CA2384637A1 - Sequences nucleotidiques issues de genes codant pour la trimethylamine n-oxyde reductase, et leurs utilisations, notamment pour la detection de bacteries - Google Patents

Abstract

La présente invention a pour objet l'utilisation de séquences nucléotidiques choisies parmi celles comprenant une séquence codant pour une protéine du système triméthylamine N-oxyde réductase (TMAO réductase) chez les bactéries , ou un fragment ou une séquence dérivée de cette séquence, pour la mise en oeuvre d'une méthode de détection de la présence de toutes bactéries impliquées dans le processus de dégradation des chairs d'animaux aquatiques, chez un hôte susceptible d'être porteur de telles bactéries. L'invention a également pour objet des séquences nucléotidiques telles que définies ci- dessus, des méthodes de détection susmentionnées ainsi que les trousses pour la mise en oeuvre de ces méthodes.

Description

SEQUENCES NUCLEOTIDIQUES ISSUES DE GENES CODANT POUR LA
TRIMETHYLAMINE N-OXYDE REDUCTASE, ET LEURS UTILISATIONS, NOTAMMENT POUR LA DETECTION DE BACTERIES.
La présente invention a pour objet des séquences nucléotidiques issues de gènes codant pour la triméthylamine N-oxyde réductase (TMAO réductase) et utilisables, notamment en tant qu'amorces, pour la mise en oeuvre de procédés de détection de bactéries impliquées dans i l'altération des chairs d'animaux aquatiques, et plus particulièrement d'animaux marins.
Le triméthylamine N oxyde (TMAO) est un des principaux constituants de petit poids moléculaire des animaux marins, où il peut représenter jusqu'à 1% de leur poids sec. En anaérobiose, certaines bactéries utilisent le TMAO comme accepteur exogène d'électrons pour leur respiration. Le TMAO est alors réduit en triméthylamine (TMA), composé
très volatil, responsable en grande partie de l'odeur nauséabonde des poissons en voie de décomposition. La réduction du TMAO en TMA a été mise en évidence chez les bactéries marines, comme celles du genre Shewanella, Photobacterium ou Yibrio (1, 2), chez des bactéries photosynthétiques isolées dans les eaux saumâtres, comme celles du genre Rhodobacter (3), mais aussi chez plusieurs entérobactéries, comme Escherichia coli, Salmonella typhimuriur~c ou Proteus vulgaris (4).
L'enzyme responsable de la réduction du TMAO en TMA, correspond à la triméthylamine N-oxyde réductase (TMAO réductase), dont les propriétés ont été
étudiées chez différents organismes. A titre d'exemple, il existe chez E. coli deux enzymes distinctes responsables de la réduction du TMAO : la TMAO réductase et 1â DMSO réductase.
La TMAO
réductase, qui est responsable de 90% de la réduction du TMAO, est une molybdoenzyme périplasmique de 90 kDa, pouvant être trouvée sous forme de monomère ou de dimère (5). Les TMAO réductases des différentes bactéries étudiées sont toutes des molybdoenzymes de 80 100 kDa qui peuvent être retrouvées sous forme de monomère, dimère ou tétramère. Ces protéines sont toutes inductibles en anaérobiose par le TMAO, mais aussi par le DMSO
(diméthylsulfoxyde). Enfin, hormis chez P. vulgaris, les TMAO réductases sont toutes localisées dans le périplasme de la bactérie.
L'étude du système TMAO réductase au niveau génétique et moléculaire a été
réalisée chez les entérobactéries E. coli et celles du genre Rhodobacter. Les deux TMAO/DMSO
réductases des bactéries du genre Rhodobacter et la TMAO réductase inductible d'E. coli présentent une homologie au niveau de leur séquence primaire (6, 7, 8). La structure globale de la TMAO réductase d'E. coli pourrait se rapprocher de celles décrites pour Rhodobacter sphaeroides ou Rhodobacter capsulatus. Chez E. coli, les gènes qui codent pour les différents composants du système TMAO réductase sont organisés en opéron : l'opéron torCAD, qui code pour les trois protéines TorC, TorD et TorA (6). Chez Rhodobacter, les gènes qui codent pour les différents composants du système TMAO/DMSO réductase sont également organisés en opéron : fopéron dorCDA, qui code pour trois protéines DorC, DorD (également appelé Dora) et DorA, possédant des homologies avec respectivement les protéines TorC, TorD
et TorA
d'E.coli (9, 10).
Une étude phylogénétique par séquencage de l'ADNr 16S a été réalisée sur une bactérie isolée à partir d'un poisson péché dans la baie de Marseille, et gardé à
température ambiante dans de l'eau de mer filtrée. Les résultats obtenus montrent que cette bactérie, qui possède une activité TMAO réductase importante, correspond à une nouvelle espèce du genre Shewanella, proche de Shewanella putrefaciens. Elle a été appelée Shewanella massilia.
Excepté la protéine TorE, les produits des gènes de l'opéron torECAD de S. massilia possèdent de fortes homologies avec les protéines impliquées dans les systèmes TMAO réductase d'E.
coli et des bactéries du genre Rhodobacter (19). De même, la structure globale de la TMAO
réductase de S. massilia présente des homologies avec les structures déjà décrites des TMAO/DMSO
réductases des bactéries du genre Rhodobacter (20).
L'altération des chairs de poissons, comme de la plupart des aliments, est essentiellement due à l'activité métabolique de certaines bactéries, pouvant représenter jusqu'à 10g cellules par gramme de produit. Les premières modifications post mortem qui surviennent au niveau des chairs dé poissons ne sont pas nécessairement dues aux bactéries; mais à
certaines réactions d'autolyse. Cependant, le développement microbien constitue très vite l'élément majeur de l'altération, le tissu musculaire du poisson constituant un substrat pour la croissance bactérienne. Plusieurs facteurs intrinsèques aux chairs de poissons peuvent expliquer leur très grande altérabilité, comparée à d'autres produits alimentaires : une hydratation importante, un pH post mortem élevé (> 6), une forte teneur en substances azotées non protéiques, dont le TMAO forme la part essentielle et, une faible teneur en protéines de soutien (11, 12). Ces différentes caractéristiques contribuent au développement d'une flore microbienne d'altération spécifique des chairs de poissons. De façon intéressante, la diversité des espèces de poissons ne semble pas avoir d'incidence sur la nature ou le nombre de bactéries initialement présentes sur

2 le poisson: En revanche, la microflore bactérienne du poisson semble directement liée à
l'environnement naturel où il évolue. Ainsi, la contamination de l'eau qui dépend essentiellement de la température, la salinité ou la concentration en oxygène dissous, semble jouer un rôle déterminant. L'origine des bactéries retrouvées au niveau des chairs de poissons ne provient pas uniquement de la microflore des poissons vivants : des bactéries contaminantes peuvent notamment provenir de la chaîne du froid (la glace, les récipients contenant les poissons, les étapes de transformation...). Parmi l'ensemble de la flore microbienne retrouvée au niveau des chairs de poissons, une partie seulement est rendue responsable du phénomène de putréfaction. Tandis qu'une contamination bactérienne ne rend pas nécessairement les chairs de poissons impropres à la consommation, certaines bactéries entraînent rapidement des changements désagréables dans la texture, la saveur ou l'odeur dégagée (13).
Les produits de la mer représentent donc ' une denrée hautement périssable, posant de nombreux problèmes de conservation aux industriels de la pêche. La maîfirise de la qualité
fraîcheur de ces produits constitue ainsi une préoccupation de plus en plus importante pour l'ensemble du secteur de la pêche (producteurs, transformateurs ou distributeurs), conduisant depuis quelques années les industriels à rechercher de nouvelles techniques permettant de rendre compte de l'état de fraîcheur du poisson dans des délais très brefs.
Actuellement, la détermination de (état de fraîcheur des produits de la mer est essentiellement fondée sur une appréciation sensorielle (aspect, odeur, saveur) qui permet au mieux de conclure à un produit frais, moyennement frais ou impropre à la consommation. Cette méthode organoleptique n'est cependant applicable qu'à des produits entiers, et des analyses plus fiables en laboratoire sont souvent indispensables.
Lés méthodes basées sur une analyse bactériologique (flore bactérienne totale) applicables à des produits transformés sont de plus en plus utilisées pour apprécier l'état de fraîcheur du poisson. L'estimation directe du nombre de bactéries cultivables sur un échantillon de poisson reste la méthode la plus communément utilisée : après croissance sur différents milieux (par exemple milieu de citrate de fer), chaque cellule va former une colonie visible sur boîtes de pétri, permettant ainsi un dénombrement. Bien que cette technique soit simple d'utilisation et assez sensible, elle nécessite cependant un temps d'incubation pour la croissance important (de 3 à 5 jours environ). De plus, la composition du milieu de croissance, ou les températures retenues pour ces tests (20-30°C), ne permettent pas toujours de détecter l'ensemble des bactéries d'altération. Ainsi, la réglementation actuelle qui préconise une

3 température de 30°C pour réaliser ces tests (arrêté de 1979), ne permet pas de pouvoir détecter certaines bactéries d'altération comme Photobacterium phosphoreum qui ne croissent pas à
cette température. Ainsi, même si la mesure non spécifique de la charge microbienne totale constitue un bon indicateur de l'état d'hygiène des poissons, elle ne permet cependant pas d'évaluer la qualité sensorielle de ce type de produit. L'examen microscopique des aliments est une technique rapide pour estimer le niveau de contamination bactérienne. Les cellules colorées à facridine orange sont visualisées par une technique de microscopie de fluorescence ; le principal inconvénient de cette méthode reste cependant sa faible sensibilité
(entre 104 et 105 cellules).
La dégradation des composants cellulaires du poisson conduit à la production de nombreuses substances qui peuvent servir d'indicateur indirect d'une contamination bactérienne. Une alternative aux méthodes énumérées ci-dessus a donc consisté
à suivre par des techniques chimiques, différents produits de dégradation des chairs de poissons (14). La détermination de l'azote basique volatile total (ABVT), dont l'ammoniac (NH3) et la triméthylamine (TMA) forment la part essentielle, est une technique largement répandue à
l'heure actuelle pour estimer le degré de décomposition des chairs de poissons. Le dosage de l'ABVT a l'avantage d'être simple, rapide et d'un coût de revient très faible.
La détermination du taux de TMA dans l'ABVT, permet d'apporter un élément qualitatif supplémentaire au critère ABVT. Ce critère semble en effet moins dépendant de variations qui affectent généralement le taux de TMA ou d'ABVT (l'espèce du poisson, sa teneur en graisses etc...). La même méthodologie que pour l'ABVT peut être utilisée pour doser la TMA.
D'autres techniques colorimétrique, enzymatique ou chromatographiques ont également été
décrites pour quantifier la TMA (15, 16). Lors de la réaction de réduction du TMAO en TMA
par les bactéries, les chairs de poissons en décomposition subissent différents changements : baisse du potentiel rédox, une augmentation du pH, de la conductivité électrique.
Plusieurs études ont donc également utilisé ces différents indicateurs pour tenter de suivre indirectement le dégagement de TMA. Cependant l'ensemble de ces études n'a jamais permis d'établir une corrélation définitive entre le niveau de TMA dégagé et la qualité fraîcheur des échantillons de poissons. De nombreux autres produits de dégradation ont également été testés afm de pouvoir déterminer par des dosages chimiques le niveau d'altération du poisson : le sulfure d'hydrogène, l'hypoxanthine, l'indol, l'histamine et les acides aminés.
Cependant, ces

