KR20040073559A - 폴리페놀을 포함하는 영양성 제약 제제 및 암 치료에서의용도 - Google Patents

폴리페놀을 포함하는 영양성 제약 제제 및 암 치료에서의용도 Download PDF

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라쓰 마티아스
슈리랑 넷케
알렉산드라 니드츠비키
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라쓰 마티아스
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Abstract

아스코르브산, L-리신, L-프롤린 및 에피갈로카테킨 갈레이트, 에피카테킨 갈레이트, 에피갈로카테킨, 에피카테킨, 카테킨으로 구성된 군에서 선택되는 1종 이상의 폴리페놀 화합물을 포함하는 영양성 제약 제제, 및 암 및 다른 종양에서의 치료 용도가 제공된다. 에피칸 포르테(EPICAN FORTE)TM의 영양성 제약 제제 조성물 및 암을 예방 및 치료함에 있어서 그의 사용 방법이 개시되어 있다.

Description

폴리페놀을 포함하는 영양성 제약 제제 및 암 치료에서의 용도 {A Nutrient Pharmaceutical Formulation Comprising Polyphenols and Use in Treatment of Cancer}
관련 출원에 대한 상호참조
본 출원은 35 U.S.C.§119(e)하에서 미국 가특허출원 일련번호 60/348,143호 (2002년 1월 11일 출원)의 이익을 특허청구하며, 상기 출원은 본 명세서에서 그 전체가 참고문헌으로 포함된다.
암은 산업화된 세계에서 주요 사망 원인 중의 하나이다. 암에 대한 특이적 원인 요법이 존재하지 않으며, 암으로부터의 사망율이 모든 질병 중에서 가장 높다. 대부분 널리 사용되는 치료법 (화학요법 및 방사선요법)은 건강한 조직과 암을 구별하지 못하고, 심각한 부작용과 연관된다. 따라서, 암의 선택적 치료법이 요구되고 있다.
신체에서 암 세포가 확장되고 전이되기 위해 사용하는 주요 메카니즘의 하나는, 주변의 연결 조직을 효소적으로 파괴하는 것과 관련된다. 특정 약물을 통해 이러한 과정을 제어하는 치료적 접근법은 성공적이지 못하였으며, 현재 암 전이를 제어하기 위해 이용가능한 수단이 존재하지 않는다. 화학요법 및 방사선요법을 사용한 현재의 치료 프로토콜은 신체에서의 암 세포 파괴에 촛점을 두고 있으며, 이러한 방법은 전이에 대해서는 해결하지 못한다. 게다가, 이러한 치료법은 독성이 높고, 비특이적이며, 심각한 부작용과 연관된다. 화학요법 및 방사선요법은 새로운 암의 발생 위험을 보유하며, 신체내에서 연결 조직의 파괴를 통하여 암의 침습을 더욱 수월하게 할 수 있다.
암 세포는 신체의 다른 부분으로 증식 및 팽창하기 위하여 각종 기질 금속단백질분해효소(MMPs) 및 플라스민을 통해 세포외 기질을 분해시키고, 그의 활성은 종양 증식의 공격성과 상관관계를 갖는다. 라스(Rath)와 폴링(Pauling) (1992)은, 아미노산, 리신 및 아스코르브산과 같은 영양소가 세포외 기질 단백질분해의 천연 억제제로서 작용할 수 있고, 따라서 종양 증식 및 팽창을 조정할 수 있는 가능성을 갖고 있는 것으로 가정하였다. 이러한 영양소는 여러 메카니즘을 통하여, 그 중에서도 MMPs의 억제에 의하여, 그리고 암 세포를 둘러싼 연결 조직의 강화에 의하여(종양 "캡슐화" 효과) 항-종양 가능성을 발휘할 수 있다.
미국 특허 5,962,517호는 여러가지 의학적 증후(좌창 치료)를 위한 제약 조성물을 개시하고 있다. 개시된 조성물은 좌창 감소 성분, 1종 이상의 우엉 뿌리 황색 참소리쟁이속(dock) 뿌리, 또는 카테킨-기재 조성물; 및 전이 금속을 포함한 피부 세포 조절 성분을 포함한다. 개시된 조성물은 암 치료 및/또는 예방에서 유리한 가치를 갖는 것으로 나타나 있지 않다.
PCT WO 00/76492호는 카테킨 화합물을 함유하는 질병 감소용 영양성 제제를 개시하고 있다. 그러나, 카테킨 화합물의 생체이용성은 다소 낮은 것으로 밝혀졌다 [Chen L., Lee M.J., Yang C.S. Drug Metab. Dispos. 25: 1045-1050 (1997); Yang C.S., Chen L., Lee M.J., Balentine D.A., Kuo M.C., Schantz S. Cancer Epidemol. Biomark. Prev. 7:351-35 (1998); Bell J.R., Donovan J.L., Wong R., Waterhouse H., German J.B., Walzem R.L., Kasim K.Am. J.Clin.Nutr. 71:103-108 (2000); Sherry Chow H.H., Cai Y., Alberts D.S., Hakim I., Dorr R., Shahi F., Crowell J.A., Yang S.C., Hara H. Cancer Epidemol. Biomark.Prev. 10: 53-58 (2001)]. PCT WO 00/76492호에는, 암 치료 및/또는 예방에서 요구되는 생체이용성을 증가시키는 수단이 개시되어 있지 않다.
데뮬(Demeule) 등은 녹차 카테킨이 기질 금속단백질분해효소에 대한 억제 효과를 가질 수 있음을 개시하고 있다. 그러나, 암 치료 및/또는 예방에서 어떻게 카테킨을 사용하는지에 관해서는 제안되거나 교시된 바 없다. 인간에서 폴리페놀의 생체이용성이 극히 낮은 사실을 고려하면, 카테킨의 낮은 조직 농도가 에피갈로카테킨 갈레이트(EGCG)를 포함한 폴리페놀의 치료적 가치를 크게 감소시킨다. 신생물형성 질병 및 염증성 질병과 연관된 기타 질병의 치료에서 효과적인 폴리페놀을 함유하는, 더욱 양호한 영양성 제약 조성물을 찾아내는 것이 부단히 요구되고 있다.
신체내에서 암 확장 과정을 제어하기 위해 사용될 수 있는 안전하고 효과적인 자연적 접근법이 계속 요구된다. 또한, 인간에서 발생되는 암 또는 양성 종양에 대한 예방 수단이 요구되며, 이러한 수단은 치료에 관련된 부작용의 위험이 없으면서 환자에게 적용될 수 있다. 최근들어 암의 발병율이 증가함에 따라, 영양성 제약 조성물은 널리 보급되고 있다. 이러한 조성물의 요구는 계속될 것이고 아마도 계속 증가할 것이다.
발명의 요약
하나의 목적에서, 본 발명은 a) 아스코르브산 화합물; b) L-리신 화합물; c) L-프롤린 화합물; 및 d) 에피갈로카테킨 갈레이트, 에피카테킨 갈레이트, 에피갈로카테킨, 에피카테킨 및 카테킨으로 구성된 군에서 선택되는 1종 이상의 폴리페놀 화합물을 포함하는, 암의 치료에서 유용한 영양성 제약 조성물을 제공한다. a) 내지 c)의 화합물은 암 증식 및 전이를 차단하는 폴리페놀 화합물의 활성을 향상시킨다.
바람직하게는, 아스코르브산 화합물은 아스코르브산, 제약학적으로 허용가능한 아스코르베이트 염, 아스코르베이트 에스테르 및/또는 이들의 혼합물로 구성된 군에서 선택된다. 바람직하게는, 제약학적으로 허용가능한 아스코르베이트 염은 칼슘 아스코르베이트 또는 마그네슘 아스코르베이트이다. 더욱 바람직하게는, 아스코르베이트 에스테르는 아스코르빌 팔미테이트이다. 바람직하게는, 리신 화합물은 리신 히드로클로라이드 및 리신 제약학적으로 허용가능한 리신 염으로 구성된 군에서 선택된다. 바람직하게는, 프롤린 화합물은 프롤린 히드로클로라이드 및 프롤린 제약학적으로 허용가능한 프롤린 염으로 구성된 군에서 선택된다.
다른 목적에서, 본 발명의 영양성 제약 조성물은 셀레늄, 구리, 망간, 칼슘 및 마그네슘으로 구성된 군에서 선택되는 미량 원소를 더욱 포함한다.
다른 목적에서, 본 발명의 영양성 제약 조성물은 아미노산을 더욱 포함한다. 바람직하게는, 아미노산은 아르기닌이다. 더욱 바람직하게는, 본 발명의 영양성 제약 조성물은 N-아세틸 시스테인을 더욱 포함한다.
다른 목적에서, 본 발명은 a) 아스코르브산 화합물; b) L-리신 화합물; c) L-프롤린 화합물; d) N-아세틸 시스테인; 및 e) 에피갈로카테킨 갈레이트, 에피카테킨 갈레이트, 에피갈로카테킨, 에피카테킨 및 카테킨으로 구성된 군에서 선택된 1종 이상의 폴리페놀 화합물을 포함하는, 암의 치료에서 유용한 영양성 제약 조성물을 제공한다. a) 내지 d) 화합물은 암 증식 및 전이를 차단하는데 있어서 폴리페놀 화합물의 활성을 향상시킨다.
