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Bereich der Erfindung
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Diese
Erfindung betrifft eine Vorrichtung zur optischen Projektionstomografie
mit einem drehbaren Probenhalter zur Abbildung einer Probe.
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Hintergrund der Erfindung
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Optische
Abbildungsvorrichtungen zur Erzeugung dreidimensionaler Abbildungen
von Proben durch optische Projektionstomografie sind bekannt, siehe
zum Beispiel
US-Patent Nr. 5,680,484 .
Die in diesem Patent nach dem Stand der Technik offenbarte optische
Vorrichtung erstellt eine Serie von digitalen Abbildungen einer
Probe aus unterschiedlichen Winkeln. Diese Abbildungen werden in
einen Algorithmus eingegeben, welcher eine mathematische Transformation
zur Rekonstruktion einer dreidimensionalen Abbildung benutzt. In
US 5,680,484 wird die Probe
innerhalb eines transparenten Rohres gehalten, welches an zwei Punkten
getragen wird, so dass es im Wesentlichen horizontal ist, und das
Rohr wird unter Verwendung eines Schrittmotors und eines Antriebsriemens
gedreht, damit unterschiedliche Abschnitte der Probe abgebildet
werden. Lichtbrechung durch das Rohr beeinflusst eine Signalqualität und eine
Verwendung des Rohres stellt eine starke Beschränkung der maximalen Probengröße dar,
welche abgebildet werden kann. Die in diesem Patent nach dem Stand
der Technik offenbarte Vorrichtung weist verschiedene Einschränkungen
auf, welche die Verwendungsmöglichkeiten
dieser Abbildungstechnik beeinflussen, insbesondere ist es schwierig,
die Probe in das hohle zylindrische Rohr einzuführen, und schwierig, die Position
der Probe einzustellen.
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M.
Almqvist et al. offenbart in „Ultrasonics" vol. 37 (1999),
Seiten 343–353
ein Licht-Diffraktions-Tomografiemesssystem zur Durchführung von Messungen
mit hoher räumlicher
Auflösung
von Ultraschall mit kontinuierlicher Welle.
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US-Patent 5710625 offenbart
einen drehbaren Halter zur Halterung und Positionierung einer Probe
zum Zweck einer Spektralanalyse der Probe.
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Zusammenfassung der Erfindung
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In Übereinstimmung
mit der vorliegenden Erfindung wird eine Vorrichtung zur optischen
Projektionstomografie (OPT) gemäß Anspruch
1 bereitgestellt. Sie weist einen drehbaren Probenhalter mit einem
Probenhaltemittel, das ein drehbares Glied aufweist, welches dazu
dient, eine abzubildende Probe um eine Drehachse quer zu einer optischen
Achse zu drehen, entlang welcher Licht von der Probe emittiert wird,
dadurch gekennzeichnet, dass die Drehachse vertikal oder im Wesentlichen
vertikal ist, das Probenhaltemittel über einer Abbildungskammer
zur Aufnahme der Probe angeordnet ist, die in optischem Abbildungsfluid
innerhalb der Kammer eingetaucht ist, und die Abbildungskammer stationär ist.
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Der
OPT-Scanner kann ein separates Mikroskop und damit verbundene Hardware
und Software aufweisen, welche ein dreidimensionales Abbilden einer
Probe, wie zum Beispiel ein biologisches Gewebe, ermöglichen.
Dadurch, dass das Probenhaltemittel von dem Mikroskop in einem Abstand
angeordnet ist, kann die Positionierung der Probe auf Grund verbesserter
Erreichbarkeit des Probenhalters leichter eingestellt bzw. justiert
werden. Bei einer länglichen
Probe liegt die längste
Achse der Probe im Wesentlichen parallel zur Schwerkraft, wenn sie
innerhalb des Probenhaltemittels gehalten ist. Dies ermöglicht es,
dass die Probe nur in einem Punkt gehalten wird, wobei eine erneute
Unterstützung
durch eine Anordnung der Probe innerhalb des Probenhaltemittels
vorliegt, und vermeidet eine Durchbiegung der Probe durch Schwerkrafteinflüsse, da
eine derartige Durchbiegung einen unerwünschten Verzug der Probengestalt
bewirken kann und die Genauigkeit und Auflösung der erhaltenen Abbildung
beeinflusst.
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Das
Vorhandensein einer stationären
Kammer, die von dem drehbaren Teil des Probenhalters getrennt ist,
ist die Kammerform nicht auf eine rotationssymmetrische Gestalt
begrenzt. Die Kammer weist vorzugsweise eine plane Seite auf, auf
welche Licht zum Abbilden der Probe auftrifft. Eine Verwendung einer
flachen planen Seite ohne Mängel
und Welligkeiten gewährleistet,
dass eine Abbildungsverzerrung auf Grund einer Lichtbrechung verringert
ist. Die Kammer kann als transparenter hohler Würfel geformt und so angeordnet
sein, dass zwei gegenüber liegende
Seiten des Quaders im Wesentlichen senkrecht zu der optischen Achse
liegen, längs
welcher Licht von der Probe so ausgesendet wird, dass der optischen
Achse eine große
Querschnittsfläche
dargestellt wird. Die Auswahl einer derartigen Kammer mit einem
quadratischen Querschnitt stellt sicher, dass die Lichtmenge, welche
vor einem Durchlaufen der Probe gebrochen wird, gegenüber zylindrischen drehbaren
Kammern des Standes der Technik im Wesentlichen verringert ist,
und die Abbildungsqualität
somit verbessert ist. Eine Wand oder Seite der Kammer kann so gestaltet
sein, dass sie Licht auf eine gewollte Art und Weise bricht, zum
Beispiel um einen Vergrößerungseffekt
zu schaffen.
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Der
drehbare Probenhalter kann weiterhin eine schwenkbar angebrachte
Einstelleinrichtung aufweisen, wie zum Beispiel einen Hebel mit
einem davon hervorstehenden Zapfen, wobei der Zapfen bei Gebrauch
so angeordnet ist, dass er mit einer Probe in Eingriff kommt, um
ihre Position relativ zu der Drehachse zu ändern.
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Der
drehbare Probenhalter kann weiterhin ein Prisma aufweisen, welches
so positioniert ist, dass es Licht empfangt, nachdem das letztere
die Probe beleuchtet hat, wobei das Prisma so wirkt, dass es Licht
um 90° ablenkt,
um zu ermöglichen, dass
das Licht von einem Mikroskop mit einer vertikalen optischen Achse
empfangen wird. Durch Verwendung eines Prismas ist es nicht notwendig,
dass der optische Pfad zu dem Mikroskop geradlinig verläuft, und
somit ist eine Modifizierung von vorhandenen Mikroskopen für einen
Gebrauch mit einem drehbaren Probenhalter in Übereinstimmung mit der vorliegenden
Erfindung nicht nötig.
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Der
drehbare Probenhalter des Probenhaltemittels kann auf einer einstellbaren
Plattform getragen werden, deren Position relativ zu der Horizontalen
variabel ist. Dies gestattet es, dass die Drehachse relativ zu einer
optischen Achse so justierbar ist, dass ein 90°-Winkel – falls gewünscht – zwischen der optischen Achse
und der Drehachse eingestellt ist. Dies ist insbesondere für dreidimensionales
Abbilden nützlich.
