JP2004125706A - 相互反応作用検出方法及びバイオアッセイ装置、並びにバイオアッセイ用基板 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】セル検出部2において、カンチレバー13の端面13aは予め表面処理が施されており、検出用ヌクレオチド鎖Dを固定化可能とされている。反応領域10には正電極11及び負電極12によって電界が生じており、ノズル3から滴下された標的ヌクレオチド鎖Tは、伸長したまま端面13aの方向に移動する。検出用ヌクレオチド鎖Dと標的ヌクレオチド鎖Tとがハイブリダイゼーションするとカンチレバー13の質量が増加するため、固有振動数が低下する。そこで、カンチレバー13に交流電圧を印加して固有振動数変化を測定することで、ハイブリダイゼーションの有無を検出すると共に、ハイブリダイゼーションした標的ヌクレオチド鎖Tの本数等を定量的に検出する。
【選択図】 図2
Description
【発明の属する技術分野】
本発明は、バイオインフォマティクス(生命情報科学)分野において特に有用な相互反応作用検出方法及びバイオアッセイ装置、並びにバイオアッセイ用基板に関する。
【0002】
【従来の技術】
現在、マイクロアレイ技術によって所定のDNAが微細配列された、いわゆるDNAチップ又はDNAマイクロアレイ(以下、DNAチップと総称する。)と呼ばれるバイオアッセイ用の集積基板が、遺伝子の突然変異、SNPs(一塩基多型)分析、遺伝子発現頻度解析等に利用されており、創薬、臨床診断、薬理ジェノミクス、法医学その他の分野において広範に活用され始めている。
【0003】
このDNAチップは、ガラス基板やシリコン基板上に多種多数のDNAオリゴヌクレオチド鎖や、cDNA(complementary DNA)等が集積されていることから、ハイブリダイゼーション等の分子間相互反応の網羅的解析が可能となる点が特徴とされている。
【0004】
DNAチップによる解析手法の一例を簡潔に説明すれば、ガラス基板やシリコン基板上に固相化されたDNAプローブに対して、細胞、組織等から抽出したmRNA(messenger RNA)を逆転写PCR(Polymerase Chain Reaction)反応等によって蛍光プローブdNTPを組み込みながらPCR増幅し、上記基板上においてハイブリダイゼーションを行い、所定の検出器で蛍光測定を行うというものである。
【0005】
ここで、DNAチップは、2つのタイプに分類できる。第1のタイプは、半導体露光技術を応用したフォトリソグラフィーの技術を用いて、所定の基板上に直接オリゴヌクレオチドを合成していくものであり、アフィメトリクス(Affymetrix)社によるものが代表的である。この第1のタイプのDNAチップについては、例えば下記の特許文献1に記載されている。
【0006】
一方、第2のタイプは、「スタンフォード方式」とも称されるもので、先割れピンを用いて、予め用意されたDNAを基板上に分注・固相化していくことによって作製されるものである。この第2のタイプのDNAチップは、集積度は第1のタイプのDNAチップに比べて低いものの、1kb程度のDNA断片を固相化できるという利点がある。この第2のタイプのDNAチップについては、例えば下記の特許文献2に記載されている。
【0007】
また、下記の特許文献3には、MEMS(Micro Electro Mechanical Systems:マイクロマシン)を用いて作製されたカンチレバー(片持ち梁)を利用する、上述した従来のDNAチップ技術とは異なる技術的思想に基づくカンチレバーセンサー技術が提案されている。
【0008】
この特許文献3に記載されたカンチレバーセンサーによる解析手法の一例を簡潔に説明すると、上面にDNAプローブが固相化されたカンチレバーにレーザー光を照射し、ハイブリダイゼーション反応の結果カンチレバーが撓むことにより所定位置の受光部における反射光の強度が変化するのを測定することで、ハイブリダイゼーション反応の有無を検出するというものである。
【0009】
【特許文献1】
特表平4−505763号公報
【特許文献2】
特表平10−503841号公報
【特許文献3】
国際公開第01/33226号パンフレット
【0010】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、上述した従来のDNAチップ技術では、2次元である基板の狭小な検出部において、DNAプローブ等の検出用ヌクレオチド鎖やタンパク質等を固相化(固定化)し、ハイブリダイゼーション反応や抗原抗体反応等の物質間の相互反応を進行させるという技術であることから、空間的に反応生成物の自由度が制限され、また、反応の際に立体障害が発生する可能性があった。このため、従来のDNAチップ技術等では、相互反応の効率が悪く、反応時間が長いという問題があった。
【0011】
また、従来のDNAチップ技術では、試料溶液は、基板上の所定のスポット部位(検出部)に滴下されるのみであって、試料溶液に含まれている標的物質とスポット部位に固定された状態の検出物質との相対的な位置決めを行うための工夫は、何ら講じられていなかった。
【0012】
