JP2005519055A - ポリフェノール類を含む栄養医薬製剤および癌の治療におけるその使用方法（関連出願の説明）本願は、２００２年１月１１日に出願された米国仮特許出願第６０／３４８，１４３号の、米国特許法第１１９条（ｅ）に基づく利益を主張し、その内容は参照によりそのまま本明細書に組み込まれるものとする。 - Google Patents

ポリフェノール類を含む栄養医薬製剤および癌の治療におけるその使用方法（関連出願の説明）本願は、２００２年１月１１日に出願された米国仮特許出願第６０／３４８，１４３号の、米国特許法第１１９条（ｅ）に基づく利益を主張し、その内容は参照によりそのまま本明細書に組み込まれるものとする。 Download PDF

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Abstract

アスコルビン酸、Ｌ−リジン、Ｌ−プロリン、ならびにエピガロカテキンガレート、エピカテキンガレート、エピガロカテキン、エピカテキン、カテキンからなる群より選ばれる少なくとも１つのポリフェノール化合物を含む栄養医薬製剤組成物と、癌および他の腫瘍の治療におけるその使用を提供する。ＥＰＩＣＡＮ ＦＯＲＴＥ（商標）の栄養医薬製剤組成物および癌の予防および治療におけるその使用方法を開示する。

Description

本発明は、栄養医薬製剤ならびに癌の治療におけるその使用方法に関する。具体的に述べると、本発明は、癌の治療に有効な量のポリフェノール類を含むポリフェノール含有医薬製剤に関する。本発明の製剤は、アスコルビン酸、リジン、プロリン、ならびにエピガロカテキンガレート、エピカテキンガレート、エピガロカテキン、エピカテキンおよびカテキンからなる群より選ばれる少なくとも１つのポリフェノール化合物を含み、癌の予防剤および治療剤として使用される。
癌は工業国における主な死因の１つである。癌には特異的原因療法がなく、癌による死亡率は、すべての疾患のなかで最も高い部類に入る。最も広く用いられている治療、すなわち化学療法と放射線療法は、健常組織と癌とを区別せず、重篤な副作用を伴う。したがって、癌の選択的な治療方法が必要とされている。
癌細胞が体内で拡大し転移するために用いる基本的機序の１つには、周囲結合組織の酵素的破壊が含まれる。特異的薬物を使ってこの過程を抑制しようとする治療アプローチは成功しておらず、今のところ、癌転移を抑制するために利用できる手段はない。化学療法および放射線療法による最新の治療プロトコールは、体内での癌細胞破壊に的が絞られており、転移には対処していない。さらに、これらの治療には毒性があり、特異的ではなく、重篤な副作用を伴う。化学療法および放射線療法は新しい癌が発生する危険を伴い、体内の結合組織を破壊することにより、癌の浸潤を促進する場合もある。
癌細胞は、成長し身体の他の部分に拡大するために、さまざまなマトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）とプラスミンを使って細胞外マトリックスを分解し、それらの酵素の活性は腫瘍成長の攻撃性との相関関係が証明されている。アミノ酸、リジンおよびアスコルビン酸などの栄養素は細胞外マトリックスタンパク質分解の天然阻害剤として作用することができ、したがって腫瘍の成長および拡大を調整する能力を持っていると、ＲａｔｈおよびＰａｕｌｉｎｇ（１９９２）は考えた。これらの栄養素はその抗腫瘍能力をいくつかの機序で発揮することができ、そのなかには、ＭＭＰの阻害による機序や、癌細胞を取り巻く結合組織の強化（腫瘍「封入」作用）による機序などがある。
米国特許第５，９６２，５１７号には医学的適応（ざ瘡治療）が異なる医薬調合物が開示されている。この米国特許に開示されている組成物は、ざ瘡軽減成分と、ゴボウ根、イエロードック根またはカテキン系組成物の少なくと１つと、遷移金属を含む皮膚細胞コンディショニング成分とを含んでいる。この米国特許に開示されている組成物が癌の治療及び（又は）予防に有益であることは示されていない。
ＰＣＴ 国際公開公報第００／７６４９２号には、カテキン化合物を含む疾患軽減用の栄養製剤が開示されている。しかし、カテキン化合物の生物学的利用率は低いことが示されており（Ｃｈｅｎ Ｌ．，Ｌｅｅ Ｍ．Ｊ．，Ｙａｎｇ Ｃ．Ｓ． Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂ． Ｄｉｓｐｏｓ． ２５：１０４５−１０５０（１９９７年）；Ｙａｎｇ Ｃ．Ｓ．，Ｃｈｅｎ Ｌ．，Ｌｅｅ Ｍ．Ｊ．，Ｂａｌｅｎｔｉｎｅ Ｄ．Ａ．，Ｋｕｏ Ｍ．Ｃ．，Ｓｃｈａｎｔｚ Ｓ． Ｃａｎｃｅｒ Ｅｐｉｄｅｍｏｌ． Ｂｉｏｍａｒｋ． Ｐｒｅｖ． ７：３５１−３５（１９９８年）；Ｂｅｌｌ Ｊ．Ｒ．，Ｄｏｎｏｖａｎ Ｊ．Ｌ．，Ｗｏｎｇ Ｒ．，Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅ Ｈ．，Ｇｅｒｍａｎ Ｊ．Ｂ．，Ｗａｌｚｅｍ Ｒ．Ｌ．，Ｋａｓｉｍ Ｋ． Ａｍ． Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｎｕｔｒ． ７１：１０３−１０８（２０００年）；Ｓｈｅｒｒｙ Ｃｈｏｗ Ｈ．Ｈ．，Ｃａｉ Ｙ．，Ａｌｂｅｒｔｓ Ｄ．Ｓ．，Ｈａｋｉｍ Ｉ．，Ｄｏｒｒ Ｒ．，Ｓｈａｈｉ Ｆ．，Ｃｒｏｗｅｌｌ Ｊ．Ａ．，Ｙａｎｇ Ｓ．Ｃ．，Ｈａｒａ Ｈ． Ｃａｎｃｅｒ Ｅｐｉｄｅｍｏｌ． Ｂｉｏｍａｒｋ． Ｐｒｅｖ． １０：５３−５８（２００１年））、ＰＣＴ 国際公開公報第００／７６４９２号には、癌の治療及び（又は）予防に要求される生物学的利用率の向上を達成する手段が開示されていない。
Ｄｅｍｅｕｌｅらは、緑茶カテキン類がマトリックスメタロプロテイナーゼに対して阻害作用をもちうることを開示している。癌の治療及び（又は）予防にカテキン類を使用する方法については示唆も教示もなされていない。ポリフェノール類の生物学的利用率がヒトでは極めて低いという事実を考えると、カテキン類の低い組織濃度は、エピガロカテキンガレート（ＥＧＣＧ）を含むポリフェノール類の治療的価値を著しく低下させる。新生物性疾患および他の疾患（炎症性疾患を含む）の治療に有効な、より良いポリフェノール類含有栄養医薬調合物を見いだすことが、絶えず求められている。
体内で癌が拡大する過程を抑制するために使用することができる安全で有効な自然的アプローチが必要とされている。また、ヒトに癌もしくは良性腫瘍が発生するのを防ぐための予防措置であって、治療関連副作用の危険を伴わずに患者に適用することができる措置も必要とされている。近年、癌の発生率が増加するにつれて、栄養医薬調合物は広く普及するようになった。このような組成物の需要は今後も続き、おそらくは増加すると思われる。
一態様として、本発明は、ａ）アスコルビン酸化合物、ｂ）Ｌ−リジン化合物、ｃ）Ｌ−プロリン化合物、ならびにｄ）エピガロカテキンガレート、エピカテキンガレート、エピガロカテキン、エピカテキンおよびカテキンからなる群より選ばれる少なくとも１つのポリフェノール化合物を含む、癌の治療に有用な栄養医薬調合物を提供する。ａ）〜ｃ）の化合物は、癌の増殖と転移を阻止するポリフェノール化合物の活性を増強する。