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Die
einstellbare Plattform ist vorzugsweise vertikal so einstellbar,
dass das drehbare Glied relativ zu der optischen Achse angehoben
und abgesenkt werden kann, wobei es auf diese Weise ermöglicht wird,
dass eine Probe in einen optischen Lichtpfad hinein oder aus ihm
heraus abgesenkt werden kann.
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Vorzugsweise
ist das drehbare Glied so geformt, dass die Probe von dem unteren
Ende des drehbaren Glieds hängen
oder schweben oder nach unten herunterhängen kann. Wenn eine Probe
in geeigneter Weise mit einem magnetisierbaren Halter vorbereitet
worden ist, dann ist eine Anbringung der Probe an das Probenhaltemittel
unkompliziert, was nur auf magnetischer Anziehungskraft und nicht
auf einer empfindlichen Befestigung beruht. Dies ist von Vorteil,
da die Proben typischerweise eher klein und empfindlich sind und üblicherweise
einen Durchmesser in dem Bereich von 1 bis 20 mm aufweisen, und ein
ihre Befestigung in einem Halter mit einem Schraubengewinde kompliziert
sein kann.
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Kurze Beschreibung der Zeichnungen
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Die
Erfindung wird nun beispielhaft mit Bezugnahme auf die begleitenden
Zeichnungen beschrieben, von denen
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1 eine
perspektivische Ansicht einer optischen Abbildungsvorrichtung ist,
welche eine bevorzugte Ausführung
der Erfindung bildet und einen drehbaren Probenhalter zusammen mit
einem Mikroskop aufweist;
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2 eine
schematische Darstellung ist, wie eine solche Abbildungsvorrichtung
beim Erfassen von digitalen Abbildungen gesteuert wird;
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3 eine
perspektivische Vorderansicht der Vorrichtung ist;
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4(a) und 4(b) schematische
Diagramme sind, welche zur Illustration der am besten geeigneten
Arbeitskonfiguration der Vorrichtung dienen;
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5(a), 5(b), 5(c) und (5d) eine Anbringung
einer Probe an dem Probenhaltemittel und eine Ausrichtung eines
interessierenden Bereiches illustrieren;
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6(a), 6(b) und (6c) schematische Diagramme zur Erläuterung
einer Auflösung
der Vorrichtung sind;
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7(a) einen Querschnitt durch ein Rohr nach dem
Stand der Technik zeigt, welches eine Probe beinhaltet, wobei
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7(b) und 7(c) zwei
Probenkammern darstellen, die in der vorliegenden Erfindung verwendet
werden;
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8(a) und 8(b) eine
Teildraufsicht längs
Linie VIII-VIII nach 1 ist, wobei eine Verwendung
eines schwenkbar angebrachten Hebels zur Einstellung einer Probenposition
illustriert wird;
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9 eine
perspektivische Ansicht einer modifizierten optischen Vorrichtung
gemäß der Erfindung
ist;
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10 ein
Diagramm zur Illustration der Vorrichtung nach 9 zeigt;
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11a, 11b, 11c, 12a, 12b, 13a, 13b und 14 ein
Positionieren und Betrachten der Probenabbildung in der Vorrichtung nach 9 illustrieren;
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15 und 16 eine
kollimierte bzw. parallel ausgerichtete Beleuchtungseinrichtung
illustrieren, welche in der Vorrichtung nach 1 oder 9 benutzt
werden kann;
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17 eine
Art und Weise einer Auswahl einer Wellenlänge von einer Lichtquelle in
der optischen Stufe von 1 oder 9 angibt;
und
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18 eine
Modifizierung der in 16 gezeigten Vorrichtung illustriert.
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Detaillierte Beschreibung
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1 zeigt
eine optische Abbildungsvorrichtung in der Gestalt eines OPT-Scanners
bzw. -Abtasters, welcher einen drehbaren Probenhalter 10 und ein
Mikroskop mit großer
Reichweite oder ein Präpariermikroskop 12 getrennt
von dem drehbaren Probenhalter 10 aufweist. Der drehbare
Probenhalter 10 besitzt einen Träger 14, einen schwenkbar
angebrachten Hebel 16, eine Irisblende und einen optischen
Diffusor 20, und ein Quarzprisma 22. Der Träger 14,
die Irisblende und Diffusor 20 und das Prisma 22 sind
an einer Basis 24 des Probenhalters 10 befestigt,
ebenso wie ein Halter 25 zur Aufnahme einer transparenten
Kammer 26 oder Küvette
einer im Allgemeinen quader- oder
würfelförmigen Gestalt.
Die Küvette 26 beinhaltet
ein Fluid mit geeigneten optischen Eigenschaften zur Abbildung einer
Probe 28, welche innerhalb der Küvette aufgehängt ist,
wobei ein geeignetes Fluid eine Mischung aus Benzylalkohol und Benzylbenzoat
ist. Diese Vorrichtung kann zur Hellfeld-, Dunkelfeld- und Fluoreszenzabbildung verwendet
werden, aber ist insbesondere dort geeignet, wo eine dreidimensionale
(3D-)Abbildung der Probe aus einer Serie von in unterschiedlichen
Winkeln aufgenommenen Abbildungen erzeugt wird, und für Proben,
die zu groß sind,
um von konfokaler Mikroskopie abgebildet zu werden.
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Licht
breitet sich längs
einer optischen Achse 29 aus, läuft durch das Zentrum der Irisblende
und des Diffusors 20 und durch die Probe 28 und
wird in rechten Winkeln von dem Prisma 22 abgelenkt, um
in ein Objektiv 30 des Mikroskops einzufallen. Da das Mikroskop
eine große
Reichweite besitzt, ist genug Raum für das Prisma 22 vorhan den,
um unterhalb des Mikroskopobjektivs 30 zu verbleiben. Eine
Verwendung eines Prismas gestattet es, ein vertikal orientiertes
Mikroskop zur Abbildung der Probe zu benutzen. Das Prisma 22 kann
jedoch entfallen, wenn das Mikroskopobjektiv parallel zur optischen
Achse angeordnet ist. Die Irisblende und der Diffusor 20 steuern
die Lichtmenge, welche sie von einer Lichtquelle (nicht dargestellt)
durchläuft,
um die Probe 28 zu erreichen und eine gleichmäßige Beleuchtung
zu schaffen.