一方、上述したカンチレバーセンサー技術では、試料溶液に含まれている標的物質を予め蛍光標識する必要がないという利点がある一方で、カンチレバーを高集積化した場合に、カンチレバー表面にレーザー光を照射し、その反射光を受光する機械的な制御が困難になるという問題があった。
【0013】
本発明は、このような従来の実情に鑑みて提案されたものであり、標的物質に対する蛍光標識等を行うことなく、ハイブリダイゼーションその他の物質間の相互作用を定量性よく検出する相互反応作用検出方法及びバイオアッセイ装置、並びにバイオアッセイ用基板を提供することを目的とする。
【0014】
【課題を解決するための手段】
上述した目的を達成するために、本発明に係る相互反応作用検出方法及びバイオアッセイ装置は、検出用物質を固定可能なように少なくともその一部に表面処理が施されたカンチレバーと、当該表面処理部に固定化された状態の検出用物質と標的物質との相互反応作用の場を提供する反応領域と、上記カンチレバーを振動励起する駆動源と、上記カンチレバーの振動振幅を検出する振動検出手段とを少なくとも備える検出部において物質間の相互反応作用を検出するものであり、上記相互反応作用に基づく上記カンチレバーの固有振動数の変化を測定することで、上記相互反応作用を検出する。
【0015】
ここで、上記カンチレバーは、対向電極間に圧電材料を配置してなる振動子を有しており、上記駆動源は、上記対向電極間に交流電圧を印加することにより上記カンチレバーを振動励起する。
【0016】
また、上記検出用物質及び上記標的物質は、例えばヌクレオチド鎖であり、上記相互反応作用は、例えばハイブリダイゼーションである。
【0017】
このような相互反応作用検出方法及びバイオアッセイ装置では、検出用物質を固定可能なように少なくともその一部に表面処理が施されたカンチレバーに検出用物質を固定化し、上記検出用物質と標的物質との相互反応作用に基づく上記カンチレバーの固有振動数変化を測定することで、上記相互反応作用を検出する。
【0018】
例えば、上記検出用物質及び上記標的物質がヌクレオチド鎖である場合、上記カンチレバーの端面に固定化された検出用ヌクレオチド鎖と標的ヌクレオチド鎖とがハイブリダイゼーションすると上記カンチレバーの質量が増加するため、カンチレバーの固有振動数が低下する。そこで、本発明に係る相互反応作用検出方法及びバイオアッセイ装置では、この固有振動数変化を測定することで、ハイブリダイゼーションを検出する。
【0019】
また、上述した目的を達成するために、本発明に係るバイオアッセイ用基板は、検出用物質を固定可能なように少なくともその一部に表面処理が施されたカンチレバーと、当該表面処理部に固定化された状態の検出用物質と標的物質との相互反応作用の場を提供する反応領域とを少なくとも備える検出部が設けられたものである。
【0020】
ここで、上記検出部は、上記カンチレバーが一壁面から突出して設けられたセル検出部として構成することができ、このセル検出部は、基板上に複数配設される。本発明に係るバイオアッセイ用基板は、円盤状基板として形成することができ、この場合、セル検出部は、上方視放射状を呈するように配設される。
【0021】
また、バイオアッセイ用基板を円盤状基板として形成する場合において、上記反応領域を基板上に放射状に延設された条溝内に設けるようにしてもよく、この場合、上記カンチレバーは、上記条溝の片側から突出して設けられる。
【0022】
さらに、上記セル検出部若しくは条溝単位、又はグルーピングされた複数のセル検出部若しくは条溝単位に、異なる検出用物質を固定化することができる。
【0023】
さらにまた、上記反応領域に対して、室温と反応至適温度との間で、ゲル、ゾルの可逆相変化が起こり得る物質を充填してもよい。
【0024】
このようなバイオアッセイ用基板では、上記相互反応作用に基づく上記カンチレバーの固有振動数の変化を測定することで上記相互反応作用が検出される。
【0025】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を適用した具体的な実施の形態について、図面を参照しながら詳細に説明する。この実施の形態で説明するバイオアッセイ装置及びその相互反応作用検出方法は、対向電極間に圧電材料を配置してなる振動子を有するカンチレバー(片持ち梁)の端面に予め検出用ヌクレオチド鎖(検出用物質)の末端部位を固定化し、この検出用ヌクレオチド鎖と標的ヌクレオチド鎖(標的物質)とのハイブリダイゼーション反応に由来する質量変化によりカンチレバーの固有振動数が変化することを利用して、ハイブリダイゼーション反応を定量的に検出するものである。
【0026】
ここで、本明細書において「ヌクレオチド鎖」とは、プリン塩基又はピリミジン塩基と糖とがグリコシド結合したヌクレオシドのリン酸エステルの重合体を意味し、DNAプローブを含むオリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、プリンヌクレオチドとピリミジンヌクレオチドとが重合したDNA(全長或いはその断片)、逆転写により得られるcDNA(cDNAプローブ)、RNA等を広く含む。
【0027】
