CN109439700A - 一种脱卤酶高效催化合成他汀类药物中间体的方法 - Google Patents

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况洪福
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Abstract

本发明公开了一种脱卤酶高效催化合成他汀类药物中间体的方法，属于生物催化技术领域。该方法步骤为：在卤代醇脱卤酶发酵液中加入水，匀浆，将获得的新鲜卤代醇脱卤酶酶液置于水浴中；加入底物(3R，5S)6‑氯‑3，5‑二羟基己酸叔丁酯和阴离子交换树脂，搅拌，反应过程中采用NaCN水溶液自动滴定反应液，控制反应过程中体系pH为8.0。本发明方法简单，采用本发明方法合成他汀类药物中间体A7的应时间大大缩短，D3和A7在反应过程中的水解损失大大降低，D3的转化速率和A7的收率显著提高。

Description

一种脱卤酶高效催化合成他汀类药物中间体的方法
技术领域
本发明涉及一种催化合成他汀类药物中间体的方法，具体涉及一种脱卤酶高效催化合成他汀类药物中间体的方法，属于生物催化技术领域。
背景技术
心脑血管疾病是一种严重威胁人类，具有高患病率、高致残率和高死亡率的特点，全世界每年死于心脑血管疾病的人数高达1500万人，居各种死因首位。 2015年国内调血脂类药物总体市场已超过200亿元人民币，他汀类药物独占鳌头，国内他汀药物终端零售价市场达到了151.43亿元的规模，占整个降血脂用药市场近80％。其中，他汀类药物上市近20年的临床证明，药物安全性高、不良反应小，在降低LDL胆固醇治疗方面优于其它他汀类药物。2015年，中国他汀类药物总体市场达到了83.19亿元，同比上一年增长了7.97％，并仍呈现逐年上涨的趋势。
他汀类药物分子结构，如下化学式所示，主要分为两部分，即多苯环取代的丁酰胺结构(M4主环)和手性3,5-顺式二羟基庚酸结构(侧链)。
传统他汀类药物的合成工艺为：首先合成他汀侧链A8，合成路线如下，以 R-4-氯-3-羟基丁腈(A3)为底物经过盐酸乙醇水解并酯化制得S-4-氯-3-羟基丁酸乙酯(A4)，再通过氰化钠取代得到R-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯(A5)，随后在-70℃的超低温条件下经克莱森缩合得到A6，后经过酶催化还原制得(3R,5R)6- 腈基-3,5-二羟基己酸叔丁酯(A7)，再对两个羟基进行保护得到A8；然后将A8 与M4主环物质经过两步化学反应合成阿托伐他汀，进而实现多种他汀类药物的工业化生产。他汀侧链A8的合成工艺存在下述弊端：(1)路线中的A3到A5 收率低，尤其是A5，由于A5不稳定，在精馏过程中易分解导致分离，收率很低；(2)A6的合成需采用正丁基锂，金属锂非常昂贵，价格高达800元/公斤，且丁基锂危险性非常高，必须深冷降温，液氮属于高能耗原料，不利于环保，另外为了回收贵金属锂和二异丙胺，需要大量设备配套支撑，同时在回收过程中产生大量固废，大幅度增加三废处置难度和成本；(3)A6反应收率偏低，对于后面A8成本影响非常大，且品质受到局限。
随着市场竞争的日益加剧以及企业社会责任的落实，阿托伐他丁的生产技术亟需改进和创新，一方面需减少工业生产对环境资源的破坏及能源的浪费，另一方面可降低企业成本和患者用药成本，以提升整个行业的经济效益和社会效益。采用生物催化技术升级他汀类药物药物关鍵中间体合成技术，能够建立节能、绿色、高效的新生产工艺。其中，卤代醇脱卤酶具有一步转化法替代高能耗和高溶剂用量的化学合成步骤，具备高效催化的特性，通过卤代醇脱卤酶脱卤后，可加上CN-、N3-、NO2-、OCN-、SCN-、HCOO-等基团，适用于建立低能耗、低成本和环保的他汀类药物侧链合成新工艺。
