JP2003514252A - 光学ピンセットおよび／または加工ビームを顕微鏡内へ接続する装置 - Google Patents

光学ピンセットおよび／または加工ビームを顕微鏡内へ接続する装置

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JP2003514252A
JP2003514252A JP2001536624A JP2001536624A JP2003514252A JP 2003514252 A JP2003514252 A JP 2003514252A JP 2001536624 A JP2001536624 A JP 2001536624A JP 2001536624 A JP2001536624 A JP 2001536624A JP 2003514252 A JP2003514252 A JP 2003514252A
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tweezers
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ベンデンブルグ ロナルド
ホフマン アンヤ
グロイリッヒ カール・オットー
モナジェムバシ シャムチ
ウール ヴォルカー
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カール ツァイス イエナ ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング
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Abstract

(57)【要約】 【課題】レーザ走査型顕微鏡内の顕微鏡的対象物を、物体面を押し動かしているときにも、たとえば撮像時にも空間的に固定することを可能とし、したがって、動く対象物も鮮明に撮像できる装置 【解決手段】粒子を捕捉するための光学ピンセットおよび／または加工ビームの少なくとも１本のビームを、顕微鏡光路内へ、特にレーザ走査型顕微鏡の光路内へ結合する装置であって、光学ピンセットおよび／または加工ビームのビーム焦点位置を、顕微鏡の焦点位置の変更に関して自由調節可能な仕方で変更するための手段を配設した装置である。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、レーザ走査型顕微鏡内の顕微鏡的対象物を、物体面を押し動かして
いるときにも、たとえば撮像時にも空間的に固定することを可能とし、したがっ
て、動く対象物も鮮明に撮像できる装置に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
一連の生物学操作技術として、光学ピンセットは興味をそそる操作具であるこ
とがわかる。レーザ走査型顕微鏡とレーザ微小技術との結合により、実験の可能
性が広がることが期待される。 ＬＳＭ撮像は動く対象物を、特に内部の閉じた細胞内で、多くの細胞より細か
い構造が走査時間の間に動いてしまうため、満足できない像しかできないことが
多い。
【０００３】 光学ピンセットは、いたわりをもって生体を固定する理想的なものとして投入
される。 さらに、光学ピンセットによれば固定物体を、空間的に決まった大きさだけ動
かすことが可能である。補償光学ピンセットをレーザ走査型顕微鏡に投入する応
用例は、細胞小器官たとえばクロロパステンの検査、または運動蛋白質によって
動かされる物体の把握である。後者の場合、好適な条件下では力の測定すら可能
である。基本的には運動体は、たとえば懸濁液またはある種の細胞小器官中の粒
子は、補償光学ピンセットによる固定なしには鮮明に撮像することができない。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
対物レンズによって結合された光学ピンセットは、図１に示すように焦点を物
体面に結ぶ。３次元撮像手順（「走査」）によって物体面は平行に押し動かされ
るので、光学ピンセットの焦点は一緒に押し動かされる。その結果、光学ピンセ
ットによって把握された物体は、同様に押し動かされる。これはしかし撮像時に
は望ましくない。したがって、物体面を押し動かすのは、適合した設備によって