4 différents dosages ne sont significatifs que dans certaines espèces de poissons, ou à un niveau d'altération très avancé.
La réaction de polymérisation en chaîne (PCR) est une technique moléculaire qui permet d'amplifier de grandes quantités d'une séquence d'ADN cible dans le but de la visualiser. Depuis quelques années, la technique de la PCR est de plus en plus utilisée pour la détection et l'identification de micro-organismes notamment dans le domaine de la bactériologie clinique ou celui de la sécurité des aliments (17, 18).
Actuellement, les tests PCR
appliqués aux produits alimentaires permettent principalement la détection de bactéries pathogènes bien déterminées (Shigella, Salmonella, Listeria ...).
La présente invention découle de la mise en évidence par les inventeurs du fait que les séquences d'ADN codant pour une protéine du système TMAO réductase, ont une homologie suffisante au sein des diverses bactéries, notamment au sein des bactéries responsables de l'altération des tissus d'organismes aquatiques, et plus particulièrement au sein des bactéries marines, pour permettre la mise en oeuvre de procédés de détection de toutes bactéries responsables de (altération des tissus par leur activité TMAO réductase, lesdits procédés étant applicables sur tout animal aquatique, et notamment sur tout animal marin.
L'un des buts de la présente invention est de fournir un test de qualité
fraîcheur des produits aquatiques, et plus particulièrement des produits de la mer, à la fois rapide, peu coûteux, et offrant une fiabilité élevée en terme de spécificité et de sensibilité.
L'un des autres buts de la présente invention est de fournir un test de détection non pas d'un type bactérien, mais de l'ensemble des bactéries responsables de l'altération des tissus d'organismes aquatiques, et notamment de la putréfaction des chairs de poissons, à savoir aussi bien les bactéries marines, que les entérobactéries ou les bactéries isolées au niveau des eaux saumâtres.
Un autre but de la présente invention est de fournir un test de détection de bactéries responsables de l'altération des tissus d'organismes marins, applicable à
différentes espèces de poissons provenant de régions géographiques différentes.
Un autre but de la présente invention est de fournir un test de détection de bactéries responsables de l'altération des tissus d'organismes marins, suffisamment sensible pour détecter des étapes précoces de l'altération.
La présente invention a pour obj et l'utilisation de séquences nucléotidiques choisies parmi celles comprenant une séquence codant pour une protéine du système triméthylamine N-oxyde s réductase (TMAO réductase) chez les bactéries, ou un fragment de cette séquence telle qu'une sonde ou une amorce d'environ 15 à environ 25 nucléotides, ou une séquence dérivée par addition, suppression, et/ou substitution d'un ou plusieurs nucléotides de cette séquence codant pour une protéine du système TMAO réductase ou d'un fragment de cette dernière, ledit fragment et ladite séquence dérivée étant capables de s'hybrider, notamment dans les conditions d'hybridation définies ci-après, avec ladite séquence codant pour une protéine du système TMAO réductase, pour la mise en oeuvre d'une méthode de détection de la présence de toutes bactéries impliquées dans le processus de dégradation des chairs d'animaux aquatiques, chez un hôte susceptible d'être porteur de telles bactéries.
Avantageusement, les séquences nucléotidiques codant pour une protéine du système TMAO réductase susmentionnées, sont choisies parmi celles correspondant à
l'opéron torCAD
ou l'opéron dorCDA mentionnés ci-dessus, du systéme TMAO réductase chez les bactéries.
De préférence, la séquence codant pour une protéine du système TMAO réductase susmentionnée, est choisie parmi les séquences codant pour la TMAO réductase chez les bactéries, encore désignée protéine TorA ou DorA, ou codant pour un cytochrome de type c chez les bactéries, encore désigné protéine TorC ou DorC.
Selon un mode particulièrement avantageux de l'invention, les séquences nucléotidiques codant pour une protéine du système TMAO réductase sont choisies parmi celles des bactéries suivantes - les bactéries marines, telles que celles du genre Shewanella, Photobacterium ou Vibrio, lesdites séquences étant notamment choisies parmi les suivantes * la séquence SEQ >D NO :1 codant pour la protéine TorA de Shewanella massilia représentée sur la figure 1, * la séquence SEQ )D NO :2 codant pour la protéine TorA de Shewanella putref'aciens représentée sur la figure 1, * la séquence SEQ ID NO :3 codant pour la protéine TorA de Shewanella c représentée sur la figure 2, * la séquence partielle SEQ m NO :4 codant pour la protéine TorA de Photobacterium phosphoreum représentée sur la figure 3, * la séquence codant pour la protéine TorC SEQ m NO :5 de Shewanella massilia représentée sur la figure 14, - les bactéries provenant des eaux saumâtres, telles que celles du genre Rhodobacter, ou Roseobacter, lesdites séquences étant notamment choisies parmi les suivantes * la séquence SEQ >D NO : 6 codant pour la protéine DorA de Rhodobacter sphaeroides représentée sur la figure 4, * la séquence SEQ ID NO : 7 codant pour la protéine DorA de Rhodobacter capsulatus représentée sur la figure 4, * la séquence codant pour la protéine DorC SEQ ID NO : 8 de Rhodobacter sphaeroides représentée sur la figure 14, - les entérobactéries, telles que celles du genre Escherichia, ou Salmonella, lesdites séquences étant notamment choisies parmi les suivantes * la séquence SEQ )D NO : 9 codant pour la protéine TorA de Escherichia coli représentée sur la figure 4, * la séquence partielle SEQ )D NO : 10 codant pour la protéine TorA de Salmonella typhimurium représentée sur la figure 5, * la séquence codant pour la protéine TorC SEQ >D NO : 11 de Escherichia 1 S coli représentée sur la figure 14.
L'invention a plus particulièrement pour objet l'utilisation susmentionnée de séquences nucléotidiques choisies parmi les fragments des séquences définies ci-dessus, ou parmi les séquences dérivées de ces fragments, lesdits fragments ou séquences dérivées comprenant environ 15 à 25 nucléotides, et sont utilisés par paires pour former des couples d'amorces permettant l'amplification de fragments de gènes codant pour une protéine du système TMAO-réductase de bactéries impliquées dans la dégradation des chairs d'animaux aquatiques, selon la technique PCR.
Avantageusement, les séquences nucléotidiques susmentionnées sont utilisées sous forme de couples d'amorces choisis parmi l'un quelconque des trois groupes d'amorces suivants (1) le groupe d'amorces « DDN » amplifiant des fragments d'ADN du gène torA, ce groupe comprenant ~ les compositions de séquences nucléotidiques « DDN+ » suivantes - DDN1+ (SEQ ID NO : 12) : S' CGG vGA yTA CTC bAC hGG TGC 3' : mélange de 54 séquences nucléotidiques, - DDNS+ (SEQ )D NO : 13) : S' ATy GAT GCG ATy CTC GAA CC 3' : mélange de 4 séquences nucléotidiques, 1 les compositions de séquences nucléotidiques « DDN- » suivantes - DDN2- (SEQ ID NO : 14) : 5'CGT Amw sGT CGA kAT CGT TrC GCT C 3' mélange de 32 séquences nucléotidiques, - DDN3- (SEQ ID NO : 15) : 5' GAC TCA CAy Awy TGy GAG TG 3' : mélange de 16 séquences nucléotidiques, - DDN4- (SEQ ID NO : 16) : S' TGr CCd CGr kCG TT~ AAG AC 3' : mélange de 24 séquences nucléotidiques, - DDNS- (SEQ ID NO : 17) : S' CCv GGT TCG AGr ATC GCA TC 3' : mélange de 6 séquences nucléotidiques, (2) le groupe d'amorces « BN » » amplifiant des fragments d'ADN du gène torA, ce groupe comprenant ~ les compositions de séquences nucléotidiques « BN+ » suivantes - BN1+ (SEQ ID NO : 18) : 5' C bGA yAT CsT rCT GCC 3' : mélange de 16 séquences nucléotidiques, - BN3+ (SEQ >D NO : 19) : S ' GGm GAy TAy TCb ACm GGy GC 3 ' : mélange de 96 séquences nucléotidiques, - BN6+ (SEQ ID NO : 20) : 5' Twy GAr CGy AAC GAy mTC GA 3' : mélange de 64 séquences nucléotidiques, ~ les compositions de séquences nucléotidiques « BN- » suivantes - BN2- (SEQ m NO : 21) : 5' GG vyC rTA CCA bsC vCC TTC 3' : mélange de 216 séquences nucléotidiques, - BN4- (SEQ >D NO : 22) : 5' ATC Arr CCn swv GGC GTG CC 3' : mélange de 192 séquences nucléotidiques, - BNS- (SEQ )D NO : 23) : S'GbC ACr TCd GTy TGy GG 3', : mélange de 72 séquences nucléotidiques, (3) le groupe d'amorces « BC » » amplifiant des fragments d'ADN du gène torC, ce groupe comprenant 1 les compositions de séquences nucléotidiques « BC+ » suivantes - BC1+ (SEQ ID NO : 24) : 5' ACn CCn GAr AAr TTy GAr GC 3' : mélange de 256 séquences nucléotidiques, - BC2+ (SEQ ID NO : 25) : 5' TGy ATh GAy TGy CAy AAr GG 3' : mélange de 96 séquences nucléotidiques, 1 les compositions de séquences nucléotidiques « BC- » suivantes - BC2- (SEQ )D NO : 26) : S' CCy TTr TGr CAr TCd ATr CA 3' : mélange de 96 séquences nucléotidiques, - BC3- (SEQ m NO : 27) : S' TTn GCr TCr AAr TGn GC 3' : mélange de 128 séquences nucléotidiques, dans lesquelles n = (A,C,G,T), y = (C,T), r = (A,G), h = (A,C,T), d = (G,A,T), m = (A,C), w = (A,T), b = (G,T,C), s = (G,C), v = (G,A,C), et k = (G, T), les couples d'amorces étant choisis de telles de telle sorte que l'une des amorces d'un couple correspond à l'une des compositions de séquences nucléotidiques DDN+, BN+ ou BC+
susmentionnées, tandis que l'autre amorce correspond respectivement à l'une des compositions de séquences nucléotidiques DDN-, BN- ou BC- susmentionnées, lesdits couples d'amorces étant notamment choisis parmi l'un quelconque des quatre couples suivants (a) le couple DDN1+ / DDNS-, conduisant à l'amplification de fragments du gène codant pour la protéine TorA chez les bactéries, d'une taille d'environ 820 paires de bases (bp), et notamment à l'amplification d'un fragment de 821 bp du gène codant pour la protéine TorA
chez les bactéries du genre Shewanella, tel que le fragment de 821 bp délimité
par les nucléotides situés aux positions 620 à 1450 du gène torA de S. massilia représenté sur la figure 4, (b) le couple BN6+ / BN2-, conduisant à l'amplification de fragments du gène codant pour la protéine TorA chez les bactéries, d'une taille d'environ 710 bp, et notamment à
l'amplification d'un fragment de 727 bp du gène codant pour la protéine TorA
chez les bactéries du genre Shewanella, tel que le fragment de 727 bp délimité par les nucléotides situés aux positions 1657 à 2403 du gène torA de S. massilia représenté sur la figure 4, (c) le-couple BN6+ /BN4-, conduisant à l'amplification de fragments du gène codant pour la protéine TorA chez les bactéries, d'une taille d'environ 360 bp, et notamment à
l'amplification d'un fragment de 355 bp du gène codant pour la protéine TorA
chez les bactéries du genre Shewanella, tel que le fragment de 355 bp délimité par les nucléotides situés aux positions 1657 à 2023 du gène torA de S. massilia représenté sur la figure 4, (d) le couple BC1+ /BC2-, conduisant à l'amplification de fragments du gène codant pour la protéine TorC chez les bactéries, d'une taille d'environ 170 bp, et notamment à
l'amplification d'un fragment de 197 bp du gène codant pour la protéine TorC
chez les bactéries du genre Shewanella, tel que le fragment de 197 bp codant pour le fragment polypeptidique délimité par les acides aminés situés aux positions 114 à 179 de la protéine TorC de S. massilia représentée sur la figure 14.
Les hôtes susceptibles d'être porteurs de bactéries impliquées dans le processus de dégradation des chairs d'animaux aquatiques, telles que décrites ci-dessus, sont des organismes aquatiques, notamment des organismes marins tels que les poissons et les crustacés, et plus particulièrement les poissons d'Atlantique tels que la sole, le .cabillaud, ou les poissons de la mer Méditerranée tels que le rouget de roche, la dorade, ainsi que certains animaux des eaux douces ou saumâtres.
L'invention a plus particulièrement pour objet l'utilisation susmentionnée de séquences i nucléotidiques décrites ci-dessus, pour la mise en oeuvre d'une méthode de détection de la présence de toutes bactéries impliquées dans la dégradation des chairs d'animaux aquatiques, dans le cadre d'un procédé d'évaluation de l'état de fraîcheur des animaux aquatiques sur lesquels est prélevé l'échantillon testé, lorsque ces derniers sont extraits de leur environnement naturel.
L'invention concerne également toute séquence nucléotidique correspondant à
l'une des séquences suivantes - DDN1+ : 5' CGG vGA yTA CTC bAC hGG TGC 3', - DDNS+ : 5' ATy GAT GCG ATy CTC GAA CC 3', - DDN2- : S'CGT Amw sGT CGA kAT CGT TrC GCT C 3', - DDN3- : 5' GAC TCA CAy Awy TGy GAG TG 3', - DDN4- : 5' TGr CCd CGr kCG TTA AAG AC 3', - DDNS- : S' CCv GGT TCG AGr ATC GCA TC 3', - BN1+ : 5' C bGA yAT CsT rCT GCC 3', - BN3+ : S' GGm GAy TAy TCb ACm GGy GC 3', - BN6+ : S ' Twy GAr CGy AAC GAy mTC GA 3 ', - BN2- : 5' GG vyC rTA CCA bsC vCC TTC 3', - BN4- : 5' ATC Arr CCn swv GGC GTG CC 3', - BNS- : 5'GbC ACr TCd GTy TGy GG 3', - B C 1 + : 5 ' ACn CCn GAr AAr TTy GAr GC 3 ', - BC2+ : 5' TGy ATh GAy TGy CAy AAr GG 3', - BC2- : 5' CCy TTr TGr CAr TCd ATr CA 3', - BC3- : S' TTn GCr TCr AAr TGn GC 3', dans lesquelles n = (A,C,G,T), y = (C,T), r = (A,G), h = (A,C,T), d = (G,A,T), m = (A,C), 1o w = (A,T), b = (G,T,C), s = (G,C), v = (G,A,C), et k = (G,T).
L'invention a également pour obj et toute composition de séquences nucléotidiques en mélange, correspondant à l'une des compositions suivantes ~ les compositions de séquences nucléotidiques « DDN+ » suivantes - DDN1+ : 5' CGG vGA yTA CTC bAC hGG TGC 3' : mélange de 54 séquences nucléotidiques, - DDNS+ : S' ATy GAT GCG ATy CTC GAA CC 3' . mélange de 4 séquences nucléotidiques, ~ les compositions de séquences nucléotidiques « DDN- » suivantes - DDN2- : S'CGT Amw sGT CGA kAT CGT TrC GCT C 3' : mélange de 32 séquences nucléotidiques, - DDN3- : 5' GAC TCA CAy Awy TGy GAG TG 3' : mélange de 16 séquences nucléotidiques, - DDN4- : 5' TGr CCd CGr kCG TTA AAG AC 3' : mélange de 24 séquences nucléotidiques, - DDNS- : S' CCv GGT TCG AGr ATC GCA TC 3' : mélange de 6 séquences nucléotidiques, 1 les compositions de séquences nucléotidiques « BN+ » suivantes - BN1+ : 5' C bGA yAT CsT rCT GCC 3' : mélange de 16 séquences nucléotidiques, - BN3+ : 5' GGm GAy TAy TCb ACm GGy GC 3' : mélange de 96 séquences nucléotidiques, - BN6+ : 5' Twy GAr CGy AAC GAy mTC GA 3' : mélange de 64 séquences nucléotidiques, ~ les compositions de séquences nucléotidiques « BN- » suivantes - BN2- : 5' GG vyC rTA CCA bsC vCC TTC 3' : mélange de 216 séquences nucléotidiques, - BN4- : 5' ATC Arr CCn swv GGC GTG CC 3' : mélange de 192 séquences nucléotidiques, - BNS- : 5'GbC ACr TCd GTy TGy GG 3' : mélange de 72 séquences nucléotidiques, 1 les compositions de séquences nucléotidiques « BC+ » suivantes - BC1+ : S' ACn CCn GAr AAr TTy GAr GC 3' : mélange de 256 séquences nucléotidiques, - BC2+ : 5 ' TGy ATh GAy TGy CAy AAr GG 3 ' : mélange de 96 séquences nucléotidiques, ~ les compositions de séquences nucléotidiques « BC- » suivantes - BC2- : 5' CCy TTr TGr CAr TCd ATr CA 3' : mélange de 96 séquences nucléotidiques, - BC3- : S' TTn GCr TCr AAr TGn GC 3' : mélange de 128 séquences nucléotidiques, dans lesquelles n = (A,C,G,T), y = (C,T), r = (A,G), h = (A,C,T), d = (G,A,T), m = (A,C), w = (A,T), b = (G,T,C), s = (G,C), v = (G,A,C), et k = (G,T).
L'invention concerne également les couples d'amorces choisis au sein de l'un des groupes d'amorces suivants (1) le groupe d'amorces « DDN » comprenant 1 les compositions de séquences nucléotidiques « DDN+ » suivantes - DDN1+ : 5' CGG vGA yTA CTC bAC hGG TGC 3' : mélange de 54 séquences nucléotidiques, - DDNS+ : 5' ATy GAT GCG ATy CTC GAA CC 3' : mélange de 4 séquences nucléotidiques, ~ les compositions de séquences nucléotidiques « DDN- » suivantes - DDN2- : 5'CGT Amw sGT CGA kAT CGT TrC GCT C 3' : mélange de 32 séquences nucléotidiques, - DDN3- : 5 ' GAC TCA CAy Awy TGy GAG TG 3 ' : mélange de 16 séquences nucléotidiques, - DDN4- : S' TGr CCd CGr kCG TTA AAG AC 3' : mélange de 24 séquences nucléotidiques, - DDNS- : 5' CCv GGT TCG AGr ATC GCA TC 3' : mélange de 6 séquences nucléotidiques, (2) le groupe d'amorces « BN » comprenant ~ les compositions de séquences nucléotidiques « BN+ » suivantes - BN1+ : S' C bGA yAT CsT rCT GCC 3' : mélange de 16 séquences nucléotidiques, - BN3+ : 5' GGm GAy TAy TCb ACm GGy GC 3' : mélange de 96 séquences nucléotidiques, - BN6+ : 5' Twy GAr CGy AAC GAy mTC GA 3' : mélange de 64 séquences nucléotidiques, 1 les compositions de séquences nucléotidiques « BN- » suivantes - BN2- : 5' GG vyC rTA CCA bsC vCC TTC 3' . mélange de 216 séquences nucléotidiques, - BN4- : 5' ATC Arr CCn swv GGC GTG CC 3' . mélange de 192 séquences nucléotidiques, - BNS- : 5'GbC ACr TCd GTy TGy GG 3' : mélange de 72 séquences nucléotidiques, (3) le groupe d'amorces « BC » comprenant ~ les compositions de séquences nucléotidiques « BC+ » suivantes - BC1+ : S' ACn CCn GAr AAr TTy GAr GC 3' : mélange de 256 séquences nucléotidiques, - BC2+ : 5' TGy ATh GAy TGy CAy AAr GG 3' : mélange de 96 séquences nucléotidiques, 1 les compositions de séquences nucléotidiques « BC- » suivantes - BC2- : 5' CCy TTr TGr CAr TCd ATr CA 3' : mélange de 96 séquences nucléotidiques, - BC3- : 5' TTn GCr TCr AAr TGn GC 3' : mélange de 128 séquences nucléotidiques, dans lesquelles n = (A,C,G,T), y = (C,T), r = (A,G), h = (A,C,T), d = (G,A,T), m = (A,C), w = (A,T), b = (G,T,C), s = (G,C), v = (G,A,C), et k = (G,T), les couples d'amorces étant choisis de telles de telle sorte que l'une des amorces d'un couple correspond à l'une des compositions de séquences nucléotidiques DDN+, BN+ ou BC+
susmentionnées, tandis que l'autre amorce correspond respectivement à l'une des compositions de séquences nucléotidiques DDN-, BN- ou BC- susmentionnées, lesdits couples d'amorces étant notamment choisis parmi l'un quelconque des quatre couples suivants (a) le couple DDN1+ / DDNS-, conduisant à l'amplification de fragments du gène codant pour la protéine TorA chez les bactéries, d'une taille d'environ 820 paires de bases (bp), et notamment à l'amplification d'un fragment de 821 bp du gène codant pour la protéine TorA
chez les bactéries du genre Shéwanella, tel que le fragment de 821 bp délimité
par les nucléotides situés aux positions 620 à 1450 du gène torA de S. massilia représenté sur la figure 4, (b) le couple BN6+ / BN2-, conduisant à l'amplification de fragments du gène codant pour la protéine TorA chez les bactéries, d'une taille d'environ 710 bp, et notamment à
l'amplification d'un fragment de 727 bp du gène codant pour la protéine TorA
chez les bactéries du genre Shewanella, tel que le fragment de 727 bp délimité par les nucléotides situés aux positions 1657 à 2403 du gène torA de S. massilia représenté sur la figure 4, (c) le couple BN6+ BN4-, conduisant à l'amplification de fragments du gène codant pour la protéine TorA chez les bactéries, d'une taille d'environ 360 bp, et notamment à
l'amplification d'un fragment de 355 bp du gène codant pour la protéine TorA
chez les bactéries du genre Shewanella, tel que le fragment de 355 bp délimité par les nucléotides situés aux positions 1657 à 2023 du gène torA de S. massilia représenté sur la figure 4, (d) le couple BC1+ BC2-, conduisant à l'amplification de fragments du gène codant pour la protéine TorC chez les bactéries, d'une taille d'environ 170 bp, et notamment à
l'amplification d'un fragment de 197 bp du gène codant pour la protéine TorC
chez les bactéries du genre Shewanella, tel que le fragment de 197 bp codant pour le fragment polypeptidique délimité par les acides aminés situés aux positions 114 à 179 de la protéine TorC de S. massilia représentée sur la figure 14.
L'invention a également pour objet une. méthode de détection de toutes bactéries impliquées dans la dégradation des chairs d'animaux aquatiques chez un hôte susceptible d'être porteur de telles bactéries, ladite méthode étant effectuée à partir d'un échantillon biologique prélevé sur cet hôte, cet échantillon biologique correspondant notamment à un fragment sous-cutané de chair de (animal aquatique en question, et étant caractérisée en ce qu'elle comprend une étape d'hybridation d'au moins une séquénce nucléotidique telle que définie ci-dessus, avec des fragments de gènes codant pour une protéine du système TMAO-réductase de bactéries impliquées dans la dégradation des chairs d'animaux aquatiques susceptibles d'être présentes dans l'échantillon biologique prélevé sur ledit hôte, suivie d'une étape de révélation, notamment par électrophorèse, de la présence éventuelle dans ledit échantillon de gènes codant pour une protéine du système TMAO-réductase, ou de fragments de ces gènes, dont le nombre de copies a été le cas échéant amplifié.
L'invention a plus particulièrement pour objet une méthode de détection telle que définie ci-dessus, caractérisée en ce qu'elle comprend les étapes suivantes - le traitement d'un échantillon biologique prélevé sur cet hôte afm d'extraire l'ADN total de cet hôte et de rendre le génome de ces bactéries accessible aux séquences nucléotidiques ou amorces définies ci-dessus, ce traitement étant notamment effectué à l'aide d'une technique d'extraction rapide de l'ADN basée sur la fixation des acides nucléiques à des billes de silice, - l'amplification du nombre de copies de gènes codant pour les protéines du système TMAO-réductase de bactéries impliquées dans la dégradation des chairs d'animaux aquatiques, ou de fragments de ces gènes, susceptibles d'être présents dans cet échantillon, à l'aide des séquences nucléotidiques ou amorces susmentionnées, - la détection de la présence éventuelle d'un nombre amplifié de copies de gènes codant pour une protéine du système TMAO-réductase des bactéries susmentionnées, ou de fragments de ces gènes, et donc de la présence de telles bactéries dans l'échantillon biologique étudié.
Avantageusement, les méthodes de détection selon l'invention, sont caractérisées en ce que l'amplification du nombre de gènes codant pour les protéines du système TMAO-réductase comprend les étapes suivantes - la prédénaturation de l'ADN double brin total de l'hôte en ADN mono-brin, de préférence dans un tampon constitué de IOmM Tris-HCl pH 8,3, SOmM KCI, l,SmM
MgCl2, 0,01 % de gélatine, des 4 désoxynucléotides constitutifs des ADN (dCTP, dATP, dGTP, dTTP) à une concentration de 100 p,M chacun, et des couples d'amorces, tels que définis ci-dessus, par chauffage entre environ 90 °C et environ 100 °C, avantageusement à 94 °C, pendant environ 1,5 minute, - l'amplification proprement dite par addition au milieu obtenu à l'étape précédente d'ADN polymérase, par exemple la Taq polymérase, 1 chauffage à environ 94°C pendant environ 30 secondes, ce qui correspond à
l'étape de dénaturation proprement dite, 1 puis chauffage entre environ 35°C à environ 60 °C, et notamment à environ 45°C
ou 55°C, pendant environ 30 secondes, ce qui correspond à l'étape d'hybridation des amorces avec les gènes codant pour les protéines du système TMAO-réductase de bactéries, ou des fragments de ces gènes, susceptibles d'être présents dans l'échantillon biologique étudié, ~ et enfin, chauffage à 72 °C, pendant environ 45 secondes, ce qui correspond à
l'étape d'élongation des amorces, hybridées à l'étape précédente, l'une vers l'autre, produisant ainsi des séquences nucléotidiques complémentaires de fragments des gènes codant pour les protéines du système TMAO-réductase de bactéries, ces dernières séquences étant délimitées par les nucléotides s'hybridant avec les amorces susmentionnées, - la répétition de l'étape d'amplification précédente entre environ 15 et environ 35 fois, avantageusement environ 30 fois.
L'invention concerne également les trousses ou kits pour la mise en oeuvre d'une méthode de détection susmentionnée, caractérisés en ce qu'ils comprennent - une ou plusieurs séquences nucléotidiques ou amorces telles que définies ci-dessus, - une ADN polymérase, - un milieu réactionnel avantageusement constitué de IOmM Tris-HCl pH 8,3, SOmM
KCI, l,SmM MgClz, 0,01 % de gélatine, des 4 désoxynucléotides constitutifs des ADN (dCTP, dATP, dGTP, dTTP) à une concentration de 100 pM chacun.
L'invention concerne également toute séquence nucléotidique comprenant - la séquence représentée sur la figure 2 du gène torA codant pour la protéine TorA de la bactérie marine Shewanella C, - ou toute séquence dérivée de la séquence susmentionnée par dégénérescence du code génétique, et codant pour la protéine TorA de Shewanella C, dont la séquence peptidique est représentée sur la figure 6, - ou toute séquence dérivée de la séquence nucléotidique susmentionnée, notamment par substitution, suppression ou addition d'un ou plusieurs nucléotides, ladite séquence dérivée ayant de préférence une homologie d'environ 35. % à 100 % avec la séquence nucléotidique susmentionnée représentée sur la figure 2, - ou tout fragment de la séquence nucléotidique susmentionnée, ou d'une séquence dérivée de cette dernière telle que définie ci-dessus, ledit fragment étant de préférence constitué
d'au moins environ 15 nucléotides.
L'invention a également pour objet tôute séquence peptidique codée par la séquence nucléotidique susmentionnée représentée sur la figure 2, et comprenant - la séquence en acides aminés représentée sur la figure 6 de la protéine TorA
de Shewanella c, - ou une séquence dérivée de la séquence peptidique susmentionnée, notamment par substitution, suppression ou addition d'un ou plusieurs acides aminés, ladite séquence dérivée ayant de préférence une homologie d'environ 35 % à 100 % avec la séquence peptidique susmentionnée représentée sur la figure 6, - ou un fragment de la séquence peptidique susmentionnée, ou d'une séquence dérivée de cette dernière telle que définie ci-dessus, ledit fragment étant de préférence constitué d'au moins environ S acides aminés.
L'invention concerne également toute séquence nucléotidique comprenant - la séquence partielle représentée sur la figure 3 du gène codant pour la protéine TorA de la bactérie marine Photobacterium phosphoreum, - ou toute séquence dérivée de la séquence susmentionnée par dégénérescence du code génétique, et codant pour le fragment de la protéine TorA de Photobacterium phosphoreum dont la séquence peptidique est représentée sur la figure 7, - ou toute séquence dérivée de la séquence nucléotidique susmentionnée, notamment par substitution, suppression ou addition d'un ou plusieurs nucléotides, ladite séquence dérivée ayant de préférence une homologie d'environ 35 % à 100 % avec la séquence nucléotidique susmentionnée représentée sur la figure 3, - ou tout fragment de la séquence nucléotidique susmentionnée, ou d'une séquence dérivée de cette dernière telle que définie ci-dessus, ledit fragment étant de préférence constitué
d'au moins environ 15 nucléotides.
L'invention concerne également toute séquence peptidique codée par la séquence nucléotidique susmentionnée représentée sur le figure 3, et comprenant - la séquence partielle en acides aminés représentée sur la figure 7 de la protéine TorA de Photobacterium phosphoreum, - ou une séquence dérivée de la séquence peptidique susmentionnée, notamment par substitution, suppression ou addition d'un ou plusieurs acides aminés, ladite séquence dérivée ayant de préférence une homologie d'environ 35 % à 100 % avec la séquence peptidique susmentionnée représentée sur la figure 7, - ou un fragment de la séquence peptidique susmentionnée, ou d'une séquence dérivée de cette dernière telle que définie ci-dessus, ledit fragment étant de préférence constitué d'au moins environ 5 acides aminés.
L'invention a également pour objet toute séquence nucléotidique comprenant - la séquence partielle représentée sur la figure 5 du gène codant pour la protéine TorA de la bactérie marine Salmonella typhimurium, - ou--toute séquence dérivée de la séquence susmentionnée par dégénérescence du code génétique, et codant pour la protéine TorA de Salmonella typhimurium dont la séquence peptidique est représentée sur la figure 8, - ou toute séquence dérivée de la séquence nucléotidique susmentionnée, notamment par substitution, suppression ou addition d'un ou plusieurs nucléotides, ladite séquence dérivée ayant de préférence une homologie d'environ 35 % à 100 % avec la séquence nucléotidique susmentionnée représentée sur la figure 5, 3 0 - ou tout fragment de la séquence nucléotidique susmentionnée, ou d'une séquence dérivée de cette dernière telle que définie ci-dessus, ledit fragment étant de préférence constitué
d'au moins environ 15 nucléotides.

