JP2003509067A - トリメチルアミンｎ−オキシドレダクターゼをコードする遺伝子に由来するヌクレオチド配列、および特に細菌検出のためのその使用 - Google Patents

トリメチルアミンｎ−オキシドレダクターゼをコードする遺伝子に由来するヌクレオチド配列、および特に細菌検出のためのその使用

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JP2003509067A JP2001523801A JP2001523801A JP2003509067A JP 2003509067 A JP2003509067 A JP 2003509067A JP 2001523801 A JP2001523801 A JP 2001523801A JP 2001523801 A JP2001523801 A JP 2001523801A JP 2003509067 A JP2003509067 A JP 2003509067A
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ジョルダーノ，ジェラール
ドス・サントス，ジャン−フィリップ
メジョン，ヴァンサン
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Abstract

(57)【要約】 本発明は、細菌を有する疑いのある宿主における、水生動物の肉の腐敗プロセスに関与するすべての細菌の存在を検出する方法を実施するための、細菌中のトリメチルアミンＮ−オキシドレダクターゼ（ＴＭＡＯレダクターゼ）系のタンパク質をコードする配列またはこの配列の断片もしくはこの配列に由来する配列を含む配列から選択されたヌクレオチド配列の使用に関する。本発明は、上記ヌクレオチド配列、上記検出方法及び上記方法を実施するためのキットにも関する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 本発明は、トリメチルアミンＮ−オキシドレダクターゼ（ＴＭＡＯレダクター
ゼ）をコードする遺伝子に由来するヌクレオチド配列と、水中動物、特に詳細に
は海洋動物の肉の損傷に関与する細菌を検出する方法を実施するために、特にプ
ライマーとして使用可能なヌクレオチド配列に関する。
【０００２】 トリメチルアミンＮ−オキシド（ＴＭＡＯ）は、海洋動物の低分子量の主要な
構成要素のひとつであり、乾燥重量でその最大１％に対応することがある。嫌気
性条件では、ある細菌はＴＭＡＯを呼吸のための外因性電子受容体として使用す
る。このときＴＭＡＯは、腐敗しかけている魚のひどい悪臭の原因の大半を占め
る揮発性の高い化合物、トリエチルアミン（ＴＭＡ）に還元される。ＴＭＡＯか
らＴＭＡへの還元は、汽水中で分離された光合成細菌のシーワネラ（ Shewanell
a）属、フォトバクテリウム（Photobacterium ）属または ビブリオ（Vibrio）
属（１、２）、ロードバクター（Rhodobacter）属（３）などの海洋細菌で証明
されているが、エシェリシア・コリ（Escherichia coli）、サルモネラ・ティフ
ィムリウム（Salmonella typhimurium） または プロテウス・ブルガリス（Prot
eus vulgaris）（４）などの複数の腸内細菌でも証明されている。
【０００３】 ＴＭＡＯからＴＭＡへの還元の原因である酵素は、トリメチルアミンＮ−オキ
シドレダクターゼ（ＴＭＡＯレダクターゼ）であり、その特性は各種の生物で調
べられている。たとえば E. coliでは、ＴＭＡＯ還元の原因である２種類の別個
の酵素：ＴＭＡＯレダクターゼおよびＤＭＳＯレダクターゼがある。ＴＭＡＯレ
ダクターゼは、ＴＭＡＯ還元の９０％以上の原因であり、モノマーまたはダイマ
ー形で生じる９０kDaの周辺質モリブデン酵素である（５）。調査された各種の
細菌のＴＭＡＯレダクターゼはすべて、モノマー、ダイマーまたはテトラマーと
して生じる８０〜１００kDaのモリブデン酵素である。このタンパク質はすべて
ＴＭＡＯの嫌気生活によって誘起できるが、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）
によっても誘起できる。最後に、ＴＭＡＯは P. vulgarisを除き、細菌の周辺質
にすべて局在している。
【０００４】 ＴＭＡＯレダクターゼ系は、腸内細菌 E. ColiおよびRhodobacter属において
遺伝子および分子レベルで調査されている。Rhodobacter属の細菌のＴＭＡＯ／
ＤＭＳＯレダクターゼおよびE. coliの誘導性ＴＭＡＯレダクターゼは、その一
次配列のレベルで相同性を示す（６、７、８）。E. coliのＴＭＡＯレダクター
ゼの全体の構造は、ロードバクター・スファロイドス（Rhodobacter sphaeroide
s）またはロードバクター・カプスラトス（Rhodobacter capsulatus）について
述べられているものと同様である。E. coliにおいて、ＴＭＡＯレダクターゼ系
の各種成分をコードする遺伝子は、オペロン：３種類のタンパク質ＴｏｒＣ、Ｔ
ｏｒＤおよびＴｏｒＡをコードするｔｏｒＣＡＤオペロンとして構成される（６
）。Rhodobacterにおいて、ＴＭＡＯ／ＤＭＳＯレダクターゼ系の各種成分をコ
ードする遺伝子もオペロン：E. coliのタンパク質ＴｏｒＣ、ＴｏｒＤおよびＴ
ｏｒＡとそれぞれ相同性を有する、３種類のタンパク質ＤｏｒＣ、ＤｏｒＤ（Ｄ
ｏｒＢとも呼ばれる）およびＤｏｒＡをコードするｄｏｒＣＤＡオペロンとして
構成される（９、１０）。
【０００５】 マルセイユ湾で捕獲された魚より分離され、濾過した海水中で室温にて保存さ
れた細菌に対して、ｒＤＮＡ １６Ｓの配列決定による系統学的研究を実施した
。得られた結果は、かなりのＴＭＡＯレダクターゼ活性を持つこの細菌が、Shew
anella putrefaciens に近い、Shewanella属の新種に対応することを示している
。これは Shewanella massilia と名付けられている。ＴｏｒＥタンパク質は別
として、S. massilia のｔｏｒＥＣＡＤオペロンの遺伝子の生成物は、E. coli
おおび Rhodobacter属の細菌のＴＭＡＯレダクターゼ系に関与するタンパク質と
強い相同性を持つ（１９）。さらに、S. massiliaのＴＭＡＯレダクターゼの全
体構造は、Rhodobacter属の細菌のＴＭＡＯ／ＤＭＳＯレダクターゼについてす
でに述べられた構造との相同性を示している（２０）。
【０００６】 魚肉の腐敗は大半の食品と同様に、実質的に、製品１グラム当たり最大１０8
細胞に相当する、ある細菌の代謝活性による。魚肉において死後最初に発生する
変化は、必ずしも細菌によるものではなく、自己分解のある反応による。しかし
、魚の筋肉組織が細菌増殖の基質となるため、微生物の成長が非常に迅速に腐敗
の主要な要素を構成するようになる。魚肉に固有の複数の要因によって、他の食
品と比べた場合の腐敗し易さを説明することができる：相当の水和作用、高い死
後ｐＨ（＞６）、大半がＴＭＡＯである、高い含有量の非タンパク質窒素含有物
質、および低い含有量の構造性タンパク質（１１、１２）。これら各種の特徴は
、魚肉に特有の分解系微生物フローラの拡大に寄与する。興味深いことに、魚種
の多様性は、魚に最初に存在する細菌の性質または数に影響しないように思われ
る。これに対して、魚の細菌ミクロフローラは、それが展開する自然環境に直接
関係しているように見える。それゆえ、温度、塩分または溶存酸素濃度に実質的
に依存する水の汚染が、決定的な役割を果たすように思われる。魚肉に見られる
細菌は、生きている魚のミクロフローラから単に発生するわけではない：汚染性
細菌は特に冷凍手順（氷、魚用容器、処理工程など）から発生することがある。
魚肉に見られるすべての微生物フローラの中で、その一部のみが腐敗作用現象の
原因であった。細菌による汚染が必ずしも魚を消費に適さない状態にするわけで
はないが、ある細菌は組織、味または臭気の好ましくない変化を迅速に引き起こ
す（１３）。
【０００７】 それゆえ、海産物は非常に腐敗しやすい製品であり、水産業は貯蔵上の問題を
多く抱えている。この製品の鮮度管理は、漁業部門全体（生産者、加工業者、ま
たは流通業者）でますます重要な問題であり、数年にわたって同業界は、魚の鮮
度を非常に短時間で判定する新しい技術を発見しようと努めている。
【０００８】 現在、海産物の鮮度の判定は実質的に、製品が新鮮であるか、適度に新鮮であ
るか、または消費に適さないか否かを判定するのに最善である、感覚（感覚受容
）評価（外観、臭気、味）に基づいている。しかしこの官能検査法は、製品全体
についてのみ適用可能であり、さらに信頼性の高い実験室分析が不可欠な場合が
多い。
【０００９】 加工製品に適用可能な、細菌分析（全細菌フローラ）に基づく方法が魚の鮮度
を評価するためにますます使用されるようになっている。魚のサンプルで増殖可
能な細菌数の直接決定はなお、最も一般に使用される方法である：各種培地（た
とえばクエン酸鉄培地）で増殖させた後では、各細胞は、ペトリ皿に目で見える
コロニーを形成するため、計数可能である。この技術は使用しやすく、かなり感
受性であるが、増殖のための相当なインキュベーション時間（約３〜５日）が必
要である。その上、増殖培地の組成、またはこの試験で使用する温度（２０〜３
０℃）によって、かならずしもすべての分解性細菌が検出できるようになるわけ
ではない。したがって、この試験を実施する温度を３０℃に規定する既存の規則
（１９７９年の命令）によって、その温度で増殖しない Photobacterium phosph
oreum などのある分解性細菌の検出は不可能である。それゆえ、全微生物負荷の
非特異性測定が魚の衛生状態の良好な指標になるとはいえ、これはこの種の製品
の感覚受容品質の評価には使用できない。食品の顕微鏡検査は、細菌汚染レベル
を迅速に判定する方法である。アクリジンオレンジで染色した細胞は、蛍光顕微
鏡法によって可視化される；しかし、この方法の欠点は、感度が低い（１０4−
１０5細胞の間）ことである。
【００１０】 魚の細胞構成要素の分解により、細菌汚染の間接指標となりうる非常に多くの
物質が生成される。したがって上述の方法の代わりとして、魚肉分解の各種生成
物を監視するために化学的技術を用いることがある（１４）。ほぼアンモニア（
ＮＨ3）およびトリメチルアミン（ＴＭＡ）からなる、全揮発性塩基性窒素（Ｔ
ＶＢＮ）の定量は、魚肉の分解程度を判定するために現在広く用いられている技
術である。ＴＶＢＮの定量の利点は、簡単、迅速であり、非常に低コストなこと
である。ＴＶＢＮ中のＴＭＡの割合を決定すると、ＴＶＢＮ基準に、さらに定性
的要素を加えることができる。この基準は実際に、ＴＭＡまたはＴＶＢＮの割合
に通常影響を与える変化（魚種、脂肪含有量など）にあまり依存しないように思
われる。ＴＶＢＮに使用した同じ方法が、ＴＭＡの定量にも使用できる。他の比
色、酵素またはクロマトグラフィーによる技術も、ＴＭＡの定量的測定について
述べられている（１５、１６）。細菌によるＴＭＡＯからＴＭＡへの還元反応の
間、分解する魚肉は各種の変化：酸化還元ポテンシャルの低下、ｐＨおよび電気
伝導度の上昇を受ける。この各種指標も、ＴＭＡ放出を間接的に監視する目的で
、複数の研究で使用されている。しかし、この研究のいずれも、放出ＴＭＡのレ
ベルと魚サンプルの鮮度の間に明確な相関をこれまでに確立していない。非常に
多くの他の分解生成物も、魚の腐敗程度を判定する目的で、化学的定量を用いて
試験されている：硫化水素、ヒポキサンチン、インドール、ヒスタミンおよびア
ミノ酸。しかし、この各種の定量は、ある種の魚のみに、あるいは腐敗が非常に
進行した場合のみに有意義である。
【００１１】 ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、大量の標的ＤＮＡ配列を描出するために
増幅する分子技術である。数年の間、ＰＣＲ技術は、特に臨床細菌学または食品
