JP3405252B2

JP3405252B2 - 生体試料観察装置

Info

Publication number: JP3405252B2
Application number: JP03773999A
Authority: JP
Inventors: 貴志冨永; 整山田
Original assignee: RIKEN Institute of Physical and Chemical Research
Current assignee: RIKEN Institute of Physical and Chemical Research
Priority date: 1999-02-16
Filing date: 1999-02-16
Publication date: 2003-05-12
Anticipated expiration: 2019-02-16
Also published as: JP2000235147A

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】この発明は、生理活性を有す
る生体試料またはその組織を生理活性を保持した状態で
観察するための装置にかかわり、とくに落射蛍光撮像装
置と実体顕微鏡の機能を兼ね備えた生体試料観察装置に
関するものである。

【０００２】

【従来の技術】生体を個体のままあるいはその一部を試
料とし、外的な刺激などによる生体組織などの細胞活動
の変化、すなわち生理作用の変化を観察する手法の一つ
として、生体試料の特定部位に蛍光性膜電位感受性色素
等による染色処理または遺伝子組換え技術等によって蛍
光物質（緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ：Green Fluoresc
ent protein）等）を発現させる処理を施し、その生体
試料から発せられる蛍光像を観察する、いわゆる蛍光プ
ローブを用いた生態観察が知られている。この蛍光プロ
ーブを用いた生態観察の際には多くの場合、生体試料に
励起光を照射しつつ、その生体試料の表面に現れる蛍光
像をＣＣＤ（Charge Coupled Device）等の撮像装置で
撮像し、その画像を解析する方法がとられる。その際、
生体試料の損傷および蛍光物質の退色を最小限にとどめ
る必要上、生体試料に照射する励起光の光量をできるだ
け抑えて、暗い蛍光をとらえることが要求される。この
ため、蛍光プローブを用いた生態観察のためには、高開
口数の光学系を備えた観察装置が必要となる。

【０００３】この種の生体観察装置として、図３に示す
ようなタンデムレンズ光学系を用いたものが知られてい
る。同図に示す光学系は、対物レンズ２１と撮像用投影
レンズ２２とを互いに光軸を一致させ、かつ両レンズ２
１、２２間が無限遠焦点系となるように配置し、対物レ
ンズ２１を通して生体試料２３に励起光２４を照射しつ
つ、生体試料２３から放出される蛍光２９を対物レンズ
２１でとらえ、撮像用投影レンズ２２によりＣＣＤ２５
の撮像面（受光面）２５ａに結像させるように構成され
ている。対物レンズ２１と撮像用投影レンズ２２との間
には、励起光を生体試料２３に導くためにダイクロイッ
クミラー２６が設けられている。ダイクロイックミラー
２６は、その光軸と無限遠焦点系の光軸とが４５°の角
度をなすようにして一定の姿勢に保持されている。励起
光２４は励起フィルタ２７を通して側方から導入され、
ダイクロイックミラー２６により対物レンズ２１側に反
射される。対物レンズ２１からの蛍光２９はダイクロイ
ックミラー２６を透過して撮像用投影レンズ２２に入射
する。励起フィルタ２７は、図示しない光源からの照明
光のうち励起光２４として使用する特定波長の光のみ透
過し、それ以外の波長領域の光は吸収する光学特性をも
っている。また、撮像用投影レンズ２２の入射側には吸
光フィルタ２８が設けられている。この吸光フィルタ２
８は撮像しようとする特定波長の光、すなわち生体試料
２３から放出される蛍光２９のみ透過し、それ以外の波
長領域の光は吸収する光学特性をもっている。この生体
観察装置によれば、高開口数の対物レンズ２１を用いる
ことにより、暗い蛍光像でも高効率でとらえてＣＣＤ２
５の撮像面２５ａに結像させることができるため、生体
試料２３に照射する励起光２４の光量を最小限に抑えつ
つ、明るい蛍光像の撮像を行い、その画像をモニタに表
示したり録画したりすることができる。

