WO2005033703A1

WO2005033703A1 - 二枚の基板を重ね合わせてバイオアッセイ用基板を製造する方法及びバイオアッセイ用基板

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Publication number: WO2005033703A1
Application number: PCT/JP2004/014536
Authority: WO
Inventors: Michihiro Ohnishi; Yuichi Aki; Minoru Inagaki
Original assignee: Sony Corporation
Priority date: 2003-10-03
Filing date: 2004-09-27
Publication date: 2005-04-14
Also published as: CN1836162A; US20070269344A1; EP1677110A4; JP2005114427A; EP1677110A1

Description

明細書二枚の基板を重ね合わせてバイオアツセィ用基板を製造する方法及びバイオアツセィ用基板技術分野，

本発明は、 D N Aチップその他のバイオアツセィ用基板に係わる技術に関する。より詳しくは、電極を有する二枚の基板を位置合わせして重ね合わせることによって対向電極が形成されたバィォアツセィ用基板並びに該バイオアツセィ用基板の製造方法に関する。 ' 背景技術

本発明に関する主たる背景技術を説明する。まず、第一の背景技術（従来技術）は、マイクロアレイ技術によって所定の D NA が微細配列された、いわゆる D N Aチップ又は D N Aマイクロアレイ（以下、「 D N Aチップ」と総称。）と呼ばれるバイオアツセィ用の集積基板に関する技術である（例えば、特表平 4一 5 0 5 7 6 3号公報、特表平 1 0 — 5 0 3 8 4 1号公報参照）。

この D N Aチップ技術、ガラス基板やシリコン基板上に多種 · 多数の D N Aオリゴ鎖ゃ c D N A (complementary DNA) 等が集積されていることから、ハイブリダィゼーシヨン等の分子間相互反応の網羅的解析が可能となる点が特徴とされている。このため D NAチップは、遺伝子の変異解析、 S N P s (—塩基多型）分析、遺伝子発現頻度解析等に利用されており、創薬、臨床診断、薬理ジエノミクス、法医学その他の分野において広範囲に活用され始めている。 D N Aチップ以外にも、基板上にタンパク質を固定したプロテインチップや種々の物質間の相互作用を解析するためのバイオセンサーチップなども開発されている。

第二の背景技術は、液相中において荷電して存在する物質に対する電界の作用に係わる技術である。具体的には、ヌクレオチド鎖（核酸分子）は、液相中において電界の作用を受けると伸長又 'は移動することが知られており、その原理は、ヌクレオチド鎖の骨格をなすリン酸イオン（陰電荷）とその周辺にある水がイオン化した水素原子（陽電荷）とによってイオン雲を作っていると考えられ、これらの陰電荷及び陽電荷により生じる分極ベクトル (双極子）が、高周波高電圧の印加により全体として一方向を向き、その結果としてヌクレオチド鎖が伸長し、加えて、電気力線がー部に集中する不均一電界が印加された場合、ヌクレオチド鎖は電気力線が集中する部位に向かって移動する（Seiichi Suzuki, Takeshi Yamanash i , Sh i n- i ch i Taza a, Os amu Kurosawa and Mas ao Wash i zu : "Quantitative analysis on electrostatic

orientation of DNA in stationary AC electric field using fluorescence anisotropy" ， IEEE Transact ion on Indus trial Applications, Vol.34，No.1，P75-83 (1998)参照）。この移動は「誘電泳動」と呼ばれる。例えば、数十から数百 / z mのギャップを持つ微細電極中に D NA溶液をおき、ここに l MV/m、 1 MH z 程度の高周波電界を印加すると、ランダムコイル状で存在する D NAに誘電分極が生じ、その結果、 D N A分子は電界と平行に直線状に引き伸ばされる。そして、「誘電泳動」と呼ばれる電気力学的効果によって、分極した D NAは自発的に電極端へと引き寄せられ、電極エッジにその一端を接した形で固定されることが知られている（鷲津正夫、「見ながら行う D N Aハンドリング」、可視化情報 V o l . 2 0 N o . 7 6 ( 2 0 0 0年 1 月）参照）。