先ず、本実施の形態におけるバイオアッセイ装置に用いられるバイオアッセイ用基板(以下、基板と略称する。)1の外観斜視図を図1に示す。図1に示す基板1は、CD(Compact Disk)、DVD(Digital Versatile Disk)、MD(Mini Disk)(登録商標)等の光情報記録媒体に用いられる円盤状基板(ディスク)に採用される基材から形成されている。
【0028】
この基材は、石英ガラスやシリコン、ポリカーボネート、ポリスチレンその他の円盤状に成型可能な合成樹脂、好ましくは射出成型可能な合成樹脂によって円盤状に形成されている。なお、安価な合成樹脂基板を用いることで、従来のガラス基板に比して低ランニングコストを実現できる。基板1の中心には、基板1を回転する場合に使用されるスピンドル固定用の孔(図示せず)を形成することもできる。
【0029】
基板1の一方の表面には、基板1の中心の周辺領域から上方視放射状に延びるように、周辺の基板領域とは区画された小室状の反応領域を備えるセル検出部2が多数配設されている。
【0030】
このセル検出部2は、基板1上の適切な位置に配設することが可能であるが、このように上方視放射状に配設することで、基板1上のスペースを有効に利用することができ、情報の集積密度を高めることができる。
【0031】
また、セル検出部2は、互いにコンタミネーションしないように区画されているため、セル検出部単位又はグルーピングされたセル検出部単位で、異なる検出用ヌクレオチド鎖を固定化し、検出用ヌクレオチド鎖毎に別個独立の条件を設定して、ハイブリダイゼーション反応を進行させることができる。
【0032】
例えば、疾病発症のマーカー遺伝子を基板1上にグルーピングして固定化することができ、これにより1つの基板1を用いて同時に複数の疾病の発現状況を確認することができる。
【0033】
また、Tm(Melting Temperature)又はGC含有率の違いに基づいて、固定化する検出用ヌクレオチド鎖をグルーピングしておくことも可能である。これにより、アクティブなハイブリダイゼーション反応が得られるバッファー組成、濃度等の反応条件、洗浄条件、滴下するサンプル溶液濃度等を、検出用ヌクレオチド鎖の性質に応じてきめ細かく選択することが可能となり、解析作業において疑陽性又は疑陰性が示される危険性を減少させることができる。
【0034】
このセル検出部2の1つを拡大した外観斜視図を図2に示す。図2に示すように、セル検出部2は、検出用ヌクレオチド鎖Dと標的ヌクレオチド鎖Tとの間のハイブリダイゼーション反応の場となる反応領域10と、その反応領域10の両端に電場(電界)を形成する正電極11及び負電極12と、セル検出部2の負電極12側から突出して設けられたカンチレバー13とを備えている。
【0035】
反応領域10は、上方に開口する略正方形のセル、例えば、深さが1μm、長さ及び幅が共に100μmのセルとして形成されているが、図示された形状、サイズに限定されない。
【0036】
上述したカンチレバー13の反応領域10側の端面13aは、検出用ヌクレオチド鎖Dの末端部位がカップリング反応等の化学結合によって固定化されるように、表面処理が施されている。すなわち、この端面13aは、DNAプローブ等の検出用ヌクレオチドDの予め加工された末端部位を固定化するのに好適な表面処理が施されていればよい。例えば、ストレプトアビジンによってカンチレバー13の端面13aが表面処理されている場合には、ビオチン化されたヌクレオチド鎖末端の固定化に適している。なお、ここでは端面13aに表面処理が施されているが、これに限定されるものではなく、カンチレバー13の少なくとも一部に表面処理が施されていればよい。
【0037】
ここで、ヌクレオチド鎖内では、ヌクレオチド鎖の骨格をなすリン酸イオン(陰電荷)とその周辺にある水がイオン化した水素イオン(陽電荷)とによってイオン雲が形成されていると考えられ、これらの陰電荷及び陽電荷により生じる分極ベクトルが、高周波高電圧の印加により全体として一方向を向き、その結果としてヌクレオチド鎖が伸長する。さらに、電気力線が一部に集中する不均一電界が印加された場合、ヌクレオチド鎖は、電気力線が集中する部位に向かって移動する(Seiichi Suzuki, Takeshi Yamanashi, Shin−ichi Tazawa, Osamu Kurosawa and Masao Washizu: ”Quantitative analysis on electrostatic orientationof DNA in stationary AC electric field using fluorescence anisotropy”, IEEE Transaction on Industrial Application, Vol.34,No.1, p.75−83 (1998)参照)。
【0038】
そこで、正電極11及び負電極12により、各カンチレバー13の端面13aに電気力線が集中するような高周波高電圧の電界を印加すると、高周波高電圧の印加によって伸長処理されたヌクレオチド鎖が端面13aに向かって移動し、その末端部位が端面13aと接触することによって、検出用ヌクレオチドDの末端部位をカンチレバー13の端面13aに確実に固定化することができる。特に、カンチレバー13として、後述するようにPZT(ジルコン酸チタン酸鉛)やSBT(タンタル酸ストロンチウムビスマス)等の圧電性を有する強誘電体を用いる場合には、その強誘電体により電気力線がカンチレバー13の端面13aに集中するため好適である。