L'invention concerne également toute séquence peptidique codée par la séquence nucléotidique susmentionnée représentée sur la figure 5, et comprenant - la séquence en acides aminés représentée sur la figure 8 de la protéine TorA
de Salmonelle typhimurium, - ou une séquence dérivée de la séquence peptidique .susmentionnée, notamment par substitution, suppression ou addition d'un ou plusieurs acides aminés, ladite séquence dérivée ayant de préférence une homologie d'environ 35 % à 100 % avec la séquence peptidique susmentionnée représentée sur la figure 8, - ou un fragment de la séquence peptidique susmentionnée, ou d'une séquence dérivée de cette dernière telle que définie ci-dessus, ledit fragment étant de préférence constitué d'au moins environ S acides aminés.
L'invention sera davantage illustrée à l'aide de la description détaillée qui suit de l'obtention d'amorces de l'invention, et de leur utilisation pour la mise en oeuvre d'un procédé
de détection selon (invention.
1 S Description des figures - la figure 1 représente l'alignement des séquences nucléotidiques des gènes torA de Shewanella massilia (torA/S.m.), de Shewanella c (torA/S.c.), et de Shewanella putrefaciens (torA/S.p.).
- la figure 2 représente la séquence nucléotidique complète du gène torA
codant pour la TMAO réductase de Shewanella c.
- la figure 3 représente la séquence nucléotidique partielle du gène torA
codant pour la TMAO réductase de Photobacterium phosphoreum.
- la-figure 4 représente l'alignement des séquences nucléotidiques des gènes torA de Shewanella massilia (torA/S.m.), de E. coli (torA/E. c.), de Rhodobacter sphaeroides (TorA/R.s.), et Rhodobacter capsulatus (TorA/R.c.). Les flèches indiquent la position des différentes amorces sur le gène torA de la bactérie Shewanella massilia, élaborées à partir des régions conservées. Plus particulièrement, les positions des différentes amorces « DDN » et « BN » sur le gène torA de S. massilia sont les suivantes DDNl+ : 620 BNl+ : 1628 3 0 DDNS+ : 1428 BN3+ : 621 DDN2- : 1684 BN6+ : 1657 DDN3- : 2201 BN2- : 2403 DDN4- : 2325 BN4- : 2023 DDNS- : 1450 BNS- : 946 - la figure 5 représente la séquence nucléotidique partielle du gène torA
codant pour la TMAO réductase de Salmonella typhimurium.
- la figure 6 représente la séquence peptidique complète de la TMAO réductase de Shewanella c.
- la figure 7 représente l'alignement des séquences peptidiques du fragment de la protéine TorA de Photobacterium phosphoreum (TorA/P.p.), déduit du fragment d'ADN
amplifié chez P. phosphoreum à l'aide des amorces moléculaires DDN1+/DDNS-, avec les régions protéiques correspondantes des protéines TorA de Shewanella massilia (TorA/S.m.), de E.
coli (TorA/E.c.), et de Rhodobacter sphaeroides (DorA/R.s.).
- la figure 8 représente l'alignement des séquences peptidiques du fragment de la protéine TorA de Salmonella typhimurium (TorA/S.t.), déduit du fragment d'ADN amplifié
chez S.
typhimurium à l'aide des amorces moléculaires DDN1+/DDNS-, avec les régions protéiques correspondantes de la protéine TorA de E. coli (TorA/E. c.), de la protéine DorA de Rhodobacter sphaeroides (DorA/R.s.), et de la protéine TorA de Shewanella massilia (TorA/S.m.).
- la figure 9 représente l'alignement de séquences nucléiques d'une région très conservée du gène qui code pour la TMAO réductase des bactéries du genre Shewanella et de E. coli, utilisée pour l'élaboration d'une des amorces moléculaires « DDN » selon l'invention.
(a) Position approximative et orientation des différentes amorces DDN sur le gène torA
codant pour la TMAO réductase de différentes bactéries du genre Shewanella et de E. coli, (b) Exemple de stratégie d'élaboration d'une des amorces .DDN (DDNl+); la zone encadrée correspond à une région nucléique très conservée du gène qui code pour la TMAO
réductase des bactéries du genre Shewanella [Shewanella massilia (torAlS.
massilia), Shewanella putrefaciens (torAlS. putrefaciens), Shewanella c (torAlS. c)] et de E. coli.
- la figure 10 représente l'électrophorèse sur gel d'agarose des produits de la PCR lorsque l'amplification est réalisée à partir de l'ADN chromosomique de Shewanella massilia (pistes 1, 2, 3 et 4), de Shewanella c (pistes 5, 6, 7 et 8) et de Shewanella putrefaciens MR-1 (pistes 9, 10, 11 et 12) en utilisant les amorces moléculaires DDN1+/DDNS- (pistes 1, 5 et 9 ; taille attendue : 820 pb), DDNS+/DDN2- (pistes 2, 6 et 10 ; taille attendue : 234 pb), DDNS+/DDN3-(pistes 3, 7 et 11 ; taille attendue : 740 pb), DDNS+/DDN4- (pistes 4, 8 et 12 ; taille attendue 866 pb). Pistes M : Marqueurs de taille.
- la figure 11 représente l'électrophorèse sur gel d'agarose des produits de la PCR lorsque l'amplification est réalisée à partir de l'ADN chromosomique de Photobacterium phosphoreum en utilisant les couples d'amorces DDN1+/DDNS- (piste 1 ; taille attendue :
820 pb), DDNS+/DDN2- (piste 2 ; taille attendue : 234 pb), DDNS+/DDN3- (piste 3 ;
taille attendue 740 pb) et DDNS+/DDN4- (piste 4 : taille attendue : 866 pb). Pistes M :
marqueurs de taille.
- la figure 12 représente l'électrophorèse sur gel d'agarose des produits de la PCR lorsque (amplification est réalisée à partir de l'ADN chromosomique de S. massilia (pistes l, 4, 7 et 10), de E. coli (pistes 2, 5, 8 et 11) et de S. typhimurium (pistes 3, 6 et 9), en utilisant les couples d'amorces moléculâires DDN1+lDDNS- (pistes 1 à 3 ; taille attendue :
820 pb), DDNS+/DDN2- (pistes 4 à 6 ; taille attendue : 234 pb), DDNS+/DDN3- (pistes 7 à
9 ; taille attendue : 740 pb), DDNS+/DDN4- (pistes 10 et 11 ; taille attendue : 866 pb).
Pistes M
Marqueurs de taille.
- la figure 13 représente l'alignement de séquences nucléiques d'une région très conservée du gène qui code pour la TMAO réductase des bactéries du genre Shewanella, Rhodobacter et de E. coli, utilisée pour l'élaboration d'une des amorces moléculaires « BN »
selon l'invention.
(a) Position approximative et orientation des différentes amorces BN sur le gène torA
codant pour la TMAO réductase de différentes bactéries du genre Shewanella, Rhodobacter et E. coli, (b) Exemple de stratégie d'élaboration d'une des amorces BN (BN3+); la zone encadrée correspond à une région nucléique très conservée du gène qui code pour la TMAO
réductase des bactéries Shewanella massilia (torAlS. massilia), de E. coli, de Rhodocbacter sphaeroides (dorAlR. sphaeroides), et de Rhodocbacter capsulatus (dorAlR. capsulatus).
- la figure 14 représente l'alignement de séquences protéiques du cytochrome TorC de S.
massilia (TorC/S.m.), de E. coli (TorC/E.c.) et du cytochrome DorC de R.
sphaeroides (DorC/R.s.). Les flèches indiquent la position des différentes amorces sur le gène torC de la bactérie Shewanella massilia, élaborées à partir des régions conservées. A
titre d'exemple, le couple BC1+BC2- conduit à l'amplification du fragment d'une taille de 197 bp du gène codant pour la protéine TorC chez S. massilia, ce fragment codant pour le polypeptide de 66 acides aminés délimité par les acides aminés situés aux positions 114 et 179 de la séquence peptidique de TorC de S. massilia. Le couple BC1+/BC3- conduit à l'amplification du fragment d'une taille de 719 bp du gène codant pour la protéine TorC chez S. massilia, ce fragment codant pour le polypeptide de 240 acides aminés délimité par les acides aminés situés aux positions 114 et 353 de la séquence peptidique de TorC de S. massilia. Le couple BC2+/BC3-conduit à
l'amplification du fragment d'une taille de 542 bp du gène codant pour la protéine TorC chez S.
massilia, ce fragment codant pour le polypeptide de 181 acides aminés délimité
par les acides aminés situés aux positions 173 et 353 de la séquence peptidique de TorC de S.
massilia.
- la figure 15 représente l'électrophorèse sur gel d'agarose (2%) des produits de la PCR
lorsque l'amplification est réalisée à partir de l'ADN chromosomique de E.
coli (piste 1), de S.
typhimurium (piste 2), de P. phosphoreum (piste 3), de S. massilia (piste 4), de R. sphaeroides (piste 5), ou d'Erwinia chrysanthemi (piste 6) en utilisant les amorces moléculaires BC1+ et BC2-. La taille du fragment d'ADN attendue (177 paires de bases) est indiquée par une flèche.
Pistes M : Marqueurs de taille.
- la figure 16 représente l'influence de l'ADN chromosomique de poisson sur la spécificité des amorces moléculaires selon l'invention. L'amplification PCR
est réalisée à l'aide des amorces moléculaires DDNl+ et DDNS- en présence de 2,5 p,g (Pistes 1 et 4), 5 pg (Pistes 2 et S), ou 10 pg (Pistes 3 et 6) d'ADN chromosomique purifié de Hareng. Les pistes 4, 5 et 6 correspondent aux essais réalisés en ajoutant 2,5 p1 de suspension cellulaire de Shewanella massilia au mélange réactionnel. Pistes M : marqueurs de taille.
- la figure 17 représente l'électrophorèse en gel d'agarose (2%) des produits de la PCR
lorsque l'amplification est réalisée à partir d'ADN total extrait à partir de chairs de poissons en décomposition (cabillaud : piste 1 à 3 ; sole : piste 4 à 6 ; dorade : piste 7 à 9 et rouget de roche : piste 10 à 12) à l'aide des amorces BN6+/BN4- (pistes 1, 4, 7 et 10, taille attendue : 364 pb), amorces BN6+/BN2- (pistes 2, 5, 8 et 11, taille attendue : 711 pb), amorces DDN1+/DDNS- (pistes 3, 6, 9 et 12, taille attendue : 820 pb). Pistes M :
standard de taille (échelle 1 Kb de BRL).
- la figure 18 représente l'électrophorèse sur gel d'agarose (2%) des produits de la PCR
lorsque l'amplification est réalisée à l'aide des amorces moléculaires BC1+/BC2- sur deux préparations différentes d'ADN total d'un rouget de roche en voie de putréfaction (piste 1 et 2).
La flèche indique le fragment d'ADN amplifié de 177 paires de bases.
- la figure 19 représente l'alignement des séquences nucléotidiques des gènes torA de Photobacterium phosphoreum (torA/P.p.), de Shewanella putrefaciens (torA/S.p.), de Shewanella massilia (torA/S.m.), de Shewanella c (torA/S.c.), et de Salmonelle typhimurium (torA/S.t.).
A) METHODES D'ETUDES
Elaboration d'amorces spécifiques à partir du gène codant pour l'enzyme TMAO
réductase : sondes moléculaires « DDN », « BN » et « BC ».
La première étape de l'étude ci-dessous porte sur l'élaboration d'amorces (ou sondes) moléculaires utilisables pour une réaction PCR, et sur l'étude de leur spécificité pour différentes bactéries impliquées dans l'altération des chairs de poisson. La deuxième étape porte sur l'application de la technique PCR sur des chairs de poisson.
>7 Elaboration et validation d'amorces moléculaires servant à la réaction PCR.
Le choix des amorces nucléotidiques est une étape critique pour la réussite d'un test PCR.
Ces amorces doivent être élaborées à partir de régions hautement conservées du gène qui code pour la TMAO réductase chez l'ensemble des bactéries responsables de la dégradation des chairs de poissons. Plusieurs stratégies ont été utilisées pour élaborer ces amorces.
(1) Amorces moléculaires élaborées à partir de régions du gène torA conservées chez les bactéries du genre Shewanella et chez E. coli : amorces « DDN ».
L'élaboration d'amorces très peu dégénérées à partir de régions protéiques conservées est très difficile en raison de la dégénérescence du code génétique.
Les amorces moléculaires, appelées « DDN », ont été définies à partir de l'alignement de séquences nucléiques du gène torA des différentes bactéries du genre Shewanella et d'E. coli (Figure 9): En effet, plusieurs régions d'ADN du gène torA chez ces bactéries présentent un degré d'identité de séquence élevé avec très peu de mésappariements.
Les amorces moléculaires DDN sont les amorces moléculaires DDN1+, DDN2-, DDN3-, DDN4-, DDNS- et DDNS+ telles que définies ci-dessus.
Pour l'ensemble des réactions PCR, la température d'appariement est portée à
55°C afin de rendre l'amplification plus spécifique et donc de limiter l'apparition de bandes d'ADN
contaminantes. Ceci est rendu possible par la faible dégénérescence des amorces nouvellement synthétisées. L'amplification PCR met en jeu 30 cycles de réactions successives. Chaque cycle comprend une étape de dénaturation à 94°C pendant 30 s, une étape d'hybridation à 45°C
pendant 30 s et une étape d'élongation à 72°C pendant 45 s.