アスコルビン酸化合物は、好ましくは、アスコルビン酸、薬学的に許容し得るアスコルビン酸塩、アスコルビン酸エステル及び（又は）その混合物からなる群より選ばれる。好ましくは、薬学的に許容し得るアスコルビン酸塩は、アスコルビン酸カルシウムまたはアスコルビン酸マグネシウムである。より好ましくは、アスコルビン酸エステルはパルミチン酸アスコルビルである。リジン化合物は、好ましくは、リジン塩酸塩および薬学的に許容し得るリジン塩からなる群より選ばれる。プロリン化合物は、好ましくは、プロリン塩酸塩および薬学的に許容し得るプロリン塩からなる群より選ばれる。
もう一つの態様として、本栄養医薬調合物は、セレン、銅、マンガン、カルシウムおよびマグネシウムからなる群より選ばれる微量元素をさらに含む。
もう一つの態様として、本栄養医薬調合物はアミノ酸をさらに含む。このアミノ酸は、好ましくは、アルギニンである。より好ましくは、本栄養医薬調合物はＮ−アセチルシステインをさらに含む。
もう一つの態様として、本発明は、ａ）アスコルビン酸化合物、ｂ）Ｌ−リジン化合物、ｃ）Ｌ−プロリン化合物、ｄ）Ｎ−アセチルシステイン、ならびにｅ）エピガロカテキンガレート、エピカテキンガレート、エピガロカテキン、エピカテキンおよびカテキンからなる群より選ばれる少なくとも１つのポリフェノール化合物を含む、癌の治療に有用な栄養医薬調合物を提供する。ａ）〜ｄ）の化合物は、癌の増殖と転移を阻止するポリフェノール化合物の活性を増強する。
もう一つの態様として、本発明は、アスコルビン酸２５０ｍｇ、アスコルビン酸カルシウム２５０ｍｇ、アスコルビン酸マグネシウム２５０ｍｇ、パルミチン酸アスコルビル２５０ｍｇ、ポリフェノール類１０００ｍｇ、Ｎ−アセチルシステイン２００ｍｇ、リジン１０００ｍｇ、プロリン７５０ｍｇ、アルギニン５００ｍｇ、セレン３０ｍｃｇ、銅２ｍｇ、およびマンガン１ｍｇを含む栄養医薬調合物を提供する。
もう一つの態様として、本発明は、アスコルビン酸２５ｍｇ、アスコルビン酸カルシウム２５ｍｇ、アスコルビン酸マグネシウム２５ｍｇ、パルミチン酸アスコルビル２５ｍｇ、ポリフェノール類２００ｍｇ、Ｎ−アセチルシステイン１０ｍｇ、リジン５０ｍｇ、プロリン２５ｍｇ、アルギニン５０ｍｇ、セレン１ｍｃｇ、銅２０ｍｃｇ、およびマンガン５０ｍｃｇを含む栄養医薬調合物を提供する。
もう一つの態様として、本発明は、アスコルビン酸５０００ｍｇ、アスコルビン酸カルシウム５０００ｍｇ、アスコルビン酸マグネシウム５０００ｍｇ、パルミチン酸アスコルビル５０００ｍｇ、ポリフェノール類５０００ｍｇ、Ｎ−アセチルシステイン１５００ｍｇ、リジン５０００ｍｇ、プロリン３０００ｍｇ、アルギニン３０００ｍｇ、セレン２００ｍｃｇ、銅９ｍｇ、およびマンガン１０ｍｇを含む栄養医薬調合物を提供する。
もう一つの態様として、本発明は、アスコルビン酸２５０ｍｇ、アスコルビン酸カルシウム２５０ｍｇ、アスコルビン酸マグネシウム２５０ｍｇ、パルミチン酸アスコルビル２５０ｍｇ、ポリフェノール類１０００ｍｇ、Ｎ−アセチルシステイン２００ｍｇ、リジン１０００ｍｇ、プロリン７５０ｍｇ、アルギニン５００ｍｇ、セレン１００ｍｃｇ、銅２ｍｇ、マンガン１ｍｇ、カルシウム５００ｍｇ、およびマグネシウム４００ｍｇを含む栄養医薬調合物を提供する。
もう一つの態様として、本発明は、アスコルビン酸２５０ｍｇ、アスコルビン酸カルシウム２５０ｍｇ、アスコルビン酸マグネシウム２５０ｍｇ、パルミチン酸アスコルビル２５０ｍｇ、ポリフェノール類１０００ｍｇ、Ｎ−アセチルシステイン２００ｍｇ、リジン１０００ｍｇ、プロリン７５０ｍｇ、アルギニン５００ｍｇ、セレン１００ｍｃｇ、銅２ｍｇ、マンガン１ｍｇ、カルシウム５００ｍｇ、マグネシウム４００ｍｇ、およびシトラスバイオフラボノイド２００を含む栄養医薬調合物を提供する。
さらにもう一つの態様として、本発明は、Ｌ−リジン、Ｌ−プロリン、Ｌ−アルギニン、アスコルビン酸、カルシウム、マグネシウム、ポリフェノール類、Ｎ−アセチルシステイン、セレン、銅、およびマンガンを含む、癌の治療に有用な栄養医薬調合物を提供する。
もう一つの態様として、本発明は、Ｌ−リジン１０００ｍｇ、Ｌ−プロリン７５０ｍｇ、Ｌ−アルギニン５００ｍｇ、アスコルビン酸７１０ｍｇ、カルシウム２２ｍｇ、マグネシウム５０ｍｇ、ポリフェノール類１０００ｍｇ、Ｎ−アセチルシステイン２００ｍｇ、セレン３０ｍｃｇ、銅２ｍｇ、およびマンガン１ｍｇを含む栄養医薬調合物を提供する。
もう一つの態様として、本発明は、個体の癌を治療する方法であって、その個体に、上記栄養医薬調合物を投与する工程を含む方法を提供する。癌は、好ましくは、メラノーマ癌、乳癌、大腸癌、肺癌および脳腫瘍からなる群より選ばれる。
もう一つの態様として、本発明は、個体の炎症性疾患を治療する方法であって、その個体に、上記栄養医薬調合物を投与する工程を含む方法を提供する。炎症性疾患は、好ましくは、変形性関節症である。
本明細書において、「リジン」という用語はＬ−リジンと可換的に使用され、「プロリン」という用語はＬ−プロリンと可換的に使用され、「アルギニン」という用語は「Ｌ−アルギニン」と可換的に使用される。また、「ビタミンＣ」という用語はアスコルビン酸と可換的に使用され、アスコルビン酸塩またはアスコルビン酸エステルを包含しうる。「ＭＭＰ」は、例えばＭＭＰ−１、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−３、ＭＭＰ−４、ＭＭＰ−５、ＭＭＰ−６、ＭＭＰ７、ＭＭＰ−８、ＭＭＰ−８、ＭＭＰ−９、ＭＭＰ−１０、ＭＭＰ−１１などのマトリックスメタロプロテイナーゼを指す。「ＥＧＣＧ」は、緑茶に含まれる主要ポリフェノール成分である（−）−エピガロカテキン−３−ガレートを指す。「ＮＨＤＦ」は、正常ヒト皮膚線維芽細胞を指し、ヒト軟骨細胞およびヒトストローマ細胞を包含する。
本発明は、アスコルビン酸、リジン、プロリンおよび少なくとも１つのポリフェノール化合物を含む栄養医薬調合物を提供する。アスコルビン酸化合物は、好ましくは、アスコルビン酸、アスコルビン酸塩およびアスコルビン酸エステルからなる群より選ばれる。リジンは、好ましくは、リジン塩酸塩または薬学的に許容し得るリジン塩である。プロリンは、好ましくは、プロリン塩酸塩または薬学的に許容し得るプロリン塩である。
ポリフェノール化合物は緑茶の抽出物である。これらはカテキン類とも呼ばれている。ポリフェノール類は緑茶中に存在し、癌を含むさまざまな疾病に対して防御作用があると言われている（Ｍｕｋｈｔａｒ Ｈ．，Ａｈｍｅｄ Ｎ． Ａｍ． Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｎｕｔｒ． ７１：１６９８Ｓ−１７０２Ｓ（２０００年））。マウスでは、緑茶の経口投与により、ドキソルビシンの腫瘍阻害作用が増強された。カテキン類の潜在的抗癌活性は、癌細胞の増殖とその転移に関わるいくつかの因子にカテキン類が及ぼす作用と関係があるのだろう。カテキン類は、ヒト癌腫細胞で、細胞周期停止を引き起こすことが知られている（Ａｈｍａｄ Ｎ．，Ｆｅｙｅｓ Ｄ．Ｋ．，Ｎｉｅｍｉｎｅｎ Ａ．Ｌ．，Ａｇａｒｗａｌ Ｒ．，Ｍｕｋｈｔａｒ Ｈ．Ｊ． Ｎａｔｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ． ８９：１８８１−１８８６（１９９７年））。緑茶から得られるポリフェノール画分は、腫瘍が誘導するサイトカインや炎症に対する防御作用とも関連づけられている。
