JPH08234110A

JPH08234110A - 落射蛍光顕微鏡

Info

Publication number: JPH08234110A
Application number: JP7059948A
Authority: JP
Inventors: Tatsuro Otaki; 達朗大瀧; Shuji Toyoda; 修治豊田
Original assignee: Nikon Corp
Current assignee: Nikon Corp
Priority date: 1995-02-23
Filing date: 1995-02-23
Publication date: 1996-09-13
Anticipated expiration: 2017-10-28
Also published as: JP3339244B2

Abstract

(57)【要約】【目的】特殊な特性を有するダイクロイックミラーを
使用することなく、落射蛍光観察法と光ピンセット法と
が可能な落射蛍光顕微鏡を提供すること。【構成】本発明においては、励起光照射光学系と、観
察光学系と、光ピンセット手段とを備えた落射蛍光顕微
鏡において、前記励起光照射光学系は、励起光を供給す
るための第１光源と、前記観察光学系の光路中に配置さ
れ、前記第１光源からの励起光を標本へ導くとともに前
記標本からの蛍光を前記観察光学系の光路へ導く第１波
長分別手段とを有し、前記光ピンセット手段は、レーザ
ー光を供給するための第２光源と、前記観察光学系の光
路中に配置され、前記第２光源からのレーザー光を前記
標本へ導くとともに前記標本からの蛍光を前記観察光学
系の光路へ導く第２波長分別手段とを有する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は落射蛍光顕微鏡に関し、
特に落射蛍光照明装置と光ピンセットとを備えた顕微鏡
に関する。

【０００２】

【従来の技術】顕微鏡の観察方法として、水銀ランプ等
の光源からの短い波長の励起光を標本上の観察視野領域
に照明し、標本から発する長い波長の蛍光を観察する落
射蛍光観察法がある。具体的には、対物レンズから拡大
像に至る観察光学系の平行光束光路中に配置されたダイ
クロイックミラーによって水銀ランプ等からの短い波長
の励起光を反射し、反射光を対物レンズを介して標本に
照明する。また、最近では、細胞や染色体などの微細な
対象物を光学的に捕捉する方法として、レーザー光を用
いた光ピンセット法が知られている。

【０００３】以下、光ピンセット法の原理について説明
する。光ピンセット法では、開口数の大きな対物レンズ
を介して強力なレーザー光を標本上に集光させる。この
とき、標本中のたとえばビーズのような微小な物体とた
とえば水のような周囲の溶液との間の屈折率の違いによ
り、ビーズと水との境界面においてレーザー光の屈折が
起こる。このレーザー光の屈折によりビーズに作用する
モーメント力を利用して、レーザー光の集光点の近くに
ビーズを光学的に捕捉する。捕捉可能な物体はビーズに
限られることなく、細胞や染色体のような生物標本中の
微細物体でも同様に捕捉可能である。顕微鏡では、光ピ
ンセット法を利用した様々な応用が考えられる。

【０００４】光ピンセットを組み込んだ従来の落射蛍光
顕微鏡では、落射蛍光観察用の励起光を標本に照射する
ための励起光照射光学系の光路を利用して、レーザー光
を標本に入射させている。すなわち、励起光を供給する
光源と観察光学系の光路中に配置された第１ダイクロイ
ックミラーとの間の光路中に別の第２ダイクロイックミ
ラーを設け、この別の第２ダイクロイックミラーを介し
てレーザー光を励起光照射光学系の光路中に取り込んで
いる。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】上述のような従来の落
射蛍光顕微鏡では、観察光学系の光路中に配置された第
１ダイクロイックミラーが、励起光のような短波長の光
およびレーザー光のような長波長の光をともに反射する
とともに、標本からの蛍光を透過するという特殊な特性
を有する必要がある。たとえば、ＵＶ励起法を用いて蛍
光観察を行う場合、３４０〜３９０ｎｍの光（励起光）
および８００ｎｍ以上の光（レーザー光）を反射し、且
つ４００〜７００ｎｍの光（蛍光）を透過するという特
殊な特性を第１ダイクロイックミラーに付与しなければ
ならない。このため、第１ダイクロイックミラーの製造
が困難となり、製造コストも高くなってしまう。

