CN106138036A - 抗坏血酸棕榈酸酯在制备抗肿瘤药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了抗坏血酸棕榈酸酯在制备抗肿瘤药物中的应用。体外细胞试验及荷瘤小鼠试验表明，本药物或其组合物对多种恶性肿瘤有效，尤其是乳腺癌、肝癌、肺癌、胰腺癌、胃癌、宫颈癌、胶质瘤、前列腺癌、结直肠癌。抗坏血酸棕榈酸酯适用于静脉注射和口服或瘤内注射等途径给药，并且有优良的物理化学稳定性。

Description

抗坏血酸棕榈酸酯在制备抗肿瘤药物中的应用

技术领域

本发明涉及一种治疗恶性肿瘤的药物，尤其是用于静脉注射和口服或瘤内注射等途径给药的抗坏血酸棕榈酸酯抗癌药物，它以抗坏血酸棕榈酸酯或和一种或多种其它化疗药物合用，制备成药学上可接受的注射或口服剂型给药。本发明的药物，有优良的物理化学稳定性和确切的抗肿瘤作用，体外细胞试验及荷瘤小鼠试验表明，本药物或其组合物对乳腺癌、肝癌、肺癌、胰腺癌、胃癌、宫颈癌、胶质瘤、前列腺癌、结直肠癌等多种恶性肿瘤有效。

背景技术

维生素C(Vitamin C)又称抗坏血酸(Ascorbic acid)，化学分子式是C₆H₈O₆。是1928年由匈牙利科学家与诺贝尔化学奖获得者Szent-Gyorgyi首次分离并报道 ^[1]，化学结构式如图5所示。维生素C具有很多重要的生理功能^[2]，例如可通过激活羟化酶而促进胶原蛋白的生成；可将食物中的Fe³⁺还原为Fe²⁺，促进人体对Fe²⁺的吸收，预防和治疗缺铁性贫血；在谷胱甘肽还原酶的作用下可使氧化型谷胱甘肽还原为还原型谷胱甘肽，有利于维持细胞膜的完整性；在消化道中可形成酸性介质，防止不溶性钙络合物的生成，促进膳食钙的吸收，利于维持骨骼和牙齿的正常功能。

研究结果表明，低剂量的维生素C是一种抗氧化剂，参与体内多种酶促反应过程，是维持生命活动的重要物质。高剂量的维生素C则具有氧化作用，在肿瘤细胞内Fe³⁺的催化下可产生H₂O₂而起到杀死肿瘤细胞作用。自20世纪70年代以来，维生素C的抗肿瘤作用引起了较为广泛的关注。最初由美国科学家L.Pauling和癌症专家E.Cameron根据当时已有的一些流行病学资料、动物实验和临床实验提出了癌症的维生素C治疗方法^[3]。随后，越来越多的实验表明，维生素C可在一定程度上防治肿瘤，对多种肿瘤细胞具有选择性抑制及杀伤作用^[4]。此外，维生素C还可增强抗肿瘤药物活性，降低抗肿瘤药物的毒副作用。维生 素C治疗肿瘤的作用机制主要包括以下三个方面^[5]：(1)静脉注射药理浓度的维生素C作为H₂O₂的前药被运送到细胞外液，在细胞外产生H₂O₂后，H₂O₂可通过细胞膜，细胞外的H₂O₂进入细胞膜脂质层，形成H₂O₂或中间产物，正常细胞中这些产物可以被清除，但在敏感的肿瘤细胞中却无法被清除，进而可以起到选择性杀伤肿瘤细胞的作用^[6]。(2)维生素C能影响肿瘤凋亡相关基因P53、C-myc、Bcl-2的表达，抑制肿瘤细胞内DNA复合物的合成，干扰肿瘤细胞代谢周期，诱导肿瘤细胞的分化，限制肿瘤细胞的生长，促进肿瘤细胞的凋亡^[7]。(3)维生素C可与胺竞争结合硝酸盐，抑制致胃癌、食管癌的物质亚硝胺的生成^[8]。