早期人们对卤代醇脱卤酶的研究主要针对其催化的脱卤反应，产物往往是手性醇。1994年开始报道采用卤代醇脱卤酶对1,3-二氯-2-丙醇进行脱氯和氰化，制备(R)-γ-氯-β-羟基丁腈。如今，通过卤代醇脱卤酶，脱卤后，可加上CN-、N3-、 NO2-、OCN-、SCN-、HCOO-等基团。卤代醇脱卤酶的氰化反应的底物谱和反应活性也不断提高，其中催化他汀侧链化合物生物法氰化的底物谱包括：1,3-二氯 -2-丙醇、4-氯-3-羟基丁腈、4-氯-3-羟基丁酸乙酯、D3。例如国内已有的两个相关专利，即ZL2014103144781和ZL2015100665777，将卤代醇脱卤酶应用于他汀侧链化合物的生物转化。专利ZL2014103144781保护一株大肠杆菌工程菌株，该菌株表达来源于Agrobacterium radiobacter AD1的HheC改进型的HHDH卤代醇脱卤酶，用于一步法生物催化生产A7，使用该工程菌，加入底物(10mM) 时，8h内，最高底物转化率大于99％，达到理论产率的94％以上。专利 ZL2015100665777保护一株大肠杆菌工程菌及其生物催化制备(3R,5R)6-氰基 -3,5-二羟基己酸叔丁酯的工艺。该工程菌株，生产来自Arthrobacter sp.AD2的卤代醇脱卤酶HheA，利用该菌株添加10mM的底物D3，18h，结合乙酸乙酯的萃取，最高底物转化率大于99％，达到理论产率的84％以上。由于使用现有的卤代醇脱卤酶，其底物添加浓度有限，德国布伦瑞克工业大学Schallmey课题组在2016年报道了从基因组数据库挖掘的17种代表性的卤代醇脱卤酶基因，重组表达后比较分析不同酶的活性、立体选择性和稳定性等催化特性，结果表明一些酶较目前使用最多的HheC具有更好的温度耐受性或具备更高的活性，这些酶具有很好的工业应用前景。
但是，在实际生产过程中，D3生物催化转化成A7的反应时间大于8小时，这期间D3和A7的水解率高达15％，存在D3到A7的反应时间过长，反应过程中D3和A7水解严重，D3的转化速率和A7的产率低的问题，中国专利申请 CN105567655A公开了一种卤醇脱卤酶及其在合成他汀类药物中间体中的应用，该文件虽然通过对卤醇脱卤酶进行重组，在一定程度上提高了收率，但是并未有专利公开解决D3和A7在生物催化过程中的水解问题。因此，如何有效缩短反应时间，降低D3和A7在生物催化过程中的水解程度，从而提高D3的转化速率和A7的收率，对他汀类药物中间体A7的生物催化具有重要意义。
发明内容
针对现有技术中的问题，本发明提供一种脱卤酶高效催化合成他汀类药物中间体的方法，采用本发明方法合成他汀类药物中间体A7反应时间大大缩短，D3 和A7在反应过程中的水解损失大大降低，D3的转化速率和A7的收率显著提高。
为实现以上技术目的，本发明的技术方案是：
一种脱卤酶高效催化合成他汀类药物中间体的方法，步骤为：在卤代醇脱卤酶发酵液中加入水，匀浆，将获得的新鲜卤代醇脱卤酶酶液置于15～45℃的水浴中；加入对新鲜的卤代醇脱卤酶酶液质量浓度为80～120g/L的底物(3R,5S)6- 氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯和对新鲜的卤代醇脱卤酶酶液质量浓度为50～150g/L 的阴离子交换树脂，搅拌，反应过程中采用10wt.％NaCN水溶液自动滴定反应液，控制反应过程中体系pH为8.0。
优选地，所述树脂为XRD368。
进一步优选地，所述树脂的质量浓度为80～100g/L。