上記した D N Aチップ技術は、物質間の相互作用の場を提供する反応領域を基板に予め設定しておき、この反応領域中に D N A プローブ等の検出用ヌクレオチド鎖を固定しておくことによつて、この検出用ヌクレオチド鎖と相補的な標的ヌクレオ'チド鎖との間の相互作用であるハイブリダィゼ一シヨンを解析する技術であるが、ハイブリダィゼ一シヨンの効率が悪いため、同反応に長時間を要する点や、擬陽性や偽陰性が発生するため検出精度が低い点などが重要な技術的課題となっている。

この D N Aチップ技術を実施する場合において、前記反応領域中にその末端部位が固定されて存在する検出用ヌクレオチド鎖を伸長状態に調整することができれば、ランダムコイル状の分子高次構造に起因する立体障害や前記検出用ヌクレオチド鎖と周辺表面との干渉（例えば、付着や接触）による障害を排除することが可能となり、その結果、ハイブリダィゼーシヨンの効率が向上すると考えられる。

そこで、本発明は、反応領域に対向電極を設けておき、これに定の電界を印加することによって、物質の高次構造調整、移動、定化等を自在に行うことができるバイオアツセィ用基板の提並びにその製造方法を提供することを主な目的とする。明の開示

本発明で提供するバイオアツセィ用基板の基本構成は、物質間の相互作用の場を提供する反応領域と、該反応領域に臨むように配置された第 1電極と、を少なくとも備える「第 1基板」と、該第 1 電極に対向するように形成された第 2電極を少なくも備える「第 2基板」と、が重ね合わされた形態のものであり、また、第 1 電極と第 2電極の対向軸が反応領域の底面に対して垂直となるものである。

そして、第 1基板側の第 1電極部位に光源を設け、第 2基板側の第 2電極部位に受光部を設けた構成、あるいは、前記第 1電極部位に受光部が設けられ、前記第 2電極部位に光源が設けられた構成のバイオアツセィ用基板も提供できる。

次に、本発明では、物質間の相互作用の場を提供する反応領域と、該反応領域に臨むように設けられた第 1電極と、を少なくとも備える検出部が設けられた「第 1基板」と、前記第 1電極との間で前記反応領域に電界印加可能な第 2電極が少なくとも設けられた「第 2基板」と、を用いて、これら二枚の基板を、前記第 1電極と前記第 2電極とが対向するように重ね合わせるバイオアツセィ用基板の製造方法を提供する。

また、複数個の前記検出部が配列された「第 1基板」と、複数個一組の前記検出部のそれぞれに配置されている前記第 1電極との間で対向電極の関係を形成する共通第 2電極が設けられた「第 2基板」と、を重ね合わせる製造方法を提供する。この「共通第 2電極」は、複数の第 1電極との間で対向電極を形成できるので、電極構成を簡易化できる。

さらに、円盤状の形態をなす二枚の基板を重ね合わせる場合では、複数の前記検出部が基板中央から放射状列、同心円状列、スパイラル状列のいずれかの形状をなして配設された円盤状の「第 1基板」と、一つの前記形状列に属する一部又は全部の検出部にまたがる帯状又は線状の前記共通第 2電極が形成された「第 2基板」と、を重ね合わせる製造方法

も提供する。

ここで、本発明で使用する主たる技術用語の定義付けを行う。まず本発明において用いられる「相互作用」は、物質間の非共有結、共有結合、水素結合を含む化学的結合あるいは解離を広

S M味し、例えば、核酸（ヌクレオチド鎖）間の相補結合である八ィブリダィゼーシヨンを含む。

次に、「対向電極」は、電極面が向かい合った状能配置される少なくとも一対の電極を意味する。「対向軸」とは、対向する二つの電極面の中心同士を結ぶ直線によって形成される軸を意味する

で、本発明において「核酸」とは、プリンまたはピリミジン塩基と糖がグリコシド結合したヌクレオシドの U ン酸エステルの重合体を意味し、 D Ν Αプローブを含むオリゴヌクレオチド、、ポリヌクレオチド、プリンヌクレオチドとピリミジンヌクレオチォドが重合した D N A (全長あるいはその断片）、逆転写により得られる c D N A ( c D N Aプローブ）、 R N A ポリアミドヌクレォチド誘導体（ P N A ) 等を広く含む。

