JP2004531729A - 試料を画像化するための回転ステージ - Google Patents

Abstract

光投射型断層撮影に用いるための回転ステージ（１０）は、回転可能な垂直なシャフト（４４）を備えたステッピングモータ（４２）を含み、その下方端部には、画像化されるべき試料（２８）が、実質的に垂直な軸を中心にして回転するように担持される。ステッピングモータ（４２）はテーブル（３４）上に装着され、その位置は傾斜および垂直な位置に正確に調整可能であり、これにより、試料の回転軸は光軸（２９）に対して垂直であることが確実となる。試料（２８）は固定チャンバ（２６）内で回転し、回転ステージは試料の３次元画像を提供する顕微鏡とともに用いられる。

Description

【技術分野】
【０００１】
発明の分野
この発明は、試料を画像化するための回転ステージと、試料の像を得る方法とに関する。この発明は、これに限定されるわけではないが、特に、光投射型断層撮影および３次元顕微鏡に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
光投射型断層撮影によってサンプルの３次元画像を生成するための光学画像化装置は、たとえば、米国特許第５，６８０，４８４号から公知である。この先行技術特許に開示される光学装置は、サンプルの一連のデジタル画像を異なる角度から撮る。これらの画像は、数学的変換を用いて３次元画像を復元するアルゴリズムへ送られる。米国特許第５，６８０，４８４号では、試料は、実質的に水平になるように２つの地点で支持される透明な管内に保持され、この管がステッピングモータおよび駆動ベルトを用いて回転されて、試料の別々の部分を画像化することが可能となる。管からの光屈折は信号品質に影響を及ぼし、管を用いることにより、画像化することのできる試料の大きさの上限が厳しく制限される。この先行技術特許に開示される装置は、この画像化技術の可能性のある用途に影響を及ぼすいくつかの制限を有し、特に、中空の円筒形の管にサンプルを入込むこと、およびサンプルの位置を調整することが難しい。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
この発明の目的は、上述の問題のうち少なくともいくつかを克服する装置および方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
発明の概要
この発明の一局面に従って、複数の方向から試料を画像化するのに用いるための回転ステージが提供され、この回転ステージは試料支持手段を含み、この試料支持手段は、それに沿って光が試料から放射される光軸を横断する、垂直または実質的に垂直な回転軸を中心にして画像化される試料を回転させるよう動作する回転可能部材を含み、この試料支持手段は、チャンバ内の光学画像化液に浸された試料を受取るために、固定画像化チャンバの上方に配置される。
【０００５】
回転ステージは、別個の顕微鏡と、生物学的組織等の試料の３次元の画像化を可能にする、関連のハードウェアおよびソフトウェアと共に用いることができる。顕微鏡から間隔を空けて試料支持手段を配置することにより、試料ホルダへのアクセスが改善されるので、試料の位置決めを容易に調整することができる。細長い試料の場合、試料支持手段内に保持されるとき、試料の最長の軸は実質的に重力と平行である。これにより、一地点だけで試料を保持することが可能となり、さらに試料支持手段内で試料の配置を補助し、重力の作用により試料が撓むのを防ぐ。というのも、このような撓みにより試料の形状に望ましくない歪みが生じ、得られる画像の精度および解像度に影響を及ぼすおそれがあるからである。
【０００６】
ステージの回転部分から固定チャンバを分けておくことにより、このチャンバの形状は回転対称形には制限されない。好ましくは、チャンバは少なくとも１つの平面を有し、この上に光が当たって試料を画像化する。欠陥またはうねりのない平坦な平面を用いること
により、確実に、光の屈折による画像の歪みを減ずる。チャンバは、透明な中空の直方体として形成され得、この直方体の２つの対向する側面が、それに沿って光が試料から放射される光軸に対して実質的に垂直となるように配置され得、これにより、広い断面積が光軸に呈示される。方形の断面を備えたこのようなチャンバを選択することにより、確実に、試料を通過する前に屈折される光の量が先行技術の円筒形の回転チャンバよりも実質的に減じられ、したがって画像品質が向上する。このチャンバの１つの壁または面は、所望の方法で光を屈折させるように形作られて、たとえば拡大効果をもたらし得る。
【０００７】
回転ステージはさらに、レバー等の、回動するように装着される調整手段を含み得、そこから延在する差込みを有し、この差込みは、試料と係合して回転軸に対する試料の位置を変えるように、使用の際に、配置される。
【０００８】
回転ステージはさらに、光が試料を照射した後にこの光を受取るよう位置付けられるプリズムを有し得、このプリズムは光を９０°偏向するよう作用して、垂直な光軸を備えた顕微鏡がこの光を受取ることを可能にする。プリズムを用いることにより、顕微鏡に対する光路は真っ直ぐである必要がなく、このため既存の顕微鏡の変形例は、この発明に従った回転ステージとともに用いられる必要はない。
【０００９】
試料支持手段の回転可能部材は、調整可能なプラットフォーム上で担持され得、水平軸に対するその位置は可変である。これにより、回転軸を光軸に対して調整することが可能となり、このため必要に応じて、光軸と回転軸との間が９０°の角度に設定される。これは特に３次元の画像化に有用である。
【００１０】
調整可能なプラットフォームは、好ましくは、光軸に対して回転部材を上げ下げできるように垂直に調整可能であるので、試料を下げて光の光路から出し入れすることが可能となる。