安全性の分野で微生物の検出および同定でますます使用されるようになっている
（１７、１８）。現在、食品に適用されるＰＣＲ試験は主として、明確な病原性
細菌（Shigella、Salmonella、Listeria など）の検出を行う。
【００１２】 本発明によって、発明者らによる証明から、ＴＭＡＯレダクターゼ系のタンパ
ク質をコードするＤＮＡ配列が特に海洋生物の組織分解の原因となる各種の細菌
の中で、より詳しくは海洋細菌の中で、そのＴＭＡＯレダクターゼ活性による組
織分解の原因となるすべての細菌を検出する方法の適用を可能にする、十分な相
同性を持つことがわかり、該方法はどの水生動物、さらに詳細にはどの海洋動物
にも適用可能である。
【００１３】 本発明の目的の１つは、迅速かつ安価であり、特異性および感受性の点で信頼
性が向上した、水産製品、さらに詳細には海産物の鮮度の試験を提供することで
ある。
【００１４】 本発明の別の目的の１つは、海洋生物の組織の分解、特に魚肉の腐敗作用の原
因である１種類の細菌ではなく、すべての細菌、すなわち海洋細菌および腸内細
菌または汽水中で分離された細菌の両者を検出するための試験を提供することで
ある。
【００１５】 本発明のもう１つの目的は、各種の地域からの各種の魚に適用可能な、海洋生
物の組織の分解の原因である細菌を検出するための試験を提供することである。
【００１６】 本発明のもう１つの目的は、分解の初期段階を検出するために十分に感受性で
ある、海洋生物の組織の分解の原因である細菌を検出するための試験を提供する
ことである。
【００１７】 本発明は、細菌中のトリメチルアミンＮ−オキシドレダクターゼ系（ＴＭＡＯ
レダクターゼ）のタンパク質をコードする配列を含むヌクレオチド配列から選択
されたヌクレオチド配列、または約１５〜約２５ヌクレオチドのプローブまたは
プライマーなどの、この配列の断片、またはＴＭＡＯレダクターゼ系のタンパク
質をコードするこの配列の１以上のヌクレオチドの付加、抑制、および／または
置換に由来する配列または後者の断片の使用に関し、該配列および該由来配列は
、この細菌の担体となりうる宿主において、水生動物の肉の分解プロセスに関与
するすべての細菌の存在を検出する方法を適用するために、特に以下で定義する
ハイブリダイゼーション条件において、ＴＭＡＯレダクターゼ系のタンパク質を
コードする該配列とハイブリダイゼーション可能である。
【００１８】 有利なことに、ＴＭＡＯレダクターゼ系のタンパク質をコードする該ヌクレオ
チド配列は、細菌内のＴＭＡＯレダクターゼ系の、上述のｔｏｒＣＡＤオペロン
またはｄｏｒＣＤＡオペロンに対応するヌクレオチド配列から選択される。
【００１９】 好ましくは、上述のＴＭＡＯレダクターゼ系のタンパク質をコードする上述の
配列は、さらにＴｏｒＡまたはＤｏｒＡタンパク質と呼ばれる、細菌内のＴＭＡ
Ｏレダクターゼをコードする配列、またはさらにＴｏｒＣまたはＤｏｒＣタンパ
ク質と呼ばれる、細菌内のｃ型チトクロムをコードする配列から選択される。
【００２０】 本発明の特に有利な態様により、ＴＭＡＯレダクターゼをコードするヌクレオ
チド配列は以下の細菌のヌクレオチド配列から選択される： −該配列が特に以下から選択される、Shewanella、Photobacterium または Vi
brio 属などの海洋細菌： ＊図１に示す Shewanella massilia のＴｏｒＡタンパク質をコードする配
列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、 ＊図１に示す Shewanella putrefaciens のＴｏｒＡタンパク質をコードす
る配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２、 ＊図２に示すShewanella cのＴｏｒＡタンパク質をコードする配列ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：３、 ＊図３に示すPhotobacterium phosphoreumのＴｏｒＡタンパク質をコードす
る部分配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４、 ＊図１４に示すShewanella massiliaのＴｏｒＣタンパク質をコードする配
列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５、 −該配列が特に以下から選択される、RhodobacterまたはRoseobacter属などの
汽水から得られた細菌： ＊図４に示すRhodobacter spharoidesのＤｏｒＡタンパク質をコードする配
列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６、 ＊図４に示すRhodobacter capsulatusのＤｏｒＡタンパク質をコードする配
列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７、 ＊図１４に示すRhodobacter spharoidesのＤｏｒＣタンパク質をコードする
配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８、 −該配列が特に以下から選択される、Escherichia または Salmonella属など
の腸内細菌： ＊図４に示す Escherichia coli のＴｏｒＡタンパク質をコードする配列Ｓ
ＥＱ ＩＤ ＮＯ：９、 ＊図５に示す Salmonella typhimurium のＴｏｒＡタンパク質をコードする
部分配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０、 ＊図１４に示す Escherichia coli のＴｏｒＣタンパク質をコードする配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１。
【００２１】 本発明はさらに詳細には、上で定義した配列の断片から、またはこの断片に由
来する配列から選択したヌクレオチド配列の上述の使用に関し、該断片または由
来配列は約１５〜２５個のヌクレオチドより成り、ＰＣＲ技術によって、水生動
物の肉の分解に関与する細菌のＴＭＡＯレダクターゼ系のタンパク質をコードす
る遺伝子の断片の増幅を可能にするプライマーの対を形成するために、対で使用
される。
【００２２】 有利なことに、上述のヌクレオチド配列は、以下の３つの群のプライマーのい
ずれか１つから選択されるプライマー対の形で使用される： （１） 以下を含む、ｔｏｒＡ遺伝子のＤＮＡ断片を増幅するプライマー“Ｄ
ＤＮ”の群： ◆ヌクレオチド配列“ＤＤＮ＋”の以下の組成物：
【００２３】
【表２４】
【００２４】 ◆ヌクレオチド配列“ＤＤＮ−”の以下の組成物：
【００２５】
【表２５】
【００２６】 （２） 以下を含む、ｔｏｒＡ遺伝子のＤＮＡ断片を増幅するプライマー“Ｂ
Ｎ”の群： ◆ヌクレオチド配列“ＢＮ＋”の以下の組成物：
【００２７】
【表２６】
【００２８】 ◆ヌクレオチド配列“ＢＮ−”の以下の組成物：
【００２９】
【表２７】
【００３０】 （３） 以下を含む、ｔｏｒＣ遺伝子のＤＮＡ断片を増幅するプライマー“Ｂ
Ｃ”の群： ◆ヌクレオチド配列“ＢＣ＋”の以下の組成物：
【００３１】
【表２８】
【００３２】 ◆ヌクレオチド配列“ＢＣ−”の以下の組成物：
【００３３】
【表２９】
【００３４】 ここで
【００３５】
【表３０】
【００３６】 プライマー対は、対のプライマーの１つがヌクレオチド配列ＤＤＮ＋、ＢＮ＋
またはＢＣ＋の上述の組成物：の１つに対応するが、これに対して他のプライマ
ーはそれぞれヌクレオチド配列ＤＤＮ−、ＢＮ−またはＢＣ−の上述の組成物：
の１つに該当し、前記プライマー対は以下の４つの対のいずれか１つから選択さ
れる： （ａ） 細菌中のサイズが約８２０塩基対（ｂｐ）のＴｏｒＡタンパク質をコ
ードする遺伝子の断片の増幅、特に、図４に示すS. massilia のｔｏｒＡ遺伝子
の位置６２０〜１４５０に位置するヌクレオチドを境界とする８２１ｂｐ断片な
どの、Shewanella属の細菌中のＴｏｒＡタンパク質をコードする遺伝子の８２１
ｂｐ断片の増幅を導く、対ＤＤＮ１＋／ＤＤＮ５−、 （ｂ） 細菌中のサイズが約７１０ｂｐのＴｏｒＡタンパク質をコードする遺
伝子の断片の増幅、特に、図４に示すS. massilia のｔｏｒＡ遺伝子の位置１６
５７〜２４０３に位置するヌクレオチドを境界とする７２７ｂｐ断片などの、Sh
ewanella属の細菌中のＴｏｒＡタンパク質をコードする遺伝子の７２７ｂｐ断片
の増幅を導く、対ＢＮ６＋／ＢＮ２−、 （ｃ） 細菌中のサイズが約３６０ｂｐのＴｏｒＡタンパク質をコードする遺
伝子の断片の増幅、特に、図４に示すS. massilia のｔｏｒＡ遺伝子の位置１６
５７〜２０２３に位置するヌクレオチドを境界とする３５５ｂｐ断片などの、Sh
ewanella属の細菌中のＴｏｒＡタンパク質をコードする遺伝子の３５５ｂｐ断片
の増幅を導く、対ＢＮ６＋／ＢＮ４−、 （ｄ） 細菌中のサイズが約１７０ｂｐのＴｏｒＣタンパク質をコードする遺
伝子の断片の増幅、特に、図１４に示すS. massilia のＴｏｒＣタンパク質の位
置１１４〜１７９に位置するアミノ酸を境界とするポリペプチド断片をコードす
る１９７ｂｐ断片などの、Shewanella属の細菌中のＴｏｒＣタンパク質をコード
する遺伝子の１９７ｂｐ断片の増幅を導く、対ＢＣ１＋／ＢＣ２−。
【００３７】 上で述べたような、水生動物の肉の分解プロセスに関与する細菌の担体になり
うる宿主は、海洋生物、特に魚および甲殻類などの海洋生物、特に詳細には、淡
水または汽水のある動物と同様に、シタビラメおよびタラなどの大西洋の魚、ま
たはヒメジおよびタイなどの地中海の魚である。
【００３８】 本発明はさらに詳細には、試験サンプルを得た水生動物の鮮度を評価する方法
の枠組み内で、後者が自然環境から取り出されたときの、水生動物の肉の分解に
関与するすべての細菌の存在を検出する方法を実施するための、上述のヌクレオ
チド配列の上述の使用に関する。
【００３９】 本発明は、以下の配列の１つに対応するいずれかのヌクレオチド配列に関する
：
【００４０】
【表３１】
【００４１】 ここで、
【００４２】
【表３２】 である。
【００４３】 本発明は、以下の組成物：の１つに対応するヌクレオチド配列の混合物のいず
れかの組成物：にも関する： ◆ヌクレオチド配列“ＤＤＮ＋”の以下の組成物：
【００４４】
【表３３】
【００４５】 ◆ヌクレオチド配列“ＤＤＮ−”の以下の組成物：
【００４６】
【表３４】
【００４７】 ◆ヌクレオチド配列“ＢＮ＋”の以下の組成物：
【００４８】
【表３５】
【００４９】 ◆ヌクレオチド配列“ＢＮ−”の以下の組成物：
【００５０】
【表３６】
【００５１】 ◆ヌクレオチド配列“ＢＣ＋”の以下の組成物：
【００５２】
【表３７】
【００５３】 ◆ヌクレオチド配列“ＢＣ−”の以下の組成物：
【００５４】
【表３８】
【００５５】 ここで
【００５６】
【表３９】 である。
【００５７】 本発明は、以下のプライマーの群の１つから選択したプライマー対にも関する
： （１） 以下を含むプライマー“ＤＤＮ”の群： ◆ヌクレオチド配列“ＤＤＮ＋”の以下の組成物：
【００５８】
【表４０】
【００５９】 ◆ヌクレオチド配列“ＤＤＮ−”の以下の組成物：
【００６０】
【表４１】
【００６１】 （２） 以下を含むプライマー“ＢＮ”の群： ◆ヌクレオチド配列“ＢＮ＋”の以下の組成物：
【００６２】
【表４２】
【００６３】 ◆ヌクレオチド配列“ＢＮ−”の以下の組成物：
【００６４】
【表４３】
【００６５】 （３） 以下を含むプライマー“ＢＣ”の群： ◆ヌクレオチド配列“ＢＣ＋”の以下の組成物：
【００６６】
【表４４】
【００６７】 ◆ヌクレオチド配列“ＢＣ−”の以下の組成物：
【００６８】
【表４５】
【００６９】 ここで
