JP2003516710A5

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Publication number: JP2003516710A5
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Filing date: 1999-04-01
Publication date: 2009-06-18
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Description

ハイブリッド形成段階（ｃ）は標識されたプローブの定量的分離を可能にする。これは定量分析の意味で有利である。

ハイブリッド形成段階に続いて、オリゴヌクレオチドプローブ上のラベルを検出する。上記のように、ラベルに関連して、選択されたラベルに依存して業界で知られているどんな方法によってでも検出を行うことができる。望むならば、その分野で記載されているように信号増幅も使用してよい（例えば、P. Komminoth 及び M. Werner著、標的と信号増幅、その場でのハイブリッド形成の感度増大へのアプローチ、1997 Histochem, Cell Biol. 108:325-333参照）。検出はまた定性，定量または半定量でも良い。このように、例えば、比色により、色素形成によりまたは蛍光のような視覚により、またはラベルから検出しうる他の信号により標的ヌクレオチド配列の存在又は不存在の表示を簡単なイエスまたはノーで与えることができる。しかしながら、有利には、サンプル中に存在する標的ヌクレオチドの量を量的に測定することができるような検出法である。これは存在する標的の量の絶対的表示でありまたは他の定量的または半定量的表示法、例えばサンプル中の全核酸に対するパーセンテージ、比率または類似の表示法である。

そのような方法では、標的ヌクレオチド配列を含む核酸は標的分子として同じプライマー型配列を含む選択した競争者分子と共に増幅される。このようにして競争者はＰＣＲプライマー結合と増幅のために標的と競争する。競争者は標的から区別するための方法を含み、便利には、上記の検出分析に関連して記載した“標的特異”オリゴヌクレオチドプローブに類似する競争者特異オリゴヌクレオチドプローブに結合するための識別配列を含む（即ち上記の（ａ）段階のプローブ）。
このように識別配列は上記のオリゴヌクレオチドプローブの“標的領域”に類似している。標準カーブと比較するために既知の量の単独競争者を加えるかまたは種々の量、例えば一連の希釈された、種々の量の競争者を使用して一連の増幅を行ってもよい。興味のある核酸分子中の標的ヌクレオチド配列（そして競争者中の同じ配列）に側面を接する配列に相補的なプライマーを加えそしてＰＣＲ増幅を行う。競合ＰＣＲは、より正確な分析結果を与えることに関連する構造をもって実施すべき検出を可能にする。標準カーブは、その分野で公知の標準技術を使用して形成される。

