JP2003513611A - Ａｂｃ１ポリペプチドおよびコレステロール水準を調節する方法と試薬 - Google Patents

Ａｂｃ１ポリペプチドおよびコレステロール水準を調節する方法と試薬

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Abstract

(57)【要約】 本発明は異常コレステロール調節の診断と処置のためのＡＢＣ１核酸とポリペプチドに関する。本発明は更に動物（例えばヒト）におけるコレステロール水準を調節する化合物を確認する方法に関する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の背景】
低ＨＤＬコレステロール（ＨＤＬ−Ｃ）、すなわち低アルファリポタンパク質
症は血液脂質異常であり、高リスクの心臓血管病（ＣＶＤ）、とりわけ冠状動脈
病（ＣＡＤ）、それだけでなく脳血管病、冠状動脈再狭窄、および末梢血管病に
相関する。ＨＤＬ（高密度リポタンパク質）、すなわち「善玉コレステロール」
水準は環境および遺伝因子の両方により影響を受ける。
【０００２】 血漿ＨＤＬ−Ｃ濃度はＣＡＤの発生率と逆相関することは疫学研究で絶えず提
示されてきた。ＨＤＬ−Ｃ水準は強く段階付けられ独立した心臓血管危険因子で
ある。高ＨＤＬ−Ｃの保護作用は８０歳まで持続する。低ＨＤＬ−Ｃは正常（＜
５．２ｍｍｏｌ／ｌ）全血漿コレステロール水準においてすらＣＡＤリスクの増
加に関連する。冠状動脈病のリスクはＨＤＬ−Ｃの１ｍｇ／ｄＬ（０．０２６ｍ
ｍｏｌ／ｌ）毎に男性で２％、女性では３％増加し、大多数の研究では他の脂質
および非脂質危険因子の調節後においてもなおこの関係は統計的に有意である。
ＨＤＬ−Ｃ水準の減少は早発性ＣＡＤの患者に見られるもっとも一般的なリポタ
ンパク質異常である。早発性ＣＡＤの患者の４％は他のリポタンパク質異常がな
くてＨＤＬ−Ｃ水準の減少の単離形態を持ち、一方その２５％は併発する低ドグ
リセリド症を伴う低ＨＤＬ水準にある。
【０００３】 他の脂血不全症または二次因子を考慮しても、ＨＤＬ−ＣはＣＡＤの重要な予
言者である。糖尿病患者のコホート（部分集団）では、単離された低ＨＤＬコレ
ステロールを持つ人は正常ＨＤＬコレステロール（＞０．９ｍｍｏｌ／ｌ）を持
つ糖尿病患者と比較して死亡率が６５％増加した。更に家族性高コレステロール
血症を持つ人などのような高リスク集団内でも、ＨＤＬコレステロール水準はＣ
ＡＤの重要な予言者である。低ＨＤＬコレステロール水準はかくしてＣＡＤの主
要で、独立したリスクとなることが示された。
【０００４】 これらの発見は処置のための焦点としてＨＤＬコレステロール水準に対する関
心を高め、全米コレステロール教育プログラムの勧告となった。これらのガイド
ラインは０．９ｍｍｏｌ／ｌ以下のＨＤＬコレステロール値は男性および女性に
著しいリスクを与えることを示唆する。このように、ＣＡＤを持つ患者のほぼ半
分は低ＨＤＬコレステロールを持つであろう。従って、この表現型に寄与する因
子をよりよく理解することが重要である。低ＨＤＬコレステロール水準の薬物介
入がこれまでの所、不満足であることが証明されたことを考慮して、循環でこれ
らの水準を調節する因子を理解することは、この理解が新しい治療標的を明らか
にするために重要である。
【０００５】 ＨＤＬコレステロールの絶対水準は必ずしもＣＡＤのリスクを予言するとは限
らない。ＣＥＴＰ欠損症の場合、個体はＨＤＬコレステロール水準の増加にもか
かわらず、ＣＡＤ成長の増加リスクを示す。この場合重要であると見做されるも
のは逆コレステロール輸送経路の機能活性であり、このプロセスにより細胞内コ
レステロールは細胞からＡｐｏＡＩまたはＨＤＬなどの受容体タンパク質へと行
き交う。ＨＤＬコレステロール水準の他の重要な遺伝的決定基、およびそのＣＡ
Ｄとの逆関係はＨＤＬ形成と細胞コレステロールの通行および流出に導くプロセ
スに存在するであろう。今日までの所、このプロセスは殆ど理解されておらず、
しかしまた明らかにこの経路の成分すべてが同定されてはいない。かくして適切
なＨＤＬ仲介コレステロール流出を妨げる欠損はＣＡＤの重要な予言者となるで
あろう。従って細胞内コレステロール通行と流出経路に含まれる新規な遺伝子を
同定し理解することはきわめて重要である。
【０００６】 ＨＤＬ粒子は逆コレステロールに輸送のプロセスの中心にあり、従って組織コ
レステロールホメオスタシス（恒常性）の維持の中心となる。このプロセスは多
段階であり、すなわちＨＤＬの細胞表面成分への結合、受動吸収によるコレステ
ロールの獲得、ＬＣＡＴ（レチシンコレステロールアシルトランスフェラーゼ）
によるこのコレステロールのエステル化および続いて起こるＣＥＴＰ（コレステ
ロールエステル輸送タンパク質）によるエステル化コレステロールのＶＬＤＬ（
超低密度リポタンパク質）への輸送、および肝臓摂取のためのカイロミクロンレ
ムナントである。これらの各段階はＨＤＬの血漿濃度に強く影響をするものとし
て知られる。
【０００７】 ＡｐｏＡＩ−ＣＩＩＩ、リポタンパク質リパーゼ、ＣＥＴＰ、肝性リパーゼお
よびＬＣＡＴの遺伝子の変化はすべてヒトのＨＤＬ−Ｃ水準の決定に寄与する。
遺伝子ＨＤＬ欠損の一つの稀な形態は世界中で約４０人しかいないと診断され、
また（常染色体劣性形質としてＯＭＩＭにリストされた（ＯＭＩＭ２０５４００
））ＨＤＬコレステロール（ＨＤＬ−Ｃ）水準のほぼ完全な欠除と関連するタン
ジアー病（ＴＤ）である。これらの患者は非常に低いＨＤＬコレステロールおよ
びＡｐｏＡＩ水準にあり、これは脂質の遅延獲得とそれに伴う成熟ＨＤＬへの転
換の不全による発生期ＨＤＬとＡｐｏＡＩの異化亢進に帰せられる。ＴＤ患者は
コレステロールエステルをいくつかの組織で累積し、その結果抗大黄色扁桃、肝
脾腫大、末梢ニューロパシー、直腸粘膜でのコレステロールエステル沈着などの
ような疾患、固有の特性を示す。ＡｐｏＡＩによる細胞コレステロールとリン脂
質の欠損除去同じく細胞間コレステロールのＨＤＬ仲介流出での標識欠損はＴＤ
繊維芽細胞で示された。例えこれが稀な疾患であるにしても、その分子基礎の決
定は全集団でのコレステロール調節のための関連する経路を同定できるであろう
。タンジアー病患者の細胞の表面膜で流出する遊離コレステロール利用度の減少
は細胞脂質代謝または通行での欠損に原因があるように見える。タンジアー病患
者の約４５％は早発性ＣＡＤの徴候を示し、これはコレステロール流出の減少、
低ＨＤＬコレステロールとＣＡＤとの間に強力な関係があることを示唆している
。ＴＤにかかっている人の直腸粘膜ではコレステロールの増加が観察されるので
、ＴＤに原因がある分子機構もまた胃腸（ＧＪ）管からのコレステロール吸着を
調節するであろう（ＯＭＩＭ １０７６８）。
【０００８】 より一般的な形態での遺伝子ＨＤＬ欠損は通常年齢と性の第５百分位数以下の
低血漿ＨＤＬコレステロールを持つが、タンジアー病に特異的な臨床表示の欠損
を持つ患者で現れる（マーシル他、アーテリオスクレロシス・スロンボシス・バ
スキュラソー・バイオロジー、１９巻、１５９−１６９ページ、１９９９年；マ
ーシル他、アーテリオスクレロシス・スロンボシス・バスキュラー・バイオロジ
ー、１５巻、１０１５−１０２４，１９９５年）。これらの患者はこの脂質表現
型と関連する明白な環境因子を持つことはなく、また厳しいＨＤＬ欠損病（Ａｐ
ｏＡＩ，ＬＣＡＴ，またはＬＰＬ欠損症）の原因として知られている厳しい高ト
リグリセリド症も持たなかったし、糖尿病でなかった。この異常の継承の様式は
メンデルの優性形質（ＯＭＩＭ １０７６８）ともっともよく一致する。
【０００９】 コレステロール代謝を調節する薬剤の開発はこれまでの所、ゆっくりと進行し
ている。かくしてコレステロールの流出経路の遺伝子成分のよりよい理解が必要
となる。新しく発見された成分は次いで薬剤設計の標的として役立ち得る。
【００１０】 低ＨＤＬ水準は多数の遺伝因子の故であるように思われる。患者に適応した処
置を設計するのに役立つ薬剤遺伝学の使用はコレステロールに流出経路の成分に
ある多型性を同定するための望ましいものとする。これら多型性のタンパク質機
能に対する作用の理解は患者にとって最適の治療法の設計を可能にする。
【００１１】 発明の概要 第１の見地において、本発明はＡＢＣ１生物活性を持つ事実上純粋なＡＢＣ１
ポリペプチドを扱う。望ましくは、ＡＢＣ１ポリペプチドはヒトＡＢＣ１（例え
ば配列識別番号１のアミノ酸１乃至６０またはアミノ酸６１乃至２２６１を含む
もの）である。望ましい実施例において、ＡＢＣ１ポリペプチドは配列識別番号
１のアミノ酸１乃至２２６１を含む。
【００１２】 本発明のポリペプチドから特異的に除外されるのは、ジェンバンク・アクセス
番号ＣＡＡ１０００５．１の完全アミノ酸配列を持つポリペプチドと、ＡＪ０１
２３７６．１の完全配列を持つ核酸である。同じく除外されるのはジェンバンク
・アクセス番号Ｘ７５９２６の完全アミノ酸配列を持つタンパク質である。
【００１３】 関連する見地において、本発明は配列識別番号１のアミノ酸１乃至２２６１を
含む事実上純粋なＡＢＣ１ポリペプチドを扱う。
【００１４】 も一つの見地において、本発明はＡＢＣ１生物活性を持つＡＢＣ１ポリペプチ
ドをコード化する事実上純粋な核酸分子（例えば配列識別番号１のヌクレオチド
７５乃至２５４またはヌクレオチド２５５乃至６８５８を含む核酸分子）を扱う
。一つの望ましい実施例において、核酸分子は配列識別番号２のヌクレオチド７
５乃至６８５８を含む。
【００１５】 関連する見地において、本発明は本発明の核酸分子を含む発現ベクター、細胞
、または非ヒト哺乳類を扱う。
【００１６】 更にも一つの見地において、本発明は配列識別番号２のヌクレオチド７５乃至
２５４、配列識別番声２のヌクレオチド２５５乃至６８５８、または配列識別番
号２の７５乃至６８５８を含む事実上純粋な核酸を扱う。
【００１７】 更にも一つの見地において、本発明はヒトＡＢＣ１遺伝子からの５′または３
′未翻訳領域に一致する少なくとも１５個のヌクレオチドを含む事実上純粋な核
酸分子を扱う。望ましくは、３′未翻訳領域は配列識別番号２のヌクレオチド７
０１５−７８６０を含む。
【００１８】 関連する見地において、本発明は配列識別番号２のヌクレオチド７０１５−７
８６０を含むプローブに高い緊縮でハイブリッド形成する事実上純粋な核酸分子
を扱う。
【００１９】 も一つの見地において、本発明はＡＢＣ１ポリペプチド、またはそのコレステ
ロール調節断片、あるいはＡＢＣ１ポリペプチドをコード化する核酸分子、もし
くはそのコレステロール調節断片をヒトに投与することを含む低ＨＤＬコレステ
ロールにまたは心臓血管病を持つヒトを処置する方法を扱う。望ましい実施例に
おいて、ヒトは正常な値に対して低いＨＤＬコレステロール水準を持つ。望まし
くは、ＡＢＣ１ポリペプチドは野生型ＡＢＣ１であり、または突然変異がその安
定性とその生物活性を増加させる。望ましい生物活性はコレステロールの調節で
ある。
【００２０】 関連する見地において、本発明はプロモーターに操作可能に連結されるＡＢＣ
１核酸分子を含みＡＢＣ１生物活性を持つＡＢＣ１ポリペプチドをコード化する
発現ベクターをヒトに導入ることを含む心臓血管病を予防しまたは処置する方法
を扱う。
【００２１】 も一つの関連する見地において、本発明はプロモーターに操作可能に連結され
るＡＢＣ１核酸分子を含みＡＢＣ１生物活性を持つＡＢＣ１ポリペプチドをコー
ド化する発現ベクターをヒトに導入することを含むＡＢＣ１遺伝子での疾病発病
突然変異の作用を予防しまたは改善する方法を扱う。
【００２２】 更にも一つの見地において、本発明は野生型ＡＢＣ１の活性を模倣しあるいは
ＡＢＣ１の生物活性を調節する化合物を動物（例えばヒト）に投与することを含
む心臓血管病を処置しまたは予防する方法を扱う。
【００２３】 本発明の方法を使用して処置できる一つの望ましい心臓血管病は冠状動脈病で
ある。その他脳血管病と末梢血管病が含まれる。
【００２４】 ＡＢＣ１遺伝子とタンパク質が血清ＨＤＬ水準に影響するコレステロール輸送
を伴うということの発見は、ＨＤＬ増加またはＣＶＤ阻害薬剤の同定のための各
種の診断試験と検定でＡＢＣ１タンパク質および遺伝子の使用を可能にする。こ
のような検定の一つのファミリーで、ＡＴＰを結合するＡＢＣ１タンパク質の領
域の能力が利用される。この結合を高める化合物は潜在的ＨＤＬ増加薬剤である
。同様に細胞膜での陰イオン輸送能力と膜孔形成機能は薬剤スクリーニングに使
用することができる。
【００２５】 ＡＢＣ１発現もまた低ＨＤＬまたはＣＶＤの診断用具として使用できる。ＡＢ
Ｃ１遺伝子配列の遺伝的亜類型化の決定は低ＨＤＬ表現型がＡＢＣ１機能に関係
するかどうかを決定するために低ＨＤＬ個体またはファミリーを亜類型化するた
めに使用できる。この診断プロセスは、患者の応答についての予言（例えば化合
物または薬剤の投与に対する効能の増加または減少、あるいは望ましくない副作
用）を含む患者の遺伝子型に基づく薬剤処置の適応（薬剤遺伝学）に導くことが
できる。
【００２６】 ＡＢＣ１ポリペプチドに対する抗体は療法および診断法の両方で使用できる。
抗体はＢ細胞で抗ＡＢＣ１タンパク質の産生を刺激するＡＢＣ１ポリペプチドで
Ｂ細胞含有生物系、例えばマウスなどの動物を免疫的に攻撃し、次いでその生物
系から抗体を単離することで産生される。このような抗体は血清などの生物サン
プルを抗体と接触させ、次いでサンプル内のＡＢＣ１ポリペプチドの尺度として
免疫複合体を測定することによりサンプル内のＡＢＣ１ポリペプチドを測定する
のに使用できるＡＢＣ１に対する抗体は更にＡＢＣ１生物活性の調節のために治
療薬として使用できる。
【００２７】 かくしても一つの見地において、本発明はＡＢＣ１と特異的に結合する精製さ
れた抗体を扱う。
【００２８】 更にも一つの見地において、本発明は（ａ）ＡＢＣ１ポリペプチドを提供し、
（ｂ）ＡＢＣ１ポリペプチドを候補化合物と接触させ、（ｃ）ＡＢＣ１生物活性
を測定することを含む候補化合物がＡＢＣ１生物活性を調節するかどうかを決定
する方法を扱い、ここで化合物と接触されないＡＢＣ１ポリペプチドと対比した
変性ＡＢＣ１生物活性は、候補化合物がＡＢＣ１生物活性を調節することを示し
ている。
【００２９】 更にも一つにおいて、本発明は修補化合物がＡＢＣ１発現を調節するかどうか
を決定するための方法を扱う。この方法は（ａ）レポーター遺伝子に操作可能に
連結されるＡＢＣ１プロモーターより成る核酸分子を提供し、（ｂ）核酸分子を
候補化合物に接触され、（ｃ）レポーター遺伝子発現を測定することを含み、こ
こで化合物に接触されない核酸分子に対比した変性レポーター遺伝子は候補化合
物がＡＢＣ１発現を調節することを示している。
【００３０】 も一つの見地において、本発明は候補化合物がコレステロール水準を調節する
のに有用であるかどうかを決定する方法を扱い、この方法は（ａ）ＡＢＣ１ポリ
ペプチドを提供し、（ｂ）ポリペプチドを候補化合物と接触させ、（ｃ）ＡＢＣ
１ポリペプチドの結合を測定するステップを含み、ここでＡＢＣ１ポリペプチド
の結合は候補化合物がコレステロール水準を調節するのに役立つことを示してい
る。
【００３１】 関連する見地において、本発明は候補化合物がＡＢＣ１生物活性をまねるかど
うかを決定する方法を扱う。この方法は（ａ）ＡＢＣ１ポリペプチド発現しない
細胞を提供し、（ｂ）細胞を候補化合物に接触させ、（ｃ）細胞のＡＢＣ１生物
活性を測定することを含み、ここで化合物に接触されない細胞に対比した変性Ａ
ＢＣ１生物活性は候補化合物がＡＢＣ１生物活性を調節することを示す。望まし
くは、細胞はＡＢＣ１ヌル突然変異を持つ。望ましい実施例において、細胞はＡ
ＢＣ１遺伝子が突然変異したマウスまたはニワトリ（例えばＷＨＡＭニワトリ）
内にある。
【００３２】 更にも一つの実施例において、本発明は候補化合物が低ＨＤＬコレステロール
の処置に有用であるかどうかを決定する方法を扱う。この方法は（ａ）ＡＢＣ輸
送体（例えばＡＢＣ１）を提供し、（ｂ）輸送体を候補化合物と接触させ、（ｃ
）ＡＢＣ輸送体の生物活性を測定することを含み、ここで化合物に接触されない
輸送体と対比した増加ＡＢＣ輸送体生物活性は候補化合物が低ＨＤＬコレステロ
ールの処置に有用であることを示している。望ましくは、ＡＢＣ輸送体は細胞ま
たは無細胞検定システム内にある。
【００３３】 更にも一つの見地において、本発明は候補化合物がコレステロール水準を調節
するのに有用であるかどうかを決定する方法を扱う。この方法は（ａ）レポータ
ー遺伝子に操作可能に連結されるＡＢＣ輸送体プロモーターより成る核酸分子を
提供し、（ｂ）核酸分子を候補化合物と接触させ、（ｃ）レポーター遺伝子の発
現を測定することを含み、ここで化合物に接触されない核酸分子と対比したレポ
ーター遺伝子の増加発現は候補化合物がコレステロール水準を調節するのに有用
であることを示している。
【００３４】 更にも一つの見地において、本発明は候補化合物がＡＢＣ輸送体ポリペプチド
の安定性を増加しまたは調節された異化作用を減少させるかどうかを決定する方
法を扱う。この方法は（ａ）ＡＢＣ輸送体ポリペプチドを提供し、（ｂ）輸送体
を候補化合物に接触させ、（ｃ）ＡＢＣ輸送体ポリペプチドの半減期を決定する
ことを含み、ここで化合物と接触されない輸送体と対比した半減期の増加は候補
化合物がＡＢＣ輸送体ポリペプチドの安定性を増加しまたはその調節された異化
作用を減少させることを示している。望ましくは、ＡＢＣ輸送体は細胞または無
細胞検定システム内にある。
【００３５】 本発明のスクリーニング法の望ましい実施例において、細胞は動物内にある。
望ましいＡＢＣ輸送体はＡＢＣ１、ＡＢＣ２、ＡＢＣＲ、およびＡＢＣ８であり
、また望ましい生物活性はコレステロール（例えばＨＤＬコレステロールまたは
ＬＤＬコレステロール）またはインターロイキン−１の輸送であり、あるいはＡ
ＢＣ１ポリペプチドによるＡＴＰの結合または加水分解である。
【００３６】 望ましくは、スクリーニング法で使用されるＡＢＣ１ポリペプチドは配列識別
番号１のアミノ酸１−６０を含む。選択肢として、ＡＢＣ１ポリペプチドは高緊
縮条件の下で配列識別番号２のヌクレオチド７５乃至２５４にハイブリッド形成
するヌクレオチド配列によりコード化される領域を含むことができる。
【００３７】 も一つの見地において、本発明は患者が心臓血管病のリスクの増加を負うかど
うかを決定する方法を扱う。この方法は患者のＡＢＣ１遺伝子が突然変異である
かどうかを決定することを含み、ここで突然変異は患者が心臓血管病のリスクの
増加を負うことを示している。
【００３８】 関連する見地において、本発明は患者が心臓血管病のリスクの増加を負うかど
うかを決定する方法を扱う。この方法は患者のＡＢＣ１遺伝子が多型性を持つか
どうかを決定することを含み、ここで多型性は患者が心臓血管病のリスクの増加
を負うことを示している。
【００３９】 も一つの見地において、本発明は患者が心臓血管病のリスクの増加を負うかど
うかを決定する方法を扱う。この方法は患者にあるＡＢＣ１生物活性を測定する
ことを含み、ここで正常水準に対比したＡＢＣ１生物活性での水準の増加または
減少は患者が心臓血管病のリスクの増加を負ったことを示している。
【００４０】 更にも一つの見地において、本発明は患者が心臓血管病のリスクの増加を負う
かどうかを決定する方法を扱う。この方法は患者にあるＡＢＣ１発現を測定する
ことを含み、ここで正常水準に対比したＡＢＣ１発現での水準の減少は患者が心
臓血管病のリスクの増加を負うことを示している。望ましくは、ＡＢＣ１発現は
、ＡＢＣ１ポリペプチドまたはＡＢＣ１ ＲＮＡを測定することにより決定され
る。
【００４１】 も一つの見地において、本発明は突然変異ＡＢＣ１ポリペプチドをコード化す
る核酸分子より成る導入遺伝子を持つ非ヒト哺乳類を扱う。一つの実施例では、
突然変異は優性ネガティブ変異である。
【００４２】 関連する見地において、本発明はＡＢＣ１生物活性を持つＡＢＣ１ポリペプチ
ドをコード化する核酸分子を含む導入遺伝子を持つ非ヒト哺乳類を扱う。
【００４３】 も一つの関連する見地において、本発明はＡＢＣ１生物活性を持つＡＢＣ１ポ
リペプチドをコード化する核酸分子を含む導入遺伝子を持つ非ヒト哺乳類からの
細胞を扱う。
【００４４】 更にも一つの見地において、本発明は候補化合物が優性ネガティブＡＢＣ１ポ
リペプチドの阻害を減少させるかどうかを決定する方法を扱う。この方法は（ａ
）優性ネガティブＡＢＣ１ポリペプチドを発現する細胞を提供し、（ｂ）細胞を
候補化合物と接触させ、（ｃ）細胞のＡＢＣ１生物活性を測定することを含み、
ここで化合物と接触されない細胞と対比したＡＢＣ１生物活性の増加は候補化合
物が優性ネガティブＡＢＣ１ポリペプチドの阻害を減少させることを示している
。
【００４５】 「ポリペプチド」とは糖化またはリン酸化などの翻訳後修飾にも拘らず２個以
上のアミノ酸のある鎖を意味する。
【００４６】 「事実上同一」とは、参照アミノ酸または核酸配列と少なくとも５０％、望ま
しくは８５％、より望ましくは９０％またもっとも望ましくは９５％の同一性を
示すポリペプチドまたは核酸を意味する。ポリペプチドでは、比較配列の長さは
一般に少なくとも１６個のアミノ酸、望ましくは少なくとも２０個のアミノ酸、
より望ましくは２５個のアミノ酸、またもっとも望ましくは３５個のアミノ酸で
ある。核酸では、比較配列の長さは一般に少なくとも５０個のヌクレオチド、望
ましくは少なくとも６０個のヌクレオチド、より望ましくは少なくとも７５個の
ヌクレオチド、またもっとも望ましくは少なくとも１１０個のヌクレオチドであ
る。
【００４７】 配列の同一性は典型的にはそこに定義されたデフォオールトパラメーターでの
配列分析ソフトウェア（例えばジェネティクス・コンピューター・グループの配
列分析ソフトウェアパッケージ、５３７０５ ウィスコンシン、マジソン、ユニ
バーシティ・アベニュー １７１０、ユニバーシティ・オブ・ウィスコンシン・
バイオテクノロジーセンター）を用いて測定される。このソフトウェアプログラ
ムは各種の置換、欠失、および他の修飾に対し相同の度合を割当てることで類似
の配列に適合する。同類置換は典型的には下記のグループ：すなわちグリシン、
アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、
アスパラギン、グルタミン、セリン、リシン、アルギニン、およびフェニルアラ
ニン、チロシン内での置換を含む。
【００４８】 「高い緊縮条件」とは少なくとも４０個のヌクレオチドのＤＮＡプローブ長さ
で２×ＳＳＣ、４０℃でハイブリッド形成することを意味する。高い緊縮条件の
他の定義については、ここで引用例として組み込まれているＦ．アウスベル他、
分子生物学での現在のプロトコル、６．３．１−６．３．６ページ、ジョン・ワ
イリー・アンド・サンズ、ニューヨーク、ニューヨーク １９９４年を参照され
たい。
