JP2005220028A - タンパク質の高密度配向集積方法 - Google Patents

Abstract

【課題】 タンパク質や抗体の配向を制御し、高密度に基板上に集積する方法を提供する。
【解決手段】 Gly-Val-Gly-Val-Proの繰り返しからなるタンパク質と、プロテインGのCドメインの繰り返しからなるタンパク質とからなる融合タンパク質を、疎水性基板上に添加し、その後、前記基板上に抗体を添加し、更に前記抗体と結合するタンパク質を添加することを特徴とするタンパク質の集積方法。
【選択図】 なし

Description

本発明は、抗体及びタンパク質の集積方法に関する。本発明の集積方法は、抗体やタンパク質の配向を制御でき、かつ疎水性基板上に高密度に抗体等を集積できるので、抗体アレイやタンパク質アレイの作製に有用である。

タンパク質を基板に集積する方法として、化学結合法と物理吸着法が一般に用いられている。化学結合法は、タンパク質中にランダムに存在する官能基を利用するため、結合部位を制御することが困難であり、タンパク質失活の可能性が大きい。一方、物理吸着法も基板上での配向制御が困難であり、タンパク質の活性が低下することが問題になっている。
TsutomuSugihara, Gi Hun Seong, Eiry Kobatake and Masuo Aizawa Bioconjugate Chem. 2000, 11, 789-794

タンパク質をいかにして配向を制御し、かつ高密度に基板上に集積するかは、タンパク質アレイやバイオセンサーの開発において重要な課題の一つである。本発明は、従来のタンパク質集積法における上記問題を解決することを目的としている。

タンパク質アレイの作製において、通常用いられている物理吸着によるタンパク質の基板への結合は、主として、タンパク質表面と、基板との疎水性相互作用を利用している。そこで、本発明者は、より疎水性の高いドメインをタンパク質に導入すれば、その部分で優先的に基板と結合し、比較的親水性である機能部位を基板外側に提示した高密度集積が可能であることを見出し、この知見に基づき本発明を完成するに至った。

即ち、本発明は、以下の（１）〜（１１）を提供する。
（１）疎水性タンパク質と、抗体結合能を有するタンパク質とを含む融合タンパク質。
（２）疎水性タンパク質が、線維状のタンパク質である（１）記載の融合タンパク質。
（３）疎水性タンパク質が、βスパイラル構造をとるアミノ酸配列の繰り返しからなるタンパク質である（１）記載の融合タンパク質。
（４）βスパイラル構造をとるアミノ酸配列が、Gly-Val-Gly-Val-Proである（３）記載の融合タンパク質。
（５）βスパイラル構造をとるアミノ酸配列の繰り返しが、10〜100回である（３）又は（４）記載の融合タンパク質。
（６）抗体結合能を有するタンパク質が、プロテインG、プロテインA、又はプロテインLの抗体結合ドメインの繰り返しからなるタンパク質である（１）乃至（５）のいずれか記載の融合タンパク質。
（７）抗体結合能を有するタンパク質が、プロテインGのCドメインの繰り返しからなるタンパク質である（１）乃至（５）のいずれか記載の融合タンパク質。
（８）（１）乃至（７）のいずれか記載の融合タンパク質を疎水性基板上に添加し、その後、前記基板上に抗体を添加することを特徴とする抗体の集積方法。
（９）（１）乃至（７）のいずれか記載の融合タンパク質を疎水性基板上に添加し、その後、前記基板上に抗体を添加し、更に前記抗体と結合するタンパク質を添加することを特徴とするタンパク質の集積方法。
（１０）疎水性基板上に多数の抗体が固定されている抗体アレイであって、前記抗体が（１）乃至（７）のいずれか記載の融合タンパク質によって前記基板上に固定されていることを特徴とする抗体アレイ。
（１１）疎水性基板上に多数のタンパク質が固定されているタンパク質アレイであって、前記タンパク質が、（１）乃至（７）のいずれか記載の融合タンパク質及び前記タンパク質と結合能を有する抗体によって固定されていることを特徴とするタンパク質アレイ。

以下、本発明を詳細に説明する。

本発明の融合タンパク質は、疎水性タンパク質と抗体結合能を有するタンパク質とを含むものである。

疎水性タンパク質は、上記融合タンパク質に、疎水性基板との親和性を付与できるものであれば特に限定されない。疎水性タンパク質は、線維状のタンパク質であってもよい。疎水性で線維状のタンパク質としては、絹フィブロイン、コラーゲン、ケラチンなどを例示することができる。

また、疎水性タンパク質は、βスパイラル構造をとるアミノ酸配列の繰り返しからなるタンパク質であってもよい。βスパイラル構造をとるアミノ酸配列としては、Gly-Val-Gly-Val-Pro、Gly-Val-Gly-Val-Ala-Proなどを例示することができる。アミノ酸配列の繰り返しの回数は、疎水性基板との親和性が確保でき、なおかつ遺伝子の構築及びタンパク質の発現に問題を生じない範囲内であれば特に限定されない。具体的には、10〜100回という範囲を例示できるが、これに限定されるわけではない。