緑茶には乾燥重量で３０％のポリフェノール化合物が含まれている。これにはフラバノール類、フラバンジオール類、フラボノイド類、およびフェノール酸類が含まれる。フラバノール類は緑茶のポリフェノール類では最も豊富に存在し、一般にカテキン類と呼ばれている。緑茶には、４つの主要カテキン類、すなわち１）（−）−エピカテキン、２）（−）−エピカテキン−３−ガレート、３）（−）−エピガロカテキン、および４）（−）−エピガロカテキン−３−ガレート（ＥＧＣＧ）が含まれている。これらカテキン類のうち、ＥＧＣＧは緑茶に含まれる主要ポリフェノール成分である。ＥＧＣＧは強力な抗酸化化合物であり、緑茶が持つ抗癌活性の一因となりうる。カテキン化合物は、血管新生過程を妨げることによって、その抗転移活性を発揮すると報告されている（Ｃａｏ Ｙ．，Ｃａｏ Ｒ． Ｎａｔｕｒｅ ３９８：３８１（１９９９年））。ＥＧＣＧは、ヒト癌で最も高頻度に発現される酵素の一つであるウロキナーゼ（ｕ−プラスミノゲン活性化因子）の活性を妨害することも示されている（Ｊａｎｋｕｎ Ｊ．，Ｓｅｌｍａｎ Ｓ．Ｈ．，Ｓｗｉｅｒｃｚ Ｒ．，Ｓｋｒｚｙｐｃｚａｋ Ｊ．Ｅ． Ｎａｔｕｒｅ：３８７−５６７（１９９７年））。ＥＧＣＧは好ましいポリフェノール化合物である。
ポリフェノール化合物は、好ましくは、エピガロカテキンガレート、エピカテキンガレート、エピガロカテキン、エピカテキン、カテキン、および他の薬学的に許容し得るポリフェノール塩及び（又は）その混合物からなる群より選ばれる。
本願の主な治療標的の１つは、細胞外マトリックスの消化の防止とその修復である。コラーゲン、エラスチンおよび他の重要な細胞外マトリックス分子の合成には、アスコルビン酸またはその塩（すなわちアスコルベート）が必要である。
好ましくは、アスコルビン酸、プロリンおよびリジンの組合せを使って、ポリフェノール化合物の抗癌活性を増強する。この組合せは、より好ましくは、エピガロカテキンガレート、エピカテキンガレート、エピガロカテキン、エピカテキン、カテキンを含むポリフェノール化合物を、そのポリフェノール化合物が癌細胞の浸潤を減少させるかまたはその浸潤を完全に阻止するのに有効であるように増強する。
理論に拘束されるわけではないが、本栄養医薬製剤は、ポリフェノール類を含む諸成分の混合物を含有し、この混合物は増殖過程および転移過程を阻止する機能を効果的に果たすことが分かる。本発明者らは、本栄養製剤組成物が、癌細胞の浸潤を有意に減少させるか、または癌細胞の転移を完全に阻止することを見いだした。したがってこの組成物は、これらの癌細胞が拡散するのを効果的に防止した。本願化合物の治療的使用は、乳癌、大腸癌および他の器官の癌にとって有効かつ選択的かつ安全な治療である。好ましくは、本願栄養医薬調合物は、その成分のうちの２つが共有結合しているものを含みうる。
好ましくは、癌および他の腫瘍の成長と浸潤に有益な影響を及ぼすことが知られている化合物（Ｌ−アルギニン及び（又は）アルギニン含有化合物など）を含めることによって、栄養組成物の効力を増強する。より好ましくは、Ｎ−アセチルシステインを使用する。より好ましくは、癌および他の腫瘍を予防および治療するのに有効なセレン塩、銅塩、マンガン塩を使用する。この組成物には、細胞のクレブス回路、呼吸鎖または他の代謝機能に補酵素として要求される１つ以上の化合物を、癌および他の腫瘍の予防および治療に有効な量で含めることもできる。
本栄養医薬調合物は、癌および他の腫瘍を予防および治療するために、カプセル剤、錠剤、散剤、丸剤、注射剤、注入剤、吸入剤、坐剤または他の薬学的に許容し得る担体及び（又は）送達手段によって、患者に投与することができる。好ましくは、本栄養医薬調合物をカプセル剤、錠剤または散剤として投与する。より好ましくは、カプセル剤として投与する。
本栄養医薬調合物は、胸部、卵巣、子宮頸部または女性生殖器系の他の器官、肺、肝臓、皮膚、胃腸系、脳、骨または身体の他の器官に腫瘍または癌が存在する選ばれた患者の癌および他の腫瘍の予防および治療に使用することができる。本組成物は、好ましくは、肺癌および脳腫瘍に使用される。
本栄養医薬調合物は、感染性疾患、アテローム性動脈硬化、再狭窄、他の心血管疾患および炎症疾患の予防および治療にも使用することができる。この炎症性疾患は、好ましくは、変形性関節症である。
ＭＭＰによるプラスミンの活性化：ＭＭＰ活性には、プラスミンを介した機序で（ただし他の機序を排除するわけではない）、リジンによって影響を及ぼすことができると考えられる。ＭＭＰはプロ酵素として分泌され、その活性化は、一部、プラスミンによって媒介され、その完了には活性型ＭＭＰ−３が必要である。Ｎａｇａｓｅ（１９９７年）によって詳述されたさまざまなＭＭＰの活性化機序から、ＭＭＰ−３も、プラスミノゲンの、その活性化型であるプラスミンへの変換を必要とすることが分かる。プラスミノゲン活性結合中心は、リジンが特異的に結合される部位を持っている。したがってリジンは、プラスミノゲン活性部位に結合することにより、プラスミノゲン活性化因子によるプラスミノゲンのプラスミンへの活性化を、妨害することができる（ＲａｔｈおよびＰａｕｌｉｎｇ，１９９２年）。プラスミンが誘導するタンパク質分解をこの機序によって阻害するために、合成リジン類似体であるトラネキサム酸が使用されている。
いくつかの組織ＭＭＰを誘導するにはプラスミン活性が不可欠なので、リジンはプラスミノゲンのプラスミンへの変換を妨害することでき、そうすることにより、ほとんどすべてのＭＭＰの活性化を阻害することができる。またＥＧＣＧは、ＭＭＰ−２を阻害することにより、細胞外マトリックス分解に対して阻害作用を発揮しうる。
癌浸潤とマトリックスの役割：癌細胞マトリックス浸潤には、癌細胞を取り巻く結合組織の安定性と強度を増大させて腫瘍を「封入」する一助とすることによって、影響を及ぼすこともできる。これには、コラーゲン原線維の合成と構造を最適化する必要があり、それにはコラーゲン原線維中のヒドロキシプロリン残基およびヒドロキシリジン残基のヒドロキシル化が不可欠である。アスコルビン酸はこれらのアミノ酸のヒドロキシル化に不可欠でありうる。アスコルビン酸とＬ−リジンは通常、人体では産生されない。したがって、さまざまな病理学的病期で、また不適切な食餌によって、これらの栄養素が至適レベルを下回ることもある。プロリンはアルギニンから合成されうるが、病理学的状態では、その合成及び（又は）ヒドロキシル化が影響を受ける場合もある。したがって、転移性腫瘍組織のヒドロキシプロリン含量は、非転移性腫瘍組織よりもはるかに低いことが示されている（Ｃｈｕｂａｉｎｓｋａｉａら，１９８９年）。転移を減少させるさまざまな薬物は、組織のヒドロキシプロリン含量も増加させた（Ｃｈｕｂｉｎｓｋａｉａら，１９８９年）。癌患者の尿中ヒドロキシプロリン含量は、健常者または非癌患者よりも高いことが見いだされている（Ｏｋａｚａｋｉら，１９９２年）。これらの知見はすべて、癌細胞がプロリンの代謝に悪影響を及ぼすことと、癌患者ではおそらく条件的にプロリン不足が起こっていることを示唆している。
癌患者はアスコルビン酸レベルが不十分である可能性がある。アスコルビン酸は悪性細胞株に細胞毒性を示す場合があり、抗転移作用を発揮する。本発明は、アスコルビン酸、プロリン、リジンおよび少なくとも１つのポリフェノール化合物の組合せが、癌細胞株に対して、強力な抗増殖および抗転移作用を発揮することを開示する。好ましくは、本栄養医薬製剤は、メラノーマ、乳癌および大腸癌細胞に対して有効である。より好ましくは、本医薬製剤はヒト大腸癌細胞に対して有効である。