【０００６】ところで、光ピンセットが組み込まれてい
ない従来の落射蛍光顕微鏡では、励起光の波長を選択す
るための励起フィルタと第１ダイクロイックミラーとが
交換可能なフィルタカセットを構成している。そして、
励起法を変えて落射蛍光観察を行うような場合には、適
当なフィルタカセットと交換することにより、第１ダイ
クロイックミラーと励起フィルタとを一体的に交換して
いる。

【０００７】しかしながら、上述のような従来の落射蛍
光顕微鏡では、第２ダイクロイックミラーよりも励起光
の光源側に励起フィルタを配置しなければならない。し
たがって、たとえばＵＶ励起法からＢ励起法等の他の励
起法に変えて落射蛍光観察を行うような場合、互いに離
間して配置された第１ダイクロイックミラーと励起フィ
ルタとを個別に交換しなければならない。その結果、顕
微鏡の構成が複雑になるばかりでなく、操作性も悪いと
いう不都合があった。

【０００８】本発明は、前述の課題に鑑みてなされたも
のであり、特殊な特性を有するダイクロイックミラーを
使用することなく、落射蛍光観察法と光ピンセット法と
が可能な落射蛍光顕微鏡を提供することを目的とする。

【０００９】

【課題を解決するための手段】前記課題を解決するため
に、本発明においては、落射蛍光観察用の励起光を標本
に照射するための励起光照射光学系と、前記励起光に対
する標本からの蛍光を対物レンズを介して結像させ前記
標本の像を観察するための観察光学系と、前記標本の所
定位置にレーザー光を集光して前記標本中の物体を前記
所定位置で光学的に捕捉するための光ピンセット手段と
を備えた落射蛍光顕微鏡において、前記励起光照射光学
系は、前記励起光を供給するための第１光源と、前記観
察光学系の光路中に配置され、前記第１光源からの励起
光を前記標本へ導くとともに前記標本からの蛍光を前記
観察光学系の光路へ導く第１波長分別手段とを有し、前
記光ピンセット手段は、前記レーザー光を供給するため
の第２光源と、前記観察光学系の光路中に配置され、前
記第２光源からのレーザー光を前記標本へ導くとともに
前記標本からの蛍光を前記観察光学系の光路へ導く第２
波長分別手段とを有することを特徴とする落射蛍光顕微
鏡を提供する。

【００１０】本発明の好ましい態様によれば、前記観察
光学系の光路中に配置され前記標本からの蛍光の一部を
取り出すための光路分割手段と、該光路分割手段を介し
て取り出された蛍光が形成する前記標本の像を撮影する
ための撮影手段とを有する撮影光学系をさらに備えてい
る。

【００１１】

【作用】本発明の落射蛍光顕微鏡では、観察光学系の光
路中に配置されたダイクロイックミラーのような第１波
長分別手段を介して落射蛍光観察用の励起光を標本に照
射するとともに、観察光学系の光路中に配置された別の
ダイクロイックミラーのような第２波長分別手段を介し
て光ピンセット用のレーザー光を標本に照射する。具体
的には、たとえば、蛍光観察用の励起光を第１ダイクロ
イックミラーで全反射して観察光学系の光路中に導くと
ともに、光ピンセット用のレーザー光を第２ダイクロイ
ックミラーで全反射して観察光学系の光路中に導く。

【００１２】こうして、特殊な特性を有するダイクロイ
ックミラーを使用することなく、蛍光観察用の励起光と
光ピンセット用のレーザー光とを照射効率良く対物レン
ズを介して標本上に導くことができる。その結果、標本
中の微細物体を光学的に捕捉するための必要なレーザー
光の出力を最小限に抑えることができる。また、観察光
学系の光路中にハーフプリズムのような光路分割手段を
配置し、ハーフプリズムを介して取り出した蛍光が形成
する標本の像をビデオカメラ等の撮影手段により撮影す
ることもできる。