【0039】
図2中にその先端部位を示すノズル3は、試料溶液S(S’)を滴下するものであり、後述するように基板1から提供される位置情報と回転同期情報とに基づいて、検出用ヌクレオチド鎖Dを含有する試料溶液Sと標的ヌクレオチド鎖Tを含有する試料溶液S’とを、反応領域10に正確に追従して滴下する構成とされている。
【0040】
滴下手段としては、インクジェットプリンティング法を好適に採用することができる。これは、所定の反応領域10に正確に追従して微小滴を滴下することができるためである。
【0041】
「インクジェットプリンティング法」は、インクジェットプリンターで用いられるノズルを応用する方法であり、電気を用いてインクジェットプリンターのようにプリンターヘッドから基板1に試料溶液S(S’)を噴射するものである。この方法には、圧電式インクジェット法、バブルジェット(登録商標)法、超音波ジェット法がある。
【0042】
圧電式インクジェット法は、圧電体にパルスを印加することによって生じる変位の圧力により液滴を飛ばす方式である。また、バブルジェット(登録商標)法は、熱方式であって、ノズル中のヒーターを熱して発生させた気泡の圧力によって液滴を飛ばす方式である。ノズル内にヒーターとなるシリコン基板を埋め込み、約300℃/sで制御して一様な気泡を作成し、液滴を押し出す。しかしながら、試料溶液S(S’)が高温に曝されることになるため、生体物質試料を用いる場合には注意を要する。超音波ジェット法は、超音波ビームを試料溶液S(S’)の自由面に当て、局所的に高い圧力を与えることによってその箇所から小滴を放出させる方式である。ノズルを必要とせず、高速で直径約1μmの小滴を形成できる。
【0043】
本実施の形態においては、「インクジェットプリント法」として、「圧電式インクジェット法」を好適に採用できる。印加するパルスの形状を変えることによって、液滴(微小滴)のサイズを制御することができるため、解析精度向上に好適である。すなわち、液滴表面の曲率半径が小さいときには液滴を小さくし、液滴の曲率半径が大きいときには液滴を大きくすることができる。また、パルスを急激に負の方向に変化させることにより液滴表面を内側に引っ張り、曲率半径を小さくすることも可能である。
【0044】
ここで、反応領域10に滴下されてきた検出用ヌクレオチドDの多くは、塩基が重層した状態でカンチレバー13の端面13aに固定化されるため、後から滴下された標的ヌクレオチド鎖Tとのハイブリダイゼーション反応の際には、立体障害の問題が発生してしまう。
【0045】
そこで本実施の形態では、セル検出部2に配設された正電極11と負電極12との間に電位差を生じさせることで反応領域10に貯留保持されている液層(塩溶液)に電場(電界)を形成し、電界の向きに沿って検出用ヌクレオチドDを直鎖状に伸長させる。なお、上記高周波高電圧は、1×106 V/m、約1MHz付近が好適と考えられる(Masao Washizu and Osamu Kurosawa: ”Electrostatic Manipulation of DNA in Microfabricated Structures”,IEEE Transaction on Industrial Application, Vol.26,No.26, p.1165−1172 (1990) 参照)。
【0046】
なお、基板1上にセル検出部2が列設された場合においては、セル検出部2毎に正電極11及び負電極12を設けるようにしてもよく、また、正電極11及び負電極12をそれぞれ共通電極化するようにしてもよい。
【0047】
上述のように高周波高電圧を印加することにより、検出用ヌクレオチド鎖D及び標的ヌクレオチド鎖Tが直鎖状に伸長するため、立体障害が少なくなり、ハイブリダイゼーション反応が効率よく進行することになる。この結果、ハイブリダイゼーションの反応時間が短縮化されるとともに、疑陽性又は疑陰性を示す確率も減少する。
【0048】
ここで、セル検出部2の反応領域10側に突設されたカンチレバー13を拡大して図3に示す。この図3は、カンチレバー13の端面13aにその末端部位が固定化された検出用ヌクレオチド鎖Dと該検出用ヌクレオチド鎖Dの塩基配列と相補性のある塩基配列を有する標的ヌクレオチド鎖Tとがハイブリダイゼーションし、2本鎖を形成している状態を模式的に表したものである。なお、図3では、簡単のため、端面13aに1本の検出用ヌクレオチド鎖Dが固定化されている状態を示しているが、実際にはカンチレバー13の幅に応じて相当数の検出用ヌクレオチド鎖Dが固定化される。
【0049】
反応領域10に対しては、室温と反応至適温度との間で、ゲル、ゾルの可逆相変化が起こり得るアガロースゲル等の相変化物質(図示せず)を充填することも可能である。この場合には、相変化物質を高温下でゾル化し、この状態で電圧を印加して1本鎖DNA等のヌクレオチド鎖を配列した後に、温度を低下させてゲル化し、さらに続いてハイブリダイゼーション時には、反応至適温度でゾル化する手順を行うことができるという利点がある。また、ハイブリダイゼーション時において相変化物質をゲル状態に保持しておけば、DNA等のヌクレオチド鎖を伸長させた状態でハイブリダイゼーションさせることができるため好適である。