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Der
Träger 14 trägt eine
kreisförmige
Nabe, auf welcher eine geneigte Platte 33 um eine Achse 90 (siehe 4) schwenkbar angebracht ist, wobei auf
der geneigten Platte eine aufwärts
und abwärts verschiebbare
Platte 32 montiert ist. Die Platte 32 trägt eine
einstellbare Plattform 34, welche horizontal von der Platte 32 freitragend
hervorsteht. Der Winkel der Plattform 34 kann relativ zu
der Horizontalen unter Verwendung einer Neigungseinstellung 36 verändert werden,
und die vertikale Position der Plattform 34 kann mittels
einer Vertikaleinstellung 40 variiert werden. Ein Schrittmotor 42 ist
auf der Plattform 34 befestigt, wobei sich eine drehbare
Motorwelle 44 des Motors durch die Plattform 34 hindurch
erstreckt. Ein Magnet 46 (ein Permanentmagnet oder ein
Elektromagnet) ist an dem unteren Ende der Welle 44 angebracht
und trägt
die abzubildende Probe 28. Die Art und Weise, auf welche
die Probe an dem Magneten angebracht ist, wird später mit
Bezugnahme auf 5 beschrieben. Der
Schrittmotor 42 dreht die Welle 44 mit einer Schrittweite
von 0,9 Grad, wobei bis zu 400 Abbildungspositionen der Probe vorgesehen
werden. Eine Serie von digitalen Bildern der länglichen Probe 28 wird
aufgenommen, indem die Welle 44 auf ihre aufeinander folgenden
Drehpositionen indexiert wird, und wobei so ein Positionieren der Probe
in aufeinander folgenden Drehpositionen erfolgt, während die
Probe innerhalb der Küvette 26 aufgehängt ist,
bleibt die Küvette
feststehend.
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Durch
eine Befestigung des Schrittmotors 42 mit seiner Drehachse
in vertikaler Lage, muss die stabartige Probe 28 nur an
einem Punkt gesichert werden, typischerweise an ihrem obersten Ende,
damit ein gesteuerte Rotation der Probe auftritt. Die Probe 28 wird
in die Flüssigkeit
eingetaucht, wobei sie von oben durch den Magnet 46 getragen
wird, indem die Vertikaleinstellung 40 zur Absenkung der Plattform
benutzt wird. Diese vertikale Ausrichtung der Probe und die Drehachse
vermeiden den Gebrauch von O-Ringen oder anderen mechanischen Anordnungen,
welche notwendig würden,
um den trockenen Motor mit der eingetauchten Probe zu verbinden,
und die gewähr leistet
zweitens, dass die Probe nicht aus ihrer Drehachse durch Schwerkraft
ausgelenkt wird, da die Hauptachse der länglichen Probe parallel zur
Schwerkraft verläuft.
Eine Vermeidung von Verzugsauswirkungen auf die Probe, indem eine vertikal
ausgerichtete Probe vorliegt, ist besonders wichtig zur Erlangung
von exakten 3D-Abbildungen, insbesondere
für größere Proben.
Eine Verwendung eines im Allgemeinen aufrechten hohlen Quaders als Abbildungskammer 26 um
die Probe 28 herum gewährleistet,
dass der Oberflächenbereich
der Abbildungsflüssigkeit
begrenzt ist, wobei eine Verdunstung der Flüssigkeit reduziert wird. Zusätzlich können viel
größere Proben,
typischerweise 1 bis 20 mm im Durchmesser, ohne Verlust an digitaler
Signalqualität abgebildet
werden, indem eine solche befestigte Kammer benutzt wird.
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Bei
Betrieb ist eine Digitalkamera
52 (
2) an dem
Mikroskop
12 angebracht und erzeugt eine digitale Abbildung
der Probe, wie sie von dem Mikroskop von dem Licht abgebildet wird,
das sich längs der
optischen Achse
29 ausgebreitet hat und durch die Kammer
und Probe übertragen
worden ist. Eine Serie von digitalen Abbildungen wird von der Probe
in unterschiedlichen Winkeln aufgenommen, und diese digitalen Daten
werden in einen Algorithmus eingegeben, welcher eine mathematische
Formel benutzt, um den Aufbau bzw. die Struktur der Probe in drei
Dimensionen zu rekonstruieren. Typischerweise werden die Abbildungen
erhalten, indem die Steuerelemente wie in
2 aufgebaut
verwendet werden. So steht ein Computer
50 mit einer Software
zur Erfassung von digitalen Abbildungen in einer Zweiwegekommunikation
mit der Digitalkamera
52 in Verbindung, die an dem Mikroskop
12 angebracht
ist, welches Abbildungen von einer interessierenden Probe empfängt. Der
Computer
50 steuert Filterrevolver
56, die an
dem Mikroskop
12 angebracht sind, um die Wellenlänge einer
Strahlung zu verändern,
die erfasst wird. Die Computer-Erfassungssoftware ist in
2 schematisch
als Software
58 dargestellt, um eine Abbildungsaufnahme
von der Digitalkamera zu steuern, ein Programm
54 zur Steuerung
der Abbildungssoftware, des drehbaren Probenhalters und der Filterrevolversoftware,
Software
48 zur Steuerung der Filterrevolver und Software
64 zur
Umwandlung der Abbildungsdateien in eine 3D-Rekonstruktion. Der
Computer steht auch in einer Zweiwegekommunikation mit elektronischen
Steuerschaltungen
60, die mit dem drehbaren Probenhalter
10 verbunden sind,
und steuert die Schaltungen
60 zur Justierung der Ausrichtung
der Probe, wie es während
der Abbildungsaufnahme von aufeinanderfolgenden Abbildungen erforderlich
ist. Sobald die digitalen Abbildungen erlangt worden sind, werden
sie unter
64 verarbeitet, um eine 3D-Rekonstruktion
66 der
Probe unter Verwendung mathematischer Bearbeitung in einer ähnlichen
in
US 5,680,484 beschriebenen
Art und Weise zu erzeugen.
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Falls
erforderlich, kann der Computer den gesamten Abbildungsprozess steuern,
wobei er eine Abbildungsverarbeitung vornimmt, um die Größe der Probe,
ihre Ausrichtung, ob sie im Brennpunkt liegt, usw. zu bestimmen,
und die Position der Probe vor einer Durchführung der Rotationsabbildung
einstellt. Diese vollständige
Automatisierung des Abbildungsprozesses ist insbesondere für Large-Scale-Gene-Expression-Mapping- bzw. umfangreiche
Genatlasprojekte wünschenswert,
bei welchen viele solcher Vorrichtungen parallel arbeiten können.
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Die
Schaltung 60, welche auf den Computer anspricht, um den
Schrittmotor 42 zu steuern, ist im Handel für die meisten
Personalcomputersysteme erhältlich.
Die Schaltung 60 ist an den Computer 50 angeschlossen
und spricht auf Signale von dem Computer 50 an, um eine
Vielfalt von mechanischen Vorrichtungen (Schrittmotoren, Elektromagnete
usw.) zu steuern.
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Zur
Erzeugung einer 3D-Rekonstruktion der Probe führt die Software die folgenden
Funktionen aus: (1) Festlegen der Drehachse (durch die Symmetrie,
welche zwischen jedem Paar von Abbildungen vorhanden ist, die um
180 Grad zueinander aufgenommen wurden), (2) Umorganisieren des
Stapels von Abbildungen in einen orthogonalen Stapel von Projektionsabbildungen
(in welchen eine Abbildung einen einzelnen Schnitt durch die Probe
darstellt, von allen den unterschiedlichen aufgenommenen Winkeln
aus betrachtet), (3) Durchführen
der mathematischen Bearbeitung mit jeder Projektionsabbildung, um
den Schnitt durch die Probe erneut zu erzeugen, (4) Kombinieren
aller berechneten Schnittabbildungen in ein 3D-Format. Rekonstruktionen
können
sowohl von übertragenem
Licht als auch von durch Fluoreszenz emittiertem Licht erzeugt werden.
