ES2294583T3 - Aparato para tomografias de proyeccion optica con platina rotatoria para obtener imagenes de un especimen. - Google Patents
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Abstract
Un aparato de tomografía de proyección óptica (OPT) que incluye una platina rotatoria (10) y una cámara de formación de imágenes para uso en la formación de imágenes de un espécimen a partir de una pluralidad de direcciones, comprendiendo la platina rotatoria un medio de soporte para el espécimen que incluye una pieza rotatoria (44) que puede ser operada para rotar un espécimen para la formación de imágenes alrededor de un eje de rotación (94) en forma trasversal a un eje óptico (29) a lo largo del cual la luz es emitida desde el espécimen, caracterizado porque: (a) el eje de rotación (94) es vertical o sustancialmente vertical, (b) el medio de soporte para el espécimen está dispuesto por encima de la cámara para formación de imágenes (26) para recibir al espécimen inmerso en un fluido óptico para formación de imágenes dentro de la cámara, y (c) la cámara para formación de imágenes es estacionaria.
Description
Aparato para tomografías de proyección óptica
con platina rotatoria para obtener imágenes de un espécimen.
Esta invención se relaciona con un aparato para
tomografías de proyección óptica con platina rotatoria para la
formación de imágenes de un espécimen.
Los aparatos ópticos de imágenes para la
producción de imágenes tridimensionales de muestras por medio de
tomografías de proyección óptica son conocidos; ver, por ejemplo la
Patente Estadounidense No. 5.680.484. El aparato óptico divulgado
en esta patente del estado del arte tomo una serie de imágenes
digitales de una muestra desde diferentes ángulos. Estas imágenes
son alimentadas a un algoritmo que utiliza una transformación
matemática para reconstruir una imagen tridimensional. En la Patente
Estadounidense No. 5.680.484, se mantiene el espécimen dentro de un
tubo transparente que está soportado en dos puntos de tal manera que
se mantenga en una posición sustancialmente horizontal, y se rota
el tubo utilizando un motor por etapas y una correa transportadora
para permitir la formación de imágenes de las diferentes partes del
espécimen. La refracción de la luz por parte del tubo afecta la
calidad de la señal y el uso del tubo impone una severa restricción
sobre el tamaño máximo del espécimen que puede ser trabajado. El
aparato divulgado en esta patente del estado de la técnica tiene
varias limitaciones que afectan los usos potenciales de esta técnica
para la formación de imágenes, en particular la difícil
introducción de la muestra en el tubo cilíndrico hueco, y la
dificultad para ajustar la posición de la muestra.
M. Almquist y colaboradores en
"Ultrasonics" vol. 37 (1999), páginas 343-353,
divulga un sistema de medición para la tomografía por difracción de
luz para obtener mediciones de alta resolución espacial de
ultrasonido de onda continua.
La Patente Estadounidense No. 5.710.625 divulga
una platina rotatoria para soportar y posicionar una muestra con el
propósito de obtener un análisis espectral de la muestra.
De acuerdo con la presente invención, se provee
un aparato para tomografías de proyección óptica (OPT) de acuerdo
con la reivindicación 1.
El aparato incluye una platina rotatoria que
comprende un medio de soporte para el espécimen que incluye una
pieza rotatoria que permite la rotación de un espécimen del cual se
van a obtener imágenes alrededor de un eje de rotación transversal
a un eje óptico a lo largo del cual el espécimen emite luz,
caracterizado porque el eje de rotación es vertical o
sustancialmente vertical, el medio de soporte para el espécimen está
dispuesto encima de una cámara para obtención de las imágenes para
recibir al espécimen inmerso en un fluido óptico para obtención de
las imágenes dentro de la cámara, y la cámara para obtención de las
imágenes es estacionaria.
El escáner para OPT puede incluir un microscopio
separado y un hardware y software asociados que permitan la
formación tridimensional de imágenes de un espécimen, tal como un
tejido biológico. Teniendo un medio de soporte para el espécimen
distanciado del microscopio, se puede ajustar fácilmente la
colocación del espécimen debido a una mejor accesibilidad del
soporte para el espécimen. Con un espécimen alargado, el eje más
largo del espécimen es sustancialmente paralelo a la gravedad
cuando lo sostiene dentro del medio de soporte para el espécimen.
Esto permite que el espécimen sea sostenido únicamente en un punto,
ayudando nuevamente con la colocación del espécimen dentro del
medio de soporte para el mismo, y evitando la deflexión del
espécimen causado por el efecto gravitacional, ya que tal deflexión
puede causar una distorsión no deseada de la forma del espécimen y
afectar la precisión y la resolución de la imagen obtenida.
Teniendo una cámara estacionaria distanciada de
la parte de la platina que rota, la forma de la cámara no está
limitada a una forma rotacionalmente simétrica. Preferiblemente, la
cámara tiene al menos una cara plana sobre la cual choca la luz
para formar la imagen del espécimen. El uso de una superficie plana
lisa sin imperfecciones u ondulaciones garantiza que se reduzca la
distorsión de la imagen debido a la refracción de la luz. La cámara
se puede elaborar en forma de un paralelepípedo rectangular hueco
transparente dispuesto de tal manera que las dos caras opuestas del
paralelepípedo rectangular sean sustancialmente perpendiculares al
eje óptico a lo largo del cual se emite la luz a partir del
espécimen, de tal manera que se presente una gran área transversal
al eje óptico. La selección de tal cámara con una sección
transversal cuadrada garantiza que la cantidad de luz refractada
antes de pasar a través del espécimen se reduzca sustancialmente con
relación a las cámaras cilíndricas de rotación del estado de la
técnica y de este modo de mejora la calidad de la imagen. A una
pared o superficie de la cámara se le puede dar una forma para que
refracte la luz en una forma deseada, por ejemplo para suministrar
un efecto de magnificación.
La platina rotatoria puede comprender además un
medio de ajuste montado sobre un pivote, tal como una palanca, que
tiene una espita que se extiende a partir de allí, estando la espita
en uso dispuesta para engranarse con un espécimen para alterar su
posición en relación con el eje de rotación.
La platina rotatoria puede comprender además un
prisma ubicado a fin de recibir la luz después de que esta última
ha iluminado al espécimen, actuando el prisma para desviar la luz
hasta 90º para hacer posible que la luz sea recibida por un
microscopio con un eje óptico vertical. Por medio del uso de un
prisma, la ruta óptica para el microscopio no necesita ser recta, y
por lo tanto no se requiere la modificación de los microscopios
existentes para utilizarlos con una platina rotatoria de acuerdo con
la presente invención.