【００４９】 「事実上純粋なポリペプチド」とは、自然にポリペプチドを伴う成分から分離
されたポリペプチドを意味する。典型的には、ポリペプチドはそれが少なくとも
重量で６０％であり、タンパク質とそれが自然に関連する自然発生有機分子とを
欠いている場合に事実上純粋である。望ましくは、ポリペプチドは重量で少なく
とも７５％、より望ましくは少なくとも９０％、またもっとも望ましくは少なく
とも９９％純粋であるＡＢＣ１である。事実上純粋なＡＢＣ１ポリペプチドは、
例えばＡＢＣ１ポリペプチドをコード化する組換え核酸の発現により、あるいは
タンパク質の化学合成により自然源（例えば膵臓細胞）から得られる。純度は適
切な方法、例えばカラムクロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動
、あるいはＨＰＬＣ分析により測定することができる。
【００５０】 ポリペプチドはその自然状態でポリペプチドを伴う不純物から分離される時に
事実上自然関連成分無しとなる。かくして化学合成されるか自然に由来する細胞
とは異なる細胞系で産生されるポリペプチドはその自然関連無しとなる。従って
事実上純粋なポリペプチドは真核生物に自然に由来し、しかし大腸菌または原核
生物でも合成される。
【００５１】 「事実上純粋な核酸」とは本発明の核酸が誘導される生体の自然発生ゲノムで
核酸に隣接する遺伝子を欠いている核酸を意味する。この用語は従って、例えば
ベクターに、自動複製プラスミドまたはウイルスに、原核または真核細胞のゲノ
ム核酸に組み込まれる、あるいは他の配列から独立した別の分子（例えばＰＣＲ
または制限エンドヌクレアーゼ消化で産生されるＣＤＮＡまたはゲノムあるいは
ＣＤＮＡ断片）として存在する組換え核酸を含む。それは更に追加のポリペプチ
ド断片をコード化するハイブリッド遺伝子の部分である組換え核酸を含む。
【００５２】 「調節する」とは増加または減少を意味する。望ましくは、コレステロール水
準（例えばＨＤＬコレステロール水準、ＬＤＬコレステロール水準、あるいは総
コレステロール水準）、またはＡＢＣ１生物活性、発現安定性または分解を調節
する化合物は、少なくとも１０％、より望ましくは少なくとも２５％、またもっ
とも望ましくは少なくとも５０％調節する。
【００５３】 「精製抗体」とは重量で少なくとも６０％タンパク質と、タンパク質が自然関
連する自然発生有機分子を欠いている抗体を意味する。望ましくは、その調製は
重量で少なくとも７５％、より望ましくは９０％、またもっとも望ましくは少な
くとも９９％抗体である。精製抗体は多分例えば組換え産生タンパク質または保
存モチーフペプチドを用いるアフィニティクロマトグラフィーおよび標準手法に
より得ることができる。
【００５４】 「特異的に結合する」とは例えばヒトＡＢＣ１ポリペプチドを認識し結合する
が、例えばサンプル、例えば自然にタンパク質を含む生物学的サンプル内で他の
非ＡＢＣ１分子を事実上認識せずまた結合もしない抗体を意味する。望ましい抗
体は図９Ａ（配列識別番号１）のＡＢＣ１ポリペプチド配列と結合する。
【００５５】 「多型性」とはヌクレオチドまたはヌクレオチド領域がいくつかの異なった形
態で発生することで特徴付けられることを意味する。「突然異変」はコード化タ
ンパク質の発現水準、安定性、機能または生物活性が事実上変更される多型性の
形態である。
【００５６】 「ＡＢＣ輸送体」または「ＡＢＣポリペプチド」とはＡＴＰを加水分解し物質
を膜を通して輸送する輸送体を意味する。望ましくは、ＡＢＣ輸送体ポリペプチ
ドはＡＴＢ結合カセットと膜貫通領域を含む。ＡＢＣ輸送体の例は必ずしもそれ
に限定されないが、ＡＢＣ１、ＡＢＣ２、ＡＢＣＲおよびＡＢＣ８である。
【００５７】 「ＡＢＣ１ポリペプチド」とは配列識別番号１のアミノ酸配列を持つＡＢＣ１
ポリペプチドと事実上同一性を持つポリペプチドを意味する。
【００５８】 「ＡＢＣ生物活性」または「ＡＢＣ１生物活性」とはＡＴＰの加水分解または
結合、化合物（例えばコレステロール、インターロイキン１）あるいは胃を貫通
するイオンの輸送、またはコレステロールもしくはリン脂質水準（例えばＨＤＬ
コレステロールまたはＬＤＬコレステロール水準の増加あるいは減少のいずれか
によって）の調節を意味する。
【００５９】 本発明はヒト患者に使用できる治療化合物（コレステロール調節剤または抗Ｃ
ＶＤ薬剤）を同定するスクリーニング手順を提供する。ＡＢＣ生物活性（例えば
ＡＢＣ１生物活性）を調節する化合物はＡＢＣ濃度、タンパク質安定性、制御さ
れた異化作用、あるいは他のタンパク質または因子を結合する能力を調節する化
合物として本発明で有用と考えられる。一般に本発明のスクリーニング法はいず
れかの数の試験管内または生体内実験システムを採用することにより治療活性剤
としてのいくつかの数の化合物をスクリーニングすることを伴う。このような化
合物の確認のために有用な代表的な方法は以下で説明される。
【００６０】 本発明の方法は低ＨＤＬとＣＶＤの処置と予防のための活性剤の評価、確認お
よび開発を単純化する。一般にスクリーニング法は更に評価されいくつかの活性
および選択材料に濃縮される大きな集団からの対象となる自然産物抽出物または
化合物を選択するためのたやすい手段を提供する。このプールの成分は次いでそ
のＨＤＬ上昇または抗ＣＶＤ活性もしくはその両方を決定するために、本発明の
方法で精製され評価される。
【００６１】 本発明の他の特性と利点とは以下の望ましい実施例の明細書と請求項から明ら
かになるであろう。
【００６２】 遺伝子はＨＤＬ水準に影響する著しい役割を果す。タンジアー病（ＴＤ）は最
初に報告された遺伝的なＨＤＬ欠損であった。ＴＤの分子主成分は未知であるが
３ファミリーで９ｑ３１に地図作製されている。我々は２個の追加発端者とその
ファミリーを同定し、連鎖を確認し、限定されたゲノム領域に対する遺伝子座を
精緻化した。これら２個のファミリーの４個の対立遺伝子を説明するＡＢＣ１遺
伝子の突然変異は検出された。低ＨＤＬ水準のより多くの原因は異なった疾患、
家族性ＨＤＬ欠損（ＦＨＡ）である。独立した結合、減数分裂組換え体およびハ
プロタイプ関連疾患を基礎にして、ＦＨＡはＡＢＣ１遺伝子を取り囲む小さなゲ
ノム領域に局在化された。保存残基内の突然変異はＦＨＡで分離された。線維芽
細胞内のＡＢＣ１転写物のアンチセンス減数分裂はコレステロール流出の著しい
減少と関係していた。
【００６３】 コレステロールは通常細胞内脂質で組立てられ分泌されるが、ＴＤではこのプ
ロセスは転換されコレステロールはリソソームに分解される。コレステロールの
細胞間通行の障害は、リソソームの形態的変化とゴルジ装置と、組織球、シュヴ
ァン細胞、平滑筋細胞、肥胖細胞および線維芽細胞でのコレステリルエステルの
蓄積と関連した細胞内コレステロールエステルの蓄積の増加を来たす。
【００６４】 ＴＤを持つ患者の臨床および生化学的異種混交は遺伝的異種混交もまたこの疾
患に横たわる可能性に導く。これを考慮して、我々はまず異なった先祖（ＴＤ−
１はオランダ人、ＴＤ−２はイギリス人；フローリッヒ他、Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅ
ｓｔ．Ｍｅｄ．１０巻；３７７−３８２ページ、１９８７年）のこれら２家族の
連鎖分析を行い、これらの家族にあるＴＤに横たわる遺伝的突然変異が同じ９ｑ
３１領域に局在化され、これに対してＴＤを持つ大型家族が特定されたことを確
認した（ラスト他、ネイチャー・ジェネティス、２０巻、９６−９８ページ、１
９９８年）。詳細なハプロタイプ分析は物理的地図の構築と共にこの遺伝子の局
在化を明らかにした。ＡＢＣ１遺伝子の突然変異がＴＤで発見された。
【００６５】 ＦＨＡはその正確な頻度は知られていないけれどもＴＤより多く一般にある。
ＴＤは今日まで４０家族のみであると記載されている一方、我々はオランダとケ
ベックだけで４０ＦＨＡ家族を同定した。９ｑ３１への連鎖の最初の提案の後、
この領域での約１０ｃＭに拡がる１３個の多型性標識が類別されＤ９Ｓ２７７で
最高のＬＯＤ得点をした。その両親の血族の故でＴＤに近い標識にホモ接合性で
あることが期待されたＴＤ−２発端者でのマーカーのホモ結合性についての分析
はＴＤ遺伝子をＤ９５１２７の遠位の遺伝子に置いた。ＴＤとＦＨＡ家族から組
合せた遺伝子データはＤ９Ｓ１２７とＤ９Ｓ１８６６の間の約１，０００キロベ
ースに広がる同一ゲノムセグメントに向けられた。ＡＢＣ１輸送体遺伝子は最小
ゲノム領域内に含まれた。一家族のＲＴ−ＰＣＲ分析はＡＢＣ１の第１膜貫通領
域の残基６９３（Δ６９３）でのロイシンの欠失を示し、これはこの家族でのＨ
ＤＬ欠失の表現型で分離された。
【００６６】 ＡＢＣ１はＡＴＰ結合カセット（ＡＢＣ輸送体）上科の部分であり、それは膜
を貫通する各種多様な基質のエネルギー依存輸送を伴う（ディーン他、Ｃｕｒｒ
．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎ．Ｄｅｖ．５巻、７７９−７８５ページ、１９９５年）。こ
れらのタンパク質はこのクラスのタンパク質を他のＡＴＰ結合タンパク質から区
別する進化を通じて保存された特有のモチーフを持つ。ヒトではこれらの遺伝子
は基本的に２個のＡＴＰ結合セグメントと２個の膜貫通ドメインをコード化する
（ディーン他、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎ．Ｄｅｖ．５巻、７７９−７８５ペ
ージ、１９９５年）。我々はこれからＡＢＣ１輸送体が細胞間コレステロール輸
送にとって重要であることを示していく。
【００６７】 我々はオリゴヌクレオチドアンチセンスアプローチを用いるＡＢＣ１転写物の
減数分裂が流出を減少させたことを示し、その遺伝子とその機能作用内の変更の
間の結合を明らかに示した。ＴＤとＦＨＡは今ではタンパク質のＡＢＣ基に欠損
があるため遺伝病の成長するリストに加わっており、それは嚢胞性線維症（ジー
レンスキー他、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．，２９巻、７７７−８０７ページ
、１９９５年）、副腎脳白質ジストロフィー（モッサー他、ネイチャ−、３６１
巻、７２６−７３０ページ、１９９３年）。ツェルヴェーガー症候群（ゲルトナ
ー他、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１巻２３、１９９２年）、進行性家族性肝臓内胆汁
うつ滞（ブル他、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１８巻、２１９−２２４ページ、１９９
８年）、およびシュタルガルト病を含む異なった眼の疾患、（アリクメッツ他、
Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１５巻、２３６−２４６ページ、１９９７年）、常染色体
退縮性色素性網膜炎（アリクメッツ他、サイエンス、２７７巻、１８０５−１８
０７ページ、１９９７年）、および錐杆体ディストロフィー（クレマース他、Ｈ
ｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．７巻、３５５−３６２ページ１９９８年）を含む。
【００６８】 ＴＤの患者は、タンジアー病が常染色体退縮性疾患（ＯＭＩＭ ２０５４０）
であるのに対してＦＨＡは常染色体優性形質（ＯＭＩＭ １０７６８）として遺
伝することでＦＨＡの患者とは区別されてきた。更にＴＤを持つ患者はＦＨＡ患
者には見られない細胞内コレステロール蓄積の明らかな証拠が見られる。ＴＤの
ヘテロ接合体がＨＤＬ水準をしっかり減少させ、また同じメカニズムがＴＤと同
じくＦＨＡのヘテロ接合体で見られるＨＤＬの欠損とコレステロール流出の欠損
に横たわることは明らかである。更にＴＤでのより厳しい表現型がＡＢＣ１遺伝
子の対立遺伝子両方からの機能の損失を表している。
【００６９】 ＡＢＣ１は望ましくはリン酸化を経由してプロテインキナーゼにより活性化さ
れ、それはまたコレステロール流出を促進する際にプロテインキナーゼＣの基本
的役割のための一つの説明を提供する（ドロブニク他、Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅ
ｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｖａｓｃ．Ｂｉｏｌ．１５巻、１３６９−１３７７ページ、
１９９５年）。小胞体とゴルジの間の通行を阻害するブレフェルジンは多分ＡＢ
Ｃ１生物活性の阻害を通じて基本的にＡＢＣ１内の突然変異の作用を再産生して
著しくコレステロール流出を阻害する。この発見は未成熟のアテローム硬化に導
くメカニズムの理解にとって重要である。ＴＤホモ結合体は３８年にわたる冠状
動脈症の徴候を持つＴＤ−Ｉ（III−０１）の発端者に見られるように未成熟冠
状動脈症を成長させる。ＴＤ患者が著しく減少したＨＤＬを提示するのに加えて
、更に低ＬＤＬコレステロールを有し、しかもまだこれにも拘らずアテローム硬
化を成長させるので注目するに値する。これはアテローム発生の重要なメカニズ
ムとしてＨＤＬ細胞内輸送の重要性を際立たせる。ＴＤのヘテロ結合体が更に未
成熟の血管病のリスクを増加させる著しい証拠も存在する（シェーファー他、Ａ
ｎｎ．Ｉｎｔ．Ｍｅｄ．９３巻、２６１−２６６ページ、１９８０年；セルファ
ティ−ラクロスニエール他，アテローム硬化，１０７巻８５−９８ページ，１９
９４年）。更にＦＨＡを持つ何人かの発端者に未成熟アテローム硬化の予備証拠
が存在する（図３Ｂ）。例えばＦＨＡ−２（III−０１）の発端者は４６歳で冠
状動脈バイパス移植を受け、一方ＦＨＡ−３（図２Ｃ）の発端者は約５０歳の頃
ＣＡＤの証拠を示した。ＴＤ−１発端者はＴＤ−２発端者よりもより厳しい流出
欠損を有していた（図１Ｃ）。興味深いことに、ＴＤ−２発端者は彼が関係のな
い原因で６２歳で死亡した時にＣＡＤの何らの徴候も示さず、（突然変異の性質
により部分的に仲介された）コレステロール流出の度合とアテローム硬化の尤度
との間の関係のための予備証拠を提供した。
【００７０】 ＡＢＣ１遺伝子はコレステロール輸送、とりわけ単球と線維芽細胞での細胞内
コレステロール輸送に重大な役割を果す。それはまた神経系、胃腸管、角膜など
の他の組織で重要な役割を果す。完全に欠損のある細胞内コレステロール輸送は
末梢神経障害、角膜混濁、およびコレステロールエステルの直腸粘膜への付着を
来たす。
【００７１】 ＨＤＬ欠損は事実上異質性のものである。ＴＤとＦＨＡの遺伝的基礎について
の概要説明は細胞内コレステロールと輸送でのこの特殊な経路、およびアテロー
ム硬化の病因におけるその役割の重要性を引き起こす。ＴＤとＦＨＡの分子的基
礎の解明は細胞からのコレステロール流出の貧弱に定義された経路での主要なス
テップを定義し、総集団でのＨＤＬ欠損を持つ患者の処置に対する新しいアプロ
ーチに導くことができた。
【００７２】 ＨＤＬは数多くの他の生物学的プロセスで意味を持ってきた。それは必ずしも
それに限定されないが、リポタンパク質酸化の予防、内毒素の吸収、ブルースト
リパノソーマ感染からの保護、内皮細胞の調節、血小板の凝縮を含む（ジェネス
ト他、Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｍｅｄ．４７巻、３１−４２ページ、１９９９年、こ
こで引用例として組み込まれる。ＨＤＬ水準を調節するいずれかの化合物は前記
プロセスの一つまたはそれ以上を調節するのに有用である。ＡＢＣ１がＨＤＬを
調節するように機能するという本発見は初めてＡＢＣ１を前記プロセスに結合さ
せる。
【００７３】 以下の実施例は本発明を説明するものである。それは本発明を何らかの方法で
限定することを意味するものではない。
【００７４】
【発明を実施するための最良の形態】
ＴＤ家族の分析 コレステロール流出の研究 発端者の両者は、ＴＤ患者でこれまでに示されたものと類似のコレステロール
流出の著しい欠損を持っていた（図１Ｃ）。ＴＤ−１はオランダ人の家系であり
、一方ＴＤ−２はイギリス人の家系である。
【００７５】 物理的地図の連鎖分析と立証 多重ＤＮＡ標識はＴＤへの連鎖が記載された９ｑ３１の領域で遺伝子型にされ
た（ライト他、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．２０巻、９６−９８ページ（１９９８年）
。２点連鎖分析は１０ｃＭまでの間隔ですべての標識に対する連鎖の重要な証拠
でＤ９Ｓ１８３２で６．４９のＬＯＤ得点で最大のピークを与えた（表１）。も
っとも近接標識Ｄ９Ｓ１６９０での組換えはＴＤ−１家族のＩＩ−０９で見られ
（図３ＤのＡ*）、疾病遺伝子に対するセントロメア（動原体）境界を提供した
。これらデータの多重点連鎖分析は疾病形質遺伝子座の位置決めの精度を高めな
かった。
【００７６】
【表１】
【００７７】 この領域で約１０ｃＭに拡がる物理的地図はＹＡＣコーティングの成長で立証
された（図３Ａ）。加えて、この特殊な領域で拡がる２２個の他の多型性多対立
遺伝子標識はｃｏｔｉｇに地図化され（図３Ｂ）、これらのサブセットは更なる
分析のためにハプロタイプ（アロタイプ）の構築に使用された（図１Ａと図１Ｂ
：表２）。
【００７８】
【表２】
【００７９】 オランダ家系の家族は何らの血族関係も示さなかったが、ＴＤ−２の発端者は
、近親血族結婚の子孫であった（図１Ｂ）。我々は従ってこの発端者が突然変異
のホモ接合体であり、一方オランダ家族の発端者は複雑なヘテロ接合体であるら
しいと仮定した。オランダ発端者は完全に異なったハプロタイプを持つ突然変異
を示し、この仮説を支持した（図３Ｃ）。
【００８０】 ＴＤ−２発端者はＤ９Ｓ１２７に遠位で、試験されたすべての標識にホモ接合
性であった（図１Ｂ）が、Ｄ９Ｓ１２７とそれにセントロメアであるＤＮＡ標識
でヘテロ接合性であった（図３Ｃ）。これはＴＤに対する遺伝子がＤ９Ｓ１２７
にテロメア性であるゲノム領域に位置を占めたようであり、またホモ接合性を示
す標識で取り込まれたことを示唆していた（図１Ｂ）。
【００８１】 突然変異の検出 ＴＤを持つ患者における細胞内コレステロール輸送の欠陥に基づいて、我々は
このプロセスで役割を果すことに関連するこの領域での遺伝子のＥＳＴデータベ
ースを調査した。我々が候補として調査した一つの遺伝子はＤ９Ｓ１８０１近く
で地図化されたリゾホスファチド酸（ＬＰＡ）レセプター（ＥＤＧ２）であった
（図３Ｃ）。このレセプターはＬＰＡと結合しホスホリパーゼＣ（ＰＬＣ）を刺
激し、線維芽細胞内で発現される。正常ＨＤＬ３仲介コレステロールに流出して
必要なＰＬＣの協調調節がＴＤで悪化することがこれまでに示されてきた（ウォ
ルター他、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９８巻：２３１５−２３２３ページ、
１９９６年）。従ってこの遺伝子はＴＤ遺伝子に対する優れた候補を示した。こ
の遺伝子をノーザンブロットとＲＴ−ＰＣＲと配列分析を用いる詳細な評価は、
ＴＤの原因としてこの遺伝子を除外するすべての尤度において、この家族で変異
体表現型での分離に何らの変化も示さなかった。しかし多型性はＲＴ−ＰＣＲ産
物で検出され、両対立遺伝子からの転写物の発現を示した。
【００８２】 第２候補遺伝子（ＲＧＳ３）は同じくコレステロール流出に影響することに含
まれ得るＧタンパク質信号を調節する家族のメンバーをコード化する（メンデス
他、Ｔｒａｎｓ．Ａｓｓｏｃ．Ａｍｅｒ．Ｐｈｙｓ．１０４巻：４８−５３ペー
ジ、１９９１年）。この遺伝子はＬＰＡレセプターにテロメア化される０．７Ｃ
Ｍに地図化されたが（図３Ｃ）、線維芽細胞で発現される。それはそのゲノム組
織が公開されたので、エキソン特異的増幅により評価された（チャッタージー他
、ゲノミクス、４５巻：４２９−４３３ページ、１９９７年）。著しい配列変化
は検出されなかった。
【００８３】 ＡＢＣ１輸送体遺伝子はこれまで９ｑ３１に位置付けられたが、その正確な物
理的位置は決定されなかった（ルチアーニ他 ゲノミクス、２１：１５０−１５
９、１９９４）。ＡＢＣ１遺伝子はアミの酸、ペプチド、ビタミン、ステロイド
ホルモンを含む異なった基質の膜輸送を伴う高度保存タンパク質の上科を表すＡ
ＴＰ結合カセット輸送体のメンバーである（ルチアーニ他、ゲノミクス、２１：
１５０−１５９，１９９４。ディーン他、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎ．Ｄｅｖ
．５：７７９−７８５、１９９５）。この遺伝子の３’ＵＴＲに対するプライマ
ーはそれがＴＤに対する強力な候補であるためにそれと適合するＤ９Ｓ３０６に
拡がるＹＡＣに位置付けられた（８８７−Ｂ２と９３０−Ｄ３）。我々は標識Ｄ
９Ｓ３０６の周りに約８００キロベースに拡がるＢＡＣの大型ゲノム配列化を開
始した（ＢＡＣｓ ２６９、２７４、２７９，２９１）（図３Ｅ）。ＡＢＣ１遺
伝子は４９個のエキソンと少なくとも７５キロベースのゲノム配列を含むことを
明らかにした。コレステロール輸送体としてのこの科の遺伝子の潜在機能線維芽
細胞でのその発現及びＴＤに横たわる最小ゲノムセグメントの局在化を考慮して
、我々はＡＢＣ１を候補として正式に認定した。
【００８４】 患者と対照の全繊維芽細胞はノーザンブロット分析とＲＴ−ＰＣＲと配列分析
で使用された。ＴＤ−１のＲＴ−ＰＣＲと配列分析はＴＤ−１発端者でのヘテロ
接合体ＴからＣへの置換を明らかにし（図４Ａ）、それはマウスとヒトの間の保
存残基でアルギニンのシステインへの置換を生じるであろう（図４Ｂ）。ＡＢＣ
１遺伝子のエキソン３０の配列化により確認されたこの突然変異はこの科の一側
面での表現型で完全な分離を示した（図４Ｃ）。この置換はＨｇａＩ部位を創り
、増幅ゲノムＤＮＡのＲＦＬＰ分析と突然変異の確認を可能にした（図４Ｃ）。
エキソン３０での点突然変異はオランダ家系の影響を受けないヒトからの２００
個の正常染色体および西ヨーロッパ家系の２５０個の染色体で見られず、それが
多型性であることは疑わしいことを示している。遺伝子のエキソン１乃至４９を
包含するｃＤＮＡを用いた繊維芽細胞ＲＮＡのノーザンブロット分析は、正常サ
イズから８キロベースの転写物を、対照ＲＮＡとＨＤＬ欠陥の他の患者からのＲ
ＮＡでは見えない切形変異体転写物を明らかにした。更にｃＤＮＡの離散領域を
含むクローンを用いるノーザンブロット分析は、変異転写物がエキソン１乃至４
９（ａ）、１乃至４１（ｂ）、１乃至２２（ｃ）を含むｃＤＮＡでは検出され、
エキソン２３乃至２９（ｄ）に拡がるプローブではずっと不鮮明であり、またエ
キソン３０乃至４２（ｅ）を含むプローブでは見られず、エキソン３０乃至４９
（ｆ）に拡がるｃＤＮＡ断片では見られなかった。これは対照ＲＮＡ、ＨＤＬ欠
陥の他の患者および他のＴＤ発端者からのＲＮＡの多数のフィルターで繰返され
、ＴＤ−１でのみ切形転写物が観察された。コーディング領域の配列はこの発見