ポリフェノール化合物（カテキン類）：ＥＧＣＧは緑茶抽出物に含まれるカテキン類の１つであり、ヒト癌細胞に対して成長阻害作用を持ちうる。根底にある正確な機序ははっきりしていない。本発明は、アスコルビン酸、プロリンおよびリジンと少なくとも１つのポリフェノール化合物とを含む栄養医薬製剤が、驚くべき相乗作用を示して、癌細胞の増殖と転移を効果的に阻止することを開示する。
本発明の栄養医薬調合物は、乳癌、大腸癌、皮膚癌（メラノーマ）および他の形態の癌の浸潤を効果的に阻止する。本栄養製剤に含まれる成分は天然化合物であり、本願に記載する請求の範囲内で使用すれば、それらは毒性副作用を持たないことが示される。したがって本組成物は予防的にも使用することができる。すなわち本組成物は、体内の癌および他の腫瘍の効果的な予防にもなりうる。
ウイルス細胞（ｖｉｒａｌ ｃｅｌｌｓ）および他の侵入微生物は、感染を体中に広げるのに、癌細胞と同様のプロテアーゼを用いるので、本願の組成物はウイルス疾患および他の感染性疾患の効果的な予防および治療にも使用することができる。
癌細胞がマトリックス浸潤に用いる機序と同様のマトリックスメタロプロテイナーゼ活性化機序は、心筋梗塞や脳卒中につながるアテローム斑の不安定化の一因にもなる。したがって、本願の組成物は、アテローム性動脈硬化、再狭窄および他の心血管合併症の効果的な予防および治療にも使用することができる。
癌細胞がマトリックス浸潤に用いるマトリックスメタロプロテイナーゼの活性化は、さまざまな炎症状態における重要な一要素である。したがって、本願の組成物は、慢性関節リウマチ、気腫、アレルギー、変形性関節症などの疾患および炎症的側面を含む他の状態の効果的な予防および治療にも使用することができる。
本発明の栄養医薬調合物は、錠剤、丸剤、注射剤、注入剤、吸入剤、坐剤または他の薬学的に許容し得る担体及び（又は）送達手段によって、患者に提供することができる。
さまざまなヒト癌細胞株で、アスコルビン酸、リジン、プロリン、および少なくとも１つのポリフェノール化合物の作用を、その抗増殖能および抗浸潤能について研究した。特に、緑茶抽出物成分の１つ（すなわちエピガロカテキンガレート（ＥＧＣＧ））を調べた。
材料と方法
ヒト乳癌細胞ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ヒト大腸癌細胞ＨＣＴ１１６、ヒトメラノーマ細胞株Ａ２０５８は、ＡＴＣＣから入手した。正常ヒト皮膚線維芽細胞はＧＩＣＢＯから入手した。特に表示がない場合は、ＡＴＣＣから入手した培養培地を使用した。
癌細胞増殖研究では、各治療を８回繰り返した。浸潤アッセイでは、複製した３重または４重の試料で各治療を行った。
細胞増殖研究
これらの研究では、２４穴プレートを使って、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含むリーボビッツ（Ｌｉｅｂｏｖｉｔｚ）培地で、５×１０4個の乳癌細胞を成長させた。培地は、そのまま使用するか（基礎培地）、または指定した添加物を加えて使用した。プレートを空気循環培養器（ＣＯ2補充なし）で４日間インキュベートした。大腸癌細胞ＨＣＴ１１６はマッコイ（ＭｃＣｏｙ）の５Ａ培地で成長させ、５％ＣＯ2−空気循環培養器で維持した。インキュベーション期間の最後に、培地を除去し、ウェル中の細胞をＰＢＳで洗浄した後、ＭＴＴ染色剤と共に３時間インキュベートした。各ウェルにジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ，１ｍｌ）を加えた。ＤＭＳＯを加えたプレートを穏やかに撹拌しながら１５分間、室温に置いた後、各ウェル中の溶液のＯＤを５５０ｎｍで測定した。ウェル中のＤＭＳＯ溶液のＯＤ550は細胞数に正比例すると見なした。添加物を何も含んでいない治療（基礎培地）のＯＤ550を１００とみなした。
マトリゲル（Ｍａｔｒｉｇｅｌ）浸潤研究
マトリゲル（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）インサートを、適合する２４穴プレートで使用して、マトリゲル浸潤研究を行った。ＤＭＥＭを使って、プレートのウェルに線維芽細胞を播種し、成長させた。線維芽細胞がコンフルエントに達したら、培地を除去し、各治療用の培地７５０μｌに置き換えた。実験計画で指定した栄養素を添加した培地２５０μｌに懸濁した癌細胞（５×１０4個）を、ウェルのインサート上に播種した。したがってインサート上の培地とウェル中の培地は、同じ添加物を含んでいる。次に、インサートを含むプレートを１８〜２０時間インキュベートした（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の場合は空気循環培養器で行い、大腸癌細胞およびメラノーマ細胞の場合は５％ＣＯ2培養器で行った）。インキュベーション後に、培地をウェルから除去した。インサートの上面にある細胞を綿棒でそっとこすり落とした。マトリゲル膜を貫通してマトリゲルの下面まで遊走した細胞をヘマカラー（ｈｅｍａｃｏｌｏｒ）染色剤（ＥＭ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）で染色し、顕微鏡下で目視計数した。結果をＡＮＯＶＡにかけ、考えうるすべての対を、ｐ＜０．０５での有意性について検定した。
各研究では、アスコルビン酸、プロリン、リジンおよびＥＧＣＧを、表示した濃度で培地に添加した。
ゼラチナーゼザイモグラフィー
ゼラチナーゼザイモグラフィーは、０．１％ゼラチンの存在下に１０％ノベックス（Ｎｏｖｅｘ）プレキャストポリアクリルアミドゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で行った。培養培地（２０μｌ）をのせ、トリス−グリシンＳＤＳ緩衝液を使ってＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。電気泳動後に、ゲルを５％トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−１００で３０分間洗浄し、染色した。タンパク質標品を同時に泳動し、およその分子量を決定した。
改良型マトリゲル浸潤チャンバー（ＢＤ）中のマトリゲルインサート上に、ＭＤＡ−ＭＢ２３１（ＡＴＣＣ）乳癌細胞を播種した。正常ヒト皮膚線維芽細胞（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ）の条件培地にさまざまな薬剤（図１に記載）を添加したものを、ウェルに加えた。チャンバーを２４時間インキュベートし、マトリゲル膜に浸潤して膜の下面まで遊走した細胞を数えた。これらのデータは、ＭＤＡ−ＭＢ２３１ヒト乳癌細胞によるマトリゲル浸潤および遊走にエピガロカテキンガレートならびにアスコルビン酸、プロリンおよびリジンの組合せが及ぼす阻害作用を示している。
改良型マトリゲル浸潤チャンバー（ＢＤ）中のマトリゲルインサート上に、ＨＴＣＴ１１６（ＡＴＣＣ）ヒト大腸癌細胞を播種した。正常ヒト皮膚線維芽細胞（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ）の条件培地にさまざまな薬剤（図２に記載）を添加したものを、ウェルに加えた。チャンバーを２４時間インキュベートし、マトリゲル膜に浸潤して膜の下面まで遊走した細胞を数えた。これらのデータは、ＨＣＴ１１６ヒト大腸癌細胞によるマトリゲル浸潤および遊走にエピガロカテキンガレートならびにアスコルビン酸、プロリンおよびリジンの組合せが及ぼす阻害作用を示している。