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Nachdem
nun die allgemeine Vorrichtung und ihre Verwendung zur Datenerfassung
beschrieben worden ist, werden bestimmte Komponenten der Abbildungsvorrichtung
ausführlicher
erläutert.
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Eine
Vorderansicht des drehbaren Probenhalters 10 ist in 3 dargestellt.
Der Neigungseinsteller 36 variiert den Neigungswinkel der
Plattform 34 um die Achse 90, welche unter dem
unteren Ende der Welle 44 liegt und ungefähr auf der
Höhe der
Probe angeordnet ist, so dass eine Neigungseinstellung die Probe
im Wesentlichen nicht bewegt. Die Achse 90 kann die optische
Achse 29 schneiden. Eine Neigungseinstellung (illustriert
durch den doppelköpfigen
Pfeil 92 in 3) gewährleistet, dass die Drehachse 94 des
Schrittmotors 42 genau senkrecht zu der optischen Achse 29 angeordnet
ist. Nach Einstellung der Neigung der Plattform 34 wird
die Position der Plattform 34 relativ zu der Basis 24 unter
Verwendung der Vertikaleinstellung 40 einjustiert, welche eine
Zahnstangengetriebeanordnung benutzt, um die Plattform 34 in
der eingestellten Richtung der Drehachse 94 anzuheben und
abzusenken. Durch Verwendung der Vertikaleinstellung 40 kann
eine Probe, die von dem an dem Ende der Welle 44 angebrachten
Magnet getragen wird, auf eine erforderlich Tiefe in die Abbildungskammer
zur Abbildung abgesenkt und aus der Kammer angehoben werden, sobald eine
Abbildung durchgeführt
worden ist. Die vertikale Stellung der Probe während des Abbildungsvorgangs
kann auf diese Weise ebenso geändert
werden, falls es erforderlich ist. In der angehobenen Position der
Welle können
Proben auf den Probenhalter geladen oder von ihm entladen werden.
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Wenn
die Vorrichtung vorbereitet ist, wird sie so ausgerichtet, dass
die optische Achse des Mikroskops durch das Prisma und durch die
Mitte der Abbildungskammer verläuft.
Bei hoher Vergrößerung kann
die Ausrichtung jedoch eine Justierung notwendig machen, da die
Probe leicht aus der Mitte des Gesichtsfeldes versetzt wird. Der
oben erwähnte
Anhebungs-/Absenkungsmechnismus kann eingestellt werden, um diese
Versetzung in der vertikalen Richtung zu korrigieren.
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Während viel
Abbilden der Probe durchgeführt
werden kann, indem die Drehachse ungefähr senkrecht zu der optischen
Achse verläuft,
wird eine 3D-Rekonstruktion der Probe unter Verwendung der mathematischen
Bearbeitung von sehr geringer Qualität ausfallen, wenn der Winkel
zwischen der optischen Achse und der Drehachse nicht exakt 90° beträgt. Die
Neigungseinstellung 36 ermöglicht es, die Dreh- bzw. Rotationsachse 94 so
gering zu neigen, dass sichergestellt wird, dass der Winkel exakt
90° beträgt. Die
Neigungseinstellung 36 beruht typischerweise auf einem
Schraubengewindemechanismus, um die Plattform 34 auf eine
Seite zu drücken.
Ein Kalibriermus ter wird benutzt, um den Neigungswinkel einzustellen,
wobei das Kalibriermuster eine Anzahl von kleinen Partikeln enthält, deren
Trajektorien auf einem Computerbildschirm überwacht werden können, während sich
die Welle dreht. Wenn die Drehachse nicht genau senkrecht zu der
optischen Achse verläuft,
erscheint die Trajektorie des Partikel als eine Ellipse, siehe 4(a), welche die Ansicht längs der optischen Achse zeigt,
wie sich die Welle um die Achse 94 dreht. Wenn die Achse
korrekt ausgerichtet ist, ist das Partikel in einer Bewegung von
Seite zu Seite gesehen werden, ohne eine vertikale Komponente in der
Bewegung, siehe 4(b).
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5 zeigt das verwendete magnetische Anbringungssystem,
welches auf magnetischer Anziehungskraft zwischen einer Metallscheibe 110,
die an einer Probe 112 angebracht ist, und dem ständig an
dem unteren Ende der drehbaren Welle 44 des Schrittmotors 42 befestigten
zylindrischen Magneten 46 beruht. Jede Probe weist eine
kleine magnetisierbare Metallscheibe auf, die an einem Ende während der
Probenpräparation
angeklebt wird. Die Scheibe wird dann an dem Magnet angebracht,
wenn ein Abbilden durchgeführt
werden soll, und die Probe wird als Resultat der magnetischen Anziehungskraft
zwischen der Scheibe und dem Magnet gehalten. Da die Scheibe 110 und
Probe 112 relativ leicht sind, ist es nicht notwendig,
dass der Magnet zum Halten ihres Gewichts stark magnetisiert ist.
Ein Vorteil des Magnetsystems gegenüber zum Beispiel einem Einschraubsystem
besteht darin, dass die kleine Größe der Scheibe und Probe eine
Handhabung mit Zange oder Pinzette nötig macht. Ein Anordnen der
Befestigung oder Scheibe 110 auf einem Magneten ist mit einer
Zange unkompliziert, wohingegen ein Einschrauben in eine Anbringung
es nicht ist. Ein weiterer Vorteil ist es, dass die Position relativ
zu der Drehachse ohne weiteres eingestellt werden kann, indem die
Anbringung 110 über
die Magnetoberfläche 120 verschoben
wird. Auch können
viele Proben mit einer angebrachten Scheibe vorpräpariert
und dann schnell in die Vorrichtung zum Abbilden eingesetzt werden,
wenn es erforderlich ist.
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Bestimmte
Flüssigkeiten,
die in der Kammer zur Probenabbildung verwendet werden, sind giftig und
gegenüber
Kunststoff korrosiv, und wo das der Fall ist, ist die beste Handhabungsweise
der Proben eine Verwendung von Zangen. Das magnetische Befestigungssystem
ist dann von Vorteil, da die Proben nur unter den Magnet gehalten
werden müssen,
um sicher angebracht zu werden. Es ist gleichermaßen einfach,
jede Probe nach einem Abbilden zu entfernen.
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Zur
Maximierung der Auflösung
der Abbildungen muss ein interessierender Bereich 122 in
einer Probe 112 auf der Drehachse 94 zentriert
werden, das heißt
sich nicht bewegen, wenn sich die Welle dreht. Wenn der interessierende
Bereich oder die gesamte Probe außermittig bzw. -zentrisch bei
einer Rotationsabbildungsaufnahme liegt und von Seite zu Seite oszilliert,
dann wird die erforderliche Vergrößerung um sie in Ansicht zu
halten gering sein. Dies ist in 6(a) illustriert.