「ハイブリダィゼ一シヨン」は、相補的な塩基配列構造を備えるヌクレオチド鎖間の相補鎖（二本鎖）形成反応を意味する。「ミスハイブリダィゼ一シヨン」は、正規ではない前記相補鎖形成反応を意味し、本発明では、しばしば「ミスハイプリ」と略称する。

「反応領域」は、ハイブリダィゼーシヨンその他の相互作用の反応場を提供できる領域であり、例えば、液相やゲルなどを貯留できるゥエル形状を有する反応場を挙げることができる。この反応領域で行われる相互作用は、本発明の目的や効果に沿う限りにおいて、狭く限定されない。例えば、一本鎖核酸間の相互反応、即ちハイブリダィゼーシヨンに加え、検出用核酸から所望の二本鎖核酸を形成し、該ニ本鎖核酸とペプチド（又はタンパク質）の相互反応、酵素応答反応その他の分子間相互反応も行わせることも可能である。例えば、前記二本鎖核酸を用いる場合は、転写因子であるホルモンレセプ夕一等のレセプタ一分子と応答配列 D

N A部分の結合等を分析することができる。

「立体障害（steric hindrance) は、分子内の反応中心等の近ィ旁に嵩高い置換基の存在や反応分子の姿勢や立体構造（高次構造）によって、反応相手の分子の接近が困難になることによって、所望の反応（本発明では、ハイブリダィゼーシヨン）が起こりにくくなる現象を意味する。

「誘電泳動」は、電界が一様でない場において、分子が電界の強い方へ駆動する現象であり、交流電圧をかけた場合も、かけた電圧の極性の反転につれて分極の極性も反転するので、直流の場合と同様に駆動効果が得られる（監修 · 林輝、「マイクロマシンと材料技術（シーエムシー発行）」、 P 3 7〜 P 4 6 · 第 5章 · 細胞および D N Aのマニピユレ一ション参照）。

「バイオアツセィ用基板」は、生物化学的、あるいは分子生物的な分析や解析を目的に使用される情報集積基板を意味し、いわゆる D NAチップを含む。

本発明によれば、現在普及している確立された光ディスクの製造技術を用いて、対向電極を備えるバイオアツセィ用基板を低コス卜で、かつ容易に製造することができる。バイオアツセィ用基板の対向電極に所定の電界を所定のタイミングで印加することによって、前記反応領域中に存在する核酸等の物質の高次構造調整、電界に沿って物質の移動、物質の末端部位の電極表面への固定化等を自在に行うことができる。図面の簡単な説明

第 1 図は、本発明に係るバイオアツセィ用基板の基本構成の一例と該バイオアツセィ用基板（ 1 ) の基本的な製造方法を説明するための図である。

第 2図は、第 1 図中の I 一 I線矢視断面図（重ね合わされた状態）である。

第 3図は、本発明に係るバイオアツセィ用基板の第二の基本構成の一例と該バイオアツセィ用基板（ 2 ) の基本的な製造方法を説明するための図である。

第 4図は、第 3図中の I I 一 I I 線矢視断面図（重ね合わされた状態）である。

第 5図は、本発明に係るバイオアツセィ用基板の第三の基本構成を説明する図であって、該バイオアツセィ用基板（ 3 ) を構成する円盤状の第 1基板（ 3 1 ) の構成を示す図である。

第 6図は、同バイオアツセィ用基板（ 3 ) を構成する円盤状の第 2基板（ 3 2 ) の構成を示す図である。

第 7図は、第 1基板（ 3 1 ) と第 2基板（ 3 2 ) とが重ね合わされた状態の同バイオアツセィ用基板（ 3 ) の断面図である。第 8図は、本発明に係るバイオアツセィ用基板で採用可能な円盤状の第 1基板の変形例（ 4 1 ) の構成を示す図である。