光学ピンセットの光路内で補償されなければならない。
【０００５】 光学ピンセットが対物レンズによって結合され、第３の次元が撮像に際して、
対物レンズまたは標本台を押し動かすことによって推論され、または光学ピンセ
ットの焦点を標本に相対的に押し動かす他の方法によって推論されるならば、本
発明は常にレーザ走査型顕微鏡メーカにとって必要なものである。
【０００６】 光学ピンセットを反対側から標本へ結合する第２の高開口対物レンズを通じて
、光学ピンセットを倒立顕微鏡へ結合すると（Ｋ．ヴィッシャー、Ｇ．Ｊ．ブラ
ーケンホフ：生物学に応用するための共焦点顕微鏡内に構築された単一ビーム光
学捕獲、ツィトメトリー１２：４８６−４９１（１９９１））、光学ピンセット
の補償された動きが実に流暢となるが、そのためには、標本は２枚のカバーグラ
スの間になければならず、ある厚さを超えてはならない。
【０００７】 さらにこの種の接続法は、倒立顕微鏡内で透過光路が存在する場所に光学ピン
セット用対物レンズが置かれているため、従来の顕微鏡利用法を制限する。その
ほか、標本は上から無制限に自由に入れることはできず、たとえば微量注入設備
または温度調節設備を用いて利用するのは、不可能でないにしても非常に困難で
ある。
【０００８】 温度調節設備は、マイクロレンズを配され直接標本上へ導入されるガラス繊維
によって粒子を光学的に固定する構成にも用いられる。加えて標本の無菌性の問
題として、粒子が液体の下側に固定される必要がある場合、ガラス繊維がより厚
い液体層中に浸かっていなければならないという問題が起きる。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明の構成中重要なのは、光学的ピンセットが、顕微鏡対物レンズによって
物体面内へ導かれるということである。光学ピンセットは、物体面内に存在する
顕微鏡的粒子が保持されるように、すなわち、光学ピンセットの焦点が物体面内
にあるように調節される。
【００１０】 レーザ走査型顕微鏡によって、３次元撮像をする際には、しかし物体面は平行
に押し動かし、物体面から突き出る第３の次元を推論するようにしなければなら
ない。したがって、これによって光学ピンセットの焦点も押し動かされ、固定粒
子が押し動かされるという望ましからぬ結果となる。この動きを補償しないと、
光学ピンセットによって保持される３次元物体が３次元的に解明されて撮像され
ない。
【００１１】 物体面の動きを補償することを以下ｚ補償と言うが、これがさまざまな光学的
要素から成り、光学ピンセットの光路内に加わり、物体面の動きを補償する。こ
のｚ成分は物体面を動かすのと同時進行で光学ピンセットを補償的に動かすので
、固定物体の位置は標本内で保持されている。
【００１２】
【発明の実施の形態】
実現するのは、電気機械的に押し動かせる光学素子を通じた光学ピンセット結
合システム内での補償である。物体面の精密な位置は、レーザ走査型顕微鏡の制
御エレクトロニクスから撮像過程で得られる。それに応じて、押し動かすことの
できる光学素子は、光学ピンセット結合システム内でコンピュータ制御されるの
で、固定物体の位置は標本に相対的に保持されたままである。重要な光学素子の
位置は電気機械的または光学的にも検出可能であるから、物体面の位置は原則と
してレーザ走査型顕微鏡の制御エレクトトロニクスから導く必要はない。とはい
え、検出には大きな費用がかかる。
【００１３】 光学ピンセットの光路がレーザから顕微鏡まで光導波路を通っている場合、ｚ
補償は顕微鏡側の光導波路保持部と結合することができる。こうすれば最小の光
学素子によるコンパクトなユニットですむ。ｚ補償を手動で行う可能性もある。
そのうえ、検査すべき対象物はさまざまなｘ−ｙ断面で走査される。断面の間で
物体面はレーザ走査型顕微鏡によって押し動かされる。次の撮像の前に光学ピン
セットの焦点位置は、光学ピンセットの光路内にある付加の光学素子を手動で押
し動かすことによって再び出力点へもたらされる。この過程はｘ−ｙ断面ごとに
繰り返される。
【００１４】 しかし、上記のようにコンピュータ制御によって電気機械的に補償素子を押し
動かすことによって、３次元撮像の間に時間が節約され、このことは寿命の短い