【００１１】
好ましくは、回転可能部材は、回転可能部材の下方端部から試料を懸垂、懸架または垂下することができるように形成される。試料が磁化可能な金属マウントとともに適切に準備された場合、試料は、外れやすい固定ではなく磁力に依拠して、真っ直ぐに試料支持手段に取付けられる。これは有利なことである。というのも、典型的には、この試料は幾分小さくかつもろく、通常直径が１〜２０ｍｍの範囲であり、ねじ山を用いてホルダにこれら試料を固定することは複雑であるおそれがあるからである。
【００１２】
この発明の別の局面に従って、試料の画像を得る方法が提供され、この方法は、それに沿って光が試料から放射される光軸を横断する、垂直または実質的に垂直な回転軸を中心にして試料を回転させるステップを含み、この回転する試料は、固定光学チャンバ内で液体に浸される。
【００１３】
この発明は、添付の図面に関連して、例示のために記載される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
詳細な説明
図１は、回転ステージ１０と、回転ステージ１０とは分かれている長作動距離または解剖顕微鏡１２とを含む、ＯＰＴスキャナの形の光学画像化装置を示す。回転ステージ１０は、支持部１４、回動するよう装着されたレバー１６、絞りおよび光学ディフューザ２０、ならびに石英プリズム２２を有する。支持部１４、絞りおよび光学ディフューザ２０、ならびにプリズム２２は、一般的に直方体である透明チャンバ２６またはキュベットを受けるためのホルダ２５が固定されるのと同様に、ステージ１０の基部２４に固定される。キュベット２６は、キュベット内に懸架される試料２８を画像化するのに好適な光学特性
を有する液体を含み、適切な液体とは、ベンジルアルコールと安息香酸ベンジルとの混合物である。この装置は、明視野、暗視野および蛍光画像化のために用いることができるが、異なる角度で撮られた一連の画像から試料の３次元（３Ｄ）画像を作り出す場合、および、共焦点顕微鏡で画像化するには試料が大きすぎる場合には、特に適切である。
【００１５】
光は、光軸２９に沿って進み、絞りおよびディフューザ２０の中心、さらに試料２８を通過し、プリズム２２により直角に偏向して、顕微鏡１２の対物レンズ３０に入る。顕微鏡が長い作動距離を有するので、プリズム２２を顕微鏡の対物レンズ３０の下に置くのに十分な空間を利用することができる。プリズムを用いることにより、垂直に配向された顕微鏡が試料を画像化することが可能となる。しかしながら、顕微鏡の対物レンズが光軸と平行である場合、プリズム２２を省いてもよい。絞りおよびディフューザ２０は、光源（図示せず）から進む光の量を制御して、試料２８に達するようにし、かつ一様な照射をもたらす。
【００１６】
支持部１４は、その上に、軸９０（図４）を中心にして回動するように装着される円形のボス、その上で上下にスライド可能な傾斜プレート３３、プレート３２を担持する。プレート３２は、プレート３２から水平に突き出る調整可能なプラットフォーム３４を担持する。プラットフォーム３４の角度は、傾斜アジャスタ３６を用いて水平軸に対して変えることができ、プラットフォーム３４の垂直位置は垂直アジャスタ４０により変えることができる。ステッピングモータ４２はプラットフォーム３４上に装着され、モータの回転可能なモータシャフト４４はこのプラットフォーム３４にわたって延在する。磁石４６（永久磁石または電磁石）は、シャフト４４の下方端部に取付けられ、画像化されるべき試料２８を担持する。試料を磁石に取付ける方法が、図５に関連して後に記載される。ステッピングモータ４２は、０.９°刻みでシャフト４４を回転させ、試料の最高４００箇所の画像化位置を提供する。細長い試料２８の一連のデジタル画像は、シャフト４４をその連続回転位置に割出しし、こうして試料を連続回転位置に位置決めすることにより撮られるが、この間試料はキュベット２６内に懸架され、このキュベットは固定されたままである。
【００１７】
ステッピングモータ４２を、その回転軸を垂直にして装着することにより、ロッド状の試料２８は、その試料の制御された回転をもたらすためには、１つの地点、典型的にはその最上端部が固定されるだけでよい。試料２８は磁石４６により上方から支持されており、垂直アジャスタ４０を用いてプラットフォームを下げることにより、液体に浸される。試料および回転軸のこの垂直な配向により、浸された試料に乾いたモータを接続するのに必要となるＯリングまたは他の機械的配置を使用せずに済み、第２に、細長い試料は、重力と平行な主軸を有するので、重力によってその回転軸から逸れないことが確実となる。試料を垂直に配向させることにより試料に対する歪みの影響を回避することは、正確な３Ｄ画像を得るために、特により大きな試料にとっては、特に重要である。ほぼ直立の中空の直方体を試料２８の周りの画像化チャンバ２６として用いることにより、確実に、画像化液の表面積が制限され、液体の蒸発が減じられる。加えて、典型的には直径が１〜２０ｍｍのはるかに大きな試料は、このような固定されたチャンバを用いることにより、デジタル信号の品質を損なうことなく画像化され得る。
【００１８】
使用の際に、デジタルカメラ５２（図２）は顕微鏡１２に取付けられる。このデジタルカメラ５２は、光軸２９に沿って伝わりかつチャンバと試料とを通って透過された光から顕微鏡によって画像化された試料のデジタル画像を生成する。一連のデジタル画像は試料を異なる角度から撮ったものであり、このデジタル情報は、数式を用いて試料の構造を３次元に復元するアルゴリズムに送られる。典型的には、これら画像は、図２に説明されるように、制御要素を用いて得られる。こうして、デジタル画像取得ソフトウェアを備えるコンピュータ５０は、対象の試料から画像を受取る顕微鏡１２に取付けられたデジタルカ