优选地，所述水浴温度为40℃。
优选地，所述卤代醇脱卤酶发酵液与蒸馏水的体积比为1:3。
本发明的有益效果在于：
本发明在反应体系中加入阴离子交换树脂，利用树脂快速吸附反应过程中产生的氯离子，可以解除氯离子对反应的抑制作用，加快反应速度，缩短反应时间，从而减少反应过程中D3和A7的水解损失，提高了D3的转化速率和A7的收率。
附图说明
图1为本发明方法的合成路线图；
图2为实施例3反应过程中D3、A7的色谱峰；
具体实施方式
下面通过实施例子，进一步阐述本发明的特点，但不对本发明的权利要求做任何限定。
实施例1：
卤代醇脱卤酶发酵液的制备：根据已公开申请的专利(申请号CN 201810133923.2)，制备卤代醇脱卤酶发酵液，其细胞密度为100g/L，脱卤酶的酶活为160U/mL(酶活定义及酶活测定方法，见申请号CN 201810133923.2 的专利)。
取10ml上述制备的卤代醇脱卤酶发酵液，加入蒸馏水30ml，200Mpa高压下匀浆，获得新鲜的卤代醇脱卤酶酶液，将其置于40℃水浴中；安装搅拌装置和pH自动控制装置；加入4g底物D3((3R,5S)6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯)、 2g树脂XRD368，采用10wt％NaCN水溶液进行自动滴定反应液，控制反应过程中体系pH 8.0；反应过程中取样，将取得的样品处理后用于气相色谱分析。 D3转化95％所需的时间及A7的产率如表1所示。
样品处理方法：取样品100μL，加入到1.0mL的乙酸乙酯中；充分震荡后， 10000×g离心1min；取上清100μL，加入到900μL的乙酸乙酯中。
气相色谱分析方法：毛细管色谱柱：DB1701 30m×0.53mm×1.5μm；柱温： 100℃以20℃/min升温至200℃，保温5min；进样口温度：140℃；检测器温度：260℃；载气(N2):5ml/min；分流比：20:1；进样量：1μl；空白溶液：乙酸乙酯。
实施例2：
按实施例1所述方法制备卤代醇脱卤酶发酵液；
取10ml卤代醇脱卤酶发酵液，加入蒸馏水30ml，200Mpa高压下匀浆，获得新鲜的卤代醇脱卤酶酶液，将其置于40℃水浴中；安装搅拌装置和pH自动控制装置；加入4g底物D3、3.2g树脂XRD368，采用10wt％NaCN水溶液进行自动滴定反应液，控制反应过程中体系pH8.0；反应过程中取样，将取得的样品处理后用于气相色谱分析，样品处理方法和气相色谱分析方法与实施例1相同。D3转化95％所需的时间及A7的产率如表1所示。
实施例3：
按实施例1所述方法制备卤代醇脱卤酶发酵液；
取10ml卤代醇脱卤酶发酵液，加入蒸馏水30ml，200Mpa高压下匀浆，获得新鲜的卤代醇脱卤酶酶液，将其置于40℃水浴中；安装搅拌装置和pH自动控制装置；加入4g底物D3、4g树脂XRD368，采用10wt％NaCN水溶液进行自动滴定反应液，控制反应过程中体系pH 8.0；反应过程中取样，将取得的样品处理后用于气相色谱分析，样品处理方法和气相色谱分析方法与实施例1相同。 D3转化95％所需的时间及A7的产率如表1所示。
实施例4：
按实施例1所述方法制备卤代醇脱卤酶发酵液；
取10ml卤代醇脱卤酶发酵液，加入蒸馏水30ml，200Mpa高压下匀浆，获得新鲜的卤代醇脱卤酶酶液，将其置于40℃水浴中；安装搅拌装置和pH自动控制装置；加入4g底物D3、6g树脂XRD368，采用10wt％NaCN水溶液进行自动滴定反应液，控制反应过程中体系pH 8.0；反应过程中取样，将取得的样品处理后用于气相色谱分析，样品处理方法和气相色谱分析方法与实施例1相同。 D3转化95％所需的时间及A7的产率如表1所示。