La pieza rotatoria del medio de soporte para el
espécimen puede ser rotada sobre una plataforma ajustable, cuya
posición con relación a la horizontal es variable. Esto permite
ajustar el eje de rotación con relación a un eje óptico de modo que
si se requiere se ajusta un ángulo de 90º entre el eje óptico y el
eje de rotación. Esto es particularmente útil para la formación de
imágenes tridimensionales.
La plataforma ajustable se ajusta
preferiblemente verticalmente a fin de subir y bajar la pieza de
rotación con relación al eje óptico, permitiendo así que el
espécimen sea bajado dentro o fuera de un paso óptico de luz.
Preferiblemente, se concibe la pieza que puede
ser rotada para permitirle al espécimen ser colgado, en forma
suspendida o hacia abajo dependiendo del extremo inferior de la
pieza que puede ser rotada. Donde se prepara apropiadamente un
espécimen con una montura metálica, la unión del espécimen al medio
que sirve de soporte para el mismo es entonces sencilla,
dependiendo solamente de una atracción magnética y no de un delicado
aseguramiento. Esta es una ventaja ya que típicamente los
especímenes son bastante pequeños y delicados, usualmente con un
diámetro en el rango de 1-20 mm, y el aseguramiento
de los mismos en un soporte utilizando un tornillo roscado puede ser
complicado.
La invención será descrita ahora, a manera de
ejemplo, con referencia a los dibujos acompañantes en los
cuales:
La Figura 1 es una vista en perspectiva de un
aparato óptico para formación de imágenes que forma una modalidad
preferida de la invención y comprende una platina rotatoria junto
con un microscopio;
La Figura 2 muestra una ilustración esquemática
de cómo tal aparato para la formación de imágenes es controlado
cuando se adquieren imágenes digitales;
La Figura 3 muestra una vista frontal en
perspectiva del aparato;
Las Figuras 4(a) y 4(b) son
diagramas esquemáticos utilizados para ilustrar la configuración de
trabajo más apropiada del aparato;
Las Figuras 5(a), 5(b),
5(c) y 5(d) ilustran la unión de un espécimen al medio
de soporte para el espécimen y la alineación de una región de
interés;
Las Figuras 6(a) y 6(b) y
6(c) son diagramas esquemáticos utilizados para explicar la
resolución del aparato;
La Figura 7(a) muestra una sección
transversal a través de un tubo del estado del arte que contiene un
espécimen, con las Figuras 7(b) y 7(c) mostrando dos
cámaras para el espécimen como las utilizadas en la presente
invención;
Las Figuras 8(a) y 8(b) muestran
una vista en un plano parcial a lo largo de la línea
VIII-VIII de la Figura 1, ilustrando el uso de una
palanca montada en forma de pivote para ajustar la posición del
espécimen;
La Figura 9 es una vista en perspectiva de un
aparato óptico modificado para la formación de imágenes de acuerdo
con la invención;
La Figura 10 es un diagrama que ilustra al
aparato de la Figura 9;
Las Figuras 11(a), 11(b),
11(c), 12(a), 12(b), 13(a), 13(b)
y 14 ilustran el posicionamiento y la observación de la imagen del
espécimen en el aparato de la Figura 9;
Las Figuras 15 y 16 ilustran un medio de
iluminación colimada que puede ser utilizado en el aparato de la
Figura 1 o de la Figura 9;
La Figura 17 indica una forma de seleccionar las
longitudes de onda de una fuente de luz en la platina óptica de la
Figura 1 o de la Figura 9, y
La Figura 18 ilustra una modificación del
aparato mostrado en la Figura 16.
La Figura 1 muestra un aparato óptico para la
formación de imágenes en la forma de un escáner para OPT que
consiste de una platina rotatoria 10 y una distancia de trabajo
grande o microscopio de disección 12, separado de la platina
rotatoria 10. La platina rotatoria 10 tiene un soporte 14, una
palanca montada en forma de pivote 16, un iris y un difusor óptico
20, y un prisma de cuarzo 22. El soporte 14, el iris y el difusor
20, y el prisma 22 están fijos a una base 24 de la platina 10, que
es un soporte 25 para recibir una cámara transparente 26, o cubeta,
de una forma generalmente de paralelepípedo rectangular. La cubeta
26 contiene un fluido con propiedades ópticas adecuadas para la
formación de la imagen de un espécimen 28 suspendido dentro de la
cubeta, siendo el fluido apropiado una mezcla de alcohol bencílico
y de benzoato de bencilo. Este aparato puede ser utilizado para la
formación de imágenes en campo claro, campo oscuro y fluorescencia
pero es particularmente apropiado donde se crea una imagen
tridimensional (3D) del espécimen a partir de una serie de imágenes
tomadas en diferentes ángulos, y para especímenes muy grandes para
formar imágenes por medio de microscopía confocal.
La luz que pasa a lo largo del eje óptico 29,
pasa a través del centro del iris y del difusor 20, y a través del
espécimen 28 y se desvía a través de ángulos rectos por el prisma 22
para entrar a un objetivo 30 del microscopio 12. Ya que el
microscopio tiene una gran distancia de trabajo, hay suficiente
espacio disponible para que el prisma 22 descanse por debajo del
objetivo del microscopio 30. El uso de un prisma le permite a un
microscopio orientado verticalmente para formar la imagen del
espécimen. Sin embargo el prisma 22 puede ser omitido cuando el
objetivo del microscopio es paralelo al eje óptico. El iris y el
difusor 20 controlan la cantidad de luz que pasa desde una fuente
de luz (no mostrada) hasta alcanzar el espécimen 28 y suministrar
iluminación uniforme.
El soporte 14 tiene una protuberancia circular
sobre la cual está montada en forma de pivote, alrededor de un eje
90 (Figura 4), una placa inclinada 33 sobre la cual se desliza,
hacia arriba y hacia abajo, una placa 32. La placa 32 transporta
una plataforma voladiza que puede ser ajustada 34 horizontalmente
desde la placa 32. El ángulo de la plataforma 34 se puede alterar
con relación a la horizontal utilizando un ajustador inclinado 36
y se puede variar la posición vertical de la plataforma 34 por medio
de un ajustador vertical 40. Un motor por etapas 42 está montado
sobre la plataforma 34, con un eje giratorio para el motor 44 del
motor que se extiende a través de la plataforma 34. Un imán 46 (un
imán permanente o un electroimán) está unido al extremo inferior
del eje 44 y trasporta al espécimen 28 del cual se van a obtener las
imágenes. La forma en la cual el espécimen está unido al imán será
descrito posteriormente con referencia a la Figura 5. El motor por
etapas 42 hace girar al eje 44 con un tamaño de paso de 0,9 grados,
proveyendo hasta 400 posiciones para la formación de imágenes del
espécimen. Se toma una serie de imágenes digitales del espécimen
alargado 28 indicándole al eje 44 sus sucesivas posiciones de giro,
y de esta manera posicionar el espécimen en sucesivas posiciones de
giro mientras el espécimen está suspendido dentro de la cubeta 26,
permaneciendo estacionaria la cubeta.