a) Utilisation des amorces moléculaires DDN pour la détection du système TMAO
réductase des bactéries du genre Shewanella.
La première série d'expériences, utilisant les couples d'amorces DDN1+/DDNS-, DDNS+/DDN2-, DDNS+/DDN3-, DDNS+/DDN4-, a été réalisée sur l'ADN chromosomique de la souche Shewanella massilia (S. massilia). Les couples d'amorces DDN1+/DDN2-, DDNl+/DDN3- et DDN1+/DDN4- ont volontairement été écartés du fait de l'éloignement de leurs positions sur le gène torA.
Les résultats, regroupés dans la figure 10 (pistes 1 à 4), révèlent pour la majorité des couples d'amorces moléculaires utilisés, l'amplification d'un fragment unique d'ADN
spécifique à la taille attendue. Bien que pour le couple d'amorces DDNS+/DDN2-(piste 2), un fragment d'ADN non spécifique, supplémentaire d'environ 300 paires de base, soit amplifié, les amorces moléculaires DDN se révèlent être spécifiques du système TMAO
réductase de S.
massilia.
Les couples d'amorces DDN ont ensuite été testés sur d'autres bactéries appartenant au genre Shewanella. La même série d'expériences a été réalisée en utilisant comme matrice l'ADN chromosomique de la souche Shewanella c et S. putrefaciens MR-1.
L'ensemble des couples d'amorces permet d'amplifier un fragment d'ADN spécifique à la taille attendue pour ces deux bactéries (figure 10).
Les différents couples d'amorces DDN permettent donc de détecter l'ensemble des bactéries Shewanella testées.
b) Utilisation des .amorces moléculaires DDN pour la détection du gène codant pour la TMAO réductase chez la bactérie marine Photobacterium phosphoreum, et pour la mise en oeuvré du séquençage dudit gène.
Photobacterium phosphoreum (P. phosphoreum) est une bactérie qui comme S.
putrefaciens est dans un certain nombre de cas rendue responsable de l'altération des chairs de poissons marins (12, 21). Elle appartient à la famille des Vibrionaceae, et possède une température optimale de croissance de 15°C. C'est une bactérie très peu étudiée, dont le système TMAO réductase putatif est absolument inconnu à ce jour.
Afin de vérifier la spécificité des amorces moléculaires selon l'invention sur des bactéries distinctes du groupe des Shewanella, et susceptibles de contaminer les chairs de poissons, une souche P. phosphoreum de collection a été obtenue par l'ATCC (American Type Culture Collection n° 11040) . Les premiers essais de croissance réalisés sur cette bactérie sur milieu marin (Difco) à 15°C ont montré que l'ajout de TMAO au milieu de culture améliore de façon significative sa vitesse de croissance. La densité optique (D06~) obtenue après 24 heures de croissance est de 0,28 pour la souche cultivée en absence de TMAO, et de 0,47 pour la souche cultivée en présence de TMAO. Ce résultat est en accord avec la présence d'une TMAO
réductase respiratoire chez P. phosphoreum. Une amplification.génique a été
réalisée à partir de l'ADN chromosomique de cette bactérie (préparé à partir de 10 ml de culture en milieu marin) en utilisant l'ensemble des couples d'amorces moléculaires DDN.
Les résultats, présentés dans la figure 11, montrent que les amorces DDN
permettent dans tous les cas l'amplification d'un fragment d'ADN spécifique. Les différentes tailles de fragments d'ADN sont en accord avec celles obtenues pour l'amplification réalisée sur le chromosome des bactéries du genre Shewanella.
Afin de confirmer que le fragment d'ADN amplifié chez P. phosphoreum correspond bien à une partie du gène codant pour la TMAO réductase de P. phosphoreum, le séquençage dudit fragment a été réalisé. Ainsi, le séquençage d'environ 600 nucléotides du fragment amplifié à partir du couple d'amorces moléculaires DDN1+/DDNS- a été réalisé.
Le produit PCR directement purifié par Geneclean (Bio101) a été séquencé par la technique de terminaison des chaînes (22) en utilisant l'amorce moléculaire DDN1+. La séquence protéique déduite de cette séquence nucléique a été alignée avec celles de diverses TMAO réductases (figure 'n.
Cette séquence protéique présente environ 60 % d'identité avec une région de la TMAO
réductase de S. massilia. Les homologies observées sont suffisamment élevées pour conclure que le fragment d'ADN séquencé correspond bien à une partie du gène qui code pour la TMAO
réductase de P. phosphoreum.
Ces résultats mettent en évidence la présence d'un système TMAO réductase chez la bactérie P. phosphoreum, et valident la méthode de détection selon l'invention par le test PCR, puisque ce dernier permet de détecter le système TMAO-réductase chez des bactéries d'altération relativement éloignées du point de vue phylogénétique.
c) Utilisation des amorces moléculaires DDN pour la détection de gènes codant pour la TMAO réductase d'entérobactéries, et pour la mise en oeuvre du séquençage desdits gènes.
Afin de vérifier que le test PCR est valide pour la détection d'entérobactéries telle que E.
coli ou certaines bactéries pathogènes comme Salmonella typhimurium, la même expérience PCR que celle décrite ci-dessus a été réalisée, avec comme ADN matrice de l'ADN

chromosomique de E. coli et de S. typhimurium.
Chez S. typhimurium, la région promotrice du système TMAO réductase a pu être mise en évidence par une approche PCR (23).
Les résultats obtenus sont regroupés dans la figure 12. Les quatre couples d'amorces moléculaires DDN1+/DDNS-, DDNS+/DDN2-, DDNS+/DDN3- et DDNS+/DDN4- permettent l'amplification d'un fragment d'ADN spécifique chez E. coli (piste 2, 6, 10 et 16). Dans le cas de S. typhimurium, le couple d'amorces DDNl+/DDNS- permet également l'amplification d'un fragment d'ADN, de 820 paires de bases, compatible avec un fragment spécifique du système TMAO réductase (piste 3).
Afin de confirmer que le fragment d'ADN amplifié chez S. typhimurium correspond bien à une partie du gène codant pour la TMAO réductase de S. typhimurium, le séquençage dudit fragment a été réalisé. La séquence protéique, déduite à partir d'une partie de ce fragment d'ADN (477 nucléotides), possède d'importantes homologies avec la séquence protéique de diverses TMAO réductases (figure 8). Elle présente en outre plus de 88 %
d'identité avec la séquence de la TMAO réductase d'E. coli et 45 % avec celle de l'enzyme chez S.
massilia. Le fragment d'ADN amplifié à l'aide des amorces DDN1+/DDNS- correspond donc vraisemblablement à une partie du gène qui code pour la TMAO réductase de S.
typhimurium.
d) Conclusion Ainsi que cela a été précédemment décrit, le couple d'amorces DDN1+/DDNS-permet de détecter le gène torA des bactéries marines (Shewanella et P. phosphoreum), mais également des entérobactéries (E. coli et S. typhimurium).
Les mêmes tests PCR ont été réalisés sur des bactéries isolées au niveau des eaux saumâtres-(Rhodobacter) qui peuvent éventuellement être retrouvées au niveau des chairs de poissons. Afin de réaliser ces tests, des échantillons d'ADN chromosomique de la bactérie R.
sphaeroides ont été utilisés comme ADN matrice.
La bactérie R. sphaeroides possède un système DMSO/TMAO réductase proche de celui décrit chez E. coli (9, 10). Bien que l'enzyme terminale de cette bactérie puisse réduire indifféremment le TMAO et le DMSO, elle possède de nombreuses homologies de séquences protéiques avec la TMAO réductase d'E. coli ou S. massilia (respectivement 47,5% et 45%
d'identité).
Cependant, les tests PCR réalisés avec les sondes moléculaires DDN n'ont pas permis d'amplifier un fragment d'ADN correspondant au gène de la TMAO réductase de cette bactérie.
2s (2) Amorces moléculaires élaborées à partir de régions du gène torA conservées chez l'ensemble des bactéries étudiées : amorces « BN ».
Afin d'élargir encore le spectre de détection des amorces moléculaires du test PCR, la séquence nucléique du gène de la TMAO/DMSO réductase des bactéries du genre Rhodobacter (R. sphaeroides et R. capsulatus) a été intégrée à l'alignement réalisé à
partir des séquences du gène torA des bactéries du genre Shewanella et d'E. coli.
Une nouvelle série d'amorces, dénommées « BN », a ainsi été élaborée (Figure 13).
Pour l'ensemble des expériences, l'amplification PCR est réalisée avec une température d'hybridation de SS°C. A cette température, une petite partie seulement des amorces présentes dans le mélange va pouvoir s'hybrider de manière spécifique à l'ADN matrice.
Pour cette raison, une quantité plus importante d'amorces moléculaires est ajoutée au mélange réactionnel (environ 100 pmoles dans SO ~l final).
Les amorces BN obtenues sont les amorces BNl+, BN2-, BN3+, BN4-, BNS-, BN6+
telles que définies ci-dessus.
Le tableau 1 ci-dessous représente les résultats obtenus quant à l'application des amorces moléculaires BN sur l'ADN de différentes bactéries.
L'amplification est réalisée à partir de 5 ng d'ADN chromosomique bactérien.
La réaction PCR met en jeu 30 cycles de réactions successives.
+ : Un fragment d'ADN spécifique à la taille attendue est amplifié
: Aucune amplification Tableau 1 Bactries Amorces Amorces Amorces Amorces Amorces BN1+BN2- BN1+BN4-BN3+BNS- BN6+BN4- BN6+BN2-S. massilia + + + + +

Shewanella + + + + +
c S. putrefaciens+ + + + +

P. phosphoreum+ + + + +

E. coli + - + + +

S. typhimurium- - + + +

R. sphaeroides- - - + +

Deux couples d'amorces : BN6+/BN2- et BN6+/BN4-, permettent d'amplifier un fragment d'ADN spécifique chez l'ensemble des bactéries testées, et notamment chez R.
sphaeroides.
Les amorces BN se révèlent donc parfaitement appropriées pour la détection des bactéries qui possèdent un système TMAO réductase, et qui sont susceptibles de contaminer les chairs de poissons.
D'autre part, l'utilisation lors de la PCR d'une température d'hybridation élevée (55°C), et d'une quantité plus importante d'amorces moléculaires dégénérées, a permis d'améliorer de façon significative la spécificité de l'amplification.
(3) Amorces moléculaires élaborées à partir du gène codant pour le cytochrome TorC du système TMAO réductase : amorces « BC ».
L'étude du système TMAO réductase chez différentes bactéries a permis de montrer que la chaîne de transfert d'électrons jusqu'à l'enzyme terminale TorA fait intervenir dans tous les cas un cytochrome pentahémique de type c, le cytochrome TorC (ou DorC) (6, 9, 10, 19).
Afin de mettre en évidence le système TMAO réductase chez les bactéries d'altération, des amorces nucléiques dirigées contre le gènè codant pour ce cytochrome ont été élaborées.
Le mufti-alignement de séquences protéiques, présenté dans la figure 14, fait apparaître de nombreuses régions protéiques conservées entre les cytochromes du système TMAO
réductase de différentes bactéries : S. massilia, E. coli, R. sphaeroides.
Certaines de ces régions conservées correspondent aux sites de fixation des hèmes de type c (motif CxxCH) et sont donc retrouvées dans un grand nombre de cytochromes tétrahémiques de classe NapC/NirT
impliqués-dans d'autres systèmes respiratoires (24). Le cytochrome TorC
possède néanmoins la particularité de contenir un domaine carboxy-terminal additionnel qui fixe un cinquième hème (6, 19).
Les amorces moléculaires BC sont les amorces BC1+, BC2+, BC2- et BC3- telles que définies ci-dessus. Pour élaborer lesdites amorces, les régions protéiques conservées ont été
recherchées parmi l'ensemble des cytochromes de classe NapC/NirT (sondes BC2+
et BC2-), mais aussi uniquement parmi les cytochromes TorC (sondes BC1+ et BC3-). La position et l'orientation des quatre amorces moléculaires dégénérées BC sont indiquées dans la figure 14.
Les amorces moléculaires BC sont capables de s'hybrider au gène codant pour le cytochrome TorC du système TMAO réductase.