プレパラートのとき、決定的な意義を持つことができる。しかしｚ補償について
は、その技術的実施によらずそれ自体を特許申請する。
【００１５】 数個の液体中を動く対象物を検査しなければならない場合、これらはすべて１
基の光学ピンセットで固定されなければならない。ここに記述されたｚ補償は、
１基の光学ピンセットのいわゆる「マルチトラップ」と結合することも許容し、
これによって１本または数本のレーザビームを数個の対象物上へ固定するために
偏向できる。これは、１基の走査鏡を介して１本のビームを交互に高い周波数で
数個の対象物上へ偏向し、レーザビームが永続的に対応する対象物を照射しなく
ても、これらが固定されたままでいるようにすることによっても実現できる。
【００１６】 光学ピンセットと同じ方法で、レーザマイクロビームも補償のため結合できる
（レーザマイクロビームは、微小材料加工を行うため顕微鏡内へ結合される短波
長レーザビームである）。したがって、レーザマイクロビーム結合には光学ピン
セットと同じ光学系を使用できる。ｚ補償レーザマイクロビームは、たとえば光
／材料相互作用を詳細に調査するために撮像するとき、精密な材料加工を可能と
する。
【００１７】 図２は、標本Ｐ、対物レンズＯおよび円筒レンズＴＬを有する顕微鏡光路を示
す。 偏向鏡ＵＳを通じて、走査レンズＳＬおよびｘ／ｙスキャナＳＣ、さらに偏向
鏡ＵＳ１およびダイクロイックビームスプリッタＳＴ１を通じ、標本Ｐをｘ／ｙ
方向に走査するレーザビームＬ１が結合されている。
【００１８】 標本Ｐ内のビーム焦点は、この場合対物レンズＯを、ｚ方向に駆動ユニットＡ
Ｓを通じて押し動かすことによって、高さ調節し、標本Ｐをさまざまなｚ位置で
走査できるようにする。標本から来るビームは、復路上ビームスプリッタＳＴ１
を通じて、ピンホール光学系ＰＯ、ピンホールＰＨおよび検出器ＤＥから成る検
出ユニット上へ到達する。
【００１９】 さらに、別のビームスプリッタＳＴ２およびレンズＬを通じてＨＢＯ照明が結
合可能となっている。ビームスプリッタＳＴ２および別のビームスプリッタＳＴ
３を通じて、さらに変形として対応する補正光学系Ｏ１，Ｏ２を通じて、パルス
化されたレーザビームＬ２が光学ナイフエッジへ、および別のレーザビームＬ３
が光学ピンセット（Ｏｐｔｉｃａｌ ｔｗｅｅｚｅｒ）として結合されている。
【００２０】 たとえば光結合するために、間接結合により光導波路を通じて扱うこともでき
、その場合コリメーション光学系を後置する。光学系または光導波路の終端を光
軸に沿って押し動かすことによって、それぞれのレーザビーム焦点位置は標本Ｐ
内で変化する。
【００２１】 補正光学系Ｏ１，Ｏ２は変形Ｖ１では光軸に沿って駆動ユニットＡＳを通じて
押し動かせるように装置されると共に、駆動ユニットＡＳはこの動きを対物レン
ズＯの動きと一致させることができる。これは算出またはあらかじめ保存されて
いる補正値を通じて対物レンズを押し動かすのに一致した少なくともレーザビー
ムＬ３の逆向きの動きによって行われる。
【００２２】 一方、焦点位置が標本内部においてｚ方向に決まった大きさだけ変化すること
ができる。他方、光学ピンセットによって固定された対象物が、対物レンズをｚ
方向に押し動かすことによって、常に標本内の同じ位置に留まることができる点
が有利である。レーザＬ３のための光学系Ｏ２を動かすことのほか、ナイフエッ
ジレーザＬ２のための光学系Ｏ１も対応して動かすことができ、それによってカ
ット位置が任意に、またレーザＬ３の位置から結合をはずすように選択すること
もできる。
【００２３】 続いて示す変形Ｖ２では、レーザＬ２，Ｌ３のために共通に押し動かす補正光
学系Ｏ３が配設されている。この場合にも、付加的にレーザＬ２光路内へ投入可
能なさまざまな光学系によってＬ２およびＬ３の動きが得られる。
【００２４】 さらに、いわゆるマルチビームピンセット、すなわち１本または数本のレーザ
ビームが数個の対象物を把握するために利用できるようなピンセットが可能であ
る。これは、レーザビームＬ３がスキャナ鏡を介して高周波数で数個の対象物上
へ偏向し、これらを同時に把握するようにすることによって行うことができる（
Ｃ．ホーヤー、Ｓ．モナイェンバシ、Ｋ．Ｏ．グロイリッヒ：レーザ／マニピュ
レーションと個体ＤＮＡ分子のＵＶ誘導単一分子反応；ジャーナル／オヴ／バイ