メラ５２と双方向通信する。コンピュータ５０は、顕微鏡１２に取付けられるフィルタホィール５６を制御して、検出される放射線の波長を変える。コンピュータ取得ソフトウェアは、デジタルカメラからの画像の取込みを制御するソフトウェア５８、画像化ソフトウェア、回転ステージおよびフィルタホィールソフトウェアを制御するプログラム５４、フィルタホィールを制御するソフトウェア４８、ならびに画像ファイルを３Ｄ復元に変換するソフトウェア６４として、図２に図示される。コンピュータは、回転ステージ１０に接続される電子制御回路６０とも双方向通信し、連続画像の画像取込み中に、必要に応じて、回路６０を制御して試料の配向を調整する。デジタル画像が得られると、米国特許第５，６８０，４８４号に記載される分析と類似の態様で、６４で処理されて、数学的処理を用いて試料の３Ｄ復元６６を生成する。
【００１９】
必要な場合、コンピュータは画像化プロセス全体を制御し、画像処理に取り掛かり、試料のサイズ、そのアライメント、焦点が合っているかどうか等を判断し、試料の位置を調整してから回転画像化を実行することができる。画像化プロセスをこのように完全に自動化することは、特に、多くのこのような装置を並行して実行する可能性のある大規模な遺伝子発現マッピングプロジェクトには望ましいことである。
【００２０】
コンピュータに応答してステッピングモータ４２を制御する回路６０は、最も一般的なコンピュータシステムのために市販されている。回路６０はコンピュータ５０に接続しており、コンピュータ５０からの信号に応答して種々の機械装置（ステッピングモータ、ソレノイド等）を制御する。
【００２１】
試料の３Ｄ表示を作成するために、ソフトウェアは以下の機能を実行する。すなわち、（１）（互いに１８０°で撮られた各々の対の画像の間に存在する対称性によって）回転軸を決定し、（２）画像のスタックを再構成して、垂直なスタックの投影画像にし（この画像は、取込まれたすべての異なる角度から見える試料の単一の断面を呈示し）、（３）各投影画像上で数学的処理を行なって試料のその断面を再度作成し、（４）算出された断面の画像をすべて３Ｄ形式に組合わせる。透過光および蛍光放射光の両方から復元することができる。
【００２２】
データ取得における一般的な装置およびその使用について記載したので、画像化装置のある構成要素を次により詳細に記載する。
【００２３】
回転ステージ１０の正面図が図３に示される。傾斜アジャスタ３６は軸９０を中心にしてプラットフォーム３４の傾斜角を変える。この軸９０は、シャフト４４の下方端部より下にあり、かつ、ほぼ試料の高さにあるので、傾斜の調整によって試料が実質的に動くことはない。軸９０は光軸２９と交差し得る。（図３において両方向の矢印９２により示される）傾斜調整により、ステッピングモータ４２の回転軸９４が光軸２９に正確に垂直であることが確実となる。プラットフォーム３４の傾斜を調整した後、基部２４に対するプラットフォーム３４の位置は、ラックアンドピニオン構成を用いて回転軸９４の調整された方向にプラットフォーム３４を上げ下げする垂直アジャスタ４０を用いて調整される。垂直アジャスタ４０を用いることにより、シャフト４４の端部に取付けられる磁石上に担持される試料は、画像化のために所望の深さだけ画像化チャンバの中に下げられ、画像化が実行されると、チャンバから上げられ得る。画像化中の試料の垂直位置もまた、必要に応じてこのように変更し得る。シャフトが上げられた位置にある場合、試料を回転ステージに載せたりそこから降ろしたりすることができる。
【００２４】
装置が設定されると、これを、顕微鏡の光軸がプリズムを通り画像化チャンバの中心を通過するように整列させる。しかしながら、高倍率では、試料が視野の中心から僅かにずれるので、アライメントを調整しなければならない可能性がある。上述の上下させる機構
を調整して、垂直方向へのこのずれを修正することができる。
【００２５】
試料の画像化のほとんどは、回転軸を光軸に対してほぼ垂直にすることにより行なうことができるが、数学的処理を用いる試料の３Ｄ復元では、光軸と回転軸との間の角度が正確に９０°でない限り、品質が極めて低くなるだろう。傾斜アジャスタ３６は、角度を確実に正確に９０°とするように、回転軸９４を僅かに傾斜させることができる。傾斜アジャスタ３６は、典型的には、ねじ機構に依拠してプラットフォーム３４を一方側に圧迫する。較正サンプルを用いて傾斜の角度を調整する。この較正サンプルはいくらかの小粒子を含み、これら小粒子の軌道は、シャフトの回転中にコンピュータスクリーン上で監視され得る。回転軸が光軸に対して完全には垂直でない場合、粒子の軌道は、楕円形として現われる。シャフトが軸９４を中心にして回転するときの光軸の図を示す図４（ａ）を参照されたい。この軸が正確に調整されると、図４（ｂ）に示されるように、垂直な構成要素は動かずに、粒子が左右に動くのが見える。
【００２６】
図５は、試料１１２に取付けられる金属円板１１０と、ステッピングモータ４２の回転可能なシャフト４４の下方端部に永久的に取付けられる円筒形の磁石４６との間の磁力に依拠して用いられる磁気取付システムを示す。各試料は、試料の準備中に一方端に接着される小さな磁化可能な金属円板を有する。次いで、画像化が行なわれる際に円板が磁石に取付けられ、試料が磁力により円板と磁石との間で支持される。ディスク１１０および試料１１２は比較的軽いので、磁石はこれらの重量を支持するのに強く磁化される必要はない。たとえばねじ込みシステムに比べて磁石システムの１つの利点は、円板および試料のサイズが小さいので、鉗子またはピンセットで処理する必要がある点である。マウントまたは円板１１０は、磁石の上に鉗子でもって真っ直ぐに置かれるが、これをねじ込んで取付けるとそうはならない。別の利点は、磁石面１２０にわたってマウント１１０をスライドさせることにより、回転軸に対する試料の位置を容易に調整し得る点である。また、多くの試料は、予め円板に取付けられて準備され得、必要なときに画像化のための装置に迅速に取付けられ得る。