抗坏血酸棕榈酸酯(L-palmitoyl ascorbate，PA)又称L-维生素C棕榈酸酯、棕榈酰抗坏血酸酯，分子式是C₂₂H₃₈O₇，化学结构式如图6所示，人工合成于1943年，为美国Swern等人由维生素C的C6位OH和一分子棕榈酸脱水成酯生成的^[10]。由于棕榈酸基的植入，使其既有亲水的抗坏血酸基，又有亲油的棕榈酰酯，从而成为了一种优良的抗氧化剂。

抗坏血酸棕榈酸存在于枸杞等植物药或食材中，有极高的安全性，已被广泛用作水产及养殖业的饲料添加剂，食品和药品中的抗氧化剂，化妆品的增白剂等，全世界每年使用量约为5000吨；是我国唯一一种被允许加入婴儿食品中的抗氧化剂；美国药典(TheUnited States Pharmacopeial Convention 35)及欧洲药典(European Pharmacopoela8.0)已作为药用辅料应用。

目前国内外未见其作为主要治疗成分的药物制剂产品，也没有相应的临床应用报道，尤其是抗肿瘤用途的药物，仅见少量的细胞或动物实验零星报道 ^{[11，12，13，14，15，16，17]}，但其研究结果存在四个问题，尚不足以作为抗坏血酸棕榈酸酯制备抗肿瘤药的依据：1、用于研究其药效的细胞株种类较少，仅有乳腺癌、卵巢癌、肾癌、腹水癌、皮肤癌、白血病等共7种，而对临床上常见的乳腺癌、肝癌、肺癌、胰腺癌、胃癌、宫颈癌、胶质瘤、前列腺癌、结直肠癌、口腔上皮癌、淋巴癌、食道癌、黑色素瘤A375、膀胱癌、鼻咽癌等尚未报道；2、其研究结果中抗坏血酸棕榈酸酯的抗肿瘤活性不强(IC₅₀＞1000μM)，与维生素C相比无明显优势，与本研究的结果(IC₅₀＜200μM)相差较大，分析原因可能为其研究过程中抗坏血酸棕榈酸酯的浓度比标示量低，抗坏血酸棕榈酸酯溶解不完全或放置条 件不当导致其被氧化或降解；3、虽然也有抗坏血酸棕榈酸酯脂质体的报道^[11]，但其配方中药物与辅料的比例及胆固醇与磷脂的比例不当且放置过程中抗坏血酸棕榈酸酯容易被氧化。文献中抗坏血酸棕榈酸酯在处方中所占的摩尔比为30mol％(折算为质量比为34.6％)^[11]，本研究表明该比例过大，制备出的脂质体包封率低，且放置过程中抗坏血酸棕榈酸酯容易析出；胆固醇的比例过高(磷脂∶胆固醇＝70∶30mol％，即为2∶1，w/w)，这会导致脂质体微囊膜形成困难，膜不牢固易破坏从而导致包含物泄漏；得到的制剂由于包封率低及稳定性差，可能是其细胞实验结果中抗癌活性较差的主要原因；4、虽然文献中也有抗坏血酸棕榈酸酯与阿霉素^[15]或紫杉醇^[14]合用制成复方制剂的报道，但其处方中抗坏血酸棕榈酸酯的含量均较低，达不到协同增效的目的。印度卡卡提亚大学(Kakatiya University)的Rambhau Devraj教授报道^[15]了一种抗坏血酸棕榈酸酯与阿霉素的复方脂质体制剂，其抗坏血酸棕榈酸酯与阿霉素(DOX)的比例为0.6∶1(w/w)，(注：其10mL制剂中含抗坏血酸棕榈酸酯为15mg，DOX为25mg(浓度为2.5mg/mL)，所以抗坏血酸棕榈酸酯∶DOX＝15∶25＝0.6∶1，w/w)。而美国东北大学的VladimirP.Torchilin教授报道了一种抗坏血酸棕榈酸酯与紫杉醇的复方脂质体制剂^[13，14]，抗坏血酸棕榈酸酯与紫杉醇的比例为20∶3.4＝5.88∶1(w/w)或10∶2＝5∶1(w/w)(参见该文献图5：PCT loaded PA-liposomes(20mg/kg of PA and 3.4mg/kg of PCT)，及文献图6：(10mg/kgof PA and 2mg/kg of PCT))。