La réaction PCR est réalisée dans les mêmes conditions que celles utilisées avec les amorces moléculaires BN. Elle met en jeu 30 cycles de réaction successives.
Chaque cycle est constitué d'une étape de dénaturation à 94°C pendant 30 s, d'une étape d'hybridation à 55°C
pendant 30 s et d'une étape d'élongation pendant 45 s.
Environ 100 pmoles de chaque amorces moléculaires sont ajoutées au mélange réactionnel (volume final 50 p.1). Parmi les trois couples d'amorces moléculaires testés (BC1+BC2-, BC1+BC3- et BC2+BC3-), le couple BC1+BC2- a permis d'amplifier un fragment d'ADN à la taille attendue (177 paires de bases) pour l'ensemble des bactéries précédemment testées (figure 15 ; pistes 1 à 5). Ce résultat nous permet d'envisager l'utilisation du couple d'amorces moléculaires BC1+BC2- pour le test PCR.
En parallèle, la même expérience PCR a été réalisée avec le couple d'amorces BC1+BC2- à partir du chromosome de la bactérie Erwinia chrysanthemi, entérobactérie phytopathogène qui serait dépourvue d'un système TMAO réductase (4). Dans ce cas, aucun fragment d'ADN d'une taille compatible avec celle attendue pour une amplification à partir du gène torC n'est observé (figure 15, piste 6).
Le couple d'amorces BC1+BC2- semble donc reconnaître spécifiquement le cytochrome TorC du système TMAO réductase.
(4) Application de la technique de la PCR aux cellules entières Pour la réalisation d'un test PCR destiné à être utilisé directement à partir d'échantillons de poissons, il est important de s'affranchir de l'étape de préparation de l'ADN chromosomique des bactéries. Pour cette raison, les expériences de PCR utilisant les couples d'amorces DDN, BN et BC- ont été reproduites à partir de bactéries entières de S. massilia.
Les colonies bactériennes isolées sur boîte sont remises en suspension dans 200 p1 d'eau distillée stérile (D06oo comprise entre 0,1 et 0,5). La réaction PCR est alors réalisée dans les conditions précédemment décrites avec pour matrice 2,5 ~1 de la suspension cellulaire (dans 50 ~1 de volume final). Pour l'ensemble des réactions PCR réalisées (avec les amorces DDN, BN et BC), le résultat obtenu est équivalent à celui observé avec de l'ADN
chromosomique purifié.
Les bactéries sont donc bien lysées au cours de la première étape de la PCR
qui correspond à
une incubation à 94°C des échantillons pendant 1,5 min. Ce résultat positif permet d'envisager une utilisation du test PCR directement à partir des chairs de poissons.

II) Application du test PCR-TMAO aux chairs de poissons Après avoir vérifié la spécificité des amorces moléculaires selon l'invention sur des bactéries responsables de l'altération des produits de la mer, l'étape suivante consiste donc dans l'application directe du test PCR à des chairs de poissons.
Les quatre couples d'amorces DDN1+/DDNS-, BN6+BN4-, BN6+BN2- et BCl+BC2-ont été choisis pour réaliser ces tests car ils permettent l'amplification d'un fragment d'ADN
spécifique pour la grande majorité des bactéries précédemment testées.
(1) Influence de l'ADN chromosomique du poisson lors de l'amplification PCR du gène de la TMAO réductase des bactéries.
Pour l'utilisation du test PCR sur des échantillons de chairs de poissons, il faut d'abord vérifier que l'ADN chromosomique du poisson ne rentre pas en compétition avec l'ADN
bactérien, lors de l'hybridation des amorces moléculaires.
Afin de tester l'influence de l'ADN chromosomique du poisson sur la spécificité des 1 S amorces moléculaires selon l'invention, des concentrations variables d'ADN
chromosomique purifié de sperme de hareng ont été ajoutées au mélange réactionnel de la PCR
contenant ou non 2,5 ~l de suspension cellulaire de la bactérie S. massilia.
La figure 16 obtenue avec le couple d'amorces DDNI+/DDNS- montre qu'aucun fragment d'ADN n'est amplifié en absence de bactérie ajoutée au mélange réactionnel (piste 1 à
3) et ceci, quelle que soit la concentration d'ADN chromosomique de poisson.
Si on ajoute la bactérie S. massilia au mélange réactionnel (pistes 4 à 6) un fragment d'ADN
spécifique est amplifié. Les mêmes résultats ont été obtenus pour les couples d'amorces BN6+BN2-, BN6+BN4- ou BC1+BC2-, et permettent ainsi de conclure que la, présence d'ADN
étranger dans le mélange réactionnel de la PCR n'interfère pas avec la spécificité des amorces moléculaires selon l'invention.
Ces résultats importants permettent donc d'exclure l'éventualité d'une amplification non spécifique qui serait due à l'ADN chromosomique du poisson.
(2) Extraction de l'ADN total des chairs de poissons et validation de la technique PCR.
Traditionnellement, les tests de détection des micro-organismes, lors du contrôle microbiologique des aliments, nécessitent une première étape de pré-enrichissement des bactéries sur un milieu sélectif.
Dans la perspective d'un test rapide de qualité fraîcheur, la technique de la PCR a été
appliquée directement à des échantillons de poisson. Différentes conditions d'extraction de l'ADN total des chairs de poissons en voie d'altération (ADN bactérien + ADN
du poisson) ont donc été testées.
Dans un premier temps, une technique rapide d'extraction de l'ADN des cellules a été
testée en traitant les échantillons de poisson au NaOH/SDS (25). Cette technique permet la lyse cellulaire et donc l'extraction de l'ADN chromosomique total. La préparation se fait à partir d'environ 25 mg de chairs prélevés sur un poisson (rouget de roche) gardé 12 heures à
température ambiante. Après 10 min d'incubation à 95°C, 5 w1 du mélange de chairs de poisson homogénéisées sont utilisés directement dans le mélange réactionnel de la PCR.
Toutefois, par cette technique rapide d'extraction de l'ADN total, l'ensemble des réactions PCR réalisées avec les différentes amorces moléculaires n'a pas permis d'amplifier un fragment d'ADN spécifique. La présence de plusieurs substances inhibitrices de la PCR
contenues dans les chairs de poissons pourrait expliquer ce résultat. En effet, des composés présents en grande quantité dans certains produits alimentaires (graisses, protéines...) peuvent avoir une influence sur l'efficacité de la PCR (26). Afin de vérifier cette hypothèse, les mêmes tests PCR ont été réalisés en rajoutant aux échantillons de chairs de poissons

5 ng d'ADN
chromosomique de S. massilia. Toutefois, comme précédemment, aucun fragment d'ADN n'a été amplifié par PCR, quelles que soient les amorces moléculaires utilisées.
Ces résultats permettent de conclure que la réaction PCR est inhibée par certains composés contenus dans les chairs de poissons.
La technique de purification de l'ADN chromosomique total des chairs de poissons, utilisée selon la présente invention, doit donc permettre d'éliminer l'ensemble des composés inhibiteurs de la PCR.
Un kit d'extraction rapide de l'ADN (environ 1 heure), basée sur la fixation des acides nucléiques à des billes de silice, a ainsi été testé (kit commercialisé sous la dénomination « High Pure PCR Template Preparation Kit » par Boehringer Mannheim/Roche).
Après fixation de l'ADN, cette technique permet en effet d'éliminer les sels, les protéines et d'autres impuretés cellulaires par une simple étape de lavage.
L'extraction de l'ADN total (ADN bactérien + ADN de poisson) a été réalisée sur quatre espèces de poisson différentes en voie de décomposition (gardés 12 h à
température ambiante) 2 espèces de la mer Méditerranée (rouget de roche et dorade), et 2 espèces de l'Atlantique (sole et cabillaud). A partir d'environ 50 mg de chairs de ces poissons (prélevés sous la peau), 1 à 4 p.g d'ADN chromosomique total ont ainsi été purifiés. Environ 25 ng de cet ADN
sont alors ajoutés au mélange réactionnel de la PCR (volume final 50 p1). Pour l'ensemble des réactions PCR, la température d'hybridation est portée à 55°C, et 100 pmoles de chaque amorces moléculaires sont ajoutées au mélange réactionnel.
La figure 17 regroupe les résultats obtenus en utilisant les couples d'amorces DDN1+/DDNS-, BN6+/BN2- et BN6+/BN4-. Pour l'ensemble des espèces de poissons testées, un fragment d'ADN unique est amplifié, et ceci avec chacun des couples d'amorces utilisés.
La taille du fragment d'ADN amplifié correspond à la taille attendue pour une amplification à partir du gène torA. Ce résultat indique que les différents fragments d'ADN ont bien été amplifiés à partir du gène torA des bactéries présentes sur les chairs de poisson.
De même, les tests réalisés sur deux autres espèces de poissons en voie de putréfaction (7 jours sous glace fondante), le maquereau (poisson gras) et le merlan, ont permis de mettre en évidence le gène torA des bactéries d'altération.
Ainsi, l'utilisation des couples d'amorces moléculaires DDNl+/DDNS-, BN6+/BN2-et BN6+/BN4- peut être envisagée pour l'application du test PCR à des chairs de poissons.
De plus, l'utilisation d'un filtre de billes de silice est une méthode adéquate pour purifier l'ADN total contenu dans les chairs de poissons. Cette technique est très rapide (environ une heure), et très facile à mettre en oeuvre comparativement à une extraction isoamylalcool/chloroforme qui nécessite plusieurs étapes pour éliminer les protéines contenues dans les chairs de poissons (28).
L'amplification réalisée dans les mêmes conditions avec le couple d'amorces BC1+/BC2 a également donné des résultats encourageants sur l'ADN total de chairs d'un rouget de roche en voie de putréfaction (figure 18). En effet, malgré un bruit de fond important, l'électrophorèse en gel d'agarose des produits de la PCR révèle la présence du fragment de 177 paires de bases.
L'application de la technique à un suivi d'altération de cabillaud a permis de montrer que la technique est en corrélation directe avec la qualité fraîcheur des chairs de poisson au cours de leur conservation dans le temps.
III) Conclusion Les couples d'amorces moléculaires selon l'invention permettent donc de détecter le gène torA chez les bactéries marines, mais également chez des bactéries relativement éloignées phylogénétiquement, à savoir les entérobactéries et les bactéries des eaux saumâtres.
L'application du test PCR aux chairs de poissons donne des résultats encourageants S puisque les amorces moléculaires selon l'invention permettent de détecter le gène torA de bactéries présentes sur le poisson en voie de putréfaction. L'amplification PCR ne pouvant être appliquée directement à des échantillons de chairs de poissons, une extraction de l'ADN total de ces chairs est au préalable nécessaire.
De plus, la technique est directement liée à la qualité fraîcheur des chairs de poissons et est plus sensible que les techniques classiques comme l'ABVT.
B) MATÉRIELS ET MÉTHODES
1) Isolement des souches bactériennes, milieux et conditions de croissance Le poisson utilisé pour l'isolement des souches bactériennes Shewanella c et Shewanella massilia correspond à un rouget de roche (Mullus surmuletus) pêché en mer Méditerranée au large de Marseille, et gardé à température ambiante pendant 48 heures dans un tube stérile contenant de l'eau de mer. L'eau de mer a été préalablement stérilisée à
travers un filtre millipore (0,45pM).
Les souches Shewanella sont cultivées en anaérobiose ou en aérobiose à
30°C dans du milieu LB (« Luria Broth » : extrait de levure 10 g/1, bacto-peptone Sg/1 et NaCI Sg/1). Les bactéries E. coli et Salmonella typhimurium sont cultivées à 37°C sur milieu LB. La souche Photobacterium phosphoreum a été obtenue par l'ATCC (n°11040) et ne pousse pas sur les milieux conventionnels tel que le milieu LB. Elle est cultivée à 15°C
sur milieu marin (marine broth ; Difco).
2) Techniques de PCR
a) PCR standards Les amplifications PCR standards sont réalisées dans les conditions décrites dans la référence (6). Le mélange réactionnel (50 p1) contient 10 ng d'ADN
chromosomique, 0,2 ~g de chacune des sondes oligonucléotidiques, 100 p.M de chacun des quatre désoxyribonucléotides triphosphates (dXTPs), 10 mM de Tris/HCl (pH 8,3), 1,5 mM de MgCl2, 50 mM de KCI, 0,01 de gélatine et une unité d'ADN polymérase (Taq polymérase, Boehringer Mannheim/Roche).
Le mélange réactionnel est finalement recouvert par 50 ~1 d'huile minérale afin d'empêcher l'évaporation durant le processus de la PCR.
L'amplification, réalisée dans un appareil thermocycleur (MJ Research), met en jeu 30 cycles de réactions, un cycle comprenant une étape de dénaturation à
94° C pendant 30 secondes, une étape d'hybridation à 55°C pendant 30 secondes et une étape d'élongation à 72 °C
pendant environ 45 secondes (lkb/min). L'ADN est préalablement dénaturé durant 1,5 min à
94°C avant d'entamer le premier cycle. 10 ~,1 de chacun des produits d'amplification sont ensuite analysés par électrophorèse sur un gel d'agarose.
b) Conditions PCR avec les amorces moléculaires dégénérées selon l'invention Les amorces moléculaires selon l'invention, notamment les amorces dénommées « DDN », « BN » ou « BC », sont telles que définies ci-dessus.
Le mélange réactionnel (50 p1) contient soit 10 ng d'ADN chromosomique de la bactérie, soit 5 ~l de suspension cellulaire (D06oo = 0,5-1) soit 25 ng d'ADN
total extrait à
partir de poisson, 100 pM de chacun des quatre désoxyribonucléotides triphosphates (dXTPs), 0,8 ~,g de chacun des mélanges d'amorces selon l'invention, 10 mM Tris-HCl (pH
8,3), 1,5 mM
MgCl2, 50 mM KCI, 0,01 % de gélatine et une unité de Taq polymérase.
La réaction PCR met en jeu 30 cycles de réactions successives constituées d'une étape de dénaturation à 94° C pendant 30 secondes suivie d'une étape d'hybridation à SS°C ou 45°C
pendant 30 secondes, puis d'une étape d'élongation à 72 °C pendant 45 secondes. L'ADN est préalablement dénaturé durant 1,5 min à 94°C avant d'entamer le premier cycle.
3) Préparation d'ADN chromosomique des bactéries La préparation d'ADN chromosomique des bactéries est réalisée à partir de 10 ml de culture (D06oo ~ 1). Après centrifugation des cellules à 10 000 rpm pendant 10 min, le culot est resuspendu dans 1 ml d'EDTA 10 mM (pH 8). La lyse des cellules est obtenue par addition de SDS (0,5 % final). Cette solution est mélangée à un volume égal d'isoamylalcool/chloroforme (1:24). Après centrifugation pendant 20 min à 7 000 rpm, la phase supérieure est récupérée.
Cette opération est reproduite plusieurs fois afin d'éliminer la plus grande quantité de protéines résiduelles. L'ADN est finalement précipité par ajout de NaCI (0,3 M final) et d'éthanol (2,2 Vol).

4) Préparation de l'ADN chromosomique totale des chairs de poissons en voie de putréfaction pour la PCR
a) Préparation rapide à l'aide d'un kit basé sur la fixation de l'ADN à des billes de sillice (High pure PCR template Preparation Kit, Boehringer Mannheim/Roche) 25 mg de chairs de poissons sont incubés 45 min à 55°C .dans 200 p1 de tampon de lyse (urée 4 M, Tris 200 mM, NaCI 20 mM et EDTA 200 mM, pH 7,4) en présence de 40 p1 de protéinase K (0,8 mg). Afin de faciliter la lyse cellulaire, l'échantillon est préalablement broyé
à l'aide d'un scalpel. 200 ~1 de tampon de fixation (guanidine-HCl 6 M, urée 10 mM, Tris-HCl mM et Triton 20% v/v, pH 4,4) sont ajoutés à l'échantillon qui est ensuite incubé pendant 10 10 min à 72°C. Cette solution est mélangée à 100 ~1 d'isopropanol puis centrifugée à 8 000 rpm pendant 1 min à travers un filtre à base de billes de sillice (tube High Pure Filter + tube collecteur). Les impuretés résiduelles sont éliminées par deux étapes de lavage (tampon de lavage : NaCI 20 mM, Tris-HCl 2 mM, éthanol 80% v/v, pH 7,5). L'ADN est ensuite élué dans un tampon d'élution (Tris 10 mM, pH 8,5).
b) Extraction d'ADN des cellules par traitement au NaOA/SDS
mg de chairs de poissons sont prélevés sur un poisson en voie de putréfaction (après 16 heures d'incubation dans un tube stérile gardé à température ambiante), et placés dans 50 p1 d'une solution de NaOH 0,05 M, SDS 0,25%. Après broyage des cellules, l'échantillon est incubé 15 min à 95 °C. 450 ~,1 d'eau stérile sont ajoutés au mélange et les débris cellulaires sont 20 alors éliminés par une étape de centrifugation de 2 min à 8 000 g. 5 ~,1 du surnageant obtenu sont directement utilisés pour le test PCR.
c) Extraction isoamylalcooUchloroforme La préparation d'ADN chromosomique totale par extraction isoamylalcool/chloroforme est réalisée à partir de 25 mg de chairs de poissons contaminées comme décrit précédemment 25 pour l'ADN bactérien. Le nombre d'étapes d'extraction est en revanche augmenté afin de pouvoir éliminer les quantités importantes d'impuretés contenues dans les échantillons de chairs de poissons.

Références bibliographiques (1) Unemoto T., Hayashi M. and Miyaki K. (1965) Intracellular localization and properties of trimethylamine N oxide reductase in Vibrio parahaemolyticus.
Biochim.Biophys.Acta 110, 319-328.
(2) Easter M.C., Gibson D.M. and Ward F.B. (1983) The induction and location of trimethylamine N oxide reductase in Alteromonas sp. NCMB 400. .I.
Gen.Microbiol. 129, 3689-3696.
(3) McEwan A.G., Ferguson S.J. and Jackson J.B. (1983) Electron flow to dimethylsulphoxide or trimethylamine N oxide generates a membrane potentiel in Rhodopseudomonas capsulata. Arch.Microbiol. 136, 300-305.
(4) Barrett E.L. and Kwan H.S. (1985) Bacterial reduction of trimethylamine oxide.
Annu.Rev.Microbiol. 39, 131-149.
(5) Silvestro A., Pommier J. and Giordano G. (1988) The inducible trimethylamine N
oxide reductase of Escherichia coli K12: biochemical and immunological studies.
Biochim.Biophys.Acta 954, 1-13.

