて測定した。目的の他の基質で、エチル4−クロロ−3−ケト−酪酸エステルを置換して、他の基質に関するケトレダクターゼ活性を評価し得る。
100mMリン酸カリウム緩衝液(pH7.0)中の50mMグルコースの溶液に、同じ緩衝液中に予め溶解した溶液としてグルコースデヒドロゲナーゼ酵素を添加した。この反応を、NADPH(最終1mM)を添加することにより開始し、反応の経過を、340nmでの吸光度の増加を測定することにより、または蛍光(励起340nm、放出455nm)の増加を測定することにより、追跡した。結果を、吸光度単位(NADPH) 対 時間としてプロットし、プロットの傾き(吸光度単位/分)を決定した。吸光度 対 時間 プロットの傾きを、NADPHの吸光係数を使用して濃度単位へと変換し(上記(1)参照)、グルコースデヒドロゲナーゼの活性を、μmol(消費したNADPH)/分/mg(総グルコースデヒドロゲナーゼ触媒)にて決定した。
300mMリン酸カリウム中のエチル(S)−4−クロロ−3−ヒドロキシ酪酸(10mM)溶液、300mM NaCN緩衝液(pH8.0)に、同じ緩衝液中に予め溶解した溶液としてハロゲンデヒドロゲナーゼ酵素を添加した。経時的に、この混合物のアリコートを取り出し、3容量の酢酸エチルで抽出した。その後、その有機層を、下記実施例6において記載されるように、ガスクロマトグラフィー(GC)により分析した。サンプルを種々の時点で採取し、生成物であるシアノヒドリン,エチル(R)−4−シアノ−3−ヒドロキシ酪酸のピーク面積を、時間の関数としてプロットした。ピーク面積を、エチル(R)−4−シアノ−3−ヒドロキシ酪酸について調製した標準曲線を使用して、濃度単位へと変換した。ハロヒドリンデハロゲナーゼの活性を、μmol(生成したシアノヒドリン)/分/mg(総ハロヒドリンデハロゲナーゼ触媒)の単位で決定した。目的の他の求核試薬および/または基質でシアン化物を置換して、他の求核試薬および/または基質に関してハロヒドリンデハロゲナーゼ活性を評価し得る。
100mMトリエタノールアミン緩衝液(pH7.0)中の150mMギ酸溶液に、同じ緩衝液中に予め溶解した溶液としてギ酸デヒドロゲナーゼ酵素を添加した。この反応を、NADの添加(最終2mM)により開始し、反応の経過を、340nmでの吸光度の増加を測定することにより、または蛍光(励起340nm、放出455nm)の増加を測定することにより、追跡した。結果を、吸光度単位(NADH) 対 時間としてプロットし、プロットの傾き(吸光度単位/分)を決定した。吸光度 対 時間 プロットの傾きを、NADHの吸光係数を使用して濃度単位へと変換し(上記(1)参照)、ギ酸デヒドロゲナーゼの活性を、μmol(生成したNADH)/分/mg(総ギ酸デヒドロゲナーゼ触媒)にて決定した。
室温の100mMリン酸カリウム緩衝液、500mM NaCl(pH7)の十分に攪拌した溶液(1L)に、グルコース(160g、830mmole、1.1当量)を添加した。これに、ケトレダクターゼ(配列番号2)(0.9g)、グルコースデヒドロゲナーゼS06(配列番号10)(0.5g)およびNADP(0.5g)を、凍結乾燥粉末として添加した。一旦溶解すると、酢酸エチル(500mL)を添加してエマルジョンを形成させた。このエマルジョンに、酢酸ブチル(500mL)中のエチル4−クロロアセトアセテート(100g、608mmole)の溶液を、3時間にわたって滴下した。そのpHを、Na2CO3(水中2M、合計約160mL)を供給する自動滴定器により、6.8と7との間に維持した。40時間後、塩基の自動添加を停止した。ガスクロマトグラフィーによって、残留出発物質は存在しなかった。これらの層を分離し、水相を、酢酸エチル(500mL)で洗浄した。合わせた有機物を、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、そしてロータリーエバポレーターでエバポレートして、本質的に純粋な(約97%の)エチル(S)−4−クロロ−3−ヒドロキシブチレートを得た。
実施例5において生成したエチル(R)−4−シアノ−3−ヒドロキシブチレートを、Agilent HP−5カラム、30m長、0.25μm内径を使用し、以下のプログラムを使用する、水素炎イオン化(FID)検出によるガスクロマトグラフィーを使用して分析した:100℃にて1分間、5℃/分を10分間;25℃/分を2分間;その後、200℃にて2分間。入口温度および出口温度は、両方とも300℃であった。流量は、2ml/分であった。これらの条件下で、エチル(R)−4−シアノ−3−ヒドロキシブチレートは、6.25分で溶出し、エチル(S)−4−クロロ−3−ヒドロキシブチレートは、4.5分で溶出し、エチル4−クロロアセトアセテートは、4.1分で溶出する。
機械的攪拌器を備え、pH電極による自動滴定器および塩基添加用供給チューブに接続された、3首ジャケット付き3Lフラスコに、トリエタノールアミン(6.6mL)およびH2O(492mL)を充填して、100mMトリエタノールアミン溶液を生成した。そのpHを、37%HClを用いて7に調整した。その後、D−グルコース(125g)を添加した。フラスコジャケットに循環する水を、30℃に設定した。10分間後、ケトレダクターゼ(配列番号2)(5.7g)およびグルコースデヒドロゲナーゼS06(配列番号10)(3.1g)の粉末を、添加した。10分間後、β−NAD(125g)を添加し、生じた混合物を、5分間攪拌させた。その後、酢酸ブチル(250mL)を充填した。添加漏斗を使用して、2.4Mのエチル4−クロロアセトアセテート(250mL、酢酸ブチル167mL中100g)を、3時間かけてゆっくり添加した。そのpHを、自動滴定器により2MのNa2CO3(152mL)を15時間かけて添加することによって、7に維持した。セライト(16g)を添加し、反応混合物を10分間攪拌させた。その溶液をセライトパッドに通して濾過し、有機層を分離した。水層を酢酸ブチル(2×200mL)で抽出した。有機層を合わせ、溶媒をロータリーエバポレーションにより真空下で除去して、87gのエチル(S)4−クロロ−3−ヒドロキシブチレートを得た。エナンチオマー過剰は、実施例8においてそれをエチル(R)−シアノ−3−ヒドロキシブチレートに変換した後に決定すると、>99%であった。