【００７０】
【表４６】 である。
【００７１】 プライマー対は、対のプライマーの１つがヌクレオチド配列ＤＤＮ＋、ＢＮ＋
またはＢＣ＋の上述の組成物：の１つに対応するが、これに対して他のプライマ
ーはそれぞれヌクレオチド配列ＤＤＮ−、ＢＮ−またはＢＣ−の上述の組成物：
の１つに該当し、前記プライマー対は以下の４つの対のいずれか１つから選択さ
れる： （ａ） 細菌中のサイズが約８２０塩基対（ｂｐ）のＴｏｒＡタンパク質をコ
ードする遺伝子の断片の増幅、特に、図４に示すS. massiliaのｔｏｒＡ遺伝子
の位置６２０〜１４５０に位置するヌクレオチドを境界とする８２１ｂｐ断片な
どの、Shewanella属の細菌中のＴｏｒＡタンパク質をコードする遺伝子の８２１
ｂｐ断片の増幅を導く、対ＤＤＮ１＋／ＤＤＮ５−、 （ｂ） 細菌中のサイズが約７１０ｂｐのＴｏｒＡタンパク質をコードする遺
伝子の断片の増幅、特に、図４に示すS. massilia のｔｏｒＡ遺伝子の位置１６
５７〜２４０３に位置するヌクレオチドを境界とする７２７ｂｐ断片などの、Sh
ewanella属の細菌中のＴｏｒＡタンパク質をコードする遺伝子の７２７ｂｐ断片
の増幅を導く、対ＢＮ６＋／ＢＮ２−、 （ｃ） 細菌中のサイズが約３６０ｂｐのＴｏｒＡタンパク質をコードする遺
伝子の断片の増幅、特に、図４に示すS. massilia のｔｏｒＡ遺伝子の位置１６
５７〜２０２３に位置するヌクレオチドを境界とする３５５ｂｐ断片などの、Sh
ewanella属の細菌中のＴｏｒＡタンパク質をコードする遺伝子の３５５ｂｐ断片
の増幅を導く、対ＢＮ６＋／ＢＮ４−、 （ｄ） 細菌中のサイズが約１７０ｂｐのＴｏｒＣタンパク質をコードする遺
伝子の断片の増幅、特に、図１４に示すS. massiliaのＴｏｒＣタンパク質の位
置１１４〜１７９に位置するアミノ酸を境界とするポリペプチド断片をコードす
る１９７ｂｐ断片などの、Shewanella属の細菌中のＴｏｒＣタンパク質をコード
する遺伝子の１９７ｂｐ断片の増幅を導く、対ＢＣ１＋／ＢＣ２−。
【００７２】 本発明は、宿主から採取した生物学的サンプルから出発して行う、細菌の担体
になることが可能である宿主内での水生動物の肉の分解に関与するすべての細菌
を検出する方法であって、該生物学的サンプルは特に問題の水生動物の肉の皮下
断片に相当し、該宿主から採取した生物学的サンプル中に存在することが可能で
ある水生動物の肉の分解に関与する細菌のＴＭＡＯレダクターゼ系のタンパク質
をコードする遺伝子の断片を用いて、上のいずれか一項で定義したような少なく
とも１個のヌクレオチド配列のハイブリダイゼーション工程、続いて、必要に応
じ、コピー数が増幅されている、ＴＭＡＯレダクターゼ系のタンパク質をコード
する遺伝子またはこの遺伝子の断片の該サンプル中の存在の可能性を、特に電気
泳動によって検出する工程を含むことを特徴とする方法にも関する。
【００７３】 本発明はさらに詳細には、以下の工程を含むことを特徴とする、上で定義した
検出方法に関する： −本宿主から全ＤＮＡを抽出し、この細菌のゲノムを上で定義したヌクレオチ
ド配列またはプライマーに接近することができるようにするための、本宿主から
採取した生物学的サンプルの処理であって、核酸のシリカビーズへの固定に基づ
く迅速ＤＮＡ抽出技術を特に使用して行われる処理、 −本サンプルに存在可能である水生動物の肉の分解に関与するＴＭＡＯレダク
ターゼ系のタンパク質をコードする遺伝子、またはこの遺伝子の断片の、上述の
ヌクレオチド配列またはプライマーによるコピー数の増幅、 −上述の細菌のＴＭＡＯレダクターゼ系のタンパク質をコードする遺伝子、ま
たはこの遺伝子の断片の複製の増幅数のありうる存在の検出、ひいては調査する
生物学的サンプル中の該細菌の存在の検出。
【００７４】 有利なことに、以下の工程を含む、本発明による検出方法はＴＭＡＯレダクタ
ーゼ系のタンパク質をコードする遺伝子数の増幅を特徴とする： −好ましくは１０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．３、５０mM ＫＣｌ、１．
５mM ＭｇＣｌ2、０．０１％ゼラチンと、ＤＮＡを構成するそれぞれ濃度１０
０μMの４種類のデオキシヌクレオチド（ｄＣＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴ
ＴＰ）、および上述したプライマー対からなるバッファー中において、約９０℃
−約１００℃の間、有利には９４℃において約１．５分間加熱することによる、
宿主の全２本鎖ＤＮＡの１本鎖ＤＮＡへの予備変性、 −たとえばＴａｑポリメラーゼなどのＤＮＡポリメラーゼを前の工程で得られ
た培地に添加することによる実際の増幅、 ◆実際の変性工程に対応する、約９４℃における約３０秒間の加熱、 ◆次に、調査した生物学的サンプル中に存在することのできる、細菌のＴＭ
ＡＯレダクターゼ系のタンパク質をコードする遺伝子、またはこの遺伝子の断片
とプライマーのハイブリダイゼーション工程に対応する、約３５℃〜約６０℃の
間、特に約４５℃または５５℃での約３０秒間の加熱、 ◆最後に、前の工程で互いに対してハイブリダイズしたプライマーの伸長工
程に対応する、７２℃での約４５秒間の加熱、これによる細菌のＴＭＡＯレダク
ターゼ系のタンパク質をコードする遺伝子の断片の相補性ヌクレオチド配列の作
成、この後者の配列の上述のプライマーへのハイブリダイズしたヌクレオチドに
よる結合、 −約１５〜約３５回、有利には約３０回、前の増幅工程を反復。
【００７５】 本発明は、以下を含むことを特徴とする、上述の検出方法を実施するためのキ
ットにも関する： −上で定義した１以上のヌクレオチド配列またはプライマー、 −ＤＮＡポリメラーゼ、 −好ましくは１０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．３、５０mM ＫＣｌ、１．
５mM ＭｇＣｌ2、０．０１％ゼラチン、ＤＮＡを構成するそれぞれ濃度１００
μMの４種類のデオキシヌクレオチド（ｄＣＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴ
Ｐ）からなる反応培地。
【００７６】 本発明は、以下のいずれかを含むヌクレオチド配列にも関する： −図２に示す、海洋細菌Shewanella CのＴｏｒＡタンパク質をコードするｔｏ
ｒＡ遺伝子の配列、 −または、ペプチド配列を図６に示す、遺伝子コードの変性により上述の配列
に由来する、およびShewanella CのＴｏｒＡタンパク質をコードする任意の配列
、 −または、特に１以上のヌクレオチドの置換、抑制または添加による上述のヌ
クレオチド配列に由来する任意の配列であって、図２に示す上述のヌクレオチド
配列と好ましくは約３５％〜１００％の相同性を有する配列、 −または、上述のヌクレオチド配列、または上で定義した後者に由来する配列
のいずれかの断片であって、好ましくは少なくとも１５個のヌクレオチドからな
る断片。
【００７７】 本発明は、図２に示す上述のヌクレオチド配列によってコードされ、以下を含
むいずれかのペプチド配列にも関する： −図６に示す、Shewanella cのＴｏｒＡタンパク質のアミノ酸配列、 −または、特に１以上のアミノ酸の置換、抑制または添加による上述のペプチ
ド配列に由来する配列であって、図６に示す上述のペプチド配列と好ましくは約
３５％〜１００％の相同性を有する配列、 −または、上述のペプチド配列、または上で定義した後者に由来する配列のい
ずれかの断片であって、好ましくは少なくとも５個のアミノ酸からなる断片。
【００７８】 本発明は、以下を含むいずれかのヌクレオチド配列にも関する： −図３に示す、海洋細菌Photobacterium phosphoreumのＴｏｒＡタンパク質を
コードする遺伝子の部分配列、 −または、ペプチド配列を図７に示す、遺伝子コードの変性により上述の配列
に由来する、およびPhotobacterium phosphoreumのＴｏｒＡタンパク質をコード
する任意の配列、 −または、特に１以上のヌクレオチドの置換、抑制または添加による上述のヌ
クレオチド配列に由来する任意の配列であって、図３に示す上述のヌクレオチド
配列と好ましくは約３５％〜１００％の相同性を有する配列、 −または、上述のヌクレオチド配列、または上で定義した後者に由来する配列
のいずれかの断片であって、好ましくは少なくとも１５個のヌクレオチドからな
る断片。
【００７９】 本発明は、図３に示す上述のヌクレオチド配列によってコードされ、以下を含
むいずれかのペプチド配列にも関する： −図７に示す、Photobacterium phosphoreumのＴｏｒＡタンパク質の部分アミ
ノ酸配列、 −または、特に１以上のアミノ酸の置換、抑制または添加による上述のペプチ
ド配列に由来する配列であって、図７に示す上述のペプチド配列と好ましくは約
３５％〜１００％の相同性を有する配列、 −または、上述のペプチド配列、または上で定義した後者に由来する配列のい
ずれかの断片であって、好ましくは少なくとも５個のアミノ酸からなる断片。
【００８０】 本発明は、以下を含むいずれかのヌクレオチド配列にも関する： −図５に示す、海洋細菌Salmonella typhimuriumのＴｏｒＡタンパク質をコー
ドする遺伝子の部分配列、 −または、ペプチド配列を図８に示す、遺伝子コードの変性により上述の配列
に由来する、およびSalmonella typhimuriumのＴｏｒＡタンパク質をコードする
任意の配列、 −または、特に１以上のヌクレオチドの置換、抑制または添加による上述のヌ
クレオチド配列に由来する任意の配列であって、図５に示す上述のヌクレオチド
配列と好ましくは約３５％〜１００％の相同性を有する配列、 −または、上述のヌクレオチド配列、または上で定義した後者に由来する配列
のいずれかの断片であって、好ましくは少なくとも１５個のヌクレオチドからな
る断片。
【００８１】 本発明は、図５に示す上述のヌクレオチド配列によってコードされ、以下を含
むいずれかのペプチド配列にも関する： −図８に示す、Salmonella typhimuriumのＴｏｒＡタンパク質のアミノ酸配列
、 −または、特に１以上のアミノ酸の置換、抑制または添加による上述のペプチ
ド配列に由来する配列であって、図８に示す上述のペプチド配列と好ましくは約
３５％〜１００％の相同性を有する配列、 −または、上述のペプチド配列、または上で定義した後者に由来する配列のい
ずれかの断片であって、好ましくは少なくとも５個のアミノ酸からなる断片。
【００８２】 本発明は、本発明のプライマーの作成、および本発明による検出方法を実施す
るためのその使用についての、以下の詳細な説明でさらに説明される。
【００８３】 Ａ）検査方法
【００８４】 酵素ＴＭＡＯレダクターゼをコードする遺伝子から開始する特異性プライマー
：“ＤＤＮ”、“ＢＮ”および“ＢＣ”分子プローブの調製。
【００８５】 以下に述べる検査の第１工程は、ＰＣＲ反応に使用可能な分子プライマー（ま
たはプローブ）の調製、および魚肉の腐敗に関与する各種細菌へのその特異性の
検査に関する。第２工程は、ＰＣＲ技術の魚肉への応用に関する。
【００８６】 Ｉ） ＰＣＲで使用する分子プライマーの調製および確認。
【００８７】 ヌクレオチドプライマーの選択は、ＰＣＲ試験を成功させるための重要な工程
である。このプライマーは、魚肉分解に原因であるすべての細菌においてＴＭＡ
Ｏレダクターゼをコードする遺伝子の、高度に保存された領域から出発して調製
する必要がある。このプライマーの調製には、複数の方法が使用されている。
【００８８】 （１） Shewanella属の細菌および E. coli中に保存されたｔｏｒＡ遺伝子の
領域から開始する、調製された分子プライマー：“ＤＤＮ”プライマー。
【００８９】 保存タンパク質領域から開始し、変性をほとんど含まないプライマーの作成は
、遺伝子コードの変性により非常に困難である。
【００９０】 “ＤＤＮ”と呼ばれる分子プライマーは、Shewanella属の各種細菌および E.