を説明できる配列での変更を明らかにしなかった。更にサザンブロットによるＤ
ＮＡ分析は必要な再調整を何も示さなかった。ゲノムＤＮＡでのエキソン配列化
の完成はこの突然変異がイントロン２４の位置（−１）でのＧからＣへのトラン
スバージョンであることを示し（図１１）、スプライスドナー部位に影響を与え
異常スプライシングを生じさせることを示した。
【００８５】 ＴＤ−２の発端者からのＡＢＣ１遺伝子をコード化する繊維芽細胞ＲＮＡのＲ
Ｔ−ＰＣＲ（図１Ｂ）はエキソンＢの配列識別番号２のヌクレオチド１８６４で
ＡからＧへのホモ接合性ヌクレオチドの変化を明らかにし（図５Ａ）、マウスと
シーエレガンス（土壌線虫）相同体に保存される残基で最初に予想されたＡＢＣ
１の膜貫通領域（図８）に丁度近位で起こる配列識別番号１の残基５９７でアル
ギニンのグルタミンへの置換となった。この突然変異はエキソン１３内の第２Ａ
ｃｉＩ部位を創造する。この科での突然変異の分離分析は予想されたように突然
変異と低ＨＤＬ表現型の間の完全な一致を明らかにした（図５Ｃ）。ＴＤ−２の
発端者はこの血族家族に突然変異を起こす我らの期待する疾病と一致してこの突
然変異にホモ接合性である。
【００８６】 ＦＨＡ家族の分析 ＦＨＡの遺伝子を含む最小ゲノム領域の連鎖結合と改良 フランス系カナダ人の４系統からの個別家族のマイクロサテライト類別化から
のデータが分析された（図２）。０．０の組換え分画での９.６７の最高ＬＯＤ
得点が染色体９ｑ３１のＤ９Ｓ２７７で検出された（図３、表３）。その後２２
個の標識がこれらの家族でこの遺伝子座の周り１０ｃｍに広がる領域で類別され
た（図２、図３）。これら標識の頻度はフランス系血統の無関係で影響を受けな
い被験者のサンプルから検定された（表２）。
【００８７】
【表３】
【００８８】 ＴＤとＦＨＡはかくしてこれまでの所別の臨床および生化学特性を持つ別個で
あると見倣されてきた。たとえこれらの疾患に対する遺伝子が同じ領域に位置す
るとしても、ＦＨＡとＴＤが同一遺伝子での突然変異によるもの、あるいは代替
的に、類似の領域の遺伝子によるものであるかどうかは不確定であった。ＦＨＡ
の遺伝子を含む領域の改良はハプロタイプ共有の検証と重要な組換え事象の同定
により可能であった（図２）。７個の別個の減数分裂組換え事象がこれらの家族
に見られ（図２と図３の「Ａ」から「Ｇ」）潜在的な疾病遺伝子を含む最小ゲノ
ム領域が標識Ｄ９Ｓ１６９０とＤ９Ｓ１８６６により拡がる約４.４ｃＭゲノム
ＤＮＡの領域であることを明示した（図２と図３）。この領域は標識Ｄ９Ｓ２７
７とＤ９Ｓ３０６を持つ最大ＬＯＤ得点を明らかにしＤ９Ｓ１６９０にセントロ
メアでありＤ９Ｓ１８６６にテロメアである領域を基本的に排除する２点の連鎖
分析の結果と一致する。第８減数分裂組換え事象（図３の「Ｈ」）は更にＦＨＡ
領域をＤ９Ｓ２７７に遠位に改良した。
【００８９】 ここに記載されたように、ＡＢＣ１遺伝子はこの間隔内に位置を占めた。オー
バーラップ遺伝子データはＦＨＡとＴＤからの一連の遺伝子データの利用はＴＤ
−２のホモ接合性データに基づきＤ９Ｓ１８６６（減数分裂組換え）（図３Ｄ）
でのテロメア限界とＤ９Ｓ１２７でのセントロメア標識を提供した。これはＤ９
Ｓ１２７とＤ９Ｓ１８６６の間で遺伝子座を約１Ｍｂに改良した。ＡＢＣ１遺伝
子はこの最小領域内に位置を占めた（図３Ｅ）。
【００９０】 ＦＨＡでの突然変異検出 ＡＢＣ１遺伝子の突然変異評価がＦＨＡ１で行われた（図２Ａ）。ｍＲＮＡの
オーバーラップセグメントを拡げたプライマーを用いて我々はＲＴ−ＰＣＲ分析
を行いこれらの断片に突然変異分析を与えた。３個のヌクレオチドの欠失がＦＨ
Ａ−１ ＩＩＩ．０１のＲＴ−ＰＣＲ配列で明らかであり（図６Ａ）、配列識別
番号２のヌクレオチド２１５１−２１５３の欠損と配列識別番号１のアミノ酸６
９３の位置でロイシン（ΔＬ６９３）の欠損を生成する（図６Ａ）。このロイシ
ンはマウスとシーエレガンスで保存される（図６Ｂ）。変化はＲＴ−ＰＣＲ産物
と、同じくエキソン１４特異的増幅からのゲノム配列で検出された。この突然変
異はＥａｒＩ制限部位の欠損を来たす。家族からのゲノムＤＮＡの分析は突然変
異がＨＤＬ欠失の表現型と完全に分離したことを示した。ＥａｒＩ部位の欠損は
この突然変異にヘテロ接合性の人に残るより大きな断片を生成する（図６Ｃ）。
この突然変異はＡＢＣ１の第１推定貫通膜領域に位置を占め（図８）、フランス
系カナダ人家系の人の１３０染色体にも、また他のヨーロッパ血統の人の４００
染色体以上にも見られなかった。
【００９１】 突然変異は更にケベックからの系統ＦＨＡ−３の患者ゲノムＤＮＡで発見され
た。エキソン４１内の配列識別番号２のヌクレオチド５７５２−５７５７の６塩
基対欠失は配列識別番号１のアミノ酸１８９３（Ｇｌｕ）と１８９４（Ａｓｐ）
の欠失をもたらす。欠失は欠失点から出発する二重に重畳された配列として検出
され（図６Ｄ）、双方向での配列読み取りで検出された。検出は３％アガロース
または１０％ポリアクリルアミドゲルで検出でき、ＦＨＡ−３の疾病と共に分離
する。それはフランス系カナダ人の１２８染色体または他の４３４対照染色体で
は見られなかった。アミノ酸１８９３と１８９４はヒト、マウス、シーエレガン
スの間で保存され（図６Ｅ）、それが機能的に重要であることを意味している。
【００９２】 追加の突然変異はケベックからの系統ＦＨＡ-２の患者ゲノムＤＮＡで発見さ
れた（図６Ｆ）。配列識別番号２の位置６５０４でのＣからＴへの移行という変
化は配列識別番号１の位置２１４４でアルギニンをＳＴＯＰコドンへ転換し、Ａ
ＢＣ１タンパク質の最後の１１８アミノ酸の切形を起こす。この変化は家族ＦＨ
Ａ−２の疾病を分離する。
【００９３】 ＡＢＣ１で発見されるすべての突然変異と多型性は図１１で示される。各変異
体はその家族で低ＨＤＬを持つ突然変異分離体として示され、それは数百個の対
照染色体では見られなかった。
【００９４】 ＡＢＣ１転写物水準とコレステロール流出の変化の間の機能関係 ＡＢＣ１転写物を減少させ細胞内コレステロール輸送での転写物の変更の作用
を評価するためにアンチセンスアプローチが行われた。ＡＢＣ１の５’末端への
アンチセンスプライマーの使用は正常ＲＮＡ水準の約５０％の減少を来たした（
図７Ａ）。これはＴＤとＦＨＡを持つ患者のヘテロ接合体で見られるものに類似
した対立遺伝子での突然変異による機能の低下に部位的にまねるものと期待され
る。重要なことは、ＡＢＣ１遺伝子へのｍＲＮＡの減少が細胞コレステロール流
出の著しい減少を起こし（図７Ｂ）、更に逆コレステロール輸送でのこのタンパ
ク質の役割を確立し、検出された突然変異が機能突然変異の損失を構成するもの
になるだろうという証拠も提供したことであった。更にこれらのデータはタンパ
ク質の最初の６０アミノ酸の機能的重要性を支持する。アンチセンスオリゴヌク
レオチドＤＮＡ−６は新規な出発コドン５'をＡＪ０１２３７６．１に示された
ものに向け、このアンチセンスオリゴヌクレオチドは効果的に流出を抑制する。
【００９５】 前記の結果は下記の材料と方法を用いて得られた。
【００９６】 患者の選択 ＴＤ家族の発端者はこれまで臨床および生化学データに基づきＴＤを患ってい
ると診断されてきた。ＦＨＡを持つ研究被験者はザ・クリニカル・リサーチ・イ
ンスティチュート・オブ・モントリオールの心臓病クリニックから選ばれた。生
存基準は、年齢と性別で第５百分位数以上のＨＤＬ−Ｃ水準で、発端者と同じ脂
質異常の１親等の親族で第９５百分位数以下のトリグリセリドの血漿濃度を持つ
人であった。加えて患者は糖尿病を持たない人であった。
【００９７】 生化学研究 血漿脂質：リポタンパク質コレステロールＡｐｏＡＩ、およびトリグリセリド
分析と、−８０℃での貯蔵のために血漿からＥＤＴＡ含有管に抽出された。白血
球がＤＮＡ抽出のために軟膜から単離された。
【００９８】 リポタンパク質測定は別に記載された新鮮血漿で行われた（ログラー他、Ａｒ
ｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｖａｓｃ．Ｂｉｏｌ．１５：６８３−６
９０、１９９５）。の研究所は脂質研究プログラム標準化プログラムに参加しそ
の基準に合致する。脂質、コレステロールおよびトリグリセリド水準はデキスト
ランマンガンでの沈殿の前後に（準備超遠心で得られた）全血漿とｄ＜１．００
６ｇ／ｍＬの密度での血漿で測定された。アポリポタンパク質測定はＡｐｏＢと
ＡｐｏＡＩに対する比濁法で行われた。
【００９９】 連鎖解析 形質遺伝子座とマイクロサテライト遺伝子座の間の連鎖はＦＡＳＴＬＩＮＫバ
ージョン（４．０Ｐ）を用いて解析された。ＦＡＳＴＬＩＮＫ／ＭＬＩＮＫは完
全な滲透度で常染色体優性形質を仮定する２点連鎖解析に使用された。ＦＨＡと
ＴＤヘテロ接合体で、表現型は年齢と性別で第５百分位数以下のＨＤＬ欠損であ
った。疾病対立遺伝子頻度は０．００５であると推定された。標識対立遺伝子頻
度はＮＥＷＰＲＥＰを用いて系統の創始者の遺伝子型から推定された。多点連鎖
解析はＦＡＳＴＬＩＮＫ／ＬＩＮＫＭＡＰを用いて行われた。
【０１００】 ゲノムクローンアセンブリと９ｑ３１領域の物理的地図構築 ホワイトヘッド・インスティチュート／ＭＩＴセンター・フォー・ゲノム・リ
サーチ地図を参考に使用して、９ｑ３１で対象となる遺伝標識がＹＡＣコンティ
ーグ内で同定された。公共データベースと文献からの約９ｑ３１間隔に位置付け
られた追加標識は次いでＰＣＲとハイブリッド形成分析でＹＡＣクローに対して
検定された。標識のオーダーは固定ＹＡＣコンティーグに後ではＢＡＣコンティ
ーグにそれらに存在または不在に準拠した。ハプロタイプ分析に基づき、Ｄ９Ｓ
２２７とＤ９Ｓ３０６の間の領域は細菌人工細胞（ＢＡＣｓ）を用いる高次転換
物理的地図化研究のための標的とされた。対象となる領域内でのＢＡＣｓはＤＮ
Ａ標識プローブと、ＲＰＣＩ−１１ヒトＢＡＣライブラリーからのクローンを含
む高密度フィルターに対しての全ＹＡＣのハイブリッド形成により単離された（
図３）。
【０１０１】 配列検索とアラインメント ヒトＡＢＣ１ｍＲＮＡ配列はジェンバンク・アクセス番号ＡＪ０１２３７６．
１でＥｎｔｒｅｚヌクレオチド照会を使ってジェンバンクから検索された（バク
セバニス他、遺伝子とタンパク質の分析のための実務ガイド、Ａ．Ｄ．バクセバ
ニス、Ｂ．Ｆ．Ｆ．ケレット編、９８：１２０、１９９８）。我々が野生型（正
常）として使用したタンパク質配列のバージョンはＣＡＡ１０００５．１であっ
た。
【０１０２】 我々はこれまで信じられてきた出発メチオニンの枠内で追加の６０個のアミノ
酸を同定した（図９Ａ）。追加アミノ酸の生物情報分析は短い広がりの基本アミ
ノ酸残基、次いで疎水性広がり、更にいくつかの極性残基の存在を示す。これは
リーダー配列、またはも一つのＡＢＣ１タンパク質の膜貫通あるいは膜関連領域
を表す。前記の可能性の中に分化するために、アミノ酸１−６０の領域に向けら
れた抗体は細胞膜と関連するアミノ酸１−６０の物理的関係を決定するために持
ち上げられ使用される。例えば融合タンパク質の発現および細胞分裂などの他の
標準方法を使用することもできる。
【０１０３】 我々はまたこれまでに報告されたヌクレオチド配列の（図１１：配列識別番号
２の位置８３９、４７３８、５０１７、５９９５、６５５７および６８９９で）
６個の誤りを確認した。従って図９ＡのＡＢＣ１ポリペプチドの配列は以下の通
りＣＡＡ１０００５．１と異なる：位置１５５４でＴｈｒ⇒Ｉｌｅ；位置１６４
２でＰｒｏ⇒Ｌｅｕ；位置１９７３でＡｒｇ⇒Ｌｙｓ；また位置２１６７でＰｒ
ｏ⇒Ｌｅｕ．我々はまた５’と３’ＵＴＲ配列を確認した（図９Ｂ−９Ｅ）。
【０１０４】 使用されたマウスＡＢＣ１配列はアクセス番号Ｘ７５９２６を持つ。このマウ
ス配列はヒトＡＢＣ１でここに記載された追加の６０個のアミノ酸を欠いている
ために十分不完全であるように見える。
【０１０５】 クラスタルＷのバージョン１．７はデフォールトパラメーターでグラフ上で高
めるためにＢＯＸＳＨＡＤＥで多重配列アラインメントのために使用された（ｈ
ｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｓｒｅｃ．ｉｓｂ−ｓｉｂ．ｃｈ：８０８０／ｓｏｆｔ
ｗａｒｅ／ＢＯＸ．ｆｒｏｍ．ｈｔｍｌ）。シーエレガンスＡＢＣ１オルソロー
グはシーエレガンス用の生体フィルターを使うことを除いてデフォールトパラメ
ーターで照会としてＣＡＡ１００５．１（前記参照）を用いるＢＬＡＳＴ（バー
ジョン２．０８）で確認された。選択されたタンパク質配列は３７５の得点と１
０３のＥ値を持つＡＣＣ６９２２３．１であった。
【０１０６】 ゲノムＤＮＡ配列化 ＢＡＣ ＤＮＡはニュークレオ・ボンド・プラスミド・マキシ・キット（カリ
フォルニア、パロアルト、クロンテック）を用いて細菌培養から抽出された。Ｄ
ＮＡ配列化のために、サブライブラリーがまず各ＢＡＣ ＤＮＡｓから構築され
た（ローウェン他、自動ＤＮＡ配列化と分析、Ｍ．Ｄ．アダムス、Ｃ．フィール
ズ、Ｊ．Ｃ．ベンターズ編、１９９４）。要約すると、ＢＡＣ ＤＮＡは単離さ
れ噴霧化で無作為の刈り取られた。刈り取られたＤＮＡは次いでアガロースゲル
電気泳動でサイズ分画され、２キロベース以上の断片は収集され、マングマメ・
ヌクレアーゼで処置され、次いで平滑末端を確保するためＴ４ＤＮＡポリメラー
ゼとクレハウ酵素で処置されＳｍａＩ切断Ｍ１３ｍｐ１９にクローンされた。ラ
ンダムクローンはＡＢＩ３７３または３７７シークエンサーと蛍光標識プライマ
ーで配列された（カリフォルニア、フォスターシティ、アプライド・バイオシス
テムズ）。ＤＮＡＳｔａｒソフトウェアはゲルトレース分析とコンティーグアセ
ンブリのために使用された。すべてのＤＮＡ配列はＢＬＡＳＴｎをリピート・マ
スカー（ユニバーシティ・オブ・ワシントン）を主として使って利用できる公開
データベースに対して検証された。
【０１０７】 逆転写（ＲＴ）−ＰＣＲ増幅と配列分析 全ＲＮＡはＴＤとＦＨＡ患者の培養繊維芽細胞から単離され、ザン他、Ｊ．Ｂ
ｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７：１７７６−１７８３、１９９６に）記載されたように
スーパースクリプトＩＩ逆転写酵素（メリーランド、ロックビル、ライフ・テク
ノロジーズ、インコーポレイテッド）２５０単位を用いてオリゴｄ（Ｔ）１８を
含むＣＤＳプライマーで逆転写された。ｃＤＮＡは公開されたヒトＡＢＣ１ ｃ
ＤＮＡ配列（ルチアーニ他、ジェノミクス、２１：１５０−１５９、１９４４）
から誘導されるプライマーを用いてＴａｑＤＮＡポリメラーゼで増幅された。６
セットのプライマーに対して各ｃＤＮＡを増幅するように設計され６個のＤＮＡ
断片を検出し、それは全長ヒトＡＢＣ１ ｃＤＮＡの１３５乃至７０１４塩基対
にわたりオーバーラップされた。ヌクレオチドは公開ヒトｃＤＮＡ配列（ＡＪ０
１２３７６．１）のオーダーに基づき以下の番号を付される。プライマー対（１
）：１３５−１５８（ｆ）および１１８３−１１９９（ｒ）；（２）：１１８０
−１１０７（ｆ）および２２４７−２２７３（ｒ）；（３）：２１７１−２１９
７（ｆ）および３３７６−３４０４（ｒ）；（４）：３３２３−３３５３（ｆ）
および４５８７−４６１７（ｒ）；（５）４５１５−４５３９（ｆ）および５７
８２−５８１１（ｒ）；（６）５７４２−５７６９（ｆ）および６９８５−７０
１４（ｒ）。Ｒｔ−ＰＣＲ産物はキアーゲン回転カラムで精製された。配列化は
製造業者のプロトコルに従ってＴａｑジデオキシ・ターミネーター・サイクル配
列化とビッグダイキットを用いてモデル３７３Ａ自動ＤＮＡシークエンサー（ア
プライド・バイオシステム）で実行された。
【０１０８】 ノーザンブロット分析 ノーザン伝達とハイブリッド形成は基本的に記載された通りに行われた（ザン
他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７：１１７６−１７８３、１９９６）。要約す
ると、全繊維芽細胞ＲＮＡサンプル２０μｇがホルムアルデヒド７％の存在下で
変性アガロース（１．２％、重量／容積）ゲル内電気泳動で溶解され、ナイロン
膜に移された。フィルターは指示通り３２ｐ標識ヒトＡＢＣ１ ｃＤＮＡでプロ
ーブされた。予備ハイブリッド形成とハイブリッド形成が製造業者のプロトコル
に従って６８℃でエクスプレスヒブ溶液（クロンテク）で行われた。
【０１０９】 ＴＤでの突然変異検出 Ｔ４５０３ＣとＡ１８６４Ｇ変異体の遺伝子類別化がエキソン３０のＰＣＲ増
幅により、次いでＨｇａＩの制限消化とエキソン１３の増幅、更にＡｃｉＩでの
消化によりそれぞれ行われた。ＰＣＲは全量で５０μＬのＭｇＣｌ2，１．５ｍ
Ｍ、各ｄＮＴＰ、１８７．５ｎＭ、Ｔａｑポリメラーゼ２．５Ｕおよび各プライ
マー１５ｐｍｏｌで行われた（各プライマーは以下の通りである。エキソン３０
内の前進プライマー：5' CTG CCA GGC AGG GGA GGA AGA GTG-3'（配列識別番号
４）；エキソン３０とイントロン３０の接合部に拡がる逆プライマー：5'-GAA A
GT GAC TCA CTT GTG GAG GA-3'（配列識別番号５）；イントロン１２内の前進プ
ライマー：5'-AAA GGG GCT TGG TAA GGG TA-3'（配列識別番号６）；イントロン
１３内の逆（プライマー）：5'-CAT GCA CAT GCA CAC ACA TA-3'（配列識別番号
７））の３分、９５℃の最初の変性に続き、９５℃、１０秒、５８℃、３０秒、
7２℃、３０秒より成る３５サイクルが行われ、１０分、７２℃で最終延長され
た。Ｔ４５０３Ｃ突然変異の検出のために、エキソン３０ＰＣＲ産物１５μＬが
ＨｇａＩ、４Ｕと共に全量２５μＬで２時間３７℃で保温され、生成断片はアガ
ロースゲル１．５％で単離された。Ｔ４５０３Ｃ突然変異の存在はＨｇａＩに制
限部位を創り出し、かくして１９４塩基対ＰＣＲ産物はＴ４５０３Ｃ変異体の存
在下で１３４と６０塩基対の断片に切断されるが、Ｔ４５０３Ｃの不在下ではそ
うはならない。Ａ１８６４Ｇ突然変異の検出のために、エキソン１３ＰＣＲ産物
１５μＬは３時間３7℃でＡｃｉＩ、８Ｕで消化された。産物はアガロースゲル
２％で単離された。Ａ１８６４Ｇ突然変異の存在はＰＣＲ産物内で第２ＡｃｉＩ
部位を創り出す。かくして３６０塩基対ＰＣＲ産物は野生型対立遺伝子上で２１
５塩基対と１４５塩基対に分割されるが、１８５塩基対、１４５塩基対と３０塩
基対は変異体対立遺伝子上にある。
【０１１０】 ＦＨＡでの突然変異検出 Δ６９３変異体の遺伝子類別化がエキソン１４のＰＣＲ増幅により、ついでＥ
ａｒＩでの制限酵素消化で実施された。ＰＣＲは全量で８０μＬのＭｇＣｌ2、
１．５ｍＭ、各ｄＮＴＰ１８７．５ｎＭ、Ｔａｑポリメラーゼ２．５Ｕおよび各
プライマー２０ｐｍｏｌで行われた（各プライマーは以下の通りである。エキソ
ン１４内の前進プライマー：5'-CTT TCT GCG GGT GAT GAG CCG GTC AAT-3'（配
列識別番号８）；イントロン１４内の逆プライマー：5'-CCT TAG CCC GTG TTG A
GC TA-3'（配列識別番号９））。３分９５℃の最初の変性に続き、９５℃、１０
秒、５５℃、３５秒、７２℃、３０秒より成る３５サイクルが行われ、１０分7
２℃で最終延長された。ＰＣＲ産物２０マイクロリットルがＥａｒＩ、４Ｕと共
に全量２５μＬで２時間３７℃で保温され、断片はアガロースゲル２％で単離さ
れた。Δ６９３突然変異の存在はＥａｒＩの制限部位を破壊し、かくして２９７
塩基対ＰＣＲ産物は野生型対立遺伝子の存在下で１５１塩基対、５９塩基対、４
８塩基対および３９塩基対の断片に切断されるが、欠失の存在下では２１０塩基
対、４８塩基対、３９塩基対の断片のみである。
【０１１１】 ヌクレオチド５７５２−５７５７（包括）を含む６塩基対欠失はこのエキソン
に隣接するイントロン１０に位置するプライマーを使ってゲノム配列化によりＦ
ＨＡ−３家族の発端者のエキソン４１で検出された。ＦＨＡ−３家族でのこの突
然変異の遺伝子型決定はそれぞれエキソン４１の５'および３'末端に位置する前
進プライマー(5'-CCT GTA AAT GCA AAG CTA TCT CCT CT-3'（配列識別番号１０
）と逆プライマー(5'-CGT CAA CTC CTT GAT TTC TAA GAT GT（配列識別番号１１
）)でＰＣＲにより行われた。各ＰＣＲは６９３変異体の遺伝子型決定について
行われたが、アニーリング温度は５８℃であった。ＰＣＲ産物２０マイクロリッ
トルがアガロース３％またはアクリルアミドゲル１０％に溶解された。野生型対
立遺伝子は臭化エチジウムでの染色により１１７塩基対帯でまた突然変異体対立
遺伝子は１１１塩基対帯で検出された。
【０１１２】 ＡＣからＴへの移行はＦＨＡ−２家族の発端者のゲノムＤＮＡのヌクレオチド
６５０４で検出された。それは変化に対してヘテロ接合性であるこの個体のエキ
ソン４８のゲノム配列で二重ＣとＴのピークとして検出された。ＡＢＣ１タンパ
ク質の最後の１１８アミノ酸の切形に帰着するＳＴＯＰコドンを創り出すこの突
然変異は、同じく野生型配列に存在するＲｓａＩ制限部位を破壊する。ＦＨＡ−
２家族のこの突然変異と対照の遺伝子型決定はエキソン４８に隣接するイントロ
ン風配列に向けられる前進プライマー(5'-GGG TTC CCA GGG TTC AGT AT-3')（配
列識別番号１２）と逆プライマー(5'-GAT CAG GAA TTC AAG CAC CAA-3')（配列
識別番号１３）でＰＣＲにより行われた。ＰＣＲは６９３変異体と同じように行
われた。ＰＣＲ産物の１５ミリリットルがＲｓａＩ５ユニットで３７℃、２時間
消化され、消化産物はアガロースゲル１.５％に溶解された。変異体対立遺伝子
は未切断４３６塩基対帯として検出される。正常配列は３３２および１０４塩基
対帯を産出するためにＲｓａＩで切断される。
【０１１３】 細胞培養 皮膚繊維芽細胞培養が文献記載の通りＦＨＤ患者と健康な対象被験者の前腕の
３．０ｍｍパンチ生検から確立された（マーシル他、Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ
．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｖａｓｃ．Ｂｉｏｌ．１９：１５９−１６９、１９９９）。
【０１１４】 細胞コレステロール標識と装荷 細胞コレステロール流出実験のプロトコルに別途詳細に記載された（マーシル
他、Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｖａｓｃ．Ｂｉｏｌ．１９：１
５９−１６９、１９９９）。細胞は成長の間に3Ｈ−コレステロール標識され、
遊離コレステロールは成長停止の際に装荷された。
【０１１５】 コレステロール流出研究 流出研究は精製ＡｐｏＡＩ（１０μｇタンパク質／ｍＬ培地）の存在下で０乃
至２４時間行われた。流出は細胞が特定の時間期間保温された後の培地内の遊離