【0050】
なお、上記相変化物質がゲル化した状態のときには、標的ヌクレオチド鎖Tを含む試料溶液S’をセル検出部2に滴下した際に、ハイブリダイゼーションの進行が妨げられる虞があるため、通常の電気泳動の場合と同様に、滴下ポイントに垂直方向の溝を予め形成しておき、この溝の中に試料溶液S’を滴下するようにしてもよい。
【0051】
ところで、上述したカンチレバー13は、対向電極間に圧電材料を配置してなる振動子を有しており、交流電圧を印加することで、その周波数に応じて振動させることができる。この際、カンチレバー13の全体を圧電振動子として形成することもでき、また、カンチレバー13上に圧電素子を形成することもできる。
【0052】
このカンチレバー13は、例えば特開2001−347499号公報に記載された技術を応用して作製することができる。この作製手法の原理を図4を用いて簡潔に説明する。
【0053】
先ず、図4(A)に示すように、セル検出部2となるシリコン基板20の底部の一部に、最終的に空隙部分を形成するための犠牲層となるポリシリコン層21を形成し、底部全体が一様な高さとなるようにする。そして、底部表面にフォトレジストを塗布し、フォトリソグラフィー法などにより、カンチレバー13を作製する部分以外をマスクするレジストパターンを形成する。その後、例えばSiH4−N2O系を用いたCVD(Chemical Vapor Deposition:化学的気相成長)法により、同図(B)に示すようにSiO2(二酸化シリコン)からなる絶縁層22を形成する。なお、SiO2に限らず、例えばSiH4−NH3系を用いたCVD法により、SiNx(窒化シリコン)からなる絶縁層22を形成するようにしても構わない。
【0054】
そして、同図(C)に示すように、Pt(白金)又はIn(インジウム)等からなる下部電極層23、PZT(Pb(Ti,Zr)O3:ジルコン酸チタン酸鉛)又はSBT(SrBi2Ta2O9:タンタル酸ストロンチウムビスマス)等からなる圧電材料層24、Pt又はIn等からなる上部電極層25を順次積層してパターニングする。
【0055】
最後に、同図(D)に示すように、真空チャンバ内でXeF2(二フッ化キセノン)又はBrF3(三フッ化臭素)を昇華させて導入し、選択的エッチングによりポリシリコン層21を完全に除去する。
【0056】
本実施の形態では、このようにして作製されたカンチレバー13の固有振動数変化を検出することにより、ハイブリダイゼーション反応の有無を検出する。
【0057】
具体的には、図5に示すように、下部電極層23と上部電極層25とを接続した交流回路を形成し、カンチレバー13の駆動源となる交流電源30により周波数を変化させながらカンチレバー13を振動励起する。そして、共振振幅に関連した電流を抵抗31で電圧変換し、この電圧を振動検出手段としての電圧計32で計測する。電圧計32で計測される電圧波形は、例えば図6の実線のようになる。なお、カンチレバー13の共振振幅は、交流電源30の周波数がカンチレバー13の固有振動数と一致したときに最大となるため、電圧のピーク時における交流電源30の周波数f1は、カンチレバー13の固有振動数を示している。
【0058】
ここで、カンチレバー13の端面13aに固定化された検出用ヌクレオチド鎖Dと該検出用ヌクレオチド鎖Dの塩基配列と相補性のある塩基配列を有する標的ヌクレオチド鎖Tとがハイブリダイゼーションして2本鎖を形成した場合、標的ヌクレオチド鎖Tに由来するカンチレバー13の質量増加によりカンチレバー13の固有振動数が低下する。これにより、電圧波形は図6の破線の位置に下方シフトし、ピーク時における交流電源30の周波数はf2となる。
【0059】
したがって、この電圧のピーク時における周波数(固有振動数)の変化を検出することにより、ハイブリダイゼーションの有無を検出することができる。
【0060】
さらに、この固有振動数の変化量(f1−f2)は、カンチレバー13の質量変化量と正に相関するため、検出用ヌクレオチド鎖Dの固定化前の固有振動数、検出用ヌクレオチド鎖Dの固定化後の固有振動数、及びハイブリダイゼーション反応完了後の固有振動数を測定することで、カンチレバー13に固定化された検出用ヌクレオチド鎖Dの本数、或いは検出用ヌクレオチド鎖Dとハイブリダイゼーションした標的ヌクレオチド鎖Tの本数を定量的に検出することが可能である。
【0061】
なお、質量変化の大きい方が固有振動数変化の検出感度が上がるため、標的ヌクレオチド鎖Tの末端をアンカー分子で修飾し、質量を増加させておくことが好ましい。
【0062】
また、上述したように反応領域10にアガロースゲル等の相変化物質を充填している場合には、正確に振動数を検出できない虞があるため、ハイブリダイゼーション反応完了後、振動数の測定前に、この相変化物質をゾル化し、基板1を回転させることで生じる遠心力の作用により、相変化物質を除去してもよい。
【0063】
以上の例では、カンチレバー13の全体を圧電振動子としたが、これに限定されるものではなく、図7に示すように、カンチレバー13の上部に駆動電極となる圧電素子40aと検出電極となる圧電素子40bとを設けるようにしても構わない。この場合における圧電素子40a及び40bを含む位置でのカンチレバー13の垂直断面図を図8に示す。
