PT1530073E - Aparelho de tomografia com projecção óptica tendo um suporte giratório para a obtenção de imagens de uma amostra - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO "APARELHO DE TOMOGRAFIA COM PROJECÇÃO ÓPTICA TENDO UM SUPORTE GIRATÓRIO PARA A OBTENÇÃO DE IMAGENS DE UMA AMOSTRA"

Campo da Invenção

Esta invenção refere-se a um aparelho de tomografia com projecção óptica tendo um suporte giratório para a obtenção de imagens de uma amostra.

Antecedentes da Invenção São conhecidos aparelhos ópticos de obtenção de imagens para a produção de imagens tridimensionais de amostras através da tomografia com projecção óptica, ver por exemplo, a Patente US N° 5680484. O aparelho óptico divulgado nesta patente da técnica anterior tira uma série de imagens digitais de uma amostra a partir de diferentes ângulos. Estas imagens são fornecidas a um algoritmo que utiliza uma transformação matemática para reconstruir uma imagem tridimensional. No documento US 5680484 a amostra é mantida dentro de um tubo transparente que é suportado em duas pontas de modo a estar substancialmente horizontal, e o tubo é girado utilizando um motor passo a passo e correia de comando para permitir a obtenção de imagens de diferentes partes da amostra. A refracção da luz nos tubos afecta a qualidade do sinal e a utilização dos tubos constitui um grave constrangimento na dimensão máxima da amostra cuja imagem se pretende obter. O aparelho divulgado 1 nesta patente da técnica anterior tem várias limitações que afectam as utilizações potenciais desta técnica de obtenção de imagens, em particular, o facto de ser difícil introduzir amostra no tubo cilíndrico oco e de ajustar a posição da amostra. M. Almavist, et al., publicado na "Ultrasonics", volume 37 (1999), páginas 343-353, divulga um sistema de medição por tomografia com difracção de luz para realizar medições de alta resolução espacial de ultra-sons de onda contínua. A patente US 5710625 divulga um suporte giratório para segurar e posicionar uma amostra a fim de realizar a análise espectral da amostra.

Resumo da Invenção

De acordo com a presente invenção, é proporcionado um aparelho de tomografia com projecção óptica (OPT) de acordo com a reivindicação 1. Ele inclui um suporte giratório compreendendo meios de suporte da amostra incluindo um elemento giratório que serve para girar uma amostra cuja imagem se pretende obter em torno de um eixo de rotação transversal em relação a um eixo óptico ao longo do qual é emitida luz vinda da amostra, caracterizado por o eixo de rotação ser vertical ou substancialmente vertical, os meios de suporte da amostra serem dispostos em cima de uma câmara de obtenção de imagens para receber a amostra imersa num fluido óptico para obtenção de imagens dentro da câmara, e a câmara de obtenção de imagens ser estacionária. 2 0 leitor de OPT pode incluir um microscópio separado e hardware e software associados que permitem a obtenção de imagens tridimensionais de uma amostra, tal como um tecido biológico. Ao ter os meios de suporte da amostra afastados do microscópio, o posicionamento da amostra pode ser facilmente ajustado devido à melhor acessibilidade do dispositivo de fixação da amostra. Com uma amostra alongada, o eixo mais comprido da amostra fica substancialmente paralelo à força de gravidade quando fixo nos meios de suporte da amostra. Esta situação permite que a amostra seja fixa apenas num ponto, ajudando mais uma vez à localização da amostra dentro dos meios de suporte da amostra, e evita a deflexão da amostra devido aos efeitos da força de gravidade, uma vez que uma tal deflexão pode provocar uma distorção indesejada da forma da amostra e afectar a precisão e a resolução da imagem obtida.

Ao ter uma câmara estacionária separada da parte giratória do suporte, a forma da câmara não fica limitada à uma forma simétrica giratória. De um modo preferido, a câmara tem, pelo menos, uma face plana na qual incide a luz para obter a imagem da amostra. A utilização de uma face plana lisa sem quaisquer imperfeições ou ondulações assegura uma redução da distorção da imagem devida à refracção da luz. A câmara pode ser formada como um cubóide oco transparente e disposta para que duas faces opostas do cubóide estejam substancialmente perpendiculares ao eixo óptico ao longo do qual a luz é emitida da amostra, para que uma grande área transversal seja apresentada ao eixo óptico. A selecção de uma câmara deste tipo com uma secção transversal quadrada assegura que a quantidade de luz refractada antes de passar através da amostra seja substancialmente reduzida quando comparada com as câmaras giratórias cilíndricas da técnica anterior melhorando, consequentemente, a qualidade da imagem. 3

Uma parede ou face da câmara pode ser formada para refractar a luz de uma maneira desejada, por exemplo, para proporcionar um efeito de ampliação. 0 suporte giratório pode ainda compreender um meio de ajuste montado de modo articulado, tal como uma alavanca, tendo um dente que se estende a partir do mesmo, sendo o dente disposto, em utilização, de modo a encaixar-se com uma amostra para alterar a sua posição relativamente ao eixo de rotação. 0 suporte giratório pode ainda compreender um prisma posicionado de modo a receber luz depois desta ter iluminado a amostra, actuando o prisma para deflectir a luz em 90° para permitir que a luz seja recebida por um microscópio com um eixo óptico vertical. Ao utilizar um prisma, a trajectória óptica até ao microscópio não necessita de ser uma linha recta e, consequentemente, não é necessária a modificação dos actuais microscópios para poderem ser utilizados com um suporte giratório de acordo com a presente invenção. 0 elemento giratório dos meios de suporte da amostra pode ser suportado por uma plataforma ajustável, sendo variável a sua posição relativamente à horizontal. Esta situação permite o ajuste do eixo de rotação relativamente a um eixo óptico para que, se for necessário, é proporcionado um ângulo de 90° entre o eixo óptico e o eixo de rotação. Esta situação é particularmente útil na obtenção de imagens tridimensionais.

De um modo preferido, a plataforma ajustável é ajustável na vertical de modo a subir ou descer o elemento giratório relativamente ao eixo óptico, permitindo assim que uma amostra 4 seja inserida numa trajectória óptica da luz, ou ajustada da mesma.