【００１３】

【実施例】以下、本発明の実施例を、添付図面に基づい
て説明する。図１は、本発明の実施例にかかる落射蛍光
顕微鏡の構成を概略的に示す図である。図示の装置は倒
立型の顕微鏡であり、観察すべき標本１の図中下方には
対物レンズ２が配置されている。そして、この対物レン
ズ２の下方から落射蛍光照明が施されるようになってい
る。落射蛍光用の光源１１からの光束は、コレクタレン
ズ１２によって集光されて一旦結像した後、リレーレン
ズ１３および励起フィルタＥＸ１を介してダイクロイッ
クミラーＤＭ１に入射する。

【００１４】なお、コレクタレンズ１２とリレーレンズ
１３との間の結像位置には、視野絞りＦＳが配置されて
いる。また、ダイクロイックミラーＤＭ１は、顕微鏡の
観察光学系のリレーレンズ系（３、３’）の平行光束光
路中に配置されている。ダイクロイックミラーＤＭ１に
より図中上方に反射された落射蛍光用の光束は、対物レ
ンズ２を介して標本１の観察視野領域を照明する。標本
１と視野絞りＦＳ１とは光学的に共役の位置にあり、観
察視野領域は視野絞りＦＳの開口部の形状および大きさ
に依存して規定される。

【００１５】なお、本実施例ではＵＶ励起法を用いてお
り、励起フィルタＥＸ１は波長が３４０〜３９０ｎｍの
光すなわち励起光を透過する特性を有する。一方、ダイ
クロイックミラーＤＭ１は波長が４００ｎｍ以下の光を
反射し、４００ｎｍを超える光を透過する特性を有す
る。このように、光源１１、コレクタレンズ１２、視野
絞りＦＳ、リレーレンズ１３、励起フィルタＥＸ１、ダ
イクロイックミラーＤＭ１、および対物レンズ２は、落
射蛍光顕微鏡の励起光照射光学系を構成している。

【００１６】こうして、光源１１からの励起光が照射さ
れた標本で発生した蛍光のうち波長が４００ｎｍを超え
る蛍光は、対物レンズ２によって集光された後、リレー
レンズ系（３、３’）中のダイクロイックミラーＤＭ１
を透過する。さらに、４２０ｎｍ以上の波長を有する光
を透過するバリアフィルタＢＡ１を介して、波長が４０
０未満の蛍光が除去される。このように、観察に有害な
光が除去された後、標本１からの蛍光はハーフプリズム
１５を介してミラー４に入射する。そして、ミラー４に
おいて図中左斜め上方に反射された光は、拡大像５を形
成する。

【００１７】拡大像５からの光は、リレーレンズ系６お
よびプリズム７を介して再結像し、像８が形成される。
像８は、接眼レンズ９を介して観察者の肉眼１０によっ
て観察される。このように、対物レンズ２、リレーレン
ズ系（３、３’）、ミラー４、リレーレンズ系６、プリ
ズム７および接眼レンズ９は、顕微鏡の観察光学系を構
成している。なお、本実施例におけるＵＶ励起法のため
のダイクロイックミラーＤＭ１、励起フィルタＥＸ１お
よびバリアフィルタＢＡ１の分光透過率特性を、図２に
示す。

【００１８】図１中破線で示すように、ダイクロイック
ミラーＤＭ１、励起フィルタＥＸ１およびバリアフィル
タＢＡ１は、観察光学系の光路に対して一体的に挿脱自
在な、すなわち交換可能なフィルタカセットＦＣを形成
している。そして、このフィルタカセットＦＣは、たと
えばＢ励起法、Ｖ励起法、Ｇ励起法等の他の励起法用の
フィルタカセットと適宜交換されるようになっている。
したがって、観察光学系の光路に対して一体的に挿脱自
在なフィルタカセットを交換するだけで、所望の励起法
を操作性良く選択することができる。