コレストロールのパーセントで決定された。全ての実験は１個の対照被験物から
の細胞と試験される研究被験物からの細胞の存在下で３組ずつで行われた。流出
欠損を示すすべての結果は少なくとも３回確認された。
【０１１６】 オリゴヌクレオチド合成 ヒトＡＢＣ１ ｃＤＮＡ配列の各種領域に相補である８個のホスホロチオエー
ト・デオキシオリゴヌクレオチドがＧＩＢＣＯ ＢＲＬから得られた。オリゴヌ
クレオチドはＨＰＬＣで精製された。アンチセンスオリゴヌクレオチドの配列と
その位置は表にされる。他のＡＢＣ１アンチセンサ配列もＡＢＣ１仲介コレステ
ロール調節を減少する能力のために生産し試験できることを当業者は認識するで
あろう。
【０１１７】 名称 配列（５′−３′） mRNA標的 対照％ AN-1 GCAGAGGGCATGGCTTTATTTG(配列識別番号 NO:3) AUGコドン 46 AN-2 GTGTTCCTGCAGAGGGCATG(配列識別番号 NO:30) AUGコドン 50 AN-3 CACTTCCAGTAACAGCTGAC(配列識別番号 NO:31) ５′未翻訳 79 AN-4 CTTTGCGCATGTCCTTCATGC(配列識別番号 NO:32) コーディング 80 AN-5 GACATCAGCCCTCAGCATCTT(配列識別番号 NO:33) コーディング 120 AN-6 CAACAAGCCATGTTCCCTC(配列識別番号 NO:34) コーディング AN-7 CATGTTCCCTCAGCCAGC(配列識別NO:35) コーディング AN-8 CAGAGCTCACAGCAGGGAC(配列識別番号NO:36) コーディング アンチセンスオリゴヌクレオチドでの細胞形質移入 細胞は８０％密集になるまで３５ｍｍ培養血で成長し、次いで１回ＤＭＥＭ培
地（血清と抗生物質無し）で洗浄された。アンチセンスオリゴヌクレオチド５０
０ｎＭとリポフェクチン（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ）５μｇ／ｍｌまたは７．５μｇ
／ｍｌが製造業者のプロトコルに従って各ウェルに加えられた。細胞は３７℃で
４時間保温され、次いで培地はＦＣＳ１０％を含むＤＭＥＭで取り替えた。形質
移入２４時間後に全細胞ＲＮＡは単離された。全ＲＮＡの１０マイクログラムが
アアガロースホルムアルデヒドゲル１％に溶解されたナイロン膜に移された。α
−32Ｐ ｄＣＴＰ標識ヒトＡＢＣ１ ｃＤＮＡで一晩６８℃でハイブリッド形成
された。膜は続いてＸ線フィルムに露出された。ハイブリッド形成帯は当学濃度
測定と標準で２８５リボンソームＲＮＡと走査された。
【０１１８】 抗ＡＢＣ１オリゴヌクレオチドでのコレステロール流出 ヒト皮膚線維芽細胞は６ウェル平板に培養された。細胞はそれが５０％密集に
なった時に２日間ＦＢＳ１０％を持つＤＭＥＭ内で3Ｈコレステロール（０．２
μＣｉ／ｍｌ）で標識された。細胞は次いで製造業者のプロトコルに従って、リ
ポフェクチン（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ）７．５μｇ／ｍｌを持つＤＭＥＭ（血清お
よび抗生物質無し）内で５００ｎＭでアンチセンスＡＢＣ１オリゴヌクレオチド
で形質移入された。形質移入に続き、細胞は非リポタンパク質（２０μｇ／ｍｌ
）１２時間血清無しのＢＳＡ２ｍｇ／ｍｌを含むＤＭＥＭで装荷された。細胞コ
レステロールプールは次いで６時間ＤＭＥＭ−ＢＳＡで平衡にされた。Ａｐｏ
ＡＩ（ＤＭＥＭ−ＢＳＡ内で１０μｇ／ｍｌ）で仲介されたコレステロール流出
は次いで形質移入４８時間後に実施された。
【０１１９】 培地に放出された放射線標識コレステロールはウエル当り全3Ｈコレステロー
ル（培地＋細胞）のパーセンテージで表現された。結果は３組皿の平均値＋／−
標準偏差である。
【０１２０】 ＡＢＣ１遺伝子のゲノム構造の決定 大抵のスプライス部位配列はＡＢＣ１遺伝子に広がるＢＡＣクローンから生成
されたゲノム配列から決定された。１６０キロベース以上のゲノム配列が生成さ
れた。ゲノム配列はイントロン／エキソンの境界を確認するためにｃＤＮＡ配列
でアラインされた。ある場合には、隣接エキソンの間の長距離ＰＣＲがｃＤＮＡ
配列に基づき設計された増幅プライマーを用いてイントロン／エキソン境界を増
幅するために使用された。
【０１２１】 Ｎ末端で新規に発見された６０個のアミノ酸の機能性 アンチセンス実験 ホスホロチオエート・アンチセンス・オリゴヌクレオチドで新規に発見された
翻訳出発部位近くのｃＤＮＡ領域に相補であるように設計された。ＡＮ−６とＡ
Ｎ−７両方はイニシエーター．メチオニンコドンをオーバーラップする。この部
位はオリゴヌクレオチドの中間にある。アンチセンス・オリゴヌクレオチドＡＮ
−１はＡＪ１２３７６のＡＢＣ１イニシエーターメチオニンとして確認される部
位に対応するＡＢＣ１ ｃＤＮＡの領域に相補である。図７Ｃはアンチセンス・
オリゴヌクレオチドＡＮ−６がアンチセンス・オリゴヌクレオチドが行う範囲ま
で正常線維芽細胞で細胞コレステロール流出に干渉することを示す。これらアン
チセンス・オリゴヌクレオチドのいずれかによる形質移入はＦＨＡ細胞で見られ
るのと殆ど同じ位厳しい細胞コレステロール流出を起こす。一般にコーディング
配列に相補であり、とりわけ遺伝子コーディング配列の５′末端近くのアンチセ
ンス・オリゴヌクレオチドはより３′配列にまたは非コーディング配列に向けら
れたオリゴヌクレオチドよりも転写の有効量を減少するのにより有効になるもの
と期待されている。ＡＮ−６がＡＮ−１と同じく有効に細胞コレステロール流出
を押し下げるという観察は、これらのオリゴヌクレオチドの両方がＡＢＣ１コー
ディング配列に相補であり、またアミノ末端６０アミノ酸がＡＢＣ１タンパク質
に含まれているようであることを意味する。これとは逆に、ＡＮ−８に効果がな
いのはイニシエーター・メチオンニンとＡＮ−８の標的領域との間に組立て停止
コドンの存在で予想されたように、それが転写物のタンパク質コーディング領域
の外にあるらしいことを示している。
【０１２２】 抗体実験 ポリクローナル抗体とモノクローナル抗体はＡＢＣ１アミノ酸配列の分離した
部分に対応するペプチドを用いて生成された。これらの内の一つでＮ末端システ
ィンがペプチドの接合を容易にするために加えられた２０アミノ酸ペプチド＃２
(Pep2:CSVRLSYPPYEQHECHFPNKA（配列識別番号３７）は新規に発見されたＡＢＣ
１タンパク質配列に対応する。このペプチドはＫＬＨ担体タンパク質に結合され
、３００μｇが３回の間隔でＢａｌｂ／ｃマウスに４週にわたり注射された。脾
臓が遊離ペプチドに対し最高のエリザ決定免疫応答を持つマウスから収穫され、
細胞は標準モノクローナル抗体生成法によりＮＳ−１骨髄腫細胞に融合された。
正のハイブリドーマはまずエリザにより選択され、次いで更に培養一次ヒト線維
芽細胞を用いてウエスタンブロッティングにより特徴付けられた。高抗体力価を
産生し特異的に２４５キロダルトンヒトＡＢＣ１タンパク質を認識するモノクロ
ーナル細胞系が蓄えられた。同一サイズＡＢＣ１タンパク質産物は同一タンパク
質の４個の別個の領域に向けられる抗体により検出された。２４５キロダルトン
帯は適切な遊離ペプチドでの競合実験で排除することができ、これはそれがＡＢ
Ｃ１タンパク質を表すことを示した（図１３）。
【０１２３】 前記の実験は、ＡＢＣ１タンパク質がこれまでに記載されたＡＢＣ１アミノ酸
配列内でアミノ酸配列に対応する抗体だけでなく、新規に発見されたＮ末端６０
アミノ酸内のエピトープを認識するＰｅｐ２モノクローナル抗体により検出され
ることを示している。Ｎ末端６０アミノ酸領域は従ってコーディングであり、ま
たＡＢＣ１タンパク質の一部分である。
【０１２４】 Ｐｅｐ２モノクローナル抗体で認識されるエピトープは、更にヒト、マウス、
ニワトリの間で保存される。ウエスタンブロットで採用されるこれら３個の種か
ら得る肝臓組織はＰｅｐ２モノクローナル抗体でのプローブされた時に２４５キ
ロダルトンのＡＢＣ１帯を産生した。これは６０アミノ酸Ｎ末端配列がヒト、マ
ウス、およびニワトリのＡＢＣ１コーディング配列の一部であることを示す。こ
の領域での存在は従って進化的に保存され、ＡＢＣ１タンパク質にとって重要な
機能的重要性であるものと考えられる。
【０１２５】 ＡＢＣ１タンパク質配列の生物情報分析 膜貫通予測プログラムは１３個の膜貫通（ＴＭ）領域を示し、その最初のもの
はアミノ酸２６と４２の間にある（ｈｔｔｐ：／／ｐｓｏｒｔ．ｎｉｂｂ．ａｃ
．ｊｐ：８８００／ｐｓｏｒｔ／ｈｅｌｐｗｗｗ２．ｈｔｍｌ＃ｅａｌｏｍ）。
閾値０．５のＴＭ領域の仮の数は１３である（ＩＮＴＥＧＲＡＬ 尤度＝−７．
７５ 膜貫通２６−２４）。他の１２ＴＭは−０．６４と−１２の間の値の範囲
にある（全結果は下記の通り）。従って新規に発見された６０アミノ酸はＴＭ領
域を含み、またＡＢＣ１のアミノ末端がもともと教えられたものよりも膜の反対
側にあるということが大いにある。
【０１２６】 ＡＬＯＭ：ＴＭ領域割り当て 計算用初期位置：１ 閾値のためのＴＭの仮値０５：１３ INTEGRAL 尤度 ＝-7.75 膜貫通 26-42 INTEGRAL 尤度 ＝-3.98 膜貫通 640-656 INTEGRAL 尤度 ＝-8.70 膜貫通 690-706 INTEGRAL 尤度 ＝-9.61 膜貫通 717-733 INTEGRAL 尤度 ＝-1.44 膜貫通 749-765 INTEGRAL 尤度 ＝-0.64 膜貫通 771-787 INTEGRAL 尤度 ＝-1.28 膜貫通 1041-1057 INTEGRAL 尤度 ＝-12.79 膜貫通 1351-1367 INTEGRAL 尤度 ＝-8.60 膜貫通 1661-1677 INTEGRAL 尤度 ＝-6.79 膜貫通 1708-1724 INTEGRAL 尤度 ＝-3.40 膜貫通 1737-1753 INTEGRAL 尤度 ＝-1.49 膜貫通 1775-1791 INTEGRAL 尤度 ＝-8.39 膜貫通 1854-1870 PERIPHERAL 尤度 ＝0.69(1643での) ALOM得点：-12.79(TMSs値：13) ここでは明白な切断ペプチドは現れないので、この最初のアミノ酸残基は切断
されるようには見えず、また従って、それらは特異的にシグナル／標的配列では
ない。他のシグナル（例えば特異的な細胞小器官）も明らかではない。
【０１２７】 作用薬と拮抗薬 有用な治療化合物はＡＢＣ１の発現、活性また安定性を調節するものを含む。
これらの化合物は単離するために、ＡＢＣ１発現、生物活性、または調節された
異化作用はＡＢＣ１発現細胞の培養培地への候補化合物の追加に続いて測定され
る。選択肢として、候補化合物は動物（例えばマウス、ブタ、またはニワトリ）
に直接投与され、そのＡＢＣ１発現に対する作用をスクリーンするために使用さ
れる。
【０１２８】 コレステロールの調節での役割に加えて、ＡＢＣ１は更にＡＢＣ１調節体の開
発が有用である他の生物学的プロセスに関与する。一つの実施例において、ＡＢ
Ｃ１は細胞膜を貫通しまた細胞からインターロイキン１β（ＩＬ−１β）を輸送
する。ＩＬ−１βは炎症性応答の前駆体であり、このようにしてＡＢＣ１発現ま
たは生物活性の阻害薬または拮抗薬は必ずしもそれに限定されないが、慢性関節
リウマチ、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、甲状腺低下または甲状腺機能亢
進症、炎症性腸炎、および真性糖尿病を含むいずれかの炎症性疾患の処置に有用
である。も一つの実施例で、マクロファージに発現されたＡＢＣ１は死滅細胞の
沈降または排除に従事することが示されてきた。マクロファージのこれらのアポ
トーシス細胞体の取り入れる能力はＡＢＣ１の抗体仲介遮断後には弱められる。
従ってＡＢＣ１発現、安定性または生物活性を調節する化合物はこれらの疾患の
処置に有用なものとなるであろう。
【０１２９】 ＡＢＣ１発現は例えばＡＢＣ１核酸配列（またはその断片）をハイブリッド形
成プローブとして使用するノーザンブロット分析で、または抗ＡＢＣ１抗体およ
び標準技術を用いるウエスタンブロットにより測定される。候補分子の存在下で
のＡＢＣ１発現の水準は同じ培養培地で、また試験動物の平行セットで、しかし
候補分子の存在下で同一細胞で測定される。ＡＢＣ１活性はまたコレステロール
流出検定を用いて測定することもできる。
【０１３０】 ＡＢＣ１発現の転写調節 ＡＢＣ１ｍＲＮＡはコレステロール負荷に対して約８倍増加する。この増加は
転写水準で制御できるように見られる。ここに記載したプロモーター配列を用い
て、例えばゲルシフト法、ＤＮＡｓｅ保護検定、あるいは試験管内または生体内
レポーター遺伝子ベース検定などを行うことによりプロモーターに結合する転写
因子を同定することができる。同定された転写因子はそれ自身薬剤標的となる。
ＡＢＣ１の場合、ＡＢＣ１の転写調節を通じて作用する薬剤化合物はＨＤＬ調節
、アテローム硬化の予防、心臓血管病の処置に使用することができた。例えばＡ
ＢＣ１を抑制する転写因子を阻害する化合物の使用はＡＢＣ１、従ってＨＤＬ水
準の上向き調節を来たすと期待される。も一つの実施例では、転写因子発現また
は活性を高めるまたは化合物ＡＢＣ１発現とＨＤＬ水準を増加するであろう。
【０１３１】 アポリポタンパク質または他のコレステロール調節あるいは脂質調節遺伝子の
調節で他の遺伝子を調節するものとして知られる転写因子はとりわけ関連性が高
い。このような因子は必ずしもそれに限定されないがステロイド応答要素結合タ
ンパク質（ＳＲＥＢＰ−１とＳＲＥＢＰ−２）、ＰＰＡＲ（ペルオキシソーム増
殖活性化レセプター）転写因子を含む。ある種の要素のためのいくつかのコンセ
ンサス部位はＡＢＣ１遺伝子に対する配列化５'領域に存在し（図１６）、ＡＢ
Ｃ１発現を調節するように考えられる。例えばＰＰＡＲｓはレチノイドＸレセプ
ター（ＲＸＲｓ）でのヘテロ二量体化を含み次いで特異的増殖体応答要素（ＰＰ
ＲＥｓ）に結合する機構によりＡＢＣ１の転写を変更する。このようなＰＰＡＲ
ｓの例はＰＰＡＲα、β、γおよびδを含む。これらの異なったＰＰＡＲｓは異
なった遺伝子に対して転写調節作用を持つことを示してきた。ＰＰＡＲαは主と
して肝臓で発現され、一方ＰＰＡＲγは特に脂肪細胞で発現される。ＰＰＡＲα
とＰＰＡＲγはいずれも冠状動脈と頸動脈のアテローム硬化斑および内皮細胞、
平滑筋細胞、単球と単球誘導マクロファージで検出される。ＰＰＡＲαの活性化
は例えばリポタンパク質リパーゼ（ＬＰＬ）、アポリポタンパク質ＣＩＩＩ（ア
ポＣＩＩＩ）およびアポリポタンパク質ＡＩ（アポＡＩ）とＡＩＩ（アポＡＩＩ
）などのような遺伝子へのＰＰＡＲαの作用を通じて変更されたリポタンパク質
代謝をもたらす。ＰＰＡＲα活性化はＬＰＬとアポＡＩとアポＡＩＩの過剰反応
をもたらすがアポＣＩＩＩの発現を阻害する。ＰＰＡＲの活性化は更に炎症を阻
害し、脂質参加を刺激し、肝臓取込みと遊離脂肪酸（ＦＦＡ’ｓ）のエステル化
を高める。ＰＰＡＲαとＰＰＡＲγ活性化はマクロファージ内の酸化窒素（ＮＯ
）シンターゼを阻害し、ＩＬ−６とミクロオキシゲナーゼ＝２（ＣＯＸ−２）の
インターロイキン１（ＩＬ−１）誘導発現と、ＮＦ−ＫＢの負の転写調節に二次
的なトロンビン誘導エンドセリン−１発現と、タンパク質−１シグナル化経路の
活性化を妨げる。ＰＰＡＲαがＮＦ−ＫＢ活性の阻害を通じて単球誘導マクロフ
ァージでのアポトーシスを誘導することも示された。
【０１３２】 ＰＰＡＲαの活性化はフィブレート、β−エストラジオール、アラキドン酸誘
導体、ＷＹ−１４、６４３およびＬＴＢ４または８（ｓ）ＨＥＴＥなどの化合物
により達成できる。ＰＰＡＲγの活性化はチオゾリジネジオン抗糖尿病薬、９−
ＨＯＤＥおよび１３ＨＯＤＥなどの化合物を通じて達成できる。ニコチン酸また
はＨＭＧ ＣｏＡ還元酵素阻害薬などの追加化合物もＰＰＡＲｓの活性を変更す
る。
【０１３３】 いずれかのＰＰＡＲｓ（例えばＰＰＡＲαまたはＰＰＡＲγ）の活性を変更す
る化合物はＡＢＣ１発現に作用し、そのためＨＤＬ水準、アテローム硬化および
ＣＡＤのリスクに作用できる。ＰＰＡＲｓは更に（３チア脂肪酸などの修飾脂肪
酸を含む）脂肪酸、ロイコトリエンＢ４などのロイコトリエン、およびＰＰＡＲ
αの天然活性化合物質／リガンドであるプロスタグランジンＪ２などにより調節
される。ＰＰＡＲを調節する薬剤は従って（ＨＤＬとトリグリセリド水準を含む
）調節脂質水準および変更されたＣＡＤリスクに重要な作用を持つ。この作用は
ＡＢＣ１遺伝子発現の調節を通じて達成することができた。薬剤は更に脂肪細胞
分化決定因子１（ＡＤＤ−１）およびステロール調節エレメント結合タンパク質
１および２（ＳＲＥＢＰ−１、ＳＲＥＢＰ−２）などの他の転写因子を経由して
ＰＰＡＲｓに間接的作用することにより、ＡＢＣ１遺伝子発現ならびに従ってＨ
ＤＬ水準に作用する。実施例と組合せて与えられるＰＰＡＲαおよびＰＰＡＲα
とＰＰＡＲγ作用染活性と組合せた薬剤、またはＰＰＡＲγ作用薬はＨＤＬ水準
を更に高める。
【０１３４】 ＰＰＡＲ結合部位（ＰＰＲＥエレメント）はＡＢＣ１遺伝子の５’（配列識別
番号１４のヌクレオチド２１５０乃至２１６９）に見出される。Ｃ−ＡＣＳ、Ｈ
Ｄ、ＣＹＰ４ＡｂおよびＡｐｏＡＩ遺伝子で見出されるＰＰＲＥエレメントと同
じように、このＰＰＲＥ部位はＰＰＲＥコンセンサス配列に関連する三量体であ
る。この結合部位での反復の数と配列が一部類似しているために、とりわけこの
エレメントはＡＢＣ１遺伝子の調節に生理学的関連が非常にあるように見える。
【０１３５】 ＡＢＣ１遺伝子発現とそれによるＨＤＬ水準、アテローム硬化およびＣＡＤリ
スクを調節することに作用する追加の転写因子は、ＲＥＶ−ＥＲＢα、ＳＲＥＢ
Ｐ−１とＳＲＥＢＰ−２、ＡＤＤ−１、ＥＢＰα、ＣＲＥＢ結合タンパク質、Ｐ
３００、ＨＮＦ４、ＲＡＲ、ＬＸＲ、およびＲＯＲαを含む。これらの因子の追
加縮重結合部位は配列識別番号１４にある配列の試験を通じて発見することがで
きる。
【０１３６】 ＡＢＣ１ポリペプチド：核酸、およびモジュレーターの追加効用 ＡＢＣ１は細胞からの有毒タンパク質またはタンパク質断片（例えばＡＰＰ）
の輸送体として作用する。かくしてＡＢＣ１作用薬／上向き調節物質はアルツハ
イマー病、ニーマン−ピック病およびハンティングトン舞踏病を含む他の疾病領
域の処置に有用である。
【０１３７】 ＡＢＣ輸送体は細胞質ゾルからペルオキシソームへの長鎖脂肪酸の取込みを増
加しまた更により長鎖の脂肪酸のβ酸化で役割を果たすことが示された。重要な
ことは、Ｘ−連鎖副腎脳白質ジストロフィー（ＡＬＤ）で脂肪酸代謝はペルオキ
シソームＡＢＣ輸送体での欠陥により異常である。ＡＢＣ輸送体発現または生物
活性を上向き調節するいずれかの薬剤はこのためＡＬＤまたはいずれか他の脂質
疾患の処置に有用となる。
【０１３８】 ＡＢＣ１はマクロファージで発現され、プログラムされた細胞死を受ける細胞
の沈下を必要とする。アポトーシスプロセスそれ自身とその調節は細胞死を適切
に受ける細胞の破損のメカニズムの一つである癌などの疾患に対して重要な意味
を持つ。ＡＢＣ１はアポトーシスを促進し、このようにして癌処置の介入点を表
す。ＡＢＣ１発現または活性を高め、あるいはいずれかの方法によるＡＢＣ１の
上向き調節はアポトーシスを高め、かくしてこの疾病で特徴付けられる異常な細
胞増殖を潜在的に減少させることで癌に対する処置法を構築する。これとは逆に
いずれかの方法によるＡＢＣ１の下向き調節は、アポトーシスを減少させ細胞成
長が制限される条件で細胞増殖の増加を可能にする。このような疾患は必ずしも
それに限定されないが、神経欠損と神経退化、および発育疾患を含む。従ってＡ
ＢＣ１は潜在的に癌の処置、または変形性疾患の処置で使用される化合物の確認
のため方法として使用することができる。
【０１３９】 ＡＢＣ１発現または生物活性を上向き調節する薬剤は必ずしもそれに限定され
ないがプロテインキナーゼＡ、プロテインキナーゼＣ、バナジウム酸塩、オカダ
酸、およびＩＢＭＸ１を含む。
【０１４０】 当業者は他の化合物もＡＢＣ１生物活性を調節することができることを認識す
るであろうし、これ他の化合物はまたこの発明の精神の下にある。
【０１４１】 ＡＢＣ１遺伝子またはタンパク質に基づく薬剤スクリーン ＡＢＣ１タンパク質と遺伝子はその活性を調節しまたコレステロール水準を調
節する潜在的薬剤になる化合物の識別のためのスクリーニング検定に使用するこ
とができる。有用なＡＢＣ１タンパク質は組換え形態でのまたは内在的に発現さ
れた野生型および突然変異体ＡＢＣ１タンパク質またはタンパク質断片を含む。
ＡＢＣ１発現産物に作用する化合物を識別する薬剤スクリーンはタンパク質のい
ずれかの機能特性を利用する。一つの実施例において、リン酸化機能または他の
翻訳後修復がＡＢＣ１生物活性の尺度としてもモニターされる。ＡＢＣ１はＡＴ
Ｐ結合部位を持ち、かくして検定は全体としてまたは部分的にＡＴＰに結合しま
たはＡＴＰａｓｅ活性を提示するＡＢＣ１の能力を試験する。ＡＢＣ１は類似の
タンパク質との相似によりチャンネル状構造を形成できるものと見做される。薬
剤スクリーニング検定はチャンネルを形成するタンパク質の能力を検定すること
に、またはコレステロールあるいはも一つの分子を輸送する能力に基づき、もし
くはチャンネルを形成するためにＡＢＣ１と結合されまたは調節される他のタン
パク質の能力に基づくことができた。選択肢として、リン脂質または脂質輸送は
同じくＡＢＣ１生物活性の尺度として使用することができる。
【０１４２】 コレステロール水準の調節物質としての役割に加えて、ＡＢＣ１は更に陰イオ
ンを輸送するという証拠が存在する。機能検定はこの資質に基づき、また例えば
（必ずしもそれに限定されないが）、そのような検定で特異的なイオン濃度での
変化に対応して色を変える各種の染料の能力がリボソームなどの小胞で行うこと
ができる、あるいは全細胞を使用するように適応させることができるというよう
な薬剤スクリーニング技術を採用することができる。
【０１４３】 薬剤スクリーニング検定は更に他のタンパク質と相互作用するＡＢＣ1または
他のＡＢＣ輸送体の能力に基づくこともできる。このような相互作用タンパク質
は、例えば放射性免疫沈降法、同一免疫沈降法、酵素ツーハイブリッドスクリー
ニングを含む各種の従来公知の方法で識別することができる。このような相互作
用は更に必ずしもそれに限定されないが蛍光偏光法またはシンチレーション近接
法により検定することができる。薬剤スクリーンはまたタンパク質のＸ線クリス
タログラフィーに対して限定されたＡＢＣ1タンパク質の機能と、その３Ｄ構造
の機能が公知であるタンパク質のそれとの比較に基づくことができる。そのよう
なクリスタル構造は原核ＡＢ科部材であるＨｉｓＰ、ヒスチジン透過酵素と決定
された。薬剤スクリーンは遺伝子導入マウスまたはノックアウトマウスの作成、
または試験管内哺乳類細胞でのタンパク質またはタンパク質断片の過剰発現に対