機械撹拌機を備え、pH電極および塩基の添加のための供給管によって自動滴定装置に接続した3つ首ジャケット付き3Lフラスコに、H2O(1200mL)、NaCN(37.25g)およびNaH2PO4(125g)をチャージし、溶液をpH7にした。水循環器を40℃に設定した。10分後、ハロヒドリンデハロゲナーゼ配列番号32を細胞可溶化物(250mL)として加えた。反応混合物を、5分間撹拌した。添加漏斗を用い、エチル(S)−4−クロロ−3−ヒドロキシブチラート(実施例7からの物質45g)をゆっくりと1時間にわたって加えた。自動滴定機による10M NaOH(27mL)の17時間にわたる添加によって、pHを7に維持した。その後、反応サンプルのガスクロマトグラフィーにより、生成物への完全な変換が見られた。セライト(16g)をフラスコに加え、次いで、ダイアフラムに接続し、その排気を5M NaOH(200mL)中で泡立て、HCNを除去した。この混合物を、100mm Hgの圧力下で60℃まで過熱した。1時間後、水中の空気バブラーを溶液に加え、HCNの除去を補助した。3時間後、HCN検出器は、着たい廃棄物中5ppm HCN未満を示した。この混合物を、室温まで冷却し、次いでセライトのパッドを通して濾過した。濾液を酢酸ブチル(3×800mL)で抽出し、そして合わせた有機層を、活性炭のパッドを通して濾過した。この溶媒を、回転蒸発により真空化で除去し、28.5gのエチル(R)−4−シアノ−3−ヒドロキシブチラートを得た。純度は、HPLCで98%(w/w)であり、鏡像異性の過剰は>99%であった(キラルGCにより、S鏡像異性体は検出されなかった)。
pH電極および塩基の添加のための供給管によって自動滴定機に接続した100mL容器に、100mMトリエタノールアミンpH7緩衝液中グルコース(7.5g)溶液をチャージした。この溶液に、ケトレダクターゼ配列番号42(100mg);50mg GDH配列番号66およびNADP(6.25mg)をチャージした。次いで、酢酸ブチル(10ml)をチャージした。次いで、酢酸ブチル(10ml)中エチル4−クロロアセトアセテート(6g)をチャージした。自動滴定機による4M NaOH(7.5mL)の7時間にわたる添加によって、pHを7に維持した。反応混合物のサンプルを、等量の酢酸ブチルで抽出し、そして有機層をGCによって分析した。この分析は、エチル4−クロロアセトアセテートからエチル(S)−4−クロロ−3−ヒドロキシブチラートへの99%の変換を示した。
この手順は、400mgのケトレダクターゼ配列番号42を使用したことおよびNADPの代わりにNAD+(12.5mg)を添加したことを除き、実施例9の手順と同一であった。自動滴定機によるNaOH溶液の添加は、11時間で完了し、そしてGC分析は、エチル4−クロロアセトアセテートからエチル(S)−4−クロロ−3−ヒドロキシブチラートへの99%の変換を示した。
pH電極および塩基の添加のための供給管によって自動滴定機に接続した100mL容器に、水(30mL)中グルコース(12g)溶液をチャージした。この溶液に、ケトレダクターゼ配列番号42(100mg);50mgGDH配列番号66およびNADP(6.25mg)をチャージした。次いで、酢酸ブチル(10ml)をチャージした。次いで、エチル4−クロロアセトアセテート(10g)を、以下のシリンジポンプを介してチャージした:1mLを迅速にチャージし、次いで残りをandthe1mL/時間の速度でチャージした)。自動滴定機による4M NaOHの18時間にわたる添加によって、pHを7に維持した。撹拌を止め、そして相を分離させた。有機層は、幾らかのエマルジョンを含んだ。この有機層(幾らかのエマルジョンを含む)を、分離し、そして10mLの水で洗浄した。合わせた水層を、20mLの酢酸ブチルで2度抽出した。この有機抽出物を合わせ、そして減圧下で回転蒸発し、水を除去した。さらなる酢酸ブチルを、蒸発の間に添加し、水の除去を補助した。水が除去されたとき、酢酸ブチル溶液を固体からフラスコにデカントした。次いで、減圧下での溶媒の蒸発は、非常に純度の高い8.85gのエチル(S)−4−クロロ−3−ヒドロキシブチラート(収率87.4%)を生じた。
pH電極および塩基の添加のための供給管によって自動滴定機に接続した170mL容器に、NaCN(1.5g,31mmol)および水(50mL)をチャージした。この容器を密封し、そしてヘッドスペースを窒素で脱気した。濃H2SO4(0.9mL)の添加により、pHを7に調整した。この反応混合物を、40℃まで過熱し、そしてハロヒドリンデヒドロゲナーゼ配列番号32の溶液(42μLの14M β−メルカプトエタノール含有水10mL中1.2g)で処理した。次いで、エチル(S)−4−クロロ−3−ヒドロキシブチラート(1.8g、10.8mmol)を、シリンジを介して添加した。自動滴定機による2M NaOHの添加により、pHを7で維持した。15時間後、反応は完了し、計4.6mLの2M NaOHを加えた。反応混合物のサンプルを、等量の酢酸ブチルで抽出した。有機抽出物のGC分析は、エチル(S)−4−クロロ−3−ヒドロキシブチラートからエチル(R)−4−シアノ−3−ヒドロキシブチラートへの変換が>99%であったことを示した。
この手順は、2M NaOHの代わりに4M NaCNを塩基として使用したことを除き、実施例12の手順と同一であった。8時間後、反応は完了し、計2.3mLの4M NaCNを加えた。GC分析により、エチル(S)−4−クロロ−3−ヒドロキシブチラートからエチル(R)−4−シアノ−3−ヒドロキシブチラートへの変換は>99%であったことを示した。
−4−シアノ−3−ヒドロキシブチラートの調製)
pH電極および塩基(7.5M NaOH)の添加のための供給管によって自動滴定機に接続した250mL容器に、水(83.5mL)および0.7gのハロヒドリン
デハロゲナーゼ配列番号24をチャージした。この混合物を30分間撹拌した。滴定機を活性化させ、そしてpH7を維持するように設定した。次いで、HCN 25%水溶液(9.26ml、8.6g)を、20分間に渡ってチャージし、2.3% HCN溶液を作製した。この混合物を40℃で10分間過熱し、次いでエチル(S)−4−クロロ−3−ヒドロキシブチラート(5g)を1時間に渡ってチャージした。自動滴定機による2M NaOHの添加により、pHを7で維持した。20時間後、反応サンプルの酢酸ブチル抽出物のGC分析は、エチル(S)−4−クロロ−3−ヒドロキシブチラートからエチル(R)−4−シアノ−3−ヒドロキシブチラートへの変換が95%であったことを示した。
20mLスクリューキャップ容器に、NaCN(250mg)およびNaH2PO4(830mg)を添加した。水(10mL)を加え、その後ハロヒドリンデハロゲナーゼ配列番号32を凍結乾燥粉末(200mg)で加えた。次いで、エチル(S)−4−クロロ−3−ヒドロキシブチラート(300mg)を加えた。容器にふたをし、湯浴中で40℃で加熱した。4時間後、反応サンプルの酢酸ブチル抽出物のGC分析は、エチル(S)−4−クロロ−3−ヒドロキシブチラートからエチル(R)−4−シアノ−3−ヒドロキシブチラートへの54%の変換を示した。72時間後、GC分析は、変換の完了を示した。