【0064】
図8に示すように、カンチレバー13は、シリコン基板41上にSiO2又はSiNxからなる絶縁層42が形成されたものである。また、圧電素子40a及び40bは、Pt又はInからなる下部電極層43a,43b、PZT又はSBTからなる圧電材料層44a,44b、Pt又はInからなる上部電極層45a,45bとが順次積層されたものである。
【0065】
ハイブリダイゼーション反応の有無を検出する際には、駆動源となる交流電源50により周波数を変化させながらカンチレバー13を振動励起する。そして、共振振幅に基づく電位差を振動検出手段としての電圧計51で計測する。上述と同様に、ハイブリダイゼーション反応によりカンチレバー13の質量が増加すると、カンチレバー13の固有振動数が低下し、電圧のピーク時における交流電源50の周波数は低くなる。
【0066】
以上のようにしてハイブリダイゼーション反応に由来する固有振動数変化が確認された場合、例えば所定の細胞等から抽出された試料溶液S’中に、特定の疾患に関連するマーカー遺伝子を含む検出用ヌクレオチド鎖Dと相補性を有する標的ヌクレオチド鎖Tが存在するという事実が認識でき、その結果、上記細胞には上記疾患が発生していることが予測されることになる。
【0067】
次に、本実施の形態におけるバイオアッセイ装置に用いられる基板の他の例について、図9を参照しながら説明する。ここで、図9(A)は、本例における基板の上方視平面図を示し、図9(B)は、図9(A)中のX部の拡大平面図を示す。
【0068】
図9に示す基板60は、条溝検出部61を備える。この条溝検出部61は、反応領域70が基板60上に放射状に延設された条溝を備え、該条溝を形成する長手方向の片側からは、同図(B)に示すように、上記セル検出部2におけるカンチレバー13と同様の構成を備えるカンチレバー73が所定間隔で突設されている。また、カンチレバー73が設けられた各部位には、反応領域70を挟むように正負電極71,72が対設されている。なお、条溝検出部61は、上記セル検出部2が条溝内に配列された構成ともいえる。
【0069】
各正電極71は共通電極化することができ、同様に各負電極72についても共通電極化できる。すなわち、正の共通電極と負の共通電極とを、反応領域70を挟むように対向させて、基板60上に放射状をなすように並設することができる。この構成により、針状のプローブを正負の共通電極に上方から押し当てて、通電させることができる。
【0070】
上述の反応領域70は、各条溝内に配列形成したピット(図示せず)に形成してもよく、このピットの反応領域に微小滴を滴下することによって、ほぼ同一のスポットサイズを実現することができる。
【0071】
また、この条溝検出部61では、毛細管現象を利用した送液や、円盤状の基板60を所定の方法で回転させることによって生じる遠心力を活かした送液手段も利用することができる。
【0072】
具体的には、基板60の中心部に液溜部62を設け、この液溜部62に試料溶液S(S’)や、反応後にアクティブに結合しなかった余分な標的ヌクレオチド鎖Tを除去するための洗浄液等を注入し、基板60を回転させることによって、基板中心領域から条溝内(すなわち反応領域70)に円滑かつ確実に送液することができる。
【0073】
なお、この条溝検出部61においても、条溝検出部単位又はグルーピングされた条溝検出部単位に、異なる検出用ヌクレオチド鎖Dを固定化することができる。
【0074】
以下、基板1,60の位置情報及び回転同期情報について簡潔に説明する。基板1,60の回転方向には、予めディスクマスタリングプロセスにより形成された多数のアドレスピットが形成されている。基板1,60を光ディスクとして考えた場合、滴下検出位置である反応領域10,70は、ユーザーデータ領域と考えられる。他の領域には、サンプルサーボ方式等により同期ピットを配列し、かつトラッキングサーボとしても利用し、さらに、直後にアドレス部(ディスク上の地理的な番地)を挿入することによって位置情報を与える。
【0075】
アドレス部は、先頭パターンであるセクターマークから始まり、実際に回転しているディスクの回転位相を与えるVFO、アドレスデータの開始位置を与えるアドレスマーク、トラック及びセクタのナンバーが入ったID(Identifier)などが組み合わされてなる。
【0076】
上述した構成の基板1,60を用いてバイオアッセイを行うには、少なくとも以下の手段及び機構を備える装置を使用する。すなわち、上記基板1,60を回転可能に保持する基板回転手段と、この基板回転手段によって基板1,60を回転させながら、反応領域10,70に対して試料溶液S(S’)を一定の順序、タイミングで滴下する滴下手段と、該滴下手段(のノズル)と基板との間の距離を一定に保持するためのフォーカスサーボ機構と、基板1,60から提供される位置情報及び回転同期情報に基づいて、試料溶液S(S’)の滴下を基板1,60の反応領域10,70に追従させるトラッキングサーボ機構とを少なくとも備えている装置(図示せず)である。
【0077】
以上説明した基板1,60及びこれらを用いるバイオアッセイ装置を採用すれば、上述した本発明に係る相互反応作用検出方法を好適に実施することができる。