して明らかな機能または特性に基づくことができる。その上、酵母菌またはシー
エレガンス内での哺乳類（例えばヒト）ＡＢＣ１の発現は野生型と変異体バック
グラウンドでの候補化合物のスクリーニング、同じくＡＢＣ１依存性表現型を高
めまたは抑制する突然変異のスクリーニングを可能にする。修飾スクリーンも遺
伝子導入マウスまたはノックアウトマウスで行うことができる。
【０１４４】 更に薬剤スクリーニング検定は遺伝子機能でアンチセンス干渉から推定される
ＡＢＣ１機能に基づくことができる。ＡＢＣ１の細胞内局在化、またはタンパク
質の細胞内局在化での変化で起こる作用は薬剤スクリーニングのための検定とし
て使用することができる。免疫細胞化学法はＡＢＣ１タンパク質の正確な位置を
決定するのに使用されるであろう。
【０１４５】 ヒトおよびネズミＡＢＣ１タンパク質はモノクローナル抗体を含む抗体を高め
る抗原として使用できる。このような抗体は必ずしもそれに限定されないが、薬
剤スクリーニング検定と診断の機能的研究と開発を含む各種の目的に有用である
。ＡＢＣ１の発現または生物活性に関し作用薬（例えば薬剤化合物等）の影響を
モニターすることは基本薬剤スクリーニングだけでなく、臨床試験にも適用でき
る。例えばＡＢＣ１遺伝子発現、タンパク質水準、または生物活性を高めるため
にここで記載されたスクリーニング検定により決定される作用薬の効果は変化し
たＡＢＣ１遺伝子発現、タンパク質水準、または生物活性を示す被験者の臨床試
験でモニターできる。選択肢として、ＡＢＣ１遺伝子発現、タンパク質水準、ま
たは生物活性を調節するスクリーニング検定により決定される作用薬の効果は変
化したＡＢＣ１遺伝子発現、タンパク質水準、または生物活性の減少を示す被験
者の臨床試験でモニターできる。このような臨床試験において、例えば心臓血管
病に関係してきたＡＢＣ１および望ましくは他の遺伝子の発現または活性は特殊
な薬剤の効果を確かめるために使用できる。
【０１４６】 例えば、またそれを限定することなく、（例えばここで記載されたようにスク
リーニング検定で確認された）ＡＢＣ１生物活性を調節する作用薬（例えば化合
物、薬剤または小さい分子）での処置により細胞内で調節されるＡＢＣ１を含む
遺伝子を確認することができる。かくして例えば臨床試験でコレステロール水準
または心臓血管病に対する作用薬の作用を研究するために、細胞が単離されＲＮ
Ａが調節され患者に関連するＡＢＣ１および他の遺伝子の発現水準が分析された
。遺伝子発現の水準はノーザンブロット分析またはＲＴ-ＰＣＴにより、あるい
は選択肢として産生されるタンパク質の量を測定することにより、従来公知の数
多くの技術の一つにより、またはＡＢＣ１あるいは他の遺伝子の生物活性の水準
により計量することができる。このように遺伝子発現は細胞の作用薬に対する生
物的応答を示す標識として役立ち得る。従ってこの応答機能は作用薬での個体の
処置の前、および処置の間の各時点で決定される。
【０１４７】 望ましい実施例において、本発明は作用薬（たとえば作用薬、拮抗薬ペプチド
模擬薬、タンパク質、ペプチド、核酸、小分子、またはここに記載されたスクリ
ーニング検定で確認される薬剤候補）を用いて被験者の処置の効果をモニターす
る方法を含み、それは以下のステップすなわち（ｉ）作用薬の投与の前に被験者
から投与前サンプルを確保し、（ｉｉ）投与前サンプルのＡＢＣ１タンパク質、
ｍＲＮＡ、あるいはゲノムＤＮＡの発現水準を検出し、（ｉｉｉ）被験者から投
与後の１個以上のサンプルを獲得し、（ｉｖ）投与後のＡＢＣ１タンパク質、ｍ
ＲＮＡ、あるいはゲノムＤＮＡの発現水準または活性水準を検出し、（ｖ）投与
前サンプルのＡＢＣ１タンパク質、ｍＲＮＡ、またはゲノムＤＮＡの発現または
活性水準を投与後サンプルのＡＢＣ１タンパク質、ｍＲＮＡ、またはゲノムＤＮ
Ａのそれと比較し、また（ｖｉ）従って被験者への作用薬の投与の投与を変更す
るステップを含む。例えば、作用薬の増加投与は検出されたもの以上の高い水準
でＡＢＣ１の発現または活性を増加し、すなわち作用薬の効果を増加するために
望ましい。選択肢として、作用薬の減少投与は検出されたもの以下の低い水準で
ＡＢＣ１の発現または活性を減少させるために望ましい。
【０１４８】 ＡＢＣ１遺伝子またはその断片はタンパク質を試験管内または生体内の適切な
細胞で発現する用具として使用でき（遺伝子治療）、または薬剤スクリーニング
のための試験管内検定に使用される大量のＡＢＣ１タンパク質を産生するのに使
用できる発現ベクターにクローン化することができる。採用される発現システム
はバキュロウイルス、ヘルペスウイルス、アデノウイルス、アデノ関連性ウイル
ス、バクテリアシステムおよびＣＨＯ細胞などの真核システムを含む。裸ＤＮＡ
とＤＮＡリポソーム複合体も使用できる。
【０１４９】 ＡＢＣ１活性の検定は、細胞内相互作用タンパク質との結合、ＡＢＣ１活性を
上向き調節するタンパク質との相互作用、ＨＤＬ粒子または構成物との相互作用
、ＨＤＬまたはその構成物との相互作用を促進する他のタンパク質との相互作用
、およびコレステロール流出の測定を含む。更に検定は蛍光タンパク質バイオセ
ンサーにより高分子、代謝およびイオンの分子力学に基礎をおく。選択肢として
、発現または活性に対する候補調節物質の作用は、ＡＢＣ１特異的抗体を用いる
ウエスタンブロッティングまたは免疫沈降法などのような標準免疫検出法と組合
せた同じ一般的アプローチを使用したＡＢＣ１タンパク質産生の水準で測定され
る。更にまた有用なコレステロール調節または抗ＣＶＤ治療調節物質がＡＢＣ１
ポリペプチド産生での変化を産生するものとして確認される。作用薬も発現水準
に何らの作用も与えることなしにＡＢＣ１活性の影響を与える。
【０１５０】 候補調節物質は精製（または事実上精製）された分子あるいは化合物の混合物
の一成分（例えば細胞から得られた抽出物または上澄み）である。混合化合物検
定において、ＡＢＣ１発現は単一化合物または最小化合物混合物がＡＢＣ１発現
を調節することを示すようになるまで、（例えば標準精製技術、例えばオースベ
ル他、ＨＰＬＣまたはＦＰＬＣにより産生された）候補化合物プールの次第に小
さくなるサブセットに対して試験される。
【０１５１】 細胞ＡＢＣ１発現または活性の水準を調節するのに有効な作用薬、拮抗薬、ま
たは模擬薬は動物モデル（例えばマウス、ブタ、ラビットまたはニワトリ）で有
用であることが発見された。例えば化合物はマウスまたはニワトリの低アルファ
ーリポタンパク質症の低ＨＤＬ水準を改良する。
【０１５２】 ＡＢＣ１発現または活性の増加を促進する化合物は本発明でとりわけ有用であ
ると見做される。このような分子は、例えば天然細胞ＡＢＣ１の水準または活性
を増加し、これにより動物（例えばヒト）の低ＨＤＬ条件を処置するための治療
薬として使用される。
【０１５３】 ＡＢＣ生物活性を増加する一つの方法はＡＢＣタンパク質の安定性を高めまた
はその分解を予防することである。かくしてタンパク質の安定性を高めるように
導くＡＢＣポリペプチド（例えばＡＢＣ１）における突然変異を確認することが
有用となる。これらの突然変異は低ＨＤＬ-Ｃまたはいずれか他のＡＢＣ１生物
活性の損失から生じる異常を処理するためにとられる何らかのタンパク質治療ま
たは遺伝子治療に組み込むことができる。同様に、野生型ＡＢＣポリペプチドの
安定性を増加しまたはその異化作用を減少する化合物もまた低ＨＤＬ−Ｃまたは
いずれか他のＡＢＣ１生物活性の損失から生じる異常の処理に有用である。この
ような突然変異と化合物はここに記載の方法を用いて確認することができる。
【０１５４】 一つの実施例においては、突然変異を持つＡＢＣポリペプチドを発現する細胞
は翻訳の間に遷移的に代謝標識され、ＡＢＣポリペプチドの半減期は標準技術を
使って決定される。ＡＢＣポリペプチドの半減期を増加する突然変異はＡＢＣ安
定性を高める変異である。これらの突然変異に次いでＡＢＣ生物活性を評価でき
る。それらはまたＡＢＣ１ ｍＲＮＡまたはタンパク質の安定性は影響するタン
パク質を同定するために使用できる。次いでＡＢＣ１に結合するためにこれらの
因子にまたはこれらの因子の能力に作用する化合物を検定することができる。
【０１５５】 も一つの実施例においては、野生型ＡＢＣポリペプチドを発現する細胞は翻訳
の間に遷移的に代謝標識され、候補化合物と接触され、ＡＢＣポリペプチドの半
減期は標準技術を用いて決定される。ＡＢＣポリペプチドの半減期を増加する化
合物は本発明での有用な化合物である。
【０１５６】 望ましければ本発明の作用薬を用いる処置はいずれか他のＨＤＬ上昇または抗
ＣＶＤ治療と組合わせられる。
【０１５７】 ＡＢＣ１がここに記載された薬剤スクリーンのための望ましいＡＢＣ輸送体で
ある一方、他のＡＢＣ輸送体も使用することができる。ＡＢＣ１をも一つのＡＢ
Ｃ輸送対に置換することはＡＢＣ２，ＡＢＣＲ，またはＡＢＣ８が同じような調
節のメカニズムを持つであろうことから可能である。
【０１５８】 代表的な検定は以下で特に詳細に記載される。
【０１５９】 タンパク質ベース検定 ＡＢＣ１ポリペプチド（精製または未精製のもの）は（必ずしもそれに限定さ
れないが、特異的にＡＢＣ１と相互作用することが発見されたタンパク質を含む
）も一つのタンパク質に結合する能力を決定する検定に使用できる。その結合に
対する化合物の作用が次いで決定される。
【０１６０】 タンパク質相互作用検定 ＡＢＣ１タンパク質（またはポリペプチド断片あるいはエピトープ標識形態も
しくはその断片）は適切な源から（例えば原核発現システム、真核細胞、無細胞
システムからあるいはＡＢＣ１発現細胞から免疫沈降法によって）収穫される。
ＡＢＣ１ポリペプチドは次いで適切な支持材（例えばＡＢＣ１のｈｉｓ標識形態
の場合例えばニトロセルロースまたは抗体もしはく金属アガロースカラム）に結
合される。支持材への結合は望ましくはＡＢＣ１ポリペプチドと関連するタンパ
ク質がそれと関連したままで留まるような条件の下で行なわれる。このような条
件はタンパク質相互作用での干渉を最小にする緩衝液の使用を含む。結合段階は
ＡＢＣ１と他の分子の間の相互作用に干渉するその能力が試験された化合物の存
在または不在の下で行うこととができる。もし望ましければ、他のタンパク質（
例えば細胞ラゼート）が加えられ、ＡＢＣポリペプチドと結合する時間が与えら
れる。固定されたＡＢＣ１ポリペプチドは次いでポリペプチドまたは支持材と非
特異的に結合するタンパク質または他の細胞を除去するために洗浄される。固定
ＡＢＣ１ポリペプチドは次いでその支持材から解離され、そのためそれと結合し
ていたタンパク質は（例えば加熱により）放出され、または代替的に結合タンパ
ク質は支持材からＡＢＣ１ポリペプチドを放出することなしでＡＢＣ１から放出
される。放出タンパク質と他の細胞構成物は例えばＳＤＳ−ＰＡＧＥ，ウエスタ
ンブロッティングと特異的抗体での検出、ホスホアミノ酸分析、プロテアーゼ消
化、タンパク質配列化、または等電点電気泳動により分析することができる。Ａ
ＢＣ１の正常および変異形態がＡＢＣ１のどの部分に与えられた因子が結合する
のかに関して追加の情報を得るためにこれらの検定で採用することができる。加
えて不完全に精製されたポリペプチドが採用される時、タンパク質の正常および
変異形態の比較が真の結合タンパク質を区別するのに役立つように使用すること
ができる。
【０１６１】 前記の検定はＡＢＣ１と相互作用することが知られる精製または半精製あるい
は他の分子を用いて行うことができる。この検定は以下のステップを含み、 １．ＡＢＣ１タンパク質を収穫し適切な蛍光標識をそれに結合する ２．相互作用タンパク質（または他の分子）を第２の異なる蛍光標識で標識す
る。染料が相互に非常に近くにある時、対それが物理的に離れている場合（すな
わち染料が相互に近くある時には相互に消光しそれらが近くにいない場合には消
光しない染料）異なった消光パターンを産生する染料を使用し、 ３．相互作用する分子を固定されたＡＢＣ１に、これら２個の間の相互作用に
干渉する能力を試験された化合物の存在下または存在下で露出し、また ４．蛍光読み出しデータを収集する、 ステップである。
【０１６２】 も一つの検定は蛍光共鳴エネルギー移転（ＦＲＥＴ）検定である。この検定は
次のように実施できる。
【０１６３】 １．ＡＢＣ１タンパク質またはその適切なポリペプチド断片を提供し適切なＦ
ＲＥＴ供与体（例えばニトロベンゾキサジアゾール（ＮＢＤ））をそれと結合し
、 ２．相互作用タンパク質（または他の分子）をＦＲＥＴ受容体（例えばローダ
ミン）で標識し、 ３．受容体標識相互作用分子を供与体標識ＡＢＣ１に、その２個の間の相互作
用に干渉する能力を試験された化合物の存在下または不在下で露出し、また ４．蛍光共鳴エネルギー移転を測定する。
【０１６４】 消光とＦＲＥＴ検定は関連する。どちらもどのフルオロフォアの対が検定に使
用されたかに依存して与えられた場合に適用できる。
【０１６５】 膜透過性検定 ＡＢＣ１タンパク質は更に膜透過性に対する作用を試験することができる。例
えば脂質を置き換えるその推定上の能力を越えて、ＡＢＣ１はイオンに対する膜
透過性に影響する。他の膜関連タンパク質、もっとも著名なものである嚢胞性線
維症膜貫通コンダクタンス調節物質およびスルホニル尿素受容体はイオンチャン
ネルと関連し調節する。
【０１６６】 ＡＢＣ１はＡＢＣ１の断片は合成小胞に組み込まれ、あるいは選択肢として、
細胞と小胞に発現され、またはＡＢＣ１を含む他の細胞サブ構造は単離される。
ＡＢＣ１含有小胞または細胞は（外側への動きを観察するために）イオンを検出
できるレポーター分子（その蛍光イオン指示薬）が特殊なイオンを結合する時に
その蛍光性質を変化させるような蛍光イオン支持薬など）を装荷され、また選択
肢として、外部媒体が（内側への動きを観察するために）そのような分子を装荷
される。分子が小胞の外側にある時に比べて分子が小胞の内側にある時に異なる
性質を示す分子が望ましい。例えば分子が高濃度にある時に、しかしそれがも一
つの低い濃度にある時には存在しない消光性質を持つ分子が適切であろう。（移
動する能力または動きの運動学のいずれかの）装荷分子の動きがそのプロセスに
影響する能力を試験された化学物の存在下または不在下で決定することができる
。
【０１６７】 も一つの検定において、膜透過性は標準電気生理学手法によりＡＢＣ１で仲介
または調節されるイオン流入または流出を測定することにより電気生理学的に決
定される。適切な対照（例えはＴＤ細胞または非常に低い内因性ＡＢＣ１発現を
持つ細胞系）は観察された作用がＡＢＣ１を発現する細胞に特異的であるかどう
かを決定するための検定で対照として使用できる。
【０１６８】 更にも一つの検定において小胞へのまたはそれからの放射性同位元素の取り入
れが測定できる。小胞は小胞外培地から分離され、また小胞内および培地内の放
射能は計量され比較される。
【０１６９】 核酸ベース検定 ＡＢＣ１核酸はＡＢＣ１遺伝子転写に必要な因子の結合に基礎を置く検定に使
用される。ＡＢＣ１ ＤＮＡと結合因子との間の結合はタンパク質結合およびタ
ンパク質結合ＤＮＡの間を識別するいずれかのシステム（例えばゲルシフト検定
）により評価される。因子のＡＢＣ１ ＤＮＡの結合に対する化合物の作用はこ
のような検定により評価される。試験管内結合検定に加えて、ＡＢＣ１遺伝子の
調節領域がレポーター遺伝子と連鎖する試験管検定が同じように実行される。
【０１７０】 ＡＢＣ１安定性を測定する検定 細胞ベースまたは無細胞システムはＡＢＣ１ ｍＲＮＡまたはＡＢＣ１タンパ
ク質の半減期に対する作用に基づく化合物をスクリーンするために使用できる。
この検定は標識ｍＲＮＡまたはタンパク質を採用する。選択肢としてＡＢＣ１
ｍＲＮＡは特異的にハイブリッド形成するプローブまたは計量ＰＣＲ検定により
検出される。タンパク質は例えば蛍光抗体ベース方法により計量される。
【０１７１】 試験管内ｍＲＮＡ安定性検定 １．試験管内転写によりＡＢＣ１ ｍＲＮＡの適切な量を単離または産生し、 ２．ＡＢＣ１ ｍＲＮＡを標識し、 ３．ＡＢＣ１ ｍＲＮＡ安定性を調節する能力を試験された化合物の存在下ま
たは不在下でｍＲＮＡのアリコートを細胞ライゼートに露出し、 ４．残存ｍＲＮＡの無傷状態を適切な時間点で評価する。
【０１７２】 試験管内タンパク質安定性検定 １．適切な量のＡＢＣ１タンパク質を発現し、 ２．タンパク質を標識し、 ３．ＡＢＣ１タンパク質安定性を調節する能力を試験された化合物の存在下ま
たは不在下で標識タンパク質のアリコートを細胞ライゼートに露出し、 ４．残存ｍＲＮＡの無傷状態を適切な時間点で評価する。
【０１７３】 生体内ｍＲＮＡまたはタンパク質安定性検定 １．ｍＲＮＡまたはタンパク質に対する作用を調節された化合物の存在下また
は不在下で非常に短い時間（例えば５分内）でＡＢＣ１ ｍＲＮＡまたはタンパ
ク質を発現する細胞をトレーサー（それぞれ放射標識リボヌクレオチドまたは放
射線標識アミノ酸）と共に保温し、 ２．未標識リボヌクレオチドまたはアミノ酸と共に保温し、 ３．ステップ２の出発に始まるＡＢＣ１ ｍＲＮＡまたはタンパク質の放射能
が約８０％減少する時間までにわたる時間間隔でＡＢＣ１ ｍＲＮＡまたはタン
パク質放射能を計量する。ｍＲＮＡまたはタンパク質を計量するために例えばゲ
ル電気泳動のような手段により放射性分解産物から無傷または殆ど無傷のｍＲＮ
Ａまたはタンパク質を分離することが望ましい。
【０１７４】 優先ネガティブ活性の阻害を測定する検定 変異体ＡＢＣ１ポリペプチドは優先ネガティブ活性（すなわち野生型ＡＢＣ１
機能に干渉する活性）を持つように見える。そのような変異体に干渉できる化合
物の検定は変異体の存在下で正常なＡＢＣ１活性を計量する何れかの方法に基づ
く。例えば、正常ＡＢＣ１はコレステロール流出を促進し、優先ネガティブ変異
体はこの作用に干渉するであろう。優先ネガティブ変異体の作用を妨害する化合
物の能力は細胞コレステロール流出に、または変異体により抑制可能となった野
生型ＡＢＣ１の他の正常な活性に基づくものである。
【０１７５】 リン酸化を測定する検定 ＡＢＣ１リン酸化に対する化合物の作用はタンパク質またはＡＢＣ１の特異的
残基のリン酸化状態を評価するものに対するリン酸塩を計量する方法により検定
することができる。このような方法は必ずしもそれに限定されなが32Ｐ標識化と
免疫沈降法、抗ホスホアミノ酸抗体（例えば抗ホスホセリン抗体）での検出、2
次元ＴＬＣ平板に対するホスホアミノ酸分析、およびタンパク質のプロテアーゼ
消化フィンガープリンティングと続く32Ｐ標識断片の検出を含む。
【０１７６】 他の翻訳後修飾を測定する検定 ＡＢＣ１の翻訳後修飾に対する化合物の作用は特定の修飾を計量できるいずれ
かの方法に基礎を置く。例えば糖鎖形成に対する化合物の作用はＡＢＣ１をグリ
コシラーゼで処置し放出された炭水化合物の量と性質を計量することにより検定
される。
【０１７７】 ＡＴＰ結合を測定する検定 ＡＴＰに結合するＡＢＣ１の能力はＡＢＣ１に影響する化合物をスクリーンす
るも一つの検定を提供する。ＡＴＰ結合は以下のように計量することができる。
【０１７８】 １．ＡＢＣ１タンパク質を適切な純度水準で提供し、それを脂質小胞に再構成
する。
【０１７９】 ２．ＡＴＰ結合への影響を試験された化合物の存在下または不在下で標識され
るが加水分解できないＡＴＰ類似体（例えばガンマ35Ｓ−ＡＴＰ）などに小胞を
露出する。アジドＡＴＰ類似体がアジドＡＴＰのタンパク質の（紫外線による）
共有付着を可能にしタンパク質に結合するＡＴＰの量の計量をより容易にさせる
。
【０１８０】 ３．ＡＢＣ１と結合するＡＴＰ類似体の量を計量する。
【０１８１】 ＡＴＰａｓｅ活性を測定する検定 ＡＢＣ１のＡＴＰａｓｅ活性の計量はＡＢＣ１に対する化合物の作用について
検定することができる。これは望ましくはＡＢＣ１を細胞内で多くの他のＡＴＰ
ａｓｅから分離するように無細胞検定で行われる。ＡＴＰａｓｅ検定は膜の存在
または不在下で、またＡＢＣ１タンパク質の膜への取り込みありまたは無しで行
われる。もし小胞ベース検定で行われる場合には、産生されるＡＴＰ加水分解産
物または加水分解されたＡＴＰは小胞内でまたは小胞外であるいはその両方で測
定される。このような検定はＡＴＰの消失またはＡＴＰ加水分解産物の出現を基
礎にする。
【０１８２】 高処理量のスクリーニングにとっては、結合ＡＴＰａｓｅ検定が望ましい。例
えばピルビン酸キナーゼと乳酸デヒドロゲナーゼを含む反応混合物を使用するこ
とができる。混合物はホスホエノールピルビン酸塩（ＰＥＰ）、ニコチンアミド
アデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ＋）、およびＡＴＰを含む。ＡＢＣ１のＡＴＰ
ａｓｅ活性はＡＴＰからＡＤＰを精製する。ＡＤＰは次いでビルビン酸キナーゼ
反応の一部としてＡＴＰに戻される。後の反応は無色の基礎（ＮＡＤ＋）から染
色キノン（ＮＡＤＨ）を生成し、また全反応はＮＡＤＨの形成に際して色の変化
の検出によりモニターすることができる。ＡＤＰはピルビン酸キナーゼを制限す
るために、この結合システムは正確にＡＢＣ１のＡＴＰａｓｅ活性をモニターす
る。
【０１８３】 コレステロール流出を測定する検定 輸送ベースの検定は生体内または試験管内で実行することができる。例えば検
定はコレステロールまたはリン酸脂質流出などのように、培養で容易に再創出で
きる逆コレステロール輸送プロセスの一部を基礎にする。選択肢として、検定は
標識物質（コレステロールなど）により評価される全生体での正味コレステロー
ル輸送に基礎を置く。
【０１８４】 高処理のために蛍光脂質はＡＢＣ１触媒流出を測定するために使用できる。リ
ン酸脂質のために、蛍光前駆体であるＣ６−ＮＢＤ−ホスファチジン酸が使用で
きる。この脂質は細胞により取り上げられたホスファチジン酸ホスホヒドロラー
ゼにより脱リン酸される。この産物であるＮＢＤ−ジグリセリドは次いでホスフ
ァチジルコリン（レシチン）などのグリセロリン脂質の合成のための前駆体とな
る。ＮＢＤ−ホスファチジルコリンの流出は細胞培養培地の適切な受容体に対す
るＮＢＤの蛍光共鳴エネルギー移転（ＦＲＥＴ）を検出によりモニターできる。
この受容体は細胞により容易に取り込まれないリン脂質は培地でのリン脂質輸送
タンパク質の必要を不要にする。コレステロールのために、ＮＢＤ−コレステロ
ールエステルはＬＤＬに再構築することができる。ＬＤＬはこの脂質を細胞にＬ
ＤＬ受容経路を通じて有効加水分解され、血漿膜に戻され細胞から流出できるＮ
ＢＤ−コレステロールを生成する。流出はＮＢＤがその蛍光共鳴エネルギーをロ
ーダミンホスファチジルエタノリン受容体に移す前記のＦＲＥＴ検定によりモニ
ターすることができる。
【０１８５】 動物モデルシステム 前記検定のいずれかで活性を持つものとして確認された化合物は、次いで必ず
しもそれに限定されないが、ブタ、ラビット、ＷＨＡＭニワトリを含むいずれか
の利用できる動物モデルシステムでスクリーンされる。試験化合物はこれらの動