改良型マトリゲル浸潤チャンバー（ＢＤ）中のマトリゲルインサート上に、Ａ２０５８（ＡＴＣＣ）ヒトメラノーマ細胞を播種した。正常ヒト皮膚線維芽細胞（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ）の条件培地にさまざまな薬剤を添加したものを、ウェルに加えた。チャンバーを２４時間インキュベートし、マトリゲル膜に浸潤して膜の下面まで遊走した細胞を数えた。これらのデータは、Ａ２０５８ヒトメラノーマ細胞によるマトリゲル浸潤および遊走にエピガロカテキンガレートならびにアスコルビン酸、プロリンおよびリジンの組合せが及ぼす阻害作用を示している。
この実験では、
Ａ：正常ヒト線維芽細胞（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ）の条件培地、および
Ｂ：同じ培地に、図４の説明文に示すさまざまな栄養素を添加したもの、
の存在下で、改良型マトリゲル浸潤チャンバー（ＢＤ）中のマトリゲルインサート上に、Ａ２０５８（ＡＴＣＣ）ヒトメラノーマ細胞を播種した。２４時間インキュベートした後、マトリゲル膜に浸潤して膜の下面まで遊走した細胞を、顕微鏡下で調べて、計数した。
これらのデータは、エピガロカテキンガレートおよびアスコルビン酸＋プロリン＋リジンの組合せがＡ２０５８に及ぼすアポトーシス作用を表している。Ａ：組織培養培地中のヒトメラノーマ細胞。Ｂ：アスコルビン酸（１００μＭ）、プロリン（１４０μＭ）、リジン（４００μＭ）およびＥＧＣＧ（２０μｇ／ｍｌ）を含む組織培養培地中のヒトメラノーマ細胞。注：細胞は破壊された。
癌細胞増殖研究
メラノーマＡ２０５８細胞
図５は、リジン、プロリンおよびアスコルビン酸を添加した１０、２０および５０μｇ／ｍｌのＥＧＣＧ、ならびにリジン、プロリンおよびアスコルビン酸を添加していない１０、２０および５０μｇ／ｍｌのＥＧＣＧがメラノーマ細胞の増殖に影響を及ぼす作用を表している。リジン、プロリンおよびアスコルビン酸も、１０および２０μｇ／ｍｌのＥＧＣＧも、細胞増殖に対して有意な作用を持たなかった。しかし、５０μｇ／ｍｌのＥＧＣＧは細胞数を３０％まで有意に減少させた。リジン、プロリンおよびアスコルビン酸を加えても同様の作用が観察された。
乳癌ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞
これらの実験では、基礎培地に０、１０、２０、５０、１００または２００μｇ／ｍｌのＥＧＣＧを添加した（図６）。結果は、基礎培地に５０、１００および２００μｇ／ｍｌのＥＧＣＧを添加すると、無添加対照と比較して、細胞数がそれぞれ６６．１±５．３、３３．６±２および２９．６±０．８％まで有意に減少したことを示している。細胞培地中の濃度が２０μｇ／ｍｌまでの場合、ＥＧＣＧは、細胞増殖に対して有意な阻害作用を持たなかった。
本発明者らは、アスコルビン酸、リジン、プロリンおよびさまざまな濃度のＥＧＣＧが癌細胞の増殖に影響を及ぼす作用も研究した。図７は、アスコルビン酸、リジンおよびプロリンにより、細胞数が、有意ではないが、８６．１＋１．９３％まで減少したことを示している。この組合せに２０、５０および１００μｇのＥＧＣＧをさらに加えると、細胞数は、対照群と比較して、それぞれ７４±５．８、６４．８±１．６および２２±５％まで減少した。
大腸癌ＨＣＴ１１６細胞
大腸癌細胞の細胞増殖にアスコルビン酸、プロリンおよびリジンが及ぼす阻害作用は顕著ではなかったが、アスコルビン酸、プロリンおよびリジンと２０μｇ／ｍｌ ＥＧＣＧとの組合せは、細胞数を６９±０．５％まで有意に減少させた（図８）。この組合せにおいてＥＧＣＧのレベルを上げると（５０μｇ／ｍｌ）、細胞数は４．６±０．３％まで著しく減少した。
これらの研究で使用した栄養組成物の抗増殖活性は、癌細胞のタイプによって変動した。乳癌細胞の場合、アスコルビン酸、プロリンおよびリジンとＥＧＣＧとの組合せは、これらの栄養素を個別に使用した場合よりも高い抗増殖作用を持っていた。アスコルビン酸、プロリン、リジンの組合せへのばく露は、メラノーマ細胞および大腸癌細胞の増殖には影響を及ぼさなかった。しかし、これらの栄養素を２０μｇ／ｍｌ ＥＧＣＧと組み合わせたところ、大腸癌細胞の数は有意に減少したが、メラノーマ細胞の数は減少しなかった。アスコルビン酸、プロリン、リジンおよびＥＧＣＧの組合せに対して、大腸癌細胞は乳癌細胞よりも感受性が高く、メラノーマ細胞は感受性が最も低いようだった。アスコルビン酸、プロリンおよびリジンを５０μｇ／ｍｌのＥＧＣＧと共に投与すると、大腸癌細胞の増殖はほぼ完全に抑制された（４．６％）。
ゼラチナーゼザイモグラフ研究
基礎培地ならびにアスコルビン酸、プロリンおよびリジン添加培地で、ＭＭＰ類の発現に関して、ＥＧＣＧがメラノーマ細胞に影響を及ぼす作用を、ゼラチナーゼザイモグラフィーによって、図９に示す。メラノーマ細胞はＭＭＰ−２およびＭＭＰ−９に相当する２本のバンドを示した。アスコルビン酸、リジンおよびプロリンの組合せは、基礎培地と比較して、ＭＭＰバンドの発現に影響を及ぼさなかった。しかし、ＥＧＣＧは、ＭＭＰ−２とＭＭＰ−９の発現をどちらも用量依存的に阻害する。バンドの強度は、基礎培地でも、アスコルビン酸、リジンおよびプロリンの組合せでも、同じだった。
細胞外マトリックス浸潤および遊走研究
アスコルビン酸、プロリンおよびリジンの組合せを単独で使用した場合、およびさまざまな濃度のＥＧＣＧと一緒に使用した場合の阻害作用を調べた。これらの組合せが細胞外マトリックスに影響を及ぼす作用を、さまざまな癌細胞株の浸潤能を評価するために日常的に使用されている既製のマトリゲルマトリックスを使って研究した。
乳癌ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞
アスコルビン酸、プロリンおよびリジンの存在下でインキュベートした乳癌細胞のマトリゲル浸潤の結果を、図１０に示す。アスコルビン酸、プロリンおよびリジンの組合せを含む培地でインキュベートすると、癌細胞の浸潤は、無添加培地でインキュベートした細胞と比較して、４８．１±２２．１％まで減少した。２０μｇ／ｍｇのＥＧＣＧのみを添加した培地では、浸潤細胞の数が６９．５±２７．４％まで減少した。ＥＧＣＧ濃度を上げると（５０μｇ／ｍｌおよび１００μｇ／ｍｌ）、乳癌細胞によるマトリックス浸潤が完全に阻害された。
もう一組の研究では、１００μＭのアスコルビン酸を培地に添加することにより、浸潤が３６％減少した。アスコルビン酸と１４０μＭのプロリンとを添加すると、浸潤がさらに４７％減少した。添加物にアスコルビン酸とプロリンの他に４００μＭのリジンも使用すると、浸潤がさらに６７％まで減少し、リジンは、アスコルビン酸とプロリンの作用の増強に関して、８００μＭまでは直線的な応答を示す。
図１０は、アスコルビン酸、プロリンおよびリジンならびにＥＧＣＧ ２０μｇ／ｍｌの組合せが、細胞外マトリックス越しに起こる癌細胞の浸潤を完全に停止させるのに有効であることも示している。この組合せにより、個々の栄養素を高度濃度で使用しなくても、癌細胞浸潤に対して最大の阻害作用を達成することが可能になった。したがって、アスコルビン酸、プロリンおよびリジンとＥＧＣＧとを併用することにより、低いＥＧＣＧレベル（２０μｇ／ｍｌ）で乳癌細胞のマトリックス浸潤を完全に停止させることが可能になった。