(6) Méjean V., Iobbi-Nivol C., Lepellétier M., Giordano G., Chippaux M. and Pascal M.C. (1994) TMAO anaerobic respiration in Escherichia colis involvement of the tor operon.
Mol.Microbiol. 11, 1169-1179.

(7) Yamamoto L, Wada N., Ujüye T., Tachibana M., Matsuzaki M., Kajiwara H., Watanabe Y., Hirano H., Okubo A. and Satoh T. (1995) Cloning and nucleotide sequence of the gene encoding dimethyl sulfoxide reductase from Rhodobacter sphaeroides f.
sp.
denitrificans. Biosci.Biotechnol.Biochem. 59, 1850-1855.

(8) Knablein J., Mann K., Ehlert S., Fonstein M., Huber R. and Schneider F.
(1996) Isolation, cloning, sequence analysis and localization of the operon encoding dimethyl sulfoxide/trimethylamine N-oxide reductase from Rhodobacter capsulatus. J.
Mol. Biol. 263, 40-52.

(9) Ujüye T., Yamamoto L, Nakama H., Okubo A., Yamazaki S. and Satoh T. (1996) Nucleotide sequence of the genes, encoding the pentaheme cytochrome (dmsC~ and the transmembrane protein (dmsB), involved in dimethyl sulfoxide respiration from Rhodobacter sphaeroides f. sp. denitrificans. Biochim.Biophys.Acta 1277, 1-5.

(10) Mouncey N.J., Choudhary M. and Kaplan S. (1997) Characterization of genes encoding dimethyl sulfoxide reductase of Rhodobacter sphaeroides 2.4.1T: an essential metabolic Bene fonction encoded on chromosome II. J.Bacteriol. 179, 7617-7624.

(11) Malle P. (1994) Microflores bactériennes des poissons marins et évaluation de l'altération. Rec.Méd. Vét. 170, 147-157.

(12) Gram L. and Huss H.H. (1996) Microbiological spoilage of fish and fish products.
Int.J.Food Microbiol. 33, 121-137.

(13) Dalgaard P., Gram L. and Huss H.H. (1993) Spoilage and shelf life of cod fillets packed in vacuum or modified atmospheres. Int.J.Food Microbiol. 19, 283-294.

(14) Malle P. and Poumeyrol M. (1989) A new chemical criterion for the quality control of fish: Trimethylamine/Total Volatile Basic Nitrogen (%). J.Food Prot. 52, 419-423.

(15) Large P.J. and MacDougall H. (1975) An enzymatic method for the microestimation of trimethylamine. Anal.Biochem. 64, 304-310.

(16) Ritskes T.M. (1975) Gas chromatographic determination of trimethylamine and 1 S dimethylamine in fish, fishery products, and other fonds. .LFood Technol.
10, 221-228.

(17) Innis M.A., Gelfand D.H., Sninsky J.J. and White T.J. (1990) PCR
Protocole.
Academic Press, Inc., San Diego.

(18) Lee H., Morse S. and Olsvik O. (1997) Nucleic Acid Amplification Technologies:
Application to Disease Diagnosis. Eaton Publishing, Boston.

(19) Dos Santos J.P., Iobbi-Nivol C., Couillault C., Giordano G. and Méjean V.
(1998) Molecular analysis of the trimethylamine N oxide (TMAO) reductase respiratory system from a Shewanella species. J. Mol. Biol. 284, 421-433.

(20)-Czjzek M., Dos Santos J.P., Pommier J., Giordano G."Méjean V. and Haser R.
(1998) Crystal structure of oxidized trimethylamine N oxide reductase from Shewanella massilia at 2.5 F~ Resolution. .l. Mol. Biol. 284, 434-447.

(21) Dalgaard P. (1995) Qualitative and quantitative characterization of spoilage bacteria from packed fish. Int.J.Food Microbiol. 26, 319-333.

(22) Sanger F., Nicklen S. and Coulson A.R. (1977) DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A. 74, 5463-5467.

(23) Jourlin C., Simon G., Lepelletier M., Chippaux M. and Méjean V. (1995).
Conservation of cis-acting elements within the tor regulatory region among different Enterobacteriaceace. Gene, 152, 53-57.

(24) Roldan M.D., Sears H.J., Cheesman M.R., Ferguson S.J., Thomson A.J., Berks B.C.
and Richardson D.J. (1998). Spectroscopic characterization of a novel multiheme ç-type cytochrome widely implicated in bacterial electron transport. J. Biol. Chem.
273, 28785-28790.

(25) Rossen L., Holmstrom K., Olsen J.E. and Rasmussen O.F. (1991) A rapid polymerase chain reaction (PCR)-based assay for the identification of Listeria monocytogenes in fond samples. Int.J.Food Microbiol. 14, 145-1 S 1.

(26) Rossen L., Norskov P., Holmstrom K. and Rasmussen O.F. (1992) Inhibition of PCR
by components of food samples, microbial diagnostic assays and DNA-extraction solutions.
Int.J.Food Microbiol. 17, 37-45.

(27) Laemmli U.K. (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of the bacteriophage T4. Nature 227, 680-685.

(28) Sambrook J., Frich E.F. and Maniatis.T. (1989) Molecular Cloning: A
Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY.

(29) Takagi M., Tsuchiya T. and Ishimoto M. (1981) Proton translocation coupled to trimethylamine N oxide reduction in anaerobically grown Escherichia coli.
J.Bacteriol. 148, 762-768.

(30) Pommier J., Méjean V., Giordano G. and Iobbi-Nivol C. (1998) TorD, a cytoplasmic chaperone that interacts with the unfolded.trimethylamine N oxide reductase enzyme (TorA) in Escherichia coli. J.Biol.Chem. 273, 16615-16620.

(31) Graham A., Boxer D.H., Haddock B.A., Mandrand-Berthelot A.M. and Jones R.W.
(1980) Immunochemical analysis of the membrane-bound hydrogenase of Escherichia coli.
FEBSLett. 113, 167-172.