物に標準方法に基づいて投与される。試験化合物は更にＡＢＣ１遺伝子に突然変
異を持つマウスで試験される。更に化合物はＡＢＣ１と、ＡｐｏＡＩ、ＡｐｏＡ
ＩＩ、またはＡｐｏＥなどを構成するいずれかのＡＤＬ粒子の間の相互作用を高
めるそれらの能力をスクリーンされる。
【０１８６】 薬剤スクリーンとしてのコレステロール流出検定 コレステロール流出検定はコレステロールを細胞外受容体分子に運ぶ細胞の能
力を測定しまたＡＢＣ１機能に依存する。この手順で、細胞はいずれかいくつか
の生化学経路により放射線標識コレステロールを装荷される（マーシル他、Ａｒ
ｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｖａｓｃ．Ｂｉｏｌ．１９：１５９−１
６９．１９９９）。コレステロール流出は次いでＨＤＬ３または精製ＡｐｏＡＩ
の存在下で各種時間（典型的には０乃至２４時間）の保温の後測定される。コレ
ステロール流出は各種の保温時間の後培地で全コレステロールのパーセンテージ
として測定される。ＡＢＣ１発現水準およびまたは生物活性は流出の増加と関連
し、一方ＡＢＣ１の水準の減少はコレステロール流出の減少と関連する。
【０１８７】 この検定は薬剤スクリーニングに使用される形式（フォーマット）に容易に適
応することができ、それは多ウエル（例えば９６ウエル）形式より成る。薬剤ス
クリーニングにそれを最適化する検定の修飾は手続を減少して簡素化し、標識方
法を修飾し、異なったコレステロール受容体を使用し、保温時間を変更し、コレ
ステロール計算方法を変えることを含む。これらすべての場合、コレステロール
流出検定は実験の修飾は行うけれども、その概念としては変わらず同じである。
ＡＢＣ１を過剰発現する遺伝子導入マウスは正常ＨＬＤ水準より高い値を持つも
のと期待される。
【０１８８】 ノックアウトマウスモデル （例えば相同組換えなどにより）不活性化された１個または両方のＡＢＣ１対
立遺伝子を持つマウスなどのような動物は低ＨＤＬ−Ｃ水準を持つように見え、
かくしてＨＤＬ−Ｃ水準を高める化合物をスクリーンニングするための望ましい
動物モデルである。そのような動物は標準方法で産生することができる。試験化
合物の初期スクリーニングに加えて、変異体ＡＢＣ１遺伝子を持つ動物はここに
記載された他のスクリーニング法の一つを用いる最初に確認された薬剤または作
用薬の効果と安定性を更に試験するために有用である。動物から取り出された培
養に配置される細胞はまた試験化合物に露出することができる。ＨＤＬ−Ｃ水準
はここで記載されるような標準技術を用いて測定することができる。
【０１８９】 ＷＨＡＭニワトリ：低ＨＤＬコレステロール用動物モデル ウイスコンシン低アルファ変異体（ＷＨＡＭ）ニワトリが閉鎖群の自発的突然
変異により発生した。変異体ニワトリは「劣性ホワイトスキン」として引用され
るＺ連鎖ホワイトシャンクおよびホワイトビック表現型を通じて注目をあび（マ
クギボン、１９８１）、続いてＨＤＬを大きく欠いていることが発見された（ペ
ーナマ他、１９９０）。
【０１９０】 このニワトリの低ＨＤＬ遺伝子座（Ｙ）はＺ連鎖あるいは性連鎖している（鳥
では、雌はＺＷで雄はＺＺである）。遺伝子地図ではＹ遺伝子５座はＩＤ遺伝子
座（ビットグット、１９８８）に近位のＺ染色体（ビックグッド、１９８５）の
長腕部に配置した。ニワトリゲノム地図化プロジェクト、チックマップ（ロスリ
ン・インスティチュートで保有； HYPERLINK "http://www.ri.bbrrc.ac.uk/chic
kmap/ChickMapHomePag.html" ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒｉ．ｂｂｒｒｃ．ａｃ
．ｕｋ／ｃｈｉｃｋｍａｐ／ＣｈｉｃｋＭａｐＨｏｍｅＰａｇ．ｈｔｍｌ）の現
在地図化データの検討は、ヒト染色体９とのシンテニーの領域がＩＤ遺伝子座近
位のニワトリＺ染色体（Ｚｑ）の長腕部にあることを示した。シンテニーのこの
領域の証拠は、この領域内でのニワトリアルドラーゼＢ遺伝子座（ＡＬＤＯＢ）
の位置にある。ヒトＡＬＤＯＢ遺伝子座はヒトＡＢＣ１の位置から遠くない染色
体９ｑ２２．３に位置する（ザ・ゲノム・データベース，ｈｔｔｐ：／／ｇｄｂ
ｗｗｖ．ｇｄｂ．ｏｒｇ．／）。この地図の比較は、ニワトリＡＬＤＯＢ近くの
ニワトリＺｑ領域およびヒトＡＬＤＯＢ近くのヒト９ｑ領域がヒトとニワトリの
間のシンテニー領域を表すことを示した。
【０１９１】 低ＨＤＬ遺伝子座がヒトでは９ｑ位置またニワトリではＺｑ領域に位置するた
めに、これらのＨＤＬ遺伝子座はシンテニー領域内にほぼ位置している。かくし
て我々はＡＢＣ１がＷＨＡＭニワトリで突然変異していることを予言した。これ
を支援して、我々はヒトＡＢＣ１のアミノ酸８９に一致する位置でのＥ⇒Ｋ突然
変異を確認した（図１４．図１５）。この非保存置換はヒト、マウス、およびニ
ワトリの間に保存される位置にあり、機能的重要性を持つように見えるタンパク
質の領域にあることを示している。
【０１９２】 ＡＢＣ１タンパク質のアミノ末端部分でのＷＨＡＭ突然変異の発見は同じくア
ミノ末端領域の重要性を立証する。この領域はコレステロール流出または関連す
る課題を運ぶのに必要な他のタンパク質と関連するために重要となる。それは重
要な調節領域であり（突然変異残基の近くにカゼインキナーゼのためのリン酸化
部位がある）、またはそれは細胞膜と正確な位相関係を指示することに役立つ（
Ｎ末端６０アミノ酸領域は推定上の膜広がりまたは膜関連セグメントを含む）。
【０１９３】 タンパク質のアミノ酸末端領域（約アミノ酸６３９での最初の６−ＴＭ領域ま
で）はＡＢＣ１活性に影響するスクリーニング因子のたろの理想的な用具である
。切形タンパク質により正常ＡＢＣ１機能の干渉を試験するために、それはＡＢ
Ｃ１野生型細胞どの切形タンパク質として発現することができる。もし断片が優
性ネガティブな方法で作用するとすれば、それは正常な内因性タンパク質から離
れて競争するタンパク質を同定する免疫沈降法で使用できたであろう。
【０１９４】 Ｃ末端もまた膜貫通領域不在下で断片または標識であるいは融合タンパク質と
して発現される、分子の細胞内部分が行うのと同じような実験に手を貸す。
【０１９５】 コレステロール流出に影響するヒトゲノムにいくつかの遺伝子が存在すること
が可能であるため、ヒト遺伝子病に使用される何らかの動物モデルがその動物で
の相同性遺伝子座を表し類似の機能を持つ、異なった遺伝子座は表さないことを
立証することが重要である。前記の証拠はニワトリＹ遺伝子座とヒト染色体９低
ＨＤＬ遺伝子座が相同であることを立証する。ＷＨＡＭニワトリは従ってコレス
テロール流出を調節する薬剤の確認のために重要な動物となる。
【０１９６】 しかしＷＨＡＭニワトリのＨＤＬ欠損症候群はニワトリの短い寿命を反映する
。我々はヒトのＨＤＬを高める薬剤の開発と試験のためのヒト低ＨＤＬのモデル
としてＷＨＡＭニワトリを提案する。このようなモデルはこれらニワトリの細胞
または他の誘導体の使用を通じて、または薬剤有効性、毒性、および他の薬剤開
発目的の試験にニワトリ自身を使用することにより、いくつかの形態で採用する
ことができた。
【０１９７】 療法 必ずしもそれに限定されないが、ＡＢＣ１ポリペプチド、ＡＢＣ１核酸、他の
ＡＢＣ輸送体、およびここで開示されたいずれかの方法を用いて確認された生物
活性または発現を調節するいずれかの治療薬は、単位用量形態で薬理許容希釈剤
、担体、または賦形剤と共に投与される。従来の薬理業務はそのような組成物を
患者に投与する適切な処方または組成物を提供するために採用される。静脈内投
与が望ましいけれども、いずれかの適切な投与のルート、例えば非経口、皮下、
筋肉内、頭蓋骨、眼窩内、眼内、室内、包内、骨髄腔内、クモ膜下槽内、腹腔内
、鼻腔内、エアゾルまたは経口投与が採用される。治療処方は液体またはカプセ
ルの形態にある。経口投与では、処方は錠剤またはカプセルの形である。鼻腔処
方では粉体、鼻腔滴またはエアゾルである。
【０１９８】 処方を作成する従来よく知られている方法は、例えばレミントン：薬局の科学
と業務（１９版）．Ａ．Ｒ．ゲネーロ編．１９９５、ペンシルベニア、イースト
ン、マック・パプリッシング・カンパニーで見られる。非経口投与の処方は、例
えば賦形剤、無菌水、食塩水、ポリエチレングリコールなどのポリアルキレング
リコール、植物源の油、または水素添加ナフタレンを含む。生体適合性、生物分
解性ラクチドポリマー、ラクチド／グリコリドコポリマー、またはポリオキシエ
レレン−ポリオキシプロピレンコポリマーは化合物の放出を制御するたに使用さ
れる。本発明の作用薬の他の潜在的に有用な非経口送達システムはエチレンビニ
ルアセテートコポリマー粒子、浸透ポンプ、移植可能注入システム、およびリポ
ソームを含む。吸入の処方は、例えばラクトースなど賦形剤を含み、あるいは例
えばポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル、グリココール酸塩およびデオ
キシコール酸塩などを含む水溶液、あるいは鼻腔用滴の形でまたはゲルとして投
与れる油状溶液である。
【０１９９】 化合物 一般に異常コレステロール水準およびまたはＣＶＤの処置のための新規な薬剤
は従来公知の方法に基づいて天然産物または合成（もしくは半合成）抽出物ある
いは化学ライブラリーの両方の大型ライブラリーから確認される。この分野また
は薬剤発見および開発に熟練した人は、試験抽出物または化合物の正確な源が本
発明のスクリーニング手順にとっては重要でないことを理解するであろう。従っ
て、事実上化学抽出物または化合物のいずれかの数はここに記載された典型的な
方法を使用してスクリーンすることができる。このような抽出物または化合物の
例は、必ずしもそれに限定されないが、植物ベース抽出物、真菌ベース抽出物、
原核ベース抽出物または動物ベース抽出物、発酵肉汁、および合成化合物、同じ
く現存する化合物の修飾物を含む。数多くの方法もまた、必ずしもそれに限定さ
れないが、糖類ベース化合物、糖質ベース化合物、ペプチドベース化合物、およ
び核酸ベース化合物を含むいずれかの数の化学化合物の無作為のまたはそれらに
向けた合成（例えば半合成もしくは全合成）を創り出すのに利用される。合成化
合物ライブラリーは商業的にブランドン・アソシエーツ（ニューハンプシャー．
メリマック）とオルドリッチ・ケミカル（ウイスコンシン、ミルウォーキー）か
ら利用できる。化合物のライブラリーはバイオテックス（英国、サセックス）、
ゼノバ（英国、スラウ）、ハーバー・ブランチ・オーシャングラフィック・イン
スティチュート（フロリダ、フォートピアス）およびファーママー，Ｕ．Ｓ．Ａ
．（マサチューセッツ、ケンブリッジ）を含む数多くの源から商業的に利用でき
る。加えて、天然および合成産出ライブラリーは、もし望ましければ従来公知の
方法に従って、例えば標準抽出および分留方法により産生される。
【０２００】 加えて、薬剤発見と開発の当業者は、複製消失（例えば分類学的複製消失、生
物学的複製消失、および化学的複製消失、またはこれらのいずれかの組合わせ）
の方法が、またはＨＤＬ上昇および抗ＣＶＤ活性で既に公知の物質の複製または
反復の除去が採用できるところではどこでも採用されねばならないことを容易に
理解する。
【０２０１】 粗抽出物がコレステロール調節または抗ＣＶＤ活性あるいはその両方を持つこ
とが発見される時には、更に正の主要な抽出物の分留が観察された作用の原因と
なる化学構成物を単離する必要がある。かくして抽出物、分留、および精製プロ
セスの目標はコレステロール調節活性または抗ＣＶＤ活性を持つ粗抽出物内で化
学成分の注意深い特徴付けと確認である。化合物の混合物での活性の検出に対し
てここに記載された同じ生体内および試験管内検定は活性成分を精製し、その誘
導体を試験するのに使用することができる。このような異種抽出物の分留と精製
は従来公知である。もし望ましければ、病原性の処置のための有用な作用薬であ
ることが示される化合物は従来の技術で公知の方法に従って化学的に修飾される
。治療価値があると確認された化合物は、次いで従来公知の糖尿病または肥満症
のいずれかの標準動物モデルを用いて分析される。
【０２０２】 ＡＢＣ１を調節しまたはＡＢＣ１により調節されるタンパク質の活性を調節す
る化合物はコレステロール水準を調節するための有用な化合物であることが理解
される。典型的な化合物がここに提供されており、他のものは公知のものである
。
【０２０３】 コレステロールに構造的に関連し、またはＡｐｏＡＩあるいは関連するアポリ
ポタンパク質を模擬し、またＡＢＣ１生物活性を高める化合物は本発明のとりわ
け有用な化合物である。ＭＤＲタンパク質に作用するものとして知られる他の化
合物は更にＡＢＣ１生物活性を高めるために使用され誘導体にされその能力を検
定される。典型的なＭＤＲ調節物質はＰＳＣ８３３、ブロモクリプチン、および
シクロスポリンＡである。
【０２０４】 低ＨＤＬ−Ｃを持つ患者のスクリーニング ＡＢＣ１発現、生物活性および突然変異分析はそれぞれ低ＨＤＬの診断用具と
して役立ち得る。かくしてＡＢＣ１遺伝子配列の遺伝的亜類型化の確認は低ＨＤ
Ｌ表現型がＡＢＣ１機能に関係するかどうかを決定するために低ＨＤＬ個体また
は家族を亜類型化するために使用することができる。この診断プロセスはＨＤＬ
増加薬剤の投与に際しての副作用の予測を含む患者の遺伝子型に基づく薬剤処置
の特別仕立て（以下薬理ゲノミクスとして引用）に導くことができる。薬理ゲノ
ミクスは（例えば個体の遺伝子型は特定の作用薬に応答する個体の能力を決定す
るために試験される）個体の遺伝子型に基づく個体の治療または予防処置のため
に作用薬（例えば薬剤）の選択を可能にする。
【０２０５】 ＡＢＣ１生物活性または遺伝子発現に対する刺激または阻害作用を持つ薬剤ま
たは調節物質は、異常ＡＢＣ１活性と関連する疾患（例えば心臓血管症または低
ＨＤＬコレステロール）を処置するために個体に投与することができる。このよ
うな処置と関連して、個体の薬理ゲノミクス（すなわち個体遺伝子型と外部化合
物または薬剤に対する個体の応答との間の関係の研究）が考慮される。治療効果
の差は薬理活性薬剤の用量とその血液濃度の間の関係を変更することで厳しい毒
性と治療失敗に導くことがある。かくして個体の薬理ゲノミクスは個体の遺伝子
型の考慮に基づく予防または治療処置のために効果的な作用薬（例えば薬剤）の
選択を可能にする。このような薬理ゲノミクスは更に適切な用量と治療処方を決
定するのに使用することができる。従って、個体におけるＡＢＣ１タンパク質の
活性、ＡＢＣ１核酸の発現、またはＡＢＣ１遺伝子の突然変異容量はそれにより
個体の治療または予防処置に適切な作用薬を選択するように決定することができ
る。
【０２０６】 薬理ゲノミクスは影響を受ける人での変更された薬剤準備と異常な行為に起因
する薬剤への応答で臨床的に重要な遺伝的変化に対処する（Ｍ．アイケルバウム
、Ｃｈｉｎ．Ｅｘｐ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２３：９８３−９
８５、１９９６；Ｍ．Ｗ．リンダー，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．４３−２５４−２６
６１９９７）。二つの型の薬理遺伝学的条件に分化することができる。それは薬
剤が身体に作用する方法を変更する単一因子として伝達される遺伝条件（変更さ
れた薬剤作用）と、身体が薬剤に作用する方法を変更する単一因子として伝達さ
れる遺伝条件（変更された薬剤代謝）である。変更された薬剤作用はＡＢＣ１の
プロモーター配列、イントロ配列またはエキソン配列内で多型性（たとえば単一
ヌクレオチド多型性すなわちＳＮＰ）を持つ患者に生じる。かくして多型性の存
在と罹患率を決定することにより患者の特定の治療薬に対する応答を予測するこ
とが可能となる。とりわけ、プロモーター領域での多型性はＨＤＬ欠損とＣＶＤ
のリスクを決定するのに重要とする。
【０２０７】 ここで記載されたＡＢＣ１遺伝子どの突然変異に加えて、我々はヒトＡＢＣ１
遺伝子の多型性を検出した（図１１）。これらの多型性はＡＢＣ１のプロモータ
ー、イントロン、およびエキソン配列に位置する。標準方法を例えば直接配列決
定、ＰＣＲ，ＳＳＣＰ，あるいはいずれか他の多型性検出システムを用いて低Ｈ
ＤＬ、心臓血管病、またはいずれか他のＡＢＣ１仲介病状を持つ患者に対する薬
剤処置処方の確定の前に、これらの多型性が患者に存在するかどうかを容易に確
認することができた。これらのいくつかの多型性が事実上弱い多型性であること
もあり得る。このような突然変異を宿している個体は心臓血管症のリスクが高い
。かくしてこれらの多型性も診断決定には有用である。
【０２０８】 ＡＢＣ１遺伝子変異体とＨＤＬ水準または心臓血管病の関連研究 下記の多型性がコレステロール調節と心臓血管病の進行に対する素因に対する
影響について検討された。
【０２０９】 ヌクレオチド−１０４５でのＧのＡとの置換［Ｇ（−１０４５）Ａ］。この変
異体は我々が配列化した個体の−７３８での変異体と完全な連鎖不均衡にあり、
かくして−７３８での変異体に現在帰属するいずれかの潜在的表現型作用は少な
くとも部分的にこの部位で変化することになる。
【０２１０】 ヌクレオチド−７３８でのＧのＡとの置換［Ｇ（−７３８）Ａ］。この変異体
は低ＨＤＬコレステロールまたは早発性冠状動脈症で選択された集団できわめて
高い頻度で発見された。
【０２１１】 位置−４でのＧヌクレオチドの挿入［Ｇｉｎｓ（−４）］。この変異体は非保
菌者よりも保菌者でより少ない冠状動脈症と関連していた。
【０２１２】 ヌクレオチド−５７でのＣのＧとの置換［Ｇ（−５７）Ｃ］。この変異体は我
々が配列化した個体の−４［原文通り］での変異体と完全な連鎖不均衡にあり、
かくして−４での変異体に現在帰属する表現型作用は少なくとも部分的にその部
位で変化することになる。
【０２１３】 ヌクレオチド７３０でのＡのＧとの置換（Ｒ２１９Ｋ）、我々は著しく低い心
臓血管病を持つ保菌者を発見した。
【０２１４】 ヌクレオチド１２７０のＣのＴとの置換（Ｖ３９９Ａ）、フランス系カナダ人
集団内で、この変異体は低ＨＤＬ集団からの個体で発見されただけであった。そ
れはまたオランダ血統の個体の低ＨＤＬまたは早発性冠状動脈病を持つ個体に見
られた。
【０２１５】 ヌクレオチド２３８５でのＡのＧとの置換（Ｖ７７１Ｍ）。この変異体は低Ｈ
ＤＬで選択されたオランダ人集団で高い頻度で、また対照オランダ人集団に比較
した早発性冠状動脈症で選択されたオランダ人集団で高い頻度で発見され、この
変異体の保菌者が減少したＨＤＬと増加した冠状動脈症を持つことを示している
。
【０２１６】 ヌクレオチド２３９４のＣのＡとの置換（Ｔ７７４Ｐ）。この変異体は冠状動
脈症または低ＨＤＬを持つ集団でそれを持たない個体よりも低い頻度で見られた
。
【０２１７】 ヌクレオチド２４０２でのＣのＧとの置換（Ｋ７７６Ｎ）。この変異体は冠状
動脈病集団対類似のオランダ系バックグラウンドの対照集団で著しく低い頻度（
０．５６％対２．９１％，Ｐ＝０．０２）で発見された。
【０２１８】 ヌクレオチド３５９０でのＣのＧとの置換（Ｅ１１７２Ｄ）。この変異体は低
ＡＤＬを持つ個体と早発性冠状動脈病を持ついくつかの集団でより低い頻度で見
られた。
【０２１９】 ヌクレオチド４３８４でのＡのＧとの置換（Ｒ１５８７Ｋ）。この変異体は大
きなオランダ系 状動脈集団のもっとも高いＨＤＬ水準を持つ個体の１／３で減
少した頻度で（Ｐ＝０．０３６）、ＨＤＬコレステロール＜０．９ｍｍｄ／Ｌを
持つ人達で増加した頻度で（Ｐ＜０．００１）、またＨＤＬコレステロール＞１
．４ｍｍｏｌ／Ｌを持つコホートてこの集団（Ｐ＝０．０２）とオランダ系対照
集団（Ｐ＝０．００３）の両方で減少した集団（Ｐ＝０．０２）とオランダ系対
象手段（Ｐ＝０．００３）の両方で減少した頻度で発見された。
【０２２０】 ヌクレオチド５２６６でのＧのＣとの置換（Ｓ１７３１Ｃ）。他の対立遺伝子
にこの変異体を持つ２人のＦＨＡ個体は、他の対立遺伝子にこの変異体を持たな
い家族のＦＨＡ個体（０．６４±０．１４、Ｐ＝０．００９）よりもっと低いＨ
ＤＬコレステロールしか持たない（０．１５５±０．０２５）。この変異体はま
た第８百分位数でＨＤＬを持つ１個の一般集団フランス系カナダ人対照（０．９
２）でまた低ＨＤＬと冠状動脈症から選択された集団からの１人のフランス系カ
ナダ人（０．７２）で発見された。
【０２２１】 ヌクレオチド−１１１３でのＧのＡとの置換［Ａ（−１１１３）Ｇ］。この変
異体はそのＨＤＬ水準で識別される集団で変化する頻度で見られた。
【０２２２】 心臓血管病のリスクの変化またはコレステロール水準の変化と関連する追加の
多型性は以下の通りである。
【０２２３】 ヌクレオチド−２７２３でのＧのＡとの置換（Ｉ８８３Ｍ）。この変異体は早
発性冠状動脈症を持つオランダ系血統の個体でより高い頻度で見られた。
【０２２４】 位置−１１８１どのヌクレオチド（ＣＣＣＴ）の挿入。
【０２２５】 ヌクレオチド−４７９でのＣのＡとの置換（−５１８での連鎖不均衡）。
【０２２６】 ヌクレオチド−３８０でのＧのＡとの置換。
【０２２７】 他の実施例 本発明で言及されたすべての公開文献はあたかも個々の独立した公開文献が結
果的または個別的に引用例で組み込まれることを指示されたように、同じ範囲で
引用例としてここに組み込まれる。
【０２２８】 本発明はこの特異的実施例と関連して記載されてきたが、一方それは更なる修
飾ができることも理解されるであろう。本出願は本発明が関係しこれまでに設定
された基本的特徴に適用される従来の技術内での公知のかつ慣習上の業務内での
本発明の原理に一般に基づきかつ本開示からの逸脱を含むいずれかの変化、用途
、または適用を意図するものである。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】 タンジアー病の２の系統（ＴＤ−１およびＴＤ−２）を示す概
略図。四角と丸の記号はそれぞれ男性と女性を示す。対角線はすべて死亡した個
体の記号として配置される。両対応遺伝子で影付記号はタンジアー病の発端者を
示す。半影記号のある個体は年齢と性で第１０百分位数またはそれ以下のＨＤＬ
−Ｃを持ち、１／４影付き記号は第１１および第２０百分位数を持つ者である。 各個体の識別番号、脂質測定時の年齢、トリグリセリド水準およびＨＤＬコレ
ステロール水準次いで年齢と性の百分位数ランキングが系統記号の株にリストさ
れている。９ｑ３１−１領域に広がる標識は系統の左側に示される。影響を受け
た対立遺伝子は黒棒で表され、それは図３で見られるように分割されたハプロタ
イプ領域の限度の地図化を示す。括弧は推論上の標識データを示し、疑問符は未
知の遺伝子型を示し、大きい矢印は発端者を示す。
【図１Ｂ】 タンジアー病の２の系統（ＴＤ−１およびＴＤ−２）を示す概
略図。四角と丸の記号はそれぞれ男性と女性を示す。対角線はすべて死亡した個