第 9図は、本発明に係るバイオアツセィ用基板に対向電極を形成するときに採用できる他の実施形態を示す図である。

第 1 0図は、本発明に係るバイオアツセィ用基板（ 1 ) の発展形態の例を説明するための図である。

第 1 1 図は、バイオアツセィ用基板（ 1 ) の要部外観斜視図である。

第 1 2図は、同要部の縦断面図であり、標的 D N A ( T ) が電界により伸長されながら移動している様子を模式的に示す図である

第 1 3図は、同要部の縦断面図であり、 D N Aプローブ（D ) と標的 D N A ( T ) との間でのハイブリダィゼ一シヨンが進行して二本鎖 D N Aが形成されている状態を模式的にしている図である。発明を実施するための最良の形態

以下、本発明に係るバイオアツセィ用基板の製造方法の好適な実施方法及び同バイオアツセィ用基板の好適な実施形態について、添付図面を参照しながら説明する。

まず、第 1 図は、本発明に係るバイオアツセィ用基板の基本構成の一例と該バイオアツセィ用基板の基本的な製造方法を説明するための図であり、第 2図は、第 1 図中の I 一 I線矢視断面図である。これら第 1 図、第 2図に示された符号 1 は、本発明に係るバイオアツセィ用基板を表している。

このバイオアツセィ用基板 1 は、符号 1 1で示す下側の第 1基板と、符号 1 2で示す上側の第 2基板と、から構成されている。バイオアツセィ用基板 1 は、これら二枚の基板 1 1 と 1 2 とを正確に位置合わせして重ね合わせることによって製造される。

第 1基板 1 1や第 2基板 1 2 は、ガラスや合成樹脂で形成されており、少なくとも、ハイブリダィゼーシヨンなどの相互作用を検出するために用いる励起光が照射される側の基板は、該励起光の所定波長域で透明な部材で形成するのが望ましい。本実施形態では、第 1基板 1 1が透明樹脂で形成されている。

下側の第 1基板 1 1 の所定位置（例えば、中央位置）には、少なくとも一つの検出部 Xが設けられている。この検出部 Xには、上方に開口する所定容積のゥエル（凹部）である反応領域 Rと、この反応領域 Rの底面中央に配置された、金やアルミニウム等の金属や光透過性の I T〇（インジウム一スズ—オキサイド）などの導電性材料から形成された第 1電極 Eェェと、が設けられている。

反応領域 Rは、相互作用の場となる溶液を貯留したり、ゲルなどを保持したりできる領域又は空間として機能する。この反応領域 Rに設けられた第 1電極 Eェェは、第 2基板 1 2が第 1基板 1 1上に正確に位置合わせされて重ね合わされたときに、前記第 2 基板 1 2 の所定位置に設けられた第 2基板 E _{1 2}との間で、反応領域 Rの底面に対して垂直方向の対抗軸を備える対向電極を形成する。両電極 E iェ一 Eェ ₂間に電圧が印加されたときに、反応領域 R中の媒質に電界を形成する役割を果たす。なお、対向電極間の距離は、 1 m〜 1 m m程度である。

また、この第 1 電極 E ₁は、 D N Aプローブ Dに代表される検出用物質を固定化するための検出表面として機能させることも可能である。この場合において第 1電極は、予め D N A プローブ D等の検出用物質の末端を固定化できる表面処理を施しておく。なお、前記第 2電極 E _{1 2}を固定化の検出表面として用いることも可能である。

検出用物質が D N Aプローブ Dである場合を例に挙げると、その固定方法としては、電極表面と D N Aプローブ Dの末端がカップリング反応等の反応によって固定されるようにしても良い。例えば、ストレプトアビジンによって表面処理された電極表面の場合には、ピオチン化された D NAプローブ D末端の固定に適している。あるいは、チォ一ル（ S H) 基によって表面処理された電極表面の場合には、チォ一ル基が末端に修飾された D N Aプローブ Dをジスルフィド結合（— S— S—結合）により固定することに適している。

なお、第 1基板 1 1 の第 1電極 Ε _{1 :ί}や第 2基板 1 2 の第 2電極 Ε _{1 2}の各表面は、 S i 〇 ₂、 S i N、 S i 〇 C、 S i O F、 S i C T i 0₂のいずれか一つから選択される材料によって形成した絶縁層（図示せず。）で覆うことが望ましい（後述する形態の検出部でも同様。以下説明割愛）。これは、反応領域 R中に貯留される場合があるイオン溶液による電気化学的な反応を防止するためである。