다른 목적에서, 본 발명은 250mg 아스코르브산, 250mg 칼슘 아스코르베이트, 250mg 마그네슘 아스코르베이트, 250mg 아스코르빌 팔미테이트, 1,000mg 폴리페놀, 200mg N-아세틸-시스테인, 1,000mg 리신, 750mg 프롤린, 500mg 아르기닌, 30mcg 셀레늄, 2mg 구리 및 1mg 망간을 포함하는 영양성 제약 조성물을 제공한다.
다른 목적에서, 본 발명은 25mg 아스코르브산, 25mg 칼슘 아스코르베이트, 25mg 마그네슘 아스코르베이트, 25mg 아스코르빌 팔미테이트, 200mg 폴리페놀,10mg N-아세틸-시스테인, 50mg 리신, 25mg 프롤린, 50mg 아르기닌, 1mcg 셀레늄, 20mcg 구리 및 50mcg 망간을 포함하는 영양성 제약 조성물을 제공한다.
다른 목적에서, 본 발명은 5,000mg 아스코르브산, 5,000mg 칼슘 아스코르베이트, 5,000mg 마그네슘 아스코르베이트, 5,000mg 아스코르빌 팔미테이트, 5,000mg 폴리페놀, 1,500mg N-아세틸-시스테인, 5,000mg 리신, 3,000mg 프롤린, 3,000mg 아르기닌, 200mcg 셀레늄, 9mg 구리 및 10mg 망간을 포함하는 영양성 제약 조성물을 제공한다.
다른 목적에서, 본 발명은 250mg 아스코르브산, 250mg 칼슘 아스코르베이트, 250mg 마그네슘 아스코르베이트, 250mg 아스코르빌 팔미테이트, 1,000mg 폴리페놀, 200mg N-아세틸-시스테인, 1,000mg 리신, 750mg 프롤린, 500mg 아르기닌, 100mcg 셀레늄, 2mg 구리, 1mg 망간, 500mg 칼슘 및 400mg 마그네슘을 포함하는 영양성 제약 조성물을 제공한다.
다른 목적에서, 본 발명은 250mg 아스코르브산, 250mg 칼슘 아스코르베이트, 250mg 마그네슘 아스코르베이트, 250mg 아스코르빌 팔미테이트, 1,000mg 폴리페놀, 200mg N-아세틸-시스테인, 1,000mg 리신, 750mg 프롤린, 500mg 아르기닌, 1000mcg 셀레늄, 2mg 구리, 1mg 망간, 500mg 칼슘, 400mg 마그네슘 및 200mg 시트러스 바이오플라보노이드를 포함하는 영양성 제약 조성물을 제공한다.
또 다른 목적에서, 본 발명은 L-리신, L-프롤린, L-아르기닌, 아스코르브산, 칼슘, 마그네슘, 폴리페놀, N-아세틸-시스테인, 셀레늄, 구리 및 망간을 포함하는 암을 치료하는데 유용한 영양성 제약 조성물을 제공한다.
다른 목적에서, 본 발명은 1,000mg L-리신, 750mg L-프롤린, 500mg L-아르기닌, 710mg 아스코르브산, 22mg 칼슘, 50mg 마그네슘, 1,000mg 폴리페놀, 200mg N-아세틸 시스테인, 30mcg 셀레늄, 2mg 구리 및 1mg 망간을 포함하는 영양성 제약 조성물을 제공한다.
다른 목적에서, 본 발명은 상기 개시된 영양성 제약 조성물을 개인에게 투여하는 단계를 포함하는, 개인에서의 암의 치료 방법을 제공한다. 바람직하게는, 암은 흑색종 암, 유방 암, 결장 암, 폐 암 및 뇌 암으로 구성된 군에서 선택된다.
다른 목적에서, 본 발명은 상기 개시된 영양성 제약 조성물을 개인에게 투여하는 단계를 포함하는, 개인에서의 염증성 질병의 치료 방법을 제공한다. 바람직하게는, 염증 질병은 골관절염이다.
본 발명은 영양성 제약 제제 및 암 치료를 위한 그의 용도에 관한 것이다. 더욱 구체적으로, 본 발명은 암의 치료를 위해 유효량의 폴리페놀을 가진 폴리페놀 함유 제약 제제에 관한 것이다. 본 발명의 제제는, 아스코르브산, 리신, 프롤린, 및 에피갈로카테킨 갈레이트, 에피카테킨 갈레이트, 에피갈로카테킨, 에피카테킨 및 카테킨으로 구성된 군에서 선택되는 1종 이상의 폴리페놀 화합물을 포함하는, 암의 예방 및 치료용 약제로서 사용된다.
도 1은, 인간 유방 암 세포의 이동 거동에 대한 폴리페놀, 아스코르베이트, 프롤린 및 리신의 억제 효과를 나타낸다.
도 2는, 인간 결장 암 세포의 이동 거동에 대한 폴리페놀, 아스코르베이트, 프롤린 및 리신의 억제 효과를 나타낸다.
도 3은, 인간 흑색종 세포의 이동 거동에 대한 폴리페놀, 아스코르베이트, 프롤린 및 리신의 억제 효과를 나타낸다.
도 4는, 인간 흑색종 세포의 세포고사에 대한 폴리페놀, 아스코르베이트, 프롤린 및 리신의 억제 효과를 나타낸다.
도 5는, 인간 흑색종 세포 (A2058)의 세포 증식에 대한 아스코르브산, 프롤린, 리신 및 다양한 양의 EGCG의 억제 효과를 나타낸다.
도 6은, 인간 유방 암 세포(MDA-MB 231)의 세포 증식에 대한 EGCG의 억제 효과를 나타낸다.
도 7은, 인간 유방 암 세포(MDA-MB 231)의 세포 증식에 대해, 아스코르브산, 프롤린, 리신과 다양한 양의 EGCG를 기본 배지에 보충한 효과를 나타낸다.
도 8은, 인간 결장 암 세포(HCT 116)의 세포 증식에 대해, 아스코르브산, 프롤린, 리신 및 다양한 양의 EGCG를 기본 배지에 보충한 효과를 나타낸다.
도 9는, 인간 흑색종 세포에서 기질 금속단백질분해효소(MMP)의 발현에 대해, 아스코르브산, 프롤린, 리신 및 다양한 양의 EGCG를 기본 배지에 보충한 효과를 나타낸다.
도 10은, 인간 유방 암 세포(MDA-MB 231)에 의한 마트리겔(Matrigel) 침습에 대해, 아스코르브산, 프롤린, 리신 및 다양한 양의 EGCG를 기본 배지에 보충한 효과를 나타낸다.
도 11은, 인간 결장 암 세포(HTC 116)에 의한 마트리겔 침습에 대해, 아스코르브산, 프롤린, 리신 및 다양한 양의 EGCG를 기본 배지에 보충한 효과를 나타낸다.
도 12는, 인간 흑색종 세포(A2058)에서 침습 세포의 수를 감소시키는데 있어서 아스코르브산, 프롤린, 리신 및 다양한 양의 EGCG를 기본 배지에 보충한 효과를 나타낸다.
여기에서 사용된 "리신"은 L-리신과 서로 바꾸어 사용될 수 있고, "프롤린"은 "L-프롤린"과 서로 바꾸어 사용될 수 있고, "아르기닌"은 "L-아르기닌"과 서로 바꾸어 사용될 수 있고, "비타민 C"는 아스코르브산과 서로 바꾸어 사용될 수 있고 아스코르베이트 염 및 아스코르베이트 에스테르를 포함할 수 있다. "MMPs"는 기질 금속단백질분해효소; 예를들어 MMP-1, MMP-2, MMP-3, MMP-4, MMP-5, MMP-6, MMP-7, MMP-8, MMP-9, MMP-10, MMP-11 등을 가리킨다. "EGCG"는 녹차에 존재하는 주요 폴리페놀 성분인 (-)-에피갈로카테킨-3-갈레이트를 가리킨다. "NHDF"는 인간 연골세포 및 인간 기질 세포를 포함한 정상 인간 피부 섬유아세포를 가리킨다.
본 발명은 아스코르브산, 리신, 프롤린 및 1종 이상의 폴리페놀 화합물을 포함하는 영양성 제약 조성물을 포함한다. 바람직하게는, 아스코르베이트 화합물은 아스코르브산, 아스코르베이트 염 및 아스코르베이트 에스테르로 구성된 군에서 선택된다. 바람직하게는, 리신은 리신 히드로클로라이드 또는 제약학적으로 허용가능한 리신 염이다. 바람직하게는, 프롤린은 프롤린 히드로클로라이드 또는 제약학적으로 허용가능한 그의 프롤린 염이다.