De um modo preferido, o elemento giratório é formado para permitir que a amostra fique pendurada, suspensa ou a pender para baixo a partir da extremidade inferior do elemento giratório. Quando uma amostra é preparada apropriadamente com uma estrutura metálica de apoio magnetizável, a fixação da amostra aos meios de suporte da amostra torna-se então simples, ficando apenas dependente da atracção magnética e não numa fixação delicada. Esta situação é uma vantagem na medida em que, tipicamente, as amostras são bastante pequenas e delicadas, tendo habitualmente um diâmetro na ordem dos 1-20 mm, e pode ser complicada a sua fixação num dispositivo de fixação utilizando um parafuso.

Breve Descrição dos Desenhos A invenção será agora descrita, a titulo de exemplo, fazendo referência aos desenhos em anexo, em que: A Figura 1 é uma vista em perspectiva do aparelho de obtenção óptica de imagens que constitui uma forma de realização preferida da invenção e que compreende um suporte giratório juntamente com um microscópio; A Figura 2 mostra uma ilustração esquematizada de como um aparelho de obtenção de imagens deste tipo é controlado quando está a obter imagens digitais; 5 A Figura 3 mostra uma vista em perspectiva frontal do aparelho;

As Figuras 4 (a) e 4 (b) são desenhos esquematizados utilizados para ilustrar a configuração de funcionamento mais apropriada do aparelho;

As Figuras 5(a), 5(b), 5(c) e 5(d) ilustram a fixação de uma amostra nos meios de suporte da amostra e o alinhamento de uma região de interesse;

As Figuras 6(a), 6(b) e 6(c) são diagramas esquematizados utilizados para explicar a resolução do aparelho; A Figura 7 (a) mostra um corte transversal através de uma amostra da técnica anterior contendo um tubo, mostrando as Figuras 7(b) e 7 (c) duas câmaras de amostras conforme utilizadas na presente invenção;

As Figuras 8 (a) e 8(b) mostram uma vista em planta parcial ao longo da linha VIII-VIII da Figura 1, ilustrando a utilização de uma alavanca montada de modo articulado para ajustar a posição da amostra; A Figura 9 é uma vista em perspectiva do aparelho modificado de obtenção óptica de imagens de acordo com a invenção; A Figura 10 é um diagrama ilustrando o aparelho da Figura 9; 6

As Figuras 11a, 11b, 11c, 12a, 12b, 13a, 13b e 14 ilustram o posicionamento e a observação da imagem da amostra no aparelho da Figura 9;

As Figuras 15 e 16 ilustram um meio de iluminação colimada que pode ser utilizado no aparelho da Figura 1 ou Figura 9; A Figura 17 indica uma maneira de seleccionar o comprimento de onda de uma fonte de luz colocada no suporte óptico da Figura 1 ou da Figura 9; e A Figura 18 ilustra uma modificação do aparelho mostrado na Figura 16.

Descrição Detalhada A Figura 1 mostra um aparelho de obtenção óptica de imagens na forma de um leitor de OPT compreendendo um suporte 10 giratório e um microscópio 12 com um alcance de grande distância ou de dissecação, separado do suporte 10 giratório. O suporte 10 giratório tem um suporte 14, uma alavanca 16 montada de modo articulado, uma íris e difusor 20 óptico e um prisma 22 de quartzo. O suporte 14, a íris e difusor 20 e o prisma 22 são fixos numa base 24 do suporte 10, assim como um dispositivo 25 de fixação para receber uma câmara 26 transparente, ou cuba, que tem uma forma geralmente cubóide. A cuba 26 contém um fluido com propriedades ópticas apropriadas para a obtenção de imagens de uma amostra 28 suspensa dentro da cuba, sendo um fluido apropriado uma mistura de álcool benzílico e benzoato de benzilo. Este aparelho pode ser utilizado para a obtenção de imagens pelo método de campo luminoso, de falta de luz e de 7 fluorescência mas é particularmente apropriado quando uma imagem (3D) tridimensional da amostra é criada a partir de uma série de imagens obtidas de diferentes ângulos, e para amostras demasiado grandes para delas se obterem imagens via microscopia confocal. A luz passa ao longo do eixo 29 óptico, passando através do centro da iris e difusor 20, e através da amostra 28 e é deflectida em ângulos rectos pelo prisma 22 para entrar numa objectiva 30 do microscópio 12. Uma vez que o microscópio tem um alcance de grande distância, fica disponível um espaço suficiente para o prisma 22 ser colocado debaixo da objectiva 30 do microscópio. A utilização de um prisma permite a um microscópio orientado na vertical a obtenção da imagem da amostra. Todavia, o prisma 22 pode ser omitido quando a objectiva do microscópio estiver paralela ao eixo óptico. A íris e difusor 20 controlam a quantidade de luz que passa de uma fonte de luz (não mostrada) para alcançar a amostra 28 e proporcionar uma iluminação uniforme.

0 suporte 14 comporta uma protuberância circular na qual é montada de modo articulado, em torno de um eixo 90 (Figura 4), uma placa 33 inclinável na qual pode deslizar uma placa 32 no sentido ascendente e descendente. A placa 32 comporta uma plataforma 34 ajustável que sobressai horizontalmente da placa 32. O ângulo da plataforma 34 pode ser alterado relativamente à horizontal utilizando um regulador 36 de inclinação e a posição vertical da plataforma 34 pode ser variada através de um regulador 40 vertical. Um motor 42 passo a passo é montado na plataforma 34, com um veio 44 motor giratório do motor estendendo-se através da plataforma 34. Um íman 46 (um íman permanente ou um electroíman) é fixo na extremidade inferior do veio 44 e suporta a amostra 28 cuja imagem se pretende obter. A 8 maneira como a amostra é fixa no iman será descrita mais adiante em relação à Figura 5. 0 motor 42 passo a passo faz girar o veio 44 com um passo de 0,9 graus, proporcionando até 400 posições de obtenção de imagens da amostra. Uma série de imagens digitais da amostra 28 alongada é tirada através da indexação do veio 44 com as suas sucessivas posições giratórias e, consequentemente, do posicionamento da amostra em sucessivas posições giratórias enquanto a amostra está suspensa dentro da cuba 26, permanecendo a cuba estacionária.