【００２７】
サンプルの画像化のためにチャンバで用いられるある液体は、毒性があり、プラスチックに対して腐食性があり、この場合、試料は鉗子を用いると最適に処理される。さらに、磁気取付システムは、試料が磁石の下に保持されるだけでしっかりと取付けられるので、有利である。画像化の後に各試料を取除くことは同様に容易である。
【００２８】
画像の解像度を最大限にするために、試料１１２における対象の領域１２２は、回転軸９４を中心にして置かれる必要があり、すなわち、シャフトが回転しても動いてはならない。対象の領域または試料全体が回転画像の取込み中に中心から外れ、横方向に揺動する場合、これを視野に保持するのに必要な倍率は低くなるであろう。これは図６（ａ）に示される。２つの形状１３０および１３２は、その左右の最端の位置にある、回転中の試料１１２を示す。試料１１２が完全に中心に置かれると、図６（ｂ）に示されるように、それ自体の軸でスピン回転する。これは視野にわたるより小さな幅を示し、したがって、図６（ｃ）に示されるように、倍率を上げて、解像度がより高い画像を提供することができる。
【００２９】
回転軸９４に対する試料１１２の調整は、磁力で取付けることにより簡略化される。円板１１０に押し込むことにより、円板の中心が回転軸９４に対してずれることがある。図５（ａ）では、試料１１２内の対象の領域１２２は、回転軸上の中心ではなく左方向にずらして置かれる。モータシャフトが１８０°回転する場合、対象の領域１２２は、図５（ｂ）に示されるように、回転軸の右側に見える。磁石４６は、取付けられたままで、これに沿って金属マウント１１０をいずれの方向にもスライドさせることを可能にするので、（図５（ｃ）において矢印１１４により示されるように）レバー１６により側方から押す
ことにより、図５（ｃ）に示されるように、対象の領域１２２が回転軸の中心となるように試料を位置決めすることが可能となる。１８０°のさらなる回転により、図５（ｄ）に示されるように、対象の領域を中心に留めたまま試料１１２全体が横方向に揺動することがわかる。このように、試料は、通常、コンピュータスクリーン上の回転する試料の画像を観察しつつ調整される。
【００３０】
図１に示される画像化チャンバ２６が、ここで、図７に関連してより詳細に記載される。画像化中に試料とともに回転しない固定された試料チャンバを有することにより、このチャンバは、米国特許第５，６８０，４８４号に記載されるシステムの場合と同様に、回転中に一定の光路を維持するために円筒形である必要はない。先行技術の管１３６と本発明で用いられるチャンバとの比較が図７に示され、図７（ａ）は（水平に懸架される）先行技術の円筒形の管１３６の断面図を示し、図７（ｂ）はこの実施例で用いられるチャンバ２６を示す。画像化チャンバ２６は、一般的には直方体でかつ断面が正方形であるよう選択され、石英、ガラスまたは他の好適に透明な材料から作られる。各チャンバ／管は、試料の画像化を可能にする好適な光学特性を備えた液体１４３に浸される試料１４１を含む。チャンバ２６の平坦な側部１４２、１４２′、１４４および１４４′により、画像の屈折歪みが減じられ、より大きな試料を画像化することが可能となる。これは、方形断面のチャンバの互いに平行な壁１４２および１４２′が光軸２９に対して垂直に整列し、また、光の垂直入射が周辺の極めて小さな部分だけである円形の管１３６よりも、光の非屈折が生ずる画像化面積が大きいからである。こうして、サンプルから受取られる信号の量を改善し、屈折による歪みを減じて、チャンバ２６に対して１０ｍｍを超える幅にわたり良質の画像を形成することができる。
【００３１】
図７（ｃ）は、図７（ｂ）のサンプルチャンバの変形例を示す。図７（ｃ）では、サンプルチャンバ２６′は内周面が方形の断面を有するが、１つの壁１４０は、平凸レンズを備えるよう形作られてチャンバから出る光を屈折させる。このように形作ることにより、所望の屈折がもたらされ、図７（ｃ）の場合、拡大効果が得られる。
【００３２】
図１に示されるレバー１６が、ここで、図８に関連してより詳細に記載され、図８は図１の線ＶＩＩＩ−ＶＩＩＩに沿った平面図を示す。図８（ａ）は、レバー１６が通常の位置にあり、磁石４６および金属の試料マウント１１０から押し出されるのを示す。試料が（示されるように）一方に過度にずれた場合、ピボット１６４を中心にしてレバー１６を動かすことができ、これにより、差込み１６６が金属マウント１１０と係合して、試料を正確な位置へと押す（図８（ｂ））。これは、試料の位置をコンピュータスクリーン上で監視しながら行なわれる。手動のスイッチによりステッピングモータを慎重に制御することができるので、回転中の試料の軌道を監視することができ、試料が一方の最端部にある場合モータを停止させることができる。次いで、試料が、レバー１６を用いて中心に置かれ、光軸に対する試料のアライメントが完了するまでこのプロセスが続けられる。レバー１６は、試料に「減速された」動きをもたらすように構成され、これにより調整を制御しやすくする。
【００３３】
ピボット１６４はメインモータステージに取付けられる。これは支持部によってステージに固定され、これにより、差込み１６６が、金属マウントに接触するよう磁石のすぐ下の正確な高さにあることが確実となる。このように、差込み１６６は、試料を画像化するために選択される高さに関係なく、正確な高さにとどまる。
【００３４】