coliのｔｏｒＡ遺伝子の核酸配列のアラインメントに基づいて定義された（図９
）。実際に、この細菌中のｔｏｒＡ遺伝子の複数のＤＮＡ領域は、誤対合のほと
んどない、高度の配列同一性を有する。
【００９１】 ＤＤＮ分子プライマーは、上で定義したＤＤＮ１＋、ＤＤＮ２−、ＤＤＮ３−
、ＤＤＮ４−、ＤＤＮ５−およびＤＤＮ５＋である。
【００９２】 増幅をより特異性にするために、すべてのＰＣＲ反応において、対合温度は５
５℃に調整し、したがって、狹雑するＤＮＡバンドの出現が制限される。これは
新たに合成されたプライマーをわずかに変性させることによって可能になる。Ｐ
ＣＲ増幅は、３０サイクルの連続反応を用いる。各サイクルは、９４℃にて３０
秒間の変性工程、４５℃にて３０秒間のハイブリダイゼーション工程、７２℃に
て４５秒間の伸長工程が含まれる。
【００９３】 ａ） Shewanella属の細菌のＴＭＡＯレダクターゼ系の検出へのＤＤＮ分子プ
ライマーの使用。
【００９４】 プライマー対ＤＤＮ１＋／ＤＤＮ５−、ＤＤＮ５＋／ＤＤＮ２−、ＤＤＮ５＋
／ＤＤＮ３−、ＤＤＮ５＋／ＤＤＮ４−を用いた、最初の一連の試験は、菌株Sh
ewanella massilia（S. massilia）による染色体ＤＮＡに対して行った。プライ
マー対ＤＤＮ１＋／ＤＤＮ２−、ＤＤＮ１＋／ＤＤＮ３−およびＤＤＮ１＋／Ｄ
ＤＮ４−は、ｔｏｒＡ遺伝子上のその位置が遠いために、意図的に廃棄した。
【００９５】 図１０にまとめた結果（レーン１〜４）によって、使用した分子プライマー対
の大多数で、予想サイズに対して特異性である独自のＤＮＡ断片の増幅が明らか
になる。プライマー対ＤＤＮ５＋／ＤＤＮ２−に対しては、約３００塩基対の非
特異性ＤＮＡ断片がさらに増幅されるが（レーン２）、ＤＤＮ分子プライマーは
、S. massiliaのＴＭＡＯレダクターゼ系に対して特異性であることがわかる。
【００９６】 ＤＤＮプライマー対は次に、Shewanella属に属する他の細菌に対して試験した
。菌株Shewanella c および S. putrefaciens ＭＲ−１の染色体ＤＮＡを基質
として用い、同様の一連の試験を実施した。すべてのプライマー対は、これら２
種類の細菌についての予想サイズに対して特異性のＤＮＡ断片を増幅することが
できた（図１０）。
【００９７】 したがって、各種ＤＤＮプライマー対によって、試験を行ったすべての Shewa
nella細菌を検出することができる。
【００９８】 ｂ） 海洋細菌 Photobacterium phosphreum におけるＴＭＡＯレダクターゼ
系をコードする遺伝子の検出への、および該遺伝子の配列決定の実施へのＤＤＮ
分子プライマーの使用。
【００９９】 Photobacterium phosphreum（P. phosphreum）は、S. putrefacinesと同様に
、いくつかの場合で、海産魚の肉の腐敗の原因となる細菌である。これはVibrio
naceae族に属し、その最適成長温度は１５℃である。ほとんど研究が行われてい
ない細菌であり、その推定上のＴＭＡＯレダクターゼ系は現時点で完全に未知で
ある。
【０１００】 魚肉を汚染するおそれのあるShewanellaグループの個々の細菌に対する、本発
明による分子プライマーの特異性を検証するために、収集菌株 P. phosphoreum
をＡＴＣＣ（American Type Culture Collection No. 11040）により入手した。
この細菌に対して、海洋培地（Ｄｉｆｃｏ）で１５℃にて行った最初の増殖試験
によって、ＴＭＡＯを培地に添加すると、その増殖速度が著しく向上することが
示された。２４時間の増殖後の光学密度（ＯＤ600）は、ＴＭＡＯなしで増殖さ
せた菌株では０．２８であり、ＴＭＡＯの存在下で増殖させた菌株では０．４７
である。この結果は、P. phosphoreum中の呼吸性ＴＭＡＯレダクターゼの存在と
一致する。すべてのＤＤＮ分子プライマー対を用いて、（海洋培地中の１０mlの
培養物から調製した）この細菌の染色体ＤＮＡから開始する遺伝子増幅を行った
。
【０１０１】 図１１に示す結果は、ＤＤＮプライマーにより、すべての場合で特異性ＤＮＡ
断片の増幅が可能となる。ＤＮＡ断片の各種サイズは、Shewanella属の細菌の染
色体に対して行った増幅で得られたサイズと一致する。
【０１０２】 P. phosphreum中で増幅されるＤＮＡ断片がP. phosphreumのＴＭＡＯレダクタ
ーゼをコードする遺伝子の一部に一致することを確認するために、該断片の配列
決定を行った。そのため分子プライマー対ＤＤＮ１＋／ＤＤＮ５−から増幅開始
された約６００ヌクレオチドの断片を配列決定した。GenClean（Bio 101）によ
って直接精製したＰＣＲ生成物は、ＤＤＮ１＋分子プライマーを用いて連鎖停止
技術（２２）によって配列決定した。この核酸配列から推定したタンパク質配列
は、各種のＴＭＡＯレダクターゼの配列とアラインメントした（図７）。このタ
ンパク質配列は、S. massiliaのＴＭＡＯレダクターゼの領域と約６０％の同一
性を示す。確認された相同性は、配列決定したＤＮＡ断片がP. phosphreumのＴ
ＭＡＯレダクターゼをコードする遺伝子の一部と一致するということを結論付け
るのに十分な高さである。
【０１０３】 本発明による検出方法によって系統学的に比較的遠い腐敗細菌におけるＴＭＡ
Ｏレダクターゼ系を検出できるため、この結果は、細菌P. phosphreum中にＴＭ
ＡＯレダクターゼ系が存在することを証明し、本発明によるＰＣＲ試験により検
出方法を実証する。
【０１０４】 ｃ） 腸内細菌のＴＭＡＯレダクターゼをコードする遺伝子の検出への、およ
び該遺伝子の配列決定の実施へのＤＤＮ分子プライマーの使用。
【０１０５】 E. coliなどの腸内細菌またはSalmonella typhimuriumなどのある病原性細菌
の検出に有効であることを確認するために、E. coli および S. typhimuriumの
染色体ＤＮＡを基質ＤＮＡとして用いて、上述と同一のＰＣＲ試験を行った。
【０１０６】 S. typhimuriumにおいて、ＰＣＲ手法を用いてＴＭＡＯレダクターゼ系の促進
領域が証明されている（２３）。
【０１０７】 得られた結果を図１２に示す。４種類の分子プライマー対、ＤＤＮ１＋／ＤＤ
Ｎ５−、ＤＤＮ５＋／ＤＤＮ２−、ＤＤＮ５＋／ＤＤＮ３−およびＤＤＮ５＋／
ＤＤＮ４−によって、E. coli内の特異性ＤＮＡ断片の増幅が可能となる（レー
ン２、６、１０および１６）。S. typhimuriumの場合、プライマー対ＤＤＮ１＋
／ＤＤＮ５−も、ＴＭＡＯレダクターゼ系の特異性断片と適合性のある、８２０
塩基対のＤＮＡ断片の増幅を可能にする（レーン３）。
【０１０８】 S. typhimurium中で増幅されたＤＮＡ断片が、S. typhimuriumのＴＭＡＯレダ
クターゼをコードする遺伝子の一部によく一致することを確認するために、該断
片の配列決定を実施した。このＤＮＡ断片の一部（４７７ヌクレオチド）より推
定されたタンパク質配列は、各種ＴＭＡＯレダクターゼのタンパク質配列との重
要な相同性を有する（図８）。加えて、E. coliのＴＭＡＯレダクターゼの配列
とは８８％を超える同一性、S. massilia中の酵素の配列とは４５％を超える同
一性を有する。したがって、ＤＤＮ１＋／ＤＤＮ５−を用いて増幅したＤＮＡ断
片は、S. typhimuriumのＴＭＡＯレダクターゼをコードする遺伝子の一部におそ
らく一致する。
【０１０９】 ｄ） 結論
【０１１０】 前に述べたように、プライマー対ＤＤＮ１＋／ＤＤＮ５−によって、海洋細菌
（Shewanella および P. phsphoreum）のｔｏｒＡ遺伝子の検出が可能であるが
、腸内細菌（E. coli および S. typhimurium）のｔｏｒＡ遺伝子も検出できる
。
【０１１１】 魚肉におそらく見られるであろう、汽水（Rhodobacter）から分離した細菌に
対して、同じＰＣＲ試験を実施した。この試験を行うために、細菌 R. sphaeroi
des による染色体ＤＮＡのサンプルを基質として使用した。
【０１１２】 細菌 R. sphaeroidesは、E. coliで述べたものに似た、ＤＭＳＯ／ＴＭＡＯレ
ダクターゼ系を有する（９，１０）。この細菌の末端酵素はＴＭＡＯとＤＭＳＯ
の両方を還元できるが、E. coliまたは S. massiliaのＴＭＡＯレダクターゼと
、タンパク配列との相同性を多数有する（それぞれ４７．５％および４５％の同
一性）。
【０１１３】 しかし、ＤＤＮ分子プローブを用いて行ったＰＣＲ試験によって、この細菌の
ＴＭＡＯレダクターゼの遺伝子に一致するＤＮＡ断片の増幅は行えなかった。
【０１１４】 （２） 調査したすべての細菌中に保存されたｔｏｒＡ遺伝子の領域から開始
する、調製された分子プライマー：“ＢＮ”プライマー。
【０１１５】 ＰＣＲ試験の分子プライマーの検出のスペクトルをさらに広げるために、Shew
anella属の細菌および E. coliのｔｏｒＡ遺伝子の配列から開始するアラインメ
ントに、Rhodobacter属（R. sphaeroides および R. capsulatus）の細菌のＴＭ
ＡＯ／ＤＭＳＯレダクターゼの遺伝子の核酸配列を統合した。
【０１１６】 “ＢＮ”と呼ばれる一連の新規プライマーをこの方法で調製した（図１３）。
【０１１７】 すべての試験で、ＰＣＲ増幅は５５℃のハイブリダイゼーション温度で実施し
た。この温度では、混合物中に存在するプライマーのごく一部のみが、基質ＤＮ
Ａに特異的にハイブリダイズ可能となる。このため、大量の分子プライマーが反
応混合物中に加えられる（最終５０μl中、約１００pmol）。
【０１１８】 得られたＢＮプライマーは上で定義したように、プライマーＢＮ１＋、ＢＮ２
−、ＢＮ３＋、ＢＮ４−、ＢＮ５−、ＢＮ６＋である。
【０１１９】 以下の表１は、各種の細菌からのＤＮＡにＢＮ分子プライマーを適用した場合
に得られた結果を示す。
【０１２０】 ５ngの細菌染色体ＤＮＡから開始する増幅を実施する。ＰＣＲ反応は３０サイ
クルの連続反応を使用した。 ＋：予想サイズに特異的なＤＮＡ断片が増幅される。 −：増幅なし
【０１２１】
【表４７】
【０１２２】 ２種類のプライマー対：ＢＮ６＋／ＢＮ２−およびＢＮ６＋／ＢＮ４−によっ
て、試験を行ったすべての細菌、特に R. sphaeroidesにおいて、特性ＤＮＡ断
片の増幅が可能である。
【０１２３】 したがってＢＮプライマーは、ＴＭＡＯレダクターゼ系を有し、魚肉を汚染す
るおそれのある細菌の検出に完璧に適していることがわかる。
【０１２４】 加えて、ＰＣＲ中に高いハイブリダイゼーション温度（５５℃）を使用するこ
とと、大量の変性分子プライマーにより、増幅の特異性が著しく改善した。
【０１２５】 （３） ＴＭＡＯレダクターゼ系のｔｏｒＣチトクロムをコードする遺伝子か
ら開始する、調製された分子プライマー：“ＢＣ”プライマー。
【０１２６】 各種細菌のＴＭＡＯレダクターゼ系の検査によって、ＴｏｒＡ末端酵素までの
電子伝達鎖が、ｃ型の５ヘムチトクロム、すなわちＴｏｒＣ（またはＤｏｒＣ）
チトクロムを常に含むことが証明されている（６、９、１０、１９）。
【０１２７】 腐敗細菌中のＴＭＡＯレダクターゼ系を検出するために、このチトクロムをコ
ードする遺伝子に対して誘導される核プライマーを調製した。
【０１２８】 図１４に示すタンパク質配列のマルチアラインメントにより、各種の細菌：S.