实施例5：
按实施例1所述方法制备卤代醇脱卤酶发酵液；
取10ml卤代醇脱卤酶发酵液，加入蒸馏水30ml，200Mpa高压下匀浆，获得新鲜的卤代醇脱卤酶酶液，将其置于15℃水浴中；安装搅拌装置和pH自动控制装置；加入4g底物D3、4g树脂XRD368，采用10wt％NaCN水溶液进行自动滴定反应液，控制反应过程中体系pH 8.0；反应过程中取样，将取得的样品处理后用于气相色谱分析，样品处理方法和气相色谱分析方法与实施例1相同。 D3转化95％所需的时间及A7的产率如表1所示。
实施例6：
按实施例1所述方法制备卤代醇脱卤酶发酵液；
取10ml卤代醇脱卤酶发酵液，加入蒸馏水30ml，200Mpa高压下匀浆，获得新鲜的卤代醇脱卤酶酶液，将其置于25℃水浴中；安装搅拌装置和pH自动控制装置；加入4g底物D3、4g树脂XRD368，采用10wt％NaCN水溶液进行自动滴定反应液，控制反应过程中体系pH 8.0；反应过程中取样，将取得的样品处理后用于气相色谱分析，样品处理方法和气相色谱分析方法与实施例1相同。 D3转化95％所需的时间及A7的产率如表1所示。
实施例7：
按实施例1所述方法制备卤代醇脱卤酶发酵液；
取10ml卤代醇脱卤酶发酵液，加入蒸馏水30ml，200Mpa高压下匀浆，获得新鲜的卤代醇脱卤酶酶液，将其置于45℃水浴中；安装搅拌装置和pH自动控制装置；加入4g底物D3、4g树脂XRD368，采用10wt％NaCN水溶液进行自动滴定反应液，控制反应过程中体系pH 8.0；反应过程中取样，将取得的样品处理后用于气相色谱分析，样品处理方法和气相色谱分析方法与实施例1相同。 D3转化95％所需的时间及A7的产率如表1所示。
实施例8：
按实施例1所述方法制备卤代醇脱卤酶发酵液；
取10ml卤代醇脱卤酶发酵液，加入蒸馏水30ml，200Mpa高压下匀浆，获得新鲜的卤代醇脱卤酶酶液，将其置于40℃水浴中；安装搅拌装置和pH自动控制装置；加入4g底物D3和4g树脂XR303，采用10wt％NaCN水溶液进行自动滴定反应液，控制反应过程中体系pH 8.0；反应过程中取样，将取得的样品处理后用于气相色谱分析，样品处理方法和气相色谱分析方法与实施例1相同。 D3转化95％所需的时间及A7的产率如表1所示。
实施例9：
按实施例1所述方法制备卤代醇脱卤酶发酵液；
取10ml卤代醇脱卤酶发酵液，加入蒸馏水30ml，200Mpa高压下匀浆，获得新鲜的卤代醇脱卤酶酶液，将其置于40℃水浴中；安装搅拌装置和pH自动控制装置；加入4g底物D3和4g树脂XR218，采用10wt％NaCN水溶液进行自动滴定反应液，控制反应过程中体系pH 8.0；反应过程中取样，将取得的样品处理后用于气相色谱分析，样品处理方法和气相色谱分析方法与实施例1相同。 D3转化95％所需的时间及A7的产率如表1所示。
实施例10：
按实施例1所述方法制备卤代醇脱卤酶发酵液；
取10ml卤代醇脱卤酶发酵液，加入蒸馏水30ml，200Mpa高压下匀浆，获得新鲜的卤代醇脱卤酶酶液，将其置于40℃水浴中；安装搅拌装置和pH自动控制装置；加入4g底物D3和4g树脂XRD366，采用10wt％NaCN水溶液进行自动滴定反应液，控制反应过程中体系pH 8.0；反应过程中取样，将取得的样品处理后用于气相色谱分析，样品处理方法和气相色谱分析方法与实施例1相同。D3转化95％所需的时间及A7的产率如表1所示。
实施例11：
按实施例1所述方法制备卤代醇脱卤酶发酵液；