図６は７ケ所のノルウェーの湖の水のプロフィール分析を示す。湖は比較的低い生物量（mesotroph）を含むものから高い有機物（eutroph）含有量を有する湖までにわたっている。一般的なプローブpUNに対する信号強度は、サンプル中の異なる遺伝子タイプの比較豊富量を得るために、プローブ標識効率での差を訂正するための純粋培養液から得られたファクターで増大させた。
〔実施例１〕
有機体及びサンプルの調製
使用した有機体はノルウェー水研究所からのものである。培養は媒体z8中で実施した。証明は蛍光ランプに菌株を30μEm2s-1で暴露することによって与えられた。２種類のMicrocystis
aeruginosa株（ NIVA-CYA 228/1及び43）を分析の展開における鋳型として使用した。この系はまたノルウェーのアケルスヴアネツト湖から採集された実験的に変更された水サンプルについても試験した。細胞数はFuchst-Rosenthal計数室（Carl Hecht、ゾントハイム、ドイツ）内で顕微鏡により計数した。
ＤＮＡは単藻類培養の細胞ペレットからの標準フェノール／クロロフォルムプロトコールで精製するか、または固相細胞濃縮及びＤＮＡ精製プロトコールによって精製した。（Rudi, K., Larsen F.及び Jakobsen K.J.応用及び環境微生物学(1998), 64, 第１巻，34-37頁参照）。固相プロトコールでは水溶液１mlからのシアノバクテリアの細胞を50％イソプロパノール0.75Ｍ酢酸アンモニウム及び１Ｕ（ビーズを200μl溶解した緩衝液）ディナビーズDNA DIRECT(Dynal A/S、オスロ、ノルウェー)を含む緩衝液中のパラマグネチックビーズ（最終容積2ml）上に２０分間吸着させた。マグネチックビーズと吸着されたバクテリアを2mlミクロ遠心分離機チューブの側壁にMPC-Qマグネット(Dynal A/S)によって吸引した。次に20μlの４Mグアニジンチオシアネート−１％サルコシル液を添加し、65℃で10分間培養を続けた。96％エタノール40μlを加えてＤＮＡをビーズ上に沈殿させ続いて室温で５分間培養した。最後にＤＮＡとビーズの複合体を各洗浄の間にマグネットを使用して70％エタノール500μlで２回洗浄した。残存エタノールを除去するために複合体を65℃で５分間乾燥した。全部のビーズとDNA複合体を増幅反応に使用した。
競合ＰＣＲ（図１Ａに図示）
Microcystis
からのゲノムＤＮＡの選択的増幅のために、我々は16SrDNAプライマー5’-AGCCAAGTCTGCCGTCAAATCA-3’(CH)及び 5’-ACCGCTACACTGGGAATTCCTG-3’(CI(Rudi, K. et al. In Appl. Environ. Microbiol. 63, 2593-2599)を使用した。競争者5’-AGCCAAGTCTGCCGTCAAATCAAGCTGCCTCACTGCGGAGCTCGGACCAGGAATTCCCAGTGTAGCGGT-3’は、循環標識づけ反応に使用したＰＣＲプライマーCH−CI及びプライマーＤＫ（下記参照）に対して相補的配列をもつオリゴヌクレオチドである。増幅反応はGene Amp 2400 サーモサイクラー（Perkin Elmer,
Norwalk, Conn）を使用して、10pmolのプライマー、６×１０-９pmolの競争者、各々200μMのジオキシヌクレオチドトリホスフェート、10mMのトリス−Hcl(pH8.8)、1.5mMのMgcl2、50mMのkcl、0.1%トリトンＸ-100、1ＵのDynaZyme DNAポリメラーゼ（Finnzymes Oy,Espoo，フィンランド）及び最終容積50ml中の精製ＤＮＡを含むものであった。増幅の前にＤＮＡを94℃で４分間変性し、増幅後、72℃で７分間の伸展段階を包含した。パラメーターを使用して94℃で30秒、58℃で30秒及び72℃で30秒の周期で40サイクル実施した。

循環標識づけ（図１Ｂに図示）
循環標識反応で、競合反応からのＰＣＲ生成物5μlを使用した。デオキシヌクレオチドトリホスフェートを100nmトリスHcl（pH8.0）50nmMgcl２及び１Ｕシュリンプアルカリホスファターゼ（USB，クリーブランド、OH）の添加によって脱燐酸し、続いて37℃で１時間培養した。最後に96℃で１０分間加熱することによりホスファターゼを不活性化した。
競争者に対して相補的なプライマー5’GTCCGAGCTCCGCAGTGAGGCAG-3’(DK)3pmol、Microcystis ampliconに対して相補的なプライマー5’-TCTGCCAGTTTCCACCGCCTTTAGGT-3’(DB)3pmol、ddATP 10pmol、ddGTP 10pmol、ddTTP（ベーリンガー、マンハイム、ドイツ）10pmol、蛍光-12- ddCTP（NEN，ボストン、マサチューセッツ）7pmol、サーモンシクエナーゼ反応緩衝液1.25μl、酵素希釈緩衝液1.1μl、サーモシクエナーゼ（Amershamインターナショナルplc、バッキンガムシャーイギリス）0.15ml及びホスファターゼ処理PCR生成物6mlを含有する容積20mlについて循環標識づけ反応を実施した。パラメータを使用し95℃で30秒間及び50℃で4分間の25サイクルで標識づけを行った。