Através da montagem do motor 42 passo a passo com o seu eixo giratório na vertical, a amostra 28 do tipo haste necessita apenas de ser fixa num ponto, tipicamente, na sua extremidade superior, para que ocorra uma rotação controlada da amostra. A amostra 28 é imersa no liquido, suportada da parte de cima pelo iman 46, utilizando o regulador 40 vertical para fazer descer a plataforma. Esta orientação vertical da amostra e do eixo giratório evita a utilização de juntas circulares ou de outras configurações mecânicas que seriam necessárias para conectar o motor seco à amostra imersa e, em segundo lugar, assegura que a amostra não é deflectida para fora do seu eixo giratório pela força de gravidade uma vez que a amostra alongada tem o seu eixo principal paralelo à força de gravidade. Poder evitar os efeitos das distorções na amostra através da colocação da amostra numa orientação vertical é particularmente importante para a obtenção de imagens tridimensionais precisas, em particular, para amostras de maior dimensão. A utilização de um cubóide oco geralmente vertical, como a câmara 26 de obtenção de imagens em torno da amostra 28 assegura que a área superficial do liquido para obtenção de imagens seja limitada, reduzindo a evaporação do liquido. Para além disto, podem ser obtidas imagens de amostras de maior dimensão, com diâmetros tipicamente de 9 1-20 mm, através da utilização de uma câmara fixa deste tipo sem perda da qualidade do sinal digital.

Em utilização, uma câmara 52 digital (Figura 2) é fixa ao microscópio 12 e produz uma imagem digital da amostra conforme obtida pelo microscópio a partir da luz que percorreu o eixo 29 óptico e que foi transmitida através da câmara e da amostra. Uma série de imagens digitais é tirada da amostra a partir de diferentes ângulos e esta informação digital é fornecida a um algoritmo que utiliza uma fórmula matemática para reconstruir a estrutura da amostra em três dimensões. Tipicamente, as imagens são obtidas utilizando os elementos de controlo conforme apresentados na Figura 2. Consequentemente, um computador 50 que tem software de captação de imagens digitais está em comunicação bidireccional com a câmara 52 digital fixa ao microscópio 12 que recebe imagens de uma amostra de interesse. O computador 50 controla os discos 56 do filtro fixos no microscópio 12 para alterar o comprimento de onda da radiação que é detectada. O software de captação do computador é mostrado, em forma de diagrama, na Figura 2, como sendo um software 58 para controlar a captação de imagens vindas da câmara digital, um programa 54 para controlar o software de obtenção de imagens, o suporte giratório e o software dos discos do filtro, software 48 para controlar os discos do filtro e software 64 para converter os ficheiros de imagem numa reconstrução tridimensional. O computador está, também, em comunicação bidireccional com circuitos 60 electrónicos de controlo conectados ao suporte 10 giratório e controla os circuitos 60 para ajustar a orientação da amostra conforme o desejado durante a captação de sucessivas imagens. Assim que as imagens digitais forem obtidas, são processadas em 64 para produzir uma reconstrução 66 tridimensional da amostra utilizando um processamento 10 matemático, de uma maneira similar à análise descrita no documento US 5680484.

Se necessário, o computador pode controlar todo o processo de obtenção de imagens, realizando o processamento de imagens para determinar a dimensão da amostra, os seu alinhamento, e se ela está focada, etc., e ajustando a posição da amostra antes da realização da obtenção giratória das imagens. Esta automatização total do processo de obtenção de imagens é particularmente desejada em projectos de mapeamento de expressões de genes em grande escala em que muitos dispositivos deste tipo poderiam funcionar em paralelo.

Os circuitos 60 sob comando do computador para controlar o motor passo a passo 42 estão disponíveis comercialmente para a maioria dos sistemas informáticos populares. Os circuitos 60 são conectados ao computador 50 e são sensíveis aos sinais vindos do computador 50 para controlar uma variedade de dispositivos mecânicos (motor passo a passo, solenoides, etc.).

Para criar uma representação tridimensional da amostra, o software realiza as seguintes funções: (1) determina o eixo de rotação (através da simetria que existe entre cada par de imagens que foram tiradas com 180 graus entre si), (2) reorganiza a pilha de imagens numa pilha ortogonal de imagens de projecção (em que uma imagem representa uma única secção através da amostra, vista de todos os diferentes ângulos capturados), (3) realiza o processamento matemático em cada imagem de projecção, para recriar aquela secção através da amostra, (4) combina num formato tridimensional todas as imagens de secções calculadas. As reconstruções podem ser criadas quer a partir de 11 luz transmitida, quer de luz emitida de uma maneira fluorescente.

Agora que estão descritos o aparelho em geral e a sua utilização na aquisição de dados, certos componentes do aparelho de obtenção de imagens serão descritos em mais pormenor. A Figura 3 mostra uma vista frontal do suporte 10 giratório. O regulador 36 da inclinação varia o ângulo de inclinação da plataforma 34 em torno do eixo 90 que esta debaixo da extremidade inferior do veio 44 e está, aproximadamente, à mesma altura da amostra para que os ajustes na inclinação não desloquem substancialmente a amostra. O eixo 90 pode intersectar o eixo 29 óptico. O ajuste da inclinação (ilustrado pela seta 92 bidireccional na Figura 3) assegura que o eixo 94 giratório do motor passo a passo 42 fica precisamente na perpendicular com o eixo 29 óptico. Tendo ajustado a inclinação da plataforma 34, é ajustada a posição da plataforma 34 relativamente à base 24 utilizando o regulador 40 vertical que utiliza uma disposição de engrenagem de cremalheira para subir e descer a plataforma 34 na direcção ajustada do eixo 94 giratório. Através da utilização do regulador 40 vertical, uma amostra transportada no iman fixo na extremidade do veio 44 pode ser descida até uma profundidade necessária dentro da câmara de obtenção de imagens para que sejam obtidas as imagens e subida para fora da câmara depois de ser realizada a obtenção de imagens. Se necessário, a posição vertical da amostra durante a obtenção de imagens pode também ser alterada desta maneira. Na posição elevada do veio, as amostras podem ser inseridas ou removidas do suporte giratório.