【０００４】一方、低倍の目視観察の際に使用される実
体顕微鏡に、励起光照射系及び撮像系を組み込むことに
より、目視観察と蛍光像の撮像の両方を一台で行えるよ
うにした生体観察装置も製品化されている。図４にこの
種の生体観察装置の一例を示す。この生体観察装置は、
一つの対物レンズ３１、左右一対の投影レンズ３２ａ、
３２ｂおよび接眼レンズ３３ａ、３３ｂを備えた双眼式
実体顕微鏡を利用したものであり、対物レンズ３１から
一方の投影レンズ３２ｂに至る光路の途中にはダイクロ
イックミラー３４が、その投影レンズ３２ｂと接眼レン
ズ３３ｂとの間の焦点位置にはＣＣＤ３５が設置され
る。ダイクロイックミラー３４は、その光軸と無限遠焦
点系の光軸とが４５°の角度をなすようにして一定の姿
勢に保持されており、励起フィルタ３６を通して側方か
ら導入された励起光３７を対物レンズ３１側に反射す
る。生体試料３８から放出された蛍光３９は、対物レン
ズ３１を通過した後、それぞれ吸光フィルタ４０ａ、４
０ｂを透過して二つの投影レンズ３２ａ、３２ｂに至
る。そして、一方の投影レンズ３２ｂを通過した蛍光像
はＣＣＤ３５の撮像面３５ａに結像し、もう一方の投影
レンズ３２ａを通過した蛍光像は接眼レンズ３３ａを通
して目視観察される。また、この種の装置には、図５に
示すように、励起光３７を生物試料３８に導くための光
学系（ミラー４２）を投影レンズ３２ａ、３２ｂとは別
光路に配置したものもある。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】上述したように、図３
に示した生体観察装置によれば、高開口数の対物レンズ
２１を用いることにより、暗い蛍光像でも高効率でとら
えてＣＣＤ２５の撮像面２５ａに結像させることができ
る。しかし、この生体観察装置は、生体試料２３に何ら
かの実験操作を加える際に目視による観察ができないた
め、実験操作の際には、これを試料台から取り除き、明
視野すなわち普通の照明で観察が可能な目視用の光学系
からなる他の生体観察装置を試料台に設置する必要があ
る。また、実験操作後に撮像を行う場合には、目視用の
生体観察装置を取り外して、図３の生体観察装置を設置
しなおす必要がある。このような装置の付け外し作業は
煩雑であるとともに、この作業の際に生じる機械的振動
が装置や生体試料２３に作用して観測に支障をきたすこ
とがある。また、図４および図５に示した生体観察装置
は、目視観察と蛍光像の撮像の両方を一台で行うことが
でき、しかもＣＣＤ３５、ダイクロイックミラー３４、
吸光フィルタ４０ａ、４０ｂなどを取り外せば、明視野
で観察が可能な高開口数の実体顕微鏡としても使用でき
る。しかし、対物レンズ３１そのものの開口数は大きい
にもかかわらず、対物レンズ３１でとらえた蛍光像を左
右の光路に分割してしまうため、蛍光像の撮像を行う場
合には、ＣＣＤ３５に入射する光量も接眼レンズ３３ａ
に入射する光量も削られてしまい、明るい蛍光像を撮像
することはできない。また、明視野観察のたびに、ＣＣ
Ｄ３５、ダイクロイックミラー３４、吸光フィルタ４０
ａ、４０ｂなどを付け外しする作業を行う必要があるた
め、やはり作業が煩雑であるとともに、この作業の際に
生じる機械的振動が装置や生体試料３８に作用して観測
に支障をきたすことがある。そこで、この発明が解決し
ようとする課題は、生体試料に励起光を照射しつつ、そ
の生体試料に現れる蛍光像を撮像装置で撮像する落射蛍
光撮像装置の機能と、普通照明を用いて実像を目視観察
できる実体顕微鏡の機能とを併せ持ち、且つ簡単な操作
で両機能を切り替えて使用することができる生体試料観
察装置を提供することにある。

【０００６】

【課題を解決するための手段】上記課題を解決するため
に、請求項１記載の発明に係る生体試料観察装置は、生
体試料に励起光を照射しつつ、その生体試料に現れる蛍
光像を撮像装置で撮像する落射蛍光撮像光学系と、普通
照明を用いて実像を目視観察するための実体観察光学系
とを備え、両光学系で共用する光学部品の姿勢を定位置
で切り替えることにより、両光学系を排他的に切り替え
て使用できるように構成したことを特徴とする。また、
請求項２記載の発明は、請求項１記載の生体試料観察装
置において、前記光学部品は、これを回転させることに
より前記姿勢の切り替えがなされることを特徴としてい
る。また、請求項３記載の発明は、請求項１または請求
項２記載の生体試料観察装置において、前記落射蛍光撮
像光学系は、対物レンズと撮像用投影レンズとを互いに
光軸を一致させて配置するとともに、当該対物レンズを
通して生体試料に励起光を照射しつつ、当該生体試料に
現れる蛍光像を対物レンズでとらえ、当該撮像用投影レ
ンズにより前記撮像装置の撮像面に結像させるように構
成されていることを特徴としている。また、請求項４記
載の発明は、請求項１、請求項２または請求項３記載の
生体試料観察装置において、前記光学部品は、励起光を
生体試料に導くべく設けられた反射体であることを特徴
としている。また、請求項５記載の発明は、請求項４記
載の生体試料観察装置において、前記反射体は、前記対
物レンズと前記撮像用投影レンズとの間に設けられたダ
イクロイックミラーであることを特徴としている。この
ダイクロイックミラーは、落射蛍光撮像光学系を使用す
る際には、励起光を反射させて対物レンズへ導くととも
に対物レンズからの蛍光はそのまま透過させて撮像用投
影レンズへ導き、実体観察光学系を使用する際には、対
物レンズからの光を反射させて実体観察光学系の接眼光
学系側へ導く。また、請求項６記載の発明は、請求項
３、請求項４または請求項５記載の生体試料観察装置に
おいて、前記対物レンズと前記撮像用投影レンズとの間
は無限遠焦点系を成すことを特徴としている。