ハイブリッド形成及び発色検出（図１Ｃ及びＤに図示）
１ml（100pmol／ml）のプライマー5’-ACCTAAAGGCGGTGGAAACTGGCAGA-3’(DA)及び5’-CTGCCTCACTGCGGAGCTCGGAC-3’(DJ)を膜ストリップ（0.4×２cm）GeneScreen（NEN）上にスポットしその後5000ジュール／cm２で紫外線架橋させた。プライマーＤＡはプライマーＤＢに相補しプライマーＤＪはプライマーＤＫに相補する。0.7×SSC、１×SPEP、５×Denhardts及び100μg／mlの非相同ＤＮＡを含有する予備ハイブリッド形成溶液中で37℃で２時間ストリップを予備ハイブリッド形成した。循環標識づけ反応からの生成物を２mlミクロ遠心分離チューブ中のハイブリッド形成溶液（0.7×SSC、１×SPEP、１×Denhardts10％デキシトランサルフェート及び100μg／ml非相同ＤＮＡ）0.5ml中に添加し、95℃で５分間変性した。ストリップを加え、37℃でゆるやかな倒置法で２時間培養を続けた。膜ストリップを50ml（１×SSC及び１％SDS）中で洗浄し次に50ml（0.１×SSC及び0.１％SDS）中で、最後に２回50ml （0.10Mトリス−Hcl〔pH7.5〕及び0.15M Nacl）中で洗浄した。核洗浄は室温で短い渦動によって行った。
抗体検出のために、膜ストリップを20ml （0.10Mトリス−Hcl〔pH7.5〕、0.15M Nacl及び0.5％スキムミルク）溶液で１時間ブロックし、1／1000抗蛍光−HRPコンジュゲート（NEN）を含む同じ緩衝液10ml中で更に１時間培養した。膜ストリップを50mlの（0.10Mトリス−Hcl〔pH7.5〕及び0.15M Nacl）溶液中で短い渦動により３回洗浄した。発色反応は製造者（NEN）の支持に従って、ＨＲＰの発色検出ためのRENAISSANCE 4CNプラスを用いて５分間実施した。
信号の比強度はCCDビデオカメラ（CohuハイパフォーマンスCCDカメラ、日本）を使用して測定し、ゲル−プロANALYZERソフトウエア（Media Cybernetics，Silver Spring Md．）を使用して分析した。

精製ＤＮＡを含む規定サンプルについての検出分析
滴定実験によって競争者の最適量（検出下限を得るためと再現可能な増幅のための両方）がサンプル当り6×10-9pmol（即ち3600分子）であることが分かった。従って、Microcystis aeruginosa NIVA-CYA 43からの精製ＤＮＡについての分析試験に6×10-9pmolの競争者を使用した。約10７ないし10０ゲノムコピー（推定ゲノムサイズ5±3Mb（9b））からのMicrocystis ＤＮＡの希釈シリーズを競合ＰＣＲ分析（図２Ａ）及びその後の標識分析（図２Ｂ）の両方に使用した。
標的物質の競争者生成物に対する比の測定はアガロースゲル電気泳動法として10５ないし10２ゲノムコピーの範囲で与えられた（図２Ｃ）。これに対して本発明の課題である標識分析では10７ないし10２ゲノムコピーより大きい定量範囲を与えた。これは、アガロースゲル電気泳動検定と比較して動的範囲で約100倍の増加である。10コピーというような少ない量でも、発色検出反応の培養時間を5ないし30分間増加することにより標識分析で検出することができた。発色検出反応のライブビデオ捕捉がこのレベルまでの定量範囲を与えるために使用される。即ち、標的及び競争者のスポットの色密度のため、0ないし30分間の時間曲線を比信号強度の外挿のために使用できる。しかし競争者のスポットは30分後には色密度が飽和する。

標識づけ反応中のサイクル数による定量範囲への効果
循環標識づけ反応は、増幅したＤＮＡの直接検出に比較して分析の定量的範囲を増大した。競合ＰＣＲのためには−標的濃度のための対数スケールを使用して−、競争者と標的の信号の比率は比較的せまい定量範囲をもつＳ-字状の曲線となった（Ｆｉｇ．２Ｃ参照）。僅か数回の標識づけサイクルでも循環標識づけ分析を実施することによりＳ-字状曲線が得られた。然し標識づけサイクルの数を増加することにより競争者または標的オリゴヌクレオチドは各希釈シリーズの最終点でラベルで飽和されて（即ちすべてのプローブが標識されて）、その結果、より広い定量範囲をもつカーブを導き出した（図２Ｃ参照）。サイクルの数を増加することで更に、カーブの中間部で両方のオリゴヌクレオチドがラベルで飽和されるために中間部が平坦になったカーブを与えた。