폴리페놀 화합물은 녹차의 추출물이다. 이들은 또한 카테킨으로 공지되어 있다. 폴리페놀은 녹차에 존재하고, 암을 포함한 여러 질병에 대한 보호를 제공하는 것으로 제안되어 왔다 [Mukhtar H., Ahmed N.Am.J.Clin.Nutr. 71:1698S-1702S (2000)]. 녹차의 경구 투여는 생쥐에서 독소루비신의 종양-억제 효과를 향상시켰다. 카테킨의 잠재적인 항암 활성은 암 세포의 증식 및 그의 전이에 연관된 여러 인자에 미치는 효과에 관련될 수 있다. 카테킨은 인간 암종 세포에서의 세포 주기정지를 일으키는 것으로 알려져 있다 [Ahmad N., Feyes D.K., Nieminen A.L., Agarwal R., Mukhtar H.J. Natl. Cancer Inst. 89:1881-1886 (1997)]. 또한, 녹차로부터의 폴리페놀 분획은 종양에 의해 유발된 염증 및 시토킨에 대항하여 보호하는 것에 연루된다.
폴리페놀 화합물은 녹차 중에 30% 건조 중량으로 존재한다. 이들은 플라바놀, 플라반디올, 플라보노이드 및 페놀산을 포함한다. 플라바놀은 녹차에 있는 폴리페놀 중에서 가장 풍부하고 보통 카테킨으로 공지된다. 녹차에는 4개의 주요 카테킨이 존재한다: 1) (-)-에피카테킨, 2) (-)-에피카테킨-3-갈레이트, 3) (-)-에피갈로카테킨, 및 4) (-)-에피갈로카테킨-3-갈레이트 (EGCG). 카테킨 중에서, EGCG는 녹차에 존재하는 주요 폴리페놀 성분이다. EGCG는 강력한 산화방지 화합물이고, 녹차의 항암 활성의 원인이 될 수 있다. 카테킨 화합물은 맥관형성 과정을 방지함으로써 항-전이 활성을 발휘하는 것으로 보고되었다 [Cao Y., Cao R. Nature 398: 381 (1999)]. EGCG는 또한, 인간 암에서 가장 빈번히 발현되는 효소의 하나인 유로키나제(u-플라스미노겐 활성화제)의 활성을 방해하는 것으로 밝혀졌다 [Jankun J., Selman S.H., Swiercz R., Skrzypczak J.E. Nature: 387-567 (1997)]. EGCG는 바람직한 폴리페놀 화합물이다.
바람직하게는, 폴리페놀 화합물은 에피갈로카테킨 갈레이트, 에피카테킨 갈레이트, 에피갈로카테킨, 에피카테킨, 카테킨 및 다른 제약학적으로 허용가능한 폴리페놀 염 및/또는 이들의 혼합물로 구성된 군에서 선택된다.
이 특허 출원의 주요 치료 표적의 하나는 세포외 기질의 소화 및 그의 회복을 예방하는 것이다. 콜라겐, 엘라스틴 및 기타 주요 세포외 기질 분자의 합성을 위해 아스코르브산 또는 그의 염 (즉, 아스코르베이트)이 요구된다.
바람직하게는, 폴리페놀 화합물의 항암 활성을 향상시키기 위해 아스코르브산, 프롤린 및 리신의 조합이 사용된다. 더욱 바람직하게는, 이러한 조합은 폴리페놀 화합물이 암 세포의 침습을 감소시키거나 완전히 침습을 차단하는데 효과적인 방식으로 에피갈로카테킨 갈레이트, 에피카테킨 갈레이트, 에피갈로카테킨, 에피카테킨, 카테킨을 포함한 폴리페놀 화합물을 향상시킨다.
어떠한 이론에 의해 구속되지 않으면서, 본 발명의 영양성 제약 제제는 폴리페놀을 포함한 성분의 혼합물을 함유하고, 혼합물은 증식 및 전이 과정을 차단하는데 효과적으로 작용하는 것으로 밝혀졌다. 본 발명자들은, 본 발명의 영양성 제제 조성물이 암 세포의 침습을 상당히 감소시키거나 암 세포의 전이를 완전히 차단하는 것을 알아내었다. 따라서, 이 조성물은 암 세포가 만연되는 것을 효과적으로 방지한다. 청구된 화합물의 치료적 용도는 유방암, 결장암 및 기타 기관의 암을 위해 효과적이고, 선택적이고 안전한 치료이다. 바람직하게는, 개시된 영양성 제약 조성물은 공유 결합된 2개의 성분을 함유할 수 있다.
바람직하게는, L-아르기닌 및/또는 아르기닌-함유 화합물을 포함하여, 암 및 기타 종양의 생육 및 침습에 유리하게 영향을 미치는 것으로 공지된 화합물을 포함함으로써, 영양성 조성물의 효능이 향상된다. 더욱 바람직하게는, N-아세틸-시스테인이 사용된다. 더욱 바람직하게는, 암 및 기타 종양을 예방하고 치료하는데 효과적인 셀레늄 염, 구리 염 및 망간 염이 사용된다. 또한, 이러한 조성물은, 크렙스-사이클, 호흡 사슬에서의 조효소로서 필요하거나 또는 세포의 다른 대사 기능을 위해 필요한 하나 이상의 화합물을 암 및 기타 종양을 예방하고 치료하는데 효과적인 양으로 포함할 수도 있다.
본 발명의 영양성 제약 조성물은, 캡슐, 정제, 분말, 환제, 주사액, 주입액, 흡입제, 좌약 또는 기타 제약학적으로 허용가능한 담체 및/또는 암 및 기타 종양의 예방 및 치료를 위한 전달 수단의 형태로 환자에게 투여될 수 있다. 바람직하게는, 영양성 제약 조성물은 캡슐, 정제 또는 분말로서 투여된다. 더욱 바람직하게는, 이것은 캡슐로서 투여된다.
본 발명의 영양성 제약 조성물은, 종양 또는 암이 유방, 난소, 자궁경부 또는 여성 생식계의 기타 기관, 폐, 간, 피부, 위장 계, 뇌, 골 또는 기타 신체 기관에 위치되어 있는 선택된 환자에서, 암 및 기타 종양을 예방하고 치료하는데 사용될 수 있다. 바람직하게는, 조성물은 폐 암 및 뇌 암에서 사용된다.
본 발명의 영양성 제약 조성물은 감염성 질병, 아테롬성경화증, 협착재발, 기타 심혈관 질병병 및 염증성 질병을 예방 및 치료하는데 사용될 수 있다. 바람직하게는, 염증성 질병은 골관절염이다.
MMP-매개 플라스민 활성화: 다른 메카니즘이 배제되지 않는다 하더라도, MMPs 활성은 플라스민-매개 메카니즘을 통하여 리신에 의해 영향을 받을 수 있는 것으로 추측된다. MMPs는 전효소로서 분비되고, 이들의 활성화는 플라스민에 의해 부분적으로 매개되며, 그의 완성은 MMP-3의 활성 형태를 필요로 한다. 나가세(Nagase) (1997)에 의해 상세히 설명된 다양한 MMPs의 활성화 메카니즘은, MMP-3가플라스미노겐을 그의 활성 형태인 플라스민으로 전환시키는 것을 필요로 한다는 것을 암시한다. 플라스미노겐 활성 결합 중심은, 리신이 특이적으로 부착되는 부위를 갖는다. 따라서, 리신은 플라스미노겐 활성 부위에 결합함으로써 플라스미노겐 활성화제에 의해 플라스미노겐이 플라스민으로 활성화하는 것을 방해할 수 있다 (Rath 및 Pauling, 1992). 이러한 메카니즘을 통해 플라스민 유도 단백질분해를 억제하기 위해 합성 리신 유사체인 트랜엑삼산이 사용되어 왔다. 플라스민 활성이 여러 조직 MMPs를 유도하는데 필수적이기 때문에, 리신은 플라스미노겐이 플라스민으로 전환하는 것을 방해할 수 있고, 이에 의해 거의 모든 MMPs의 활성화를 억제할 수 있다. 또한, EGCG는 MMP-2의 억제를 통하여 세포외 기질 분해에 대한 억제 효과를 발휘할 수 있다.
암 침습 및 기질의 역할: 암 세포를 둘러싼 연결 조직의 안정성 및 강도를 증가시키고, 종양의 "캡슐화"에 기여함으로써, 암 세포 기질 침습에 영향을 미칠 수 있다. 이것은, 콜라겐 피브릴의 합성 및 구조를 최적화하는 것을 필요로 하고, 이를 위하여 콜라겐 섬유에서 히드록시프롤린 및 히드록시리신 잔기의 히드록실화가 필수적이다. 이러한 아미노산의 히드록실화를 위해 아스코르브산이 필수적일 수도 있다. 아스코르브산 및 L-리신은 인간 신체에서 보통 생성되지 않으며; 따라서 부적절한 음식을 통해서 뿐만 아니라 다양한 병리학적 단계에서도 이러한 영양소의 최적이하의 수준이 얻어질 수 있다. 아르기닌으로부터 프롤린이 합성될 수 있긴 하지만, 그의 합성 및/또는 히드록실화는 병리학적 조건에서 영향을 받을 수도 있다. 따라서, 전이 종양 조직의 히드록시프롤린 함량은 비-전이 종양 조직보다 훨씬 낮은 것으로 밝혀졌다 (Chubainskaia 등, 1989). 전이를 감소시키는 다양한 약물들은 조직의 히드록시프롤린 함량을 또한 증가시켰다 (Chubinskaia 등, 1989). 암 환자의 뇨 히드록시프롤린 함량은 건강한 사람 또는 비-암 환자에서의 함량보다 더 높은 것으로 밝혀졌다 (Okazaki 등, 1992). 이러한 모든 연구결과는, 암 환자에서 프롤린의 대사 및 가능하게 제어된 프롤린 결핍에 미치는 암 세포의 악영향을 시사한다.