massilia、E. coli、R. sphaeroidesのＴＭＡＯレダクターゼ系のチトクロムの
間に保存されている多数のタンパク質領域が明らかになる。この保存領域の一部
は、ｃ型のヘム（ＣｘｘＣＨモチーフ）の固定部位に相当し、他の呼吸器系に含
まれる非常に多くのクラスＮａｐＣ／ＮｉｒＴの４ヘムチトクロム中にたいへん
よく見られる（２４）。それにもかかわらず、ＴｏｒＣチトクロムは、５番目の
ヘムを固定する追加のカルボキシ末端ドメインを含むという、特殊な性質を備え
ている（６、１９）。
【０１２９】 ＢＣ分子プライマーは、上で定義したプライマーＢＣ１＋、ＢＣ２＋、ＢＣ２
−およびＢＣ３−である。該プライマーを調製するために、クラスＮａｐＣ／Ｎ
ｉｒＴのチトクローム（プローブＢＣ２＋およびＢＣ２−）すべての間で保存タ
ンパク質領域を探したが、ＴｏｒＣチトクロム（プローブＢＣ１＋およびＢＣ３
−）の間も独自に探した。４個の変性分子プライマーＢＣの位置および向きは図
１４に示す。
【０１３０】 ＢＣ分子プライマーは、ＴＭＡＯレダクターゼ系のＴｏｒＣチトクロムをコー
ドする遺伝子にハイブリダイズすることができる。
【０１３１】 ＰＣＲ反応は、ＢＮ分子プライマーで用いたのと同一の条件で実施する。３０
サイクルの連続反応を使用する。各サイクルは、９４℃での３０秒間の変性工程
、５５℃での３０秒間のハイブリダイゼーション工程および４５秒間の伸長工程
からなる。
【０１３２】 約１００pmolの各分子プライマーを反応混合物に加える（最終体積５０μl）
。試験を行った３種類の分子プライマー対（ＢＣ１＋／ＢＣ２−、ＢＣ１＋／Ｂ
Ｃ３−およびＢＣ２＋／ＢＣ３−）の中で、対ＢＣ１＋／ＢＣ２−は、前に試験
を行ったすべての細菌について、ＤＮＡ断片を予測サイズ（１７７塩基対）に増
幅することができた（図１５；レーン１〜５）。この結果によって、我々は、Ｐ
ＣＲ試験での分子プライマーＢＣ１＋／ＢＣ２−の使用を想定することができる
。
【０１３３】 同時に、ＴＭＡＯレダクターゼ系を欠いている植物病原性腸内細菌である、細
菌 Erwinia chrysanthemi の染色体から開始するプライマー対ＢＣ１＋／ＢＣ２
−を用いて、同じＰＣＲ試験を実施した（４）。この場合、ｔｏｒＣ遺伝子から
開始する増幅で予想されたサイズと適合するサイズのＤＮＡ断片は見られない（
図１５、レーン６）。
【０１３４】 したがって、プライマー対ＢＣ１＋／ＢＣ２−はＴＭＡＯレダクターゼ系のＴ
ｏｒＣチトクロムを特異的に認識するように思われる。
【０１３５】 （４） ＰＣＲ技術の全細胞への適用
【０１３６】 魚サンプルから直接出発して使用されるＰＣＲ試験を実施する場合、細菌の染
色体ＤＮＡの調製工程をなくすことが重要である。このため、S.massiliaの全細
菌から開始するＤＤＮ、ＢＮおよびＢＣプライマー対を用いるＰＣＲ試験が再現
された。皿内で分離した細菌コロニーを２００μlの滅菌蒸留水中で再懸濁させ
る（ＯＤ600 ０．１〜０．５）。次に、（５０μlの最終体積中で）２．５μl
の細胞懸濁液を基質として、上述の条件でＰＣＲ反応を行った。（ＤＤＮ、ＢＮ
およびＢＣプライマーで）実施したすべてのＰＣＲ反応で、得られた結果は、精
製染色体ＤＮＡで見られた結果と同等である。したがって細菌は、９４℃にて１
．５分間の、サンプルのインキュベーションに対応する、ＰＣＲの第１工程中で
よく溶解されている。この陽性結果に基づいて、魚肉から直接開始するＰＣＲ試
験の使用を想定できる。
【０１３７】 ＩＩ） ＰＣＲ−ＴＭＡＯ試験の魚肉への応用
【０１３８】 海産物の腐敗の原因である細菌に対する、本発明による分子プライマーの特異
性を確認したため、次の工程は、ＰＣＲ試験を魚肉に直接応用することからなる
。
【０１３９】 以前に試験を行った大多数の細菌で特異性ＤＮＡ断片の増幅が可能であるため
、この試験を行うために、４種類のプライマー対、ＤＤＮ１＋／ＤＤＮ５−、Ｂ
Ｎ６＋／ＢＮ４−、ＢＮ６＋／ＢＮ２−およびＢＣ１＋／ＢＣ２−を選択した。
【０１４０】 （１） 細菌のＴＭＡＯレダクターゼの遺伝子の増幅中の魚染色体ＤＮＡの影
響。
【０１４１】 魚肉のサンプルのＰＣＲ試験を使用するために、魚染色体ＤＮＡが分子プライ
マーのハイブリダイゼーション中に細菌ＤＮＡと競合しないことを、最初に確認
する必要がある。
【０１４２】 魚染色体ＤＮＡの、本発明による分子プライマーの特異性に対する影響を試験
するために、各種濃度のニシン精子の精製染色体ＤＮＡを、２．５μlの細菌 S.
massiliaの細胞懸濁液を含む、または含まないＰＣＲ反応混合物に加えた。
【０１４３】 プライマー対ＤＤＮ１＋／ＤＤＮ５−によって得られた図１６は、反応混合物
に加えた細菌が不在の場合には、魚染色体ＤＮＡの濃度とは無関係に、ＤＮＡ断
片が増幅されないことを示している（レーン１〜３）。細菌 S. massilia を反
応混合物に加える場合（レーン４〜６）、特異性ＤＮＡ断片が増幅される。プラ
イマー対ＢＮ６＋／ＢＮ２−、ＢＮ６＋／ＢＮ４−またはＢＣ１＋／ＢＣ２−に
ついても同じ結果が得られたため、ＰＣＲ反応混合物中に異質ＤＮＡが存在して
も、本発明による分子プライマーの特異性を阻害しないと結論付けられる。
【０１４４】 したがって、この重要な結果に基づいて、魚染色体ＤＮＡによる非特異性増幅
の発生を除外することができる。
【０１４５】 （２） 魚肉からの全ＤＮＡの抽出およびＰＣＲ技術の検証。
【０１４６】 従来、食品の微生物検査中に微生物を検出するための検査には、選択性培地で
細菌を予備濃縮する第１工程が必要である。
【０１４７】 迅速な鮮度試験を行うために、ＰＣＲ技術を直接、魚サンプルに応用した。そ
こで、腐敗しかけている魚肉から全ＤＮＡ（細菌ＤＮＡ＋魚ＤＮＡ）を抽出する
各種の条件を試験した。
【０１４８】 最初に、魚サンプルをＮａＯＨ／ＳＤＳによって処理し、細胞からＤＮＡを迅
速に抽出する技術を試験した（２５）。この技術は細胞溶解を可能にし、それに
より全染色体ＤＮＡの抽出が可能である。サンプルは、１２時間室温で保存した
魚（ヒメジ）から採取した約２５mgの肉より調製した。９５℃にて１０分間イン
キュベーションした後、５μlの均質化した魚肉混合物をＰＣＲ反応混合物中で
直接使用した。
【０１４９】 しかし、全ＤＮＡの抽出にこの迅速な技術を使用すると、各種の分子プライマ
ーを用いて行うＰＣＲ反応の全範囲によって、特異性ＤＮＡ断片の増幅が行えな
かった。魚肉に含まれる複数のＰＣＲ阻害物質の存在によって、この結果が説明
されることがある。実際に、ある食品に大量に存在する化合物（脂質、タンパク
質など）は、ＰＣＲの有効性に影響を及ぼす場合がある（２６）。この仮定を検
証するために、魚肉サンプルにS. massilia による５ngの染色体ＤＮＡを加えて
、同じＰＣＲ試験を実施した。しかし前と同様に、どの分子プライマーを使用し
たかにかかわらず、ＰＣＲによってＤＮＡ断片は増幅されなかった。
【０１５０】 この結果から、ＰＣＲ反応は、魚肉に含まれるある化合物によって阻害される
と結論付けることができる。
【０１５１】 したがって、本発明により使用された、魚肉から全染色体ＤＮＡを精製する技
術は、ＰＣＲ阻害化合物すべてを除去可能でなければならない。
【０１５２】 それゆえ、シリカビーズへの核酸の固定に基づく、迅速なＤＮＡ抽出キット（
約１時間）を試験した（ベーリンガーマンハイム／ロシュによる“High Pure PC
R Template Preparation Kit”として市販されているキット）。ＤＮＡの固定後
、この技術によって実際に、塩、タンパク質および他の細胞不純物を１工程の洗
浄によって除去することができる。
【０１５３】 分解を受けている（室温で１２時間保管）４種類の異なる魚に対して、全ＤＮ
Ａ（細菌ＤＮＡ＋魚ＤＮＡ）の抽出を行った：地中海より２種（ヒメジおよびタ
イ）、大西洋より２種（シタビラメおよびタラ）。この魚による約５０mgの肉（
皮の下より採取）を用いて開始し、この方法で１〜４μgの全染色体ＤＮＡを精
製した。約２５ngのこのＤＮＡを次に、ＰＣＲ反応混合物に加えた（最終体積５
０μl）。すべてのＰＣＲ反応で、ハイブリダイゼーション温度を５５℃に調整
し、１００pmolの各分子プライマーを反応混合物に加えた。
【０１５４】 図１７に、プライマー対ＤＤＮ１＋／ＤＤＮ５−、ＢＮ６＋／ＢＮ２−、ＢＮ
６＋／ＢＮ４−を用いて得られた結果をまとめる。試験を行ったすべての魚種で
、各プライマー対の使用によって、独自のＤＮＡ断片が増幅される。
【０１５５】 増幅されたＤＮＡ断片のサイズは、ｔｏｒＡ遺伝子から開始する増幅の予想サ
イズに一致する。この結果は、魚肉に存在する細菌のｔｏｒＡ遺伝子から開始す
る各種ＤＮＡ断片が実際に増幅されたことを示す。
【０１５６】 さらに、腐敗しかけている（溶けている氷の上で７日間）別の２種、サバ（フ
ァットフィッシュ）および whiting（欧州産のタラ）に対して試験を実施すると
、腐敗細菌のｔｏｒＡ遺伝子が検出された。
【０１５７】 それゆえ、分子プライマー対ＤＤＮ１＋／ＤＤＮ５−、ＢＮ６＋／ＢＮ２−お
よびＢＮ６＋／ＢＮ４−の使用は、ＰＣＲ試験の魚肉への応用に想定できる。
【０１５８】 さらに、シリカビーズフィルタの使用は、魚肉に含まれる全ＤＮＡの精製に適
した方法である。この技術は非常に迅速（約１時間）であり、魚肉に含まれるタ
ンパク質を除去するために複数の工程を必要とするイソアミルアルコール／クロ
ロホルム抽出に比べて、非常に簡単に行える（２８）。
【０１５９】 プライマー対ＢＣ１＋／ＢＣ２−での同じ条件で行った増幅によっても、腐敗
しかけているヒメジの肉からの全ＤＮＡについて、有望な結果が得られた（図１
８）。実際に、相当のバックグラウンドノイズにかかわらず、ＰＣＲ生成物のア
ガロースゲル電気泳動によって、１７７ｂｐ断片の存在が明らかになる。
【０１６０】 タラの腐敗を監視する技術の応用によって、この技術は、長期間保存中の魚肉
の鮮度品質と直接相関があることが証明された。
【０１６１】 ＩＩＩ） 結論
【０１６２】 したがって、本発明による分子プライマー対により、海洋細菌中はもちろんの
こと、系統的に比較的遠い細菌、すなわち腸内細菌および汽水による細菌中のｔ
ｏｒＡ遺伝子を検出することができる。
【０１６３】 ＰＣＲ試験を魚肉に応用すると、本発明による分子プライマーによって腐敗し
かけている魚に存在する細菌のｔｏｒＡ遺伝子の検出が行えるため、有望な結果
が得られる。ＰＣＲ増幅は、魚肉サンプルには直接応用できないため、該肉から
の全ＤＮＡの抽出が最初に必要である。
【０１６４】 さらに、この技術は魚肉の鮮度に直接関係しており、ＴＶＢＮなどの古典的な
技術よりもさらに感受性である。
【０１６５】 Ｂ） 物質と方法
【０１６６】 １） 細菌株の分離；増殖培地および条件
【０１６７】 Shewanella cおよびShewanella missiliaを分離するために用いた魚は、マル
セイユ沖の地中海で捕獲されたヒメジ（Mullus surmuletus）に相当し、海水を
含む滅菌試験管中で４８時間室温で保持した。海水はミリポアフィルタ（０．４
５μＭ）によって事前に滅菌されていた。
【０１６８】 Shewanella菌株はＬＢ培地（“ルリア培養液”：酵母抽出物１０g/l、バクト
ペプトン５g/lおよびＮａＣｌ ５g/l）中で３０℃にて、嫌気性または好気性条
件で培養する。細菌 E. coliおよびSalmonella typhimuriumは、ＬＢ培地上で３
７℃にて培養した。菌株 Photobacterium phosphoreum は、ＡＴＣＣ（No. 1104
0）によって得られ、ＬＢ培地などの従来の培地で増殖しない。海洋培地（海洋
培養液；Ｄｉｆｃｏ）上で１５℃にて培養される。
【０１６９】 ２） ＰＣＲ技術
【０１７０】 ａ） 標準ＰＣＲ
【０１７１】 標準ＰＣＲ増幅は参考文献（６）で述べられている条件で実施する。反応混合
物（５０μl）は、１０ngの染色体ＤＮＡ、０．２μgの各オリゴヌクレオチドプ
ローブ、１００μMの４種類の各デオキシリボヌクレオチド３リン酸（ｄＸＴＰ
）、１０mMのＴｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、１．５mMのＭｇＣｌ ２、５０m
MのＫＣｌ、０．０１％のゼラチン、１単位のＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｑポリ
メラーゼ、ベーリンガーマンハイム／ロシュ）を含む。ＰＣＲプロセス中の蒸発
を防ぐため、反応混合物は最後に、５０μlの鉱油で覆われた。
【０１７２】 サーモサイクラー（MJ Research）で行う増幅は、３０サイクルの反応を使用