水サンプル中のＭｉｃｒｏｃｙｓｔｉｓの定量
Ｍｉｃｒｏｃｙｓｔｉｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａ（ＮＩＶＡ-ＣＹＡ４３及び２２８／１株）の希釈シリーズ（１０５−10°セル／ｍｌ）について固相細胞濃縮及びＤＮＡ精製を含む完全定量分析を実施した。反応特異性のコントロールとしてＰｌａｎｋｔｏｔｈｒｉｘａｇａｒｄｈｉｉＮＩＶＡ−ＣＹＡ８３／１（フィラメント状及びヘテロシスト含有）を使用した。Ｍｉｃｒｏｃｙｓｔｉｓ培養液を純水、１０５セル／ｍｌのＰｌａｎｋｔｏｔｈｒｉｘａｇａｒｄｈｉｉＮＩＶＡ−ＣＹＡ２９含有水、１０５セル／ｍｌのＡｎａｂａｅｎａｌｅｍｍｅｒｍａｎｉｉＮＩＶＡ−ＣＹＡ２９（フィラメント状）とＡｎａｂａｅｎａｌｅｍｍｅｒｍａｎｉｉＮＩＶＡ−ＣＹＡ８３／１含有水及びノルウェーのアチルスヴァトネット湖から採集した水で希釈した。

テストした異なる条件によって分析の特異性または感度に重大な相違はなかった。６×１０−９ｐｍｏｌの競争者を使用してすべての場合に１０５セル／ｍｌ以上ないし１０２セル／ｍｌに至る定量範囲を得た（ＭｉｃｒｏｃｙｓｔｉｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａＮＩＶＡ−ＣＹＡ４３の結果を図３に示してある）。発色検出反応のための培養時間を５分から３０分間に延長することにより１０セル／ｍｌまで検出することができた。

完全検出分析（固相細胞濃縮及びＤＮＡ精製を含む）のための検出曲線は精製ＤＮＡの稀釈シリーズのために得られた曲線と大体同じスロープを持ち（図２Ｃと３を比較）、細胞濃縮及びＤＮＡ精製方法（サンプル調整法）がサンプルの組成によって影響されないということを示している。更に、これらの結果は固相細胞濃縮及びＤＮＡ精製方法が水サンプルから直接定量分析に使用できることを示している。
検出限界は使用した競争者の量に依存するが競争者の下限は（６×１０−９ｐｍｏｌ）である。競争者の量を（６×１０−８ｐｍｏｌ）に１０倍に増加すると、検出限界も約１０倍に増加する結果となった（図４）。然し、６×１０−１０ｐｍｏｌへ量を下げると再現性のない結果を与えた。従って、我々は、水サンプルについての完全分析のための低い検出限界と再現可能な検出を得るためには６×１０−９ｐｍｏｌが競争者の最適量であると結論した。

水中のシアノバクテリア定量のための完全分析

Ｍｉｃｒｏｃｙｓｔｉｓ属に属するシアノバクテリアは数種類の異なるタイプの毒素を生成し、ヘパトトキシックミクロシスチンが最も重大である。この毒素は肝臓を痛める急性中毒をひき起こすのみでなく低い量で長期間さらされると発癌性腫瘍の促進剤ともなる。このように、この毒素を生産する生物体の存在をスクリーンするための連続的モニターシステムが重要である。

オーストラリアの健康管理当局（ニューサウスウェールズ、青緑色藻類調査委員会１９９２）はすでに水中のシアノバクテリア細胞数に基づいて３段階の警報システムを採用している。レベル１は５００−２０００セル／ｍｌで、このレベルで水当局は警告を出し水サンプルのモニターのための採集を増加させる。レベル２は２０００−１５０００セル／ｍｌで、この点で素性試験を行う。レベル３は１５０００セル／ｍｌ以上で、もし活性炭を使用しなければ、この水は人間の消費には安全でないと宣言される。検出限界がＭｉｃｒｏｃｙｓｔｉｓについて１００セル／ｍｌであり、定量範囲は数量の３次数よりも多いのでここに記載する本発明方法は、低濃度のＭｉｃｒｏｃｙｓｔｉｓをモニターするのにも飲料水中の潜在的な毒性のある水ブルームを検出するのにも両方に適するものである。