大腸癌ＨＣＴ１１６細胞
図１１は、アスコルビン酸、プロリンおよびリジンの組合せが、大腸癌細胞の浸潤を６７．２±３．７％まで有意に減少させたことを示している。２０μｇ／ｍｌのＥＧＣＧを単独で使用した場合、浸潤は４４．９±３．３％まで減少したのに対して、アスコルビン酸、プロリンおよびリジンと２０μｇ／ｍｌのＥＧＣＧとの組合せは相乗作用を持っていて、大腸癌細胞浸潤を２４．９±４．６％まで減少させた。
メラノーマＡ２０５８細胞
図１２は、アスコルビン酸、プロリンおよびリジンの組合せが、浸潤細胞の数を８８．２±４％まで減少させるのに有効であるが、この減少は統計的に有意ではないことを示している。これらの栄養素をわずか２０μｇ／ｍｌのＥＧＣＧを組み合わせるだけで、浸潤細胞数をゼロまで減少させる効果があった。
これらの結果は、アスコルビン酸、プロリンおよびリジンをＥＧＣＧと併用することにより、マトリゲル膜越しに浸潤および遊走する細胞の数を著しく減少させることができたことを示している。乳癌細胞およびメラノーマ細胞ではアスコルビン酸、プロリンおよびリジンと共に、わずか２０μｇ／ｍｌのＥＧＣＧを使用するだけで、浸潤がゼロまで減少した。この組合せの結果がもたらす利益は、大腸癌細胞では、メラノーマ細胞でみられたほどには劇的ではなかった。これらの細胞による浸潤を９０％減少させるには、ＥＧＣＧのレベルを５０μｇ／ｍｌにする必要があった。ＥＧＣＧはＭＭＰ類の発現に用量依存的な阻害作用を持っているが、この研究では、メラノーマ細胞におけるＭＭＰ類の発現に変化はみられなかった。
これらの一連の研究は、アスコルビン酸、プロリン、リジンおよび少なくとも１つのポリフェノール化合物を含む本栄養医薬製剤が、癌細胞に対して効果的な抗増殖作用および抗浸潤作用を発揮することを、決定的に証明している。
以下の栄養医薬製剤（表１〜５）およびＥＰＩＣＡＮ ＦＯＲＴＥ（商標）（表６）をその製造について例示する。アスコルビン酸、プロリン、リジンおよび少なくとも１つのポリフェノール化合物を含むこれらの製剤は、癌細胞の浸潤および癌細胞の転移を阻止するのに有効であることが分かる。
製剤例1
mg＝ミリグラム
mcg＝マイクログラム
「％」は製剤の総重量に対する各成分の重量％を表す。
製剤例2
mg＝ミリグラム
mcg＝マイクログラム
製剤例3
mg＝ミリグラム
mcg＝マイクログラム
「％」は製剤の総重量に対する各成分の重量％を表す。
製剤例4
mg＝ミリグラム
mcg＝マイクログラム
「％」は製剤の総重量に対する各成分の重量％を表す。
製剤例5
mg＝ミリグラム
mcg＝マイクログラム
「％」は製剤の総重量に対する各成分の重量％を表す。
EPICAN FORTE（商標）の処方
1日分：6カプセル（使用例：毎日3回、好ましくは食事と共に、2カプセルずつ服用）
mg＝ミリグラム
mcg＝マイクログラム
EPICAN FORTE（商標）は係属中の米国特許出願に記載の商標名である。
他の成分：植物性カプセル（ヒドロキシプロピルメチルセルロース）、二酸化ケイ素、セルロースおよびステアリン酸マグネシウム。
ヒト癌細胞に対するＥＰＩＣＡＮ ＦＯＲＴＥ（商標）の作用
ヒト癌細胞に対するＥＰＩＣＡＮ ＦＯＲＴＥ（商標）の作用を研究した。ゼラチナーゼザイモグラフィーによるマトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）類の発現、マトリゲル越しの浸潤能、およびＭＴＴアッセイによる増殖／成長などの転移パラメータを調べた。これらのアッセイのプロトコールは上に詳述したとおりである。以下に挙げる数種類のヒト癌細胞株を使用した：皮膚癌−メラノーマ細胞２０５８、肝癌−ＨｅｐＧ２細胞、線維肉腫−ＨＴ１０８０細胞、大腸癌−ＨＣＴ１１６、乳癌ＥＲ＋／−ＭＣＦ−７および乳癌ＥＲ−／−ＭＤＡ−ＭＢ−２３１。
結果を以下の表（表７および表８）に要約する。
ヒト癌細胞株の増殖／成長に対するＥＰＩＣＡＮ ＦＯＲＴＥ（商標）の作用
EPICAN FORTE（商標）の用量（μg/ml）：対照に対する割合（％）
ＥＰＩＣＡＮ ＦＯＲＴＥ（商標）がヒト癌細胞によるマトリゲル浸潤および遊走に影響を及ぼす作用
EPICAN FORTE（商標）の用量（μg/ml）：阻害率（％）
ＥＰＩＣＡＮ ＦＯＲＭＴＥ（商標）がヒト癌細胞株によるマトリックスメタロプロテイ ナーゼ（ＭＭＰ）類の発現に影響を及ぼす作用
メラノーマ細胞：メラノーマ細胞は、ゼラチナーゼザイモグラフィーで、ＭＭＰ−２およびＭＭＰ−９に相当する２本のバンドを示した。ＥＰＩＣＡＮ ＦＯＲＴＥ（商標）は、ＭＭＰ−２とＭＭＰ−９の発現を用量依存的に阻害した。ＭＭＰ−２とＭＭＰ−９の発現は、１００μｇ／ｍｌのＥＰＩＣＡＮ ＦＯＲＴＥ（商標）濃度で有意に阻害され、濃度１００μｇ／ｍｌでは事実上検出不能だった。
ＨｅｐＧ２細胞：メラノーマ細胞と同様に、ＨｅｐＧ２細胞も、ＭＭＰ−２とＭＭＰ−９に相当する２本のバンドを発現させた。ＥＰＩＣＡＮ ＦＯＲＴＥ（商標）は、５００μｇ／ｍｌおよび１０００μｇ／ｍｌの濃度で、ＭＭＰ−２とＭＭＰ−９の発現を阻害した。
線維肉腫ＨＴ１０８０：ＨＴ−１０８０細胞はＭＭＰ−２とＭＭＰ−９の２本のバンドを示した。ＥＰＩＣＡＮ ＦＯＲＴＥ（商標）は、やはり両方のバンドの発現を、用量依存的に阻害した。濃度５００μｇ／ｍｌと１０００μｇ／ｍｌでは極めてかすかなバンドしか見えなかった。
大腸癌ＨＣＴ１１６：ザイモグラフィーで、大腸癌細胞は、ＭＭＰ−２に相当する１本のバンドだけを示し、そのバンドは、濃度１００μｇ／ｍｌで完全に消失した。
ＭＣＦ−７およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１：これらの細胞株は、我々が設定した他の癌細胞株と同等の実験濃度では、ＭＭＰバンドを何も示さなかった。
マトリゲル越しのＭＤＡ−ＭＢ−２３１の浸潤は、１０、５０および１００μｇ／ｍｌのＥＰＩＣＡＮ ＦＯＲＴＥ（商標）により、それぞれ５０、６０および９５％阻害された。ＥＰＩＣＡＮ ＦＯＲＴＥ（商標）はＭＤＡ−ＭＢ−２３１にとって１０μｇ／ｍｌでは毒性でなく、１００μｇ／ｍｌではわずかな毒性を示した。しかし、１０００μｇ／ｍｌでは、かなりの毒性を示した。ザイモグラフィーではＭＭＰ−２もＭＭＰ−９も認められなかった。これに対して、ＥＰＩＣＡＮ ＦＯＲＴＥ（商標）は、ＭＣＦ−７にとっては、５００μｇ／ｍｌでも毒性がなく、１０００μｇ／ｍｌではわずかな毒性を示した。ＭＣＦ−７は非浸潤性であり、ＭＭＰ活性を発現させなかった。
ＥＰＩＣＡＮ ＦＯＲＴＥ（商標）はＭＭＰ−２とＭＭＰ−９の発現を用量依存的に阻害する。ＭＭＰ−２とＭＭＰ−９の発現は、１００μｇ／ｍｌのＥＰＩＣＡＮ ＦＯＲＴＥ（商標）濃度で有意に阻害され、濃度１００μｇ／ｍｌでは事実上検出不能だった。１０μｇ／ｍｌおよび１００μｇ／ｍｌの濃度で使用したＥＰＩＣＡＮ ＦＯＲＴＥ（商標）は、細胞の生存性に有意な影響を及ぼさず、１００μｇ／ｍｌでは細胞タイプに依存して１０〜４０％の範囲の細胞毒性を示した。メラノーマ細胞、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞、およびＮＨＤＦと共培養したメラノーマ細胞のマトリゲル越しの浸潤は、用量依存的に減少した。ＨＴ−１０８０細胞のマトリゲル越しの浸潤は、１０、１００、２００および１０００μｇ／ｍｌで、それぞれ１０％、５０％、７０％および１００％阻害された。興味深いことに、ＥＰＩＣＡＮ ＦＯＲＴＥ（商標）は、ＨＴ−１０８０細胞にとって、１００μｇ／ｍｌでは毒性でなかった。これらの結果は、ＥＰＩＣＡＮ ＦＯＲＴＥ（商標）がいくつかの癌細胞株に対して、また共培養状態でも、極めて有効であることを証明している。これらの知見から、ＥＰＩＣＡＮ ＦＯＲＴＥ（商標）は自然療法の基礎となりうること、そしてそれゆえに、ＥＰＩＣＡＮ ＦＯＲＴＥ（商標）はヒト癌の治療にとって貴重で有望な候補になることが分かる。