本发明的理论依据是，将抗坏血酸棕榈酸酯作为维生素C的一种脂溶性前药，由于将维生素C分子中的羟基酯化后其亲脂性得到了增强，所以从理论上讲它更容易进入肿瘤细胞，只要在酶的作用下能水解出大量的维生素C，就有可能发挥出比维生素C更强的疗效。

本发明专利的目的就是将抗坏血酸棕榈酸酯作为维生素C的一种脂溶性前药，在大量研究的基础上阐明了其在制备抗肿瘤药物中的应用。

本研究表明，抗坏血酸棕榈酸酯对大多数肿瘤细胞的IC₅₀小于200μM(见表1、表2及附图1)，而维生素C对肿瘤细胞的IC₅₀则大于1000μM，所以其疗效与维生素C相比可提高10倍以上。

本研究表明，抗坏血酸棕榈酸酯对其它抗肿瘤药物合用具有明显的增效协同作用。

抗坏血酸棕榈酸酯的另一个优点是其化学性质相对较稳定，与空气短期接触不易被氧化，从而可制成纳米制剂或脂质体等靶向药物，也可与其它化疗药制成复方制剂起到增效减毒的目的。

参考文献

[1]Grzybowski A，Pietrzak K.Albert(1893-1986)：The scientistwho discovered vitamin C[J].Clinics in Dermatology，2013，31(3)：327-331.

[2]曾翔云.维生素C的生理功能与膳食保障.[J].中国食物与营养，2005，4：52-54.

[3]Cameron E and Pauling L.Cancer and Vitamin C Linus Paulinginstitute of science and medicine，Mendio Park，California 1979.

[4]M.W.Roomi，D.House，M.Eckert-Maksic，Z.B.Maksic，C.S.Tsao，Growthsuppression of malignant leukemia cell line in vitro by ascorbic acid(vitaminC)and its derivatives.[J].Cancer Letter 1998(122)：93-99.

[5]荆晓娟.维生素C在肿瘤治疗中的作用研究进展.[J].医学综述.2010，16(4)：555-556.

[6]Chen Q，Espey MG，Krishna MC，etal.Pharmacologic ascorbic acidconcentrations selectively kill cancer cells action as a pro-drug to deliverhydrogen peroxide to tissues.

[7]Kang Jiu-Hong，SHI Yi-Min，ZHENG Rong-Liang，Effects of ascorbic acidon human hepatoma cell proliferation and redifferentiation.[J].Acta PharmacolSin.1999，20(11)：1019-1024.

[8]朱雨霏.亚硝胺类化合物的致癌作用及预防.[J].环境保护与循环经济.2008：34-35.

[10]Sapper H，Cameron D G，Mantsch H H.The thermotropic phase behaviorof ascorbyl palmitate：an infrared spectroscopic study[J].Canadian Journal ofChemistry，2011，59：2543-2549.

[11]Sawant R R，Vaze O S，Wang T，et al.Palmitoyl ascorbate liposomesand free ascorbic acid：comparison of anticancer therapeutic effects uponparenteral administration.[J].Pharmaceutical Research，2012，29(2)：375-383(9).

[12]Sawant R R，Vaze O，D’Souza G G M，et al.Palmitoyl ascorbate-loadedpolymeric micelles：cancer cell targeting and cytotoxicity.[J].PharmaceuticalResearch，2011，28(2)：301-308.

[13]Sawant R R，Vaze O S，Rockwell K，et al.Palmitoyl ascorbate-modifiedliposomes as nanoparticle platform for ascorbate-mediated cytotoxicity andpaclitaxel co-delivery[J].European Journal of Pharmaceutics&BiopharmaceuticsOfficial Journal of Arbeitsgemeinschaft Fur Pharmazeutische VerfahrenstechnikE V，2010，75(3)：321-326.