【０００７】

【発明の実施の形態】以下この発明を実施の形態に基づ
き詳細に説明する。図１はこの発明の実施の形態の一例
を示す生体試料観察装置の光学系の構成図であり、同図
（Ａ）は蛍光撮像時の状態を、同図（Ｂ）は目視観察時
の状態をそれぞれ示している。同図に示す光学系は、生
体試料１に励起光２を照射しつつ、その生体試料１の蛍
光像をＣＣＤ等の撮像装置３で撮像する落射蛍光撮像光
学系４と、普通照明５を用いて実像を目視観察するため
の実体観察光学系６とからなる。落射蛍光撮像光学系４
は、高開口数ｎ（たとえばｎ＝０．７）の対物レンズ７
と撮像用投影レンズ８とを互いの光軸を一致させ、かつ
両レンズ７、８間が無限遠焦点系となるように配置する
とともに、対物レンズ７を通して生体試料１に励起光２
を照射しつつ、生体試料１に現れる蛍光像を対物レンズ
７でとらえ、撮像用投影レンズ８により撮像装置３の撮
像面３ａに結像させるように構成されている。励起フィ
ルタ１１は、図示しない照明光源からの照明光のうち励
起光２として使用する特定波長の光のみ透過し、それ以
外の波長領域の光は吸収する光学特性をもっている。ま
た、撮像用投影レンズ８の入射側には吸光フィルタ１３
が設けられている。この吸光フィルタ１３は撮像しよう
とする特定波長の光、すなわち生体試料１からの蛍光１
７のみ透過し、それ以外の波長領域の光は吸収する光学
特性をもっている。

【０００８】吸光フィルタ１３と撮像用投影レンズ８と
の間には、励起光２を生体試料１に導くダイクロイック
ミラー９が設けられている。このダイクロイックミラー
９は、励起フィルタ１１を通して対物レンズ７と撮像用
投影レンズ８との間に側方から導入される励起光２を対
物レンズ７に向けて反射し、対物レンズ７からの蛍光１
７を透過させる特性をもっている。ダイクロイックミラ
ー９は、対物レンズ７および撮像用投影レンズ８の光軸
と直交する定位置の軸１０を中心として回転可能に保持
されており、図１（Ａ）に示すように、励起光２を対物
レンズ７側に反射させる第１の姿勢と、図１（Ｂ）に示
すように、対物レンズ７からの光１２を実体観察光学系
６側に反射させる第２の姿勢とに切り替えることができ
る。第１および第２の姿勢は、いずれもダイクロイック
ミラー９の光軸と対物レンズ７および撮像用投影レンズ
８の光軸とが４５°の角度をなす姿勢であり、ダイクロ
イックミラー９を一方の姿勢から９０°回転させると他
方の姿勢になる。このダイクロイックミラー９の姿勢の
切り替えは、ダイクロイックミラー９の保持軸に固定さ
れた図示しないレバーを手動で回動させるだけで簡単に
行うことができる。