Quando o aparelho esta preparado, ele é alinhado para que o eixo óptico do microscópio passe através de um prisma e através 12 do centro da câmara de obtenção de imagens. Todavia, numa alta ampliação o alinhamento pode necessitar de algum ajuste uma vez que a amostra fica ligeiramente deslocada do centro do campo de visão. 0 mecanismo de subida/descida acima mencionado pode ser ajustado para corrigir este desalinhamento no sentido vertical.

Embora uma grande parte da obtenção de imagens da amostra possa ser realizada colocando o eixo giratório aproximadamente perpendicular em relação ao eixo óptico, a reconstrução tridimensional da amostra utilizando o processamento matemático será de qualidade muito baixa, a não ser que o ângulo entre o eixo óptico e o eixo giratório seja, exactamente, 90°. O regulador 36 da inclinação permite que o eixo 94 giratório seja inclinado ligeiramente de modo a assegurar que o ângulo é exactamente de 90°. O regulador 36 da inclinação depende, tipicamente, de um mecanismo de parafuso para deslocar a plataforma 34 para um dos lados. Uma amostra de calibragem é utilizada para ajustar o ângulo de inclinação, com a amostra de calibração a conter um número de pequenas partículas cujas trajectórias podem ser monitorizadas no ecrã de um computador enquanto o veio gira. Se o eixo de rotação não estiver perfeitamente perpendicular com o eixo óptico, a trajectória da partícula aparece com a forma de um elipse, ver a Figura 4 (a) que mostra a vista ao longo do eixo óptico à medida que o veio gira em torno do eixo 94. Quando o eixo está correctamente alinhado, a partícula é vista a deslocar-se de um lado para o outro, sem qualquer componente vertical do movimento, ver a

Figura 4(b). A Figura 5 mostra o sistema de colocação do íman que é utilizado e que depende da atracção magnética entre um disco 110 metálico fixo numa amostra 112 e o íman 46 cilíndrico estando 13 permanentemente fixo na extremidade inferior do veio 44 giratório do motor passo a passo 42. Cada amostra tem um pequeno disco metálico magnetizável colado numa extremidade durante a preparação da amostra. 0 disco é então fixo ao íman aquando da obtenção de imagens e a amostra é suportada pela atracção magnética entre o disco e o íman. Uma vez que o disco 110 e a amostra 112 são relativamente leves, o íman não necessita de ser fortemente magnetizado para suportar os seus pesos. Uma vantagem do sistema magnético sobre, por exemplo, um sistema de parafuso, é que o pequeno tamanho do disco e da amostra obriga ao seu manuseamento com fórceps ou pinças. A colocação da estrutura de apoio ou do disco 110 num íman é relativamente simples com a utilização de fórceps, enquanto que se ela for aparafusada no dispositivo de fixação já não o é. Outra vantagem é que a posição da amostra relativamente ao eixo de rotação pode ser facilmente ajustada através do deslizamento da estrutura 110 de apoio ao longo da superfície 120 do íman. Para além disto, muitas amostras podem ser previamente preparadas com um disco fixo, e depois rapidamente inseridas no dispositivo de obtenção de imagens quando necessário.

Certos líquidos utilizados na câmara para a obtenção de imagens de amostras são tóxicos e corrosivos para o plástico e, nestes casos, as amostras são melhor tratadas utilizando fórceps. O sistema de fixação magnético torna-se então vantajoso uma vez que as amostras necessitam apenas de ser seguradas sob o efeito do íman para ficarem bem fixadas. É também fácil de remover cada amostra depois de obtidas as imagens.