[14]D’Souza G G M，Wang T，Rockwell K，et al.Surface modification ofpharmaceutical nanocarriers with ascorbate residues improves their tumor-cellassociation and killing and the cytotoxic action of encapsulated paclitaxelin vitro[J].Pharmaceutical research，2008，25(11)：2567-2572.

[15]Jukanti R，Devraj G，Shashank A S，et al.Biodistribution of ascorbylpalmitate loaded doxorubicin pegylated liposomes in solid tumor bearing mice[J].Journal of microencapsulation，2011，28(2)：142-149.

[16]陈鹏.维生素C为亲水片断的脑靶向药物载体的合成研究[D].北京化工大学，2010..

[17]谷雪贤.维生素C衍生物的制备及其在化妆品中的应用[J].化学试剂，2011，(4)：325-328.

发明内容

本发明的目的在于针对目前临床癌症的治疗，特别是治疗恶性肿瘤的现有药物中存在的全身副作用大、靶向性差的缺点，提供一种疗效确切、副作用小的新型药物，即抗坏血酸棕榈酸酯在制备抗肿瘤药物中的应用，抗坏血酸棕榈酸酯可以注射或口服剂型给药。

本发明优选的技术方案如下：

●抗坏血酸棕榈酸酯在制备抗癌药物中的应用。

●抗坏血酸棕榈酸酯在制备抗乳腺癌药物中的应用。

●抗坏血酸棕榈酸酯在制备抗肝癌药物中的应用。

●抗坏血酸棕榈酸酯在制备抗肺癌药物中的应用。

●抗坏血酸棕榈酸酯在制备抗胰腺癌药物中的应用。

●抗坏血酸棕榈酸酯在制备抗胃癌药物中的应用。

●抗坏血酸棕榈酸酯在制备抗宫颈癌药物中的应用。

●抗坏血酸棕榈酸酯在制备抗胶质瘤药物中的应用。

●抗坏血酸棕榈酸酯在制备抗前列腺癌药物中的应用。

●抗坏血酸棕榈酸酯在制备抗结直肠癌药物中的应用。

抗坏血酸棕榈酸酯是临床口服、注射常用的安全、依从性好的化学药。可以在杀伤肿瘤细胞的同时不损伤宿主细胞，达到高选择性，大大降低抗癌药物的毒副作用。优选的本发明中抗坏血酸棕榈酸酯的剂量应大于0.1mg/mL。

为了使用的方便本发明的药物组合物还可以包含药剂学上可接受的辅料。所述药剂学可接受的辅料，包括溶媒、增溶剂、稳定剂、赋形剂、载体、高分子材料、表面活性剂、冻干保护剂等，主要选自注射用水、生理盐水、乙醇、丙二醇、甘油；聚乙二醇200、聚乙二醇400、聚乙二醇600、十二羟基硬脂酸锂、聚氧乙烯蓖麻油类、聚山梨醇酯、吐温、司盘、脱氧胆酸盐类、胆酸盐、泊洛沙姆、聚乙烯吡咯烷酮、油性脂肪酸及其单或二甘油酯；乳糖、蔗糖、木糖醇、山梨醇、甘露醇、乳糖醇、右旋糖苷、d-木糖、葡萄糖；磷脂、明胶、阿拉伯胶、虫胶、瓜耳豆胶、琼脂、海藻酸及其盐、聚乙烯醇、聚乙二醇、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、乙烯一醋酸乙烯共聚物、聚酰胺、醋酸纤维素、聚丙烯酸树脂、乙基纤维素、卡波姆、白蛋白、壳聚糖、葡聚糖、甲壳素、聚乳酸、聚己内酯酸、聚乳酸羟基乙酸、聚乙烯醇、聚羟基乙酸、磷脂酰胆碱类、磷脂酰甘油类、磷脂酰肌醇类、磷脂酰乙醇胺类、神经鞘磷脂类、单链或双链磷脂(二肉蔻酸磷脂酰甘油、二月桂酸磷脂酰甘油、二软脂酸磷脂酰甘油、二硬脂酸磷脂酰甘油、二肉蔻酸磷脂酸、二月桂酸磷脂酸、二软脂酸磷脂酸、二硬脂酸磷脂酸、二油酸磷脂酰丝氨酸、二亚油酸磷脂酰肌醇、二棕榈酸磷脂酰胆碱、二月桂酸磷脂酰胆碱、二肉豆蔻酸磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰胆碱、单肉蔻酸磷脂酰甘油、单月桂酸磷脂酰甘油、单软脂酸磷脂酰甘油、单硬脂酸磷脂酰甘油、单肉蔻酸磷脂酸、单月桂酸磷脂酸、单软脂酸磷脂酸、单硬脂酸磷脂酸、单油酸磷脂酰丝氨酸、单亚油酸磷脂酰肌醇、单棕榈酸磷脂酰胆碱、单月桂酸磷脂酰胆碱、单肉豆蔻酸磷脂酰胆碱、单硬脂酰磷脂酰胆碱、卵磷脂、大豆磷脂、心磷脂、天 然或合成的脑磷脂、胆固醇中的一种、二种或多种同时用。