Por medio del montaje del motor por etapas 42
con su eje de rotación vertical, el espécimen tipo varilla 28
únicamente necesita ser asegurado en un punto, típicamente su
extremo superior, para que ocurra la rotación controlada del
espécimen. El espécimen 28 se sumerge en el líquido, soportado desde
arriba por el imán 46, por medio del uso del ajustador vertical 40
para bajar la plataforma. Esta orientación vertical del espécimen y
el eje de rotación evitan el uso de empaques en forma de anillo o de
otras disposiciones mecánicas que serían necesarias para conectar
el motor seco al espécimen sumergido, y en segundo lugar, garantiza
que el espécimen no se desvíe de su eje de rotación por causa de la
gravedad ya que el espécimen alargado tiene su eje mayor paralelo a
la fuerza de gravedad. Evitar los efectos de distorsión para el
espécimen que tiene un espécimen orientado verticalmente es
particularmente importante para obtener imágenes 3D precisas,
particularmente para los especímenes mayores. El uso de un
paralelepípedo rectangular hueco generalmente vertical como la
cámara para la formación de imágenes 26 alrededor del espécimen 28
garantiza que el área superficial del líquido para la formación de
imágenes esté limitada, reduciendo la evaporación del líquido.
Además, se pueden obtener las imágenes de especímenes mucho
mayores, típicamente de 1-20 mm de diámetro, por
medio del uso de tales cámaras fijas sin perdida de calidad de la
señal digital.
En uso, una cámara digital 52 (Figura 2) está
unida al microscopio 12 y produce una imagen digital del espécimen
tal como la que se forma en el microscopio a partir de la luz que ha
viajado a lo largo del eje óptico 29, y que ha sido trasmitida a
través de la cámara y del espécimen. Se toman una serie de imágenes
digitales del espécimen a partir de diferentes ángulos y esta
información digital es alimentada en el algoritmo que utiliza una
fórmula matemática para reconstruir la estructura del espécimen en
tres dimensiones, Típicamente, las imágenes se obtienen utilizando
los elementos de control expuestos en la Figura 2. De esta forma, un
computador 50 que tenga un software para adquisición de imágenes
digitales está en comunicación bidireccional con la cámara digital
52 unida al microscopio 12 que recibe imágenes de un espécimen de
interés. El computador 50 controla las ruedas del filtro 56 unidas
al microscopio 12 para alterar la longitud de onda de la radiación
que es detectada. El software de adquisición del computador es
mostrado en forma diagramática en la Figura 2 como el software 58
para controlar la captura de imágenes de la cámara digital, un
programa 54 para controlar el software para la formación de
imágenes, la platina rotatoria y el software para las ruedas del
filtro, el software 48 para controlar las ruedas del filtro y el
software 64 para convertir los archivos de imágenes en una
reconstrucción 3D. El computador está también en comunicación
bidireccional con circuitos electrónicos de control 60 conectados a
la platina rotatoria 10 y controla a los circuitos 60 para ajustar
la orientación del espécimen según se requiera durante la captura
de imágenes de imágenes sucesivas. Una vez se han obtenido las
imágenes digitales, son procesadas en 64 para producir una
reconstrucción 3D 66 del espécimen utilizando procesamiento
matemático, en forma similar al análisis descrito en la Patente
Estadounidense No. 5.680.484.
Si se requiere, el computador puede controlar el
proceso completo de la formación de imágenes, emprendiendo el
procesamiento de imágenes para determinar el tamaño del espécimen,
su alineación, si está en foco, etc., y ajustando la posición del
espécimen antes de llevar a cabo la formación de las imágenes en
forma rotacional. Esta automatización completa del proceso de
formación de imágenes es particularmente deseable para proyectos de
mapeo de expresión génica a gran escala en donde muchos de tales
dispositivos podrían estar corriendo en paralelo.
El circuito 60 que responde al computador para
controlar al motor por etapas 42 está comercialmente disponible
para la mayoría de los sistemas más populares de computadores. El
circuito 60 se conecta al computador 50 y es sensible a las señales
del computador 50 para controlar una variedad de dispositivos
mecánicos (motores por etapas, solenoides etc.).
Para crear una representación 3D del espécimen,
el software lleva a cabo las siguientes funciones: (1) determina el
eje de rotación (a través de la simetría que existe entre cada par
de imágenes que fueron tomadas a 180 grados entre sí), (2)
reorganiza el cúmulo de imágenes en una pila ortogonal de imágenes
de proyección (en las cuales, la imagen representa una sección
única a través del espécimen, observada desde todos los ángulos
diferentes capturados), (3) realizar el procesamiento matemático
sobre cada imagen de proyección, para recrear esa sección a través
del espécimen, (4) combinar todas las imágenes de la sección
calculada en un formato 3D. Las reconstrucciones pueden ser creadas
tanto a partir de luz trasmitida como de luz emitida por
fluorescencia.
Ahora que el aparato en general y su uso en la
adquisición de datos han sido descritos, ciertos componentes del
aparato para formación de imágenes serán descritos con más
detalle.
Una vista frontal de la platina rotatoria 10 es
mostrada en la Figura 3. El ajustador de inclinación 36 varía el
ángulo de inclinación de la plataforma 34 alrededor del eje 90 que
está por debajo del extremo inferior del eje 44 y está
aproximadamente a la altura del espécimen a fin de que el ajuste de
la inclinación no mueva sustancialmente al espécimen. El eje 90
puede intersecar al eje óptico 29. El ajuste de la inclinación
(ilustrada por la flecha bidireccional 92 en la Figura 3) asegura
que el eje rotacional 94 del motor por etapas 42 sea exactamente
perpendicular al eje óptico 29. Habiendo ajustado la inclinación de
la plataforma 34, se ajusta la posición de la plataforma 34 con
relación a la base 24 utilizando el ajustador vertical 40 que
utiliza una disposición de bastidor y piñón para subir y bajar la
plataforma 34 en la dirección ajustada del eje de rotación 94. Por
medio del uso de un ajustador vertical 40, se puede bajar un
espécimen que lleva al imán unido al extremo del eje 44 la
profundidad requerida dentro de la cámara de formación de imágenes
para la formación de las mismas y salir de la cámara una vez
formada la imagen. También se puede alterar de esta forma la
posición vertical del espécimen durante la formación de la imagen,
si se requiere. En la posición elevada del eje, los especímenes
pueden ser cargados dentro o fuera de la platina rotatoria.