【０００９】一方、実体観察光学系６は、ダイクロイッ
クミラー９からの反射光１２を直交方向（上方）に反射
させるミラー１４と、ミラー１４からの反射光を集光し
接眼レンズ１６に投影する接眼用投影レンズ１５とを有
して構成される。上記のように構成された生体試料観察
装置は、ダイクロイックミラー９を図１（Ａ）の姿勢と
することにより落射蛍光撮像装置として使用でき、ダイ
クロイックミラー９を図１（Ｂ）の姿勢とすることによ
り実体顕微鏡として使用することができる。すなわち、
図１（Ａ）の場合、照明光（平行光）は励起フィルタ１
１を通過することにより特定波長の励起光２となりダイ
クロイックミラー９に照射される。ダイクロイックミラ
ー９では励起光２のみが反射され、対物レンズ７に導か
れる。励起光２は対物レンズ７で集光され生体試料１に
照射される。生体試料１から放出された蛍光１７は、対
物レンズ７で無限遠焦点系に導入され、ダイクロイック
ミラー９、吸収フィルタ１３を通して撮像用投影レンズ
８に導かれ、撮像装置３の撮像面３ａに投影されて撮像
される。このように、高開口数の対物レンズ７を用い、
その光路幅すべてを使って生体試料からの蛍光を集光し
て無限遠焦点系に導入し、撮像用投影レンズで全て集光
して撮像装置の撮像面に結像させることにより、暗い蛍
光像でも高効率でとらえることができるため、生体試料
１に照射する励起光の光量を最小限に抑えつつ、明るい
蛍光像を撮像することができる。

【００１０】一方、普通の照明で生体試料１を観察する
ときは、ダイクロイックミラー９を図１（Ａ）の姿勢か
ら９０°回転させて、図１（Ｂ）の姿勢に切り替える。
この場合、生体試料１を透過ないし反射してきた光１２
は対物レンズ７で無限遠焦点系に導入された後、ダイク
ロイックミラー９で特定の波長の光のみが反射されて、
実体観察光学系６のミラー１４に入射する。ミラー１４
からの反射光は、接眼用投影レンズ１５を通して接眼レ
ンズ１６に投影され、目視観察される。この実体観察光
学系６の接眼部には、通常の無限遠焦点系を採用した接
眼部が利用される。そしてズーム装置を通して、あるい
は直接接眼レンズ１６から顕微鏡像が観察される。この
ように、この実施の形態の生体試料観察装置は、落射蛍
光撮像装置の機能と実体顕微鏡の機能を併せ持ち、しか
も両機能をダイクロイックミラー９を回転させるという
極めて簡単な操作により切り替えることができる。した
がって、切り替え操作が装置や生体試料に及ぼす影響が
少ない。目視観察時に接眼部分へ導かれる光はダイクロ
イックミラー９で反射される波長の光のみとなるが、通
常蛍光像を撮像装置で記録しようとする際に必要となる
光量に比べて、目視による実験操作の際には光量が少な
くてもよいため、実験操作を行う上で問題となることは
ない。なお、上記の実施の形態では、実体観察光学系６
の構成要素として、ダイクロイックミラー９からの反射
光１２を上方に反射させるミラー１４を設けたが、この
ミラー１４は必ずしも必要ない。すなわち、図２に示す
ように、ダイクロイックミラー９からの反射光１２を直
接接眼用投影レンズ１５で集光し、接眼レンズ１６に投
影するようにしてもよい。また、上記の実施の形態で
は、対物レンズ７と撮像用投影レンズ８との間が無限遠
焦点系を成す光学系を採用したが、本発明は必ずしもこ
のような光学系に限定されるものではない。また、上記
の実施の形態では、励起光２を対物レンズ７に向けて反
射し、対物レンズからの光（蛍光）を透過させる特性を
有する反射体としてダイクロイックミラーを用いたが、
これに代えて、かかる特性を有するハーフプリズムなど
その他の光学部品を用いてもよい。

【００１１】

【発明の効果】以上説明したように、本発明は以下のよ
うな優れた効果を奏する。請求項１記載の発明によれ
ば、落射蛍光撮像装置の機能と実体顕微鏡の機能を、光
学部品の姿勢を定位置で切り替えるという簡単な操作で
切り替えることができるので、機能の切り替えを瞬時に
行うことができ、しかも切り替え操作による振動などが
装置や生体試料に及ぼす影響を少なくできる。これによ
り、電気生理学等の研究分野における極度に精密な実験
操作を、装置の付け替え作業などを行うことなく、落射
蛍光撮像装置と同一光学系下で行えるようになる。した
がって、蛍光プローブを用いた生体試料の機能形態の解
析が効率良くなされ、この種の研究が飛躍的に促進され
ることが期待される。また、請求項２記載の発明によれ
ば、請求項１記載の生体試料観察装置において、光学部
品を回転させるという極めて簡単な姿勢切り替え操作に
よって、落射蛍光撮像装置の機能と実体顕微鏡の機能と
を排他的に切り替えることができる。また、請求項３記
載の発明によれば、請求項１または請求項２記載の生体
試料観察装置を落射蛍光撮像装置として使用する際、生
体試料からの蛍光は対物レンズにより集光され、撮像用
投影レンズにより撮像装置の撮像面に結像されるので、
高開口数の対物レンズを使用することにより、生体試料
に照射する励起光の光量を最小限に抑えつつ、明るい蛍
光像を撮像することができる。