この手順は、(S)−鏡像異性体の代わりにエチル4−クロロ−3−ヒドロキシブチラートの(R)−鏡像異性体を反応させたことおよび全ての反応成分の量を半分にしたこと除き、実施例15の手順と同一であった。1時間の反応時間後、GC分析は、エチル(R)−4−クロロ−3−ヒドロキシブチラートからエチル(S)−4−シアノ−3−ヒドロキシブチラートへの55%変換を示した。
この手順は、エチル4−クロロアセトアセテートの代わりに等モル量のメチル4−クロロアセトアセテートを反応させたことおよび使用した酵素がケトレダクターゼ配列番号50およびグルコースデヒドロゲナーゼ配列番号62であったことを除き、実施例9の手順と同一であった。この反応は、11時間で完了し、そしてGC分析は、>99%のメチル(S)−4−クロロ−3−ヒドロキシブチラートを示した。生成物を酢酸ブチルへの抽出によって単離し、そして溶媒蒸発およびその同一性を1Hおよび13C NMRによって確認した。
この手順は、エチル(R)−4−クロロ−3−ヒドロキシブチラートの代わりに等モル量のメチル(S)−4−クロロ−3−ヒドロキシブチラート(実施例17で調製)を反応させたことを除き、実施例16の手順と同一であった。1時間の反応時間後、GC分析はメチル(R)−4−クロロ−3−ヒドロキシブチラートからメチル(S)−4−シアノ−3−ヒドロキシブチラートへの38%の変換を示した。この生成物を、1Hおよび13C NMRによって特徴付けた。
この手順は、エチル(R)−4−クロロ−3−ヒドロキシブチラートの代わりに等モル量のエチル(S)−4−ブロモ−3−ヒドロキシブチラートを反応させたことを除き、実施例16の手順と同一であった。1時間の反応時間後、GC分析はエチル(S)−4−ブロモ−3−ヒドロキシブチラートからエチル(S)−4−シアノ−3−ヒドロキシブチラートへの90%の変換を示した。この生成物を、1Hおよび13C NMRによって特徴付けた。
この手順は、メチル4−クロロアセトアセテートの代わりに等モル量のエチルアセトアセテートを反応させたことならびに200mgのケトレダクターゼ配列番号50および100mgグルコースデヒドロゲナーゼ配列番号62を使用したことを除き、実施例17の手順と同一であった。反応は6時間で完了した。生成物を、酢酸ブチル中への抽出および溶媒蒸発により単離し、1Hおよび13C NMRによって特徴付けた。
25mg/mLシアン化ナトリウムを含む水溶液を、85%リン酸の添加により、pHメーターでモニタリングしながらpH5.0、pH6.0、pH7.0、pH7.5、pH8.0、pH8.5およびpH9.0で調製した。ハロヒドリンデハロゲナーゼ配列番号38(20mg)を各容器に添加し、その後エチル(S)−4−クロロ−3−ヒドロキシブチラート(50mg,0.30mモル)を添加した。火酵素的反応実験について、手順は、酵素を省いたことを除き同一であった。容器にふたをし、そして湯浴中で55℃で3時間加熱し、次いで取り出して室温で冷却した。核反応混合物の0.4mLサンプルを1mL酢酸ブチルで抽出し、そして抽出物を、ガスクロマトグラフィーで分析した。
リン酸水溶液を、40mL水中に0.48gのNaH2PO4を溶解し、そしてpHメーターによりモニタリングしながら2M NaOHを添加してpHの調整し、pH7.0、pH7.5、pH8.0、pH8.5、およびpH9.0で作製した。5mLの各溶液を、別々の20mLスクリューキャップ容器にチャージした。次いで、エチル(R)−4−シアノ−3−ヒドロキシブチラート(46mg、0.29mmol)を添加した。この容器にふたをし、そして湯浴中で55℃で3時間加熱し、そして室温で冷却した。0.4mLの各反応混合物を、1mLの酢酸ブチルで抽出し、この抽出物を、GCによって分析した。外部標準のために、二連のpH7.0混合物を、新しく調製し、そしてただちに抽出した。各容器中のエチル4−シアノ−3−ヒドロキシブチラートの分析した量を、表IIに示す。その加水分解の産物は、反応サンプル抽出物中に検出されなかった。このエステルの加水分解のカルボン酸生成物が、GCによって分析された抽出物中に抽出されないことは、別々に確立された。
pH電極および塩基(4M NaOH)の添加のための供給管によって自動滴定機に接続した100mL容器に、100mMトリエタノールアミンpH7緩衝液中グルコース(7.5g)溶液(25mL)をチャージした。この溶液に、ケトレダクターゼ配列番号50(50mg);50mg グルコースデヒドロゲナーゼ配列番号62およびNADP(1.5mg)をチャージした。次いで、さらなる酢酸ブチル(10ml)中酢酸ブチル(10ml)およびエチル4−クロロアセトアセテート(6g)をチャージした。自動滴定機による4M NaOHの撹拌混合物への13時間にわたる添加によって、pHを7に維持した。次いで、相を30分間分離させ、そしてエチル(S)−4−クロロ−3−ヒドロキシブチラート中間体を含む有機層(25mL)を取り出した。
20mLの容器に、NaH2PO4(415mg、3.46mmol)およびグルコース(750mg、3.8mmol)を加えた。水(5mL)を加え、その後NADP(2mg)、ケトレダクターゼ配列番号56(50mg)、グルコースデヒドロゲナーゼ配列番号62(50mg)、およびハロヒドリンデハロゲナーゼ配列番号32(100mg)を加えた。次いで、0.5mL酢酸ブチル中エチル4−クロロ−アセトアセテート(24mg、0.15mmol)を加えた。この容器にふたをし、油浴中で30℃で加熱した。1時間後、反応サンプルの酢酸ブチル抽出物のGC分析は、エチル4−クロロ−アセトアセテートからエチル(S)−4−クロロ−3−ヒドロキシブチラートへの100%の変換を96%の選択性で、そしてエチル(R)−4−シアノ−3−ヒドロキシブチラートを4%の選択性で示した。次いで、反応容器を、40℃で15時間過熱した。次いで、酢酸ブチル抽出物のGC分析は、2%のエチル(S)−4−クロロ−3−ヒドロキシ−ブチレート残渣を、開始エチル4−クロロアセテートに基づき、全体でエチル(R)−4−シアノ−3−ヒドロキシブチラート収率98%で示した。
Claims (42)
- 4−ハロ−3−ヒドロキシ酪酸エステルから4−シアノ−3−ヒドロキシ酪酸エステルを、生成するための方法であって、該方法は、以下、
(a)4−ハロ−3−ヒドロキシ酪酸エステルを供給する工程であって、
ここで、ハロ置換基が、塩素、臭素およびヨウ素からなる群から選択される、工程;ならびに