この明細書中に記載される装置は、生物学的試料と物性物理学等の他の分野からの試料との上で、いかなる目的にも応じた、３Ｄ顕微鏡とさらに回転顕微鏡とにも好適である。
【００３５】
３Ｄ顕微鏡法を行なう場合、屈折率は試料全体を通じて均一であるべきである。生物学
的組織については、これは、清浄溶剤に試料を浸すことにより容易に達成される。試料は、金属マウント上に直接接着され得るか、またはそれ自体がマウントに付着されるアガロース等の透明基材のブロックに埋め込まれ得る。次いで、清浄溶剤が、ブロックおよび試料に浸透する。ＢＡＢＢ（ベンジルアルコールと安息香酸ベンジルとの混合物）は溶剤として好適である。
【００３６】
その屈折率を均一にすることができないか、または透明ではない試料については、依然としてこの技術は有用である。（たとえ３Ｄの形状全体が凸状でないとしても）断面がすべて凸状である対象物の３Ｄの表面の形状を、その回転シルエットから、再び正確に作り出すことができる。
【００３７】
装置の生データが有用であるいくつかの適用例がある。一連の画像は回転する対象物（すなわち、試料）の動画に変換され得る。数個の静止２Ｄ画像からよりも、３Ｄ対象物の回転中に見える形状のほうがさらにより把握しやすい（多くの３Ｄ復元計画は、それらの結果をモデル回転の動画として提示する）。
【００３８】
この装置は、画像化後に他の分析のためにこの試料を用いることを可能にしつつ、生物学的組織において遺伝子発現パターン（ＲＮＡおよび／またはタンパク質分布）の３Ｄマッピングを行なうのにも好適である。この装置を用いての試料の画像化は、比較的迅速であり、約２０分で済む。対照的に、本物の組織切片を準備、埋め込み、区分け、装着、染色およびデジタル化するには何日もかかり、これにより何百ものデジタル２Ｄ部分が生成されるが、元々の３Ｄの形状を再び作り出すのに互いにこれらを整列させるための保証された方法はない。この組織切片は大いに伸びる傾向があるので、たとえこの切片すべてを互いに適合させて３Ｄの形状を作り出したとしても、最終結果は元々の試料の形状を正確には反映しないだろう。しかしながら、この装置を用いて得られる結果は、試料の実際の物理的形状に極めて類似しており、物理的な切片との唯一の違いは解像度が低いことである。この装置により生成されるデータは、純粋に３Ｄであるので、実際にはいかなる配向にも切除することができるか、または３Ｄにすることができる。
【００３９】
回転ステージの変形された構成が図９に示され、図１にそれぞれ対応する部分には同様の参照番号が付される。図９の回転ステージでは、ステッピングモータ４２の位置の３次元の調整が、３つの第２のステッピングモータ１５０、１５２および１５４を用いることにより達成される。モータ４２に対する傾斜アジャスタは存在しない。代わりに、プリズムが、横断水平軸２３を中心とした制御された傾斜により手動で調整され得る。モータ１５０および１５４は重要なステッピングモータである。モータ１５２は、手動の垂直アジャスタ４０と置換えることができる。
【００４０】
第２のステッピングモータ１５０、１５２および１５４により、ｘ、ｙおよびｚと明示される配向に沿って第１のステッピングモータ４２の３Ｄの位置をサブミクロン精度で調整することが可能となる。これらのステッピングモータ１５０、１５２および１５４は、第１のモータ４２を制御する同じコンピュータによって制御される。これは、コンピュータ５０がモータ駆動回路１５６により４つのモータを駆動する図１０に示される。この文書では、ｚ軸は光軸２９と平行であると考えられる。この軸に沿った移動により、システムの焦点が効果的に変更される。他の２つの軸に沿った移動により、試料のどの部分が光軸２９の中心と一致するかが変更される。
【００４１】
３つの第２のモータ１５０、１５２および１５４によるコンピュータ制御の並進運動は、以下の利点を有する。
【００４２】
１） 試料の対象の領域（ＲＯＩ）を、顕微鏡の視野内で中心に維持することが可能と
なる。これは２つの方法で達成される。
【００４３】
（ａ） ＲＯＩは、顕微鏡の焦点深度内に維持される。
【００４４】
（ｂ） ｘ軸に沿った、ＲＯＩの「横方向」の揺動運動を制限する。
【００４５】
これらの２つの利点により、このような機構を有さないシステムに比べて解像度がはるかに高い画像化が可能となる。
【００４６】
２） 図１および図８のレバーおよび差込みシステムより正確である。
【００４７】
３） （レバーおよび差込みシステムとは違い）コンピュータによって完全に制御され得るので、ＲＯＩをソフトウェア内で「画面上」と容易に規定し得る。
【００４８】
４） コンピュータがＲＯＩのための正確な３Ｄ座標を算出することを可能にする。
【００４９】
５） 同じ試料内の異なるスキャンが３Ｄ空間において互いに関連し合うことを可能にする。
【００５０】
６） コンピュータが、より高倍率でのより小さな領域の多重自動スキャンから、大きな試料の高解像度スキャンを構成することを可能にする（「タイリング」または「パッチング」として公知である）。
【００５１】
視野内でＲＯＩを維持するための、コンピュータ制御によるｘ移動およびｚ移動は、以下のように算出される。
【００５２】
第１に、ソフトウェアは以下の位置を算出する必要がある。
【００５３】
（ａ） 視野に対する第１のステッピングモータ４２の回転軸。
【００５４】
（ｂ） 第１のステッパの回転軸に対するＲＯＩ。
【００５５】
これらの２つの位置は１つの動作から算出され得る。全回転中に、ＲＯＩがカメラの視野内にとどまるのに十分な程度に倍率が低く設定される。このシステムは、ｘ−ステッピングモータに対していくつのパルスが、コンピュータスクリーン上の画素で測定されるような所与の変位に対応するかが分かるように、予め較正される。この関係は各倍率に対して決定される。次いで、コンピュータは、（図１１（ａ）から図１１（ｃ）に示されるように）０°、９０°、１８０°および２７０°に回転される、試料の４つの画像をユーザに呈示する。図１１（ａ）では、各々の外側の長方形がコンピュータスクリーン上の画像化ウィンドウを表し、スポットが試料の対象の領域１２２を表す。