【００１２】また、請求項４記載の発明によれば、請求
項１、請求項２または請求項３記載の生体試料観察装置
において、励起光を生体試料に導くべく設けられた反射
体の姿勢を定位置で切り替えるという極めて簡単な操作
で、落射蛍光撮像装置の機能と実体顕微鏡の機能とを排
他的に切り替えることができる。また、請求項５記載の
発明によれば、請求項４記載の生体試料観察装置におけ
る反射体としてダイクロイックミラーを用いたことによ
り、この生体試料観察装置を落射蛍光撮像装置として使
用する際には、励起光をダイクロイックミラーで反射さ
せて生体試料側へ導くとともに生体試料からの蛍光はダ
イクロイックミラーを透過させて撮像用投影レンズへ導
くことができ、かつダイクロイックミラーの姿勢を切り
替えることにより実体顕微鏡の機能に切り替えることが
できるので、装置構成を簡略化できる。また、請求項６
記載の発明によれば、請求項３、請求項４または請求項
５記載の生体試料観察装置を落射蛍光撮像装置として使
用する際、生体試料からの蛍光は対物レンズにより集光
されて無限遠焦点系に導入され、全て撮像用投影レンズ
で集光されて撮像装置の撮像面に結像されるので、生体
試料に照射する励起光の光量を最小限に抑えつつも、高
開口数の対物レンズの特性を生かし切った明るい蛍光像
を撮像することができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】この発明の実施の形態の一例を示す生体試料観
察装置の光学系の構成図であり、（Ａ）は蛍光撮像時の
状態を、（Ｂ）は目視観察時の状態をそれぞれ示す。

【図２】この発明の別の実施の形態を示す生体試料観察
装置の光学系の構成図である。

【図３】従来の技術の一例を示す光学系の構成図であ
る。

【図４】従来の技術の別の例を示す光学系の構成図であ
る。

【図５】従来の技術のさらに別の例を示す光学系の構成
図である。

【符号の説明】

１：生体試料、２：励起光、３：撮像装置、３ａ：撮像
面、４：落射蛍光撮像光学系、５：普通照明、６：実体
観察光学系、７：対物レンズ、８：撮像用投影レンズ、
９：ダイクロイックミラー、１０：軸、１１：励起フィ
ルタ、１３：吸光フィルタ、１４ミラー、１５：接眼用
投影レンズ、１６：接眼レンズ、１７：蛍光。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献特開昭60−420（ＪＰ，Ａ) 実開昭57−30718（ＪＰ，Ｕ) 実公昭48−17305（ＪＰ，Ｙ１) 実公昭38−11848（ＪＰ，Ｙ１) (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) G02B 21/06 G01N 21/64

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】生体試料に励起光を照射しつつ、その生
体試料の蛍光像を撮像装置で撮像する落射蛍光撮像光学
系と、普通照明を用いて実像を目視観察するための実体
観察光学系とを備え、両光学系で共用する光学部品の姿
勢を定位置で切り替えることにより、両光学系を排他的
に切り替えて使用できるように構成したことを特徴とす
る生体試料観察装置。
【請求項２】前記光学部品は、これを回転させること
により前記姿勢の切り替えがなされることを特徴とする
請求項１記載の生体試料観察装置。
【請求項３】前記落射蛍光撮像光学系は、対物レンズ
と撮像用投影レンズとを互いに光軸を一致させて配置す
るとともに、当該対物レンズを通して生体試料に励起光
を照射しつつ、当該生体試料に現れる蛍光像を対物レン
ズでとらえ、当該撮像用投影レンズにより前記撮像装置
の撮像面に結像させるように構成されていることを特徴
とする請求項１または請求項２記載の生体試料観察装
置。
【請求項４】前記光学部品は、励起光を生体試料に導
くべく設けられた反射体であることを特徴とする請求項
１、請求項２または請求項３記載の生体試料観察装置。
【請求項５】前記反射体は、前記対物レンズと前記撮
像用投影レンズとの間に設けられたダイクロイックミラ
ーであることを特徴とする請求項４記載の生体試料観察
装置。
【請求項６】前記対物レンズと前記撮像用投影レンズ
との間は無限遠焦点系を成すことを特徴とする請求項
３、請求項４または請求項５記載の生体試料観察装置。