本法药物组合物的剂型优选制备成注射用制剂或口服制剂，包括注射用无菌分装粉末、注射用油、脂质体、微乳、微球、纳米粒制剂等有关的控释剂型，口服脂质体、微乳、微球、纳米粒制剂等有关的控释剂型。

例如以注射用脂质体为例，该复方制剂的制备工艺如下：

精密称取处方量的抗坏血酸棕榈酸酯、化疗药物、载体溶解于有机溶剂中，旋转减压蒸发除去有机溶剂，得到均匀脂质薄膜，置于真空干燥箱中干燥过夜后加入注射用水水化，超声使薄膜脱落，经探针超声处理或高压均质处理，经滤膜过滤整粒，即得。

本发明提供了本发明药物的使用方法，该抗坏血酸棕榈酸酯药物除用于瘤内注射外，还可用于静脉、动脉注射、口服、介入治疗等方式给药。介入治疗和瘤内注射，是近年来新发展起来的一门治疗技术，它们可以直接将药物注射入肿瘤部位，使药物能够直接作用于肿瘤组织和肿瘤细胞，具有非常好的靶向性，可大大降低抗肿瘤药物的全身性毒副作用。临床上多种形式的介入治疗，是目前公认的不能手术切除的恶性肿瘤(尤其是中晚期原发性肝癌或肝脏转移癌)的首选治疗手段，已为广大临床医生所普通接受。瘤内注射属于介入治疗的一种，它是将药物通过特殊的设备，直接注射至实体瘤组织中，从而发挥杀灭肿瘤细胞的作用。大剂量抗坏血酸棕榈酸酯的杀肿瘤细胞作用，在体外试验中已得到充分的证实，故选择抗坏血酸棕榈酸酯介入或瘤内注射方式给药，能够达到最好的抗癌效果。本发明的药物除可用于静脉注射或静脉滴注外，在临床还优先用于肝癌、胰腺癌等实体恶性肿瘤及其它脑瘤、食管癌等多种恶性肿瘤等的瘤内注射、介入治疗和静脉、动脉、肌肉、皮下等特殊途径给药，也用于因身体部位的原因无法用手术、放射等进行治疗的实体瘤，还用于临床需要综合手段治疗的肿瘤。

有益技术效果

1)与市场已有的治疗恶性肿瘤的药物或常用化疗药物相比，本发明选择安全性好的抗坏血酸棕榈酸酯作为抗肿瘤的主药，具有抗瘤谱广、作用明确、副作用小、不易产生耐药性的优点，且本药物可以用于瘤内注射给药，极大地提高了实体恶性肿瘤的治疗效果。