【0078】
すなわち、カンチレバー13,73の端面に固定化された検出用ヌクレオチド鎖Dと標的ヌクレオチド鎖Tとがハイブリダイゼーションするとカンチレバー13,73の質量が増加するため、カンチレバー13,73の固有振動数が低下する。そこで、この固有振動数変化を測定することで、ハイブリダイゼーションを検出することができる。
【0079】
また、正電極11,71及び負電極12,72によって反応領域10,70に電場を形成することにより、反応領域10,70内の検出用ヌクレオチドDと標的ヌクレオチドTとを伸長させた状態で相対的に移動させ、ハイブリダイゼーションを行わせることができるため、ハイブリダイゼーションの効率が向上する。
【0080】
なお、本発明は上述した実施の形態のみに限定されるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲において種々の変更が可能であることは勿論である。
【0081】
例えば、上述の実施の形態では、バイオアッセイ用基板を円盤状に形成したが、この形態に限定されるものではなく、矩形状その他の平板状の形態を適宜選択決定することができる。
【0082】
また、上述の実施の形態では、検出用ヌクレオチド鎖Dと標的ヌクレオチド鎖Tとのハイブリダイゼーション反応の有無を検出する場合を代表例として説明したが、本発明は、このようにハイブリダイゼーション反応の有無を検出する例に限定されるものではない。
【0083】
すなわち、上述した反応領域10,70においては、ハイブリダイゼーション反応に加え、検出用ヌクレオチド鎖Dから所望の2本鎖ヌクレオチドを形成し、該2本鎖ヌクレオチドとペプチド(又はタンパク質)との相互反応、酵素応答反応その他の分子間相互作用を行わせることができる。具体的に、上記2本鎖ヌクレオチドを用いる場合には、転写因子であるホルモンレセプター等のレセプター分子と応答配列DNA分子との結合などを分析することができる。
【0084】
このように、本発明において「バイオアッセイ」とは、ハイブリダイゼーションその他の物質間の相互反応に基づく生化学的分析を広く意味するものである。
【0085】
【発明の効果】
以上詳細に説明したように本発明に係る相互反応作用検出方法及びバイオアッセイ装置は、検出用物質を固定可能なように少なくともその一部に表面処理が施されたカンチレバーと、当該表面処理部に固定化された状態の検出用物質と標的物質との相互反応作用の場を提供する反応領域と、上記カンチレバーを振動励起する駆動源と、上記カンチレバーの振動振幅を検出する振動検出手段とを少なくとも備える検出部において物質間の相互反応作用を検出するものであり、上記相互反応作用に基づく上記カンチレバーの固有振動数の変化を測定することで、上記相互反応作用を検出する。
【0086】
このような相互反応作用検出方法及びバイオアッセイ装置によれば、検出用物質を固定可能なように少なくともその一部に表面処理が施されたカンチレバーに検出用物質を固定化し、上記検出用物質と標的物質との相互反応作用に基づく上記カンチレバーの固有振動数変化を測定することで、上記相互反応作用を検出することができる。特に、カンチレバーの固有振動数の変化量が標的物質と相互反応した検出用物質の質量に相関するため、相互反応作用を定量性よく検出することができる。また、固有振動数の変化により相互反応作用を検出するため、検出用物質に対して予め蛍光標識等を行う必要もない。
【0087】
また、本発明に係るバイオアッセイ用基板は、検出用物質を固定可能なように少なくともその一部に表面処理が施されたカンチレバーと、当該表面処理部に固定化された状態の検出用物質と標的物質との相互反応作用の場を提供する反応領域とを少なくとも備える検出部が設けられたものである。
【0088】
このようなバイオアッセイ用基板によれば、上述した本発明に係る相互反応作用検出方法を好適に実施することができる。
【0089】
この相互反応作用検出方法及びバイオアッセイ装置、並びにバイオアッセイ用基板は、DNAチップに基づくバイオアッセイ方法に特に好適であり、遺伝子の変異解析、SNPs(一塩基多型)分析、遺伝子発現頻度解析等に利用でき、創薬、臨床診断、薬理ジェノミクス、法医学その他の分野において広範囲に活用できる。
【図面の簡単な説明】
【図1】本実施の形態におけるバイオアッセイ装置に用いられるバイオアッセイ用基板の外観を示す斜視図である。
【図2】同バイオアッセイ用基板に多数配設されたセル検出部の1つを拡大して示す斜視図である。
【図3】同セル検出部の反応領域側に突設されたカンチレバーを拡大して示す斜視図である。
【図4】同図(A)乃至(D)は、同カンチレバーの作製工程の一例を説明する図である。
【図5】同カンチレバーの固有振動数変化を検出する方法を示す図である。
【図6】交流電源の周波数を変化させた際に計測される電圧波形を示す図である。
【図7】同カンチレバーの他の構成を示す斜視図である。
【図8】圧電素子を含む位置におけるカンチレバーの垂直断面を示す図である。
【図9】同バイオアッセイ装置に用いられる基板の他の例を説明する図であり、同図(A)は、基板の上方視平面図を示し、同図(B)は、同図(A)中のX部の拡大平面図を示す。