암 환자들은 불충분한 수준의 아스코르브산을 가질 수 있다. 아스코르브산은 악성 세포 주에 대해 세포독성일 수도 있고 항-전이 작용을 발휘할 수도 있다. 본 발명은 아스코르브산, 프롤린, 리신 및 1종 이상의 폴리페놀 화합물의 조합이 암 세포 주에 대해 강력한 항-증식 및 항-전이 효과를 발휘한다는 것을 개시한다. 바람직하게는, 본 발명의 영양성 제약 제제는 흑색종, 유방 암 및 결장 암 세포에 대해 효과적이다. 가장 바람직하게는, 본 발명의 제약 제제는 인간 결장 암 세포에 대해 효과적이다.
폴리페놀 화합물(카테킨): EGCG는 녹차 추출물에 있는 카테킨의 하나를 나타내고, 인간 암 세포에 대해 생육 억제 효과를 가질 수 있다. 실제 기초가 되는 메카니즘은 불명확하다. 본 발명은, 암 세포의 증식 및 전이를 효과적으로 차단하는데 있어서, 아스코르브산, 프롤린 및 리신 및 1종 이상의 폴리페놀 화합물을 포함하는 영양성 제약 제제에서의 놀라운 상승효과를 개시하고 있다.
본 발명의 영양성 제약 조성물은 유방 암, 결장 암, 피부 암(흑색종) 및 기타 형태의 암의 침습을 효과적으로 차단한다. 영양성 제제에 존재하는 성분들은천연 화합물이고; 본 출원에 개시된 바와 같이 청구된 범위에서 사용될 때 독성 부작용을 갖지 않는 것으로 나타난다. 따라서, 이러한 조성물은 예방적으로 사용될 수 있고, 다시말해서, 신체에서 암 및 기타 종양을 효과적으로 예방한다.
바이러스 세포 및 기타 침습성 미생물은, 암 세포가 신체를 통한 감염을 만연시키기 위해 사용하는 것과 유사한 프로테아제를 사용하기 때문에, 본 특허에서 청구된 조성물이 바이러스성 질병 및 기타 감염성 질병의 효과적인 예방 및 치료에서 사용될 수도 있다.
기질 침습을 위해 암 세포가 사용하는 기질 금속단백질분해효소의 활성화와 유사한 메카니즘이, 심근경색 및 발작을 일으키는 아테롬성경화증 혈소판의 불안정화에 기여한다. 따라서, 이 특허에 청구된 조성물은 아테롬성경화증, 협착재발 및 기타 심혈관 합병증의 효과적인 예방 및 치료에서 사용될 수 있다.
기질 침습을 위해 암 세포가 사용하는 기질 금속단백질분해효소의 활성화가 다양한 염증성 상태에서 주요한 성분이다. 따라서, 이 특허에 청구된 조성물은 류마티스양 관절염, 폐기종, 알레르기, 골관절염 및 염증 양상을 포함한 기타 상태와 같은 질병의 효과적인 예방 및 치료에서 사용될 수 있다.
본 발명의 영양성 제약 조성물은 정제, 환제, 주사액, 주입액, 흡입제, 좌약 또는 기타 제약학적으로 허용가능한 담체 및/또는 전달 수단의 형태로 환자에게 제공될 수 있다.
다양한 인간 암 세포주에서 항-증식 및 항-침습 잠재력에 대하여 아스코르브산, 리신, 프롤린 및 1종 이상의 폴리페놀 화합물의 효과를 연구하였다. 더욱 구체적으로, 녹차 추출물 성분의 하나 (즉, 에피갈로카테킨 갈레이트(EGCG))를 조사하였다.
재료 및 방법
ATCC로부터 인간 유방암 세포 MDA-MB-231, 인간 결장암 세포 HCT 116, 인간 흑색종 세포주 A2058을 수득하였다. 정상적인 인간 피부 섬유아세포를 GICBO로부터 수득하였다. 나타내지 않은 경우에는, ATCC로부터 수득된 배양 배지가 사용되었다.
암 세포 증식 연구에서, 각각의 치료를 8회 반복하였다. 침습 분석에서, 각각의 치료를 3회 또는 4회 반복으로 수행하였다.
세포 증식 연구
이 연구에서, 24-웰 플레이트에서 10% 태아 소 혈청(FBS)이 보충된 리에보비쯔(Liebovitz) 배지 중에서 5×104유방 암 세포를 생육시켰다. 배지를 그 자체로서 사용하거나(기본) 또는 표시된 보충물로 보충하여 사용하였다. 플레이트를 공기-순환 배양기 (보충 CO2를 사용하지 않음) 내에서 4일 동안 배양하였다. 맥코이(McCoy) 5A 배지에서 결장 암 세포 HCT116을 생육시키고, 5% CO2-공기 순환 배양기에서 유지시켰다. 배양 기간의 마지막에, 배지를 회수하고, 웰에 있는 세포를 PBS로 세척한 다음, MTT 착색과 함께 3시간동안 배양하였다. 디메틸-술폭시드(DMSO, 1ml)를 각각의 웰에 첨가하였다. DMSO를 가진 플레이트를 서서히 교반하면서 실온에서 15분동안 정치시킨 다음, 각각의 웰 안에 있는 용액의 OD를 550nm에서 측정하였다. 웰에서 DMSO 용액의 OD550는 세포 수에 직접 비례하는 것으로 간주되었다. 보충물을 함유하지 않은 처리(기본)의 OD550는 100으로 간주되었다.
마트리겔 침습 연구
상용성 24-웰 플레이트에서 마트리겔(벡톤 딕킨슨(Becton Dickinson))을 사용하여 연구를 수행하였다. 섬유아세포를 접종하고, DMEM을 사용하여 플레이트의 웰에서 생육시켰다. 섬유아세포가 합류될 때, 배지를 회수하고 치료를 위해 선정된 배지 750㎕로 대체하였다. 실험의 계획에서 지정된 영양소로 보충된 250㎕의 배지중에 현탁된 암 세포(5×104)를 웰에 있는 삽입물에 접종하였다. 따라서, 삽입물 상의 배지와 웰 안에 있는 배지 양쪽 모두는 동일한 보충물을 함유하였다. 삽입물을 가진 플레이트를 18 내지 20시간동안 배양하였다 (MDA-MB-231 세포를 위한 공기-순환 배양기 및 결장 암 세포 및 흑색종 세포를 위한 5% CO2배양기에서). 배양 후에, 웰로부터의 배지를 회수하였다. 삽입물의 윗 표면 위의 세포를 면봉으로 조심스럽게 제거하였다. 마트리겔 막을 침투하고 마트리겔의 아랫면 위로 이동된 세포를 헤마컬러(hemacolor) 착색(EM 사이언스)으로 착색하고, 현미경 아래에서 눈으로 계수하였다. 결과를 아노바(ANOVA)로 처리하고, p<0.05에서 유의성을 위하여 모든 가능한 쌍들을 시험하였다.
상이한 연구에서의 배지에 아스코르브산, 프롤린, 리신 및 EGCG를 하기 나타낸 농도로 보충하였다.
젤라티나제 자이모그래피(Gelatinase Zymography)
0.1% 젤라틴의 존재하에 10% 노벡스 예비-주형 폴리아크릴아미드 겔(인비트로겐)에서 젤라티나제 자이모그래피를 수행하였다. 배양 배지(20㎕)를 부하하고, 트리스-글리신 SDS 완충액을 사용하여 SDS-PAGE를 수행하였다. 전기영동 후에, 5% 트리톤 X-100으로 30분간 겔을 세척하고 착색하였다. 단백질 표준을 동시에 주행시키고, 대략적인 분자량을 결정하였다.
실시예 1
개선된 마트리겔 침습 챔버(BD)에서 마트리겔 삽입물 위에 MDA-MB 231(ATCC) 유방 암 세포를 접종하였다. 다양한 인자(도 1에 나타냄)로 보충된 정상적인 인간 피부 섬유아세포로부터의 조절 배지(클로네틱스(Clonetics))를 웰에 첨가하였다. 챔버를 24시간동안 배양하고, 마트리겔 막을 침습하고 막의 아랫면으로 이동된 세포를 계수하였다. 이러한 데이타는, MDA-MB 231 인간 유방 암 세포에 의한 마트리겔 침습 및 이동에 미치는, 에피갈로카테킨 갈레이트 및, 아스코르브산, 프롤린 및 리신의 조합의 억제 효과를 나타낸다.