Cuando el aparato está instalado, se alinea de
tal forma que el eje óptico del microscopio pase a través del
prisma, y a través del centro de la cámara de formación de imágenes.
Sin embargo, con gran aumento la alineación puede necesitar de un
ajuste ya que el espécimen se desplaza ligeramente del centro del
campo de visión. El mecanismo para subir/bajar mencionado
anteriormente puede ser ajustado para corregir esta mala alineación
en la dirección vertical.
Aun cuando muchas de las imágenes del espécimen
pueden ser captadas tomado el eje rotacional aproximadamente
perpendicular al eje óptico, la reconstrucción 3D del espécimen
utilizando el procesamiento matemático será de muy baja calidad a
menos que el ángulo entre el eje óptico y el eje rotacional sea
exactamente de 90º. El ajustador de inclinación 36 permite que el
eje de rotación 94 sea ligeramente inclinado a fin de garantizar
que el ángulo sea exactamente de 90º. El ajustador de inclinación 36
típicamente cuenta con un mecanismo de tornillo roscado para
empujar la plataforma 34 hacia un lado. Se utiliza una muestra de
calibración para ajustar el ángulo de inclinación, con la muestra
de calibración conteniendo una cantidad de pequeñas partículas cuyas
trayectorias pueden ser monitoreadas sobre una pantalla de
computador mientras el eje rota. Si el eje de rotación no está
perfectamente perpendicular al eje óptico, la trayectoria de la
partícula aparece como una elipse, ver la Figura 4(a) que
muestra la vista a lo largo del eje óptico mientras el eje rota
alrededor del eje 94. Cuando el eje está correctamente alineado, se
observa que la partícula se mueve de un lado al otro, sin componente
vertical para el movimiento, ver Figura 4(b).
La Figura 5 muestra el sistema de montaje
magnético utilizado que cuenta con la atracción magnética entre un
disco magnético 110 unido a un espécimen 112 y el imán cilíndrico 46
unido permanentemente al extremo inferior del eje de rotación 44
del motor por etapas 42. Cada espécimen tiene un pequeño disco
metálico magnetizable pegado a un extremo durante la preparación
del espécimen. El disco se une luego al imán cuando se acomete la
obtención de las imágenes y el espécimen es soportado como resultado
de la atracción magnética entre el disco y el imán. Ya que el disco
110 y el espécimen 112 son relativamente livianos, el imán no
necesita estar fuertemente magnetizado para soportar su peso. Una
ventaja del sistema de imán, por ejemplo, sobre un sistema de
atornillado, es que el pequeño tamaño del disco y del espécimen
necesitan ser manejados con fórceps o pinzas. La colocación de la
montura o del disco 110 sobre un imán se hace directamente con el
fórceps, mientras que hacer la unión atornillando no lo es. Otra
ventaja es que la colocación del espécimen con relación al eje de
rotación se puede ajustar fácilmente deslizando la montura 110 a
través de la superficie del imán 120. Muchos especímenes se pueden
preparar previamente también con un disco adherido, y luego
acomodarlo rápidamente en el dispositivo para la formación de las
imágenes cuando se requiera.
Ciertos líquidos utilizados en la cámara para la
formación de las imágenes de la muestra son tóxicos y corrosivos
para el plástico, y cuando este sea el caso, los especímenes se
manejan preferiblemente utilizando fórceps. El sistema magnético de
unión es por lo tanto ventajoso ya que los especímenes únicamente
necesitan ser mantenidos bajo el imán para quedar firmemente
adheridos. Es igualmente fácil remover cada espécimen después de
formadas las imágenes.
Para maximizar la resolución de las imágenes, se
debe centrar una región de interés 122 en un espécimen 112 sobre el
eje de rotación 94, esto es, para que no se mueva mientras gira el
eje. Si la región de interés, o el espécimen completo, está
descentrado y oscila de un lado a otro durante una captura
rotacional de imágenes, entonces la amplificación necesaria para
mantenerlo en foco será baja. Esto está ilustrado en la Figura
6(a). Las dos formas 130, 132 representan al espécimen 112
durante la rotación, y sus posiciones más extremas a la izquierda y
a la derecha. Cuando el espécimen 112 está perfectamente centrado,
rota sobre su propio eje, ver Figura 6(b). Este presenta un
ancho menor a través del campo de visión, y por lo tanto se puede
incrementar la amplificación para proveer una imagen con resolución
más alta, ver Figura 6(c).
El ajuste del espécimen 112 con relación al eje
de rotación 94 se simplifica por medio de la unión magnética.
Empujando sobre el disco 110, se puede balancear con relación al eje
de rotación 94. En la Figura 5(a) la región de interés 122
dentro del espécimen 112 no está centrado sobre el eje de rotación
sino desplazado hacia la izquierda. Si el eje del motor rota 180º,
la región de interés 122 es ahora visible sobre el lado derecho del
eje de rotación, ver Figura 5(b). Debido a que el imán 46
permite que la montura metálica 110 se deslice a lo largo en
cualquier dirección, sin llegar a soltarse, un empujón desde el
costado de la palanca 16 (indicada por la flecha 114 en la Figura
5(c) es capaz de posicionar al espécimen para que la región
de interés 122 se centre sobre el eje de rotación, ver Figura
5(c). Una rotación adicional de 180º muestra que ahora el
espécimen completo 112 oscila de lado a lado mientras que la región
de interés permanece centrada, ver Figura 5(d).
Usualmente se intenta el ajuste del espécimen en
esta forma mientras se observan las imágenes del espécimen en
rotación sobre una pantalla de computador.