抗体結合能を有するタンパク質は特に限定されないが、プロテインGの抗体結合ドメイン（Cドメイン）、プロテインAの抗体結合ドメイン（Bドメイン）、プロテインLの抗体結合ドメイン（B1ドメイン）の繰り返しからなるタンパク質であることが好ましい。これらの中でも、マウス抗体に対する親和性の高いプロテインGのCドメインの繰り返しからなるタンパク質が特に好ましい。ドメインの繰り返しの回数は、抗体との親和性が確保でき、なおかつ遺伝子の構築及びタンパク質の発現に問題を生じない範囲内であれば特に限定されない。具体的には、1〜5回という範囲を例示できるが、これに限定されるわけではない。

本発明の融合タンパク質は、抗体の集積方法に利用することができる。即ち、本発明の融合タンパク質を、疎水性基板上に添加し、その後、前記基板上に抗体を添加することにより、疎水性基板上に抗体を集積することができる。

ここで使用する疎水性基板は特に限定されず、ガラス基板を疎水性ポリマーで覆ったものや疎水性プラスチックプレートなどを使用することができる。疎水性ポリマーとしては、フッ素系ポリマーなどを使用することができ、疎水性プラスチックとしては、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリ塩化ビニルなどを使用することができる。

上記の抗体の集積方法を応用し、タンパク質を疎水性基板上に集積することもできる。即ち、本発明の融合タンパク質を疎水性基板上に添加し、その後、前記基板上に抗体を添加し、更に前記抗体と結合するタンパク質を添加することにより、疎水性基板上にタンパク質を集積することができる。

上記の抗体及びタンパク質の集積方法は、抗体及びタンパク質の配向を制御して集積することができ、また、基板上に高密度に抗体及びタンパク質を集積することができるので、抗体アレイ及びタンパク質アレイの作製方法として有用である。

本発明の集積方法により、従来の方法では困難であったタンパク質等の配向制御や高密度集積が可能になる。これによって、より高精度のバイオセンサーの開発などが可能になる。

以下、実施例により本発明を更に詳細に説明する。

（１）融合タンパク質G98C3を発現するベクターの構築
本実験で用いたStreptococcal CMCC32138株のプロテインGの抗体結合ドメインは、文献（Sci .China B. 1993, 36(1), 75-80）に公表されている遺伝子配列を元に4本の合成オリゴヌクレオチドを用いることにより作製した。最初に抗体結合ドメインの前半部分をコードする合成オリゴヌクレオチドC-FIRSTをその相補鎖とアニーリングし、pBluescript II SK (+)のマルチクローニングサイトにあるBamHI、PstIサイトに挿入しpBS-C-FIRSTを作製した。続いて抗体結合ドメインの後半部分をコードする合成オリゴヌクレオチドC-LASTをその相補鎖とアニーリングし、PstI、EcoRIで処理したpBS-C-FIRSTとライゲーション反応により連結してpBS-Cを作製した。

pBS-CをBamHI、EcoRIで切断し、フラグメント(C insert)を得た。このC insertと、これとは別にpBS-CをBglII、EcoRIで処理したフラグメント(pBS-C vector)とをライゲーション反応により連結して、pBS-C2を作製した。また、同様の操作でCが三回繰り返したpBS-C3を作製した。作製したpBS-C3をBamHI、EcoRIで処理しpET-32(c)のマルチクローニングサイトに挿入することにより、pET-C3を作製した。

ポリペンタペプチド(GVGVP9)をコードするフラグメントは2本の合成オリゴヌクレオチドを用いて作製した。この2本のフラグメントをアニーリングし、ブランティング処理によってKpnIとBglIIサイトを削除したpET-32c(+)のBamHI、EcoRIサイトに挿入し、プラスミドpET-GVGVP9を作製した。このpET-GVGVP9をBamHI、EcoRIで切断しフラグメント（GVGVP9 insert）を得た。このGVGVP9 insertと、これとは別にpET-GVGVP9をBglII、EcoRIで処理して得られたフラグメント（pET-GVGVP9 vector）とをライゲーション反応により連結してpET-(GVGVP9)2を作製した。同様の操作で、pET-(GVGVP9)4、pET-(GVGVP9)8（pET-G98）を作製した。

最後に、pBS-C3をBamHI、EcoRIで処理することにより得られたフラグメント(C3 insert)とpET-(GVGVP9)8をBglII、EcoRIで処理したフラグメント(pET-(GVGVP9)8 vector)とをライゲーション反応により連結してpET-(GVGVP9)8-C3（pET-G98C3）を作製した。