2)抗坏血酸棕榈酸酯在制备抗癌症药物中的应用和维生素C相比具有如下优点：抗坏血酸棕榈酸酯对于肿瘤的抑制活性远远高于维生素C，是维生素C的6.8倍。

附图说明

图1.抗坏血酸棕榈酸酯溶液在14种细胞株内的体外药效试验结果。

图1-1.PA对MCF-7细胞的体外药效试验

图1-2.PA对HepG-II细胞的体外药效试验

图1-3.PA对A549细胞的体外药效试验

图1-4.PA对BxPC-3细胞的体外药效试验

图1-5.PA对SGC-7901细胞的体外药效试验

图1-6.PA对MKN45细胞的体外药效试验

图1-7.PA对Hela细胞的体外药效试验

图1-8.PA对U87细胞的体外药效试验

图1-9.PA对U251细胞的体外药效试验

图1-10.PA对PC-3细胞的体外药效试验

图1-11.PA对LOVO细胞的体外药效试验

图1-12.PA对HCT-116细胞的体外药效试验

图1-13.PA对HELF细胞的体外药效试验

图1-14.PA对L-02细胞的体外药效试验

图2.抗坏血酸棕榈酸酯溶液和维生素C溶液在人肺癌细胞A549内的体外药效试验结果。

图3.荷瘤小鼠体内抗肿瘤试验结果(肿瘤体积)。荷瘤各组小鼠分别给予生理盐水(Saline)、阿霉素水溶液(DOX solution，0.1mg/kg)、PA纳米粒(PA-NPS，20mg/kg)、复方纳米粒(DOX-PA-NPS，DOX：0.1mg/kg，PA：20mg/kg)后，各组的相对肿瘤体积变化。

图4.荷瘤小鼠体内抗肿瘤试验结果(体重变化)。荷瘤小鼠各组分别给予生理盐水(Saline)、阿霉素水溶液(DOX solution，0.1mg/kg)、PA纳米粒(PA-NPS，20mg/kg)、复方纳米粒(DOX-PA-NPS，DOX：0.1mg/kg，PA：20mg/kg)后，各组的体重变化。

图5.维生素C的化学结构式。

图6.抗坏血酸棕榈酸酯的化学结构式。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明作进一步说明，该部分并非对本发明的限定，依照本领域公知的现有技术，本发明的实施方式并不限于此，因此凡依照本发明公开内容所作出的本领域的等同替换，均属于本发明的保护范围。

试验说明：

抗坏血酸棕榈酸酯(以下简称为PA)；维生素C(以下简称为Vc)。

本专利药理试验主要包括：

一、体外药效试验：

1.PA对14种细胞的抗癌效果(12种肿瘤细胞，2种正常细胞)；

2.PA与Vc抗肿瘤效果比较；

二、制备脂质体与纳米粒制剂：

1.制备PA脂质体、复方脂质体、PA纳米粒、复方纳米粒

2.荷瘤小鼠体内抗肿瘤试验：比较复方纳米粒、PA单方纳米粒、抗肿瘤药注射液的抗肿瘤作用差别。

实验例1、PA的体外药效试验

药物配制

称取PA溶于高压灭菌水中，制成1mol/L储备液，在超净工作台内以0.22μm一次性针式滤器过滤，保存于-80℃冰箱，用时直接加入培养液中配成相应浓度 的药液。

MTT法测定细胞活性

取对数生长期的细胞株经0.25％胰酶消化后，用含10％胎牛血清的RPMI1640培养液配成单细胞悬液，以3×10³个/mL的密度接种于96孔板中，每孔加入100μL细胞悬液，置于37℃、5％CO₂培养箱中无菌培养箱中培养24h，待细胞充分贴壁后，去除原有的培养液，每孔加入用培养液配置的不同浓度PA100μL。对照组加入含0.1％DMSO的培养液，37℃培养72h。培养结束后吸弃药液，每孔加入PBS 100μL洗去残留的药液，每孔加入含10％5mg/mL MTT工作液培养液100μL，37℃继续培养4h。吸弃上清液，每孔加入150μL DMSO，振荡10min以充分溶解结晶物，在酶标仪490nn下测定OD值，按下列公式计算给予药物后肿瘤细胞的存活率，并采用GraphPad数据处理软件计算半数抑制浓度(IC₅₀)。