複合分析の開発
固相細胞濃縮とＤＮＡ精製法を含む一般的なサンプル調製と検出方法での特異性とを組み合わせて複合検出が可能である。競合ＰＣＲを使用して、競合反応に例えばユニバーサル１６ＳｒＤＮＡプライマーを使用して複数の標的を定量できる。続いて、異なるオリゴヌクレオチドプローブを決められたバクテリアグループのための記名配列に基づいて標識づけすることができる。そして最後にバクテリア群の各々のための信号と競争者の信号との比を比較することができる。

実施例２
形態学／細胞学に基づく伝統的な分類とちがって、核酸配列に基づく分類は生物体の進化論や発生学を反映している。
１６ＳｒＤＮＡ−標的プローブは、多数のシアノバクテリア群、Ｍｉｃｒｏｃｙｓｔｉｓ，Ｐｌａｕｋｔｏｔｈｒｉｘ，Ａｎａｂａｅｎａ及びＡｐｈａｎｉｚｏｍｅｎｏｎを検出するために構成された。プローブは又、異なる系統深さの群を区別するためにも構成された。１つのプローブがＮｏｓｔｏｃ群（これはＡｎａｂａｅｎａ及びＡｐｈａｎｉｚｏｍｅｎｏｎを包含する）を検出するために構成され、そして１つのプローブはすべてのユーバクテリア（Ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔｓを包含する）を検出するために構成された。構成されたプローブの特異性を単藻類の培養液について試験した。この情報を続いて７つの湖群中の生物体標的の比較分布及び豊富さを決定するために使用した。

生物体及びサンプル調製
ノルウェーの水研究所から得た下記の単藻類培養液を使用した：ＡｐｈａｎｉｚｏｍｅｎｏｎｇｒａｃｉｌｅＮＩＶＡ-ＣＹＡ１０３，ＡｎａｂａｅｎａｌｅｍｍｅｒｍａｎｎｉｉＮＩＶＡ−ＣＹＡ２６６／１，Ｎｏｓｔｏｃｓｐ．ＮＩＶＡ−ＣＹＡ１２４，Ｐｈｏｒｍｉｄｉｕｍｓｐ．ＮＩＶＡ−ＣＹＡ２０３，ＰｌａｎｋｔｏｔｈｒｉｘｐｒｏｌｉｆｉｃａＮＩＶＡ−ＣＹＡ３２０，ＭｉｃｒｏｒｙｓｔｉｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａＮＩＶＡ−ＣＹＡ１４３，Ｍｉｃｒｏｃｙｓｔｉｓｆｌｏｓ−ａｑｕａｅＮＩＶＡ−ＣＹＡ１４４，ＰｓｅｕｄａｎａｂａｅｎａｌｉｍｎｅｔｉｃａＮＩＶＡ−ＣＹＡ２７６／６．
培養は媒体Ｚ８[ノルウェー水研究所、オスロ（１９９０）の藻類の培養液コレクション、菌株のカタログ]中で実施した。蛍光ランプによる照明で菌株を３０μＥｍ−２Ｓ−１で暴露した。濃厚な培養液の１定分量（約１０７セル／ｍｌを含有）１ｍｌをミクロ遠心分離器中５０００ｒｐｍで１０分間ペレット化し、すぐに−８０℃で凍結した。凍結ペレットからマグネチックビーズベースのＤＮＡ，ＤｉｒｅｋｔＤＮＡ分離キット（ＤｙｎａｌＡ／Ｓ、オスロ、ノルウェー）と共に、シアノバクテリアから精製するために変性したプロトコールを使用してＤＮＡを精製した[Ｒｕｄｉ，Ｋ.,Ｋｒｏｋｅｎ,Ｍ.,Ｄａｈｌｂｅｒｇ,Ｏ．Ｊ．，Ｄａｇｇｅｒｄａｌ，Ａ．，Ｊａｋｏｂｓｅｎ，Ｋ．Ｓ．，及びＬａｒｓｅｎ，Ｆ．（１９９７）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ２２,５０６−１１参照]野外から採集したサンプルは直ちに、下記の細胞濃縮段階に記載したようにイソプロパノール中に保存した。その後サンプルを実験室に運搬し更に加工した。ＤＮＡは固相細胞濃縮法及び前にＲｕｄｉらによって開発された（１９９８）ＤＮＡ精製プロトコールによって精製された。固相プロトコールにおいては、０．８ｍｌの水溶液からの細胞を、５０％イソプロパノール、０．７５Ｍ酢酸アンモニウム及び１Ｕ（２００μｌ溶解緩衝液中のビーズ）ＤｙｎａｂｅａｄｓＤＮＡＤＩＲＥＣＴ（ＤｙｎａｌＡ／Ｓ，オスロ、ノルウェー）を含む緩衝液中でパラマグネチックビーズ（最終容積２ｍｌ）上に２０分間吸着させた。マグネチックビーズと吸着されたバクテリアを２ｍｌのミクロ遠心分離チューブの側面にＭＰＣ−Ｑマグネット（ＤｙｎａｌＡ／Ｓ）によって吸引した。続いて４Ｍグアニジンチオシアネート−１％サルコシルを２０μｌ加え、６５℃で１０分間培養を継続した。９６％エタノールを４０μｌ添加することによりＤＮＡをビーズ上に沈澱させ続いて室温で５分間培養を続けた。最後にＤＮＡとビーズの複合体を７０％エタノール５００ｍｌで２回、各洗滌の間にマグネットを使用して洗滌した。残存エタノールを除くために複合体を６５℃で５分間乾燥した。ビーズとＤＮＡの全複合体を次に増幅反応に使用した。