실시예 2
개선된 마트리겔 침습 챔버(BD)에서 마트리겔 삽입물 위에 HTCT116 (ATCC) 인간 결장 암 세포를 접종하였다. 다양한 인자(도 2에 나타냄)로 보충된 정상적인 인간 피부 섬유아세포로부터의 조절 배지(클로네틱스)를 웰에 첨가하였다. 챔버를 24시간동안 배양하고, 마트리겔 막을 침습하고 막의 아랫면으로 이동된 세포를 계수하였다. 이러한 데이타는, HCT 116 인간 결장 암 세포에 의한 마트리겔 침습 및이동에 미치는, 에피갈로카테킨 갈레이트 및, 아스코르브산, 프롤린 및 리신의 조합의 억제 효과를 나타낸다.
실시예 3
개선된 마트리겔 침습 챔버(BD)에서 마트리겔 삽입물 상에 A2058 (ATCC) 인간 흑색종 세포를 접종하였다. 다양한 인자로 보충된 정상적인 인간 피부 섬유아세포로부터의 조절 배지(클로네틱스)를 웰에 첨가하였다. 챔버를 24시간동안 배양하고, 마트리겔 막을 침습하고 막의 아랫면으로 이동된 세포를 계수하였다. 이러한 데이타는, A2058 인간 흑색종 세포에 의한 마트리겔 침습 및 이동에 미치는, 에피갈로카테킨 갈레이트 및 아스코르브산, 프롤린 및 리신의 조합의 억제 효과를 나타낸다.
실시예 4
이 실험에서,
A: 정상적인 인간 피부 섬유아세포로부터 조절 배지(클로네틱스)
B: 도 4 설명에 나타낸 바와 같이, 다양한 영양소가 보충된 동일한 배지
의 존재하에서, 개선된 마트리겔 침습 챔버(BD)에서 마트리겔 삽입물 위에 A2058 (ATCC) 인간 흑색종 세포를 접종하였다. 배양 24시간 후에, 마트리겔 막을 침습하고 막의 아랫 면으로 이동된 세포를 현미경 아래에서 조사하고 계수하였다.
이러한 데이타는, A2058에 미치는 에피갈로카테킨 갈레이트 및 아스코르브산+프롤린+리신의 조합의 세포고사 효과를 나타낸다. A; 조직 배양 배지중의 인간 흑색종 세포. B: 아스코르브산(100μM), 프롤린(140μM), 리신(400μM) 및 EGCG(20㎍/ml)을 함유하는 조직 배양 배지 중의 인간 흑색종 세포. 주: 세포는 파괴되었다.
실시예 5
암 세포 증식 연구
흑색종 A2058 세포
도 5는, 리신, 프롤린 및 아스코르브산 보충물을 갖거나 갖지 않은 10, 20 및 50㎍/ml EGCG가 흑색종 세포의 증식에 미치는 효과를 나타낸다. 10 및 20㎍/ml에서는 리신, 프롤린 및 아스코르브산과 EGCG의 어느 것도 세포 증식에 대해 어떠한 효과를 나타내지 않았다. 그러나, 50㎍/ml에서의 EGCG는 세포 수를 30%로 상당히 감소시켰다. 리신, 프롤린 및 아스코르브산에서도 유사한 효과가 관찰되었다.
유방 암 MDA-MB-231 세포
이 실험에서, 0, 10, 20, 50, 100 또는 200㎍/ml의 EGCG로 기본 배지를 보충하였다 (도 6). 결과는, 50, 100 및 200㎍/ml의 EGCG를 기본 배지에 보충하면, 보충되지 않은 대조군에 비하여 세포 수가 각각 66.1±5.3, 33.6±2 및 29.6±0.8%로 상당히 감소됨을 나타낸다. 세포 배지 중에서 20㎍/ml이하의 EGCG 농도는 세포 증식에 대해 상당한 억제 효과를 갖지 않았다.
본 발명자들은, 암 세포의 증식에 미치는 아스코르브산, 리신, 프롤린 및 상이한 농도의 EGCG의 효과를 연구하였다. 도 7은, 아스코르브산, 리신 및 프롤린을 사용하면 세포 수가 86.1±1.93%로 의미없게 감소됨을 나타내었다. 이러한 조합에 20, 50 및 100㎍ EGCG를 더욱 첨가하면 대조 군에 비하여 세포 수가 각각 74±5.8,64.8±1.6 및 22±5%로 상당히 감소되었다.
결장 암 HCT116 세포
결장 암 세포의 세포 증식에 대한 아스코르브산, 프롤린 및 리신의 억제 효과는 현저하지 않은 반면, 아스코르브산, 프롤린 및 리신을 20㎍/ml EGCG와 조합하면, 세포수가 69±0.5% 로 상당히 저하되었다 (도 8). 이러한 조합에서 EGCG의 더욱 높은 수준 (50㎍/ml)은 세포 수를 4.6±0.3%로 극적으로 감소시켰다.
이러한 연구에서 사용된 영양성 조합의 항-증식 활성은 암 세포의 종류에 따라 변하였다. 유방 암 세포에서, 아스코르브산, 프롤린 및 리신을 EGCG와 조합하면, 이러한 영양소를 개별적으로 사용했을 때에 비하여 더욱 높은 항-증식 효과를 가졌다. 흑색종 및 결장 암에서, 아스코르브산, 프롤린, 리신의 조합에 노출된 세포는 그들의 증식에 영향을 미치지 않았다. 그러나, 이러한 영양소를 20㎍/ml EGCG와 조합하면, 결장 암 세포의 수를 상당히 감소시키는 결과가 얻어지지만 흑색종 세포에서는 그렇지 않았다. 결장 암 세포는, 아스코르브산, 프롤린, 리신 및 EGCG의 조합에 대해 최소로 민감한 유방 암 세포 및 흑색종 세포에 비해, 더욱 민감한 것으로 나타났다. 결장 암 세포의 증식은 아스코르브산, 프롤린 및 리신이 50㎍/ml의 EGCG와 함께 주어질 때 거의 완벽하게 감소되었다(4.6%).
실시예 6
젤라티나제 자이모그래피 연구
흑색종 세포에서, 기본 및 아스코르브산, 프롤린 및 리신 보충과 EGCG가 MMPs의 발현에 미치는 효과를 젤라티나제 자이모그래피에 의하여 도 9에 나타낸다.흑색종 세포는 MMP-2 및 MMP-9에 상응하는 2개의 띠를 나타내었다. 아스코르브산, 리신 및 프롤린 조합은 기본 배지에 비해 MMPs 띠의 발현에 영향을 미치지 않았다. 그러나, EGCG는 투여량 의존 방식으로 MMP-2 및 MMP-9의 발현을 억제한다. 기본 및 아스코르브산, 리신 및 프롤린 조합에 대한 띠의 강도는 동일하였다.
실시예 7
세포외 기질 침습 및 이동 연구
다양한 농도의 EGCG와 별개로 그리고 함께 사용되는 아스코르브산, 프롤린 및 리신의 조합의 억제 효과를 조사하였다. 다양한 암 세포주의 침습 가능성을 평가하기 위해 보통 사용되는, 미리 형성된 마트리겔 기질을 사용하여 세포외 기질에 미치는 이러한 조합의 효과를 연구하였다.
유방 암 MDA-MB-231 세포
도 10은 아스코르브산, 프롤린 및 리신의 존재하에서 배양되는 유방암 세포의 마트리겔 침습 결과를 나타낸다. 아스코르브산, 프롤린 및 리신의 조합에서 배양된 암 세포의 침습은, 비-보충 배지에서 배양된 세포에 비하여, 48.1±22.1%로 감소되었다. 20㎍/ml의 EGCG 단독으로 보충된 배지에서, 침습 세포의 수는 69.5±27.4%로 감소되었다. 더 높은 EGCG 농도의 존재하에서 (50㎍/ml 및 100㎍/ml), 유방 암 세포에 의한 기질 침습이 완전히 억제되었다.
다른 일련의 연구에서, 배지에 100μM 아스코르브산을 보충하면 침습이 36% 만큼 감소되었다. 아스코르브산 및 140μM 프롤린을 보충하면, 침습이 47%만큼 더욱 감소되었다. 보충에서 아스코르브산 및 프롤린에 추가로 400μM 리신을 사용하면, 침습을 67%로 더욱 감소시켰다; 리신은 아스코르브산 및 프롤린의 효과를 800μM 수준까지 향상시키는 선형 반응을 나타낸다.
도 10은 아스코르브산, 프롤린 및 리신 뿐만 아니라 20㎍/ml의 EGCG의 조합이 세포외 기질을 통한 암 세포의 침습을 완전히 정지시키는데 효과적임을 나타낸다. 이러한 조합은, 각각의 영양소를 고 농도로 사용할 필요 없이도, 암 세포 침습에 대한 최대의 억제 효과를 달성할 수 있다. 따라서, EGCG와 함께 아스코르브산, 프롤린 및 리신을 사용하면, 낮은 수준의 EGCG(20㎍/ml)에서 유방 암 세포의 기질 침습을 완전히 정지시킬 수 있다.
결장 암 HCT 116 세포
도 11은, 아스코르브산, 프롤린 및 리신의 조합이 결장 암 세포의 침습을 67.2±3.7%로 현저히 감소시킨다는 것을 나타낸다. 20㎍/ml로 단독으로 사용된 EGCG는 침습을 44.9±3.3%로 감소시키는 반면, 아스코르브산, 프롤린 및 리신과 20㎍/ml의 EGCG의 조합은 결장 암 세포 침습을 24.9±4.6%로 감소시키는 상승 효과를 가졌다.
