CN100483132C - 光学投影体层摄影术 - Google Patents
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Abstract
用于通过光学投影体层摄影术获得样本(6)的图像的装置,该装置包括光扫描器,如光线扫描共焦显微镜(1,2,3),用于对所述样本(6)进行入射光的扫描运动。
Description
发明领域
本发明涉及光学投影体层摄影术。
发明背景
光学投影体层摄影术是用于产生样本的三维图像的技术,这种技术的一个例子披露于申请人的公开说明书WO 02/095476中。本发明的目的是提供一种将光线照射在所述样本上的不同方式,特别是在荧光显像时使用,其目的是减弱系列图像中的噪音或干扰,并且在所述系列的图像中提供改善了的景深。
发明概述
根据本发明的一个方面,提供了用于通过光学投影体层摄影术获得样本图像的装置,该装置包括光扫描装置,以及用于将所述样本旋转到标明的位置的旋转台,在每一个位置上,将所述样本用于通过所述扫描装置进行入射光的扫描运动。
可以沿垂直于由通过所述装置的光线限定的光轴的方向对所述入射光进行扫描。
所述光扫描装置可以构成共焦扫描显微镜的一部分。
根据本发明的另一方面,提供了通过光学投影体层摄影术获得样本图像的方法,该方法包括用光束扫描所述样本,以及检测由所述样本发出的光线,以便形成所述图像。
所述检波器优选检测平行于入射在所述样本上的光束地离开所述样本或绕过所述样本的光线。
所述入射光优选是以光栅形式扫描的,在所述样本的每一个标明的位置上进行一次完整的扫描。
根据本发明,在本发明中使用的样品可以按照以前的专利申请所披露的方法制备和/或采用本领域技术人员所熟知的病理学和组织学技术和方法制备。
例如,原位杂交(特别适用于检测RNAs):Hammond K L,HansonI M,Brown A G,Lettice L A,Hill R E“哺乳动物和果蝇属达克斯猎犬基因与Ski原型致癌基因相关,并且是在眼睛和肢体中表达的”。Mech Dev.1998 Jun;74(1-2):121-31。
免疫组织化学(特别适用于检测蛋白和其他分子):Sharpe J,Ahlgren U,Perry P,Hill B,Ross A,Hecksher-Sorensen J,BaldockR,Davidson D。“光学投影体层摄影术作为3D显微术和基因表达研究的工具”Science.2002 Apr 19;296(5567):541-5。
可以理解的是,在不超过本发明范围的前提下,可以对本发明进行改进。
附图的简要说明
下面将结合附图以举例形式对本发明进行说明,其中:
图1是构成本发明的优选实施方案的装置的图解,
图2a和2b所述装置的光学器件如何安装以具有小数值孔径或大数值孔径,
图3表示已知的成像光学器件,
图4和5表示本发明装置的光学系统的成像光学器件,
图6a,6b,6c和6d表示本发明装置的光学系统的典型的光路,
图7a,7b和7c表示不同程度的折射如何影响所述光学系统的工作,
图8表示如何利用一维布置的检波器测定折射,和
图9-12以三维形式说明所述光学系统的工作。
附图的详细说明
参见图1,所述装置包括光源1(激光形式的光源),由它为二维光扫描装置2提供光线,它的扫描机构具有复式反射镜系统。具有扫描运动的光线是通过成像光学器件3输入的。放置在光源1和扫描装置2之间的分色镜4将回光导向高速光检波器5。所述部件1-5可以通过共焦光学扫描显微镜提供。
来自光学器件3的光线通过在旋转台7内旋转并且由它支撑的样品6,旋转台7的结构相当于在申请人的再审批的国际专利申请号PCT/GB02/02373中所披露的旋转台。由旋转台7将样本6旋转到一系列标明的位置,在每一个位置上对激发光进行一次完整的扫描,同时所述样本是静止的。在所述光线通过样本6之后,通过光学系统8对它进行处理,由该系统将所述光线导向高速光检波器9的一维或二维阵列。