上述细胞株选自：人乳腺癌细胞株MCF-7、人肝癌细胞株HepG-II、人肺癌细胞株A549、人原位胰腺癌细胞株BxPC-3、人胃癌细胞株SGC-7901、MKN45、人宫颈癌细胞株Hela、人脑胶质瘤细胞U-87、人胶质瘤细胞株U251、人前列腺癌细胞株PC-3、人结肠癌细胞株LOVO、人结直肠癌细胞株HCT-116、人胚肺成纤维细胞株HELF、人正常肝细胞株L-02。

试验结果：见表1、表2及附图1。

试验结果显示，PA对两种正常细胞株的IC₅₀大于130μM，肿瘤细胞株中，人乳腺癌细胞MCF-7、人肺癌细胞A549、人胃癌细胞SGC-7901的IC₅₀大于130μM，其余细胞的IC₅₀值，均小于130μM，表明PA对人乳腺癌细胞、人肺癌细胞、人胃癌细胞的抗癌效果较差，对人肝癌细胞、人原位胰腺癌细胞、人宫颈癌细胞、人脑胶质瘤细胞、人胶质瘤细胞、人前列腺癌细胞、人结肠癌细胞抗癌效果较好。

表1：PA对不同细胞株的抑制率

表2.PA对不同细胞株的IC₅₀值

试验例2：PA与Vc体外药效试验比较

药物配制

称取PA、Vc溶于高压灭菌水中，制成1mol/L储备液，在超净工作台内以0.22μm一次性针式滤器过滤，保存于-80℃冰箱，用时直接加入培养液中配成相应浓度的药液。

MTT法测定细胞活性

选用对数生长期的贴壁肿瘤细胞(人肺癌细胞，A549)，用胰酶消化后，用含10％小牛血清的1640培养基配成2.5*10⁴个/mL的细胞悬液，接种在96孔培养板中，每孔接种200μL，37℃，5％CO2培养24h。

空白组铺板时加不含细胞的培养基，加药时加不含药的培养基；试验组换新的含不同浓度被测样品的培养基，对照组则换含等体积溶剂的培养基，每组设6个平行孔，37℃，5％CO2培养72h。试验组分为Vc溶液组和PA溶液组，Vc溶液组0.128～10000μM，PA溶液组：0.003456～270μM。培养结束后弃去上清液，用PBS清洗2～3次，每孔加入200μL新鲜配制的含0.5mg/mL MTT的无血清培养基，37℃继续培养4h。小心弃上清，并加入150μL DMSO，用微型超声振荡器混匀后，在酶标仪上以波长为490nm测定OD值，采用GraphPad数据处理软件计算半数抑制浓度(IC₅₀)。

试验结果：见表3、表4及附图2。

试验结果显示，与Vc溶液组相比，PA溶液组的IC₅₀值明显降低。

表3：PA和Vc对人肺癌细胞A549的抑制率

表4.PA和Vc对人肺癌细胞A549的IC₅₀值

实施例3

制备例1：注射用抗坏血酸棕榈酸酯脂质体

称取处方量的抗坏血酸棕榈酸酯、大豆磷脂和胆固醇，溶于二氯甲烷中，并置旋蒸仪中减压干燥，使成一均匀的脂质薄膜，置于真空干燥箱中干燥过夜后，加入注射用水水化，超声使薄膜脱落，经探针超声处理或高压均质处理，最后经0.22μm微孔滤膜过滤整粒，即得。

制备例2：注射用复方脂质体

称取处方量的抗坏血酸棕榈酸酯、多西紫杉醇、大豆磷脂和胆固醇，溶于二氯甲烷中，并置旋蒸仪中减压干燥，使成一均匀的脂质薄膜，置于真空干燥箱中干燥过夜后，加入注射用水水化，超声使薄膜脱落，经探针超声处理或高压均质处理，最后经0.22μm微孔滤膜过滤整粒，即得。