続いて、第 3図は、本発明に係るバイオアツセィ用基板の第二の基本構成の一例と該バイオアツセィ用基板の基本的な製造方法を説明するための図であり、第 4図は、第 3図中の I I 一 I I 線矢視断面図である。

第 3図、第 4図において符号 2で示されたバイオアツセィ用基板は、上記したバイオアツセィ用基板 1 の場合と同様に、二枚の基板が重ね合わされて製造される。即ち、符号 2 1で示された第 1基板と符号 2 2で示された第 2基板とが重ね合わされることにより製造される。

このバイオアツセィ用基板 2 を構成する下側の第 1基板 2 1 には、計 5個（ 5個に限定しない。）の検出部 Xが所定間隔で並設されており、これら各検出部 Xの各反応領域 Rのそれぞれの底面には第 1電極 E _{2 1}が配置されている。一方の第 2基板 2 2 には、該基板長手方向に延びる線状又は帯状の第 2電極 E _{2 2}が設けられている。なお、前記第 1電極 E ₂ェは、図示されたような別個独立の電極とするのではなく、第 2電極 E _{2 2}と同様に、線状又は帯状の一体の電極であってもよい。

線状又は帯状をなす第 2電極 E _{2 2}は、第 1基板 2 1 の上に第 2基板 2 2が重ね合わされたときに、すべての第 1電極 E _{2 1}を相手にして対向する共通電極として機能する。即ち、スィッチ S をオンにすると、電源 Vを介して、各反応領域 R中の媒質に対して同時に電界が形成される構成となっている（第 4図参照）。

続いて、第 5図は、本発明に係るバイオアツセィ用基板の第三の基本構成を説明する図であって、該バイオアツセィ用基板を構成する円盤状の第 1基板の構成を示す図である。第 6図は、同パィォアツセィ用基板を構成する円盤状の第 2基板の構成を示す図である。第 7 図は、第 1基板と第 2基板が重ね合わされた状態の同バイオアツセィ用基板の断面図である。

まず、第 5図に示す円盤状の第 1基板 3 1 は、その中心部に円形の孔 3 1 1 が形成されており、かつ該第 1基板 3 1 の上面には放射状あるいは同心円状をなすように配設された計 8列の検出部 X群が設けられている。各検出部 X (の反応領域 R ) には、第 1電極 E _{3 1}がそれぞれ配置されている。この第 1電極 E _{3 1}群は、孑し 3 1 1 の周囲に形成されたリング状の第 1通電部 3 1 2 に接竊状態で導出する配線 3 1 3 に接続されている。なお、第 1通電 3 1 2は、孔 3 1 1 の周壁面に露出している。

第 6図に示されている、前記第 1基板 3 1 と同口径の円盤状の第 2基板 3 2 は、その中心部に前記孔 3 1 1 と同口径の孔 3 2 1 が形成されており、該第 2基板 3 2の下面には、放射状をなすように配設された線状又は帯状をなす計 8条（ 8条に限定しない。）の共通電極 E _{3 2}が形成されている。各共通電極 E _{3 2}は、孔 3 2 1 の周囲に形成されたリング状の第 2通電部 3 2 2 に接続されている。なお、第 2通電部 3 2 2は、孔 3 2 1の周壁面に露出している。

これらの第 1基板 3 1 と第 2基板 3 2 とを正確に所定の位置決めを行い、公知の光ディスク貼り合わせ技術等を応用して重ね合わせし、バイオアツセィ用基板 3 を形成すると、第 2基板 3 2 の各共通電極 E _{3 2}は、下側の第 1電極 E ₃ェの各列の真上に、反応領域 Rを横断又は縦断するように正確に配置されることになる。これにより各共通電極 E _{3 2}と対向電極を形成する（第 7 図参照）。

このとき、第 1通電部 3 1 2 と第 2通電部 3 2 2 とは一体化し、第 7 図中に符号 3 4で示されたような一つの通電部を形成することになる。この通電部 3 4は、孔 3 5 に挿着される通電治具 3 6 と接触して通電され、これにより対向電極 E _{3 1} _ E _{3 2}に電圧が印加される。なお、通電の方法はこれに限定されず、対向電極 E ₃ェ一 E _{3 2}に電圧が印加できれば採用可能である。また、前記孔 3 5 には、バイオアツセィ用基板 3 を保持又は回転させるための図示しないチヤッキング機構も揷入される。