Se describirá ahora con más detalle la cámara de
formación de imágenes 26 como se observa en la Figura 1, con
referencia a la Figura 7. Teniendo una cámara fija para el espécimen
que no rota con el espécimen durante la formación de las imágenes,
la cámara no necesita ser cilíndrica para mantener un camino óptico
constante durante la rotación, como para el sistema descrito en la
Patente Estadounidense No. 5.680.484. Una comparación del tubo del
estado del arte 136 y de la cámara utilizada en la presente
invención es mostrada en la Figura 7, donde la Figura 7(a)
muestra una sección transversal a través del tubo cilíndrico del
estado del arte 136 (que está suspendido horizontalmente), y la
Figura 7(b) muestra la cámara 26 utilizada en la presente
modalidad. La cámara para formación de imágenes 26 se escoge
generalmente para que tenga forma en sección transversal de un
paralelepípedo rectangular o de un cuadrado, y esté elaborada en
cuarzo, vidrio u otro material transparente adecuado. Cada
cámara/tubo contiene un espécimen 141 bañado en líquido 143 con
propiedades ópticas adecuadas para permitir la toma de imágenes del
espécimen. Las caras planas 142, 142', 144, 144' de la cámara 26
reducen la distorsión refractiva de la imagen y permiten la
formación de imágenes de especímenes mayores. Esto es debido a que
las paredes mutuamente paralelas 142, 142' de la cámara de sección
transversal cuadrada están alineadas en forma perpendicular al eje
óptico 29 y proporcionan un área de formación de imágenes mayor
sobre la cual no ocurre refracción de la luz contrario a lo que
ocurre con el tubo circular 136, que únicamente tiene una parte muy
pequeña de su circunferencia con incidencia normal para la luz. De
este modo, se puede formar una buena imagen a través de un ancho
superior a 10 mm para la cámara 26, mejorando la cantidad de señal
recibida a partir de la muestra y reduciendo la distorsión debida a
la refracción.
La Figura 7c ilustra una modificación de la
cámara de la muestra de la Figura 7b. En la Figura 7c, la cámara de
la muestra 26' tiene una sección transversal interna cuadrada pero
una de las paredes 140 está provisto con un lente convexo plano
para refractar la luz que sale de la cámara. Esta forma provoca una
refracción deseada, en el caso de la Figura 7c, un efecto de
magnificación.
Se describe ahora con más detalle la palanca 16
mostrada en la Figura 1, con referencia a la Figura 8, que muestra
una vista superior a lo largo de la línea VIII-VIII
de la Figura 1. La Figura 8(a) muestra la palanca 16 en su
posición usual, alejada del imán 46 y de la montura metálica 110 del
espécimen. Si el espécimen está muy desplazado hacia uno de los
costados (como se ilustra) se pude mover la palanca 16 alrededor del
eje de rotación 164 a fin de que la espita 166 se engrane con la
montura metálica 110 para empujar el espécimen hacia la posición
correcta (Figura 8b). Esto se hace mientras se monitorea la posición
del espécimen sobre la pantalla del computador. Ya que el motor por
etapas puede ser controlado cuidadosamente a través de interruptores
manuales, se puede observar la trayectoria del espécimen durante la
rotación y se puede detener el motor cuando el espécimen esté
completamente desplazado hacia un lado. Se centra entonces el
espécimen utilizando la palanca 16, y se repite el proceso hasta
que la alineación del espécimen con relación al eje óptico esté
completa. Se organiza la palanca 16 a fin de producir un movimiento
"engranado hacia abajo" del espécimen, lo que hace más fácil
controlar el ajuste.
El eje de rotación 164 está unido a la platina
principal del motor. Está fijado a la platina por medio de un
soporte que garantiza que la espita 166 esté a la altura correcta
para hacer contacto con la montura metálica, justo por debajo del
imán. De esta forma, la espita 166 permanece a la altura correcta
con respecto a la altura escogida para la formación de imágenes del
espécimen.
La platina rotatoria descrita aquí es adecuada
para microscopía 3D y también para microscopía rotacional para
cualquier propósito, en especímenes biológicos y especímenes de
otros campos tal como en ciencia de materiales.
Cuando se emprende una microscopía 3D, el índice
de refracción debe ser uniforme en todo el espécimen. Para un
tejido biológico, esto se logra fácilmente colocando el espécimen en
un baño con solvente aclarador. Un espécimen puede ser adherido
directamente sobre la montura metálica, o embebido en un bloque de
una matriz transparente tal como agarosa, que se adhiere por si
misma a la montura. El solvente aclarador permea entonces los
bloques así como al espécimen. BABB (una mezcla de alcohol bencílico
y benzoato de bencilo) es adecuada como solvente.
Para un espécimen cuyo índice de refracción no
puede ser uniforme, o que no sea transparente, la técnica sigue
siendo útil. La forma 3D de la superficie de los objetos cuyas
secciones trasversales son todas convexas (aún si la forma 3D
completa no es convexa) se puede recrear en forma precisa a partir
de su silueta en rotación.
Existen algunas aplicaciones donde los datos en
bruto del aparato son útiles. La serie de imágenes puede ser
convertida en una película del objeto en rotación (esto es, el
espécimen). Es mucho más fácil ver la forma de un objeto 3D cuando
es observado en rotación que a partir de unas pocas imágenes
estáticas en 2D (muchos proyectos de reconstrucción 3D presentan
sus resultados como películas de un modelo en rotación).
El aparato también es adecuado para emprender el
mapeo 3D de los patrones de expresión génicos (distribución de ARN
y/o de proteína) en tejido biológico, al mismo tiempo que se permite
que el espécimen sea utilizado para otros análisis después de la
obtención de las imágenes. La formación de imágenes del espécimen
utilizando el aparto es relativamente rápida, tomando alrededor de
20 minutos. En contraste, preparar, embeber, seccionar, montar,
colorear y digitalizar secciones reales de histologías toma días y
produce cientos de secciones digitales en 2D, pero no garantiza la
forma de alinearlas con otras para recrear la forma 3D original. Las
secciones histológicas tienden a estirarse significativamente, de
tal manera que aún si todas las secciones pueden acomodarse unas
sobre otras para crear una forma 3D, el resultado tridimensional no
reflejará en forma precisa la forma del espécimen original. Sin
embargo, los resultados obtenidos utilizando el aparato son muy
similares a la forma física real del espécimen, siendo la única
diferencia con las secciones físicas una resolución reducida. Ya
que los datos generados por el aparto son genuinamente 3D pueden ser
reseccionados en forma virtual en cualquier orientación, o
suministrados en 3D.