Para maximizar a resolução das imagens, uma região 122 de interesse numa amostra 112 tem de ser centrada no eixo 94 de rotação, í. e.r não deve mexer com a rotação do veio. Se a 14 região de interesse, ou toda a amostra, estiver descentrada e oscilar de lado para lado durante a captação giratório da imagem, então a ampliação necessária para a manter em vista será baixa. Esta situação está ilustrada na Figura 6 (a). As duas formas 130, 132 representam a amostra 112 durante a rotação, nas suas posições mais extremas à esquerda e à direita. Quando a amostra 112 está perfeitamente centrada ela gira em torno do seu próprio eixo, ver a Figura 6 (b). Esta situação apresenta uma largura mais pequena em todo o campo de visão e, por isso, a ampliação pode ser aumentada para proporcionar uma imagem com uma maior resolução, ver a Figura 6(c). O ajuste da amostra 112 relativamente ao eixo 94 de rotação é simplificado pela fixação magnética. Ao empurrar o disco 110, o centro do disco pode ser deslocado relativamente ao eixo 94 de rotação. Na Figura 5 (a), a região 122 de interesse na amostra 112 não está centrada no eixo de rotação mas antes está deslocado para a esquerda. Se o veio do motor for girado em 180°, a região 122 de interesse fica então visível no lado direito do eixo de rotação, ver a Figura 5 (b) . Em virtude de o íman 46 permitir que a estrutura 110 metálica de apoio deslize sobre si em qualquer direcção, sem se desprender, um empurrão aplicado no flanco pela alavanca 16 (indicada pela seta 114 na Figura 5(c) é capaz de posicionar a amostra para que a região 122 de interesse fique centrada no eixo de rotação, ver a Figura 5(c). Uma rotação adicional de 180° mostra que, agora, toda a amostra 112 oscila de lado para lado, enquanto a região de interesse permanece centrada, ver a Figura 5(d). O ajuste da amostra desta maneira é habitualmente realizado enquanto são observadas as imagens da amostra em rotação num ecrã de um computador. 15 A câmara 26 de obtenção de imagens conforme mostrada na Figura 1 será agora descrita em mais pormenor fazendo referência à Figura 7. Ao ter uma câmara de amostra fixa que não gira com a amostra durante a obtenção de imagens, a câmara não necessita de ser cilíndrica para manter uma trajectória óptica constante durante a rotação, como acontece no sistema divulgado no documento US 5680484. A Figura 7 mostra uma comparação entre o tubo 136 da técnica anterior e a câmara utilizada na presente invenção, a Figura 7 (a) mostrando um corte transversal através do tubo 136 cilíndrico da técnica anterior (que está suspenso na horizontal), e a Figura 7(b) mostrando a câmara 26 utilizada na presente forma de realização. A câmara 26 de obtenção de imagens é escolhida para ter uma forma geralmente cubóide e uma forma de corte transversal quadrada, e é feita em quartzo, vidro ou outro material transparente adequado. Cada câmara/tubo contém uma amostra 141 imersa em líquido 143 com propriedades ópticas adequadas para permitir a obtenção de imagens da amostra. Os flancos planos 142, 142', 144, 144' da câmara 26 reduzem a distorção refractária da imagem e permitem a obtenção de imagens de amostras com maiores dimensões. Esta situação é possível porque as paredes 142, 142' paralelas entre si da câmara com corte transversal quadrado estão alinhadas na perpendicular com o eixo 29 óptico e proporcionam uma maior área de obtenção de imagens sobre a qual ocorre a não refracção da luz do que acontece com o tubo 136 circular, que só tem uma parte muito pequena da sua circunferência em incidência normal com a luz. Consequentemente, pode ser formada para a câmara 26 uma boa imagem em toda uma largura com mais de 10 mm, melhorando a quantidade de sinal recebida da amostra e reduzindo a distorção que resulta da refracção. 16 A Figura 7c ilustra uma modificação da câmara de amostras da Figura 7b. Na Figura 7c, a câmara 26' de amostras tem uma secção transversal interna quadrada mas uma parede 140 está formada para proporcionar uma lente plano-convexa para refractar a luz que sai da câmara. A sua forma provoca uma refracção desejada, no caso da Figura 7c, um efeito de ampliação. A alavanca 16 mostrada na Figura 1 é agora descrita em mais pormenor fazendo referência à Figura 8, que mostra uma vista em planta ao longo da linha vill-vm da Figura 1. A Figura 8 (a) mostra a alavanca 16 na sua posição habitual, afastada do iman 46 e da estrutura 110 metálica de apoio da amostra. Se a amostra estiver afastada em demasia para um lado (conforme ilustrado) a alavanca 16 pode ser girada em torno do pivot 164 para que o dente 166 se encaixe na estrutura 110 metálica de apoio para empurrar a amostra para a posição correcta (Figura 8b) . Isto é realizado enquanto a posição da amostra é monitorizada no ecrã do computador. Uma vez que o motor passo a passo pode ser controlado cuidadosamente através de interruptores manuais, a trajectória da amostra durante a rotação pode ser observada e o motor parado quando a amostra estiver na sua posição máxima num dos lados. A amostra é então centrada utilizando a alavanca 16, e o processo repetido até que esteja concluído o alinhamento da amostra relativamente ao eixo óptico. A alavanca 16 está concebida para produzir um movimento desmultiplicador na amostra, o que torna mais fácil o controlo do ajuste. O pivot 164 está fixo no suporte principal do motor. Ele é fixo no suporte por um suporte que assegura que o dente 166 está na altura correcta para poder entrar em contacto com a estrutura metálica de apoio, logo abaixo do iman. Desta maneira, o dente 17 166 permanece na altura correcta independentemente da altura escolhida para a obtenção de imagens da amostra. 0 suporte giratório aqui descrito é apropriado para a microscopia tridimensional e também para a microscopia giratória em qualquer utilização, em amostras biológicas e amostras vindas de outras áreas, tais como as ciências de materiais.

Durante a realização de uma microscopia tridimensional, o índice de refracção deverá ser uniforme em toda a amostra. Para tecidos biológicos esta situação é facilmente conseguida através da imersão da amostra num solvente de limpeza. A amostra pode ser colada directamente na estrutura metálica de apoio, ou embutida num bloco com uma matriz transparente, como a agarose, que é, ela própria, colada à estrutura de apoio. 0 solvente de limpeza permeia-se então nos blocos e na amostra. Um solvente adequado é o BABB (uma mistura de álcool benzílico e benzil benzoato) .

Para uma amostra cujo índice de refracção não pode ser tornada uniforme, ou que não é transparente, a técnica ainda se aplica. As formas com superfícies tridimensionais dos objectos cujas secções transversais são todas convexas (mesmo se a totalidade da forma tridimensional não seja convexa) podem ser recriadas com precisão a partir da sua silhueta giratória.

Existem algumas aplicações em que os dados originais do aparelho são úteis. A série de imagens pode ser convertida num filme do objecto (í. e. a amostra) a girar. É muito mais fácil perceber a forma de um objecto tridimensional quando ele é visto a girar do que a partir de algumas imagens bidimensionais estáticas (muitos projectos de reconstrução tridimensional 18 apresentam os seus resultados na forma de filmes de um modelo a girar). 0 aparelho também é apropriado para a realização de um mapeamento tridimensional de padrões de expressão dos genes (RNA e/ou distribuição de proteínas) em tecidos biológicos, ao mesmo tempo que permite que a amostra seja utilizada para outras análises após a obtenção de imagens. A obtenção de imagens da amostra utilizando o aparelho é relativamente rápida, demorando cerca de 20 minutos. Contrariamente a esta situação, a preparação, a colocação, o seccionamento, a montagem, o mancheamento e a digitalização de secções histológicas reais demora vários dias e produz centenas de secções digitais bidimensionais, mas nenhuma maneira garantida de as alinhar entre si para recriar a forma tridimensional original. As secções histológicas tendem a esticar significativamente, ao ponto de, mesmo se todas as secções pudessem ser encaixadas entre si para criar uma forma tridimensional, o resultado final não iria reflectir com precisão a forma da amostra original. Todavia, os resultados obtidos utilizando o aparelho são muito similares à forma física real da amostra, a única diferença face às secções físicas sendo a menor resolução. Uma vez que os dados gerados pelo aparelho são genuinamente tridimensionais, eles podem ser novamente seccionados virtualmente com qualquer orientação, ou apresentados em três dimensões.