在荧光模式下,来自样本6的光线通过光学器件3和扫描装置2,并因此通过镜片4返回高速光检波器5。在这种荧光成像方法中,激发光进入所述样本的一侧,并且在被检测之前从它的同一侧离开所述样本。在将要说明的透射模式下,使用了在图1中的旋转台7右侧示出的部件。
显微镜光学器件3可以具有大的数值孔径(图2a)或可以调整到具有小的数值孔径(图2b),可将它用于要成像的某些样本。
图3表示已知的成像系统。收集来自所述共焦平面12上的任意点的光线(在所述样本内),并且通过透镜13向像平面14上的一个点折射。存在对称性,因此在像平面14上的任何点都映射到焦平面12上的一个点,反之亦然。
相反,在图4和5中所示出的本发明的"非焦点"光学器件中取消了对成像光学装置的需要,所述附图没有显示这种对称性。非焦点光学系统8是通过凸透镜15表示的。来自焦平面12上的单个点的光线不会聚焦到单个光检波器上。它是分散的,因此只有平行于所述入射光束地离开或绕过样本6的光线会到达位于所述光轴上的单一的光检波器9a。透镜15在图4和5中的作用与在图3中的作用不同。它在光扫描状态下起作用。所述光束从所述样本上扫描通过(例如,以光栅形式),通过多个不同的位置(在图5中以黑色箭头形式示出了其中的五个位置)。非焦点光学系统8(即透镜15)的作用是将光线导向所述单一的光检波器9a,不管所述光束的扫描位置如何,离开或绕过所述样本的光线平行于入射光束。在会导致光线的明显散射的样本中,所述系统可以通过限制散射光的检测获得较高的信噪比。
图6a-6d表示散射,作为显示来自原始光束位置的偏差的例子,表示从样本6中发出的同时通过所述非焦点光学系统的射线(来自激光光束)的某些典型的光路。从左侧接近所述样本的光束是入射在所述样本上的光束。
在图6a中,从样本6的中央点散射的光线被从所述光检波器9a移开。可以通过改变所述检波器的有效尺寸来调整被检测到的散射线的比例。可以用可调整的光圈进行这种控制(它非常类似于扫描共焦显微镜上的针孔)。或者,可以调整所述透镜的位置,以便导致所述散射线的更多或更少的发散。在光学成像系统中,艾里环是由从所述样本里的单个点发射的光线产生的干涉图。能产生较大艾里环的光学系统具有较低的分辨能力,因为来自所述样本里的相邻的点的艾里环会重叠。艾里环的概念并不严格地与这样的投影测定系统相关,不过,不存在类似的概念。对于本文所披露的非焦点光学器件来说,来自每一次透射的光线产生了类似于宽的艾里环的非常宽的强度分布(在所述检波器的位置上),这可能暗示了它具有低的分辨能力。不过由于在任何时间只能测定单次投影,因此即使是很宽的分布也不会相互干扰。
在图6b中,来自沿图6a中相同的线取样的其他点的散射线同样是从光检波器9a上发散的。
在图6c中,来自不同的扫描位置的非散射光(黑色箭头)是从样本6中大体上平行于所述光轴发射的,并因此被折射朝向光检波器9a。如图6a和6b所示,散射线被引导离开检波器9a。
在图6d中,来自任何扫描位置的非散射线被导向光检波器6。箭头表示当所述激光束沿垂直于光轴的方向扫描通过样本6时它的连续的位置。
迄今为止,用光学投影体层摄影术进行的所有实验都表明了尽管某些光线被散射了,但所述样本的折射率是一致的。最新的实验业已证实,多种重要的样本(包括生物活组织检查的医学成像)具有不一致的折射率。这意味着现有的算法不能够精确地使样本成像,并且导入了扭曲和假像。所披露的装置通过测定以前无法获得的与光线离开所述样本的光束的角度相关的信息,减轻了这一问题。一般来说,在具有低投影,但是不一致的折射率的分布的样本中,该系统可以通过测定每一次透射所经历的折射度计算这种不一致的分布。