(b)該4−ハロ−3−ヒドロキシ酪酸エステルを4−シアノ−3−ヒドロキシ酪酸エステルに変換するための反応混合物を形成するために十分な条件下で、該4−ハロ−3−ヒドロキシ酪酸エステルを、ハロヒドリンデハロゲナーゼおよびシアニドと接触させる工程
を包含する、方法。 - 前記4−シアノ−3−ヒドロキシ酪酸エステルが、非ラセミ体キラル4−シアノ−3−ヒドロキシ酪酸エステルである、請求項1に記載の方法。
- 前記シアニドが、シアン化水素によって供給される、請求項1に記載の方法。
- 前記シアニドが、シアニド塩によって供給される、請求項1に記載の方法。
- 前記4−ハロ−3−ヒドロキシ酪酸エステルの前記ハロ置換基が、塩素および臭素から選択される、請求項1に記載の方法。
- 前記4−ハロ−3−ヒドロキシ酪酸エステルが、4−クロロ−3−ヒドロキシ酪酸エステルである、請求項1に記載の方法。
- 前記4−ハロ−3−ヒドロキシ酪酸エステルが、低級アルキルエステルである、請求項1に記載の方法。
- 請求項1に記載の方法であって、ここで、
(1)前記4−ハロ−3−ヒドロキシ酪酸エステルが、構造:
(2)前記4−シアノ−3−ヒドロキシ酪酸エステルが、構造:
Xは、塩素、臭素およびヨウ素からなる群から選択されるハロゲンであって、
R1、R2、R3、R4およびR6は、それぞれ独立に、水素、フッ素、必要に応じて置換された低級アルキル、必要に応じて置換されたシクロアルキル、必要に応じて置換された低級アルケニル、必要に応じて置換されたアリール、必要に応じて置換されたアリールアルキル、アミノ、必要に応じて置換された低級アルキルアミノ、必要に応じて置換されたシクロアルキルアミノ、必要に応じて置換された低級アルコキシ、必要に応じて置換されたシクロアルコキシ、必要に応じて置換されたアリールオキシ、および必要に応じて置換されたアリールアルコキシからなる群から選択され;そして、
R5は、必要に応じて置換された低級アルキル、必要に応じて置換されたシクロアルキル、必要に応じて置換されたアリール、および必要に応じて置換されたアリールアルキルからなる群から選択される、
方法。 - 前記ハロヒドリンデハロゲナーゼが、天然に存在するハロヒドリンデハロゲナーゼである、請求項1に記載の方法。
- 前記ハロヒドリンデハロゲナーゼが、天然には存在しないハロヒドリンデハロゲナーゼである、請求項1に記載の方法。
- 前記4−ハロ−3−ヒドロキシ酪酸エステルを4−シアノ−3−ヒドロキシ酪酸エステルに変換するための反応混合物が、約5〜約9の範囲のpHで維持される、請求項1に記載の方法。
- 前記4−ハロ−3−ヒドロキシ酪酸エステルを4−シアノ−3−ヒドロキシ酪酸エステルに変換するための反応混合物が、約5〜約8の範囲のpHで維持される、請求項11に記載の方法。
- 前記4−ハロ−3−ヒドロキシ酪酸エステルを4−シアノ−3−ヒドロキシ酪酸エステルに変換するための反応混合物が、約8以下のpHで維持される、請求項1に記載の方法。
- 前記4−ハロ−3−ヒドロキシ酪酸エステルを4−シアノ−3−ヒドロキシ酪酸エステルに変換するための反応混合物が、さらに、pH緩衝液を含有する、請求項1に記載の方法。
- 請求項1に記載の方法であって、さらに、
(c)前記4−ハロ−3−ヒドロキシ酪酸エステルを4−シアノ−3−ヒドロキシ酪酸エステルに変換するための反応混合物を、約5以上のpHで維持するために十分な塩基を添加する工程、
を包含する、方法。 - 前記塩基が、水酸化物塩、炭酸塩、および重炭酸塩から選択される、請求項15に記載の方法。
- 前記塩基が、シアニド塩から選択される、請求項15に記載の方法。
- 請求項1に記載の方法であって、さらに、前記4−ハロ−3−ヒドロキシ酪酸エステルを4−シアノ−3−ヒドロキシ酪酸エステルに変換するための反応混合物から、該4−シアノ−3−ヒドロキシ酪酸エステルを回収する工程を包含する、方法。
- 請求項16に記載の方法であって、さらに、前記4−シアノ−3−ヒドロキシ酪酸エステルを精製する工程を包含する、方法。
- 請求項1に記載の方法であって、工程(a)が、
4−ハロ−3−ケト酪酸エステルを供給する工程であって、
ここで、前記ハロ置換基が、塩素、臭素およびヨウ素からなる群から選択される、工程;そして、
該4−ハロ−3−ケト酪酸エステルを4−ハロ−3−ヒドロキシ酪酸エステルに変換するための反応混合物を形成するために十分な条件下で、該4−ハロ−3−ケト酪酸エステルを、ケトレダクターゼ、補因子、および補因子再生系と接触させる工程、
を包含する、方法。 - 前記補因子がNAD/NADHである、請求項20に記載の方法。
- 前記補因子がNADP/NADPHである、請求項20に記載の方法。
- 前記ケトレダクターゼが天然に存在するケトレダクターゼである、請求項20に記載の方法。
- 前記ケトレダクターゼが天然には存在しないケトレダクターゼである、請求項20に記載の方法。
- 前記補因子再生系がグルコースおよびグルコースデヒドロゲナーゼを含有する、請求項20に記載の方法。
- 前記グルコースヒドロゲナーゼが天然に存在するグルコースデヒドロゲナーゼである、請求項25に記載の方法。
- 前記グルコースデヒドロゲナーゼが天然には存在しないグルコースデヒドロゲナーゼである、請求項25に記載の方法。
- 前記補因子再生系がギ酸塩およびギ酸デヒドロゲナーゼを含有する、請求項20に記載の方法。
- 前記ギ酸デヒドロゲナーゼが天然に存在するギ酸デヒドロゲナーゼである、請求項28に記載の方法。
- 前記ギ酸デヒドロゲナーゼが天然には存在しないギ酸デヒドロゲナーゼである、請求項28に記載の方法。
- 請求項20に記載の方法であって、ここで、
前記4−ハロ−3−ケト酪酸エステルが、構造:
前記4−ハロ−3−ヒドロキシ酪酸エステルが、構造:
前記4−シアノ−3−ヒドロキシ酪酸エステルが、構造:
Xは、塩素、臭素およびヨウ素からなる群から選択されるハロゲンであって;
R1、R2、R3およびR4は、それぞれ独立に、水素、フッ素、必要に応じて置換された低級アルキル、必要に応じて置換されたシクロアルキル、必要に応じて置換された低級アルケニル、必要に応じて置換されたアリール、必要に応じて置換されたアリールアルキル、アミノ、必要に応じて置換された低級アルキルアミノ、必要に応じて置換されたシクロアルキルアミノ、必要に応じて置換された低級アルコキシ、必要に応じて置換されたシクロアルコキシ、必要に応じて置換されたアリールオキシ、および必要に応じて置換されたアリールアルコキシからなる群から選択され、そして、