Uma construção modificada do suporte giratório está ilustrada na Figura 9 onde as partes correspondendo às da Figura 1 têm o mesmo número de referência. No suporte giratório da Figura 9, o ajuste tridimensional da posição do motor passo a passo 42 é conseguido através da utilização de três motores de passo 150, 152, 154 secundários. Não está presente qualquer 19 regulador da inclinação para o motor 42. Em vez disto, um prisma é capaz de ser ajustado mutuamente através da inclinação controlada em torno de um eixo 23 horizontal transversal. Os motores de passo importantes são os motores 150 e 154. O motor 152 pode ser substituído por um regulador 40 vertical manual.

Os motores 150, 152, 154 passo a passo secundários permitem um ajuste mais preciso, abaixo dos micrones, da posição tridimensional do motor 42 passo a passo primário, ao longo das orientações indicadas por x, y e z. Estes motores 150, 152, 154 passo a passo são controlados pelo mesmo computador que controla o motor 42 primário. Esta situação está ilustrada na Figura 10 na qual o computador 50 comanda os quatro motores através de circuitos 156 de comando de motores. Para os propósitos deste documento, o eixo z é considerado paralelo ao eixo 29 óptico. Os movimentos ao longo deste eixo alteram, efectivamente, o foco do sistema. Os movimentos ao longo dos outros dois eixos alteram a parte da amostra que coincide com o centro do eixo 29 óptico. A translação controlada por computador pelos três motores 150, 152, 154 passo a passo secundários tem as seguintes vantagens: 1) permite que a região de interesse (ROI) da amostra seja mantida no centro, dentro do campo de visão do microscópio. Esta situação é conseguida de duas maneiras: (a) a ROI é mantida dentro da profundidade de foco do microscópio; (b) limita os movimentos oscilatórios "de um lado para outro" da ROI ao longo do eixo x. 20

Estas duas vantagens permitem uma obtenção de imagens com uma resolução muito maior quando comparada com um sistema que não tenha um mecanismo deste tipo. 2) ele é mais preciso que o sistema de alavanca e dente das Figuras 1 e 8. 3) ele pode ser totalmente controlado pelo computador (contrariamente ao sistema de alavanca e dente) por isso a ROI pode ser facilmente definida "no ecrã" através do software. 4) ele permite ao computador calcular com precisão as coordenadas tridimensionais para a ROI. 5) ele permite que diferentes passagens de leitura dentro da mesma amostra sejam relacionadas entre si no espaço tridimensional. 6) esta situação permite ao computador construir uma imagem digitalizada de alta resolução de uma amostra grande a partir de múltiplas passagens de leitura automáticas de regiões mais pequenas tendo uma maior ampliação (conhecido por "sobreposição" ou "reparação").

Os movimentos x e z controlados por computador para manter a ROI dentro do campo de visão são calculados da seguinte maneira:

Em primeiro lugar, o software necessita de calcular as seguintes posições: 21 (a) eixo de rotação do motor passo a passo 42 primeiro relativamente ao campo de visão. (b) da ROI relativamente ao eixo de rotação do motor passo a passo primário.

Estas duas posições podem ser calculadas numa operação. A ampliação é definida suficientemente baixa para que durante uma rotação completa a ROI fique no campo de visão da câmara. 0 sistema é previamente calibrado para que seja conhecido o número de impulsos enviados ao motor passo a passo x que corresponde a uma dada deslocação medida em pixeis no ecrã do computador. Esta relação é determinada em cada ampliação. 0 computador apresenta então ao utilizador quatro imagens da amostra, giradas em 0, 90, 180 e 270 graus (conforme mostrado nas Figuras 11a a 11c). Na Figura 11a, cada rectângulo exterior representa a janela de obtenção de imagens no ecrã do computador e o ponto representa a região 122 de interesse da amostra. A Figura 11b mostra vistas ao longo do eixo óptico (conforme observado no ecrã do computador) para uma ampliação baixa, e a Figura 11c mostra vistas em planta ao longo do eixo 94 de rotação. O utilizador utiliza então o rato do computador (ou equivalente) para indicar a ROI em cada imagem. A Figura 12 mostra como o sistema de posicionamento pode deslocar o motor passo a passo 42 em ambas as dimensões x e z e, consequentemente, pode compensar quando a ROI sai do centro. Os movimentos de x e z do motor 42 são controlados pelo computador para assegurar que a ROI 122 permanece numa posição fixa, girando em torno de um eixo de rotação efectivo. 22

Nas Figuras 11a, 11b e 11c: χΐ = a posição x da ROI a 0 graus, convertida em unidades do motor passo a passo. χ2 = a posição x da ROI a 180 graus, convertida em unidades do motor passo a passo. ;}fw = a largura da janela de obtenção de imagens, convertida em unidades do motor passo a passo.

A média de χΐ e χ2 proporciona a posição (%s) do eixo de rotação do motor passo a passo relativamente à janela iXs) de obtenção de imagens. A média de Zl e Z2 proporciona uma segunda estimativa desta posição (χε = (χΐ + χ2 + Zl + Z2)/4). A deslocação em x que seria necessária para centrar o eixo de rotação do motor passo a passo dentro da janela de obtenção de imagens é: deslocação em X (Jd) = jjfw/2 - (χΐ + χ2 + Zl + Z2)/4

Esta situação está ilustrada nas Figuras 13a e 13b.