흑색종 A2058 세포
도 12는, 아스코르브산, 프롤린 및 리신의 조합이 침습 세포의 수를 88.2±4%로 감소시키는데 효과적이지만, 이러한 감소가 통계적으로 의미가 없음을 나타낸다. 이러한 영양소를 20㎍/ml 정도로 적은 EGCG와 조합하면, 침습 세포의 수를 제로로 감소시키는데 효과적이었다.
결과는, 아스코르브산, 프롤린 및 리신을 EGCG와 함께 사용하면, 낮은 수준의 EGCG에서도 마트리겔 막을 통해 침습하고 이동하는 세포의 수를 극적으로 감소시킬 수 있음을 나타낸다. 유방 암 세포 및 흑색종 세포에서 아스코르브산, 프롤린 및 리신과 함께 20㎍/ml정도로 낮은 수준의 EGCG를 사용하면, 침습이 제로로 감소되었다. 유방 암 세포에서 수득되는 조합 결과의 장점 만큼, 결장 암 세포에서는 장점이 현저하지 않았다. 이러한 세포에 의한 침습을 90% 감소시키기 위해서는 EGCG의 수준이 50㎍/ml이어야 했다. 이러한 연구에서, EGCG가 투여량 의존 방식으로 발현에 대해 억제 효과를 갖긴 하지만, 흑색종 세포에서의 MMPs 발현에서는 변화가 관찰되지 않았다.
결론적으로, 일련의 연구들은, 아스코르브산, 프롤린, 리신 및 1종 이상의 폴리페놀 화합물을 포함하는 본 발명의 영양성 제약 제제가 암 세포에 대해 효과적인 항-증식 및 항-침습 효과를 발휘한다는 것을 증명한다.
실시예 8
하기 영양성 제약 제제(표 1 내지 표 5) 및 에피칸 포르테(EPICAN FORTE)TM(표 6)를 그들의 제조에 관해 예증한다. 아스코르브산, 프롤린, 리신 및 1종 이상의 폴리페놀 화합물을 포함하는 이러한 제제는 암 세포의 침습 및 암 세포의 전이를 차단하는데 효과적인 것으로 밝혀졌다.
제제 1
생화학 물질 양 %
아스코르브산 250mg 5.6
칼슘 아스코르베이트 250mg 5.6
마그네슘 아스코르베이트 250mg 5.6
아스코르빌 팔미테이트 250mg 5.6
폴리페놀 1,000mg 22.5
N-아세틸-시스테인 200mg 4.5
리신 1,000mg 22.5
프롤린 750mg 16.8
아르기닌 500mg 11.2
셀레늄 30mcg <0.01
구리 2mg 0.04
망간 1mg 0.02
mg = 밀리그램mcg = 마이크로그램"%"는 제제의 총 중량에 대한 개별 성분의 중량%를 가리킨다.
제제 2
생화학 물질 양 %
아스코르브산 25mg 5.7
칼슘 아스코르베이트 25mg 5.7
마그네슘 아스코르베이트 25mg 5.7
아스코르빌 팔미테이트 25mg 5.7
폴리페놀 - 50% 200mg 46.0
N-아세틸-시스테인 10mg 2.3
리신 50mg 11.5
프롤린 25mg 5.7
아르기닌 50mg 11.5
셀레늄 1mcg <0.001
구리 20mcg <0.001
망간 50mcg <0.001
mg = 밀리그램mcg = 마이크로그램"%"는 제제의 총 중량에 대한 개별 성분의 중량%를 가리킨다.
제제 3
생화학 물질 양 %
아스코르브산 5,000mg 13.3
칼슘 아스코르베이트 5,000mg 13.3
마그네슘 아스코르베이트 5,000mg 13.3
아스코르빌 팔미테이트 5,000mg 13.3
폴리페놀 -100% 5,000mg 13.3
N-아세틸-시스테인 1,500mg 4.0
리신 5,000mg 13.3
프롤린 3,000mg 8.0
아르기닌 3,000mcg 8.0
셀레늄 200mg <0.001
구리 9mg 0.02
망간 10mg 0.002
mg = 밀리그램mcg = 마이크로그램"%"는 제제의 총 중량에 대한 개별 성분의 중량%를 가리킨다.
제제 4
생화학 물질 양 %
아스코르브산 250mg 4.7
칼슘 아스코르베이트 250mg 4.7
마그네슘 아스코르베이트 250mg 4.7
아스코르빌 팔미테이트 250mg 4.7
폴리페놀-98% 1,000mg 18.7
N-아세틸-시스테인 200mg 3.7
리신 1,000mg 18.7
프롤린 750mg 14.0
아르기닌 500mg 9.3
셀레늄 100mcg <0.002
구리 2mg 0.04
망간 1mg 0.02
칼슘 500mg 9.3
마그네슘 400mg 7.5
mg = 밀리그램mcg = 마이크로그램"%"는 제제의 총 중량에 대한 개별 성분의 중량%를 가리킨다.
제제 5
생화학 물질 양 %
아스코르브산 250mg 4.5
칼슘 아스코르베이트 250mg 4.5
마그네슘 아스코르베이트 250mg 4.5
아스코르빌 팔미테이트 250mg 4.5
폴리페놀 -98% 1,000mg 18
N-아세틸-시스테인 200mg 3.6
리신 1,000mg 18
프롤린 750mg 13.5
아르기닌 500mg 9
셀레늄 100mcg <0.002
구리 2mg <0.04
망간 1mg <0.02
칼슘 500mg 9
마그네슘 400mg 7.2
시트러스 바이오플라보노이드 200mg 3.6
mg = 밀리그램mcg = 마이크로그램"%"는 제제의 총 중량에 대한 개별 성분의 중량%를 가리킨다.
에피칸 포르테TM를 위한 제제
공급 크기: 6개 캡슐 (제시된 사용법: 바람직하게는 식사와 함께 1일 3회 2캡슐)
6개 캡슐의 내용물 공급 당 양 % 1일 값
L-리신 1,000mg
L-프롤린 750mg
L-아르기닌 500mg
비타민C (아스코르브산, 칼슘 아스코르베이트, 마그네슘 아스코르베이트, 및 아스코르베이트 팔미테이트로서) 782mg 1180%
칼슘(칼슘 아스코르베이트로서) 22mg 2%
마그네슘(마그네슘 아스코르베이트로서) 50mg 12%
표준 녹차 추출물 (잎)(80% 폴리페놀 -800mg) 카페인제거됨 1,000mg
N-아세틸-시스테인 200mg
셀레늄 (L-셀레노메티오닌으로부터) 30mg 43%
구리(구리 글리시네이트로부터) 2mg 100%
망간(망간 시트레이트로부터) 1mg 50%
mg = 밀리그램mcg = 마이크로그램에피칸 포르테TM는 계류중인 미국 출원에서의 상표명이다.기타 성분들: 순식물성 캡슐 (히드록시프로필 메틸셀룰로스), 이산화규소, 셀룰로스 및 마그네슘 스테아레이트
실시예 9
인간 암 세포에 대한 에피칸 포르테 TM 의 효과
인간 암 세포에 대한 에피칸 포르테TM의 효과를 연구하였다. 젤라티나제 자이모그래피에 의한 기질 금속단백질분해효소(MMPs)의 발현, 마트리겔을 통한 침습 가능성, 및 MTT 분석에 의한 증식/생육과 같은 전이 매개변수를 연구하였다. 이러한 분석을 위한 프로토콜은 위에서 상세히 설명되었다. 여러 인간 암 세포주가 사용되었다: 피부암 - 흑색종 세포 2058, 간암 - HepG2 세포, 섬유육종 - HT 1080 세포, 결장암 - HCT 116, 유방암 ER+/- MCF-7 및 유방암 ER-/-MDA-MB-231.
하기 표(표 7 및 8)는 결과를 요약한다:
인간 암 세포주의 증식/생육에 미치는 에피칸 포르테TM의 효과
에피칸 포르테TM의 치료 투여량 (㎍/ml): 대조 %
암 세포 0 10 50 100 500 1000
흑색종 100% 98 - 105 - 50
Hep G2 100% 92 - 138 - 85
HT-1080 100% 100 - 97 80 63
결장(HCT 116) 100% 119 125 141 120 106
MCF-7 100% 93 88 92 97 77
MDA-MB-231 100% 103 - 82 - 25
인간 암 세포에 의한 마트리겔 침습 및 이동에 미치는 에피칸 포르테TM의 효과
에피칸 포르테TM의 치료 투여량 (㎍/ml): 억제 %
암 세포 0 10 50 100 500 1000
흑색종 0% 80 98 100 - -
Hep G2 0% 15 25 50 95 100
HT-1080 0% 90 - 50 70 100
결장(HCT 116) 0% 20 50 80 100 -
MDA-MB-231 0% 50 - 98 - -
MCF-7 비-침습성
인간 암 세포주에 의한 기질 금속단백질분해효소(MMPs)의 발현에 미치는 에피칸 포르테 TM 의 효과:
흑색종 세포: 흑색종 세포는 MMP-2 및 MMP-9에 상응하는 젤라티나제 자이모그래피 상에 2개의 띠를 나타내었다. 에피칸 포르테TM는 투여량 의존 방식으로 MMP-2 및 -9의 발현을 억제하였다. MMP-2 및 -9의 발현은 100㎍/ml의 에피칸 포르테TM의 농도에서 현저하게 억제되고, 1000㎍/ml의 농도에서는 눈으로 검출할 수 없었다.