R5は、必要に応じて置換された低級アルキル、必要に応じて置換されたシクロアルキル、必要に応じて置換されたアリール、および必要に応じて置換されたアリールアルキルからなる群から選択される、
方法。 - 前記4−ハロ−3−ケト酪酸エステルを4−ハロ−3−ヒドロキシ酪酸エステルに変換するための反応混合物が、約5〜約10の範囲のpHで維持される、請求項20に記載の方法。
- 前記4−ハロ−3−ケト酪酸エステルを4−ハロ−3−ヒドロキシ酪酸エステルに変換するための反応混合物が、さらに、緩衝液を含有する、請求項20に記載の方法。
- 請求項25に記載の方法であって、さらに、
前記4−ハロ−3−ケト酪酸エステルを4−ハロ−3−ヒドロキシ酪酸エステルに変換するための反応混合物を、約5以上のpHで維持するために十分な塩基を添加する工程、
を包含する、方法。 - 4−ハロ−3−ケト酪酸エステルから4−シアノ−3−ヒドロキシ酪酸エステルを生成するための方法であって、該方法は、以下、
(a)4−ハロ−3ケト酪酸エステルを供給する工程であって、
ここで、ハロ置換基が、塩素、臭素およびヨウ素からなる群から選択される、工程;ならびに
(b)該4−ハロ−3−ケト酪酸エステルを4−シアノ−3−ヒドロキシ酪酸エステルに変換するための反応混合物を形成するために、4−ハロ−3−ケト酪酸エステルを、ケトレダクターゼ、補因子、補因子再生系、シアニド、およびハロヒドリンデハロゲナーゼ
と接触させる工程、
を包含する、方法。 - 4−ハロ−3−ヒドロキシ酪酸エステルまたは4−ハロ−3−ヒドロキシ酪酸アミドから4−求核剤置換−3−ヒドロキシ酪酸エステルまたは4−求核剤置換−3−ヒドロキシ酪酸アミドを生成するための方法であって、該方法は、以下:
(a)4−ハロ−3−ヒドロキシ酪酸エステルまたは4−ハロ−3−ヒドロキシ酪酸アミドを供給する工程であって、
ここで、ハロ置換基が、塩素、臭素およびヨウ素からなる群から選択される、工程;および
(b)該4−ハロ−3−ヒドロキシ酪酸エステルまたは該4−ハロ−3−ヒドロキシ酪酸アミドを4−求核剤置換−3−ヒドロキシ酪酸または4−求核剤置換−3−ヒドロキシ酪酸アミドに変換するための反応混合物を形成するために、適した条件下で、該4−ハロ−3−ヒドロキシ酪酸エステルまたは該4−ハロ−3−ヒドロキシ酪酸アミドを、ハロヒドリンデハロゲナーゼおよび求核試薬と接触させる工程、
を包含する、方法。 - 請求項36に記載の方法であって、ここで、
前記4−ハロ−3−ヒドロキシ酪酸エステルまたは前記4−ハロ−3−ヒドロキシ
酪酸アミドが、構造:
(2)前記4−求核剤置換−3−ヒドロキシ酪酸エステルまたは前記4−求核剤置換−3−ヒドロキシ酪酸アミドが、構造:
Xは、塩素、臭素およびヨウ素からなる群から選択されるハロゲンであって;
R1、R2、R3、R4およびR6は、それぞれ独立に、水素、フッ素、必要に応じて置換された低級アルキル、必要に応じて置換されたシクロアルキル、必要に応じて置換された低級アルケニル、必要に応じて置換されたアリール、必要に応じて置換されたアリールアルキル、アミノ、必要に応じて置換された低級アルキルアミノ、必要に応じて置換されたシクロアルキルアミノ、必要に応じて置換された低級アルコキシ、必要に応じて置換されたシクロアルコキシ、および必要に応じて置換されたアリールオキシ、必要に応じて置換されたアリールアルコキシからなる群から選択され;そして、
R5は、必要に応じて置換された低級アルキル、必要に応じて置換されたシクロアルキル、必要に応じて置換されたアリール、および必要に応じて置換されたアリールアルキルからなる群から選択され;そして
Nuは、−CN、−N3および−ONOからなる群から選択される、
方法。 - 請求項36に記載の方法であって、ここで、
(1)前記4−ハロ−3−ヒドロキシ酪酸エステルまたは前記4−ハロ−3−ヒドロキシ酪酸アミドが、構造:
(2)前記4−求核剤置換−3−ヒドロキシ酪酸エステルまたはアミドが、構造:
Xは、塩素、臭素およびヨウ素からなる群から選択されるハロゲンであって;
R1、R2、R3、R4およびR6は、それぞれ独立に、水素、フッ素、必要に応じて置換された低級アルキル、必要に応じて置換されたシクロアルキル、必要に応じて置換された低級アルケニル、必要に応じて置換されたアリール、必要に応じて置換されたアリールアルキル、アミノ、必要に応じて置換された低級アルキルアミノ、必要に応じて置換されたシクロアルキルアミノ、必要に応じて置換された低級アルコキシ、必要に応じて置換されたシクロアルコキシ、必要に応じて置換されたアリールオキシ、および必要に応じて置換されたアリールアルコキシからなる群から選択され;そして、
R7およびR8は、それぞれ独立に、水素、必要に応じて置換された低級アルキル、必要に応じて置換されたシクロアルキル、必要に応じて置換されたアリール、および必要に応じて置換されたアリールアルキルからなる群から選択され;そして
Nuは、−CN、−N3および−ONOからなる群から選択される、
方法。 - 請求項36に記載の方法であって、工程(a)が、
4−ハロ−3−ケト酪酸エステルまたは4−ハロ−3−ケト酪酸アミドを供給する工程であって、
ここで、前記ハロ置換基が、塩素、臭素およびヨウ素からなる群から選択される、工程;そして、
該4−ハロ−3−ケト酪酸エステルまたはアミドを前記4−ハロ−3−ヒドロキシ酪酸エステルまたは前記4−ハロ−3−ヒドロキシ酪酸アミドに変換するための反応混合物を形成するために適した条件下で、4−ハロ−3−ケト酪酸エステルまたはアミドを、ケトレダクターゼ、補因子、および補因子再生系と接触させる工程、
を包含する、方法。 - 4−求核剤置換−3−ヒドロキシ酪酸エステルまたはアミドを生成するための方法であって、該方法は、以下:
(a)4−ハロ−3−ケト酪酸エステルまたは4−ハロ−3−ケト酪酸アミドを供給する工程であって、
ここで、ハロ置換基が、塩素、臭素およびヨウ素からなる群から選択される、工程;および
(b)該4−ハロ−3−ケト酪酸エステルまたは該4−ハロ−3−ケト酪酸アミドを4−求核剤置換−3−ヒドロキシ酪酸エステルまたは4−求核剤置換−3−ヒドロキシ酪酸アミドに変換するための反応混合物を形成するために、4−ハロ−3−ケト酪酸エステルまたは4−ハロ−3−ケト酪酸アミドを、ケトレダクターゼ、補因子、補因子再生系、求核試薬およびハロヒドリンデハロゲナーゼと接触させる工程、
を包含する、方法。 - 組成物であって、以下:
(a)ハロヒドリンデハロゲナーゼ;
(b)求核試薬;および
(c)4−ハロ−3−ヒドロキシ酪酸エステルまたは4−ハロ−3−ヒドロキシ酪酸アミド
を含有する、組成物。 - 求核試薬がシアニドである、請求項41に記載の組成物。