Nas Figuras 13a e 13b, o microscópio observa a amostra a partir da parte inferior do desenho. Consequentemente, as arestas do campo de visão aparecem como duas linhas substancialmente paralelas que indicam os limites daquilo que pode ser observado. O eixo óptico, que é o centro deste campo de visão, está mostrado como uma linha tracejada vertical na Figura 13a. A Figura 13b apresenta a amostra numa posição giratória de 0 grau (a=0). Das medições descritas na página anterior 23 (χΐ, χ2, Zl, Ζ2), as distâncias χ e ζ da região de interesse em relação ao eixo de rotação do motor passo a passo primário podem ser facilmente calculadas, χαο é a distância x quando a posição giratório (ângulo a) é zero (χαο = (χΐ - χ2)/2). De uma maneira similar, Zao pode ser calculado a partir das duas medições obtidas com α = 90 graus e α = 270 graus, (Zao = (Zl - Z2)/2). A posição da região de interesse pode então ser convertida das coordenadas cartesianas para coordenadas polares onde D é a distância entre a ROI e o eixo do motor passo a passo, e α é o ângulo daquela linha com o eixo óptico (ou uma linha paralela a ela), quando α = 0 graus. D = raiz quadrada de {χαο2 + Ζαο2) Θ = tan-1 (χαο/Ζαο)

Agora, para qualquer posição giratória (a) do motor passo a passo primário a região de interesse pode ser posicionada no eixo óptico através de movimentos dos motores de passo secundários x z, em que as deslocações totais (Xt e Zt) são calculadas por: = χό. + D.sin(a + Θ), e zt = D.cos(a + Θ) . A forma tridimensional da região amostrada a partir de uma reconstrução de OPT é substancialmente um cilindro com uma secção transversal circular, cujo eixo de simetria giratória é o efectivo eixo de rotação utilizado durante a obtenção de imagens, e cujo diâmetro e comprimento estão descritos pela largura e altura do campo de visão. Uma vez que se pode alternar entre as coordenadas cartesianas e polares para descrever as posições dentro da amostra, e se pode relacionar as dimensões dos pixeis às distâncias reais dentro da amostra, pode-se 24 facilmente calcular a posição e a forma do cilindro amostrado relativamente a qualquer das outras passagens de leitura feitas da mesma amostra.

Na obtenção de imagens bidimensionais, uma imagem de alta resolução é frequentemente construída reunindo muitas imagens de grande ampliação de pequenas regiões do objecto, e depois juntando as imagens mais pequenas. Este procedimento é frequentemente conhecido por "sobreposição" ou "reparação". 0 suporte XYZ controlado por computador permite que a mesma abordagem seja aplicada à obtenção de imagens de OPT tridimensionais.

Conforme acima descrito, a região amostrada de uma passagem de leitura de OPT é um cilindro com uma secção transversal circular. A Figura 14 ilustra, numa vista de planta olhando para baixo ao longo do eixo 94, como pode ser obtida a imagem de uma amostra 160 numa passagem de leitura 162 com baixa resolução ou, de um modo alternativo, pode ser obtida a imagem através do posicionamento de sete passagens de leitura 170 de alta resolução para que cada posição na amostra fique contida em, pelo menos, uma região de amostragem. Uma vez que as regiões individuais de amostragem têm uma secção transversal circular, uma disposição eficiente de cobertura de uma grande região é a de dispor as passagens de leitura num padrão hexagonal, com uma ligeira sobreposição entre as passagens de leitura adjacentes. Diferentes posições ao longo do eixo y da amostra podem também ser amostradas utilizando o motor passo a passo do eixo y.

Este processo de sobreposição pode ser completamente controlado e realizado pelo computador. 25

Para todas as amostras cuja imagem se pretende obter na sua totalidade com uma passagem de leitura, o cálculo da posição da região óptima amostrada pode ser realizado automaticamente sem a necessidade de o utilizador ter de identificar a ROI conforme acima descrito. 0 simples processamento de imagens pode encontrar o rebordo ou o centro da amostra dentro das imagens de teste durante o processo de alinhamento, conforme se segue: 1) regular a ampliação para o nivel baixo (pode ser realizado automaticamente utilizando um microscópio controlado por computador). 2) tirar quatro imagens com uma rotação de 0, 90, 180 e 270 graus. 3) calcular o histograma de cada imagem para determinar um nivel de valor limiar adequado para distinguir a amostra do fundo. 4) calcular a posição do centro de massa da amostra em cada imagem. 5) utilizar estas posições como medições da ROI conforme acima descrito. 6) aplicar as novas deslocações durante qualquer subsequente rotação. 7) aumentar a ampliação. 26 8) tirar quatro imagens giradas e determinar se a ampliação está alta demais (i. e. se as arestas da amostra estão fora do campo de visão). 9) se a amostra ainda estiver dentro do campo de visão, voltar ao passo 4. 10) se as arestas da amostra estiverem fora do campo de visão, reduzir a ampliação até ao valor anterior. 11) fazer a passagem de leitura da amostra.

As Figuras 15 e 16 mostram os meios de iluminação colimada que podem ser utilizados no suporte giratório da Figura 1 ou da Figura 9.

Uma laser ou outra fonte 172 de luz é utilizada juntamente com meios de focagem (lentes 174 refractivas ou espelhos reflectores) para gerar um feixe de luz 176 em que dos os raios de luz estão substancialmente paralelos ao eixo óptico. A Figura 15 ilustra este dispositivo em relação à restante parte do suporte giratório que, neste exemplo, tem dois motores de passo 150, 154 para o ajuste controlado por computador respectivamente, nas direcções x e z. O ajuste vertical é realizado manualmente através do regulador 40 vertical. A lente 22 é capaz de ajustar a inclinação em torno do eixo 23.

Os resultados das experiências realizadas demonstraram claramente que a luz de iluminação que entra na amostra vinda de uma direcção que não está paralela com o eixo óptico introduz ruído nos resultados. Uma fonte de luz colimada, em que todos os raios de luz de iluminação estão paralelos ao eixo óptico, reduz 27 este problema e, consequentemente, aumenta a qualidade da obtenção de imagens.

Fazendo referência à Figura 17, um filtro 178 de comprimento de onda é colocado numa dada posição entre a fonte 180 de luz e a amostra 28. Esta situação pode ser constituída por uma série de diferentes filtros, cada um a permitir a transmissão de diferentes extensões de comprimentos de onda, que podem ser posicionados manual ou automaticamente na trajectória da luz. Ou ela pode ser um filtro regulável electronicamente.