取10ml卤代醇脱卤酶发酵液，加入蒸馏水30ml，200Mpa高压下匀浆，获得新鲜的卤代醇脱卤酶酶液，将其置于40℃水浴中；安装搅拌装置和pH自动控制装置；加入3.2g底物D3和4g树脂XRD368，采用10wt％NaCN水溶液进行自动滴定反应液，控制反应过程中体系pH8.0；反应过程中取样，将取得的样品处理后用于气相色谱分析，样品处理方法和气相色谱分析方法与实施例1相同。D3转化95％所需的时间及A7的产率如表1所示。
实施例12：
按实施例1所述方法制备卤代醇脱卤酶发酵液；
取10ml卤代醇脱卤酶发酵液，加入蒸馏水30ml，200Mpa高压下匀浆，获得新鲜的卤代醇脱卤酶酶液，将其置于40℃水浴中；安装搅拌装置和pH自动控制装置；加入4.8g底物D3和4g树脂XRD368，采用10wt％NaCN水溶液进行自动滴定反应液，控制反应过程中体系pH8.0；反应过程中取样，将取得的样品处理后用于气相色谱分析，样品处理方法和气相色谱分析方法与实施例1相同。D3转化95％所需的时间及A7的产率如表1所示。
对比例1：
按实施例1所述方法制备卤代醇脱卤酶发酵液；
取10ml卤代醇脱卤酶发酵液，加入蒸馏水30ml，200Mpa高压下匀浆，获得新鲜的卤代醇脱卤酶酶液，将其置于40℃水浴中；安装搅拌装置和pH自动控制装置；加入4g底物D3，采用10wt％NaCN水溶液进行自动滴定反应液，控制反应过程中体系pH 8.0；反应过程中取样，将取得的样品处理后用于气相色谱分析，样品处理方法和气相色谱分析方法与实施例1相同。D3转化95％所需的时间及A7的产率如表1所示。
表1
其中，A7的产率(％)＝(A7的质量/229)/(D3的质量/238)*100
由表1可以看出本发明方法可以缩短D3催化转化为A7的反应时间，减少反应过程中D3和A7的水解损失，提高D3的转化速率和A7的收率。尤其是当采用质量浓度为100g/L(对新鲜的卤代醇脱卤酶酶液)的XRD368树脂在40℃和 pH 8.0条件下与脱卤酶共同催化100g/L(对新鲜的卤代醇脱卤酶酶液)D3转化为 A7时，催化速率大大提高，催化时间大大缩短，由7.8h缩短到3.5h，反应过程中D3和A7的水解损失大大减小，A7的产量由3.5g增加到3.8g，产率由90.9％增大到98.7％。
可以理解的是，以上关于本发明的具体描述，仅用于说明本发明而并非受限于本发明实施例所描述的技术方案。本领域的普通技术人员应当理解，仍然可以对本发明进行修改或等同替换，以达到相同的技术效果；只要满足使用需要，都在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种脱卤酶高效催化合成他汀类药物中间体的方法，其特征在于，步骤为：在卤代醇脱卤酶发酵液中加入水，匀浆，将获得的新鲜卤代醇脱卤酶酶液置于15～45℃的水浴中；加入对新鲜的卤代醇脱卤酶酶液质量浓度为80～120g/L的底物(3R，5S)6-氯-3，5-二羟基己酸叔丁酯和对新鲜的卤代醇脱卤酶酶液质量浓度为50～150g/L的阴离子交换树脂，搅拌，反应过程中采用10wt.％NaCN水溶液自动滴定反应液，控制反应过程中体系pH为8.0。
2.如权利要求1所述的一种脱卤酶高效催化合成他汀类药物中间体的方法，其特征在于，所述树脂为XRD368。
3.如权利要求2所述的一种脱卤酶高效催化合成他汀类药物中间体的方法，其特征在于，所述树脂的质量浓度为80～100g/L。
4.如权利要求1所述的一种脱卤酶高效催化合成他汀类药物中间体的方法，其特征在于，所述水浴温度为40℃。
5.如权利要求1所述的一种脱卤酶高效催化合成他汀类药物中间体的方法，其特征在于，所述卤代醇脱卤酶发酵液与蒸馏水的体积比为1∶3。
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