制备例3：注射用抗坏血酸棕榈酸酯纳米粒

将PLGA溶解于丙酮中形成PLGA丙酮溶液，将抗坏血酸棕榈酸酯加入PLGA丙酮溶液中作为油相，将大豆磷脂溶于乙醇溶液，加入泊洛沙姆188、DSPE-PEG-BIOTIN，水浴除去有机溶剂作为水相，将油相滴加入恒温搅拌的水相中，滴加完毕后继续搅拌以除去有机溶剂，将其加入透析袋中透析过夜后，加入甘露醇冷冻干燥，即得。

制备例4：注射用复方纳米粒

将PLGA溶解于丙酮中形成PLGA丙酮溶液，将抗坏血酸棕榈酸酯、阿霉素加入PLGA丙酮溶液中作为油相，将大豆磷脂溶于乙醇溶液，加入泊洛沙姆188、DSPE-PEG-BIOTIN，水浴除去有机溶剂作为水相，将油相滴加入恒温搅拌的水相中，滴加完毕后继续搅拌以除去有机溶剂，将其加入透析袋中透析过夜后，加入甘露醇冷冻干燥，即得。

荷瘤小鼠体内抗肿瘤试验

取一定浓度的阿霉素与PA复方纳米制剂、PA纳米制剂，与阿霉素注射液对比进行荷瘤小鼠体内抗肿瘤试验，以生理盐水作为阴性对照。

动物模型的建立

采用昆明种雄性ICR小白鼠，无菌抽取第三次传代第8天小鼠的腹水，用无血清RPMI1640培养基稀释，调细胞浓度至1×10⁷个/mL，将小鼠迅速乙醚麻醉后，背部皮肤消毒，每只小鼠接种约0.2mL Heps肿瘤细胞悬液于背部皮下，整个接种过程在2小时内完成。

试验方案

采用尾静脉注射给药方式，生理盐水组，复方阿霉素/PA纳米粒组(阿霉素0.1mg/kg，PA20mg/kg)，PA纳米粒组(PA20mg/kg)，阿霉素溶液组(阿霉素0.1mg/kg)。在第1天，第4天，第7天各给药一次，每三天测量小鼠肿瘤的体积和小鼠体重，并观察和记录小鼠的身体状况及死亡情况。按以下公式计算荷瘤小鼠相对肿瘤体积：

试验结果见表5、表6及附图3、附图4。

试验结果显示，与生理盐水组相比，复方纳米粒组，PA纳米粒组，阿霉素 水溶液组相对肿瘤体积均明显减小，其中复方纳米粒组相对肿瘤体积最小，其次为PA纳米粒组，说明纳米粒制剂存在优势；给药后，各组荷瘤小鼠的体重变化均不是很明显，说明复方纳米粒毒性较小。

表5：各组荷瘤小鼠相对肿瘤体积变化

表6：各组荷瘤小鼠体重变化(g)

Claims (10)

1.抗坏血酸棕榈酸酯在制备抗癌药物中的应用。

2.抗坏血酸棕榈酸酯在制备抗乳腺癌药物中的应用。

3.抗坏血酸棕榈酸酯在制备抗肝癌药物中的应用。

4.抗坏血酸棕榈酸酯在制备抗肺癌药物中的应用。

5.抗坏血酸棕榈酸酯在制备抗胰腺癌药物中的应用。

6.抗坏血酸棕榈酸酯在制备抗胃癌药物中的应用。

7.抗坏血酸棕榈酸酯在制备抗宫颈癌药物中的应用。

8.抗坏血酸棕榈酸酯在制备抗胶质瘤药物中的应用。

9.抗坏血酸棕榈酸酯在制备抗前列腺癌药物中的应用。

10.抗坏血酸棕榈酸酯在制备抗结直肠癌药物中的应用。