し、１サイクルは９４℃での３０秒間の変性工程、５５℃での３０秒間のハイブ
リダイゼーション工程、約７２℃での４５秒間（１kb／分）の伸長工程を含む。
ＤＮＡは、第１サイクルの開始前に、９４℃にて１．５分間事前に変性させる。
次に１０μlの各増幅生成物は、アガロースゲル電気泳動によって分析した。
【０１７３】 ｂ） 本発明による変性分子プライマーを用いたＰＣＲ条件
【０１７４】 本発明による分子プライマー、特に“ＤＤＮ”、“ＢＮ”または“ＢＣ”と呼
ばれるプライマーは上で定義したとおりである。
【０１７５】 反応混合物（５０μl）は、細菌からの１０ngの染色体ＤＮＡか、５μlの細胞
懸濁液（ＯＤ600＝０．５−１）または２５ngの魚から抽出された全ＤＮＡ、１
００μMの４種類の各デオキシリボヌクレオチド３リン酸（ｄＸＴＰ）、０．８
μｇの本発明によるプライマーの各混合物、１０mMのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８
．３）、１．５mMのＭｇＣｌ2、５０mMのＫＣｌ、０．０１％のゼラチン、１単
位のＴａｑポリメラーゼを含む。
【０１７６】 ＰＣＲ反応は、９４℃での３０秒間の変性工程、それに続く５５℃または４５
℃での３０秒間のハイブリダイゼーション工程、その後の７２℃での４５秒間の
伸長工程からなる、３０サイクルの連続反応を使用する。ＤＮＡは、第１サイク
ルの開始前に、９４℃にて１．５分間事前に変性させる。
【０１７７】 ３） 細菌からの染色体ＤＮＡの調製
【０１７８】 細菌からの染色体ＤＮＡは、１０ｍｌの培養物（ＯＤ600＞１）から出発して
調製した。細胞を１００００rpmで１０分間遠心分離にかけた後、残留物を１ml
の１０mM ＥＤＴＡ（ｐＨ８）中で再懸濁させる。ＳＤＳを加えて（最終０．５
％）、細胞溶解を行う。この溶液は、等体積のイソアミルアルコール／クロロホ
ルム（１：２４）と混合する。７０００rpmで２０分間遠心分離にかけた後、上
相を回収した。残留タンパク質のほとんどを除去するために、この操作を複数回
繰り返す。最後に、ＤＮＡはＮａＣｌ（０．３Ｍ最終）およびエタノール（２．
２体積）を加えて沈殿させる。
【０１７９】 ４） ＰＣＲのための、腐敗しかけている魚肉からの全染色体ＤＮＡの調製
【０１８０】 ａ） シリカビーズへのＤＮＡ固定に基づくキットを用いた迅速調製（高純度
ＰＣＲテンプレート調製キット、ベーリンガーマンハイム／ロシュ）
【０１８１】 ２５mgの魚肉を、４０μlのプロテイナーゼＫ（０．８mg）の存在下で、２０
０μlの溶解バッファー（４Ｍ尿素、２００mM Ｔｒｉｓ、２０mM ＮａＣｌ、
２００mM ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）中で、５５℃にて４５分間インキュベートす
る。細胞溶解を促進するために、サンプルを最初にメスを用いて切り刻む。２０
０μlの固定バッファー（６Ｍグアニジン−ＨＣｌ、１０mM尿素、１０mM Ｔｒ
ｉｓ−ＨＣｌ、２０％ v/v Triton、ｐＨ４．４）をサンプルに加え、次に７２
℃で１０分間インキュベートする。この溶液を１００μlのイソプロパノールと
混合し、次に８０００rpmで１分間遠心分離にかけ、シリカビーズに基づくフィ
ルターで濾過する（管高純度フィルタ＋収集管）。残留不純物は２回の洗浄工程
で除去する（洗浄バッファー：２０mM ＮａＣｌ、２mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、８
０％ v/v エタノール、ｐＨ７．５）。次にＤＮＡを溶出バッファー（１０mM
Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．５）で溶出させる。
【０１８２】 ｂ） ＮａＯＨ／ＳＤＳを用いた処理による、細胞からのＤＮＡの抽出
【０１８３】 腐敗しかけている魚（室温に維持した滅菌管中で１６時間インキュベーション
した後）から２５mgの魚肉を採取し、５０μlの０．０５Ｍ ＮａＯＨおよび０
．２５％ＳＤＳの溶液に置く。細胞をすりつぶした後、サンプルを９５℃にて１
５分間インキュベートする。４５０μlの滅菌水を混合物に加え、次に、８００
０ｇで２分間の遠心分離工程で細胞砕片を除去する。得られた５μlの上澄は、
ＰＣＲ試験に直接使用する。
【０１８４】 ｃ） イソアミルアルコール／クロロホルム抽出
【０１８５】 細菌ＤＮＡについて上述したように、２５mgの汚染魚肉から出発して、イソア
ミルアルコール／クロロホルム抽出による全染色体ＤＮＡの調製を行う。しかし
、魚肉サンプルに含まれる大量の不純物を除去できるように、抽出工程数を増加
させる。
【表４８】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 Shewanella massilia（ｔｏｒＡ／S. m.）、Shewanella c（ｔｏ
ｒＡ／S. c.）および Shewanella（ｔｏｒＡ／S. p.）のｔｏｒＡ遺伝子のヌク
レオチド配列のアラインメントを示す。
【図２】 Shewanella c のＴＭＡＯレダクターゼをコードするｔｏｒＡ遺
伝子の完全ヌクレオチド配列を示す。
【図３】 Photobacterium phosphreumのＴＭＡＯレダクターゼをコードす
るｔｏｒＡ遺伝子の完全ヌクレオチド配列を示す。
【図４】 Shewanella massilia（ｔｏｒＡ／S. m.）、E. coli（ｔｏｒＡ
／E. c.）、Rhodobacter sphaeroides（ＴｏｒＡ／R. s）および Rhodobacter c
apsulatus（ＴｏｒＡ／R. c.）のｔｏｒＡ遺伝子のヌクレオチド配列のアライン
メントを示す。矢印は、細菌Shewanella massilia のｔｏｒＡ遺伝子上で生成さ
れた、保存領域から開始する各種プライマーの位置を示す。さらに詳細には、S.
massilia のｔｏｒＡ遺伝子上の各種プライマー“ＤＤＮ”および“ＢＮ”の位
置は以下のとおりである：
【表４９】
【図５】 Salmonella typhimuriumのＴＭＡＯレダクターゼをコードするｔ
ｏｒＡ遺伝子の部分ヌクレオチド配列を示す。
【図６】 Shewanella cのＴＭＡＯレダクターゼの完全ペプチド配列を示す
。
【図７】 Shewanella massilia（ＴｏｒＡ／S. m.）、E. coli（ＴｏｒＡ
／E. c.）、Rhodobacter sphaeroides（ＴｏｒＡ／R. s）のＴｏｒＡタンパク質
の対応するタンパク質領域を使用して、ＤＤＮ１＋／ＤＤＮ５−分子プライマー
を用いて P.phosphoreum 内で増幅されたＤＮＡ断片から推定した、Photobacter
ium phosphreum（ＴｏｒＡ／P. p.）のＴｏｒＡタンパク質の断片のペプチド配
列のアラインメントを示す。
【図８】 E. coli（ＴｏｒＡ／E. c.）のＴｏｒＡタンパク質、Rhodobacte
r sphaeroides（ＴｏｒＡ／R. s）のＤｏｒＡタンパク質およびShewanella mass
ilia（ＴｏｒＡ／S. m.）のＴｏｒＡタンパク質の対応するタンパク質領域を使
用して、ＤＤＮ１＋／ＤＤＮ５−分子プライマーを用いて S. typhimurium 内で
増幅されたＤＮＡ断片から推定した、Salmonella typhimurium（ＴｏｒＡ／S. t
.）のＴｏｒＡタンパク質の断片のペプチド配列のアラインメントを示す。
【図９】 本発明による“ＤＤＮ”分子プライマーの１つを生成するために
使用する、Shewanella属の細菌および E. coliのＴＭＡＯレダクターゼをコード
する遺伝子の、高度に保存された領域の核酸配列のアラインメントを示す。 （ａ）Shewanella属の各種細菌および E. coliのＴＭＡＯレダクターゼをコ
ードするｔｏｒＡ遺伝子上の各種ＤＤＮプライマーのおおよその位置および向き
、 （ｂ）ＤＤＮプライマーの１つ（ＤＤＮ１＋）を生成するための方法の例；
枠内の区域は、Shewanella属〔Shewanella massilia（ｔｏｒＡ／S. massilia）
、Shewanella putrefaciens（ｔｏｒＡ／S. putrefaciens）、Shewanella c（ｔ
ｏｒＡ／S. c.）〕および E. Coliの細菌のＴＭＡＯレダクターゼをコードする
遺伝子の高度に保存された核領域に対応する。
【図１０】 ＤＤＮ１＋／ＤＤＮ５−分子プライマー（レーン１、５および
９；予想サイズ：８２０ｂｐ）、ＤＤＮ５＋／ＤＤＮ２−（レーン２、６および
１０；予想サイズ：２３４ｂｐ）、ＤＤＮ５＋／ＤＤＮ３−（レーン３、７およ
び１１；予想サイズ：７４０ｂｐ）およびＤＤＮ５＋／ＤＤＮ３−（レーン４、
８および１２；予想サイズ：８６６ｂｐ）を用いて、Shewanella massilia（レ
ーン１、２、３および４）、Shewanella c（レーン５、６、７および８）および
Shewanella putrefaciens ＭＲ−１（レーン９、１０、１１および１２）の染
色体ＤＮＡから開始する増幅を行った場合の、ＰＣＲによる生成物のアガロース
ゲル電気泳動を示す。レーンＭ：サイズマーカー。
【図１１】 プライマー対ＤＤＮ１＋／ＤＤＮ５−（レーン１；予想サイズ
：８２０ｂｐ）、ＤＤＮ５＋／ＤＤＮ２−（レーン２；予想サイズ：２３４ｂｐ
）、ＤＤＮ５＋／ＤＤＮ３−（レーン３；予想サイズ：７４０ｂｐ）およびＤＤ
Ｎ５＋／ＤＤＮ４−（レーン４；予想サイズ：８６６ｂｐ）を用いて、Photobac
terium phosphoreumの染色体ＤＮＡから開始する増幅を行った場合の、ＰＣＲに
よる生成物のアガロースゲル電気泳動を示す。レーンＭ：サイズマーカー。
【図１２】 分子プライマー対ＤＤＮ１＋／ＤＤＮ５−（レーン１〜３；予
想サイズ：８２０ｂｐ）、ＤＤＮ５＋／ＤＤＮ２−（レーン４〜６；予想サイズ
：２３４ｂｐ）、ＤＤＮ５＋／ＤＤＮ３−（レーン７〜９；予想サイズ：７４０
ｂｐ）、ＤＤＮ５＋／ＤＤＮ４（レーン１０および１１；予想サイズ：８６６ｂ
ｐ）を用いて、S. massilia（レーン１、４、７および１０）、E. coli（レーン
２、５、８および１１）およびS. typhimurium（レーン３、６および９）の染色
体ＤＮＡから開始する増幅を行った場合の、ＰＣＲによる生成物のアガロースゲ
ル電気泳動を示す。レーンＭ：サイズマーカー。
【図１３】 本発明による“ＢＮ”分子プライマーの１つを生成するために
使用する、Shewanella属、Rhodobacter属および E. coliのＴＭＡＯレダクター
ゼをコードする遺伝子の、高度に保存された領域の核酸配列のアラインメントを
示す。 （ａ）Shewanella属、Rhodobacter属の各種細菌および E. coliのＴＭＡＯ
レダクターゼをコードするｔｏｒＡ遺伝子上の各種ＢＮプライマーのおおよその
位置および向き、 （ｂ）ＢＮプライマーの１つ（ＢＮ３＋）を生成するための方法の例；枠内
の区域は、細菌Shewanella massilia（ｔｏｒＡ／S. massilia）、E. coli、Rho
dobacter sphaeroides（ｄｏｒＡ／R. sphaeroides）および Rhodobacter capsu
latus（ｄｏｒＡ／R. capsulatus）のＴＭＡＯレダクターゼをコードする遺伝子
の高度に保存された核領域に対応する。
【図１４】 S. massilia（ＴｏｒＣ／S. m．）、E. coli（ＴｏｒＣ／E. c
.）のＴｏｒＣチトクロムの、および R. sphaeroides（ＤｏｒＣ／R. s）のＤｏ
ｒＣチトクロムのタンパク質配列のアラインメントを示す。矢印は、細菌Shewan
ella massiliaのｔｏｒＣ遺伝子上で生成された、保存領域から開始する各種プ
ライマーの位置を示す。たとえば、対ＢＣ１＋／ＢＣ２−は、S. massilia中の
ＴｏｒＣタンパク質をコードする遺伝子の１９７ｂｐ断片の増幅を引き起こし、
アミノ酸６６個のポリペプチドをコードする該断片は、S. massilia のＴｏｒＣ
のペプチド配列の位置１１４および１７９に位置するアミノ酸によって結合され
る。対ＢＣ１＋／ＢＣ３−は、S. massilia中のＴｏｒＣタンパク質をコードす
る遺伝子の７１９ｂｐ断片の増幅を引き起こし、アミノ酸２４０個のポリペプチ
ドをコードする該断片は、S. massiliaのＴｏｒＣのペプチド配列の位置１１４
および３５３に位置するアミノ酸によって結合される。対ＢＣ２＋／ＢＣ３−は
、S. massilia中のＴｏｒＣタンパク質をコードする遺伝子の５４２ｂｐ断片の
増幅を引き起こし、アミノ酸１８１個のポリペプチドをコードする該断片は、S.