Una construcción modificada de una platina
rotatoria es ilustrada en la Figura 9 donde las partes
correspondientes a aquellas de la Figura 1 llevan los mismos
números de referencia. En la platina rotatoria de la Figura 9, el
ajuste tridimensional de la posición del motor en etapas 42 se logra
por medio del uso de tres motores secundarios por etapas 150, 152,
154. No está presente un ajustador de inclinación para el motor 42.
En vez de eso, el prisma puede ser manualmente ajustado por medio
de inclinación controlada alrededor de un eje horizontal
transversal 23. Los motores importantes por etapas son los motores
150 y 154. El motor 152 puede ser reemplazado por un ajustador
vertical manual 40.
Los motores secundarios por etapas 150, 152, 154
permiten al ajuste con una precisión por debajo de la micra de la
posición 3D del motor primario por etapas 42, a lo largo de las
orientaciones marcadas como x, y y z. Estos motores por etapas 150,
152, 154 son controlados por el mismo computador que controla al
motor primario 42. Esto está ilustrado en la Figura 10 donde el
computador 50 dirige a los cuatro motores a través de los circuitos
156 que dirigen al motor. Para el propósito de este documento, el
eje z se considera paralelo al eje óptico 29. Los movimientos a lo
largo de este eje alteran efectivamente el enfoque del sistema. Los
movimientos a lo largo de los otros dos ejes alteran aquella parte
del espécimen que coincide con el centro del eje óptico 29.
El traslado controlado por computador por medio
de los tres motores secundarios 150, 152, 154 tiene las siguientes
ventajas:
- 1)
- Permite que la región de interés (ROI) del espécimen se mantenga centrada dentro del campo de visión del microscopio. Esto se logra de dos formas:
- (a)
- La ROI se mantiene dentro de la profundidad de foco del microscopio.
- (b)
- Limita los movimientos oscilatorios "lado a lado" de la ROI a lo largo del eje x.
- Estas dos ventajas permiten una formación de imágenes con resolución mucho más alta en comparación con un sistema que no tenga tal mecanismo.
- 2)
- Es más preciso que el sistema de palanca y espita de las Figuras 1 y 8.
- 3)
- Puede ser controlado completamente por medio del computador (a diferencia del sistema de palanca y espita), de tal manera que la ROI puede ser fácilmente definida "sobre la pantalla" dentro del software.
- 4)
- Le permite al computador calcular las coordenadas 3D precisas para la ROI.
- 5)
- Permite relacionar entre sí diferentes barridos dentro del mismo espécimen en el espacio 3D.
- 6)
- Esto permite que el computador haga un barrido con alta definición de un espécimen grande a partir de múltiples barridos automáticos de regiones más pequeñas con una magnificación mayor (conocida como "embaldosado" o "parcheo").
Los movimientos en x y en y controlados por
computador para mantener la ROI dentro del campo de visión se
calculan de la siguiente manera:
Primero, el software necesita calcular las
posiciones de:
- (a)
- El eje de rotación del motor primario por etapas 42 con relación al campo de visión.
- (b)
- La ROI con relación al eje de rotación del motor primario por etapas.
Estas dos posiciones se pueden calcular a partir
de una operación. Se establece la magnificación lo suficientemente
baja de tal forma que durante una rotación completa de la ROI
permanezca dentro del campo de visión de la cámara. El sistema se
calibra previamente de tal manera que se sepa cuantos pulsos del
motor por pasos x corresponden a un desplazamiento dado medido en
pixeles sobre la pantalla del computador. Se determina la relación
para cada aumento. El computador le presenta entonces al usuario
cuatro imágenes del espécimen, rotadas 0, 90, 180 y 270 grados (como
se observa en las Figuras 11a a 11c). En la Figura 11a, cada
rectángulo externo representa la ventana para la formación de la
imagen sobre la pantalla del computador y el punto representa la
región de interés 122 del espécimen.
La Figura 11b muestra vistas a lo largo del eje
óptico (como se observan sobra la pantalla del computador) para
baja magnificación, y la Figura 1c muestra vistas superiores a lo
largo del eje de rotación 94. El usuario utiliza entonces el ratón
del computador (o un equivalente) para indicar donde esta la ROI en
cada imagen.
La Figura 12 muestra como el sistema de
posicionamiento puede mover el motor por etapas 42 tanto en la
dimensión x como en la y, y puede por lo tanto compensar la ROI que
está descentrada. Los movimientos en x y en y del motor por etapas
42 se controlan por medio del computador para garantizar que la ROI
12 permanezca en una posición fija, rotando alrededor de un eje
efectivo de rotación.
En las Figuras 11a, 11b y 11c:
\chi^{1} = la posición en x de la ROI a 0
grados, convertida en unidades del motor por etapas.
\chi^{2} = la posición en x de la ROI a 180
grados, convertida en unidades del motor por etapas.
\chi^{w} = el ancho de la ventana para la
formación de imágenes, convertida en unidades del motor por
etapas.
El promedio de \chi^{1} y \chi^{2}
suministra la posición (\chi^{S}) del eje de rotación del motor
por etapas con relación a la ventana para formación de las imágenes
(\chi^{S}). El promedio de Z1 y Z2 proveen un segundo estimado
de esta posición (\chi^{S} = (\chi^{1} + \chi^{2} + Z1 +
Z2)/4).
El desplazamiento en x que sería necesario para
centrar el eje de rotación del motor por etapas dentro de la ventana
para la formación de imágenes es:
Desplazamiento
en X (\chi^{d}) = \chi^{w/2} - (\chi^{1} + \chi^{2}
+ Z1 +
Z2)/4
Esto se ilustra en las Figuras 13a y 13b.
En las Figuras 13a y 13b, el microscopio
observa al espécimen desde el fondo del diagrama. Por lo tanto los
bordes del campo de visión aparecen como dos líneas sustancialmente
paralelas, que indican los límites de lo que puede ser observado.
El eje óptico, que es el centro de este campo de visión, es mostrado
como una línea discontinua en la Figura 13a.
La Figura 13b muestra al espécimen en una
posición rotacional de 0 grados (\alpha = 0). A partir de las
mediciones descritas en la página anterior (\chi^{1},
\chi^{2}, Z1, Z2), se pueden calcular fácilmente las
distancias x y z de la ROI a partir del eje de rotación del motor
primario por etapas. \chi^{\alpha o} es la distancia en x
cuando la posición rotacional (ángulo \alpha) es cero
(\chi\alphao = (\chi^{1}-\chi^{2})/2).