HepG2 세포: 흑색종 세포와 유사하게, HepG2 세포도 또한 MMP-2 및 MMP-9에 상응하는 2개의 띠를 발현하였다. 에피칸 포르테TM는 500 및 1000㎍/ml 농도에서 MMP-2 및 -9의 발현을 억제하였다.
섬유육종 HT-1080: HT 1080 세포는 MMP-2 및 -9에 대해 2개의 띠를 나타내었다. 에피칸 포르테TM는 또한 투여량 의존 방식으로 양쪽 띠의 발현을 억제하였다. 500 및 1000㎍/ml 농도에서 매우 희미한 띠가 나타났다.
결장암 HCT 116: 결장 암 세포는 자이모그래피 상에서 MMP-2에 상응하는 단지 한개의 띠를 나타내었으며, 이것은 100㎍/ml 농도에서 완전히 소실되었다.
MCF-7 및 MDA-MB-231: 이 암 세포주들은 본 발명의 실험 농도하에서 다른 암 세포주와 유사한 어떠한 MMPs 띠도 나타내지 않았다.
마트리겔을 통한 MDA-MB-231의 침습은 10, 50 및 100㎍/ml 에피칸 포르테TM에 의해 각각 50, 60 및 95%까지 억제되었다. 에피칸 포르테TM는 10㎍/ml에서 MDA-MB-231에 대해 독성이 아니었으며, 100㎍/ml에서 약간의 독성을 나타내었다. 그러나, 이것은 1000㎍/ml에서 상당한 독성을 나타내었다. MMP-2와 MMP-9의 어느 것도 자이모그래피에서 발현되지 않았다. 반대로, 에피칸 포르테TM는 심지어 500㎍/ml에서도 MCF-7에 대해 독성이 아니었으며, 1000㎍/ml에서는 약간의 독성을 나타내었다. MCF-7은 침습성이 아니었으며, MMPs 활성을 발현하지 않았다.
에피칸 포르테TM는 투여량-의존 방식으로 MMP-2 및 MMP-9의 발현을 억제한다. MMP-2 및 MMP-9의 발현은 100㎍/ml의 에피칸 포르테TM의 농도에서 상당히 억제되었으며, 100㎍/ml의 농도에서는 육안으로 검출할 수 없었다. 10 및 100㎍/ml 농도로 사용된 에피칸 포르테TM는 세포 생존율에 의미있는 영향을 미치지 않았으며, 100㎍/ml에서 세포 유형에 의존하여 10 내지 40%의 범위로 세포독성을 나타내었다. 흑색종 세포, MDA-MB-231 세포, 및 NHDF와 흑색종 세포의 공동-배양물의 마트리겔을 통한 침습은 투여량-의존 방식으로 상당히 감소되었다. 마트리겔을 통한 HT-1080 세포의 침습은 10, 100, 200 및 1000㎍/ml에서 각각 10%, 50%, 70% 및 100%로 억제되었다. 흥미롭게도, 에피칸 포르테TM는 100㎍/ml에서 HT-1080 세포에 대해 독성이 아니었다. 이러한 결과는 에피칸 포르테TM가 여러 암 세포주 및 공동-배양물에 대해 매우 효과적임을 증명한다. 이러한 관찰결과는, 에피칸 포르테TM가 인간 암의 치료를 위해 중요하고 유망한 후보가 되도록 하는 자연적인 치료적 근거를 제공할 수도 있음을 드러낸다.
실시예 10
인간 정상 세포 주에 대한 에피칸 포르테 TM 의 효과
정상 인간 세포에 대한 에피칸 포르테TM의 효과를 연구하였다. 암 세포주에서와 유사한 매개변수가 사용되었다; 즉 MMPs 발현에 대한 자이모그래피, 마트리겔을 통한 침습 및 MTT 분석에 의한 증식/생육. 인간 연골세포 및 인간 기질 세포를 포함한 여러 정상적인 인간 피부 섬유아세포(NHDF)를 사용하였다.
하기 표 (표 9, 표 10 및 표 11)은, 정상 인간 세포에서 증식/생육, 전이 침습 및 MMP 생성에 미치는 에피칸 포르테TM의 영향을 요약한다.
정상 인간 세포의 증식/생육에 미치는 에피칸 포르테TM의 효과에피칸 포르테TM의 치료 투여량(㎍/ml):대조 %
정상 세포 0 10 50 100 500 1000
NHDF 100% 118 - 135 - 90
연골세포 100% 113 - 148 76 82
기질 세포 100% 100 116 115 98 64
정상 인간 세포에 의한 마트리겔 침습에 미치는 에피칸 포르테TM의 효과에피칸 포르테TM의 치료 투여량(㎍/ml):억제 %
정상 세포 0 10 50 100 200 1000
NHDF 0% 67% 89% 100% - -
연골세포 0% 45% 85% 95% 100% -
기질 세포 0% 0% - 95% 100%
정상 인간 세포에 의한 기질 금속단백질분해효소(MMPs)의 발현에 미치는 에피칸 포르테TM의 효과는 다음과 같이 요약된다:
NHDF: NHDF는 MMP-2에 상응하는 자이모그래피 상에 단지 1개의 띠를 발현하고, 이것은 1000㎍/ml 농도의 에피칸 포르테TM에서 육안으로 소실되었다.
연골세포:연골세포는 MMP-2에 상응하는 단지 1개의 띠를 나타내었다. 에피칸 포르테TM는 투여량 의존 방식으로 MMP-2의 발현을 억제하였다. MMP-2의 발현은 100㎍/ml의 에피칸 포르테TM의 농도에서 상당히 억제되었고, 200㎍/ml 농도의 에피칸 포르테TM에서 완전히 소실되었다.
기질 세포: 기질 세포도 또한 MMP-2에 상응하는 단지 1개의 띠를 나타내었다. 에피칸 포르테TM는 투여량 의존 방식으로 MMP-2의 발현을 억제하였다. 50 및 100㎍/ml 농도에서 매우 희미한 띠가 나타났으며, 이것은 200 및 500㎍/ml 농도에서 검출되지 않았다.
요약하면, 결과는 에피칸 포르테TM가 투여량-의존 방식으로 MMP-2의 발현을 억제함을 나타낸다. MMP-2의 발현은 100㎍/ml의 에피칸 포르테TM의 농도에서 상당히 억제되었으며, 200㎍/ml의 농도에서 육안으로 검출되지 않았다. 또한, 마트리겔을 통한 연골세포의 침습은 10㎍/ml, 100㎍/ml 및 200㎍/ml에서 50%, 85% 및 95%로 억제되었다. 500㎍/ml에서, 침습은 0%로 완전히 감소되었다.
에피칸 포르테TM는 200㎍/ml의 농도에서도 연골세포에 대해 독성이 아니었다. 사실상, 에피칸 포르테TM는 세포 증식 효과를 발휘하였고, 200㎍/ml에서 세포 증식이 70% 증가되었으며, 대조군에 비해 70% 이상이었다. 500㎍/ml에서 약간의 독성 효과가 나타났다. 이러한 결과는, 에피칸 포르테TM가 MMP-2 발현을 억제하는데 효과적이고, 또한 에피칸 포르테TM가 골관절염 및 과다한 연골 분해를 포함한 기타 관련 질환에서 MMP 생성 및 세포외 기질 분해를 억제하기 위한 신규의 항-염증 영양성 제제를 나타낸다는 것을 증명한다.
에피칸-포르테의 생체내 시험 분야를 이제 막 수행하기 시작하였으나, 암을 치료하기 위한 약제로서 에피칸-포르테의 효력을 입증하는 2가지 경우가 보고되어 있다.
뇌 종양을 진단받은 여성 환자를 화학- 및 방사선 요법으로 치료하였으나, 성공하지 못하고 2002년 4월의 마지막에 포기하였다. 우연히 이 여성 환자를 권장투여량의 에피칸-포르테로 치료하기 시작하였다. 2002년 8월의 마지막에 MRTS는 종양이 사라졌음을 나타내었다.
2002년 5월에 현저히 높은 수준(59.9㎍/l)의 종양 마커 PSA를 가진 64세 남성 환자는, 대동맥의 임파 혈관을 따라 전이 전립선 암종을 가진 것으로 진단되었다. 이 환자를 권장 투여량의 에피칸-포르테로 치료하기 시작하였다. 3개월 후에 PSA 수준이 0.9 ㎍/l로 떨어졌다. 2002년 10월 마지막에 CT 검사는, 앞서 눈으로 볼 수 있었던 임파 전이가 더 이상 명백히 보이지 않고 그의 전립선도 정상 크기임을 나타내었다.
이상, 본 발명의 다수의 구현양태를 설명하였다. 그럼에도 불구하고, 본 발명의 취지 및 범위에서 벗어나지 않는 한 다양한 변형을 행할 수 있는 것으로 이해된다.