ＰＣＲ増幅
ユニバーサルプライマーセットＣＣ−ＣＤを使用してリボソマールＤＮＡを増幅した。ＧｅｎｅＡｍｐ２４００ＰＣＲサーモサイクラー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，ノルウェー、Ｃｏｎｎ）を使用する増幅反応は１０ｐｍｏｌプライマー、２００μＭの各デオキシヌクレオチドトリホスフェート、１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．８）、１．５ｍＭのＭｇＣｌ２、５０ｍＭのＫＣｌ、０．１％トリトンＸ−１００、１ＵのＤｙｎａＺｙｍｅＤＮＡポリメラーゼ（ＦｉｎｎｚｙｍｅｓＯｙ，エスポー、フィンランド）及び精製ＤＮＡを採集容積５０μｌ中に含有していた。増幅の前にＤＮＡを９４℃で４分間変性し、増幅後に７２℃で７分間の伸展段階を包含した。パラメーターを使用して９６℃で１５秒、７０℃で３０秒、７２℃で１分間のサイクルを３５サイクル実施した。

循環標識づけ
増幅反応からの生成物２０μｌを循環標識づけ反応に使用した。１００ｎｍのトリス-Ｈｃｌ（ｐＨ８．０）５０ｎｍのＭｇＣｌ２及び１Ｕシュリンプアルカリ性ホスファターゼ（ＵＳＢ，クリーブランド,ＯＨ）を添加してデオキシヌクレオチドトリホスフェートを脱燐酸し続いて３７℃で１時間培養した。最後にホスファターゼを９６℃で１０分間不活性化した。

循環標識づけ反応は下記の成分を含む液体８０μｌ中で実施した：下記表１に示すプライマー各々３ｐｍｏｌ,ｄｄＡＴＰ１０ｐｍｏｌ,ｄｄＧＴＰ１０ｐｍｏｌ,ｄｄＴＴＰ（ベーリンガー社製、マンハイム、ドイツ）１０ｐｍｏｌ,蛍光−１２−ｄｄＣＴＰ（ＮＥＮ製、ボストン、マサチューセッツ）７ｐｍｏｌ,サーモシークエナーゼ反応緩衝液１．２５μｌ,酵素希釈緩衝液１．１μｌ,３２Ｕ／μｌのサーモシークエナーゼ（アメルスハムファーマシアｐｌｃ,バッキンガムシャー,イギリス）０．１５μｌ及びホスファターゼ処理ＰＣＲ生成物２５μｌ。標識づけはパラメータを使用して９５℃で３０秒間、５０℃で４分間のサイクルを１０サイクル行なった。