En forma similar, Z\alphao se puede calcular a partir de las dos
mediciones tomadas con \alpha = 90 grados y con \alpha = 270
grados, (Z\alphao = (Z1-Z2)/2). La posición de la
ROI puede ser convertida entonces de coordenadas cartesianas a
coordenadas polares donde D es la distancia de la ROI desde
el eje del motor por etapas, y es el ángulo de aquella línea hasta
el eje óptico (o una línea paralela a ella), cuando = 0 grados.
D = raíz
cuadrada de (\chi\alphao^{2} + Z\alphao^{2}) \theta =
tan^{-1}
(\chi\alphao/Z\alphao)
Ahora, para cualquier posición rotacional del
motor primario por etapas (\alpha) la ROI se puede posicionar
sobre el eje óptico por medio de movimientos de los motores
secundarios por etapas para x z, en los cuales los desplazamientos
totales (\chit y Zt) se calculan por medio de.
\chit =
\chid + D. sen (\alpha + \theta),
\hskip1cmy
\hskip1cmZt = D.cos (\alpha + \theta).
La forma 3D de la región muestreada de una
reconstrucción por OPT es sustancialmente un cilindro con una
sección transversal circular, cuyo eje de simetría rotacional es el
eje efectivo de rotación utilizado durante la formación de las
imágenes, y cuyo diámetro y longitud se describen por el ancho y la
altura del campo de visión. Ya que podemos alternar entre
coordenadas cartesianas y polares para describir posiciones dentro
del espécimen, y que podemos relacionar los tamaños de los pixeles
con distancias reales dentro del espécimen, podemos calcular
fácilmente la posición y la forma del cilindro de la muestra con
relación a cualquier otro de los barridos realizados del mismo
espécimen.
En la formación de imágenes 2D, a menudo se
construye una imagen de alta resolución tomando muchas imágenes con
alta magnificación de pequeñas regiones del objeto, y luego se unen
las pequeñas imágenes juntas. Esto es a menudo conocido como
"embaldosado" o "parcheo". La platina XYZ controlada por
computador permite aplicar la misma aproximación a la formación de
imágenes por OPT en 3D.
Como se describió anteriormente, la región
muestreada de un barrido por OPT es un cilindro con sección
transversal circular. La Figura 14 ilustra, en una vista superior
que mira hacia abajo a lo largo del eje 94, como se puede formar la
imagen de un espécimen 160 en un barrido 162 con baja resolución, o
alternativamente se podría formar la imagen posicionando siete
barridos de alta resolución 170 de tal manera que cada posición
dentro del espécimen esté contenida al menos dentro de una región
muestreada. Ya que las regiones individuales de la muestra tienen
una sección transversal circular, una disposición eficiente para
cubrir una región grande es disponer los barridos en un patrón
hexagonal, con un ligero solapamiento entre los barridos adyacentes.
Las diferentes posiciones a lo largo del eje y del espécimen pueden
también ser muestreadas utilizando el motor por etapas del eje
y.
Este proceso de embaldosado puede ser controlado
y realizado completamente por el computador.
Para todos los especímenes de los cuales se
formarán imágenes completas con un barrido, el cálculo de la
posición de la región muestreada óptima se puede hacer
automáticamente sin la necesidad por parte del usuario de
identificar la ROI como se describió previamente. El procesamiento
simple de las imágenes puede hallar el contorno o el centro del
espécimen dentro de las imágenes del ensayo durante el proceso de
alineación, de la siguiente manera:
- 1)
- Establecer una magnificación muy baja (puede hacerse automáticamente utilizando un microscopio controlado por computador).
- 2)
- Tomar cuatro imágenes con una rotación de 0, 90, 180 y 270 grados.
- 3)
- Calcular un histograma de cada imagen para determinar un nivel de umbral adecuado para distinguir al espécimen del fondo.
- 4)
- Calcular la posición del centro de masa del espécimen en cada imagen.
- 5)
- Utilizar estas posiciones como las mediciones de la ROI como se describió previamente.
- 6)
- Aplicar los nuevos desplazamientos durante cualquiera de las rotaciones posteriores.
- 7)
- Incrementar la magnificación.
- 8)
- Tomar cuatro imágenes rotadas y determinar si la magnificación es muy alta (esto es, si los bordes del espécimen están por fuera del campo de visión).
- 9)
- Si el espécimen está aún dentro del campo de visión regresar a la etapa 4.
- 10)
- Si los bordes del espécimen están por fuera del campo de visión, reducir la magnificación hasta el valor anterior.
- 11)
- Hacer u barrido del espécimen.
Un medio colimado de iluminación, que puede ser
utilizado en la platina rotatoria de la Figura 1 o de la Figura 9,
se ilustra en las Figuras 15 y 16.
Se utiliza un láser u otra fuente de iluminación
172 junto con un medio de enfoque (ya sea lentes refractivos 174 o
espejos de reflexión) para generar un haz de luz 176 en el cual
todos los rayos de luz sean sustancialmente paralelos al eje
óptico. La Figura 15 ilustra este dispositivo en relación con el
resto de la platina rotatoria que, en este ejemplo, tiene dos
motores por etapas 150, 154 para ajuste controlado por computador en
las direcciones x y z, respectivamente. El ajuste vertical se
efectúa manualmente por medio de un ajustador vertical 40. El lente
22 es capaz de ajustar la inclinación alrededor del eje 23.
Como resultado de los experimentos, es claro que
la luz para iluminación que entra al espécimen en forma no paralela
al eje óptico introduce ruido en los resultados. Una fuente de luz
colimada, donde, todos los rayos de luz para iluminación son
paralelos al eje óptico, reduce este problema y por lo tanto
incrementa la calidad de la imagen.
Con relación a la Figura 17, se coloca un filtro
de longitud de onda 178 en algún sitio entre la fuente de luz 180 y
el espécimen 28. Este puede consistir ya sea de una serie de filtros
diferentes, cada uno permitiendo la trasmisión d diferente rango de
longitudes de onda, que pueden ser posicionados manual o
automáticamente en el paso de luz. O puede ser un filtro
sintonizable electrónicamente.
Alternativamente, se pueden utilizar dos filtros
de cristal líquido sintonizables electrónicamente para formación de
imágenes fluorescentes para restringir las longitudes de onda tanto
de la luz de iluminación como de la luz detectada, siendo esto
posiblemente ilustrado por el segundo filtro eléctricamente
controlado 182 ubicado en frente de un arreglo de detectores de luz
184 en 2D.