【００１９】たとえば、Ｂ励起法を用いる場合、ダイク
ロイックミラーＤＭ１’、励起フィルタＥＸ１’および
バリアフィルタＢＡ１’からなるフィルタカセットＦ
Ｃ’と交換する。ここで、ダイクロイックミラーＤＭ
１’は、波長が５１０ｎｍ以下の光を反射し、５１０ｎ
ｍを超える光を透過する特性を有する。また、励起フィ
ルタＥＸ１’は、波長が４１０〜４６０ｎｍの励起光を
透過する特性を有する。さらに、バリアフィルタＢＡ
１’は、５２０ｎｍ以上の波長を有する光を透過する特
性を有する。なお、Ｂ励起法用のフィルタカセットＦ
Ｃ’を構成するダイクロイックミラーＤＭ１’、励起フ
ィルタＥＸ１’およびバリアフィルタＢＡ１’の分光透
過率特性を、図３に示す。

【００２０】図１の落射蛍光顕微鏡はさらに、標本１中
の微細物体を光学的に捕捉するための光ピンセット手段
を備えている。光ピンセット手段は、たとえば波長が１
０６４ｎｍのレーザー光を発するＮｄＹＡＧレーザー光
源１４を有する。光源１４からのレーザー光は、観察光
学系のリレーレンズ系（３、３’）の平行光束光路中に
配置されたダイクロイックミラーＤＭ２に入射する。ダ
イクロイックミラーＤＭ２は、可視光を透過し且つ赤外
光を反射するように、波長が８００ｎｍ以下の光を透過
し且つ波長が８００ｎｍを超える光を反射する特性を有
する。このようなダイクロイックミラーＤＭ２の分光透
過率特性を、図４に示す。

【００２１】ダイクロイックミラーＤＭ２により図中上
方に反射されたレーザー光は、バリアフィルタＢＡ１、
ダイクロイックミラーＤＭ１を透過し、対物レンズ２に
入射する。対物レンズ２に入射したレーザー光は集光さ
れ、標本１上の所定位置にレーザースポットを形成す
る。こうして、光ピンセット法によって、レーザー集光
点の近傍において、標本１中の微小物体を光学的に捕捉
することができる。このように、レーザー光源１４、ダ
イクロイックミラーＤＭ２および対物レンズ２は、光ピ
ンセット手段を構成している。

【００２２】また、本実施例では、観察光学系の光路中
にハーフプリズム１５のような光路分割手段が設けられ
ている。したがって、ハーフプリズム１５を介して標本
１からの蛍光の一部が観察光学系から取り出され、取り
出された蛍光が標本１の拡大像５’を形成する。こうし
て、いわゆるサイドポートに形成された標本１の拡大像
５’を、図示を省略したビデオカメラ等の撮影手段によ
り撮影することができる。

【００２３】なお、上述の実施例では、倒立型の顕微鏡
を例にとって本発明を説明しているが、一般の正立型の
顕微鏡にも本発明を適用することができる。また、上述
の実施例では、蛍光観察用のダイクロイックミラーＤＭ
１が光ピンセット用のダイクロイックミラーＤＭ２より
も標本側に配置されているが、これらの２つのダイクロ
イックミラーの配置は逆であってもよい。さらに、上述
の実施例では、落射蛍光法としてＵＶ励起法にしたがう
構成を示したが、他の適当な励起法を用いることもでき
る。

【００２４】また、上述の実施例では、励起光を反射し
且つ蛍光を透過するダイクロイックミラーやレーザー光
を反射し且つ蛍光を透過するダイクロイックミラーを用
いた例を示している。しかしながら、励起光を透過し且
つ蛍光を反射するダイクロイックミラーやレーザー光を
透過し且つ蛍光を反射するダイクロイックミラーを用い
てもよい。また、ダイクロイックミラーに代えて、ダイ
クロイックプリズムや他の適当な波長分別手段を使用す
ることもできる。