在本装置的使用中,采用了澄清器(如BABB),以便大部分光线不会被散射。不过,它会遇到不同形式的破坏-折射。在图7中,散射线是通过虚线表示的,而所述主要光路是用实线表示的。在图7a所示的第一种实施例中,该光路在它通过样本6时没有弯曲(它只是在通过所述透镜时折射)。主要光路以比其余部分(灰色圆形)高的折射率通过所述样本区,不过,它在具有不同的折射率的区域之间遇到的界面都是垂直于所述光路的,因此不会发生折射。
在图7b所示出的第二种情形下,发光光束略高一些,因此它在所述样本的灰色区和白色区(不同的折射率)之间所遇到的界面略微偏离垂直。由此导致了所述主要光路的两种轻微的折射,因此,当所述光线从所述样本上发出时,它不再平行于所述入射光束,并且被导向略微偏移到原始中央光检波器9a的侧面。如果将辅助光检波器9b安装在中央检波器9a的任意一侧,这些辅助检波器能够测定折射度。任何投影都能提供沿光检波器阵列的某种强度分布。可将所述强度分布用于确定从所述样本上发出的主要光路的角度。该系统只需要确定该分布的中点在哪里(通常是最大强度的点),以便测定从所述样本上发出的主要光路的角度。在图7c所示出的最后一种情形下,不同的扫描位置导致了所述光束的更大的折射,它是在沿检波器阵列的进一步移动中反射的。
在图8中,样本6的椭圆形区具有比其余部分高的折射率(灰色形状)。从所述样本周围通过的射线没有被折射,因此被导向中央光检波器9a。从样本中央通过的射线(在图8中的中央的两条射线11)被折射了两次。所述光线通过的两个界面(白色-灰色以及灰色-白色)是彼此平行的,并且所述光线因此是与它们进入样本相同的角度离开样本的。这些光线同样被导向中央检波器9a。从灰色区的其他部分通过的射线同样被折射了两次,但是,没有通过平行界面,因此,这些射线是通过相邻的光检波器9b检测的。
某些光线会被折射,但仍然平行于入射光束离开样本6这一事实不再是问题。图8的实施例仅表示通过这一部分产生的多次投影中的一种。完整的成像包括捕捉通过所述部分的很多取向的这样的数据组,并且所有这样的数据的组合可以完整地重建所述分布。
图9-12表示所述装置的三维示意图。在图9中,所有通过所述样本的二维部分的未折射的(和非散射的)射线被聚焦到所述阵列的中央光检波器上。样本6绕所标明的位置之间的垂直轴线旋转,在每一个位置上进行一次完整的扫描。
图10表示照射到辅助光检波器上的散射光或折射光的光路。
图11表示使得检波器9的一维阵列能够从所述样本的完整的二维光栅扫描获取数据的透镜(或光学系统)。将一排扫描位置总是导向所述检波器排的上或下,不考虑所述扫描的垂直高度。
如图12所示,可以用光检波器9的二维阵列取代一维阵列。这样就能够测定在由图12所示出的光线所占据的平面上面或下面散射或折射的光线。
在现有的广角光学投影体层摄影术中,CCD的每一个像素应当记录来自通过所述样本的近似投影的信息。广角荧光光学投影体层摄影术存在由于以下事实所造成的问题:所述样本的发光/激发同样必须是广角的。如果所述样本的光学特性导致了光线的内部散射,很多光子会沿射线轨道离开所述样本,导致它们被不能代表来自产生所述光子的投影的像素检测。由此明显增加了图像的噪音。这里所披露的本发明的光扫描发明避免了这一问题,因为只有在所述近似投影内的荧光颗粒是在所有时间都被激发的。
来自检波器阵列9的光学器件的数据是通过算法解读的。
业已存在多种用于进行背投计算的多种不同的运算方法,一种方法是利用标准的线性滤波的背投算法(如在美国专利5680484中所披露的)。其它方法包括迭代的,最大平均信息量和代数重建技术(R.Gordonet al.,“构成投影的三维重建:程序的算法”。
所述算法是按以下方式运行的:
1.将所述数据作为平行(或扇形波束)数据使用,以便实施背投。这产生了对所述样本的吸收特征的分布的“模糊”评估,或对所述样本荧光的模糊分布的评估。