De um modo alternativo, podem ser utilizados dois filtros de cristal líquido reguláveis electronicamente para fazer a obtenção de imagens por fluorescência para restringir os comprimentos de onda quer da luz de iluminação, quer da luz detectada, estando esta possibilidade ilustrada pelo segundo filtro 182 controlado electricamente colocado à frente de uma matriz bidimensional de detectores 184 de luz.

Um dado químico irá absorver diferentes comprimentos de onda com graus variáveis de eficiência. Estas diferenças podem ser representadas como um espectro (que descreve a absorção para uma grande extensão de comprimentos de onda). A maioria das amostras é constituída por perturbações espaciais variáveis de diferentes químicos e, consequentemente, a utilização de diferentes comprimentos de onda (ou combinações de comprimentos de onda) permite a obtenção optimizada de imagens de diferentes amostras. O sistema de filtros descrito permite ao utilizador alterar os comprimentos de onda que são utilizadas na obtenção de imagens de uma dada amostra. 28

De um modo similar, os químicos fluorescentes possuem um espectro que descreve a eficiência com que os diferentes comprimentos de onda os excitam, e um segundo espectro que descreve a abundância de diferentes comprimentos de onda emitidos na fluorescência. A utilização de dois filtros controlados electronicamente produz (pelo menos) um espaço de parâmetros bidimensional para as possíveis combinações de excitação e emissão. Um sistema deste tipo permite a exploração de combinações optimizadas para distinguir entre os diferentes químicos. Esta situação permite a obtenção de imagens da histologia tridimensional de amostras biomédicas sem a necessidade de utilizar mancheamentos específicos.

Será apreciado que um suporte giratório não necessita de incluir um prisma 22, nem o suporte giratório necessita de ser utilizado com um microscópio vertical comum. A Figura 18 ilustra uma modificação à disposição da Figura 15. Na Figura 18 (onde as partes correspondendo à das Figura 15 têm o mesmo número de referência), a luz emanada da câmara 26 entra na objectiva do microscópio e numa câmara digital, proporcionando uma distância de trabalho curta entre a objectiva 30 do microscópio e a amostra. A amostra pode ser posicionada através da utilização de um suporte de translação transportado pelo veio 44. o suporte de translação tem um ajuste manual ou controlado por computador nas direcções x e z.

Lisboa, 30 de Novembro de 2007 29

Claims (12)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Aparelho de tomografia com projecção óptica (OPT) incluindo um suporte (10) giratório e uma câmara de obtenção de imagens para utilização na obtenção de imagens de uma amostra a partir de uma pluralidade de direcções, compreendendo o suporte giratório meios de suporte da amostra incluindo um elemento (44) giratório que serve para girar uma amostra cuja imagem se pretende obter em torno de um eixo (94) de rotação transversal em relação a um eixo (29) óptico ao longo do qual é emitida luz vinda da amostra, caracterizado por: (a) o eixo (94) de rotação ser vertical ou substancialmente vertical; (b) os meios de suporte da amostra estarem dispostos em cima da câmara (26) da obtenção de imagens para receber a amostra imersa num fluido óptico para obtenção de imagens dentro da câmara; e (c) a câmara de obtenção de imagens ser estacionária.
2. 2. Aparelho de OPT de acordo com a reivindicação 1, em que a câmara (26) de obtenção de imagens tem, pelo menos, uma face plana que é perpendicular ao eixo óptico.
3. 3. Aparelho de OPT de acordo com a reivindicação 1 ou 2 e incluindo um prisma (22) posicionado no eixo (29) óptico de modo a receber luz emitida pela amostra, actuando o prisma (22) para deflectir a luz em 90° para permitir que a luz seja recebida por um microscópio (12) com um eixo óptico vertical. 1
4. 4. Aparelho de OPT de acordo com a reivindicação 3, em que o prisma (22) é ajustável em termos posicionais sobre um eixo horizontal perpendicular ao eixo (29) óptico que também é horizontal.
5. 5. Aparelho de OPT de acordo com qualquer das reivindicações anteriores, em que o elemento (44) giratório é ajustável em termos posicionais para ajustar o eixo de rotação em torno de um eixo (90) de ajuste horizontal perpendicular ao eixo (29) óptico.
6. 6. Aparelho de OPT de acordo com a reivindicação 5, em que o eixo (90) de ajuste horizontal está por baixo da extremidade inferior do elemento (44) giratório para assegurar que qualquer ajuste horizontal provoque uma translação minima da amostra.
7. 7. Aparelho de OPT de acordo com qualquer das reivindicações anteriores, em que o elemento (44) giratório é ajustável através da translação ao longo de uma direcção alinhada com o eixo (94) de rotação, para permitir que os meios de suporte da amostra sejam deslocados entre uma posição operacional mais baixa e uma posição inoperacional mais acima, nas quais a amostra pode ser inserida ou removida do suporte giratório.
8. 8. Aparelho de OPT de acordo com qualquer das reivindicações anteriores, em que o elemento (44) giratório é o veio giratório de um motor (42) passo a passo montado numa plataforma (34) cuja posição é ajustável. 2
9. 9. Aparelho de OPT de acordo com qualquer das reivindicações anteriores, em que a extremidade inferior do elemento (44) giratório é formada para permitir que a amostra fique pendurada ou suspensa, ou a pender para baixo a partir da extremidade inferior do elemento giratório.
10. 10. Aparelho de OPT de acordo com qualquer das reivindicações anteriores e incluindo uma fonte de luz colimada para produzir um feixe de luz no qual todos os raios de luz estão substancialmente paralelos ao eixo óptico e que, em utilização, ilumina a amostra.
11. 11. Aparelho de OPT de acordo com qualquer das reivindicações anteriores e incluindo um filtro de comprimentos de onda para restringir o comprimento de onda da luz que ilumina a amostra.
12. 12. Aparelho de OPT de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 10 e incluindo dois filtros de comprimentos de onda, nomeadamente um primeiro filtro para restringir o comprimento de onda da luz que ilumina a amostra e um segundo filtro para restringir o comprimento de onda da luz que emana da amostra e antes de ser detectada. Lisboa, 30 de Novembro de 2007 3