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WO2011066076A1 (en) | 2009-11-25 | 2011-06-03 | Genomatica, Inc. | Microorganisms and methods for the coproduction of 1,4-butanediol and gamma-butyrolactone |
US9080192B2 (en) | 2010-02-10 | 2015-07-14 | Codexis, Inc. | Processes using amino acid dehydrogenases and ketoreductase-based cofactor regenerating system |
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US8420364B2 (en) | 2010-06-30 | 2013-04-16 | Codexis, Inc. | Highly stable beta-class carbonic anhydrases useful in carbon capture systems |
CN102168117B (zh) * | 2011-01-12 | 2014-05-07 | 江苏阿尔法药业有限公司 | 一种制备(r)-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯的方法 |
JP5705580B2 (ja) | 2011-02-21 | 2015-04-22 | 公益財団法人微生物化学研究会 | チオアミド化合物、チオアミド化合物の製造方法、[(4r,6r)−6−アミノエチル−1,3−ジオキサン−4−イル]アセテート誘導体の製造方法、及びアトルバスタチンの製造方法 |
CN102676597A (zh) * | 2011-03-16 | 2012-09-19 | 苏州国镝医药科技有限公司 | 生物酶手性合成立普妥中间体ats-5 |
CN104685058B (zh) | 2012-06-04 | 2020-07-07 | 基因组股份公司 | 制造4-羟基丁酸酯、1,4-丁二醇和相关化合物的微生物和方法 |
CN103695486A (zh) * | 2014-01-03 | 2014-04-02 | 黄冈华阳药业有限公司 | 一种(3r,5r)-6-氰基-3,5-二羟基己酸叔丁酯的生物制备方法 |
CN105368886A (zh) * | 2015-12-11 | 2016-03-02 | 江苏万年长药业有限公司 | 一种树脂固定卤醇脱卤酶催化合成(r)-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯的工艺 |
CN109439700A (zh) * | 2018-11-09 | 2019-03-08 | 浙江宏元药业股份有限公司 | 一种脱卤酶高效催化合成他汀类药物中间体的方法 |
CN111876448A (zh) * | 2020-08-03 | 2020-11-03 | 连云港宏业化工有限公司 | 4-氰基-3-羟基丁酸乙酯合成方法 |
Citations (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH0353889A (ja) * | 1989-07-20 | 1991-03-07 | Nitto Chem Ind Co Ltd | 4‐ハロ‐3‐ヒドロキシブチロニトリルの製造法 |
JPH0767674A (ja) * | 1982-12-06 | 1995-03-14 | Sigma Tau Ind Farmaceut Riunite Spa | 光学活性γ−置換β−ヒドロキシ酪酸誘導体 |
WO2001090397A1 (en) * | 2000-05-25 | 2001-11-29 | Rijksuniversiteit Groningen | Enzymatic conversion of epoxides |
JP2001335554A (ja) * | 2000-05-30 | 2001-12-04 | Mitsubishi Chemicals Corp | (r)−4−シアノ−3−ヒドロキシ酪酸低級アルキルエステルの製造方法 |
JP2002030060A (ja) * | 1991-10-11 | 2002-01-29 | Warner Lambert Co | 4−シアノ−3−ヒドロキシ酪酸エステルの製造方法 |
JP2002201169A (ja) * | 2000-10-31 | 2002-07-16 | Sumitomo Chem Co Ltd | 4−シアノ−3−オキソブタン酸エステルの製造法 |
JP2002209592A (ja) * | 2001-01-22 | 2002-07-30 | Daicel Chem Ind Ltd | (s)−4−ハロ−3−ヒドロキシ酪酸エステルの製造に有用な酵素をコードする遺伝子、その取得方法、およびこれを利用した光学活性アルコールの製造方法 |
JP2002536356A (ja) * | 1999-02-03 | 2002-10-29 | サムソン ファイン ケミカルズ カンパニー リミテッド | (r)−4−シアノ−3−ヒドロキシ酪酸エステルの製造方法 |
Family Cites Families (39)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE3019450A1 (de) * | 1980-05-21 | 1981-11-26 | Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim | Verfahren zur gewinnung von glucosedehydrogenase und hierfuer geeigneter mikroorganismus |
US4542098A (en) * | 1983-05-06 | 1985-09-17 | Institut Francais Du Petrole | Production of glucose dehydrogenase and use of the resultant enzyme in the enzymatic synthesis of L-carnitine |