Claims (33)

  1. (a) 아스코르브산 화합물;
    (b) L-리신 화합물;
    (c) L-프롤린 화합물; 및
    (d) 에피갈로카테킨 갈레이트, 에피카테킨 갈레이트, 에피갈로카테킨, 에피카테킨 및 카테킨으로 구성된 군에서 선택되는 1종 이상의 폴리페놀 화합물
    을 포함하고, (a) 내지 (c)의 화합물이 암 증식 및 전이를 차단하는데 있어서 폴리페놀 화합물의 활성을 향상시키는 것인, 암을 치료하는데 유용한 영양성 제약 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 아스코르브산 화합물이 아스코르브산, 제약학적으로 허용가능한 아스코르베이트 염, 아스코르브베이트 에스테르 및/또는 이들의 혼합물로 구성된 군에서 선택되는 것인 영양성 제약 조성물.
  3. 제2항에 있어서, 제약학적으로 허용가능한 아스코르베이트 염이 칼슘 아스코르베이트 또는 마그네슘 아스코르베이트인 영양성 제약 조성물.
  4. 제2항에 있어서, 아스코르베이트 에스테르가 아스코르빌 팔미테이트인 영양성 제약 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 리신 화합물이 리신 히드로클로라이드 및 리신 제약학적으로 허용가능한 리신 염으로 구성된 군에서 선택되는 것인 영양성 제약 조성물.
  6. 제1항에 있어서, 프롤린 화합물이 프롤린 히드로클로라이드 및 프롤린 제약학적으로 허용가능한 프롤린 염으로 구성된 군에서 선택되는 것인 영양성 제약 조성물.
  7. 제1항에 있어서, 셀레늄, 구리, 망간, 칼슘 및 마그네슘으로 구성된 군에서 선택되는 미량 원소를 더욱 포함하는 영양성 제약 조성물.
  8. 제1항에 있어서, 아미노산을 더욱 포함하는 영양성 제약 조성물.
  9. 제8항에 있어서, 아미노산이 아르기닌인 영양성 제약 조성물.
  10. 제1항에 있어서, N-아세틸 시스테인을 더욱 포함하는 영양성 제약 조성물.
  11. (a) 아스코르브산 화합물;
    (b) L-리신 화합물;
    (c) L-프롤린 화합물;
    (d) N-아세틸 시스테인; 및
    (e) 에피갈로카테킨 갈레이트, 에피카테킨 갈레이트, 에피갈로카테킨, 에피카테킨 및 카테킨으로 구성된 군에서 선택되는 1종 이상의 폴리페놀 화합물
    을 포함하고, (a) 내지 (d)의 화합물이 암 증식 및 전이를 차단하는데 있어서 폴리페놀 화합물의 활성을 향상시키는 것인, 암을 치료하는데 유용한 영양성 제약 조성물.
  12. 제11항에 있어서, 아스코르브산 화합물이 아스코르브산, 제약학적으로 허용가능한 아스코르베이트 염, 아스코르베이트 에스테르 및/또는 이들의 혼합물로 구성된 군에서 선택되는 것인 영양성 제약 조성물.
  13. 제12항에 있어서, 제약학적으로 허용가능한 아스코르베이트 염이 칼슘 아스코르베이트 또는 마그네슘 아스코르베이트인 영양성 제약 조성물.
  14. 제12항에 있어서, 아스코르베이트 에스테르가 아스코르빌 팔미테이트인 영양성 제약 조성물.
  15. 제11항에 있어서, 리신 화합물이 리신 히드로클로라이드 및 리신 제약학적으로 허용가능한 리신 염으로 구성된 군에서 선택되는 것인 영양성 제약 조성물.
  16. 제11항에 있어서, 프롤린 화합물이 프롤린 히드로클로라이드 및 프롤린 제약학적으로 허용가능한 프롤린 염으로 구성된 군에서 선택되는 것인 영양성 제약 조성물.
  17. 제11항에 있어서, 조성물이 셀레늄, 구리, 망간, 칼슘 및 마그네슘으로 구성된 군에서 선택되는 미량 원소를 더욱 포함하는 것인 영양성 제약 조성물.
  18. 제11항에 있어서, 아미노산을 더욱 포함하는 영양성 제약 조성물.
  19. 제18항에 있어서, 아미노산이 아르기닌인 영양성 제약 조성물.
  20. 아스코르브산, 칼슘 아스코르베이트, 마그네슘 아스코르베이트, 아스코르빌 팔미테이트, 폴리페놀, N-아세틸-시스테인, 리신, 프롤린, 아르기닌, 셀레늄, 구리 및 망간을 포함하는, 암을 치료하는데 유용한 영양성 제약 조성물.
  21. 제20항에 있어서, 조성물이 250mg 아스코르브산, 250mg 칼슘 아스코르베이트, 250mg 마그네슘 아스코르베이트, 250mg 아스코르빌 팔미테이트, 1,000mg 폴리페놀, 200mg N-아세틸-시스테인, 1,000mg 리신; 750mg 프롤린, 500mg 아르기닌, 30mcg 셀레늄, 2mg 구리 및 1mg 망간을 포함하는 것인 영양성 제약 조성물.
  22. 제20항에 있어서, 조성물이 25mg 아스코르브산, 25mg 칼슘 아스코르베이트, 25mg 마그네슘 아스코르베이트, 25mg 아스코르빌 팔미테이트, 200mg 폴리페놀, 10mg N-아세틸-시스테인, 50mg 리신, 25mg 프롤린, 50mg 아르기닌, 1mcg 셀레늄, 20mcg 구리 및 50mcg 망간을 포함하는 영양성 제약 조성물.
  23. 제20항에 있어서, 조성물이 5,000mg 아스코르브산, 5,000mg 칼슘 아스코르베이트, 5,000mg 마그네슘 아스코르베이트, 5,000mg 아스코르빌 팔미테이트, 5,000mg 폴리페놀, 1,500mg N-아세틸-시스테인, 5,000mg 리신, 3,000mg 프롤린, 3,000mg 아르기닌, 200mcg 셀레늄, 9mg 구리 및 10mg 망간을 포함하는 영양성 제약 조성물.
  24. 제20항에 있어서, 조성물이 250mg 아스코르브산, 250mg 칼슘 아스코르베이트, 250mg 마그네슘 아스코르베이트, 250mg 아스코르빌 팔미테이트, 1,000mg 폴리페놀, 200mg N-아세틸-시스테인, 1,000mg 리신, 750mg 프롤린, 500mg 아르기닌, 100mcg 셀레늄, 2mg 구리, 1mg 망간, 500mg 칼슘 및 400mg 마그네슘을 포함하는 영양성 제약 조성물.
  25. 제20항에 있어서, 조성물이 250mg 아스코르브산, 250mg 칼슘 아스코르베이트, 250mg 마그네슘 아스코르베이트, 250mg 아스코르빌 팔미테이트, 1,000mg 폴리페놀, 200mg N-아세틸-시스테인, 1,000mg 리신, 750mg 프롤린, 500mg 아르기닌, 100mcg 셀레늄, 2mg 구리, 1mg 망간, 500mg 칼슘, 400mg 마그네슘 및 200mg 시트러스 바이오플라보노이드를 포함하는 영양성 제약 조성물.
  26. L-리신, L-프롤린, L-아르기닌, 아스코르브산, 칼슘, 마그네슘, 폴리페놀, N-아세틸-시스테인, 셀레늄, 구리 및 망간을 포함하는, 암을 치료하는데 유용한 영양성 제약 조성물.
  27. 제26항에 있어서, 조성물이 1,000mg L-리신, 750mg L-프롤린, 500mg L-아르기닌, 710mg 아스코르브산, 22mg 칼슘, 50mg 마그네슘, 1,000mg 폴리페놀, 200mg N-아세틸 시스테인, 30mcg 셀레늄, 2mg 구리 및 1mg 망간을 포함하는 영양성 제약 조성물.
  28. 제27항에 있어서, 아스코르브산이 아스코르브산, 칼슘 아스코르베이트, 마그네슘 아스코르베이트 및 아스코르빌 팔미테이트로 구성된 군에서 선택되는 것인 영양성 제약 조성물.
  29. 제27항에 있어서, 폴리페놀이 에피갈로카테킨 갈레이트, 에피카테킨 갈레이트, 에피갈로카테킨, 에피카테킨, 카테킨 및 기타 제약학적으로 허용가능한 폴리페놀 염 및/또는 이들의 혼합물로 구성된 군에서 선택되는 것인 영양성 제약 조성물.
  30. 제1항 내지 제29항중 어느 한 항의 영양성 제약 조성물을 개인에게 투여하는단계를 포함하는, 개인에서의 암의 치료 방법.
  31. 제30항에 있어서, 암이 흑색종 암, 유방 암, 결장 암, 폐 암 및 뇌 암으로 구성된 군에서 선택되는 것인 방법.
  32. 제1항 내지 제29항중 어느 한 항의 영양성 제약 조성물을 개인에게 투여하는 단계를 포함하는, 개인에서의 염증성 질병의 치료 방법.
  33. 제32항에 있어서, 염증성 질병이 골관절염인 방법.
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