Die beiden Gestalten 130, 132 stellen die Probe 112 bei
Rotation in ihren äußersten
Positionen links und rechts dar. Wenn die Probe 112 genau
zentriert ist, dreht sie sich um ihre eigene Achse, siehe 6(b). Dies stellt eine kleinere Breite über dem
Gesichtsfeld dar, und so kann die Vergrößerung erhöht werden, um eine Abbildung
mit höherer
Auflösung
schaffen, siehe 6(c).
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Eine
Einstellung der Probe 112 relativ zur Drehachse 94 ist
durch die magnetische Anbringung vereinfacht. Durch Druck auf die
Scheibe 10 kann die Mitte der Scheibe relativ zu der Drehachse 94 versetzt
werden. In 5(a) ist der interessierende
Bereich 122 innerhalb der Probe 112 nicht auf
der Drehachse zentriert, sondern eher nach links versetzt. Wenn
sich die Motorwelle um 180° dreht,
ist der interessierende Bereich 122 nun auf der rechten
Seite der Drehachse sichtbar, siehe 5(b).
Da der Magnet 46 der metallischen Anbringung 110 eine
Verschiebung längs
jeder Richtung ohne Verlust der Befestigung gestattet, kann ein
Druck von der Seite durch den Hebel 16 (angegeben durch
Pfeil 114 in 5(c))
die Probe so positionieren, dass der interessierende Bereich 122 auf
der Drehachse zentriert wird, siehe 5(c).
Eine weitere Drehung um 180° zeigt,
dass jetzt die ganze Probe 112 von einer Seite zur anderen
oszilliert, während
der interessierende Bereich zentriert bleibt, siehe 5(d). Eine Einstellung der Probe auf diese Art
und Weise wird gewöhnlich
durchgeführt,
während
Abbildungen der sich drehenden Probe auf einem Computerbildschirm
beobachtet werden.
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Die
Abbildungskammer
26 wie in
1 gezeigt
wird nun ausführlicher
mit Bezug auf
7 beschrieben. Mit einer
festen bez. feststehenden Probenkammer, welche sich nicht mit der
Probe während eines
Abbildevorgangs dreht, muss die Kammer nicht zylindrisch sein, um
einen konstanten optischen Pfad bei einer Rotation beizubehalten,
wie bei dem in
US 5,680,484 beschriebenen
System. Ein Vergleich des Rohrs
136 aus dem Stand der Technik
und der in der vorliegenden Erfindung verwendeten Kammer ist in
7 dargestellt.
7(a) zeigt
einen Querschnitt durch das zylindrische Rohr
136 (welches
horizontal aufgehängt
ist) aus dem Stand der Technik, und
7(b) zeigt
die Kammer
26, welche in der vorliegenden Ausführung benutzt
wird. Die Abbildungskammer
26 ist im Allgemeinen quaderförmig und
mit quadratischer Querschnittsform ausgewählt, und ist aus Quarz, Glas
oder einem anderen geeigneten transparenten Werkstoff hergestellt.
Jede Kammer/jedes Rohr enthält
eine Probe
141, die in eine Flüssigkeit
143 mit geeigneten
optischen Eigenschaften zur Ermöglichung
einer Abbildung der Probe eingelegt ist. Die flachen Seiten
142,
142',
144,
144' von Kammer
26 verringern
Brechungsverzerrungen der Abbildung und ermöglichen, dass größere Proben
abgebildet werden können.
Der Grund hierfür
besteht darin, dass die wechselseitig parallelen Wände
142,
142' der Kammer
mit quadratischem Querschnitt senkrecht zu der optischen Achse
29 ausgerichtet
sind und einen größeren Abbildungsbereich
vorsehen, über
welchem keine Lichtbrechung auftritt, als für das kreisförmige Rohr
136,
welches nur einen sehr kleinen Abschnitt seines Umfangs bei normalem
Einfallen von Licht besitzt. Somit kann eine gute Abbildung über einer
Breite von mehr als 10 mm für
die Kammer
26 gebildet werden, wobei der Betrag eines von
dem Muster bzw. der Probe empfangenen Signals verbessert und eine
Verzerrung auf Grund von Brechung verringert werden.
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7c illustriert
eine Modifizierung der Probenkammer von 7b. In 7c weist
die Probenkammer 26' einen
internen quadratischen Querschnitt auf, aber eine Wand 140 ist
so gestaltet, dass sie eine Plankonvexlinse zur Brechung von Licht,
das die Kammer verlässt,
vorsieht. Die Gestaltung bewirkt eine gewünschte Brechung, in dem Fall
von 7c einen Vergrößerungseffekt.
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Der
in 1 gezeigte Hebel 16 wird nun ausführlicher
mit Bezugnahme auf 8 beschrieben, welche
eine Draufsicht längs
Linie VIII-VIII von 1 darstellt. 8(a) zeigt den Hebel 16 in seiner üblichen
Stellung, von dem Magnet 46 und der metallischen Probenhalter 110 weg
gedrückt.
Wenn die Probe zu weit nach einer Seite versetzt ist (wie illustriert), kann
der Hebel 16 um einen Schwenkbolzen 164 so geschwenkt
werden, dass Zapfen 166 mit der metallischen Halterung 110 in
Eingriff kommt, um die Probe in die korrekte Position (8b)
zu schieben. Dies erfolgt während
die Probenposition auf dem Computerbildschirm dargestellt wird.
Da der Schrittmotor durch manuelle Schalter vorsichtig gesteuert werden
kann, kann die Pro bentrajektorie bei Rotation beobachtet und der
Motor angehalten werden, wenn die Probe am weitesten auf einer Seite
ist. Die Probe wird dann unter Verwendung des Hebels 16 zentriert, und
der Vorgang wiederholt, bis eine Ausrichtung der Probe relativ zu
der optischen Achse vervollständigt ist.
Der Hebel 16 ist so ausgelegt, dass er eine „untersetzte" Bewegung auf die
Probe überträgt, welches
es erleichtert, die Einstellung zu steuern.
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Der
Schwenkbolzen 164 ist an der Hauptmotorbühne angebracht.
Er ist an der Bühne
durch einen Träger
befestigt, welche sicherstellt, dass der Zapfen 166 auf
der richtigen Höhe
zur Kontaktierung der metallischen Halterung liegt, gerade unter
dem Magnet. Auf diese Weise bleibt der Zapfen 166 auf der
richtigen Höhe,
ungeachtet der Höhe,
welche zur Abbildung der Probe gewählt ist.
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Der
hierin beschriebene drehbare Probenhalter ist für 3D-Mikroskopie und ebenfalls
für Rotationsmikroskopie
für jeden
Zweck von biologischen Proben und Proben aus anderen Bereichen,
wie zum Beispiel Materialwissenschaft geeignet.
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Wenn
3D-Mikroskopie durchgeführt
wird, sollte der Brechungsindex überall
in der Probe gleichmäßig sein.