massiliaのＴｏｒＣのペプチド配列の位置１７３および３５３に位置するアミ
ノ酸によって結合される。
【図１５】 分子プライマー対ＢＣ１＋およびＢＣ２−を用いて、E. coli
（レーン１）、S. typhimurium（レーン２）、P. phosphreum（レーン３）、S.
massilia（レーン４）、R. sphaeroides（レーン５）またはErwinia chrysanthe
mi（レーン６）の染色体ＤＮＡから開始する増幅を行った場合の、ＰＣＲによる
生成物のアガロースゲル（２％）による電気泳動を示す。ＤＮＡ断片（１１７塩
基対）の予想サイズは矢印で示す。レーンＭ：サイズマーカー。
【図１６】 本発明による分子プライマーの特異性に対する染色体ＤＮＡの
影響を示す。ＰＣＲ増幅は、２．５μg（レーン１および４）、５μg（レーン２
および５）または１０μg（レーン３および６）の精製したニシン染色体ＤＮＡ
の存在下で、分子プライマーＤＤＮ１＋およびＤＤＮ５−を用いて行う。レーン
４、５および６は、反応混合物にShewanella massiliaの細胞懸濁液２．５μｌ
を加えて行った試験に対応する。レーンＭ：サイズマーカー。
【図１７】 ＢＮ６＋／ＢＮ４−プライマー（レーン１、４、７および１０
；予想サイズ：３６４bp）、ＢＮ６＋／ＢＮ２−プライマー（レーン２、５、８
および１１；予想サイズ：７１１bp）、ＤＤＮ１＋／ＤＤＮ５−（レーン３、６
、９および１２；予想サイズ：８２０bp）を用いて、腐敗しかけている魚肉（タ
ラ：レーン１〜３；シタビラメ：レーン４〜６；タイ：レーン７〜９およびヒメ
ジ：レーン１０〜１２）から抽出した全ＤＮＡから開始する増幅を行った場合の
、ＰＣＲによる生成物のアガロースゲル（２％）による電気泳動を示す。レーン
Ｍ：サイズ標準（スケール１KbのＢＲＬ）。
【図１８】 ＢＣ１＋／ＢＣ２−分子プライマーを用いて、腐敗しかけてい
るヒメジ（レーン１および２）による全ＤＮＡの２種類の異なる調製物に対して
増幅を行った場合の、ＰＣＲによる生成物のアガロースゲル（２％）による電気
泳動を示す。矢印は、１７７塩基対の増幅ＤＮＡ断片を示す。
【図１９】 Photobacterium phosphoreum（ｔｏｒＡ／P. p.）、Shewanell
a putrefaciens（ｔｏｒＡ／S. p.）、Shewanella massilia（ｔｏｒＡ／S. m.
）、Shewanella c（ｔｏｒＡ／S. c.）、および Salmonella typhimurium（ｔｏ
ｒＡ／S. t.）のｔｏｒＡ遺伝子のヌクレオチド配列のアラインメントを示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ， ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，Ｃ Ａ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ， ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，Ｋ Ｅ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ， ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，Ｒ Ｕ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ， ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ドス・サントス，ジャン−フィリップ フランス国、エフ−13011 マルセイユ、 アヴニュー・ジャン・コンバール 16 (72)発明者 メジョン，ヴァンサン フランス国、エフ−13008 マルセイユ、 アヴニュー・ドゥ・アンブール 141 Ｆターム(参考） 4B024 AA11 CA01 CA02 CA09 HA14 4B063 QA01 QA18 QQ06 QQ42 QR32 QR39 QR56 QR62 QS25 QS34

Claims (15)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 水生動物の肉の分解プロセスに関与するすべての細菌の存在
    を、該細菌の担体となりうる宿主において検出する方法を実施するための、細菌
    中のトリメチルアミンＮ−オキシドレダクターゼ（ＴＭＡＯレダクターゼ）系の
    タンパク質をコードする配列、または約１５〜２５ヌクレオチドのプローブもし
    くはプライマーなどのこの配列の断片、またはＴＭＡＯレダクターゼ系のタンパ
    ク質をコードするこの配列のか、もしくは後者の断片の１以上のヌクレオチドの
    添加、抑制および／または置換に由来する配列であって、該断片および該由来す
    る配列が、ＴＭＡＯレダクターゼ系のタンパク質をコードする該配列とハイブリ
    ダイズ可能である配列を含むものから選択されるヌクレオチド配列の使用。
  2. 【請求項２】 ＴＭＡＯレダクターゼ系のタンパク質をコードする配列が、
    細菌中の、ＴＭＡＯレダクターゼ、さらに指定されたＴｏｒＡまたはＤｏｒＡタ
    ンパク質をコードする配列、またはｃ型チトクロム、さらに指定されたＴｏｒＣ
    またはＤｏｒＣタンパク質をコードする配列から選択されることを特徴とする、
    請求項１記載の使用。
  3. 【請求項３】 ＴＭＡＯレダクターゼ系のタンパク質をコードするヌクレオ
    チド配列が、以下の細菌： −シーワネラ（Shewanella）属、フォトバクテリウム（Photobacterium）属ま
    たはビブリオ（Vibrio）属などの海洋細菌であって、該配列が特に以下： ＊図１に示すシーワネラ・マシリア（Shewanella massilia）のＴｏｒＡタ
    ンパク質をコードする配列、 ＊図１に示すシーワネラ・プトレファシエンス（Shewanella putrefaciens
    ）のＴｏｒＡタンパク質をコードする配列、 ＊図２に示すシーワネラ・シー（Shewanella c）のＴｏｒＡタンパク質をコ
    ードする配列、 ＊図３に示すフォトバクテリウム・フォスフォレウム（Photobacterium pho
    sphoreum）のＴｏｒＡタンパク質をコードする部分配列、 ＊図１４に示すシーワネラ・マシリア（Shewanella massilia）のＴｏｒＣ
    タンパク質をコードする配列 から選択される細菌、 −ロードバクター（Rhodobacter）属またはロゼオバクター（Roseobacter）属
    などの汽水から得られた細菌であって、該配列が特に以下： ＊図４に示すロードバクター・スファロイドス（Rhodobacter sphaeroides
    ）のＤｏｒＡタンパク質をコードする配列、 ＊図４に示すロードバクター・カプスラトス（Rhodobacter capsulatus）の
    ＤｏｒＡタンパク質をコードする配列、 ＊図１４に示すロードバクター・スファロイドス（Rhodobacter sphaeroide
    s）のＤｏｒＣタンパク質をコードする配列 から選択される細菌、 −エシェリシア（Escherichia）属またはサルモネラ（Salmonella）属などの
    腸内細菌であって、該配列が、特に以下： ＊図４に示すエシェリシア・コリ（Escherichia coli）のＴｏｒＡタンパク
    質をコードする配列、 ＊図５に示すサルモネラ・ティフィムリウム（Salmonella typhimurium）の
    ＴｏｒＡタンパク質をコードする部分配列、 ＊図１４に示すエシェリシア・コリ（Escherichia coli）のＴｏｒＣタンパ
    ク質をコードする配列 から選択される細菌、 から選択されることを特徴とする、請求項１又は２記載の使用。
  4. 【請求項４】 ヌクレオチド配列が、以下の３つの群のプライマー： のものから選択されることを特徴とする、請求項１または請求項２記載の使用。 （１） 以下： ◆以下： 【表１】 のヌクレオチド配列“ＤＤＮ＋”の組成物、 ◆以下： 【表２】 のヌクレオチド配列“ＤＤＮ−”の組成物 を含むプライマー“ＤＤＮ”の群、 （２） 以下： ◆以下： 【表３】 のヌクレオチド配列“ＢＮ＋”の組成物、 ◆以下： 【表４】 のヌクレオチド配列“ＢＮ−”の組成物 を含むプライマー“ＢＮ”の群 （３） 以下： ◆以下： 【表５】 のヌクレオチド配列“ＢＣ＋”の組成物、 ◆以下： 【表６】 のヌクレオチド配列“ＢＣ−”の組成物 を含むプライマー“ＢＣ”の群、 〔ここで 【表７】 であり、 プライマー対は、対のプライマーの１つがヌクレオチド配列ＤＤＮ＋、ＢＮ＋
    またはＢＣ＋の上述の組成物の１つに対応するのに対して、他のプライマーがヌ
    クレオチド配列ＤＤＮ−、ＢＮ−またはＢＣ−の上述の組成物の１つにそれぞれ
    対応するような方法で選択され、 該プライマー対は、以下： （ａ） 約８２０塩基対（ｂｐ）のサイズの、細菌中のＴｏｒＡタンパク質を
    コードする遺伝子の断片の増幅、特に、図４に示すエス・マシリア（S. massili
    a）のｔｏｒＡ遺伝子の位置６２０〜１４５０に位置するヌクレオチドを境界と
    する８２１ｂｐ断片などの、シーワネラ（Shewanella）属の細菌中のＴｏｒＡタ
    ンパク質をコードする遺伝子の８２１ｂｐ断片の増幅を導く、ＤＤＮ１＋／ＤＤ
    Ｎ５−対、 （ｂ） 約７１０ｂｐのサイズを有する、細菌中のＴｏｒＡタンパク質をコー
    ドする遺伝子の断片の増幅、特に、図４に示すエス・マシリア（S. massilia）
    のｔｏｒＡ遺伝子の位置１６５７〜２４０３に位置するヌクレオチドを境界とす
    る７２７ｂｐ断片などの、シーワネラ（Shewanella）属の細菌中のＴｏｒＡタン
    パク質をコードする遺伝子の７２７ｂｐ断片の増幅を導く、ＢＮ６＋／ＢＮ２−
    対、 （ｃ） 約３６０ｂｐのサイズを有する、細菌中のＴｏｒＡタンパク質をコー
    ドする遺伝子の断片の増幅、特に、図４に示すエス・マシリア（S. massilia）
    のｔｏｒＡ遺伝子の位置１６５７〜２０２３に位置するヌクレオチドを境界とす
    る３５５ｂｐ断片などの、シーワネラ（Shewanella）属の細菌中のＴｏｒＡタン
    パク質をコードする遺伝子の３５５ｂｐ断片の増幅を導く、ＢＮ６＋／ＢＮ４−
    対、 （ｄ） 約１７０ｂｐのサイズを有する、細菌中のＴｏｒＣタンパク質をコー
    ドする遺伝子の断片の増幅、特に、図１４に示すエス・マシリア（S. massilia
    ）のＴｏｒＣタンパク質の位置１１４〜１７９に位置するアミノ酸を境界とする
    ポリペプチド断片をコードする１９７ｂｐ断片などの、Shewanella属の細菌中の
    ＴｏｒＣタンパク質をコードする遺伝子の１９７ｂｐ断片の増幅を導く、ＢＣ１
    ＋／ＢＣ２−対 の４つの対のいずれか１つから選択される〕 のいずれか１つの群より選択されるプライマー対の形で使用されることを特徴と
    する、請求項１〜３のいずれか１項記載の使用。
  5. 【請求項５】 請求項３に記載の、水生動物の肉の分解プロセスに関与する
    細菌の担体になりうる宿主が、水生生物、特に魚および甲殻類などの海洋生物、
    より詳細には、シタビラメおよびタラなどの大西洋の魚、またはヒメジおよびタ
    イなどの地中海の魚、または淡水または汽水からの一定の動物であることを特徴
    とする、請求項１〜４のいずれか１項記載の使用。
  6. 【請求項６】 試験サンプルを得た水生動物の鮮度を評価する方法の枠組み
    内で、該動物が自然環境から取り出されたときの、水生動物の肉の分解に関与す
    るすべての細菌の存在を検出する方法を実施するための、請求項１〜５のいずれ
    か１項記載の使用。
  7. 【請求項７】 以下の配列： 【表８】 ここで 【表９】 の１つに対応するヌクレオチド配列。
  8. 【請求項８】 以下の組成物： ◆以下： 【表１０】 のヌクレオチド配列“ＤＤＮ＋”の組成物、 ◆以下： 【表１１】 のヌクレオチド配列“ＤＤＮ−”の組成物、 ◆ヌクレオチド配列“ＢＮ＋”の以下の組成物： 【表１２】 ◆以下： 【表１３】 のヌクレオチド配列“ＢＮ−”の組成物、 ◆以下： 【表１４】 のヌクレオチド配列“ＢＣ＋”の組成物、 ◆以下： 【表１５】 のヌクレオチド配列“ＢＣ−”の組成物、 ここで、 【表１６】 である、 の１つに対応する組成物と一緒に混合されたヌクレオチド配列の組成物。