【００２５】

【効果】以上説明したように、本発明によれば、蛍光観
察用の励起光および光ピンセット用のレーザー光をそれ
ぞれ個別のダイクロイックミラーのような波長分別手段
を介して観察光学系の光路中に取り込んでいる。したが
って、特殊な特性を有するダイクロイックミラーを使用
することなく、励起光とレーザー光とを照射効率良く標
本上に導くことができる。その結果、レーザー光の出力
を最小限に抑えることができる。また、本発明によれ
ば、蛍光観察用の励起フィルタとダイクロイックミラー
とが交換可能なフィルタカセットを構成し、このフィル
タカセットを他の励起法用のフィルタカセットと交換す
るだけで、所望の励起法による蛍光観察を操作性良く行
うことができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の実施例にかかる落射蛍光顕微鏡の構成
を概略的に示す図である。

【図２】本実施例におけるＵＶ励起法のためのダイクロ
イックミラーＤＭ１、励起フィルタＥＸ１およびバリア
フィルタＢＡ１の分光透過率特性を示す図である。

【図３】Ｂ励起法のためのダイクロイックミラーＤＭ
１’、励起フィルタＥＸ１’およびバリアフィルタＢＡ
１’の分光透過率特性を示す図である。

【図４】光ピンセット用のダイクロイックミラーＤＭ２
の分光透過率特性を示す図である。

【符号の説明】

１標本２対物レンズ３、３’ リレーレンズ系４ミラー５、８像面７プリズム９接眼レンズ１０肉眼１１励起光光源１２コレクタレンズ１４レーザー光源１５ハーフプリズムＥＸ１励起フィルタＢＡ１バリアフィルタＤＭ１ダイクロイックミラーＤＭ２ダイクロイックミラーＦＣフィルタカセットＦＳ視野絞り

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】落射蛍光観察用の励起光を標本に照射す
るための励起光照射光学系と、前記励起光に対する標本
からの蛍光を対物レンズを介して結像させ前記標本の像
を観察するための観察光学系と、前記標本の所定位置に
レーザー光を集光して前記標本中の物体を前記所定位置
で光学的に捕捉するための光ピンセット手段とを備えた
落射蛍光顕微鏡において、前記励起光照射光学系は、前記励起光を供給するための
第１光源と、前記観察光学系の光路中に配置され、前記
第１光源からの励起光を前記標本へ導くとともに前記標
本からの蛍光を前記観察光学系の光路へ導く第１波長分
別手段とを有し、前記光ピンセット手段は、前記レーザー光を供給するた
めの第２光源と、前記観察光学系の光路中に配置され、
前記第２光源からのレーザー光を前記標本へ導くととも
に前記標本からの蛍光を前記観察光学系の光路へ導く第
２波長分別手段とを有することを特徴とする落射蛍光顕
微鏡。
【請求項２】前記観察光学系の光路中に配置され前記
標本からの蛍光の一部を取り出すための光路分割手段
と、該光路分割手段を介して取り出された蛍光が形成す
る前記標本の像を撮影するための撮影手段とを有する撮
影光学系をさらに備えていることを特徴とする請求項１
に記載の落射蛍光顕微鏡。
【請求項３】前記第１波長分別手段および前記２波長
分別手段は、前記観察光学系の平行光束光路中に配置さ
れていることを特徴とする請求項１または２に記載の落
射蛍光顕微鏡。
【請求項４】前記第１光源は、前記励起光を選択的に
透過するための励起フィルタを有し、前記第１波長分別手段と前記励起フィルタとは、前記観
察光学系の光路に対して一体的に挿脱自在に形成されて
いることを特徴とする請求項１乃至３のいずれか１項に
記載の落射蛍光顕微鏡。