LISTE DE SEQUENCES
<110> CNRS
<120> SEQUENCES NUCLEOTIDIQUES ISSUES DE GENES CODANT POUR LA
TRIMETHYLAMINE N-OXYDE REDUCTASE, ET LEURS
UTILISATIONS, NOTAMMENT POUR LA DETECTION DE BACTERIES
<130> WOB 99 AX CNR DORA
<140>
<141>
<150> FR9911543 <151> 1999-09-15 <160> 27 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 2487 <212> ADN
<213> Shewanella massilia <400> 1 atgaacagaa gagacttttt aaagggtatc gcctcatcct ctttcgttgt cttaggtggc 60 agctcagtgt taacgccctt aaatgcctta gccaaagcgg gcatcaatga agatgaatgg 120 ctaaccacag gttcacactt cggcgccttt aaaatgaagc gcaaaaacgg cgtcattgcc 180 gaagtgaaac ccttcgactt agataagtat ccaacggata tgattaacgg catccgcggc 240 atggtctaca atccatcgcg tgtacgttac cctatggtgc gcttagattt tttactcaaa 300 ggtcataaga gtaataccca tcaacggggt gatttccgct ttgttcgcgt aacgtgggac 360 aaggcattaa cactgtttaa gcattcatta gatgaagtcc aaacccaata cggtccatca 420 ggtctgcatg cggggcaaac cggttggcgc gccactggtc aactgcattc cagcacgagt 480 catatgcaac gtgcggtggg gatgcacggc aactatgtta agaaaatcgg cgactactcc 540 acaggtgcag gccaaactat tctgccctac gtgttaggtt caaccgaagt gtatgcccag 600 ggcacttcat ggccgctgat cttagaacac agcgacacta tcgtgctgtg gtcgaacgat 660 ccgtacaaga acctgcaagt gggttggaat gcggaaaccc atgaatcttt tgcttatctt 720 gcgcagttaa aagagaaagt gaagcaaggc aagatccgcg tgatcagtat cgaccctgtg 780 gtgactaaga cccaagccta tttgggctgc gagcaactct acgttaaccc acagacagat 840 gtgaccttaa tgctggccat cgcccacgag atgatcagca aaaagctcta cgacgataaa 900 tttatccaag gctacagctt aggttttgaa gagtttgtgc cctatgtgat gggtactaaa 960 gatggcgtag ccaaaacccc agaatgggcc gcgcctatct gtggtgttga agçccatgtt 1020 atccgcgact tggctaaaac cttagtcaag ggccgcactc agttcatgat gggctggtgt 1080 atccagcgcc agcaacacgg cgaacaaccc tattggatgc cggcggtact ggcgaccatg 1140 atcggccaaa tcggtctacc cggtggtggc atcagctatg gtcaccacta ctcgagtatc 1200 ggcgtgcctt catcgggtgc cgctgcgcca ggtgccttcc cccgtaactt ggacgaaaat 1260 caaaagccac tctttgatag ctcagacttc aagggcgcga gtagcacgat tccggttgcc 1320 cgctggattg atgcgattct cgaacccggt aaaaccattg atgctaacgg ctcgaaagtg 1380 gtttatcccg atatcaagat gatgattttc tcgggtaata atccttggaa ccatcaccaa 1440 gacagaaacc gcatgaagca agccttccat aagcttgagt gtgtggtcac tgtcgatgtg 1500 aactggacgg caacttgccg cttctcggat atcgtactgc ccgcttgtac tacctatgag 1560 cgcaacgata tcgacgtgta cggcgcctat gctaaccgcg gtattttagc catgcagaaa 1620 atggttgagc cactgtttga tagcttgtcg gattttgaaa ttttcactcg ctttgccgcc 1680 gtactcggca aagagaaaga atacacccgt aacatgggcg aaatggagtg gttagaaacc 1740 ctctataacg aatgtaaagc cgccaacgcg ggcaagtttg agatgcctga ctttgcgact 1800 ttctggaaac aaggttatgt gcattttggt gacggtgaag tctggacgcg ccatgcagac 1860 tttagaaacg atcctgaaat caatccacta ggcacgcctt caggtttgat tgaaatcttt 1920 agccgtaaga ttgatcaatt cggttacgat gactgtaaag gtcacccaac gtggatggag 1980 aaaaccgagc gtagtcatgg cggccctggc tctgacaagc atccgatttg gttgcagtca 2040 tgccatccag acaaacgttt acactcgcag atgtgtgagt cgcgagaata ccgcgagact 2100 tacgcagtca atggccgtga gcctgtgtat atcagccctg tcgacgcaaa agcacgtggc 2160 atcaaagatg gcgatatagt gcgagtcttt aacgaccgtg gccaactgtt ggcgggtgct 2220 gtggtatcgg acaacttccc taaagggatt gtgcgaattc acgaaggcgc gtggtatggg 2280 ccagtaggta aagatggtag cactgaaggt ggtgctgaag tcggcgccct gtgtagttat 2340 ggcgatccta acaccctcac tttagacata ggcacctcta aacttgccca agcttgctca 2400 gcctatactt gcttagtcga gtttgaaaaa taccaaggca aagtgcctaa ggtcagctcc 2460 ttcgatggcc cgatcgaagt cgaaatc 2487 <210> 2 <211> 2486 <212> ADN
<213> Shewanella putrefaciens <400> 2 atgaacagaa gagacttttt aaaaggctta gcctcaacct ctttcgttgc tttaggtggc 60 agctcagtac tagcgccctt aaatgcgctg gccaatactg gcctgaatga aaacgaatgg 120 ctgaccactg gctcccactt cggtgccttt aaaatcaagc gtaaaaacgg catgattgcc 180 gaagtcaaag ccttcgattt agataaatat ccaacggata tgattaacgg tatccggggt 240 atggtctata acccatcccg cgtgcgttac ccgatggttc gcttagactt tttactaaaa 300 ggccataaga gtaataccca gcagcggggg gatttccgct ttgttcgtgt gacctgggat 360 aaagcattaa agctgtttaa acactcactc gatgaggtcc aaaccaagta cggtccatcg 420 ggcttacacg caggacaaac tggttggcgc gccacggggc aactgcattc cagcaccagc 480 catatgcagc gcgcggtggg gatgcacggt aattttgtga aaaaaatcgg cgactactcc 540 accggtgcag gccaaccatt ctgccctatg tattaggctc aaccgaagta tatgcccaag 600 gcacctcttg gccactgatc ttagaaaaca gcaacacgat tgtgctgtgg tcaaacaatc 660 cttacaaaaa cctgcaagtg ggctggaacg ctgaaaccca tgaggccttt gcgtacctcg 720 cgcaattaaa agagaaggtc aaacagggta aaatccgcgt gatcagtatc gaccctgtgg 780 tgactaaaac ccaggcttac cttggctgtg agcagttgta tgtgaaccca cagactgacg 840 tgacgctgat gctggccatc gcccatgaga tgatcaccca aaagctacac gatgagaaat 900 tcatccaagg ttacagctta ggctttgaag agtttgtgcc ttacgtgatg ggcactaaag 960 atggtatcgc caaaacccct gagtgggcgg cgcctatctg cggtgttgaa ccacacatta 1020 tccgcgatct ggccaaaacc ttagttaagg gccgtaccca aataatgatg ggttggtgta 1080 ttcagcgcca acaacacggt gagcaacctt actggatggc cgcagtactt gcgaccatga 1140 taggccaaat cggcttaccc ggcggtggta ttagctatgg tcaccactac tccagtattg 1200 gtgtgccggc gaccacagct gcagctccgg gcgctttccc acgtaactta gacgagaatc 1260 aaaaaccgct gtttgacagc acagacttta aaggcgcaag cagcacgatt cccgttgccc 1320 gctggattga tgcgattctc gaacccggca aaaccattga tgccaacggt tctaaagtgg 1380 tatatcccga tattaagatg atgattttct cgggtaataa cccatggaac caccatcaag 1440 accgtaaccg catgaagcaa gccttccaaa agcttgaatg cgtggtctct attgatgtga 1500 actggacagc cacttgtcgt ttctccgaca tcgtgttgcc agcttgcacc acctatgagc 1560 gtaacgatat cgacgtgtac ggtgcctatg ccaaccgcgg tattctggcg atgcagaaaa 1620 tggtcgagcc tttgtttgaa agcttgtctg actttgagat ctttactcgt tttgccgcgc 1680 tgctgggtaa agagaaagaa tacacccgca atatgagcga aatggagtgg atagaaaccc 1740 tctataacga gtgtaaagcc gctaacgccg gtaagtatga gatgcctgac tttgccacct 1800 tctggaagca aggttatgta cactttggtg aaggcgaatt atggacgcgc cacgctgact 1860 ttagaaacga tcctgaaatc aacccattag gcacgccttc cggtttgatt gaaatcttca 1920 gtcgtaagat tgaacaattt ggctatgatg actgccaagg ccatcctatg tggatggaaa 1980 aagctgaacg cagccatggt ggtccaggtt cgaataaata tcctatgtgg ttgcaatctt 2040 gccatccgga tcaccgctta cactcacaaa tgtgtgagtc aaaggaatac cgcgaaacct 2100 acacagttaa tggtcgcgaa cctgtgtata ttagccctga agatgctaaa acccgtggca 2160 ttaaagatgg cgatatcgtg cgggtcttta acgaccgagg tcaactgtta gctggcgcag 2220 tggtatcgga tcgtttccct aaaggtgtag tgcgaattca tgaaggtgca tggtatggcc 2280 cagtgggtaa agatggcagc gttgaaggcg gagccgaaat cggtgccctg tgcagctatg 2340 gtgaccctaa taccctaacc ttagacattg gtacctctaa gttggctcaa gcttgctcag 2400 cctatacatg tctggttgag tttgaaaaat accaaggtaa agcacctaag gttagctcct 2460 tcgatggtcc tatcgaagtt gaaatc 2486 <210> 3 <211> 2487 <212> ADN
<213> Schewanella c <900> 3 atgaacagaa gagacttttt aaagggtatc gcctcatcct ctttcgttgt cttaggtggc 60 agctcagtgt tagcgccctt aaatgcctta gccaaaacgg gcatcaatga agacgaatgg 120 ctaaccacag gttcacactt cggcgccttt aaaatgaagc gcaaaaacgg cgtcattgcc 180 gaagtgaaac ccttcgactt agataagtat ccaacggata tgattaacgg catccgcgac 240 atggtctaca atccatcgcg tgtacgttac cctatggtgc gcttagattt tttactcaaa 300 ggtcataaga gtaataccca tcaacggggt gatttccgct ttgttcgtgt aacatgggac 360 aaggcattaa cactgtttaa gcattcatta gatgaagtcc aaacccaata cggtccatca 420 ggtctgcatg cgggtcaaac tggttggcgc gccacgggtc aactgcattc cagcacgagt 980 catatgcaac gtgcggtggg gatgcacggc aactatgtga agaaaatcgg cgactactcc 540 acaggtgcag gccaaacaat tctgccctac gtgttaggtt caaccgaagt gtatgcccaa 600 ggcacttcat ggccgctgat cttagaacac agcgacacta tcgtgctctg gtcgaacgat 660 ccgtacaaga acctgcaagt gggttggaat gcggaaaccc atgaatcttt tgcttatctt 720 gcgcagttaa aagagaaagt gaagcaaggc aagatccgtg ttatcagtat cgaccctgtg 780 gtgactaaga cccaagccta tttgggctgt gagcaactct acgttaaccc acagacagac 840 gtgactttaa tgctggccat cgcccacgag atgatcagca aaaagctcta cgacgataaa 900 tttatccaag gctacagctt aggttttgaa gagtttgtgc cctatgtgat gggtactaaa 960 gatggcgtag ccaaaacccc agaatgggcc gcgcctatct gtggtgttga agcccatgtt 1020 atccgcgact tggctaaaac cttagtcaag ggccgcactc agttcatgat gggctggtgt 1080 atccagcgcc agcaacacgg cgaacaaccc tattggatgg cggcggtact ggcgaccatg 1140 atcggccaaa tcggtctacc cggtggtggc atcagttatg gtcaccacta ctcgagtatc 1200 ggcgtgcctt catcgggtgc cgcggcgcca ggtgctttcc cccgtaactt ggacgaaaat 1260 caaaagccac tatttgatag ctcagacttc aagggcgcga gcagcacaat tccggttgcc 1320 cgctggattg atgcgattct cgaacctggt aaaaccattg atgctaacgg ctcgaaagtg 1380 gtttatcccg atatcaagat gatgattttc tcgggtaata atccttggaa ccatcaccaa 1440 gacagaaacc gtatgaagca agccttccat aagcttgagt gtgtggtcac tgttgatgtg 1500 aactggacgg caacttgccg cttctcggat atcgtactac ccgcttgtac tacctatgag 1560 cgcaacgata tcgacgttta cggcgcctat gctaaccgcg gtattttagc catgcagaaa 1620 atggttgagc cactgtttga tagcttgtcg gattttgaaa ttttcactcg ctttgccgcc 1680 gtacttggta aagagaaaga atacacccgt aacatgggcg aaatggagtg gctagaaacc 1740 ctctataacg aatgtaaagc cgccaacgcg ggcaagtttg agatgcctga ctttgcgact 1800 ttctggaaac aaggttatgt gcattttggt gacggtgaac tctggacgcg ccatgcagac 1860 tttagaaacg atcctgaaat caatccacta ggcacgcctt caggtttgat tgaaatcttt 1920 agccgtaaga ttgatcaatt cggttacgat gactgtaaag gtcacccaac ttggatggag 1980 aaaaccgagc gtagccatgg cggccctggt tctgacaagc atccgatttg gttgcagtca 2040 tgccacccag acaaacgctt acactcgcaa atgtgtgagt cgcgagaata ccgcgagacc 2100 tacgcagtca atggccgtga gcctgtgtat atcagccctg tcgacgcaaa agcgcgcggc 2160 ataaaagatg gcgatatagt gcgagtcttt aacgaccgtg gccaactgtt ggcgggtgca 2220 gtggtatcgg acaacttccc tactggtatt gtgcggattc acgaaggcgc atggtatggg 2280 ccagtaggta aagatggtag cactgaaggt ggggctgaag tcggcgccct gtgcagttat 2340 ggcgatccta acaccctcac tttagacata ggcacatcta aacttgccca agcttgctca 2400 gcctatactt gcttagtcga gtttgagaaa taccaaggca aagtgcctaa ggtcagctcc 2460 ttcgatggcc ctatcgaagt cgaaatc 2487 <210> 4 <211> 1080 <212> ADN
<213> Séquence artificielle <220>
<223> Description de la séquence artificielle: séquence partielle codant pour la protéine TorA de Photobacterium phosphoreum <400> 4 acaatactga aagattgtaa gacattgata tggtggtcaa atgatccgat taaaaacagt 60 caggttggct ggcagtgtga gactcatggt tcttatgagt attatgcgca attaaagcag 120 aaggtcgcag atggtgggat ccgtatgatc tcggtcgatc ctgtagtgtc gaaatcgcaa 180 aaatatttta actgtgagca ccaatacgtc aatcctcaaa ctgacgttcc tttcatgctt 240 gctattgcgc atacattgta taaagaagat ctgtacgata aacaatttct ggaaacttac 300 actttaggct tcaatgaatt cttgccttac ttattgggta caggcaaaga taaaatagcc 360 aaaacgccag aatgggcaga gccaatttgt ggcgttaaag cagaggctat tcgagaattt 420 gctcgcggat tagttaaaaa ccgtacgatg ataatgtttg gttgggctgt acagcgtcaa 480 caacacggtg agcagcctta ttggatggga gcagtgctgg cttcgatgtt aggccaaata 540 ggcttacctg gtggagggat ttcctattct cacttttaca gtggcgttgg gttacctttc 600 agtactgcag ctgggccggg gggatttccg cgtaatgttg atgaaggcca~acagccgatt 660 tggaataata acgattttaa aggctacagt tcgacaattc cggtcgcaag atggattgat 720 gcgatcatgg aaccaggtaa aaaaattcaa tataacggcg ctaatgtggt gttgcctgat 780 attaagatga tggtctttag tggttgtaat ccgtggaatc atcatcaaca acgtaatcgt 890 atgaaacaag catttagaaa gctgcaaacc gtggttaata ttgattatac atggacacca 900 acctgtcgtt tttccgatat tgtattacct gcttgtaccc aatttgagcg tagtgattta 960 gatcaatatg gtacttattc aactagcggt attttagcga tgcataagct aattgatccg 1020 ctttatcaat caaaaacaga ctttcagata tttactgaat taaccgaacg ctttgggaaa 1080 <210> 5 <211> 392 <212> PRT
<213> Shewanella massilia <400> 5 Met Lys Trp Leu Thr Asn Leu Trp Arg Thr Leu Asn Lys Pro Thr Lys Ala Leu Thr Leu Gly Ala Val Ser Ile Ser Ala Phe Ile Met Gly Ile Ile Phe Trp Gly Gly Phe Asn Thr Ala Leu Glu Ala Thr Asn Thr Glu Ala Phe Cys Ile Ser Cys His Ser Met Glu Ser Lys Pro Tyr Gln Glu Leu Gln Glu Thr Val His Trp Ser Asn His Phe Gly Val Arg Ala Thr Cys Pro Asp Cys His Val Pro His Asn Trp Ser Arg Lys Ile Ala Arg Lys Met Glu Ala Ser His Asp Val Trp Gly Trp Leu Phe Asn Thr Val Asn Thr Pro Glu Lys Phe Glu Ala Lys Arg Leu Glu Met Ala Ser Arg Glu Trp Lys Arg Phe Asp Arg Asp Asn Ser Leu Ala Cys Lys Asn Cys His Asn Tyr Asn Ser Met Lys Trp Glu Ala Met Ser Pro Leu Ala Gln Lys Gln Met Lys Arg Ala Ala Glu Ile Asp Gln Ser Cys Ile Asp Cys His Lys Gly Ile Ala His His Leu Pro Glu Met Gly Thr Ala Arg Ala Pro Glu Leu Ile Ala Glu Val Gly Ala Gly Val Ser Ser Val Glu Thr Asn Gln Thr Tyr Tyr Ser Ala Leu Thr Lys Pro Leu Phe Phe Thr Asp Lys Gly Asp Val Glu Ala Gly Thr Leu Asn Val Ala Thr Lys Val Lys Val Leu Glu Thr Gln Gly Lys Arg Ile Lys Ile Gly Ile Asp Gly Trp Arg Lys Lys Ile Gly Ala Gly Arg Val Ile Tyr Met Asp Phe Gly Val Asn Ile Leu Ser Ala Gln Leu Thr Lys Asp Ala Ala Glu Thr Gly Gly Val Ile Gln Thr Phe Glu Glu Lys Glu Asp Pro Met Thr Gly Leu Lys Trp Gln Arg Ile Glu Ala Gln Ile Trp Thr Asp Lys Asp Tyr Leu Leu Thr Glu Leu Gln Pro Leu Trp Gly Tyr Ala Arg Asp Thr Phe Arg Ser Ser Cys Ser Val Cys His Thr Gln Pro Asp Glu Ala His Phe Asp Ala Asn Thr Trp Pro Gly Met Phe Gln Gly Met Leu Ala Phe Val Asn Met Asp Gln Asp Thr Gln Ala Leu Val Gln Lys Tyr Leu Gln Glu His Ser Ser Thr Phe Val Lys Lys Glu His <210> 6 <211> 2523 <212> ADN
<213> Rhodobacter sphaeroides <400> 6 atgccccgcc cgggacgaag cccggcaaga ccgtcatacg gaagaaagga aagccagatg 60 actaagttgt caggtcagga gctgcatgcc gaactctcgc ggcgcgcctt cctgagctat 120 acggcggctg tgggggctct cggtctctgc ggcacctcgc tcctcgcgca gggagcccgc 180 gcggaaggtc tcgccaacgg cgaggtcatg tcgggctgcc actggggcgt gttcaaggcc 240 cgggtcgaga acggccgcgc cgtggccttc gagccctggg acaaggaccc cgcgccgtcg 300 caccagctgc cgggcgtgct cgattcgatc tattcgccca cgcggatcaa atatccgatg 360 gtgcgccgcg aattcctcga gaagggcgtg aacgccgacc gctccacccg cggcaacggc 420 gacttcgtcc gcgtcacctg ggatgaagcg ctcgacctcg tggccaagga actgaagcgc 480 gttcaggaaa gctacgggcc caccggcacc ttcggcggct cctacggctg gaaaaacccg 540 ggccggctgc acaactgtca ggtcctcatg cgccgcgcgc tgaatctcgc gggcgggttc 600 gtgaactcgt cgggcgacta ttcgaccggc gccgcgcaga tcatcatgcc gcatgtcatg 660 ggcacgctcg aggtctacga gcagcagacc gcctggcccg tggtggtgga caacaccgaa 720 ctgatggtct tctgggccgc cgatccggtg aagaccaacc agatcggctg ggtggtcccc 780 gaccatggcg ccttcgcggg catgcaggca atgaaggaaa agggcaccaa ggtcatctgc 840 atcaaccccg tgcgcaccga gacggccgac tatttcggcg ccgaactcgt gtcgccgcgg 900 ccgcagaccg acgtggcgct gatgctcggc atggcgcaca cgctctacag cgaagatctg 960 cacgacaagg acttcatcga aaactgcacc tcgggcttcg acatcttcgc ggcctacctg 1020 accggcgaga gcgacggcac gcccaagacg gccgaatggg ccgccgagat ctgcggcctg 1080 ccggccgagc agatcaagga actcgcccgc cgcttcgtgg gcggccggac gatgctcgcc 1140 gcgggctggt cgatccagcg gatgcaccat ggcgaacagg cgcactggat gctcgtcacg 1200 ctggcctcga tgatcggcca gatcggtctt ccgggcggcg gcttcggcct tagctaccat 1260 tactccaacg gtggctcgcc cacgagcgac ggcccggcgc tgggcggtat ttcggacggc 1320 ggcaagccgg tcgaaggtgc ggcctggctg tcggcgagcg gcgcggcttc gatcccctgc 1380 gcccgggtgg tggacatgct gctcaatccg ggcggcgagt tccagttcaa cggtgccacg 1440 gcgacctatc ccgacgtgaa gctggcctac tgggtgggcg gcaacccctt cgcgcaccac 1500 caggaccgca accggatgct caaggcctgg gaaaagctcg agaccttcat cgtgcaggac 1560 ttccagtgga ccgccaccgc gcgccacgcc gacatcgtcc tgccggcgac gacctcctac 1620 gaacgcaacg acatcgagtc ggtgggcgac tattcgaacc gcgccatcct cgcgatgaag 1680 aaggtggtcg atccgctcta cgaggcccgg tcggactacg acatcttcgc agccctgacg 1740 gagcgtctgg gcaagggcaa ggaattcacc gaaggccgcg acgagatggg ctggatcagc 1800 tcgttctacg aggcggcggt gaagcaggcc gagttcaagc agatggagat gccgtcgttc 1860 gaggacttct ggtcggaagg gatcgtcgag ttcccgatca ccgagggcgc gaacttcgtt 1920 cgctatgccg acttccgcga ggatccgctg ttcaaccccc tcggcacgcc ctcgggcctg 1980 atcgagatct actcgaagaa catcgagaag atgggctatg acgattgccc ggcccatccg 2040 acctggatgg aaccggccga gcgtctcggc gggccggggg cgaaatatcc gctccatgtg 2100 gtggcgagcc acccgaactc gcggctgcac tcgcagctga acggcacctc gctgcgcgac 2160 ctctatgcgg tcgcggggca cgagccctgt ctcatcaacc ccgacgatgc ggccgcgcgc 2220 ggcatcgcgg acggcgatgt gctgcgggtg ttcaacgacc gcgggcagat cctcgtgggc 2280 gcgaaggtga gcgacgcggt gatgccgggc gcgatccagg tctacgaggg cggctggtac 2340 gacccgctcg acccctcgga ggaaggcacg ctcgacaaat acggcgacgt gaacgtgctg 2400 tcgctcgacg tcggcacctc gaagctggcg cagggcaact gcggccagac catcctcgcg 2460 gatgtcgaaa aatatgcggg cgcgccggtg acggtgaccg tgttcgacac gccgaaggga 2520 ccc 2523 <210> 7 <211> 2475 <212> ADN
<213> Rhodobacter capsulatus <400> 7 atgacgaagt tttccggaaa cgagctgcgc gcagagcttt accgccgcgc tttcctcagc 60 tactcggttg caccgggcgc gctgggcatg ttcggccggt cgcttctggc caagggcgcc 120 cgcgccgagg cgctggccaa tggcacggtg atgtcgggca gccactgggg cgtctttacc 180 gcgacggtcg aaaacggccg cgccaccgcc ttcaccccct gggaaaaaga cccgcatccg 240 acgccgatgc tggaaggcgt gctggactcg atctattcgc cgacgcggat caaatatccg 300 atggtgcggc gcgaattcct cgaaaaaggc gtgaatgctg atcgctccac ccgcggcaac 360 ggcgattttc gtcccgtcag ctgggatcag gcgctcgatc tgcatggtcg cgg:cgaggtc 420 aaacgggtcg aaggagacct acggcccgca ggcgtctttg gcggctccta tggctggaaa 480 agccccgggc ggctgcacaa ttgcaccacg cttctgcgcc ggatgctgac gctggcgggc 540 ggctatgtga acggcgcggg cgattattcg accggcgcgg cgcaggtgat catgccgcat 600 gtggtcggca cgctggaagt ctatgaacag cagaccgcct ggccggtgct ggcggaaaac 660 accgaagtca tggtgttctg ggccgccgat ccgatcaaga cagcagatat cggctgggtg 720 tatcccgaac atggcgccta tccggggact gaggcgctca aggccaaggg caccaaggtc 780 atcgtcatcg atccggtccg caccaagacg gtcgaattct tcggcgcgga tcacgtcacg 840 ccgaaaccgc agaccgatgt ggcgatcatg ctgggcatgg cgcatacgct ggtggccgaa 900 gacctgtatg taaaggactt catcgccaac tacacctcgg gcttcgacaa gttcctgccc 960 tatctgatgg gcgagaccga cagcacgccg aagaccgccg aatgggcgtc ggatatcagc 1020 ggcgttccgg ccgagacgat caaggaactg gcgcggctgt tcaaatcgaa acgcacgatg 1080 ctggcggcgg gctggtcgat gcagcggatg catcacggcg agcaggcgca ttggatgctg 1140 gtgacgctgg cctcgatgct gggtcagatc gggctgcggg gcggcggctt cgggctgtcc 1200 tatcactatt cgggcggtgg cacgccctcg agcagcggtc cggcgctttc gggcatcacc 1260 gatggcgggc gacgaagggg ccggaatggc tggcggcgag cggcgcttcg gtgtatcccg 1320 gtggcgcgcg tggtcgacat gctggaaaac cccggcgccg aattcgactt caacggtacg 1380 cggtcgaaat tcccggatgt gaagatggcc tattgggttg gcggaacccc ttcgtgtcac 1440 catcaggacc gcaaccgcat ggtcaaggcc tgggaaaaac tggaaacctt catcgtgcat 1500 gacttccagt ggacgcccac ggcgcggcat gccgacatcg tgctgcccgc gacgaccagc 1560 tatgaacgca acgacatcga gacgatcggc gattattcga acaccggcat cctggcgatg 1620 aagaagatcg tcgagccgct ttacgaagcc cgcagcgatt acgacatctt cgccgcggtc 1680 gccgaacggc tgggcaaggg caaggagttc accgaaggca aggacgagat gggctggatc 1740 aagtccttct acgacgatgc cgccaagcag gcaaagcggg ggtcgagatg ccccgccttc 1800 gacgccttct gggcggaagg gatcgtggaa ttcccggtca ccgacggcgc ggacttcgtg 1860 cgctatgcca gcttccggga agatccgctg ctcaacccgc tgggcacgcc gaccggcctg 1920 atcgagatct actcgaagaa catcgagaag atgggctatg acgactgccc ggcgcatccg 1980 acctggatgg aaccgcttga acggctcgac gggccggggg cgaaatatcc gctgcacatc 2040 gcggctcgca cccgttcaac cggtgtactc gcacccgttc accggctcaa cggcacggtg 2100 ctgcgcgaag gctatgcggt gcaggggcac gagccctgcc tgatgcaccc cgacgacgcc 2160 gccgcgcgcg gcatcgccga tggcgacgtg gtgcgggtgc acaatgatcg cggtcagatc 2220 ctgaccgggg tcaaggtgac cgatgcggtg atgaaggggg taatccagat ctacgaaggg 2280 ggctggtatg atccctcgga cgtgaccgag gcggggacgc tcgacaaata cggcgacgtt 2340 aacgtgctgt cggccgatat cggcatgtcg aaactggcgc agggcaactg tggtcagacc 2400 gtgctggccg aggtcgagaa atacaccggc cccgccgtca ccctgaccgg ctttggtcgc 2460 gcgaaggcgg tcgaa 2475 <210> 8 <211> 404 <212> PRT
<213> Rhodobacter sphareroides <400> 8 Met Gly Arg Ser Cys Gly Gln Ala Ser Glu Ala Lys Val Ile Gly Arg Ile Trp Lys Ala Phe Trp Arg Pro Ser Thr Lys Trp Gly Leu Gly Val Leu Leu Val Thr Gly Gly Ile Ala Gly Ala Val Gly Trp Asn Gly Phe His Tyr Val Val Glu Lys Thr Thr Thr Thr Glu Phe Cys Ile Ser Cys His Ser Met Arg Asp Asn Asn Tyr Glu Glu Tyr Lys Thr Thr Ile His Tyr Gln Asn Thr Ser Gly Val Arg Ala Glu Cys Ala Asp Cys His Val 85 90 95 ._ Pro Lys Ser Gly Trp Lys Leu Tyr Arg Ala Lys Leu Leu Ala Ala Lys Asp Leu Trp Gly Glu Ile Arg Gly Thr Ile Asp Thr Arg Glu Lys Phe Glu Ala His Arg Leu Glu Met Ala Glu Thr Val Trp Ala Asp Met Lys Ala Asn Asp Ser Ala Thr Cys Arg Thr Cys His Ser Phe Glu Ala Met Asp Phe Ala His Gln Lys Pro Glu Ala Ser Lys Gln Met Gln Gln Ala Met Asn Glu Gly Gly Thr Cys Ile Asp Cys His Lys Gly Ile Ala His Lys Met Pro Asp Met Ala Ser Gly Tyr Arg Ala Leu Phe Ser Lys Leu Glu Lys Ala Ser Gln Ser Leu Lys Pro Arg Lys Gly Glu Thr Leu Tyr Pro Leu Arg Thr Ile Glu Ala Tyr Leu Glu Lys Pro Ser Gly Glu Lys Ala Lys Ala Asp Gly Arg Leu Leu Ala Ala Thr Pro Met Gln Val Val Asp Val Thr Gly Asp Trp Val Gln Val Ala Val Lys Gly Trp Gln Gln Glu Gly Ala Glu Arg Val Ile Tyr Glu Lys Gln Gly Lys Arg Ile Phe Asn Ala Ala Leu Ala Pro Ala Ala Thr Gly Ser Val Val Pro Gly Ala Ser Met Val Asp Pro Asp Thr Glu Gln Thr Trp Thr Asp Val Ser Leu Thr Ala Trp Val Arg Asn Arg Asp Leu Thr Gly Asp Gln Glu Ala Leu Trp Gln Tyr Gly Lys Gln Met Tyr Asn Gly Ala Cys Gly Met Cys His Val Leu Pro His Pro Glu His Phe Leu Ala Asn Gln Trp Ile Gly Thr Leu Asn Ala Met Lys Ser Arg Ala Pro Leu Asp Asp Glu Gln Phe Arg Leu Val Gln Arg Tyr Val Gln Met His Ala Lys Asp Val Glu Pro Glu Gly Ala Ala Glu <210> 9 <211> 2544 <212> ADN
<213> Escherichia coli <400> 9 atgaacaata acgatctctt tcaggcatca cgtcggcgtt ttctggcaca actcggcggc 60 ttaaccgtcg ccgggatgct ggggccgtca ttgttaacgc cgcgacgtgc gactgcggcg 120 caagcggcga ctgacgctgt catctcgaaa gagggcattc ttaccgggtc gcactggggg 180 gctatccgcg cgacggtgaa ggatggtcgc tttgtggcgg cgaaaccgtt cgaactggat 240 aaatatccgt cgaaaatgat tgccggattg ccggatcacg tacacaacgc ggcgcgtatt 300 cgttatccga tggtacgcgt ggactggctg cgtaagcgcc atctcagcga tacctcccag 360 cgcggtgata accgttttgt gcgcgtgagc tgggatgaag ccctcgacat gttctatgaa 420 gaactggaac gcgtgcagaa aactcacggg ccgagtgcct tgctgaccgc cagtggttgg 480 caatcgacgg ggatgttcca taacgcttcg gggatgcgtg cgaaacgtat tgccttgcat 540 ggtaatagcg ttggtacggg cggagattac tctaccggtg ctgcgcaggt gatcctgccg 600 cgcgtagtcg gttcgatgga agtgtatgaa cagcaaacct cctggccgct ggtattgcag 660 aacagcaaaa ccattgtgct gtggggctcc gatttgctga aaaaccagca agcgaactgg 720 tggtgcccgg atcacgatgt ttatgaatat tacgcgcagc taaagcgaaa gtcggccgcc 780 ggtgaaattg aggtcatcag catcgatccg gttgtcacat ccacccatga gtatctgggc 840 ggggagcatg tgaagcacat tgcggttaac ccgcaaactg acgtgccgct gcaactcgcg 900 ctggcacata cgctgtacag tgaaaacctg tacgacaaaa acttccttgc taactactgt 960 gtgggttttg aggagttcct gccgtatctg ctgggtgaga aagacggtca gccgaaagat 1020 gccgcatggg ctgaaaaact gagcggcatt gatgccgaaa ccattcgtgg gctggcgcgg 1080 cagatggcgg cgaacagaac gcaaattatt gctggctggt gcgtgcagcg tatgcagcac 1140 ggtgaacagt gggcgtggat gattgtggtt ctggcggcga tgctggggca aattggcctg 1200 ccaggtggtg gttttggttt tggctggcac tacaacggcg caggcacgcc ggggcgtaaa 1260 ggcgttattc tgagtggttt ctccggctct acgtcgattc cgcctgttca cgacaacagt 1320 gactataaag gctacagcag cactattccg attgcccgtt ttatcgatgc gatcctcgaa 1380 ccggggaaag tgatcaactg gaacggtaaa tcggtaaaac tgccgccgct gaaaatgtgt 1440 atttttgccg gaactaaccc attccatcgc catcagcaga tcaaccgcat tattgaaggc 1500 ttgcgcaacg tggaaacggt tatcgccata gataaccagt ggacctcaac ctgccgcttt 1560 gccgatatcg tactgcctgc gaccacgcag tttgagcgta acgatctcga ccagtacggc 1620 aatcactcca accgtggcat tatcgccatg aaacaggtgg tgccgccgca gttcgaggcg 1680 cgcaacgact tcgatatttt ccgcgagctg tgccgtcgct ttaatcgcga agaagccttt 1740 accgaagggc tggacgaaat gggctggctg aaacgcatct ggcaggaagg tgtacagcaa 1800 ggcaaaggac gcggcgttca tctgccagcg tttgatgact tctggaataa caaagagtac 1860 gtcgagtttg accatccgca gatgtttgtt cgccaccagg cattccgcga agatccggat 1920 ctcgaaccgc tgggcacgcc gagtggcctg attgagatct actcgaaaac tatcgccgat 1980 atgaactacg acgattgtca ggggcatccg atgtggtttg agaaaatcga acgctcccac 2040 ggtgggcctg gctcgcaaaa gtatccgttg catctgcaat ctgtgcatcc ggatttccga 2100 cttcactcgc agttatgtga gtcggaaacg ctgcgtcacg aatatacggt agcgggtaaa 2160 gagccagtat tcattaaccc gcaggatgcc agcgcgcgcg gtattcgtaa cggtgatgtg 2220 gtacgcgtct ttaacgctcg cggtcaggtg atggcagggg cagtggtttc tgaccgctat 2280 gcacccggcg tggcacgaat tcacgaaggg gcatggtacg atccagataa aggcggcgag 2340 ctgggtgcgc tgtgcaaata cggtaacccc aacgtgttga ccatcgacat cggtacatcg 2400 cagctcgcgc aggcgaccag tgcgcacact acgctggtgg aaattgagaa gtacaacgga 2460 acagtggagc aggtgacggc gtttaacggc cccgtggaga tggtggcgca gtgcgaatat 2520 gttcccgcgt cgcaggtgaa atca 2544 <210> 10 <211> 477 <212> ADN
<213> Séquence artificielle <220>
<223> Description de la séquence artificielle: séquence partielle codant pour la protéine TorA de Salmonella typhimurium <400> 10 atgaaacagg tggtgtcgcc gcagtttgaa gcgcgtaacg actttgatat tttccgcgat 60 ctctgccgac gctttaaccg tgaagcggca ttcacggaag gtcttgatga aatgggctgg 120 ctgaaacgca tctggcagga agggagccag cagggaaaag gtcgcggtat ccacttaccg 180 attttcgagg tgttctggaa tcaacaggag tacatcgagt ttgatcatcc gcagatgttt 240 gtacgccatc aggctttccg tgaagatccg gacctggagc cgttgggcac gccaagcggt 300 ttgatcgaga tttactccaa aaccatcgcc gacatgcaat acgacgatgg tcagggccat 360 cccatgtggt tcgaaaaaat cgaacgctcg catggcgggc cgggatcgca gcgctggccg 420 ctgcacttac aatccgtcca ccctgatttc cgtctgcatt cccaactgtt gcgagtc 477 <210> 11 <211> 390 <212> PRT
<213> Escherichia coli <400> 11 Met Arg Lys Leu Trp Asn Ala Leu Arg Arg Pro Ser Ala Arg Trp Ser Val Leu Ala Leu Val Ala Ile Gly Ile Val Ile Gly Ile Ala Leu Ile Val Leu Pro His Val Gly Ile Lys Val Thr Ser Thr Thr Glu Phe Cys Val Ser Cys His Ser Met Gln Pro Val Tyr Glu Glu Tyr Lys Gln Ser Val His Phe Gln Asn Ala Ser Gly Val Arg Ala Glu Cys His Asp Cys His Ile Pro Pro Asp Ile Pro Gly Met Val Lys Arg Lys Leu Glu Ala Ser Asn Asp Ile Tyr Gln Thr Phe Ile Ala His Ser Ile Asp Thr Pro Glu Lys Phe Glu Ala Lys Arg Ala Leu Leu Ala Glu Arg Glu Trp Ala Arg Met Lys Glu Asn Asn Ser Ala Thr Cys Arg Ser Cys His Asn Tyr Asp Ala Met Asp His Ala Lys Gln His Pro Glu Ala Ala Arg Gln Met Lys Val Ala Ala Lys Asp Asn Gln Ser Cys Ile Asp Cys His Lys Gly Ile Ala His Gln Leu Pro Asp Met Ser Ser Gly Phe Arg Lys Gln Phe Asp Asp Val Arg Ala Ser Ala Asn Asp Ser Gly Asp Thr Leu Tyr Ser Ile Asp Ile Lys Pro Ile Tyr Ala Ala Lys Gly Asp Lys Glu Ala Ser Gly Ser Leu Leu Pro Ala Ser Glu Val Lys Val Leu Lys Arg Asp Gly Asp Trp Leu Gln Ile Glu Ile Thr Gly Trp Thr Glu Ser Ala Gly Arg Gln Arg Val Leu Thr Gln Phe Pro Gly Lys Arg Ile Phe Val Ala Ser Ile Arg Gly Asp Val Gln Gln Gln Val Lys Thr Leu Glu Lys Thr Thr Val Ala Asp Thr Asn Thr Glu Trp Ser Lys Leu Gln Ala Thr Ala Trp Met Lys Lys Gly Asp Met Val Asn Asp Ile Lys Pro Ile Trp Ala T~r Ala Asp Ser Leu Tyr Asn Gly Thr Cys Asn Gln Cys His Gly Ala Pro Glu Ile Ala His Phe Asp Ala Asn Gly Trp Ile Gly Thr Leu Asn Gly Met Ile Gly Phe Thr Ser Leu Asp Lys Arg Glu Glu Arg Thr Leu Leu Lys Tyr Leu Gln Met Asn Ala Ser Asp Thr Ala Gly Lys Ala His Gly Asp Lys Lys Glu Glu Lys <210> 12 <211> 21 <212> ADN
<213> Séquence artificielle <220>
<223> Description de la séquence artificielle: AMORCE
PCR
<400> 12 cggvgaytac tcbachggtg c 21 <210> 13 <211> 20 <212> ADN
<213> Séquence artificielle <220>
<223> Description de la séquence artificiellé: amorce PCR
<400> 13 atygatgcga tyctcgaacc 20 <210> 14 ~ '-<211> 25 <212> ADN
<213> Séquence artificielle <220>
<223> Description de la séquence artificielle: amorce PCR
<400> 14 cgtamwsgtc gakatcgttr cgctc 25 <210> 15 <211> 20 <212> ADN
<213> Séquence artificielle <220>
<223> Description de la séquence artificielle: amorce PCR
<400> 15 gactcacaya wytgygagtg 20 <210> 16 <211> 20 <212> ADN
<213> Séquence artificielle <220>
<223> Description de la séquence artificielle: amorce PCR
<400> 16 tgrccdcgrk cgttaaagac 20 <210> 17 <211> 20 <212> ADN
<213> Séquence artificielle <220>
<223> Description de la séquence artificielle: amorce PCR
<400> 17 ccvggttcga gratcgcatc 20 <210> 18 <211> 16 <212> ADN
<213> Séquence artificielle <220>
<223> Description de la séquence artificielle: amorce PCR
<400> 18 cbgayatcst rctgcc 16 <210> 19 <211> 20 <212> ADN
<213> Séquence artificielle <220>
<223> Description de la séquence artificielle: amorce PCR
<400> 19 ggmgaytayt cbacmggygc 20 <210> 20 <211> 20 <212> ADN
<213> Séquence artificielle <220>
<223> Description de la séquence artificielle: amorce PCR
<400> 20 twygarcgya acgaymtcga 20 <210> 21 <211> 20 <212> ADN
<213> Séquence artificielle <220>
<223> Description de la séquence artificielle: amorce PCR
<400> 21 ggvycrtacc abscvccttc 20 <210> 22 <211> 20 <212> ADN
<213> Séquence artificielle <220>
<223> Description de la séquence artificielle: amorce PCR
<400> 22 atcarrccns wvggcgtgcc 20 <210> 23 <211> 17 ' <212> ADN
<213> Séquence artificielle <220>
<223> Description de la séquence artificielle: amorce PCR
<400> 23 gbcacrtcdg tytgygg 17 <210> 24 <211> 20 <212> ADN
<213> Séquence artificielle <220>
<223> Description de la séquence artificielle: amorce PCR
<400> 24 acnccngara arttygargc 20 <210> 25 <211> 20 <212> ADN
<213> Séquence artificielle <220>
<223> Description de la séquence artificielle: amorce PCR
<400> 25 tgyathgayt gycayaargg 20 <210> 26 <211> 20 <212> ADN
<213> Séquence artificielle <220>
<223> Description de la séquence artificielle: amorce PCR
<400> 26 ccyttrtgrc artcdatrca 20 <210> 27 <211> 17 <212> ADN
<213> Séquence artificielle <220>
<223> Description de la séquence artificielle: amorce PCR
<400> 27 ttngcrtcra artgngc 17