体の記号として配置される。両対応遺伝子で影付記号はタンジアー病の発端者を
示す。半影記号のある個体は年齢と性で第１０百分位数またはそれ以下のＨＤＬ
−Ｃを持ち、１／４影付き記号は第１１および第２０百分位数を持つ者である。 各個体の識別番号、脂質測定時の年齢、トリグリセリド水準およびＨＤＬコレ
ステロール水準次いで年齢と性の百分位数ランキングが系統記号の株にリストさ
れている。９ｑ３１−１領域に広がる標識は系統の左側に示される。影響を受け
た対立遺伝子は黒棒で表され、それは図３で見られるように分割されたハプロタ
イプ領域の限度の地図化を示す。括弧は推論上の標識データを示し、疑問符は未
知の遺伝子型を示し、大きい矢印は発端者を示す。
【図１Ｃ】 対照線維芽細胞でのＡｐｏＡＩ（１０μｓ／ｍＬ）仲介細胞コ
レステロール流出（ｎ＝５、１００％の規準を合わせたのも）およびタンジアー
病（ＴＤ）を持つ２個の被験者を示す図。細胞は成長の間に3Ｈ−コレステロー
ル（０．２μＣｉ／ｍＬ）標識され、成長阻止の間にコレステロール（２０μｇ
／ｍＬ）装荷された。コレステロール流出は3Ｈ培地／（3Ｈ細胞＋3Ｈ培地）で
決定される。
【図２Ａ】 ＦＨＡを持つ４個のフランス系カナダ人の系統（ＦＨＡ−１乃
至ＦＨＡ−４）を示す概略図。表示法は図１の通りである。（家族ＦＨＡ−３と
ＦＨＡ−４に表記されているように）遺伝子型のどちらかの側にある感嘆符は標
識データが潜在的なマイクロサテライト反復増大の故で矛盾しているように見え
る時に使用される。単一薄線になる棒部はハプロタイプが標識で不確かであるこ
とを示唆している。
【図２Ｂ】 ＦＨＡを持つ４個のフランス系カナダ人の系統（ＦＨＡ−１乃
至ＦＨＡ−４）を示す概略図。表示法は図１の通りである。（家族ＦＨＡ−３と
ＦＨＡ−４に表記されているように）遺伝子型のどちらかの側にある感嘆符は標
識データが潜在的なマイクロサテライト反復増大の故で矛盾しているように見え
る時に使用される。単一薄線になる棒部はハプロタイプが標識で不確かであるこ
とを示唆している。
【図２Ｃ】 ＦＨＡを持つ４個のフランス系カナダ人の系統（ＦＨＡ−１乃
至ＦＨＡ−４）を示す概略図。表示法は図１の通りである。（家族ＦＨＡ−３と
ＦＨＡ−４に表記されているように）遺伝子型のどちらかの側にある感嘆符は標
識データが潜在的なマイクロサテライト反復増大の故で矛盾しているように見え
る時に使用される。単一薄線になる棒部はハプロタイプが標識で不確かであるこ
とを示唆している。
【図２Ｄ】 ＦＨＡを持つ４個のフランス系カナダ人の系統（ＦＨＡ−１乃
至ＦＨＡ−４）を示す概略図。表示法は図１の通りである。（家族ＦＨＡ−３と
ＦＨＡ−４に表記されているように）遺伝子型のどちらかの側にある感嘆符は標
識データが潜在的なマイクロサテライト反復増大の故で矛盾しているように見え
る時に使用される。単一薄線になる棒部はハプロタイプが標識で不確かであるこ
とを示唆している。
【図３】 ３５ｃＭに広がる９ｑ３１の遺伝地図と物理的地図を示す概略図
で、９ｑ２２−９ａ３４の領域からのＹＡＣｓが同定され、この領域に広がるＹ
ＡＣコンティーグが構築された。 ３５ｃＭに広がる９ｑ３１の遺伝地図と物理的地図を示す概略図で、全体で２
２個の多型ＣＡマイクロサテライト標識がコンティーグに位置を占めＴＤ−１と
ＴＤ−２のハプロタイプ分析に使用された。 ３５ｃＭに広がる９ｑ３１の遺伝地図と物理的地図を示す概略図で、ＴＤ−１
とＴＤ−２での発端者の変異体にハプロタイプはＴＤ−２でのホモ接合性のかな
りの領域を示し、一方ＴＤ−１の発端者は２個の異なった変異体ハプロタイプを
有している。候補領域は発端者２でＣＡ標識に対するホモ接合性の領域を挟める
ことができる。ＴＤ−１（Ａ）*でのＤ９Ｓ１６９０の重要な交差は遺伝子を含
む領域でセントロメア境界を提供する。この領域で３個の候補遺伝子（ＡＢＣ１
、ＬＰＡ−ＲおよびＲＧＳ−３）が示される。 ３５ｃＭに広がる９ｑ３１の遺伝地図と物理的地図を示す概略図で、ＦＨＡ家
族（Ａ−Ｈ）での減数分型組換えはＤ９Ｓ２７７とＤ９Ｓ１８６６の間の１．２
ｃＭへの最小あいまい領域を精緻化する。ＴＤ−２でホモ接合性の連続領域で終
るＤ９Ｓ１２７でのＴＤ−２発端者のヘテロ接合性は更に１ＣＭ以下に領域を精
緻化する。これはＡＢＣ１が示した領域である。 ３５ｃＭに広がる９ｑ３１の遺伝地図と物理的地図を示す概略図で、単離ＹＡ
Ｃ ＤＮＡと領域からの選択標識が高密度ＢＡＣグリッドフィルターをプローブ
するために使用され、ＳＴＳコンテント地図化を経由して８００Ｋｂコーティン
グを産出したＢＡＣｓを選択した。４個のＢＡＣｓ ＡＢＣ１は高処理法を使用
して配列化された。
【図４Ａ】 家族ＴＤ−１の１の突然変異の配列を示す図。患者III−０１
はｃＤＮＡのヌクレオチド４５０３でＴからＣへのトランジションでヘテロ接合
性である。対照はこの位置でＴに対しホモ接合性である。この突然変異はＡＢＣ
１タンパク質でシスティンからアルギニンへの置換に一致する（Ｃ１４７７Ｒ）
。
【図４Ｂ】 マウスとヒトでの残基１４７７で、但し関連するシーエレガン
ス遺伝子ではないアミノ酸配列保存を示す図。システィンからアルギニンへの同
様の変化は大抵の置換マトリックスでのネガティブ得点により示されるようにタ
ンパク質二次および三次構造に重要な影響を持つ（シューラー他、遺伝子とタン
パク質の分析に関する実務ガイド、Ａ．Ｄ．バクセバンスおよびＢ．Ｆ．Ｆ．ケ
レット編、１４５：１７１，１９８８）。正常および変異体遺伝子のＤＮＡ配列
はそれぞれ前にまたは以下にアミノ酸配列で示される。
【図４Ｃ】 ＴＤ−１でのＴ４５０３Ｃ突然変異の分離を示す図。Ｔ４５０
３Ｃ突然変異の存在は変異体（Ｃ）対立遺伝子（。）のみを切断するＨｇａＩで
の制限酵素消化により検定された。かくして突然変異の不在下で、１９４塩基対
ＰＣＲ産物（−と−の間で増幅されたもの）が観察され、一方その存在下ではＰ
ＣＲ産物は１３４塩基対と６０塩基観察され、一方その存在下ではＰＣＲ産物は
１３４塩基対と６０塩基対の断片に切断される。発端者（個体III．０１）はそ
の娘、父、および父方の３人の従兄弟がそうであったように（１９４塩基対と１
３４塩基対帯の両方で示されたように）この突然変異にヘテロ接合性であると観
察された。４番目の従兄弟と３人の父の兄弟はこの突然変異のキャリヤーではな
かった。
【図４Ｄ】 完全ＡＢＣ１遺伝子に広がるプローブを持つノーザンブロット
分析を示す図。これは期待された８キロベースまでの転写物を明らかにし、加え
て３．５キロベースまでの切形転写物は発端者ＴＤ−１にのみ見られＴＤ２また
は対照では見られなかったことを明らかにした。これはエキソン１−４９（ａ）
、１−４１（ｂ）、１−２２（ｃ）、および２３−２９（ｄ）に広がるプローブ
で検出されたが、エキソン３０−４１（ｅ）またはエキソン４２−４９（ｆ）に
広がるプローブでは検出されなかった。
【図５Ａ】 家族ＴＤ−２での突然変異の配列を示す図。患者ＩＶ−１０は
ｃＤＮＡのヌクレオチド１８６４でＡからＧへのトランジションにホモ接合性で
ある（配列識別番号２）。対照はこの位置でＡにホモ接合性である。この突然変
異体ＡＢＣ１タンパク質でのグルタミンからアルギニンへの置換に一致する（Ｑ
５９７Ｒ）。
【図５Ｂ】 ＴＤ−２発端者で突然変異されるグルタミンアミノ酸を示す図
。グルタミンアミノ酸はヒトおよびマウスＡＢＣ１並びにシーエレガンスからの
ＡＢＣオルソローグに保存され、蠕虫と哺乳類の両方でこのＡＢＣタンパク質の
構造／機能でのこの残基の特異的な重要物を明らかにする。正常および変異体タ
ンパク質のＤＮＡ配列はそれぞれ前記または以下で示される。
【図５Ｃ】 ＴＤ−２でのＡ１８６４Ｇ突然変異の分離を示す図。Ａ１８６
４Ｇ突然変異（＋で示されるもの）の存在はＡｃｉＩでの制限酵素消化で検定さ
れた。３６０塩基ＰＣＲ産物は１個の変異体をＡｃｉＩ認識部位（↓）に持ち、
２番目はＡ１８６４Ｇ突然変異で創られる。野生型対立遺伝子はかくして２１５
塩基対と１４５塩基対に切断され、一方変異体対立遺伝子（Ｇ対立遺伝子）は１
８５塩基対、１４５塩基対、３０塩基対に切断される。血族交配の産物である発
端者（個体ＩＶ−１０）は１８５塩基対と１４５塩基対帯のみの存在で立証され
るようにＡ１８６４Ｇ突然変異（＋／−）にホモ接合性であり、ＤＮＡが試験さ
れた他の４人の家族構成員はこの突然変異のヘテロ接合性キャリアーである（２
１５塩基対と１４５塩基対断片の両方が存在した）。２１５塩基対と１４５塩基
対帯のみを持つ２人の影響を受けない個体（−／−）は比較のために示される。
【図６Ａ】 家族ＦＨＡ−１での突然変異の配列を示す図。患者III−０１
はｃＤＮＡのヌクレオチド２１５１−２１５３を欠失にヘテロ接合性である（配
列識別番号２）。この欠失は欠失後の最初のヌクレオチドで出発する重畳配列と
して検出された。これはＡＢＣ１タンパク質でのロイシン６９３の欠失に一致す
る（配列識別番号１）。
【図６Ｂ】 ヒトとマウスの野生型アミノ酸のアライメントを示す図。これ
はヒトとマウスの配列がＡＬ６９３の近くで同一であることを示している。Ｌ６
９３は同じくシーエレガンスでも保存される。この高度に保存された残基は予想
される膜貫通ドメイン内にある。正常のおよび変異体タンパク質はそれぞれ前記
および以下のアミノ酸配列で示される。
【図６Ｃ】 ＥａｒＩ制限消化で検定ＦＨＡ−１でのΔＬ突然変異の分離を
示す図。２個の内変異体ＥａｒＩ制御部位（↓で示されたもの）が水平矢印（→
←）の間に位置する２９７塩基対ＰＣＲ産物に存在し、一方第３部位は野生型対
立遺伝子のみに存在する。変異体対立遺伝子の存在はかくして２１０塩基対断片
（＋）の存在により識別され、一方正常体対立遺伝子は１５１塩基対帯両方の存
在で示されるようにこの突然変異にヘテロ接合性である。
【図６Ｄ】 家族ＦＨＡ−３での突然変異の配列を示す図。患者III−０１
はｃＤＮＡのヌクレオチド５７５２−５７５７の欠失にヘテロ接合性である（配
列識別番号２）。この欠失は欠失後の最初のヌクレオチドで出発する重畳配列と
して検出された。これはＡＢＣ１タンパク質でのグルタミン酸１８９３とアスパ
ラギン酸１８９４の欠失に一致する（配列識別番号１）。
【図６Ｅ】 ヒトとマウスの野生型アミノ酸配列のアライメントを示す図。
これはヒトとマウスの配列がΔ５７５２−５７５７の近くで同一であることを示
している。この領域はシーエレガンスで高度に保存される。正常体および変異体
タンパク質のＤＮＡ配列はそれぞれ前記および以下のアミノ酸配列で示される。
【図６Ｆ】 家族ＦＨＡ−２での突然変異の配列を示す図。患者III−０１
はｃＤＮＡのヌクレオチド６５０４でＣからＴへのトラージションにヘテロ接合
性であった（配列識別番号２）。この変更は配列識別番号１の位置２１４４でア
ルギニンをＳＴＯＰコドンに変換し、ＡＢＣ１タンパク質の最後の１１８アミノ
酸を切形にする。
【図７Ａ】 ＡＢＣ１アンチセンスオリゴヌクレオチドで処置したヒト皮膚
線維芽細胞からのコレステロール流出を示す図。対照被験者からの線維芽細胞は
４８時間成長の間に3Ｈコレステロール（０．２μＣｉ／ｍＬ）標識され、５０
０ｎＭ ＡＢＣ１アンチセンスＡＮ−１（５′-GCA GAG GGC ATG GCT TTA TTT G
-3 ′；配列識別番号３）でリポフェクチン７．５μｇと共に４時間形質移入された
。形質移入の後、細胞は１２時間コレステロール装荷され（２０μｇ／ｍＬ）、
６時間平衡状態に置かれた。細胞は次いで前記ＲＮＡを収穫され、１０μｇはノ
ーザンブロック分析に使用された。コレステロール流出実験はここで記載された
ように行われた。ＡＮ−１はＡＢＣ１ ＲＮＡ転写物水準で予想された減少を生
じたオリゴヌクレオチドであった。
【図７Ｂ】 ＡＢＣ１アンチセンスオリゴヌクレオチドで処置したヒト皮膚
線維芽細胞からのコレステロール流出を示す図。対照被験者からの線維芽細胞は
４８時間成長の間に3Ｈコレステロール（０．２μＣｉ／ｍＬ）標識され、５０
０ｎＭ ＡＢＣ１アンチセンスＡＮ−１（５′-GCA GAG GGC ATG GCT TTA TTT G
-3 ′；配列識別番号３）でリポフェクチン７．５μｇと共に４時間形質移入された
。形質移入の後、細胞は１２時間コレステロール装荷され（２０μｇ／ｍＬ）、
６時間平衡状態に置かれた。細胞は次いで前記ＲＮＡを収穫され、１０μｇはノ
ーザンブロック分析に使用された。コレステロール流出実験はここで記載された
ように行われた。二重アンチセンス形質移入法が使用された。この方法では細胞
は前記のように標識され形質移入され、２０時間で回収され、２４時間コレステ
ロール装荷され、次いでＡＮ−１で再形質移入された。第２形質移入の２０時間
後、コレステロール流出が測定された。ＡＢＣ１転写物 での５０％までの減
少は野生型とＴＤ線維芽細胞での間に見られるコレストロール流出中間体の著し
い減少と関連していた。
【図７Ｃ】 アミノ末端６０アミノ酸コード化する領域に向けてアンチセン
スオリゴヌクレオチドで処置されたヒト皮膚線維芽細胞からのコレステロール流
出を示す図。これまで認識されない翻訳開始部位に向けられていたアンチセンス
オリゴヌクレオチドＡＮ−６が細胞コレステロール流出の著しい減少をもたらす
ことは注目される。
【図８】 タンジアー病とＦＨＡのＡＢＣ１の予熱されたトポロジー、突然
変異、および多型性を示す概略図。２個の膜貫通ＡＴＰ結合ドメインが指示され
る。突然変異の位置はアミノ酸変化の矢印で示され、これはヒトＡＢＣ１ ｃＤ
ＮＡから予言される。これらの突然変異はＡＢＣ１タンパク質の異なる領域で生
じる。
【図９Ａ】 ヒトＡＢＣ１タンパク質のアミノ酸配列を示す図（配列識別番
号１）。
【図９Ｂ】 ヒトＡＢＣ１ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列を示す図（配列識
別番号２）。
【図９Ｃ】 ヒトＡＢＣ１ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列を示す図（配列識
別番号２）。
【図９Ｄ】 ヒトＡＢＣ１ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列を示す図（配列識
別番号２）。
【図９Ｅ】 ヒトＡＢＣ１ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列を示す図（配列識
別番号２）。
【図１０】 指示されたＡＢＣ１エキソンの増幅のためにそれぞれ５′と３
′ＰＣＲプライマーとしての使用に適した５′と３′ヌクレオチド配列を示す図
【図１１−１】 配列化誤り、突然変異、および多型性を含むＡＢＣ１で発
見された変更の概要を示す図
【図１１−２】 配列化誤り、突然変異、および多型性を含むＡＢＣ１で発
見された変更の概要を示す図
【図１２−１】 ＡＢＣ１プロモーターを含むゲノムコンティーング（配列
識別番号１４−２９）のシリーズ、並びにＡＢＣ１のエキソン１−４９（および
フランキングイントロン配列）を示す図。エキソン（大文字表示）はコンティー
グで以下の通り発見される： 配列識別番号１４……エキソン１；配列識別番号１５……エキソン２；配列識別
番号１６……エキソン３；配列識別番号１７……エキソン４；配列識別番号１８
……エキソン５；配列識別番号１９……エキソン６；配列識別番号２０……エキ
ソン７と８；配列識別番号２１……エキソン９乃至２２；配列識別番号２２……
エキソン２３乃至２８；配列識別番号２３……エキソン２９；配列識別番号２４
……エキソン３０と３１；配列識別番号２５……エキソン３２；配列識別番号２
６……エキソン３３乃至３６；配列識別番号２７……エキソン３７乃至４１；配
列識別番号２８……エキソン４２乃至４５；配列識別番号２９……エキソン４６
乃至４９。
【図１２−２】 図１２−１の説明と同じ
【図１２−３】 図１２−１の説明と同じ
【図１２−４】 図１２−１の説明と同じ
【図１２−５】 図１２−１の説明と同じ
【図１２−６】 図１２−１の説明と同じ
【図１２−７】 図１２−１の説明と同じ
【図１２−８】 図１２−１の説明と同じ
【図１２−９】 図１２−１の説明と同じ
【図１２−１０】 図１２−１の説明と同じ
【図１２−１１】 図１２−１の説明と同じ
【図１２−１２】 図１２−１の説明と同じ
【図１２−１３】 図１２−１の説明と同じ
【図１２−１４】 図１２−１の説明と同じ
【図１２−１５】 図１２−１の説明と同じ
【図１２−１６】 図１２−１の説明と同じ
【図１２−１７】 図１２−１の説明と同じ
【図１２−１８】 図１２−１の説明と同じ
【図１２−１９】 図１２−１の説明と同じ
【図１２−２０】 図１２−１の説明と同じ
【図１２−２１】 図１２−１の説明と同じ
【図１２−２２】 図１２−１の説明と同じ
【図１２−２３】 図１２−１の説明と同じ
【図１２−２４】 図１２−１の説明と同じ
【図１２−２５】 図１２−１の説明と同じ
【図１２−２６】 図１２−１の説明と同じ
【図１２−２７】 図１２−１の説明と同じ
【図１２−２８】 図１２−１の説明と同じ
【図１２−２９】 図１２−１の説明と同じ
【図１２−３０】 図１２−１の説明と同じ
【図１２−３１】 図１２−１の説明と同じ
【図１２−３２】 図１２−１の説明と同じ
【図１３】 ＡＢＣ１のアミノ末端６０アミノ酸領域がタンパク質コーディ
ングであることを示す一連の図。正常ヒト線維芽細胞のライゼートはヒトＡＢＣ
１のアミノ酸１−２０に対するラビックポリクローナル抗体（１）；ヒトＡＢＣ
１のアミノ酸１４３４−１４４９に対するラビットクローナル抗体（２）；およ
びヒトＡＢＣ１のアミノ酸２２３６−２２５９に対するマウスモノクローナル抗
体で平行に免疫ブロットされた。レーン２で検出された帯は抗体の特異性の欠除
またはＡＢＣ１の分解産物の存在によるものである。
【図１４】 ＷＨＡＭニワトリが非保存置換（Ｇ２６５Ａ）を含みアミノ酸
変化（Ｅ８９Ｋ）を起こすことを示す概略図
【図１５】 ＷＨＡＭニワトリでの突然変異がヒト、マウス、およびニワト
リで保存されるアミノ酸においてのものであることを示す概略図
【図１６−１】 ヒトＡＢＣ１プロモーターでのコンセンサス転写因子結合
部位の位置の概略を示す図（配列識別番号１４のヌクレオチド１−８２３８）。
略語は以下のとおり：ＰＰＲＥ＝ペルオキシソーム増殖因子活性受容体。ＳＲＥ
＝ステロイド応答要素結合タンパク質部位。ＲＯＲ＝ＲＡＲ関連オーファン受容
体。
【図１６−２】 ヒトＡＢＣ１プロモーターでのコンセンサス転写因子結合
部位の位置の概略を示す図（配列識別番号１４のヌクレオチド１−８２３８）。
略語は以下のとおり：ＰＰＲＥ＝ペルオキシソーム増殖因子活性受容体。ＳＲＥ
＝ステロイド応答要素結合タンパク質部位。ＲＯＲ＝ＲＡＲ関連オーファン受容
体。
【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書
【提出日】平成１３年４月２３日（２００１．４．２３）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 48/00 Ａ６１Ｐ 9/10 １０１ ４Ｃ０８７ Ａ６１Ｐ 3/00 25/00 ４Ｈ０４５ 9/10 １０１ 25/14 25/00 25/28 25/14 35/00 25/28 Ｃ０７Ｋ 14/47 35/00 Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｃ０７Ｋ 14/47 1/68 Ａ Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ Ｃ１２Ｑ 1/02 33/50 Ｚ 1/68 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｇ０１Ｎ 33/15 5/00 Ｂ 33/50 Ａ６１Ｋ 37/02 (31)優先権主張番号 ６０／１３９，６００ (32)優先日 平成11年６月17日(1999．6．17) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ６０／１５１，９７７ (32)優先日 平成11年９月１日(1999．9．1) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｒ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ， ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，Ｋ Ｒ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ， ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，Ｓ Ｉ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ヘイドン，マイケル，アール． カナダ，ヴィー６アール １ダブリュ９ ブリティッシュ コロンビア，バンクーバ ー，ウェスト セブンス アベニュー 4484 (72)発明者 ブルックス−ウイルソン，アンジェラ，ア ール． カナダ，ヴィー７シー ４ビー２ ブリテ ィッシュ コロンビア，リッチモンド，ラ ングトン ロード 7100 (72)発明者 ピムストーン，サイモン，エヌ． カナダ，ヴィー６ティー １シー５ ブリ ティッシュ コロンビア，バンクーバー， ウエスト シックスス アベニュー 4746 Ｆターム(参考） 2G045 AA34 AA35 DA13 DA36 FB02 FB07 4B024 AA01 AA11 BA80 CA04 DA02 EA02 FA02 GA11 HA11 HA12 HA15 4B063 QA19 QQ08 QQ43 QR08 QR36 QR42 QR56 QS25 QS34 QX02 4B065 AA90X AA93Y AB01 BA02 CA24 CA44 CA46 4C084 AA02 AA03 AA06 AA07 AA13 AA17 BA01 BA14 BA15 BA16 BA17 BA18 BA19 BA20 BA21 BA22 CA53 NA14 ZA022 ZA162 ZA452 ZA512 ZB262 ZC332 4C087 AA01 AA02 AA03 BC83 CA12 NA14 ZA02 ZA16 ZA45 ZA51 ZB26 ZC33 4H045 AA10 AA30 BA10 CA40 EA23 EA50 FA74

Claims (86)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 ＡＢＣ１生物活性を持つことを特徴とする一つの事実上純粋
    なＡＢＣ１ポリペプチド。
  2. 【請求項２】 前記ＡＢＣ１ポリペプチドがヒトＡＢＣ１ポリペプチドであ
    ることを特徴とする請求項１記載の事実上純粋なＡＢＣ１ポリペプチド。
  3. 【請求項３】 前記ポリペプチドが配列識別番号１のアミノ酸１乃至６０を