ヒト正常細胞株に対するＥＰＩＣＡＮ ＦＯＲＴＥ（商標）の作用
正常ヒト細胞に対するＥＰＩＣＡＮ ＦＯＲＴＥ（商標）の作用を研究した。癌細胞株と同様のパラメータ、すなわちＭＭＰ発現に関するザイモグラフィー、マトリゲル越しの浸潤、ＭＴＴアッセイによる増殖／成長を使用した。ヒト軟骨細胞およびヒトストローマ細胞を含めて、いくつかの正常ヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）を使った。
ＥＰＩＣＡＮ ＦＯＲＴＥ（商標）が増殖／成長、転移浸潤および正常ヒト細胞におけるＭＭＰ産生に影響を及ぼす作用を、以下の表（表９、１０および１１）に要約する。
EPICAN FORTE（商標）が正常ヒト細胞の増殖/成長に影響を及ぼす作用
EPICAN FORTE（商標）の用量（μg/ml）：対照に対する割合（％）
EPICAN FORTE（商標）が正常ヒト細胞によるマトリゲル浸潤に影響を及ぼす作用
EPICAN FORTE（商標）の用量（μg/ml）：阻害率（％）
ＥＰＩＣＡＮ ＦＯＲＴＥ（商標）が正常ヒト細胞によるマトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）の発現に影響を及ぼす作用を以下に要約する。
ＮＨＤＦ：ＮＨＤＦは、ザイモグラフィーで、ＭＭＰ−２に相当する１本のバンドだけを示し、そのバンドは１０００μｇ／ｍｌのＥＰＩＣＡＮ ＦＯＲＴＥ（商標）濃度で事実上消失した。
軟骨細胞：軟骨細胞もＭＭＰ−２に相当する１本のバンドだけを示した。ＥＰＩＣＡＮ ＦＯＲＴＥ（商標）はＭＭＰ−２の発現を用量依存的に阻害した。ＭＭＰ−２の発現は、１００μｇ／ｍｌのＥＰＩＣＡＮ ＦＯＲＴＥ（商標）濃度で有意に阻害され、２００μｇ／ｍｌのＥＰＩＣＡＮ ＦＯＲＴＥ（商標）濃度では完全に消失した。
ストローマ細胞：ストローマ細胞もＭＭＰ−２に相当する１本のバンドだけを示した。ＥＰＩＣＡＮ ＦＯＲＴＥ（商標）はＭＭＰ−２の発現を用量依存的に阻害した。５０μｇ／ｍｌおよび１００μｇ／ｍｌの濃度では極めてかすかなバンドしか見えず、２００μｇ／ｍｌおよび５００μｇ／ｍｌの濃度ではバンドは検出されなかった。
要約すると、これらの結果から、ＥＰＩＣＡＮ ＦＯＲＴＥ（商標）はＭＭＰ−２の発現を用量依存的に阻害することが示された。ＭＭＰ−２の発現は１００μｇ／ｍｌのＥＰＩＣＡＮ ＦＯＲＴＥ（商標）濃度で有意に阻害され、２００μｇ／ｍｌの濃度では事実上検出されなかった。また、マトリゲル越しの軟骨細胞の浸潤が、１０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌおよび２００μｇ／ｍｌで、５０％、８５％および９５％阻害されることもわかった。５００μｇ／ｍｌでは浸潤が０％まで完全に抑制された。
ＥＰＩＣＡＮ ＦＯＲＴＥ（商標）は、２００μｇ／ｍｌの濃度でも、軟骨細胞にとって毒性でなかった。実際には、ＥＰＩＣＡＮ ＦＯＲＴＥ（商標）は細胞増殖作用を発揮して、２００μｇ／ｍｌでは細胞増殖を対照よりも７０％増加させた。５００μｇ／ｍｌで初めてわずかな毒性作用が見られた。これらの結果は、ＥＰＩＣＡＮ ＦＯＲＴＥ（商標）がＭＭＰ−２発現を阻害するのに有効であること、そして、変形性関節症および過剰な軟骨分解を含む他の関連障害におけるＭＭＰ産生と細胞外マトリックス分解を阻害するための自然的アプローチとして、ＥＰＩＣＡＮ ＦＯＲＴＥ（商標）が新しい抗炎症性栄養製剤になることを証明している。
Ｅｐｉｃａｎ−Ｆｏｒｔｅの生体内試験群は実施され始めたばかりであるが、癌を治療するための医薬としてのＥｐｉｃａｎ−Ｆｏｒｔｅの有効性を証明する例が２つ報告されている。
脳腫瘍と診断されたある女性患者は化学療法および放射線療法による治療を受けたが効果がなく、２００２年４月末に断念された。彼女は偶然、推奨された服用量で、Ｅｐｉｃａｎ−Ｆｏｒｔｅによる治療を開始した。２００２年の８月には、腫瘍が消失していることを、ＭＲＴＳが示した。
２００２年５月、腫瘍マーカーＰＳＡが著しく上昇（５９．９μｇ／ｌ）している６４歳のある男性患者は、大動脈のリンパ管に沿って前立腺癌が転移していると診断された。彼は、推奨された服用量でＥｐｉｃａｎ−Ｆｏｒｔｅによる治療を開始した。３ヶ月後に、ＰＳＡレベルは０．９μｇ／ｌに低下した。２００２年１０月末のＣＴ検査により、以前見えていたリンパ転移がもはやはっきりせず、彼の前立腺は正常サイズであることがわかった。
本発明の実施形態を数多く説明した。しかし、本発明の精神と範囲から逸脱することなく、さまざまな変更を加えうることは、言うまでもない。
図１はヒト乳癌細胞の遊走行動に対するポリフェノール類、アスコルベート、プロリンおよびリジンの阻害作用を示す。 図２はヒト大腸癌細胞の遊走行動に対するポリフェノール類、アスコルベート、プロリン、およびリジンの阻害作用を示す。 図３はヒトメラノーマ細胞の遊走行動に対するポリフェノール類、アスコルベート、プロリンおよびリジンの阻害作用を示す。 図４はヒトメラノーマ細胞のアポトーシスに対するポリフェノール類、アスコルベート、プロリンおよびリジンの阻害作用を示す。 図５はヒトメラノーマ細胞（Ａ２０５８）の細胞増殖に対するアスコルビン酸、プロリン、リジンおよびさまざまな量のＥＧＣＧの阻害作用を示す図である。 図６はヒト乳癌細胞（ＭＤＡ−ＭＢ２３１）の細胞増殖に対するＥＧＣＧの阻害作用を示す。 図７は基礎培地へのアスコルビン酸、プロリン、リジンおよびさまざまな量のＥＧＣＧの添加がヒト乳癌細胞（ＭＤＡ−ＭＢ２３１）の細胞増殖に影響を及ぼす作用を示す。 図８は基礎培地へのアスコルビン酸、プロリン、リジンおよびさまざまな量のＥＧＣＧの添加がヒト大腸癌細胞（ＨＣＴ１１６）の細胞増殖に影響を及ぼす作用を示す。 図９は基礎培地へのアスコルビン酸、プロリン、リジンおよびさまざまな量のＥＧＣＧの添加がヒトメラノーマ細胞におけるマトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）の発現に影響を及ぼす作用を示す。 図１０は基礎培地へのアスコルビン酸、プロリン、リジンおよびさまざまな量のＥＧＣＧの添加がヒト乳癌細胞（ＭＤＡ−ＭＢ２３１）によるマトリゲル浸潤に影響を及ぼす作用を示す。 図１１は基礎培地へのアスコルビン酸、プロリン、リジンおよびさまざまな量のＥＧＣＧの添加がヒト大腸癌細胞（ＨＴＣ１１６）によるマトリゲル浸潤に影響を及ぼす作用を示す。 図１２は基礎培地へのアスコルビン酸、プロリン、リジンおよびさまざまな量のＥＧＣＧの添加がヒトメラノーマ細胞（Ａ２０５８）中の浸潤性細胞数の減少に影響を及ぼす作用を示す。 図１３はＣＴスクリーニングを示す。 図１４はＣＴスクリーニングを示す。

Claims (33)