【００５６】
図１１（ｂ）は、低倍率のための（コンピュータスクリーン上に示されるように）光軸に沿った図を示し、図１１（ｃ）は、回転軸９４に沿った平面図を示す。次いで、ユーザはコンピュータマウス（または同等物）を用いて、ＲＯＩが各画像のどこにあるかを示す。
【００５７】
図１２は、位置決めシステムが、ｘディメンジョンおよびｚディメンジョンの両方向にステッピングモータ４２をどれだけ動かし得るかと、したがって、中心から外れたＲＯＩをどれだけ補償し得るかとを示す。モータ４２のｘ移動およびｚ移動をコンピュータによって制御して、ＲＯＩ１２２が固定位置にとどまり、有効な回転軸を中心にして回転する
ことを確実にする。
【００５８】
図１１（ａ）、図１１（ｂ）、および図１１（ｃ）では、
χ１は、ステッピングモータユニットに変換される、０°でのＲＯＩのｘ−位置である。
【００５９】
χ２は、ステッピングモータユニットに変換される、１８０°でのＲＯＩのｘ−位置である。
【００６０】
χｗは、ステッピングモータユニットに変換される、画像化ウィンドウの幅である。
【００６１】
平均値χ１およびχ２により、画像化ウィンドウ（χｓ）に対するステッピングモータの回転軸の位置（χｓ）が提供される。Ｚ１およびＺ２の平均値により、この位置の第２の概算値が提供される（χｓ＝（χ１＋χ２＋Ｚ１＋Ｚ２）／４）。画像化ウィンドウ内でステッピングモータの回転軸を中心に据えるのに必要とされるｘ−変位（x-displacement）は、次のとおりである。
【００６２】
Ｘ-displacement（χｄ）＝χｗ／２−（χ１＋χ２＋Ｚ１＋Ｚ２）／４
これは図１３（ａ）および図１３（ｂ）に示される。
【００６３】
図１３（ａ）および図１３（ｂ）では、顕微鏡は図の下方向から試料を見ている。したがって、視野の端が２つの実質的に平行な線として現われ、これにより、見ることのできる範囲が示される。この視野の中心である光軸は、図１３（ａ）において垂直な点線として示される。
【００６４】
図１３（ｂ）は、０°の回転位置で試料を示す（α＝０）。前述の測定値（χ１、χ２、Ｚ１、Ｚ２）から、第１のステッピングモータの回転軸からのＲＯＩのｘ距離とｚ距離とを容易に算出することができる。回転位置（角度α）が０である場合、χα０はｘ−距離である（χα０＝（χ１−χ２）／２）。同様に、Ｚα０は、αが９０°およびαが２７０°で得られる２つの測定値から算出することができる（Ｚα０＝（Ｚ１−Ｚ２）／２）。次いで、ＲＯＩの位置をデカルト座標から極座標へ変換することができ、ここでは、αが０°である場合、Ｄはステッピングモータ軸からのＲＯＩの距離であり、θは光軸に対するその線（またはそれと平行な線）の角度である。
【００６５】
Ｄ＝（χα０²＋Ｚα０²）の平方根 θ＝tan^-1（χα０／Ｚα０）
ここでは、第１のステッピングモータのいかなる回転位置（α）に対しても、第２のｘｚステッピングモータの移動によりＲＯＩを光軸上に位置づけることができ、全体の変位（ＸｔおよびＺｔ）は次のように算出される。
【００６６】
χｔ＝χｄ＋Ｄ.sin（α＋θ），および Ｚｔ＝Ｄ．cos（α＋θ）
１つのＯＰＴ復元からサンプリングされる領域の３−Ｄ形状は、円形の断面を有する実質的に円筒形であり、その回転対称軸は、画像化中に用いられる有効回転軸であり、その直径および長さは視野の幅および高さによって表される。我々は、デカルト座標と極座標とを交互にして試料内の位置を表すことができ、画素のサイズを試料内の実際の距離と関連づけることができるので、同じ試料から得られた他のスキャンに対する、サンプリングされた円筒形の位置と形状とを容易に算出することができる。
【００６７】
２−Ｄ画像化では、高解像度の画像は、しばしば、対象物の小領域の多くの画像を高倍率で撮り、その後これらのより小さな画像を一緒につなぎ合わせることによって構成される。これは、しばしば、「タイリング」または「パッチング」として公知である。コンピ
ュータ制御のＸＹＺステージにより、同じ方策を３−ＤのＯＰＴ画像化に適用することが可能となる。
【００６８】
上述のように、ＯＰＴスキャンからのサンプル領域は、断面が円形である円筒形である。図１４は、軸９４に沿って見下ろした平面図において、試料１６０が、１つのスキャン１６２で低解像度でいかに画像化され得るか、または代替的に、試料内の各位置が少なくとも１つのサンプル領域内に含まれるように７つの高解像度スキャン１７０を位置決めすることによりいかに画像化され得るかを示す。個々のサンプル領域は断面が円形であるので、大きな領域を覆うための１つの効率的な配置は、スキャンを六角形に配置して、隣接するスキャンの間を僅かに一部重ね合わせることである。試料のｙ−軸に沿った別々の位置もまた、ｙ−軸のステッピングモータを用いてサンプリングされ得る。
【００６９】
このタイリングプロセスはコンピュータにより完全に制御および実行され得る。
【００７０】
１つのスキャンでその全体が画像化されるすべての試料については、最適なサンプル領域の位置は、上述のように、ＲＯＩを識別するユーザを必要とすることなく自動的に算出され得る。単純な画像処理により、以下のように、アライメントプロセス中にテスト画像内に試料の輪郭または中心を見出すことができる。
【００７１】
１） 倍率を低く設定する（コンピュータ制御の顕微鏡を用いて自動的に設定され得る）。
【００７２】
２） ０°、９０°、１８０°および２７０°の回転で４つの画像を撮る。
【００７３】