    含むことを特徴とする事実上純粋なＡＢＣ１ポリペプチド。
  4. 【請求項４】 前記ポリペプチドが配列識別番号１のアミノ酸６１乃至２２
    ６１を含むことを特徴とする事実上純粋なＡＢＣ１ポリペプチド。
  5. 【請求項５】 前記ポリペプチドが配列識別番号１のアミノ酸１乃至２２６
    １を含むことを特徴とする事実上純粋なＡＢＣ１ポリペプチド。
  6. 【請求項６】 配列識別番号１のアミノ酸１乃至６０を含むことを特徴とす
    る一つの事実上純粋なＡＢＣ１ポリペプチド。
  7. 【請求項７】 配列識別番号１のアミノ酸６１乃至２２６１を含むことを特
    徴とする一つの事実上純粋なＡＢＣ１ポリペプチド。
  8. 【請求項８】 配列識別番号１のアミノ酸１乃至２２６１を含むことを特徴
    とする一つの事実上純粋なＡＢＣ１ポリペプチド。
  9. 【請求項９】 配列識別番号２のヌクレオチド７５乃至２５４に高い緊縮条
    件でハイブリッド形成しＡＢＣ１生物活性を持つポリペプチドをコード化するこ
    とを特徴とする一つの事実上純粋な核酸分子。
  10. 【請求項１０】 ＡＢＣ１生物活性を持つＡＢＣ１ポリペプチドをコード化
    することを特徴とする一つの事実上純粋な核酸分子。
  11. 【請求項１１】 前記核酸分子が配列識別番号２のヌクレオチド７５乃至２
    ５４を含むことを特徴とする請求項９または１０記載の事実上純粋な核酸分子。
  12. 【請求項１２】 前記核酸分子が配列識別番号２のヌクレオチド２５５乃至
    ６８５７を含むことを特徴とする請求項９または１０記載の事実上純粋な核酸分
    子。
  13. 【請求項１３】 前記核酸分子が配列識別番号２のヌクレオチド７５乃至６
    ８５７を含むことを特徴とする請求項９または１０記載の事実上純粋な核酸分子
    。
  14. 【請求項１４】 請求項９記載の核酸分子を含むことを特徴とする一つの発
    現ベクター。
  15. 【請求項１５】 請求項９記載の核酸分子を発現する一つの細胞。
  16. 【請求項１６】 請求項９記載の核酸分子を発現する一つの非ヒト哺乳類。
  17. 【請求項１７】 配列識別番号２のヌクレオチド７５乃至２５４を含むこと
    を特徴とする一つの事実上純粋な核酸分子。
  18. 【請求項１８】 配列識別番号２のヌクレオチド２５５乃至６８５７を含む
    ことを特徴とする一つの事実上純粋な核酸分子。
  19. 【請求項１９】 配列識別番号２のヌクレオチド７５乃至６８５７を含むこ
    とを特徴とする一つの事実上純粋な核酸分子。
  20. 【請求項２０】 配列識別番号２のヌクレオチド７０１５−７８６０に一致
    する少なくとも３０個の連続ヌクレオチドを含むことを特徴とする一つの事実上
    純粋な核酸分子。
  21. 【請求項２１】 前記核酸分子が配列識別番号２のヌクレオチド７０１５−
    ７８６０を含むことを特徴とする請求項２０記載の事実上純粋な核酸分子。
  22. 【請求項２２】 配列識別番号２のヌクレオチド７０１５−７８６０を含む
    プローブに高い緊縮でハイブリッド形成することを特徴とする一つの事実上純粋
    な核酸分子。
  23. 【請求項２３】 低ＨＤＬコレステロールまたは心臓血管病を持つヒトを処
    置する一つの方法であって、前記方法が前記ヒトにＡＢＣ１ポリペプチド、また
    はそのコレステロール調節断片を投与することを特徴とする一つの方法。
  24. 【請求項２４】 請求項２３記載の方法であって、ここで前記ＡＢＣ１ポリ
    ペプチドが配列識別番号１を持つことを特徴とする方法。
  25. 【請求項２５】 請求項２３記載の方法であって、ここで前記ＡＢＣ１ポリ
    ペプチドがその安定性を増加する突然変異を含むことを特徴とする方法。
  26. 【請求項２６】 請求項２３記載の方法であって、ここで前記ＡＢＣ１ポリ
    ペプチドがその生物活性を増加する突然変異を含むことを特徴とする方法。
  27. 【請求項２７】 低ＨＤＬコレステロールまたは心臓血管病を持つヒトを処
    置する一つの方法であって、前記方法がＡＢＣ１ポリペプチド、またはそのコレ
    ステロール調節断片をコード化する核酸分子を前記ヒトに投与することを特徴と
    する方法。
  28. 【請求項２８】 請求項２７記載の方法であって、ここで前記ＡＢＣ１ポリ
    ペプチドが配列識別番号１のアミノ酸配列を持つことを特徴とする方法。
  29. 【請求項２９】 請求項２７記載の方法であって、ここで前記ＡＢＣ１ポリ
    ペプチドがその安定性を増加する突然変異を含むことを特徴とする方法。
  30. 【請求項３０】 請求項２７記載の方法であって、ここで前記ＡＢＣ１ポリ
    ペプチドがその生物活性を増加する突然変異を含むことを特徴とする方法。
  31. 【請求項３１】 請求項３０記載の方法であって、ここで前記生物活性がコ
    レステロールの調節であることを特徴とする方法。
  32. 【請求項３２】 請求項２７記載の方法であって、ここで前記ヒトが健常者
    と比較して低ＨＤＬコレステロール水準を持つことを特徴とする方法。
  33. 【請求項３３】 ヒトのＡＢＣ１生物活性を増加する一つの方法であって、
    前記方法が配列識別番号２のヌクレオチド７５乃至２５４に高い緊縮条件でハイ
    ブリッド形成し、またＡＢＣ１生物活性を持つポリペプチドをコード化する核酸
    分子を前記ヒトに投与することを含むことを特徴とする方法。
  34. 【請求項３４】 請求項３３記載の方法であって、ここで前記ヒトがアルツ
    ハイマー病，ニーマン−ピック病，ハンティングトン舞踏病、Ｘ連鎖副腎脳白質
    ジストロフィー、および癌より成るグループから選択される疾病を持つことを特
    徴とする方法。
  35. 【請求項３５】 ヒトの中でＡＢＣ１生物活性を増加する一つの方法であっ
    て、前記方法がＡＢＣ１生物活性を増加する化合物を前記ヒトに投与することを
    含むことを特徴とする方法。
  36. 【請求項３６】 請求項３５記載の方法であって、ここで前記ヒトがアルツ
    ハイマー病，ニーマン−ピック病，ハンティングトン舞踏病、Ｘ連鎖副腎脳白質
    ジストロフィー、および癌より成るグループから選択される一つの疾病を持つこ
    とを特徴とする方法。
  37. 【請求項３７】 ヒトの中で心臓血管病を予防する一つの方法であって、前
    記方法がプロモーターに操作可能に連結されるＡＢＣ１核酸分子を含む発現ベク
    ターを前記ヒトに投与することを含み、前記ＡＢＣ１核酸分子がＡＢＣ１生物活
    性を持つＡＢＣ１ポリペプチドをコード化することを特徴とする方法。
  38. 【請求項３８】 ヒトの中でＡＢＣ１遺伝子内の疾病要因突然変異の作用を
    予防しまた改善する一つの方法であって、前記方法がＡＢＣ１生物活性を持つＡ
    ＢＣ１ポリペプチドをコード化するＡＢＣ１核酸分子に操作可能に連結されるプ
    ロモーターを含む発現ベクターを前記ヒトに導入することを含むことを特徴とす
    る方法。
  39. 【請求項３９】 動物の中で心臓血管病を処置しまたは予防する一つの方法
    であって、前記方法が野生型ＡＢＣ１の活性をまねる化合物を前記動物に投与す
    ることを特徴とする方法。
  40. 【請求項４０】 請求項３９記載の方法であって、ここで前記動物がヒトで
    あることを特徴とする方法。
  41. 【請求項４１】 動物の中で心臓血管病を処置しまたは予防する一つの方法
    であって、前記方法がＡＢＣ１の生物活性を調節する化合物を前記動物に投与る
    ことを特徴とする方法。
  42. 【請求項４２】 請求項４１記載の方法であって、ここで前記動物がヒトで
    あることを特徴する方法。
  43. 【請求項４３】 請求項４１記載の方法であって、ここで前記化合物がプロ
    テインキナーゼＡ、プロテインキナーゼＣ、バナジン酸塩、オカダ酸、ＩＢＭＸ
    １、フィブレート、β−エストラジオール、アラキドン酸誘導体、ＷＹ−１４，
    ６４３、ＬＴＢ４、８（ｓ）ＨＥＴＥ、チオゾリジンディオン、抗糖尿病薬、９
    −ＨＯＤＥ、１３−ＨＯＤＥ、ニコチン酸、ＨＭＧ ＣｏＡ還元酵素阻害剤、お
    よびＰＰＡＲ仲介ＡＢＣ１発現を増加する化合物より成るグループから選択され
    ることを特徴する方法。
  44. 【請求項４４】 請求項２３，２７，３９，または４１記載の方法であって
    、ここで前記心臓血管病が冠状動脈病、脳血管症、冠状動脈再狭窄、または末梢
    血管病であることを特徴とする方法。
  45. 【請求項４５】 候補化合物がコレステロール水準を調節するのに有用であ
    るかどうかを決定する一つの方法であって、前記方法が （ａ）ＡＢＣ１遺伝子の中で突然変異を含むニワトリを提供し、 （ｂ）前記候補化合物を前記ニワトリに投与し、また （ｃ）前記ニワトリ内でのＡＢＣ１生物活性を測定する ステップを含み、ここで前記化合物に接触されないＷＨＡＭニワトリに対比した
    変性ＡＢＣ１生物活性は、前記候補化合物がコレステロール水準を調節すること
    を示すことを特徴とする方法。
  46. 【請求項４６】 請求項４５記載の方法であって、ここで前記ＡＢＣ１生物
    活性がコレステロールの輸送であることを特徴とする方法。
  47. 【請求項４７】 候補化合物がＡＢＣ１生物活性を調節するかどうかを決定
    する一つの方法であって、前記方法が （ａ）配列識別番号１のアミノ酸１乃至６０を含むＡＢＣ１ポリペプチドを発
    現する細胞を提供し、 （ｂ）前記細胞を前記候補化合物に接触し、また （ｃ）前記細胞のＡＢＣ１生物活性を測定する ステップを含み、ここで前記化合物に接触されな細胞に対比した変性ＡＢＣ１生
    物活性は、前記化合物がＡＢＣ１生物活性を調節することを特徴とする方法。
  48. 【請求項４８】 候補化合物がＡＢＣ１発現を調節するかどうかを決定する
    一つの方法であって、前記方法が （ａ）配列識別番号２のヌクレオチド７５乃至２５４を含むＡＢＣ１遺伝子を
    発現する細胞を提供し、 （ｂ）前記細胞を前記候補化合物に接触し、また （ｃ）前記細胞のＡＢＣ１発現を測定する ステップを含み、ここで前記化合物に接触されない細胞に対比した変性ＡＢＣ１
    発現は、前記候補化合物がＡＢＣ１発現を調節することを示すことを特徴とする
    方法。
  49. 【請求項４９】 候補化合物がＡＢＣ１発現を調節するかどうかを決定する
    一つの方法であって、前記方法は （ａ）レポーター遺伝子と操作可能に連結されるＡＢＣ１プロモーターを含む
    核酸分子を提供し、 （ｂ）前記核酸分子を前記候補化合物に接触し、また （ｃ）前記レポーター遺伝子の発現を測定する ステップを含み、ここで前記化合物に接触されない対照に対比した変性レポータ
    ー遺伝子発現は、前記候補遺伝子がＡＢＣ１発現を調節することを示すことを特
    徴とする方法。
  50. 【請求項５０】 請求項４９記載の方法であって、ここで前記プロモーター
    が配列識別番号１４のヌクレオチド１乃至８２３８から選択される５０個の連続
    ヌクレオチドを含むことを特徴する方法。
  51. 【請求項５１】 請求項５０記載の方法であって、ここで前記プロモーター
    がステロイド応答要素結合タンパク質、ペルオキシソーム増殖活性レセプター、
    レチノイドＸレセプター、およびＲＡＲ関連オーファンレセプターよりなるグル
    ープから選択される転写因子のための結合部位を含むことを特徴とする方法。
  52. 【請求項５２】 候補化合物がＡＢＣ１生物活性を調節するかどうかを決定
    する一つの方法であって、前記方法が、 （ａ）配列識別番号１のアミノ酸１乃至６０を含むＡＢＣ１ポリペプチドを提
    供し、 （ｂ）前記ポリペプチドを前記候補化合物と接触し、また （ｃ）ＡＢＣ１活性を測定する ステップを含み、ここで前記化合物に接触されない対照と対比したＡＢＣ１活性
    での変化は、前記候補化合物がＡＢＣ１生物活性を調節することを示すことを特
    徴とする方法。
  53. 【請求項５３】 候補化合物がＡＢＣ１発現を調節するかどうかを決定する
    一つの方法であって、前記方法が、 （ａ）配列識別番号１のアミノ酸１乃至６０を含むＡＢＣ１ポリペプチドを提
    供し、 （ｂ）前記ポリペプチドを前記候補化合物と接触し、また （ｃ）前記ＡＢＣ１ポリペプチドの発現を測定する ステップを含み、ここで前記化合物に接触されない対照と対比したＡＢＣ１ポリ
    ペプチドでの発現の変化は、前記候補化合物がＡＢＣ１発現を調節することを示
    すことを特徴とする方法。
  54. 【請求項５４】 候補化合物がＡＢＣ１生物活性を調節するかどうかを決定
    する一つの方法であって、前記方法が、 （ａ）配列識別番号１のアミノ酸１乃至６０を含むＡＢＣ１ポリペプチドを提
    供し、 （ｂ）前記ポリペプチドを前記候補化合物と接触し、また （ｃ）前記候補化合物に対する前記ＡＢＣ１ポリペプチドの結合を測定する ステップを含み、ここで前記化合物に対する前記ＡＢＣ１ポリペプチドの結合は
    、前記候補化合物がＡＢＣ１生物活性を調節することを示すことを特徴とする方
    法。
  55. 【請求項５５】 候補化合物がＡＢＣ１生物活性を調節するかどうかを決定
    する一つの方法であって、前記方法が、 （ａ）（ｉ）配列識別番号１のアミノ酸１乃至６０を含むＡＢＣ１ポリペプチ
    ド、および（ｉｉ）前記ＡＢＣ１ポリペプチドと相互作用する第２ポリペプチド
    を提供し、 （ｂ）前記ポリペプチドを前記候補化合物と接触し、また （ｃ）前記ＡＢＣ１ポリペプチドの前記第２ポリペプチドとの相互作用を測定
    する ステップを含み、ここで前記ＡＢＣ１ポリペプチドの前記第２ポリペプチドとの
    相互作用での変更は、前記候補化合物がＡＢＣ１生物活性を調節することを示す
    ことを特徴とする方法。
  56. 【請求項５６】 候補化合物がＡＢＣ１の安定性を増加しまたはその調節さ
    れた異化作用を減少させるかどうかを決定する一つの方法であって、前記方法が
    、 （ａ）配列識別番号１のアミノ酸１乃至６０を含むＡＢＣ１ポリペプチドを含
    む細胞を提供し、 （ｂ）前記細胞を前記候補化合物と接触し、また （ｃ）前記ＡＢＣ１ポリペプチドの半減期を測定する ステップを含み、ここで前記化合物と接触されない対照に対比した前記半減期で
    の増加は、前記候補化合物がＡＢＣ１ポリペプチドの安定性を増加しまたはその
    調節された異化作用を減少させることを示すことを特徴とする方法。
  57. 【請求項５７】 候補化合物がＡＢＣ１生物活性を調節するかどうかを決定
    する一つの方法であって、前記方法が （ａ）脂質膜（人工膜）にＡＢＣ１ポリペプチドを提供し、 （ｂ）前記ポリペプチドを前記候補化合物に接触し、また （ｃ）前記脂質膜を経由するＡＢＣ１仲介脂質輸送を測定する ステップを含み、ここで前記化合物に接触されない対照に対比した脂質輸送での
    変化は、前記候補化合物がＡＢＣ１生物活性を調節することを示すことを特徴と
    する方法。
  58. 【請求項５８】 請求項４９，５２，５３，５４，５５、または５７記載の
    方法であって、ここで前記ＡＢＣ１ポリペプチドが無細胞系であることを特徴と
    する方法。
  59. 【請求項５９】 請求項４９，５２，５３，５４，５５、または５７記載の
    方法であって、ここで前記ＡＢＣ１ポリペプチドが細胞内にあることを特徴とす
    る方法。
  60. 【請求項６０】 請求項５９記載の方法であって、ここで前記細胞がＷＨＡ
    Ｍニワトリからのものであることを特徴とする方法。
  61. 【請求項６１】 請求項５９記載の方法であって、ここで前記細胞がヒトま
    たは非ヒト哺乳類にあることを特徴とする方法。
  62. 【請求項６２】 請求項６１記載の方法であって、ここで前記動物がＷＨＡ
    Ｍニワトリであることを特徴とする方法。
  63. 【請求項６３】 請求項５２記載の方法であって、ここで前記生物活性が脂
    質またはインターロイキン−１の輸送であることを特徴とする方法。
  64. 【請求項６４】 請求項６２記載の方法であって、ここで前記脂質がコレス
    テロールであることを特徴とする方法。
  65. 【請求項６５】 請求項６４記載の方法であって、ここで前記コレステロー
    ルがＨＤＬ−コレステロールであることを特徴とする方法。
  66. 【請求項６６】 請求項５２記載の方法であって、ここで前記生物活性がＡ
    ＢＣ１ポリペプチドによるＡＴＰの結合または加水分解であることを特徴とする
    方法。
  67. 【請求項６７】 患者が心臓血管病のリスクの増加を持つかどうかを決定す
    る一つの方法であって、前記方法は前記患者のＡＢＣ１遺伝子が突然変異である
    かどうかを決定することを含み、ここで突然変異は前記患者が心臓血管病のリス
    クの増加を持つことを示すことを特徴とする方法。
  68. 【請求項６８】 患者が心臓血管病のリスクの増加を持つかどうかを決定す
    る一つの方法であって、前記方法は前記患者のまたは前記患者の細胞のＡＢＣ１
    生物活性を測定することを含み、ここで正常水準に対比した前記ＡＢＣ１生物活
    性の水準の増加または減少は、前記患者が心臓血管病のリスクの増加を持つこと
    を示すことを特徴とする方法。
  69. 【請求項６９】 患者が心臓血管病のリスクの増加を持つかどうかを決定す
    る一つの方法であって、前記方法は前記患者のまたは前記患者の細胞のＡＢＣ１
    発現を測定することを含み、ここで正常水準に対比した前記ＡＢＣ１発現の水準
    の減少は、前記患者が心臓血管病のリスクの増加を持つことを示すこと特徴とす
    る方法。
  70. 【請求項７０】 請求項６９記載の方法であって、ここで前記ＡＢＣ１発現
    がＡＢＣ１ポリペプチドの水準を測定することにより決定されることを特徴とす
    る方法。
  71. 【請求項７１】 請求項６９記載の方法であって、ここで前記ＡＢＣ１発現
    がＡＢＣ１ ＲＮＡの水準を測定することにより決定されることを特徴とする方
    法。
  72. 【請求項７２】 優性ネガティブＡＢＣ１ポリペプチドをコード化する核酸
    分子を含む導入遺伝子を含むことを特徴とする一つの非ヒト哺乳類。
  73. 【請求項７３】 生物活性を持つＡＢＣ１ポリペプチドをコード化する核酸
    分子を含む導入遺伝子を含むことを特徴とする一つの非ヒト哺乳類から単離され
    たことを特徴とする一つの細胞。
  74. 【請求項７４】 候補化合物が優性ネガティブＡＢＣ１ポリペプチドの阻害
    を減少させるかどうかを決定する一つの方法であって、前記方法は （ａ）優性ネガティブＡＢＣ１ポリペプチドを発現する細胞を提供し、 （ｂ）前記細胞を前記候補化合物に接触し、また （ｃ）前記細胞のＡＢＣ１生物活性を測定する ステップを含み、ここで前記化合物に接触されない細胞に対比した前記ＡＢＣ１
    生物活性での増加は、前記候補化合物が優性ネガティブＡＢＣ１ポリペプチドの
    阻害を減少させることを示すことを特徴とする方法。
  75. 【請求項７５】 多型性に対するヒトのＡＢＣ１遺伝子を試験することを含
    む心臓血管病を成長する変更されたリスクをヒトが持つかどうかを決定する一つ
    の方法であって、ここで心臓血管病と関連する多型性の存在は、ヒトが心臓血管
    病を成長させるための変更されたリスクを持つことを示すことを特徴とする方法
    。
  76. 【請求項７６】 ヒトの薬剤に対する応答を変更するＡＢＣ１遺伝子にヒト
    が多型性を持つかどうかを決定することを含むことを特徴とする前記薬剤に対す
    るヒトの応答を予測する一つの方法。
  77. 【請求項７７】 ヒトの薬剤に対する応答を変更するＡＢＣ１プロモーター
    にヒトが多型性を持つかどうかを決定することを含むことを特徴とする前記薬剤
    にするヒトの応答を予測する一つの方法。
  78. 【請求項７８】 細胞内でのＡＢＣ１発現を変更する一つの方法であって、
    前記方法が前記細胞を、フィブレート、β−エストラジオール、アラキドン酸誘
    導体、ＷＹ−１４，６４３、ＬＴＢ４、８（ｓ）ＨＥＴＥ、チオゾリジンディオ
    ン抗糖尿病薬、９−ＨＯＤＥ、１３−ＨＯＤＥ、ニコチン酸、ＨＭＧ ＣｏＡ還
    元酵素阻害剤、およびＰＰＡＲ仲介ＡＢＣ１発現を増加する化合物より成るグル
    ープから選択される化合物と接触させることを含むことを特徴とする方法。
  79. 【請求項７９】 （ｉ）高緊縮条件下で配列識別番号２のヌクレオチド７５
    乃至２５４にハイブリッド形成しまたＡＢＣ１生物活性を持つポリペプチドをコ
    ード化する核酸分子、および（ｉｉ）薬理許容担体を含むことを特徴とする一つ
    の薬剤組成物。
  80. 【請求項８０】 高緊締条件下で配列識別番号１４のヌクレオチド１乃至８
    ２３６にハイブリッド形成することを特徴とする一つの核酸。
  81. 【請求項８１】 配列識別番号１４のヌクレオチド１乃至８２３６の少なく
    とも３０個の隣接ヌクレオチドに８０％同一である領域を含むことを特徴とする
    一つの核酸。
  82. 【請求項８２】 候補化合物がＡＢＣ１生物活性を調節するかどうかを決定
    する一つの方法であって、前記方法は （ａ）ＡＢＣ１ポリペプチドを提供し、 （ｂ）前記ポリペプチドをコレステロールと前記候補化合物に接触し、また （ｃ）前記コレステロールの前記ＡＢＣ１ポリペプチドとの結合を測定する ステップを含み、ここで前記コレステロールの前記ＡＢＣ１ポリペプチドとの結
    合は、前記候補化合物がＡＢＣ１生物活性を調節することを示すことを特徴とす
    る方法。
  83. 【請求項８３】 請求項８２記載の方法であって、ここで前記コレステロー
    ルがＨＤＬ−コレステロールであることを特徴とする方法。
  84. 【請求項８４】 請求項８２記載の方法であって、ここで前記方法が無細胞
    検定で行われることを特徴とする方法。
  85. 【請求項８５】 請求項８２記載の方法であって、ここで前記ＡＢＣ１ポリ
    ペプチドが配列識別番号１のアミノ酸１乃至６０を含むことを特徴とする方法。
  86. 【請求項８６】 請求項８２記載の方法であって、ここで前記コレステロー
    ルまたは前記ＡＢＣ１ポリペプチドが検出可能に標識されることを特徴とする方
    法。
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