US4710468A (en) * | 1983-10-24 | 1987-12-01 | Sigma-Tau Industrie Pharmaceutiche Riunite S.P.A. | Process for preparing L-carnitine and chemical intermediates employed therein |
US4877733A (en) * | 1986-05-02 | 1989-10-31 | Toyo Jozo Kabushiki Kaisha | Glucose dehydrogenase and its production |
DE3711881A1 (de) * | 1987-04-08 | 1988-10-27 | Merck Patent Gmbh | Verfahren zur herstellung von glucosedehydrogenase aus bacillus megaterium |
US5250415A (en) * | 1987-04-08 | 1993-10-05 | Merck Patent Gesellschaft Mit Beschrankter Haftung | Process for the preparation of glucose dehydrogenase from Bacillus megaterium |
JPH0286779A (ja) * | 1988-09-22 | 1990-03-27 | Amano Pharmaceut Co Ltd | 改良型組換えdna、それを含む形質転換体及びそれを用いた耐熱性グルコースデヒドロゲナーゼの製造法 |
JP2742281B2 (ja) * | 1988-12-29 | 1998-04-22 | 旭化成工業株式会社 | グルコース―6―リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子 |
US5210031A (en) * | 1989-07-20 | 1993-05-11 | Nitto Chemical Industry Co., Ltd. | Process for the production of R(-)-4-halo-3-hydroxybutyronitrile |
JP2850515B2 (ja) * | 1990-09-25 | 1999-01-27 | 東洋紡績株式会社 | グルコースデヒドロゲナーゼおよびその製造法 |
US5244796A (en) * | 1990-10-12 | 1993-09-14 | Syracuse University | Cloned leuconostoc mesenteroides glucose-6-phosphate dehydrogenase genes and method of making glucose-6-phospate dehydrogenase |
US5385833A (en) * | 1992-02-26 | 1995-01-31 | The Scripps Research Institute | Pseudomonas sp. ATCC No. 49794 alcohol dehydrogenase |
CA2117482C (en) * | 1992-03-13 | 2005-02-15 | Maria-Regina Kula | New ketonic ester reductases, its preparation and use for enzymatic redox reactions |
US5413921A (en) * | 1992-05-28 | 1995-05-09 | Ajinomoto Co., Ltd. | Method of the production of (s)-gamma-halogenated-γ-hydroxybutyric acid esters |
JP3171931B2 (ja) * | 1992-06-02 | 2001-06-04 | 高砂香料工業株式会社 | (R)−(−)−4−シアノ−3−ヒドロキシ酪酸t−ブチルエステル及びその製造方法 |
JP3155107B2 (ja) * | 1993-01-12 | 2001-04-09 | ダイセル化学工業株式会社 | 光学活性4−ハロ−3−ヒドロキシ酪酸エステルの製造方法 |
JPH08336393A (ja) * | 1995-04-13 | 1996-12-24 | Mitsubishi Chem Corp | 光学活性なγ−置換−β−ヒドロキシ酪酸エステルの製造法 |
GB9512837D0 (en) * | 1995-06-23 | 1995-08-23 | Zeneca Ltd | reduction of ketone groups |
US5891685A (en) * | 1996-06-03 | 1999-04-06 | Mitsubishi Chemical Corporation | Method for producing ester of (S)-γ-halogenated-β-hydroxybutyric acid |
US5908953A (en) * | 1996-12-18 | 1999-06-01 | Mitsubishi Chemical Corporation | Method for producing (R)-4-cyano-3-hydroxybutyric acid lower alkyl ester |
CZ298236B6 (cs) * | 1997-02-07 | 2007-08-01 | Kaneka Corporation | Nová karbonylová reduktasa, gen, který ji kóduje a zpusob pro pouzití této reduktasy a genu |
US6531308B2 (en) * | 1997-11-04 | 2003-03-11 | Eli Lilly And Company | Ketoreductase gene and protein from yeast |
JPH11171850A (ja) | 1997-12-12 | 1999-06-29 | Kanegafuchi Chem Ind Co Ltd | 酪酸エステル誘導体の製造方法 |
KR100681366B1 (ko) * | 1997-12-19 | 2007-02-12 | 워너-램버트 익스포트 리미티드 | 1,3-디올의 합성방법 |
JPH11187869A (ja) * | 1997-12-25 | 1999-07-13 | Daicel Chem Ind Ltd | 新規な4−ハロアセト酢酸エステル還元酵素、該酵素の製造方法、及び該酵素を利用したアルコールの製造方法 |