３） 各画像のヒストグラムを算出して、背景と試料を区別するための好適なしきい値レベルを決定する。
【００７４】
４） 各画像における試料の重心の位置を算出する。
【００７５】
５） 上述のように、これらの位置をＲＯＩ測定値として用いる。
【００７６】
６） 次に続くいかなる回転中にも新たに変位をもたらす。
【００７７】
７） 倍率を上げる。
【００７８】
８） ４つの回転する画像を撮り、倍率が高過ぎるか（すなわち、試料の端部が視野の外側にあるか）どうかを判断する。
【００７９】
９） 試料が依然として視野内にある場合、ステップ４に戻る。
【００８０】
１０） 試料の端部が視野の外側にある場合、倍率を以前の値に減ずる。
【００８１】
１１） 試料をスキャンする。
【００８２】
図１または図９の回転ステージにおいて用いることのできる平行照射手段が、図１５および図１６に示される。
【００８３】
レーザまたは他の光源１７２を、焦点合わせ手段（屈折レンズ１７４または屈折鏡）とともに用いて、すべての光線が実質的に光軸と平行である光のビーム１７６を生成する。図１５には、回転ステージの残りの部分に関連してこの装置が示され、この例では、ｘ方
向およびｚ方向へのそれぞれの、コンピュータ制御による調整のための２つのステッピングモータ１５０および１５４が備えられる。垂直方向の調整は、垂直アジャスタ４０により手動で行なわれる。レンズ２２は、軸２３を中心にして傾斜調整することができる。
【００８４】
実験の結果、光軸と非平行な試料に入射する照射光は、その結果にノイズを生じさせることが明らかである。すべての照射光線が光軸と平行である平行光源は、この問題を緩和し、その結果、画像化の品質を上げる。
【００８５】
図１７では、波長フィルタ１７８が、光源１８０と試料２８との間の或る位置に配置される。これは、手動または自動で光路に位置決めされ得る一連の異なったフィルタからなってもよく、各々は、異なった範囲の波長の透過を可能にする。または、これは電子的に調節可能なフィルタであってもよい。
【００８６】
代替的には、２つの電子的に調節可能な液晶フィルタを蛍光画像化のために用いて、照射光と検出された光との両方の波長を制限することができ、この可能性は、光検出器１８４の２Ｄアレイの前に配置される第２の電気的に制御されたフィルタ１８２によって示される。
【００８７】
所与の化学物質は、異なる効率で別々の波長を吸収するだろう。これらの違いは、（広範囲の波長に対する吸収を説明する）スペクトルとして示すことができる。ほとんどの試料は、別々の化学物質のさまざまな空間分布を含むので、異なった試料は、異なった波長（または波長の組合せ）を用いて最適に画像化される。上述のフィルタシステムにより、所与の試料を画像化するのにどの波長を用いるかをユーザが変更することが可能となる。
【００８８】
同様に、蛍光化学物質は、これらを励起する異なった波長の効率を説明する１つのスペクトルと、蛍光で放射される大量の異なった波長を説明する第２のスペクトルとを有する。２つの電子的に制御されたフィルタを用いることにより、励起と発光との可能な組合せのために、（少なくとも）２−Ｄパラメータ空間が発生する。このようなシステムにより、最適な組合せを調査することで異なった化学物質を識別することが可能となる。これにより、生物医学的サンプルの３−Ｄ組織構造を、特定の染色を必要とせずに画像化することが可能となる。
【００８９】
この発明に従った回転ステージはプリズム２２を含む必要がなく、またこの回転ステージが標準の垂直式の顕微鏡とともに用いられる必要もないことが理解される。図１８は、図１５の構成の変形例を示す。（図１５に相当する部分が同じ参照番号を示す）図１８では、チャンバ２６から発する光は顕微鏡の光学素子およびデジタルカメラに入射し、顕微鏡の対物レンズ３０と試料との間に短い作動距離を与える。
【００９０】
この試料は、シャフト４４によって担持される並進運動ステージを用いることにより位置決めされ得る。この並進運動ステージは、ｘ方向およびｚ方向への手動またはコンピュータ制御による調整を有する。
【図面の簡単な説明】
【００９１】
【図１】顕微鏡と組合わせたこの発明に従った、回転ステージを含む光学画像化装置を示す斜視図である。
【図２】デジタル画像を得る際にこのような画像化装置がどのように制御されるかを示す概略図である。
【図３】装置の正面斜視図である。
【図４（ａ）】装置の最適な作動構成を示すのに用いられる概略図である。
【図４（ｂ）】装置の最適な作動構成を示すのに用いられる概略図である。
【図５（ａ）】試料の試料支持手段への取付と、対象の領域のアライメントとを示す図である。
【図５（ｂ）】試料の試料支持手段への取付と、対象の領域のアライメントとを示す図である。
【図５（ｃ）】試料の試料支持手段への取付と、対象の領域のアライメントとを示す図である。
【図５（ｄ）】試料の試料支持手段への取付と、対象の領域のアライメントとを示す図である。
【図６（ａ）】装置の解像度を説明するのに用いられる概略図である。
【図６（ｂ）】装置の解像度を説明するのに用いられる概略図である。
【図６（ｃ）】装置の解像度を説明するのに用いられる概略図である。
【図７（ａ）】管を含む先行技術の試料を示す断面図である。
【図７（ｂ）】この発明で用いられる２つの試料チャンバを示す図である。
【図７（ｃ）】この発明で用いられる２つの試料チャンバを示す図である。
【図８（ａ）】試料の位置を調整するための回動するように装着されたレバーの使用を示す、図１の線ＶＩＩＩ−ＶＩＩＩに沿った部分的平面図である。
【図８（ｂ）】試料の位置を調整するための回動するように装着されたレバーの使用を示す、図１の線ＶＩＩＩ−ＶＩＩＩに沿った部分的平面図である。
【図９】この発明に従った変形された光学画像化装置の斜視図である。