Un compuesto químico dado absorberá diferente
longitudes de onda con diferentes grados de eficiencia. Estas
diferencias pueden ser representadas como un espectro (que describe
la absorción para un rango amplio de longitudes de onda). La
mayoría de los especímenes consiste de diferentes distribuciones
espaciales de diferentes compuestos químicos, y por lo tanto se
forman imágenes óptimas de diferentes especímenes utilizando
diferentes longitudes de onda (o combinaciones de longitudes de
onda). El sistema de filtros descrito le permite al usuario alterar
que longitudes de onda son utilizadas para formar la imagen de un
espécimen dado.
En forma similar, los compuestos químicos
fluorescentes poseen un espectro que describe la eficiencia de
longitudes de onda diferentes para excitarlos, y un segundo
espectro que describe la abundancia de diferentes longitudes de
onda emitidas por fluorescencia. El uso de dos filtros controlados
electrónicamente produce (al menos) un espacio de parámetros 2D
para las posibles combinaciones de excitación y de emisión. Tal
sistema permite la exploración de combinaciones óptimas para
distinguir entre diferentes compuestos químicos. Esto permite la
formación de imágenes de histología en 3D de muestras biomédicas sin
la necesidad de colorantes específicos.
Se apreciará que una platina rotatoria no
incluye necesariamente un prisma 22, y tampoco necesita que la
platina rotatoria sea utilizada con un microscopio estándar
vertical. La Figura 18 ilustra una modificación del arreglo de la
Figura 15. En la Figura 18 (donde las partes correspondientes a
aquellas de la Figura 15 presentan los mismos números de
referencia), la luz que emana de la cámara 26 entra a la óptica del
microscopio y a una cámara digital, dejando una corta distancia de
trabajo entre el objetivo del microscopio 30 y el espécimen.
El espécimen se puede colocar por medio del uso
de una platina de traslación transportada por medio del eje 44. La
platina de traslación tiene un ajuste manual o controlado por
computador en las direcciones x y z.
\vskip1.000000\baselineskip
Este listado de referencias citado por el
solicitante es únicamente para conveniencia del lector. No forma
parte del documento europeo de la patente. Aunque se ha tenido gran
cuidado en la recopilación, no se pueden excluir los errores o las
omisiones y la OEP rechaza toda responsabilidad en este sentido.
- \bullet US 5680484 A [0002] [0002] [0019] [0031]
- \bullet US 5710625 A [0004]
\bullet M. ALMQUIST y colaboradores,
Ultrasonics, 1999, vol. 37, 343-353
[0003].
Claims (12)
1. Un aparato de tomografía de proyección óptica
(OPT) que incluye una platina rotatoria (10) y una cámara de
formación de imágenes para uso en la formación de imágenes de un
espécimen a partir de una pluralidad de direcciones, comprendiendo
la platina rotatoria un medio de soporte para el espécimen que
incluye una pieza rotatoria (44) que puede ser operada para rotar
un espécimen para la formación de imágenes alrededor de un eje de
rotación (94) en forma trasversal a un eje óptico (29) a lo largo
del cual la luz es emitida desde el espécimen, caracterizado
porque:
- (a)
- el eje de rotación (94) es vertical o sustancialmente vertical,
- (b)
- el medio de soporte para el espécimen está dispuesto por encima de la cámara para formación de imágenes (26) para recibir al espécimen inmerso en un fluido óptico para formación de imágenes dentro de la cámara, y
- (c)
- la cámara para formación de imágenes es estacionaria.
2. Un aparato de OPT de acuerdo con la
reivindicación 1, en donde la cámara para la formación de imágenes
(26) tiene al menos una superficie plana que es perpendicular al eje
óptico.
3. Un aparato de OPT de acuerdo con la
reivindicación 1 ó 2 y que incluye un prisma (22) posicionado sobre
el eje óptico (29) a fin de recibir la luz emitida por el
espécimen, el prisma (22) actuando para desviar la luz hasta 90º
para permitir que la luz sea recibida por un microscopio (12) con
un eje óptico vertical.
4. Un aparato de OPT de acuerdo con la
reivindicación 3, en donde el prisma (22) es ajustable en posición
alrededor de un eje horizontal perpendicular al eje óptico (29) que
es también horizontal.
5. Un aparato de OPT de acuerdo con cualquiera
de las reivindicaciones precedentes, en donde la pieza rotatoria
(44) es ajustable en posición para ajustar el eje de rotación
alrededor de un eje horizontal de ajuste (90) perpendicular al eje
óptico (29).
6. Un aparato de OPT de acuerdo con la
reivindicación 5, en donde el eje de ajuste horizontal (90) está por
debajo del extremo inferior de la pieza rotatoria (44) para
garantizar que cualquier ajuste horizontal provoque una traslación
mínima del espécimen.
7. Un aparato de OPT de acuerdo con cualquiera
de las reivindicaciones precedentes, en donde la pieza rotatoria
(44) es ajustable por traslación a lo largo de una dirección
alineada con el eje de rotación (94), para permitir que el medio de
soporte para el espécimen sea movido entre una posición operativa
abatida y una posición ineficaz elevada en las cuales se pueden
cargar o descargar los especímenes de la platina rotatoria.
8. Un aparato de OPT de acuerdo con cualquiera
de las reivindicaciones precedentes, en donde la pieza rotatoria
(44) es el eje de salida de un motor por etapas (42) montado sobre
una plataforma (34) de posición ajustable.
9. Un aparato de OPT de acuerdo con cualquiera
de las reivindicaciones precedentes, en donde el extremo inferior
de la pieza rotatoria (44) está formado para permitir que el
espécimen sea colgado o suspendido, o hacia abajo dependiendo del
extremo inferior de la pieza rotatoria.
10. Un aparato de OPT de acuerdo con cualquiera
de las reivindicaciones precedentes y que incluye una fuente
colimada de luz para producir un haz de luz en el cual todos los
rayos de luz son sustancialmente paralelos al eje óptico y que, en
uso, ilumina al espécimen.
11. Un aparato de OPT de acuerdo con cualquiera
de las reivindicaciones precedentes y que incluye un filtro de
longitudes de onda para restringir la longitud de onda de la luz que
ilumina al espécimen.
12. Un aparato de OPT de acuerdo con cualquiera
de las reivindicaciones 1 a 10 y que incluye dos filtros de
longitudes de onda, especialmente un primer filtro para restringir
la longitud de onda de la luz que ilumina al espécimen y un segundo
filtro para restringir la longitud de onda de la luz que emana del
espécimen y antes de la detección.
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