表１オリゴヌクレオチドプローブ
プローブプローブ配列＊１
ｐＫＯ５'ＣＣＴＣＴＧＧＴＡＣＣＧＴＣＡＧＧＴＴＧＣＴＴＴＣＡＣＡＡ３'
ｐＭＩ３５'ＣＣＣＴＧＡＧＴＧＴＣＡＧＡＴＡＣＡＧＣＣＣＡＧＴＡＧ３'
ｐＭＩ２５'ＧＣＡＧＧＴＧＧＴＣＡＧＣＣＡＡＧＴＣＴＧＣ３'
ｐＤＫ５'ＴＣＴＧＣＣＡＧＴＴＴＣＣＡＣＣＧＣＣＴＴＴＡＧＧＴ３'
ｐＰＬ１５'ＴＡＣＡＧＧＣＣＡＣＡＣＣＴＡＧＴＴＴＣＣＡＴＣＧＴＴＴＡＣ３'
ｐＡＬ５'ＣＴＧＣＴＧＴＴＡＡＡＧＡＧＴＣＴＧＧＣＴＣＡＡＣＣＡＧＡＴ３'
ｐＡＰ５'ＣＣＣＣＴＡＧＣＴＴＴＣＧＴＣＣＣＴＣＡＧＴＧＴＣＡＧＴ３'
ｐＮＯＳ５'ＧＣＴＣＡＡＣＣＡＲＡＴＭＡＲＡＧＣＡＧＴＧＧＡＡＡＣＴＡ３'
ｐＰＬ２５'ＣＡＡＴＣＡＴＴＣＣＧＧＡＴＡＡＣＧＣＴＴＧＣＡＴＣＣ３'
ｐＵＮ５'ＣＣＧＴＭＴＴＡＣＣＧＣＧＧＣＴＧＣＴＧＧＣＡ３'

＊１これらのプローブ配列に相補助的であるプライマーを膜上にスポットした。

ハイブリッド形成及び発色体検出

標識づけ反応で使用したプライマーに対して相補助的であるプライマー１／２μｌ（１００ｐｍｏｌ／μｌ）を膜ストリップ（４×５ｃｍ）Ｈｙｂｏｎ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）上にスポットしその後５０００ジュール／ｃｍ２の紫外線で架橋した。ストリップは０・７×ＳＳＣ，１×ＳＰＥＰ，５×Ｄｅｎｈａｒｄｔｓ及び１００μｇ／ｍｌの異種ＤＮＡを含有するプレハイブリッド形成溶液中で３７℃で２時間予備ハイブリッド形成された。循環標識づけ反応生成物を２ｍｌのミクロ遠心分離チューブ中で０．５ｍｌのハイブリッド形成溶液（０．７×ＳＳＣ，１×ＳＰＥＰ，１×Ｄｅｎｈａｒｄｔｓ，１０％デキストランサルフェート及び１００μｇ／ｍｌ異種ＤＮＡを含む）に添加し、９５℃で５分間変性した。ストリップを加えてゆるやかな倒立により３７℃で２時間培養を続けた。膜ストリップを５０ｍｌの溶液（１×ＳＳＣ及び１％ＳＤＳを含む）で洗滌し続いて（０．１×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳ）溶液５０ｍｌ、最後に（０．１０Ｍトリス−ＨＣｌ[ｐＨ７・５]及び０・１５ＭＮａＣｌ）溶液５０ｍｌで２回洗滌した。各洗滌は室温で短い渦動によって実施した。
抗体検出のために膜ストリップを２０ｍｌの液（０．１０Ｍトリス−ＨＣｌ[ｐＨ７．５],０．１５ＭＮａＣｌ及び０．５％スキムミルクを含む）で１時間ブロックし、１／１０００の抗蛍光−ＨＲＰコンジュゲート（ＮＥＮ）を含む同じ緩衝液２０ｍｌ中で更に１時間培養した。膜ストリップを短い渦動によって３回、５０ｍｌの０．１０Ｍトリス−ＨＣｌ[ｐＨ７．５]と０．１５ＭＮａＣｌを含む溶液で洗滌した。発色反応はＨＲＰの発色検出のためのＲＥＮＡＩＳＳＡＮＣＥ４ＣＮＰｌｕｓを用いて５分間、製造者の指示に従って行った（ＮＥＮ）。比信号強度をアグファスナップスキャナー６００を用いて膜をスキャンすることにより測定し、ゲループロＡＮＡＬＹＺＥＲソフトウェア（ＭｅｄｉａＣｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ，ＳｉｌｖｅｒＳｐｒｉｎｇ，Ｍｄ）を使用して分析した。