  1. ａ）アスコルビン酸化合物、
    ｂ）Ｌ−リジン化合物、
    ｃ）Ｌ−プロリン化合物、ならびに
    ｄ）エピガロカテキンガレート、エピカテキンガレート、エピガロカテキン、エピカテキンおよびカテキンからなる群より選ばれる少なくとも１つのポリフェノール化合物
    を含み、癌の増殖と転移を阻止するポリフェノール化合物の活性を、ａ）〜ｃ）の化合物が増強する、癌の治療に有用な栄養医薬調合物。
  2. アスコルビン酸化合物が、アスコルビン酸、薬学的に許容し得るアスコルビン酸塩、アスコルビン酸エステル及び（又は）その混合物からなる群より選ばれる、請求項１の栄養医薬調合物。
  3. 薬学的に許容し得るアスコルビン酸塩がアスコルビン酸カルシウムまたはアスコルビン酸マグネシウムである、請求項２の栄養組成物。
  4. アスコルビン酸エステルがパルミチン酸アスコルビルである、請求項２の栄養組成物。
  5. リジン化合物が、リジン塩酸塩および薬学的に許容し得るリジン塩からなる群より選ばれる、請求項１の栄養医薬調合物。
  6. プロリン化合物が、プロリン塩酸塩および薬学的に許容し得るプロリン塩からなる群より選ばれる、請求項１の栄養医薬調合物。
  7. セレン、銅、マンガン、カルシウムおよびマグネシウムからなる群より選ばれる微量元素をさらに含む、請求項１の栄養医薬調合物。
  8. アミノ酸をさらに含む、請求項１の栄養医薬調合物。
  9. アミノ酸がアルギニンである、請求項８の栄養医薬調合物。
  10. Ｎ−アセチルシステインをさらに含む、請求項１の栄養医薬調合物。
  11. ａ）アスコルビン酸化合物、
    ｂ）Ｌ−リジン化合物、
    ｃ）Ｌ−プロリン化合物、
    ｄ）Ｎ−アセチルシステイン、ならびに
    ｅ）エピガロカテキンガレート、エピカテキンガレート、エピガロカテキン、エピカテキンおよびカテキンからなる群より選ばれる少なくとも１つのポリフェノール化合物
    を含み、癌の増殖と転移を阻止するポリフェノール化合物の活性を、ａ）〜ｄ）の化合物が増強する、癌の治療に有用な栄養医薬調合物。
  12. アスコルビン酸化合物が、アスコルビン酸、薬学的に許容し得るアスコルビン酸塩、アスコルビン酸エステル及び（又は）その混合物からなる群より選ばれる、請求項１１の栄養医薬調合物。
  13. 薬学的に許容し得るアスコルビン酸塩がアスコルビン酸カルシウムまたはアスコルビン酸マグネシウムである、請求項１２の栄養組成物。
  14. アスコルビン酸エステルがパルミチン酸アスコルビルである、請求項１２の栄養組成物。
  15. リジン化合物が、リジン塩酸塩および薬学的に許容し得るリジン塩からなる群より選ばれる、請求項１１の栄養医薬調合物。
  16. プロリン化合物が、プロリン塩酸塩および薬学的に許容し得るプロリン塩からなる群より選ばれる、請求項１１の栄養医薬調合物。
  17. セレン、銅、マンガン、カルシウムおよびマグネシウムからなる群より選ばれる微量元素をさらに含む、請求項１１の栄養医薬調合物。
  18. アミノ酸をさらに含む、請求項１１の栄養医薬調合物。
  19. アミノ酸がアルギニンである、請求項１８の栄養医薬調合物。
  20. アスコルビン酸、アスコルビン酸カルシウム、アスコルビン酸マグネシウム、パルミチン酸アスコルビル、ポリフェノール類、Ｎ−アセチルシステイン、リジン、プロリン、アルギニン、セレン、銅、およびマンガンを含む、癌の治療に有用な栄養医薬調合物。
  21. アスコルビン酸２５０ｍｇ、アスコルビン酸カルシウム２５０ｍｇ、アスコルビン酸マグネシウム２５０ｍｇ、パルミチン酸アスコルビル２５０ｍｇ、ポリフェノール類１０００ｍｇ、Ｎ−アセチルシステイン２００ｍｇ、リジン１０００ｍｇ、プロリン７５０ｍｇ、アルギニン５００ｍｇ、セレン３０ｍｃｇ、銅２ｍｇ、およびマンガン１ｍｇを含む、請求項２０の栄養医薬調合物。
  22. アスコルビン酸２５ｍｇ、アスコルビン酸カルシウム２５ｍｇ、アスコルビン酸マグネシウム２５ｍｇ、パルミチン酸アスコルビル２５ｍｇ、ポリフェノール類２００ｍｇ、Ｎ−アセチルシステイン１０ｍｇ、リジン５０ｍｇ、プロリン２５ｍｇ、アルギニン５０ｍｇ、セレン１ｍｃｇ、銅２０ｍｃｇ、およびマンガン５０ｍｃｇを含む、請求項２０の栄養医薬調合物。
  23. アスコルビン酸５０００ｍｇ、アスコルビン酸カルシウム５０００ｍｇ、アスコルビン酸マグネシウム５０００ｍｇ、パルミチン酸アスコルビル５０００ｍｇ、ポリフェノール類５０００ｍｇ、Ｎ−アセチルシステイン１５００ｍｇ、リジン５０００ｍｇ、プロリン３０００ｍｇ、アルギニン３０００ｍｇ、セレン２００ｍｃｇ、銅９ｍｇ、およびマンガン１０ｍｇを含む、請求項２０の栄養医薬調合物。
  24. アスコルビン酸２５０ｍｇ、アスコルビン酸カルシウム２５０ｍｇ、アスコルビン酸マグネシウム２５０ｍｇ、パルミチン酸アスコルビル２５０ｍｇ、ポリフェノール類１０００ｍｇ、Ｎ−アセチルシステイン２００ｍｇ、リジン１０００ｍｇ、プロリン７５０ｍｇ、アルギニン５００ｍｇ、セレン１００ｍｃｇ、銅２ｍｇ、マンガン１ｍｇ、カルシウム５００ｍｇ、およびマグネシウム４００ｍｇを含む、請求項２０の栄養医薬調合物。
  25. アスコルビン酸２５０ｍｇ、アスコルビン酸カルシウム２５０ｍｇ、アスコルビン酸マグネシウム２５０ｍｇ、パルミチン酸アスコルビル２５０ｍｇ、ポリフェノール類１０００ｍｇ、Ｎ−アセチルシステイン２００ｍｇ、リジン１０００ｍｇ、プロリン７５０ｍｇ、アルギニン５００ｍｇ、セレン１００ｍｃｇ、銅２ｍｇ、マンガン１ｍｇ、カルシウム５００ｍｇ、マグネシウム４００ｍｇ、およびシトラスバイオフラボノイド２００を含む、請求項２０の栄養医薬調合物。
  26. Ｌ−リジン、Ｌ−プロリン、Ｌ−アルギニン、アスコルビン酸、カルシウム、マグネシウム、ポリフェノール類、Ｎ−アセチルシステイン、セレン、銅、およびマンガンを含む、癌の治療に有用な栄養医薬調合物。
  27. Ｌ−リジン１０００ｍｇ、Ｌ−プロリン７５０ｍｇ、Ｌ−アルギニン５００ｍｇ、アスコルビン酸７１０ｍｇ、カルシウム２２ｍｇ、マグネシウム５０ｍｇ、ポリフェノール類１０００ｍｇ、Ｎ−アセチルシステイン２００ｍｇ、セレン３０ｍｃｇ、銅２ｍｇ、およびマンガン１ｍｇを含む、請求項２６の栄養医薬調合物。
  28. 前記アスコルビン酸が、アスコルビン酸、アスコルビン酸カルシウム、アスコルビン酸マグネシウムおよびパルミチン酸アスコルビルからなる群より選ばれる、請求項２７の栄養医薬調合物。
  29. ポリフェノールが、エピガロカテキンガレート、エピカテキンガレート、エピガロカテキン、エピカテキン、カテキンおよび他の薬学的に許容し得るポリフェノール塩及び（又は）その混合物からなる群より選ばれる、請求項２７の栄養医薬調合物。
  30. 個体の癌を治療する方法であって、その個体に請求項１から２９のいずれかに記載の栄養医薬調合物を投与する工程を含む方法。
  31. 癌が、メラノーマ癌、乳癌、大腸癌、肺癌および脳腫瘍からなる群より選ばれる、請求項３０の方法。
  32. 個体の炎症性疾患を治療する方法であって、その個体に請求項１から２９のいずれかに記載の栄養医薬調合物を投与する工程を含む方法。
  33. 炎症性疾患が変形性関節症である、請求項３２の方法。
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