JP4012299B2 (ja) * | 1998-02-25 | 2007-11-21 | ダイセル化学工業株式会社 | ハロゲン置換を含む光学活性アルコールの製造方法 |
CA2329893A1 (en) * | 1998-04-30 | 1999-11-11 | Kaneka Corporation | Process for producing 6-cyanomethyl-1,3-dioxane-4-acetic acid derivatives |
JP3803551B2 (ja) * | 1998-08-05 | 2006-08-02 | 株式会社カネカ | 光学活性2−[6−(ヒドロキシメチル)−1,3−ジオキサン−4−イル]酢酸誘導体の製造法 |
JP2000236883A (ja) * | 1998-12-21 | 2000-09-05 | Daicel Chem Ind Ltd | 新規なカルボニル還元酵素、該酵素の製造方法、該酵素をコードするdnaおよびこれを利用したアルコールの製造方法 |
WO2001004336A1 (de) * | 1999-07-09 | 2001-01-18 | Forschungszentrum Jülich GmbH | Verfahren zur reduktion von keto-carbonsäuren und deren estern |
US6645746B1 (en) * | 1999-12-03 | 2003-11-11 | Kaneka Corporation | Carbonyl reductase, gene thereof and method of using the same |
DE60105734T2 (de) * | 2000-10-31 | 2006-02-16 | Sumitomo Chemical Co. Ltd. | Verfahren zur Herstellung von 4-Cyano-4-Oxobuttersäureester und 4-Cyano-3-Hydroxybuttersäureester |
MXPA03011813A (es) | 2001-07-02 | 2004-07-01 | Kaneka Corp | Metodo para la modificacion de enzimas y variantes de oxido reductasa. |
DE60336324D1 (de) | 2002-08-09 | 2011-04-21 | Codexis Inc | Enzymatische verfahren zur herstellung 4-substituierter 3-hydroxybuttersäure-derivate |
KR20060071397A (ko) | 2003-08-11 | 2006-06-26 | 코덱시스, 인코포레이티드 | 4-치환된 3-히드록시부티르산 유도체 및 이웃자리 시아노,히드록시 치환된 카르복실산 에스테르의 효소적 제조 방법 |
US7824898B2 (en) | 2003-08-11 | 2010-11-02 | Codexis, Inc. | Halohydrin dehalogenases and related polynucleotides |
KR20060064620A (ko) * | 2003-08-11 | 2006-06-13 | 코덱시스, 인코포레이티드 | 개선된 글루코스 데히드로게나제 폴리펩티드 및 관련폴리뉴클레오티드 |
US7541171B2 (en) * | 2003-08-11 | 2009-06-02 | Codexis, Inc. | Halohydrin dehalogenases and related polynucleotides |
CA2533838A1 (en) | 2003-08-11 | 2005-02-24 | Codexis, Inc. | Improved ketoreductase polypeptides and related polynucleotides |
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Patent Citations (8)
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JPH0767674A (ja) * | 1982-12-06 | 1995-03-14 | Sigma Tau Ind Farmaceut Riunite Spa | 光学活性γ−置換β−ヒドロキシ酪酸誘導体 |
JPH0353889A (ja) * | 1989-07-20 | 1991-03-07 | Nitto Chem Ind Co Ltd | 4‐ハロ‐3‐ヒドロキシブチロニトリルの製造法 |
JP2002030060A (ja) * | 1991-10-11 | 2002-01-29 | Warner Lambert Co | 4−シアノ−3−ヒドロキシ酪酸エステルの製造方法 |
JP2002536356A (ja) * | 1999-02-03 | 2002-10-29 | サムソン ファイン ケミカルズ カンパニー リミテッド | (r)−4−シアノ−3−ヒドロキシ酪酸エステルの製造方法 |
WO2001090397A1 (en) * | 2000-05-25 | 2001-11-29 | Rijksuniversiteit Groningen | Enzymatic conversion of epoxides |
JP2001335554A (ja) * | 2000-05-30 | 2001-12-04 | Mitsubishi Chemicals Corp | (r)−4−シアノ−3−ヒドロキシ酪酸低級アルキルエステルの製造方法 |
JP2002201169A (ja) * | 2000-10-31 | 2002-07-16 | Sumitomo Chem Co Ltd | 4−シアノ−3−オキソブタン酸エステルの製造法 |
JP2002209592A (ja) * | 2001-01-22 | 2002-07-30 | Daicel Chem Ind Ltd | (s)−4−ハロ−3−ヒドロキシ酪酸エステルの製造に有用な酵素をコードする遺伝子、その取得方法、およびこれを利用した光学活性アルコールの製造方法 |
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