純粋培養液についてのプローブ標識分析の確認

主たる系統を代表する８種類の異なるシアノバクテリア菌株にプローブ標識分析を適用した。プローブの特異性の追加コントロールとしてグループ外のＣｈｌｏｒｏｂｉｕｍｓｐ.も含ませた。単藻類培養液から精製した約５％のＤＮＡを一般的なプライマーペアＣＣ−ＣＤと共に５０μｌＰＣＲ反応容積で増幅した。増幅反応を確認するために標識づけの前に生成物を１．５％エチジウムブロマイドで着色したアガロースで目視できるようにした。すべてのサンプルを均一に増幅し、目に見える追加バンドなしに約６００ｂｐで強いバンドを生成した。

プローブ標識分析に関連して、試験した菌株について一般的プローブｐＵＮは比較的均一に標識された（但しＰｓｅｕｄａｎａｂａｅｎａＰｉｍｎｅｔｉｃａＮＩＶＡ−ＣＹＡ２７６／６を例外として）（図５Ａ参照）。このプローブはグループ外のＣｈｌｏｒｏｂｉｕｍｓｐ.にも標識された。プローブｐＰＬ２を除いて、異なるシアノバクテリア特異プローブがその系統分類上の位置から期待されるような信号を与えた（図５Ｂ及びＣ参照）。ｐＰＬ２の低い特異性は、使用したハイブリッド形成温度がこのプローブに最適ではなかったという事実によるものであろう。然し一般的に分析中でノイズに対して高い信号比であった。例えば、Ｍ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ株のＮＩＶＡ−ＣＹＡ１４３と１４４の間には唯１つの塩基ペアの差異があるのみである。ノイズに対する信号灯８０をもってＮＩＶＡ−ＣＹＡ１４３と１４４とをプローブｐＭ１２が区別した。蛍光標識されたジデオキシヌクレオチドの挿入効率は配列に依存する。プローブと標的のハイブリッド形成効率によりプローブの標識づけにも差がある。プローブ領域を攻撃する配列に加えて塩基の組成や融点がプローブのハイブリッド形成に影響を与える。この仕事中に開発されたプローブのための一般的プローブｐＵＮの標識づけに関して決定されたように、異なる標識づけ効率は１．０ないし５の範囲である。それぞれのプローブのための効率は下記の通りであった：ｐＫＯ−１．７、ｐＭ１３−２．２、ｐＭ１２−１．４、ｐＤＫ−１．９、ｐＰＬ１−４．０、ｐＡＬ−１．６、ｐＡＰ−３．３、ｐＮＯＳ−４．３、ｐＰＬ２−４．９

選ばれた７地域からのシアノバクテリアの分布

プローブ標識分析の更なる評価として、サンプルを顕微鏡によってしらべた。従って、各地域の主要な菌株については、スカルベルク等によって与えられた基準に従って、形態学及び細胞学上の特徴に基づいて決定した[Ｓｋｕｌｂｅｒｇ，Ｏ．Ｍ．，Ｃｈａｒｍｉｃｈａｅｌ，Ｗ．Ｗ．，Ｃｏｄｄ，Ｇ．Ａ．及びＳｋｕｌｂｅｒｇＲ１（１９９３）水産物及び飲料水中の藻類毒素、１４５−１６４頁、Ｅｄ．ＦａｌｃｏｎｅｒＩ．Ｒ．，ロンドンアカデミックプレス社]。遺伝子の、そして顕微鏡的な分析によって決められたように、一般にサンプル中の生物体群の間には良好な相関関係があった。然し、遺伝子分析で使用した１６ＳｒＤＮＡ遺伝子は、菌株レベルで区別するための十分な配列変形をもっていない。更に、我々はプローブ標識分析によって、形態学的に定義されたＡｎａｂａｅｎａ属とＡｐｈａｎｉｚｏｍｅｎｏｎ属を区別することができなかった。この理由は、識別のために使用した２つの位置が種の指定に従っていないからである。これは各々の位置について数個の独立の代替があったこと、２個のプローブの間に１６ＳｒＤＮＡ中で再組み合せ事件があったこと、または種の定義が系統発生的に適合していなかったことなどの理由によるものであろう。分類体系的なプローブｐＮＯＳは一方でＡｎａｂａｅｎａ及びＡｐｈａｎｉｚｏｍｅｎｏｎを含むＮｏｓｔｏｃ群について特異的であると思われた