第 8図は、本発明に係るバイオアツセィ用基板で採用可能な円盤状の第 1基板の変形例の構成を示す図である。図示された変形例である第 1基板 4 1 には、上方視スパイラル状に配列された多数の検出部 X群が設けられている。なお、各検出部 Xには、符号 E ₄ iで示す第 1電極が設けられている（第 8図参照）。

第 1 基板 4 1 のような配列構成からなる検出部 X群の場合でも、これと同軌道のスパイラル状に延設された共通第 2電極を備える第 2基板（図示せず。）を重ね合わせたり、あるいは前記検出部 X群をスパイラル状で、かつ放射列状に配列しておくことによって、例えば、上記したような第 2基板 3 2などを重ね合わせたりすることで、対向電極を形成することができる。

第 9図は、本発明に係るバイオアツセィ用基板に対向電極を形成するために採用できる他の実施形態を示す図である。下側の第 1基板には、検出部 Xを横断（又は縦断）する給電配線（又は帯状の電極） H I を延設しておき、一方の上方側の第 2基板には、検出部 Xを縦断（又は横断）する給電配線（又は帯状の電極） H 2 を延設しておくようにする。このような構成では、給電配線（又は帯状の電極） H 1 と同 H 2が交差する領域 Yにおいて、対向電極を簡単に形成することができる。

次に、第 1 0図は、本発明に係るバイオアツセィ用基板の発展形態の例を説明するための図である。この実施形態を既述したバィォアツセィ用基板 1 に適用した場合で説明する。

まず、対向電極を構成する一方の電極 £ェェ又は（電極 E _{1 2} ) に微小サイズの光源（例えば、発光ダイオードや半導体レーザ） Pを設け、かつ第 1基板 1 1 に光源 Pと光ファイバで結ばれた導波路構造を設けておき、他方の電極 Eェ ₂ (又は電極 Eェには、前記光源 Pからの出射光により発生した蛍光（例えば、蛍光インターカーレ一夕からの蛍光）を捕捉する受光部である光ディテクター Qを一体化して設けておく。

この場合、各電極 E i，又は電極 Eェ ₂は、 I T〇などの透明な導電体で形成しておけば、光源（例えば、発光ダイオードや半導体レーザ） Pや光ディテクター Qを電極電極 E _{1 2}の内部や反応領域：に臨んでいない面側に設けることができる。なお、第 1 0図の符号 Uは、光ディテクター Qに接続する解析部を示している。

続いて、第 1 1 図〜第 1 3図を用いて、本発明に係るバイオアッセィ用基板を D N Aチップとして用いる場合のバイオアツセィ方法の一例を説明する。なお、以下の前記方法に係わる説明は、既述した符号 1 のバイオアツセィ用基板を代表例として採用する。第 1 1 図は、バイオアツセィ用基板 1 の要部外観斜視図、第 1 2図、第 1 3図は、同要部の縦断面図である。

(検出用物質の伸長及び固定化）

D N Aプローブ Dに代表される検出用物質を含むサンプル溶液を、開口状態にある反応領域 Rに対して、図示しないインクジエツ卜ノズルやディスペンサー等を用いて所定容量滴下する。その後、第 1基板 1 1 に第 2基板 1 2 を位置決めして正確に重ね合わせた後、スィッチ Sをオンにし、電源 Vを介して、対向電極 E i 一 Eェ ₂間に高周波交流電界を印加する。なお、この際、対向電極 Eェ一 Eェ ₂の間に印加される前記電界の条件は、約 1 X I 0 ⁶ V / m、約 1 MH z の高周波高電圧の電界が好適である (Masao Wash i zu and Osamu Kurosawa： Electrostatic

Manipulation of DNA in Microfabricated Structures", IEEE Transaction on Indus trial Appl ication

Vol.26, No.26, p. 1165-1172 (1990)参照）。

なお、反応領域 Rに対するサンプル溶液の滴下は、第 2基板 1 2 の反応領域 Rに臨む部分に所定の孔を形成しておき（図示せず）、この孔から滴下するようにしてもよい。このような構成では、サンプル溶液を滴下する場合において、その都度、第 2基板 1 2 を第 1基板 1 1 上から取りはずして反応領域 Rを開口させる必要がなくなる。