【符号の説明】
1 バイオアッセイ用基板、2 セル検出部、3 ノズル、10 反応領域、11 正電極、12 負電極、13 カンチレバー、13a 端面、20 シリコン基板、21 ポリシリコン層、22 絶縁層、23 下部電極層、24 圧電材料層、25 上部電極層、30 交流電源、31 抵抗、32 電圧計、40a,40b 圧電素子、41 シリコン基板、42 絶縁層、43 下部電極層、44 圧電材料層、45 上部電極層、50 交流電源、51 電圧計、60 基板、61 条溝検出部、62 液溜部、70 反応領域、71 正電極、72 負電極、73 カンチレバー
Claims (18)
- 検出用物質を固定可能なように少なくともその一部に表面処理が施されたカンチレバーと、当該表面処理部に固定化された状態の検出用物質と標的物質との相互反応作用の場を提供する反応領域と、上記カンチレバーを振動励起する駆動源と、上記カンチレバーの振動振幅を検出する振動検出手段とを少なくとも備える検出部において物質間の相互反応作用を検出する相互反応作用検出方法であって、
上記相互反応作用に基づく上記カンチレバーの固有振動数の変化を測定することで、上記相互反応作用を検出する検出工程を有すること
を特徴とする相互反応作用検出方法。 - 上記カンチレバーは、対向電極間に圧電材料を配置してなる振動子を有しており、
上記駆動源は、上記対向電極間に交流電圧を印加することにより上記カンチレバーを振動励起すること
を特徴とする請求項1記載の相互反応作用検出方法。 - 上記検出用物質及び上記標的物質がヌクレオチド鎖であり、上記相互反応作用がハイブリダイゼーションであることを特徴とする請求項1記載の相互反応作用検出方法。
- 上記反応領域に電場を形成し、該反応領域内の検出用ヌクレオチドと標的ヌクレオチドとを伸長させた状態で相対的に移動させ、ハイブリダイゼーションを行わせる電場形成工程を有することを特徴とする請求項3記載の相互反応作用検出方法。
- 検出用物質を固定可能なように少なくともその一部に表面処理が施されたカンチレバーと、当該表面処理部に固定化された状態の検出用物質と標的物質との相互反応作用の場を提供する反応領域と、上記カンチレバーを振動励起する駆動源と、上記カンチレバーの振動振幅を検出する振動検出手段とを少なくとも有する検出部を備えたことを特徴とするバイオアッセイ装置。
- 上記カンチレバーは、対向電極間に圧電材料を配置してなる振動子を有しており、
上記駆動源は、上記対向電極間に交流電圧を印加することにより上記カンチレバーを振動励起すること
を特徴とする請求項5記載のバイオアッセイ装置。 - 上記検出用物質及び上記標的物質がヌクレオチド鎖であり、上記相互反応作用がハイブリダイゼーションであることを特徴とする請求項5記載のバイオアッセイ装置。
- 上記検出部は、上記反応領域に電場を形成し、該反応領域内の検出用ヌクレオチドと標的ヌクレオチドとを伸長させた状態で相対的に移動させ、ハイブリダイゼーションを行わせる電場形成手段をさらに有することを特徴とする請求項7記載のバイオアッセイ装置。
- 検出用物質を固定可能なように少なくともその一部に表面処理が施されたカンチレバーと、当該表面処理部に固定化された状態の検出用物質と標的物質との相互反応作用の場を提供する反応領域とを少なくとも備える検出部が設けられたことを特徴とするバイオアッセイ用基板。
- 上記検出部は、上記カンチレバーが一壁面から突出して設けられたセル検出部であって、当該セル検出部が基板上に複数配設されたことを特徴とする請求項9記載のバイオアッセイ用基板。
- 円盤状基板として形成され、
上記セル検出部は、上記円盤状基板上に上方視放射状を呈するように配設されたこと
を特徴とする請求項10記載のバイオアッセイ用基板。 - 上記セル検出部単位又はグルーピングされた複数のセル検出部単位に、異なる検出用物質が固定化されたことを特徴とする請求項10記載のバイオアッセイ用基板。
- 円盤状基板として形成され、
上記反応領域は、基板上に放射状に延設された条溝内に設けられ、上記条溝の片側から上記カンチレバーが突出して設けられたこと
を特徴とする請求項9記載のバイオアッセイ用基板。 - 上記条溝単位又はグルーピングされた複数の条溝単位に、異なる検出用物質が固定化されたことを特徴とする請求項13記載のバイオアッセイ用基板。
- 上記反応領域に対して、室温と反応至適温度との間で、ゲル、ゾルの可逆相変化が起こり得る物質を充填したことを特徴とする請求項9記載のバイオアッセイ用基板。
- 上記相互反応作用に基づく上記カンチレバーの固有振動数の変化を測定することで上記相互反応作用が検出されることを特徴とする請求項9記載のバイオアッセイ用基板。
- 上記検出用物質及び上記標的物質がヌクレオチド鎖であり、上記相互反応作用がハイブリダイゼーションであることを特徴とする請求項9記載のバイオアッセイ用基板。
- 上記検出部は、上記反応領域に電場を形成し、該反応領域内の検出用ヌクレオチドと標的ヌクレオチドとを伸長させた状態で相対的に移動させ、ハイブリダイゼーションを行わせる電場形成手段をさらに有することを特徴とする請求項17記載のバイオアッセイ用基板。
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