Für biologisches
Gewebe kann dies leicht erreicht werden, indem die Probe in ein
Clearing-Lösungsmittel
eingetaucht wird. Eine Probe kann direkt auf die metallische Halterung
geklebt oder in einen Block einer transparenten Matrix eingebettet
werden, wie zum Beispiel Agarosegel, welcher seinerseits auf die
Halterung geklebt wird. Das Clearing-Lösungsmittel durchdringt die
Blöcke
ebenso wie die Probe. BABB (eine Mischung aus Benzylalkohol und
Benzylbenzoat) ist als ein Lösungsmittel
geeignet.
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Für eine Probe,
deren Brechungsindex nicht gleichmäßig gemacht werden kann, oder
welche nicht transparent ist, ist diese Technik immer noch nützlich.
Die 3D-Oberflächengestalt
von Objekten, deren Querschnitte alle konvex sind (auch wenn die gesamte
3D-Gestalt nicht konvex ist), kann exakt aus seiner Rotationssilhouette
rekonstruiert werden.
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Es
gibt einige Anwendungen, bei denen die Rohdaten der Vorrichtung
von Nutzen sind. Die Abbildungsserien können in einen Film des rotierenden Objekts
(das heißt der
Probe) konvertiert werden. Es ist viel leichter, die Gestalt eines
3D-Objekts zu erfassen, wenn es rotierend betrachtet wird, als aus
wenigen statischen 2D-Abbildungen (viele 3D-Rekonstruktionsprojekte
stellen ihre Ergebnisse als Filme eines rotierenden Modells dar).
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Die
Vorrichtung ist auch zur Durchführung
eines 3D-Mapping von Gen-Expressionsmustern
(RNS und/oder Proteinverteilung) in biologischem Gewebe geeignet,
während
es gestattet, die Probe für
weitere Analyse nach einem Abbilden zu benutzen. Abbilden von Proben
unter Verwendung der Vorrichtung ist relativ schnell, wobei es ungefähr 20 Minuten
dauert. Im Gegensatz dazu nimmt ein Präparieren, Einbetten, Sektionieren,
Befestigen, Färben
und Digitalisieren von realen histologischen Schnitten Tage in Anspruch
und erzeugt Hunderte von digitalen 2D-Schnitten, aber keine garantierten
Weg, um sie miteinander zur Wiederherstellung der ursprünglichen
3D-Gestalt auszurichten. Die histologischen Schnitte neigen dazu,
sich im Wesentlichen so zu verlängern,
dass, auch wenn alle Schnitte zur Erzeugung einer 3D-Gestalt aufeinander
passen, das endgültige
Ergebnis die Gestalt der ursprünglichen
Probe nicht exakt wiedergibt. Jedoch sind die unter Verwendung der
Vorrichtung erzielten Resultate der realen physischen Gestalt der
Probe sehr ähnlich,
wobei der einzige Unterschied zu physikalischen Schnitten eine reduzierte
Auflösung
ist. Da die von der Vorrichtung erzeugten Daten echte 3D-Daten sind,
kann sie virtuell erneut in jeder Richtung geschnitten oder ein 3D-Rendering
erstellt werden.
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Eine
modifizierte Konstruktion eines drehbaren Probenhalters ist in 9 illustriert,
bei welcher Teile, die zu denjenigen von 1 korrespondieren, die
gleichen Bezugszeichen tragen. Bei dem drehbaren Probenhalter von 9 wird
eine dreidimensionale Einstellung der Position des Schrittmotors 42 durch
die Verwendung von drei sekundären
Schrittmotoren 150, 152, 154 erreicht.
Es ist keine Neigungseinstellung für den Motor 42 vorhanden.
Anstelle dessen ist das Prisma zur manuellen Justierung durch gesteuertes
Neigen um eine horizontale Querachse 23 fähig. Die
wichtigsten Schrittmotoren sind die Motoren 150 und 154.
Der Motor 152 kann durch eine manuelle Vertikaleinstellung 40 ersetzt werden.
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Die
sekundären
Schrittmotoren 150, 152, 154 ermöglichen-
eine Submikron-Genauigkeitseinstellung
der 3D-Position des ersten Schrittmotors 42 längs der
mit x, y und z bezeichneten Ausrichtungen. Diese Schrittmotoren 150, 152, 154 werden
von demselben Computer gesteuert, welcher den primären Motor 42 steuert.
Dies ist in 10 illustriert, wo der Computer 50 die
vier Motoren durch Motortreiberschaltungen 156 ansteuert.
Für den
Zweck dieses Dokuments wird die z-Achse als parallel zu der optischen
Achse 29 verlaufend betrachtet. Bewegungen längs dieser
Achse verändern
den Brennpunkt des Systems in effektiver Weise. Bewegungen längs der anderen
beiden Achsen verändern
den Abschnitt der Probe, welcher mit dem Zentrum der optischen Achse 29 zusammenfallt.
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Die
vom Computer gesteuerte Translationsbewegung bzw. Verschiebung durch
die drei sekundären
Motoren 150, 152, 154 weist die folgenden Vorteile
auf:
- 1) Sie ermöglicht, dass der interessierende
Bereich (ROI = Region Of Interest) der Probe mittig innerhalb des
Gesichtsfeldes des Mikroskops beibehalten wird. Dies wird auf zwei
Wegen erreicht:
(a) Der ROI wird innerhalb der Brennpunkttiefe des
Mikroskops beibehalten.
(b) Es begrenzt die „von Seite
zu Seite" oszillierenden
Bewegungen des ROI längs
der x-Achse.
Diese beiden Vorteile gestatten eine viel höhere Abbildungsauflösung im
Vergleich zu einem System, welches keinen solchen Mechanismus aufweist.
- 2) Sie ist exakter als das Hebel- und Zapfensystem der 1 und 8.
- 3) Sie kann vollständig
durch den Computer so gesteuert werden (im Gegensatz zu dem Hebel- und
Zapfensystem), dass der ROI innerhalb der Software leicht „auf dem
Bildschirm" festgelegt werden
kann.
- 4) Sie ermöglicht
es dem Computer, präzise 3D-Koordinaten
für den
ROI zu berechnen.
- 5) Sie gestattet es unterschiedlichen Abtastungen bzw. Scans
innerhalb derselben Probe mit jeder bzw. jeden anderen im 3D-Raum
in Beziehung gesetzt zu werden.
- 6) Dies ermöglicht
es dem Computer, eine Abtastung mit hoher Auflösung einer großen Probe
von vielfachen automatischen Scans von kleineren Bereichen bei höherer Vergrößerung aufzubauen (bekannt
als „Tiling" oder „Patching").
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Computergesteuerte
x- und z-Bewegungen zur Beibehaltung des ROI innerhalb des Gesichtsfeldes
werden wie folgt berechnet:
Zuerst muss die Software die Positionen
berechnen von:
- (a) Die Drehachse des primären Schrittmotors 42 relativ
zu dem Gesichtsfeld.
- (b) Den ROI relativ zu der Drehachse des ersten Schrittmotors.