ここで、反応領域 Rに対して前記高周波交流電界が形成されると、この反応領域 Rには、電極 Eェ ₂よりも狭小な表面面積に形成された電極 E _{1 :L} (第 1 1図参照）の表面付近あるいはこの電極 E iェのエッジ付近に電気力線が集中して、不均一電界が形成される。

この不均一電界の作用によって、前記反応領域 R中にランダムに分散して存在している検出用物質である D N Aプローブ Dが前記不均一電界に沿った方向に伸長し、直鎖状の高次構造に調製されながら誘電泳動の作用で電極 Eェェに向けて移動し、最終的には、検出用物質の末端部位が電極 Eェェの表面に、特異的な力ップリング反応等によって固定化される（第 1 1 図参照）。その後、反応領域 Rの所定のバッファ一溶液を投入して洗浄作業を行い、余剰の D N Aプローブ Dを除去したり、乾燥させたりしてもよい。

なお、特に、検出用物質が固定化される検出表面として利用する第 1電極 E ェの表面を、凹凸や突起のある粗面状に加工しておいてもよい。例えば、凹凸が島状になるようにパ夕一ニング形成しておくことによって、電気力線が、第 1電極 E _{t l}の表面の凸部位（山状部位）に集中し易くなつて、不均一電界がより形成され易くなり、また、 D N Aプローブ Dを整列固定化し易くなる。第 1電極 E ェの粗面形態は限定されない。また、電極表面を粗面加工する方法は、例えば、公知のスパッタリング技術及びエツチング技術等を用いて実施することができるが、該方法も特に限定されない。

(標的物質 Tの滴下及び伸長移動）

次に、固定化された前記 D N Aプローブ Dと相補的な塩基配列を有する標的 D NA (符号 T) を含むサンプル溶液を、第 2基板 1 2が取り外されて再び開口状態とされた反応領域 Rに滴下し (又は第 2基板 1 2 に設けられた図示しない孔から滴下し）、その後、スィッチ Sをオンにし、電源 Vを介して、対向電極一 Eェ ₂間に高周波交流電界を印加する。なお、この際、対向電極 E 一 Eェ ₂の間に印加される前記電界の条件は、約 1 X I 0 ⁶ VZm、約 1 MH z の高周波高電圧の電界が好適である（Masao Wash i zu and Osamu Kurosawa： Electrostatic Manipulation of DNA in Microf abr icated Structures", IEEE Transaction on Industrial Application Vo 1.26, No.26， p.1165-1172 (1990)参照）。

この電界印加によって、反応領域 Rで生じた不均一電界中において、符号 Tで示す標的 D NAを、誘電泳動の電気力学的効果によって、電界強度のより強い電極 Eェ iの方へ、伸長させながら移動（泳動）させることができる（第 1 2図参照）。

その結果、符号 Dで示す D N Aプローブ Dが予め固定された電極表面上に符号 Tで示す標的 D N Aが集まって濃度が高まり、ハイブリダィゼ一シヨンが進行し易い環境が形成され、ハイブリダィゼ一シヨン時間を短縮させることができる。

加えて、 D N Aプローブ Dを、不均一電界の作用により、第 1 電極 Eェェ表面に伸長状態で整列固定化させることができるので、前記検出用物質のランダムコイル状の高次構造が原因となる立体障害によるハイブリダィゼーシヨンの阻害やミスハイブリダィゼーシヨンを減少させることが可能となる。このため、ハイブリダィゼーシヨンの効率と精度を向上させることができる。

(ハイブリダィゼーシヨン）

ハイブリダィゼーシヨンの際は、一旦スィッチ Sをオフにすることによって反応領域 R中における電界をゼロの状態とし、専ら自然なブラウン運動に委ねて行うようにする。第 1 3図は、 D N Aプローブ Dと符号 Tで示す標的 D N Aとの間でのハイブリダィゼーシヨンが進行して、その結果、二本鎖 D N Aが形成されている状態が模式的に示されている。