オテクノロジー５２（１９９６），６５−７３）
【００２５】
【発明の効果】
細胞小器官は撮像中に動くため、鮮明に撮像できないことが多い。補償光学ピ
ンセットを投入することによってのみ、細胞小器官を撮像の間固定することがで
き、鮮明な３次元撮像が可能である。そこで、細胞小器官、たとえばクロロパス
テンまたはミトコンドリアは、生きた細胞中に固定され鮮明に３次元撮像できる
。通常動かない細胞小器官、たとえば分泌肺胞または妊娠知覚器官は、光学ピン
セットを用いて原初位置から導くことができ、そこでの反応（修復）が３次元調
査できる。静止位置から導くことによって、生体細胞内の細胞骨格力学も調査で
きる。
【００２６】 回転楕円体が組織のための生体モデルとしてｚ補償光学ピンセットを用いてレ
ーザ走査型顕微鏡内で３次元マニピュレートされ、調査されることができる。
【００２７】 生体色素を介して生体細胞が着色され、蛍光顕微鏡を用いて撮像することがで
きるようになる。共焦点レーザ走査型顕微鏡内に構築されたｚ補償光学ピンセッ
トを用いて、生体細胞内の染色体組織を調査することが可能である。同様に、こ
の装置を用いて非粘着性細胞で分割過程を３次元撮像し、調査することが可能で
ある。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の動作
【図２】レーザ走査型顕微鏡等の顕微鏡中での利用
【符号の説明】
Ｐ 標本 Ｏ 対物レンズ ＴＬ 円筒レンズ ＵＳ 偏向鏡 ＳＬ 走査レンズ ＳＣ ｘ／ｙスキャナ ＳＴ１ ダイクロイックビームスプリッタ Ｌ１ レーザビーム ＡＳ 駆動ユニット ＰＯ ピンホール光学系 ＰＨ ピンホール ＤＥ 検出器 Ｌ レンズ ＨＢＯ 照明 Ｖ 変形
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 カール・オットー グロイリッヒ ドイツ国 07745 イエナ マックス・ス テーエンベック ストラッセ 26 (72)発明者 シャムチ モナジェムバシ ドイツ国 69121 ハイデルベルグ フリ ッツ・フレイ ストラッセ ２ (72)発明者 ヴォルカー ウール オーストリア国 2344 マリア エンツエ ルスドルフ エルラウフ ストラッセ 37 ／１ Ｆターム(参考） 2H044 BB01 BB05 2H052 AA07 AD03 AD09 AD20 AF19

Claims (6)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】粒子を捕らえるための光学ピンセットおよび／または加工ビーム
    の少なくとも１本のビームを、顕微鏡光路へ、特にレーザ走査型顕微鏡内の光路
    へ結合するための装置であって、 光学ピンセットおよび／または加工ビームのビーム焦点位置を、顕微鏡焦点位
    置の変更に関して、自由調節可能な仕方で変更するための手段が配設されている
    装置。
  2. 【請求項２】ビーム焦点位置を変更するために、別々に動く光学系が配置され
    ている、請求項１に記載の装置。
  3. 【請求項３】光学ピンセットおよび／または加工ビームのビーム出口および／
    または照明光学系が、光軸方向に押し動かすことが可能な、前記請求項のうちの
    １に記載の装置。
  4. 【請求項４】変更することが制御可能であり、光学ピンセットおよび／または
    加工ビームが顕微鏡対物レンズの動きと反対方向に動作する、前記請求項のうち
    の１に記載の装置。
  5. 【請求項５】あらかじめ保存され、または焦点位置に基づいて算出された値に
    より押し動かすための定義された制御を有する、前記請求項ののうちの１に記載
    の装置。
  6. 【請求項６】数基の光学ピンセットおよび／または加工ビームが配設され、単
    独におよび／または共通にそれらの焦点位置に関して調節可能な、前記請求項の
    のうちの１に記載の装置。
JP2001536624A 1999-11-10 2000-11-02 光学ピンセットおよび／または加工ビームを顕微鏡内へ接続する装置 Pending JP2003514252A (ja)

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