【図１０】図９の装置を示す図である。
【図１１（ａ）】図９の装置における試料画像の位置決めと観察とを示す図である。
【図１１（ｂ）】図９の装置における試料画像の位置決めと観察とを示す図である。
【図１１（ｃ）】図９の装置における試料画像の位置決めと観察とを示す図である。
【図１２（ａ）】図９の装置における試料画像の位置決めと観察とを示す図である。
【図１２（ｂ）】図９の装置における試料画像の位置決めと観察とを示す図である。
【図１３（ａ）】図９の装置における試料画像の位置決めと観察とを示す図である。
【図１３（ｂ）】図９の装置における試料画像の位置決めと観察とを示す図である。
【図１４】図９の装置における試料画像の位置決めと観察とを示す図である。
【図１５】図１または図９の装置において用いることのできる平行照射手段を示す図である。
【図１６】図１または図９の装置において用いることのできる平行照射手段を示す図である。
【図１７】図１または図９の光学ステージにおける光源から波長を選択する方法を示す図である。
【図１８】図１６に示される装置の変形例を示す図である。

Claims (22)

1. 複数の方向から試料を画像化するのに用いるための回転ステージであって、前記回転ステージは試料支持手段を含み、この試料支持手段は、それに沿って光が試料から放射される光軸を横断する、垂直または実質的に垂直な回転軸を中心にして画像化される試料を回転させるよう動作する回転可能部材を含み、前記試料支持手段は、チャンバ内の光学画像化液に浸された試料を受取るために、固定画像化チャンバの上方に配置される、回転ステージ。
2. 前記画像化チャンバは、光軸に対して垂直な少なくとも１つの平面を有する、請求項１に記載の回転ステージ。
3. 試料によって放射される光を受取るために光軸上に位置決めされるプリズムを含み、前記プリズムは、光を９０°偏向するよう作用して、垂直な光軸を備えた顕微鏡によってこの光が受取られることを可能にする、請求項１または２に記載の回転ステージ。
4. 前記プリズムは、水平軸を中心とした位置に調整可能であり、この水平軸は、同様に水平である光軸と直交する、請求項３に記載の回転ステージ。
5. 前記回転可能部材は、光軸に対して垂直な水平調整軸を中心として回転軸を調整するために位置が調整可能である、請求項１から４のいずれかに記載の回転ステージ。
6. 前記水平調整軸は、前記回転可能部材の下方端部より下にあって、いずれの水平な調整でも試料の並進運動を最小限にすることを確実にする、請求項５に記載の回転ステージ。
7. 前記回転可能部材は、回転軸と整列する方向に沿った並進運動により調整可能であり、これにより、試料を回転ステージへ載せたりまたはそこから降ろしたりすることのできる下がった動作可能位置と上がった動作不能位置との間で、前記試料支持手段を移動させることが可能となる、請求項１から６のいずれかに記載の回転ステージ。
8. 前記回転可能部材は、位置調整可能なプラットフォーム上に装着されるステッピングモータの出力シャフトである、請求項１から７のいずれかに記載の回転ステージ。
9. 前記回転可能部材の下方端部は、前記回転可能部材の下方端部から試料を懸垂、懸架または垂下することができるように形成される、請求項１から８のいずれかに記載の回転ステージ。
10. 前記回転可能部材は、その下方端部またはその近くに、磁力により試料の取付を解放可能にするための磁気部材を有する、請求項９に記載の回転ステージ。
11. 前記試料支持手段は、回転軸に対して試料を正確に位置決めするための試料位置決め手段を含む、請求項１から１０のいずれかに記載の回転ステージ。
12. 前記試料位置決め手段は、ステージに回動するように装着され、かつ、試料の最終的な位置決めを得るために装着された試料を押すよう動作するレバーを含む、請求項１１に記載の回転ステージ。
13. 前記試料位置決め手段は、回転軸に対して垂直な面における、２つの互いに垂直な方向に沿った、前記回転可能部材のコンピュータ制御による調整のための２つの電気モータを含む、請求項１１に記載の回転ステージ。
14. 前記試料位置決め手段は、前記回転可能部材により担持される２次元の並進運動ステージの調整のための、手動またはコンピュータ制御の調整手段を含み、前記並進運動ステージは、回転軸に対して垂直な面において２つの互いに垂直な方向への調整をもたらす、請求項１１に記載の回転ステージ。
15. 光のビームを生成するための平行光源を含み、すべての光線は、光軸と実質的に平行であり、使用の際に試料を照射する、請求項１から１４のいずれかに記載の回転ステージ。
16. 試料を照射する光の波長を制限するための波長フィルタを含む、請求項１から１５のいずれかに記載の回転ステージ。
17. ２つの波長フィルタ、すなわち、試料を照射する光の波長を制限するための第１のフィルタと、検出前に試料から発する光の波長を制限するための第２のフィルタとを含む、請求項１から１５のいずれかに記載の回転ステージ。
18. 光投射型断層撮影スキャナの一部を形成する、請求項１から１７のいずれかに記載の回転ステージ。
19. 試料の画像を得る方法であって、それに沿って光が試料から放射される光軸を横断する、垂直または実質的に垂直な回転軸を中心にして試料を回転させるステップを含み、回転する試料は固定光学チャンバ内の液体に浸される、方法。
20. 前記回転軸は光軸に対して垂直である、請求項１９に記載の方法。
21. 前記試料は、回転可能部材の下方端部から懸垂、懸架または垂下される、請求項１９または２０に記載の方法。
22. 光軸に沿って見て、回転軸上にはない一部の試料の軌道を監視するステップと、軌道の形が楕円形ではなく直線となるまで調整軸を中心にして試料を傾斜させるステップとを含む、請求項１９から２１のいずれかに記載の方法。