  9. 【請求項９】 以下： （１） 以下： ◆以下： 【表１７】 のヌクレオチド配列“ＤＤＮ＋”の組成物、 ◆以下： 【表１８】 のヌクレオチド配列“ＤＤＮ−”の組成物 を含むプライマー“ＤＤＮ”の群、 （２） 以下： ◆以下： 【表１９】 のヌクレオチド配列“ＢＮ＋”の組成物、 ◆以下： 【表２０】 のヌクレオチド配列“ＢＮ−”の組成物 を含むプライマー“ＢＮ”の群、 （３） 以下を含むプライマー“ＢＣ”の群： ◆ヌクレオチド配列“ＢＣ＋”の以下の組成物： 【表２１】 ◆以下： 【表２２】 のヌクレオチド配列“ＢＣ−”の組成物 〔ここで、 【表２３】 であり、 プライマー対は、対のプライマーの１つがヌクレオチド配列ＤＤＮ＋、ＢＮ＋
    またはＢＣ＋の上述の組成物の１つに対応するのに対して、他のプライマーがヌ
    クレオチド配列ＤＤＮ−、ＢＮ−またはＢＣ−の上述の組成物の１つにそれぞれ
    対応するような方法で選択され、 該プライマー対は、以下： （ａ） 約８２０塩基対（ｂｐ）のサイズの、細菌中のＴｏｒＡタンパク質を
    コードする遺伝子の断片の増幅、特に、図４に示すエス・マシリア（S. massili
    a）のｔｏｒＡ遺伝子の位置６２０〜１４５０に位置するヌクレオチドを境界と
    する８２１ｂｐ断片などの、シーワネラ（Shewanella）属の細菌中のＴｏｒＡタ
    ンパク質をコードする遺伝子の８２１ｂｐ断片の増幅を導く、ＤＤＮ１＋／ＤＤ
    Ｎ５−対、 （ｂ） 約７１０ｂｐのサイズを有する、細菌中のＴｏｒＡタンパク質をコー
    ドする遺伝子の断片の増幅、特に、図４に示すエス・マシリア（S. massilia）
    のｔｏｒＡ遺伝子の位置１６５７〜２４０３に位置するヌクレオチドを境界とす
    る７２７ｂｐ断片などの、シーワネラ（Shewanella）属の細菌中のＴｏｒＡタン
    パク質をコードする遺伝子の７２７ｂｐ断片の増幅を導く、ＢＮ６＋／ＢＮ２−
    対、 （ｃ） 約３６０ｂｐのサイズを有する、細菌中のＴｏｒＡタンパク質をコー
    ドする遺伝子の断片の増幅、特に、図４に示すエス・マシリア（S. massilia）
    のｔｏｒＡ遺伝子の位置１６５７〜２０２３に位置するヌクレオチドを境界とす
    る３５５ｂｐ断片などの、シーワネラ（Shewanella）属の細菌中のＴｏｒＡタン
    パク質をコードする遺伝子の３５５ｂｐ断片の増幅を導く、ＢＮ６＋／ＢＮ４−
    対、 （ｄ） 約１７０ｂｐのサイズを有する、細菌中のＴｏｒＣタンパク質をコー
    ドする遺伝子の断片の増幅、特に、図１４に示すエス・マシリア（S. massilia
    ）のＴｏｒＣタンパク質の位置１１４〜１７９に位置するアミノ酸を境界とする
    ポリペプチド断片をコードする１９７ｂｐ断片などの、Shewanella属の細菌中の
    ＴｏｒＣタンパク質をコードする遺伝子の１９７ｂｐ断片の増幅を導く、ＢＣ１
    ＋／ＢＣ２−対 の４つの対のいずれか１つから選択される〕 のプライマーの群の１つから選択されることを特徴とする、プライマー対。
  10. 【請求項１０】 細菌の担体になることが可能である宿主内での水生動物の
    肉の分解に関与するすべての細菌を検出する方法であって、該方法は、該宿主か
    ら採取した生物学的サンプルから出発して行われ、該生物学的サンプルは、特に
    問題の水生動物の肉の皮下断片に対応し、そして、請求項１〜９のいずれか一項
    で定義したような少なくとも１個のヌクレオチド配列と該宿主から採取した生物
    学的サンプル中に存在することが可能である水生動物の肉の分解に関与する細菌
    のＴＭＡＯレダクターゼ系のタンパク質をコードする遺伝子の断片とのハイブリ
    ダイゼーションの工程を含み、次いで、必要に応じ、コピーの数が増幅されてい
    る、ＴＭＡＯレダクターゼ系のタンパク質をコードする遺伝子またはこの遺伝子
    の断片の該サンプル中の存在の可能性を、特に電気泳動によって検出する工程を
    含むことを特徴とする、方法。
  11. 【請求項１１】 以下の工程： − 宿主から全ＤＮＡを抽出し、この細菌のゲノムを請求項１〜９のいずれか
    １項で定義したヌクレオチド配列またはプライマーに接近することができるよう
    にするための、宿主から採取した生物学的サンプルの処理であって、核酸のシリ
    カビーズ上への固定に基づく迅速ＤＮＡ抽出技術を特に使用して行う処理、 − 上述のヌクレオチド配列または上述の遺伝子もしくは上述の遺伝子の断片
    とハイブリタイズするプライマーを用いる、サンプル中に存在可能である水生動
    物の肉の分解に関与する細菌のＴＭＡＯレダクターゼ系のタンパク質をコードす
    る遺伝子またはこの遺伝子の断片のコピー数の増幅、 −上述の細菌のＴＭＡＯレダクターゼ系のタンパク質をコードする遺伝子、ま
    たはこの遺伝子の断片の複製の増幅された数のありうる存在の検出、したがって
    調査する生物学的サンプル中の該細菌の存在の検出 を含むことを特徴とする、請求項１０記載の検出方法。
  12. 【請求項１２】 以下の工程： − 好ましくは１０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．３、５０mM ＫＣｌ、１
    ．５mM ＭｇＣｌ2、０．０１％ゼラチン、それぞれ１００μMの濃度のＤＮＡの
    ４種の構成要素のデオキシヌクレオチド（ｄＣＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴ
    ＴＰ）、および請求項１〜９記載のプライマー対からなるバッファー中において
    、約９０℃〜約１００℃、有利には９４℃において、約１．５分間加熱すること
    による、宿主の全２本鎖ＤＮＡの１本鎖ＤＮＡへの予備変性、 −前の工程で得られた媒体に、たとえばＴａｑポリメラーゼなどのＤＮＡポリ
    メラーゼを添加することによる実際の増幅、 ◆実際の変性工程に対応する、約９４℃における約３０秒間の加熱、 ◆次いで、調査した生物学的サンプル中に存在することができる、細菌のＴ
    ＭＡＯレダクターゼ系のタンパク質をコードする遺伝子またはこの遺伝子の断片
    とプライマーとのハイブリダイゼーション工程に相当する、約３５℃〜約６０℃
    、特に約４５℃または５５℃での約３０秒間の加熱、 ◆そして最後に、前の工程で互いに対してハイブリダイズしたプライマーの
    伸長工程に相当する、７２℃での約４５秒間の加熱、こうした細菌のＴＭＡＯレ
    ダクターゼ系のタンパク質をコードする遺伝子の断片の相補的ヌクレオチド配列
    の作成、この後者の配列は、上述のプライマーへとハイブリダイズするヌクレオ
    チドを境界とし、 − 約１５〜約３５回、有利には約３０回の前の増幅工程の反復 を含むＴＭＡＯレダクターゼをコードする遺伝子数の増幅を特徴とする、請求項
    １１記載の検出方法。
  13. 【請求項１３】以下： − 請求項１〜９のいずれか１項記載の１以上のヌクレオチド配列またはプラ
    イマー、 − ＤＮＡポリメラーゼ、 −好ましくは１０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．３、５０mM ＫＣｌ、１．
    ５mM ＭｇＣｌ2、０．０１％ゼラチン、それぞれ１００μMの濃度の、ＤＮＡの
    ４種の構成要素であるデオキシヌクレオチド（ｄＣＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、
    ｄＴＴＰ）からなる反応媒体 を含むことを特徴とする、請求項１０〜１２のいずれか１項記載の検出方法を実
    施するためのキット。
  14. 【請求項１４】 以下： − 図２に示す、海洋細菌シーワネラ・シー（Shewanella c ）のＴｏｒＡタ
    ンパク質をコードするｔｏｒＡ遺伝子の配列、 ＊または、ペプチド配列を図６に示す、遺伝子コードの変性により上述の配
    列に由来し、そしてシーワネラ・シー（ Shewanella c） のＴｏｒＡタンパク質
    をコードする任意の配列、 ＊または、特に１以上のヌクレオチドの置換、抑制または添加による上述の
    ヌクレオチド配列に由来する任意の配列であって、図２に示す上述のヌクレオチ
    ド配列と、好ましくは、約３５％〜１００％の相同性を有する配列、 ＊または、上述のヌクレオチド配列、または上で定義した後者に由来する配
    列の任意の断片であって、好ましくは、少なくとも１５個のヌクレオチドからな
    る断片。 −図３に示す、海洋細菌フォトバクテリウム・フォスフォレウム（ Photobact
    erium phosphoreum ）のＴｏｒＡタンパク質をコードする遺伝子の部分配列、 ＊または、ペプチド配列を図７に示す、遺伝子コードの変性により上述の配
    列に由来する、およびフォトバクテリウム・フォスフォレウム（ Photobacteriu
    m phosphoreum ）のＴｏｒＡタンパク質をコードする任意の配列、 ＊または、特に１以上のヌクレオチドの置換、抑制または添加による上述の
    ヌクレオチド配列に由来する任意の配列であって、図３に示す上述のヌクレオチ
    ド配列と好ましくは約３５％〜１００％の相同性を有する配列、 ＊または、上述のヌクレオチド配列、または上で定義した後者に由来する配
    列の任意の断片であって、好ましくは少なくとも１５個のヌクレオチドからなる
    断片、 − 図５に示す、海洋細菌サルモネラ・ティフィムリウム（Salmonella typhi
    murium のＴｏｒＡタンパク質をコードする遺伝子の部分配列、 ＊または、図８に示すペプチド配列の、遺伝子コードの変性により上述の配
    列に由来する、およびサルモネラ・ティフィムリウム（ Salmonella typhimuriu
    m ）のＴｏｒＡタンパク質をコードする任意の配列、 ＊または、特に１以上のヌクレオチドの置換、抑制または添加による上述の
    ヌクレオチド配列に由来する任意の配列であって、図５に示す上述のヌクレオチ
    ド配列と好ましくは約３５％〜１００％の相同性を有する配列、 ＊または、上述のヌクレオチド配列、または上で定義した後者に由来する配
    列のいずれかの断片であって、好ましくは少なくとも１５個のヌクレオチドから
    なる断片 を含むヌクレオチド配列。
  15. 【請求項１５】 請求項１４記載のヌクレオチド配列によってコードされ、
    そして、以下： − シーワネラ・シー（Shewanella c ）のＴｏｒＡタンパク質の図６に示す
    アミノ酸配列、 ＊または、特に１以上のアミノ酸の置換、抑制または添加による上述のペプ
    チド配列に由来する配列であって、図６に示す上述のペプチド配列と好ましくは
    約３５％〜１００％の相同性を有する配列、 ＊または、上述のペプチド配列、または上で定義した後者に由来する配列の
    いずれかの断片であって、好ましくは少なくとも５個のアミノ酸からなる断片。 −図７に示す、フォトバクテリウム・フォスフォレウム（Photobacterium pho
    sphoreum ）のＴｏｒＡタンパク質の部分アミノ酸配列、 ＊または、特に１以上のアミノ酸の置換、抑制または添加による上述のペプ
    チド配列に由来する配列であって、図７に示す上述のペプチド配列と好ましくは
    約３５％〜１００％の相同性を有する配列、 ＊または、上述のペプチド配列、または上で定義した後者に由来する配列の
    いずれかの断片であって、好ましくは少なくとも５個のアミノ酸からなる断片。 −図８に示す、サルモネラ・ティフィムリウム（Salmonella typhimurium ）
    のＴｏｒＡタンパク質の部分アミノ酸配列、 ＊または、特に１以上のアミノ酸の置換、抑制または添加による上述のペプ
    チド配列に由来する配列であって、図８に示す上述のペプチド配列と好ましくは
    約３５％〜１００％の相同性を有する配列、 ＊または、上述のペプチド配列、または上で定義した後者に由来する配列の
    いずれかの断片であって、好ましくは少なくとも５個のアミノ酸からなる断片 を含むペプチド配列。
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