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Diese
beiden Positionen können
aus einem Vorgang berechnet werden. Die Vergrößerung wird gering genug eingestellt,
so dass der ROI während einer
vollen Umdrehung innerhalb des Gesichtsfeldes der Kamera bleibt.
Das System ist vorher so kalibriert, dass es bekannt ist, wie viele
Impulse für
den x-Schrittmotor zu einer gegebenen Verschiebung korrespondieren,
wie in Pixeln auf dem Computerbildschirm gemessen. Dieses Verhältnis ist
für jede Vergrößerung festgelegt.
Der Computer stellt dann dem Benutzer vier Abbildungen der Probe
dar, gedreht auf 0, 90, 180 und 270 Grad (wie in 11a bis 11c ersichtlich
ist). In 11a repräsentiert jedes außen liegende
Rechteck das Abbildungsfenster des Computerbildschirms, und der
Punkt stellt den interessierenden Bereich 122 der Probe
dar.
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11b zeigt Ansichten längs der optischen Achse (wie
auf dem Computerbildschirm zu sehen ist) für geringe Vergrößerung,
und 11c stellt Draufsichten längs der
Drehachse 94 dar. Der Benutzer verwendet dann die Computermaus
(oder Äquivalentes)
zu Angabe, wo sich der ROI in jeder Abbildung befindet.
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12 zeigt, wie das Positioniersystem den Schrittmotor 42 sowohl
in die x- und z-Abmessungen verstellen
kann, und kann daher eine Außermittigkeit des
ROI kompensieren. Die x- und z-Verstellungen bzw. -Bewegungen des
Motors 42 werden von dem Computer gesteuert, um zu gewährleisten,
dass der ROI 122 in einer festen Position verbleibt, wobei
er sich um eine wirksame Drehachse dreht.
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In 11a, 11b und 11c bedeuten:
- χ1
- = die x-Position des
ROI bei 0 Grad, umgewandelt in Schrittmotoreinheiten.
- χ2
- = die x-Position des
ROI bei 180 Grad, umgewandelt in Schrittmotoreinheiten.
- χw
- = die Weite des Abbildungsfensters,
umgewandelt in Schrittmotoreinheiten.
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Die
Mittelwerte χ1
und χ2
stellen die Position (χs)
der Drehachse des Schrittmotors relativ zu dem Abbildungsfenster
(χs) bereit.
Die Mittelwerte von Z1 und Z2 schaffen eine zweite Einschätzung dieser
Position (χs
= (χ1 + χ2 + Z1 +
Z2)/4). Die x-Verstellung, welche
notwendig sein würde,
um die Drehachse des Schrittmotors innerhalb des Abbildungsfensters
zu zentrieren, ist: X-Verstellung(χd) = χw/2 – (χ1 + χ2 + Z1 +
Z2)/4
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Dies
ist in 13a und 13b illustriert.
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In 13a und 13b betrachtet
das Mikroskop die Probe von der Unterseite des Diagramms her. Die
Ränder
des Gesichtsfeldes erscheinen deshalb als zwei im Wesentlichen parallele
Linien, welche die Grenzen dessen angeben, was gesehen werden kann.
Die optische Achse, welche in der Mitte dieses Gesichtsfeldes liegt,
wird als eine vertikale, gestrichelte Linie in 13a dargestellt.
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13b zeigt die Probe in einer Drehposition von
0 Grad (α =
0). Aus den Messungen, die auf der vorhergehenden Seite erläutert wurden
(χ1, χ2, Z1, Z2)
können
die x- und z-Abstände des
ROI von der Drehachse des primären
Schrittmotors leicht errechnet werden. χαo ist der x-Abstand, wenn die Drehposition
(Winkel α)
Null beträgt
(χαo = (χ1 – χ2)/2). In ähnlicher
Weise kann Zαo
aus den zwei Messungen, die bei α =
90 Grad und α =
270 Grad gemacht wurden, errechnet werden (Zαo = (Z1 – Z2)/2).
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Die
Position des ROI kann dann von kartesischen Koordinaten in Polarkoordinaten
umgewandelt werden, wobei D der Abstand des ROI von der Schrittmotorachse
ist, und θ der
Winkel derjenigen Linie zu der optischen Achse ist (oder einer Linie
parallel zu ihr), wenn θ =
0 Grad ist. D = Wurzel aus (χαo2 +
Zαo2)θ =
tan–1(χαo/Zαo)
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Nun
kann der ROI für
jede Drehposition des primären
Schrittmotors (α)
auf der optischen Achse durch Verstellungen der sekundären x-z-Schrittmotoren
positioniert werden, wobei die gesamten Verstellungen (Xt und Zt)
berechnet werden durch: χt = χd + D.sin(α + θ), und Zt = D.cos(α + θ).
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Die
3D-Gestalt des von einer OPT-Rekonstruktion abgetasteten Bereiches
ist im Wesentlichen ein Zylinder mit einem kreisförmigen Querschnitt, dessen
Achse einer Rotationssymmetrie die effektive Drehachse ist, welche
während
eines Abbildens benutzt wird, und dessen Durchmesser und Länge durch
die Weite und Höhe
des Gesichtsfeldes beschrieben werden. Da ein Wechsel zwischen kartesischen
Koordinaten und Polarkoordinaten zur Beschreibung von Positionen
innerhalb der Probe, und eine Beziehung zwischen Pixeln zu realen
Abständen
innerhalb der Probe möglich
sind, ist eine leichte Berechnung der Position und Gestalt des abgetasteten
Zylinders relativ zu jeden anderen Scans ermöglicht, die von derselben Probe
erfasst worden sind.
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Beim
2D-Abbilden wird eine Abbildung mit hoher Auflösung häufig dadurch aufgebaut, dass
viele Abbildungen mit hoher Vergrößerung von kleinen Bereichen
des Objekts aufgenommen werden und dann ein Zusammenfügen der
kleineren Abbildungen erfolgt. Dies ist oft als „Tiling" oder „Patching" bekannt. Die computergesteuerte XYZ-Stufe
gestattet die gleiche Lösung,
die bei einem 3D-OPT-Abbilden angewendet werden sollte.
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Wie
oben beschrieben, ist der abgetastete Bereich eines OPT-Scan ein
Zylinder mit kreisförmigem
Querschnitt. 14 illustriert in einer Draufsicht nach
unten längs
der Achse 94, wie eine Probe 160 in einem Scan 162 bei
geringer Auflösung
abgebildet werden kann, oder alternativ abgebildet werden, indem
sieben Scans 170 mit hoher Auflösung so positioniert werden,
dass jede Position innerhalb der Probe innerhalb zumindest eines
abgetasteten Bereiches enthalten ist. Da die individuellen Abtastbereiche
einen kreisförmigen
Querschnitt aufweisen, besteht eine effiziente Anordnung zur Abdeckung
eines weiten Bereiches darin, die Scans in einem hexagonalen Muster
mit leichten Überlappungen
zwischen aneinander liegenden Scans anzuordnen. Unterschiedliche
Positionen längs
der y-Achse der Probe können
auch unter Verwendung des y-Achsen-Schrittmotors abgetastet werden.