2.评估了折射率分布的第一个近似值。这一目的可以通过多种方式实现。一种有用的方法是假设所述吸收或荧光分布能体现折射率的分布。在每一个部分计算每一个体元的2-D梯度向量。一种替代方案是以均匀的或随机的分布开始的。
3.将估算的折射分布用于进行向前投影,即,如果所述折射分布的初步评估是正确的话,所述投影数据会怎样的预测。
4.比较预测的投影和实际投影。
5.修改估算的折射分布。在预测的和实际的投影之间具有较大差别的投影鉴别了哪一个分布区需要进行更多的修饰。例如,对于图8中的灰色形状来说,来自椭圆形的弯曲末端的投影因为具有大量的折射而与所述预测有很多不同。因此,在所述部位的体元的预测的折射率的改变比其他部分更大。
6.重复从3到6的循环,直到不再能够对所述预测的投影做出进一步的改进。
还可将上述算法用于解释其他光学信号,例如,荧光或散射。
可以理解的是,在不超出本发明范围的前提下,可以对本本发明进行改进。
Claims (10)
1.用于通过光学投影体层摄影术获得样本(6)的图像的装置,该装置包括光源(1),和用于将所述样本(6)旋转到一系列标明的位置的旋转台(7),在每一个位置上,使所使用的样本暴露于来自光源的入射光,其特征在于所述装置包括光扫描装置,该扫描装置使一束入射光进行扫描运动,从而使样本(6)在每一标明的位置经受扫描运动,由此使入射光束运动通过所述样本。
2.如权利要求1的装置,其中,沿垂直于光轴的方向对所述入射光进行扫描,然后让所述光束通过该装置。
3.如权利要求1或2的装置,其中,所述入射光是以光栅形式扫描的,在所述样本的每一个标明的位置上进行一次完整的扫描。
4.如权利要求1或2的装置,其中,所述光扫描装置构成了共焦扫描显微镜的一部分。
5.一种通过光学投影体层摄影术获得样本(6)的图像的方法,包括将来自光源(1)的光束导向样本(6),所述样本(6)由旋转台(7)支撑进行旋转运动,旋转台(7)旋转样本(6)到一系列标明的位置,在每一个位置上,使样本(6)暴露于入射光束,其特征在于在每一标明的位置,所述样本(6)被运动通过所述样本(6)的光束扫描。
6.如权利要求5的方法,其中,所述光束在被检测之前通过所述样本。
7.如权利要求5的方法,其中,所述光束从所述样本的一侧进入,并且从它的同一侧离开所述样本。
8.如权利要求5-7中任意一项的方法,其中,所述样本被旋转到标明的位置上,并且在所述样本的每一个标明的位置上进行一次完整的扫描。
9.如权利要求5-7中任意一项的方法,其中,检波器检测离开所述样本或绕过所述样本的光束,该光束平行于入射在所述样本上的光束。
10.如权利要求5-7中任意一项的方法,其中,所述光束是激光。
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Title |
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OPTICAL PROJECTION TOMOGRAPHY ASA TOOLFOR3DMICROSCOPY AND GENEEXPRESSION STUDIE. SHARPE J ET AL.SCIENCE,Vol.296 . 2002 |
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WO2004020996A1 (en) | 2004-03-11 |
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JP2005537472A (ja) | 2005-12-08 |
CA2493713A1 (en) | 2004-03-11 |
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