なお、反応領域 Rにおいて、ハイブリダィゼーシヨンによつて形成された二本鎖 D N Aには、予め符号 Tで示された標的 D N A と一緒に反応領域 Rに投入された蛍光インターカーレ一夕、あるいは、八イブリダィゼ一シヨン後に反応領域 Rに投入された蛍光ィンターカーレ一夕に対して、所定の励起光を照射すると蛍光を発するようになる。この蛍光強度を検出する光学的手段（分光手

) によ.つて、ハイブリダィゼーシヨンを検出することが可能となる。また、前記ハイブリダィゼーシヨンの検出は、検出用物質である D N Aプローブ Dに標識された蛍光物質が発する蛍光を検出する方法で行うこともできる。なお、本発明において、当該検出手段は特に限定されない。産業上の利用可能性

本発明によれば、ハイブリダィゼ一ション等の相互作用の効率が良いので、該相互作用の時間も大幅に短縮することができ、かつ正確な相互作用が進行し易い環境を形成できるので、擬陽性や偽陰性の発生を少なく抑えることができる。このため、相互作用検出のためのアツセィ作業の効率に優れ、かつ検出精度が高いという特性を備えた D N Aチップ等のバイオアツセィ用基板及びその製造方法に利用することができる。

Claims

請求の範囲

1 . 液相中での物質間の相互作用の場を提供する反応領域と、該反応領域に臨むように配置された第 1電極と、を少なくとも備える第 1基板と、

該第 1電極に対向するように形成された第 2電極を少なくも備える第 2基板と、が重ね合わされたことを特徴とするバイオアッセィ用基板。

2 . 前記第 1電極と前記第 2電極の対向軸が、前記反応領域底面に対して垂直であることを特徴とする請求の範囲第 1項記載のバイオアツセィ用基板。

3 . 前記第 1電極部位に光源が設けられ、前記第 2電極部位に受光部が設けられていることを特徴とする請求の範囲第 1項記載のバイオアッセィ用基板。

4 . 前記第 1電極部位に受光部が設けられ、前記第 2電極部位に光源が設けられていることを特徴とする請求の範囲第 1項記載のバイオアッセィ用基板。

5 . 物質間の相互作用の場を提供する反応領域と、該反応領域に臨むように設けられた第 1電極と、を少なくとも備える検出部が設けられた第 1基板と、

前記第 1電極との間で前記反応領域に電界印加可能な第 2電極が少なくとも設けられた第 2基板と、を用いて、

これら二枚の基板を、前記第 1電極と前記第 2電極とが対向するように重ね合わせるバイオアツセィ用基板の製造方法。

6 . 複数個の前記検出部が配列された前記第 1基板と、複数個一組の前記検出部のそれぞれに配置されている前記第 1電極との間で対向電極の関係を形成する共通第 2電極が設けられた前記第 2基板と、を重ね合わせることを特徴とする請求の範囲第 5 項記載のバイオアツセィ用基板の製造方法。

7 . 複数の前記検出部が基板中央から放射状列をなして配設された円盤状の前記第 1基板と、一つの放射状列に属する一部又は全部の検出部にまたがる帯状又は線状の前記共通第 2電極が形成された前記第 2基板と、を重ね合わせることを特徴とする請求の範囲第 5項記載のバイオアツセィ用基板の製造方法。

8 . 複数の前記検出部が同心円状列をなして配設された円盤状の前記第 1基板と、一つの同心円状列に属する一部又は全部の検出部にまたがる帯状又は線状の前記共通第 2電極が形成された前記第 2基板と、を重ね合わせることを特徴とする請求の範囲第 5項記載のバイオアツセィ用基板の製造方法。

9 . 複数の前記検出部がスパイラル状列をなして配設された円盤状の前記第 1基板と、一つのスパイラル状列に属する一部又は全部の検出部にまたがる帯状又は線状の前記共通第 2電極が形成された前記第 2基板と、を用いることを特徴とする請求の範囲第 5項記載のバイオアツセィ用基板の製造方法。

1 0 . 前記第 1電極と前記第 2電極の対向軸は、前記反応領域底面に対して垂直であることを特徵とする請求の範囲第 5項記載のバイオアツセィ用基板の製造方法。