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Dieser „Tiling"-Prozess kann vollständig von dem
Computer gesteuert und durchgeführt
werden.
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Für alle Proben,
welche in ihrer Gesamtheit mit einem Scan abgetastet werden sollen,
kann eine Berechnung des optimalen abgetasteten Bereiches automatisch
erfolgen, ohne die Notwendigkeit für den Benutzer, den ROI wie
vorstehend beschrieben zu identifizieren. Ein einfacher Abbildungsprozess
kann die Außenkontur
oder das Zentrum der Probe innerhalb von Testabbildungen während des
Ausrichtvorgangs auffinden, wie im Folgenden beschrieben:
- 1) Einstellen einer geringen Vergrößerung (kann automatisch
unter Verwendung eines computergesteuerten Mikroskops erfolgen).
- 2) Aufnehmen von vier Abbildungen bei 0, 90, 180 und 270 Rotationsgraden
- 3) Berechnen eines Histogramms einer jeden Abbildung zum Festlegen
einer geeigneten Schwellenhöhe
zur Unterscheidung der Probe vom Hintergrund.
- 4) Berechnen der Position des Massenschwerpunktes der Probe
in jeder Abbildung.
- 5) Verwenden dieser Positionen als ROI-Messungen wie vorstehend
erläutert.
- 6) Anwenden der neuen Verstellungen während jeder der nachfolgenden
Rotationen.
- 7) Erhöhen
der Vergrößerung.
- 8) Aufnehmen von vier gedrehten Abbildungen und Festlegen, ob
eine Vergrößerung zu
hoch ist (das heißt,
ob Ränder
der Probe außerhalb
des Gesichtsfeldes liegen).
- 9) Wenn die Probe noch innerhalb des Gesichtsfeldes liegt, zurück zu Schritt
4.
- 10) Wenn Ränder
der Probe außerhalb
des Gesichtsfeldes sind, Reduzieren einer Vergrößerung auf vorhergehenden Wert.
- 11) Abtasten der Probe.
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Eine
kollimierte bzw. parallel ausgerichtete Beleuchtungseinrichtung,
welche bei dem drehbaren Probenhalter von 1 oder 9 benutzt
werden kann, ist in 15 und 16 illustriert.
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Ein
Laser oder eine andere Lichtquelle 172 wird im Zusammenhang
mit einer Fokussiereinheit (entweder Refraktionslinsen 174 oder
reflektierende Spiegel) verwendet, um einen Lichtstrahl 176 zu
erzeugen, in welchem alle Lichtstrahlen im Wesentlichen parallel
zu der optischen Achse verlaufen. 15 illustriert
diese Einrichtung in Bezug auf den Rest des drehbaren Probenhalters,
welcher in diesem Beispiel zwei Schrittmotoren 150, 154 für eine von
einem Computer gesteuerte Einstellung jeweils in der x- und z-Richtung
aufweist. Eine vertikale Einstellung wird manuell durch eine Vertikaleinstellung 40 bewirkt.
Die Linse 22 ist für
eine Neigungseinstellung um Achse 23 geeignet.
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Als
Resultat aus Versuchen ist es klar, dass Beleuchtungslicht, welches
in die Probe eindringt und sich nicht parallel zur optischen Achse
ausbreitet, zu Rauschen in den Ergebnissen führt. Eine kollimierte Lichtquelle,
bei welcher alle beleuchtenden Licht strahlen parallel zur optischen
Achse verlaufen, reduziert dieses Problem und erhöht deshalb
die Abbildungsqualität.
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Mit
Bezugnahme auf 17 ist ein Wellenlängenfilter 178 an
irgendeiner Position zwischen der Lichtquelle 180 und der
Probe 28 angeordnet. Dieser kann entweder aus einer Serie
von unterschiedlichen Filtern, von denen jedes die Übertragung
von unterschiedlichen Bereichen von Wellenlängen gestattet, bestehen, welches
manuell oder automatisch in dem Lichtpfad positioniert wird. Oder
es kann ein elektronisch abstimmbares Filter sein.
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Alternativ
können
zwei elektronisch abstimmbare Flüssigkristallfilter
zur Fluoreszensabbildung benutzt werden, um die Wellenlängen sowohl des
Beleuchtungslichts als auch des erfassten Lichts zu beschränken, wobei
dieses Möglichkeit
durch das zweite elektrisch gesteuerte Filter 182 illustriert
ist, welches vor einem 2D-Array von Lichtdetektoren bzw. -abtastern 184 angeordnet
ist.
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Eine
gegebene Chemikalie wird unterschiedliche Wellenlängen mit
variierenden Graden an Wirksamkeit absorbieren. Diese Unterschiede
können
als ein Spektrum (welches die Absorption für einen weiten Bereich von
Wellenlängen
beschreibt) dargestellt werden. Die meisten Proben bestehen aus
variierenden räumlichen
Verteilungen von unterschiedlichen Chemikalien, und folglich werden
unterschiedliche Proben unter Verwendung unterschiedlicher Wellenlängen (oder
Kombinationen von Wellenlängen)
optimal abgebildet. Die beschriebenen Filtersysteme ermöglichen
es dem Benutzer, eine Änderung
vorzunehmen, welche Wellenlängen
verwendet werden, um eine gegebene Probe abzubilden.
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In ähnlicher
Weise besitzen fluoreszierende Chemikalien ein Spektrum, welches
die Wirksamkeit von unterschiedlichen Wellenlängen beschreibt, diese anzuregen,
und ein zweites Spektrum, welches die prozentualen Häufigkeit
von unterschiedlichen Wellenlängen
beschreibt, die als Fluoreszenz emittiert werden. Die Verwendung
von zwei elektronisch gesteuerten Filtern erzeugt (zumindest) einen 2D-Parameterraum
für die
möglichen
Kombinationen von Anregung und Aussendung. Ein solches System ermöglicht die
Untersuchung von optimalen Kombinationen zur Unterscheidung zwi schen
unterschiedlichen Chemikalien. Dies gestattet die 3D-Histologie von
abzubildenden biomedizinischen Proben ohne die Notwendigkeit für besondere
Einfärbung.
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Dabei
ist hervorzuheben, dass ein drehbarer Probenhalter weder ein Prisma 22 aufweisen
muss, noch muss der drehbare Probenhalter mit einem standardmäßigen Vertikalmikroskop
benutzt werden. 18 illustriert eine Modifikation
der Anordnung nach 15. In 18 (in
welcher Teile, die zu denjenigen von 15 korrespondieren,
die gleichen Bezugszeichen aufweisen) tritt das von der Kammer 26 ausstrahlende
Licht in Mikroskopoptiken und eine Digitalkamera ein, wobei eine
kurze Arbeitsdistanz zwischen dem Mikroskopobjektiv 30 und
der Probe gegeben ist.
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Die
Probe kann unter Verwendung einer Verschiebebühne, die von der Welle 44 getragen
ist, positioniert werden. Die Verschiebebühne weist eine manuelle oder
computergesteuerte Einstellung in der x- und z-Richtung auf.