（２）融合タンパク質G98C3の発現及び精製
大腸菌BL21(DE3)株を、作製したプラスミドpET-G98、pET-G98C3、pET-C3を用いて形質転換し、アンピシリン50ug/mlを含むLB培地中37℃で培養した。OD660=0.5に達した時点で1mM イソプロピルチオ-β-ガラクトシド（IPTG）で誘導発現を行い、さらに30℃で3時間培養した。培養終了後、遠心分離によって大腸菌を回収し、PBSによって2回洗浄した。続いて超音波によって菌体を破砕し、遠心分離することによって得られた上清を可溶画分とした。融合タンパク質を、His-Tagを介したアフィニティーによって精製するために、この可溶画分にNi-NTA Agarを添加した。１時間４℃の条件でインキュベートした後、洗浄緩衝液(25mM イミダゾール, 20mM リン酸塩, 500mM NaCl; pH7.4)で4回、PBSで１回洗浄し、チオレドキシンを除去するためにプロテアーゼであるトロンビンを添加して16時間、室温で反応を行った。反応終了後、上清を回収し、そこにベンズアミジン・セファロースを添加することによってトロンビンを除去した。こうして精製した(GVGVP9)8、(GVGVP9)8-C3、C3はPBSで透析し、SDS-PAGEによって確認した。

（３）抗体集積能の測定
ガラス基板に、撥水性ポリマー（サイトップ（旭硝子））を100μm四方のドット状に500μm間隔でパターニングした。このパターニングしたガラス基板に、G98C3溶液（濃度：1、2、又は3μM）を0.5μl添加し、1%Block ACEでブロッキングを行なった。その後、蛍光物質Alexa546（Molecular Probe）で標識したヤギ由来抗マウスIgG抗体溶液（濃度：2μg/ml）を40μl添加した。洗浄後、ガラス基板上の蛍光像をアレイスキャナー（Scan Array 4000XL, GSI Luminics）で画像化し、蛍光強度を解析した。図１に、G98C3及びC3溶液を添加した場合（溶液濃度：1μM）のガラス基板の画像を示す。また、図２に、G98C3、C3、プロテインG、及びG98（GVGVPの繰り返し配列部分のみ）を添加した場合の基板上で計測された蛍光強度を示す。

これらの図に示すように、G98C3を集積した基板の撥水性ドットパターン上には、強い蛍光が観測された。一方、C3を集積した基板の蛍光強度は、G98C3を集積した基板の1/3程度であった。また、プロテインGやG98を集積した基板ではほとんど蛍光が観測されなかった。

上記で使用したAlexa546標識ヤギ由来抗マウスIgG抗体の代わりに、ウサギ由来抗チキンIgG抗体（溶液濃度：10μg/ml、添加量：0.5μl）とAlexa594標識チキン由来抗体（溶液濃度：10μg/ml、添加量：40μl）を使用し、上記と同様にガラス基板上の蛍光像を画像化した（図３）。この図においても、G98C3を集積した基板の撥水性ドットパターン上には、強い蛍光が観測された。

以上の結果から、G98C3が抗体の高密度配向集積に有用であることが示された。

G98C3及びC3溶液を基板上に集積後、蛍光標識したヤギ由来抗マウスIgG抗体を添加した場合の蛍光画像。 各種タンパク質の基板上での蛍光強度を示す図。 G98C3及びC3溶液を基板上に集積後、ウサギ由来抗チキンIgG抗体と蛍光標識したチキン由来IgGを添加した場合の蛍光画像。

Claims (11)

1. 疎水性タンパク質と、抗体結合能を有するタンパク質とを含む融合タンパク質。
2. 疎水性タンパク質が、線維状のタンパク質である請求項１記載の融合タンパク質。
3. 疎水性タンパク質が、βスパイラル構造をとるアミノ酸配列の繰り返しからなるタンパク質である請求項１記載の融合タンパク質。
4. βスパイラル構造をとるアミノ酸配列が、Gly-Val-Gly-Val-Proである請求項３記載の融合タンパク質。
5. βスパイラル構造をとるアミノ酸配列の繰り返しが、10〜100回である請求項３又は４記載の融合タンパク質。
6. 抗体結合能を有するタンパク質が、プロテインG、プロテインA、又はプロテインLの抗体結合ドメインの繰り返しからなるタンパク質である請求項１乃至５のいずれか一項記載の融合タンパク質。
7. 抗体結合能を有するタンパク質が、プロテインGのCドメインの繰り返しからなるタンパク質である請求項１乃至５のいずれか一項記載の融合タンパク質。
8. 請求項１乃至７のいずれか一項記載の融合タンパク質を疎水性基板上に添加し、その後、前記基板上に抗体を添加することを特徴とする抗体の集積方法。
9. 請求項１乃至７のいずれか一項記載の融合タンパク質を疎水性基板上に添加し、その後、前記基板上に抗体を添加し、更に前記抗体と結合するタンパク質を添加することを特徴とするタンパク質の集積方法。
10. 疎水性基板上に多数の抗体が固定されている抗体アレイであって、前記抗体が請求項１乃至７のいずれか一項記載の融合タンパク質によって前記基板上に固定されていることを特徴とする抗体アレイ。
11. 疎水性基板上に多数のタンパク質が固定されているタンパク質アレイであって、前記タンパク質が、請求項１乃至７のいずれか一項記載の融合タンパク質及び前記タンパク質と結合能を有する抗体によって固定されていることを特徴とするタンパク質アレイ。