Claims (15)

REVENDICATIONS

1. Utilisation de séquences nucléotidiques choisies parmi celles comprenant une séquence codant pour une protéine du système triméthylamine N-oxyde réductase (TMAO
réductase) chez les bactéries, ou un fragment de cette séquence telle qu'une sonde ou une amorce d'environ 15 à environ 25 nucléotides, ou une séquence dérivée par addition, suppression, et/ou substitution d'un ou plusieurs nucléotides de cette séquence codant pour une protéine du système TMAO réductase ou d'un fragment de cette dernière, ledit fragment et ladite séquence dérivée étant capables de s'hybrider avec ladite séquence codant pour une protéine du système TMAO réductase, pour la mise en oeuvre d'une méthode de détection de la présence de toutes bactéries impliquées dans le processus de dégradation des chairs d'animaux aquatiques, chez un hôte susceptible d'être porteur de telles bactéries.

2. Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que la séquence codant pour une protéine du système TMAO réductase est choisie parmi les séquences codant pour la TMAO
réductase chez les bactéries, encore désignée protéine TorA ou DorA, ou codant pour un cytochrome de type c, encore désigné protéine TorC ou DorC.

3. Utilisation selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisée en ce que les séquences nucléotidiques codant pour une protéine du système TMAO réductase sont choisies parmi celles des bactéries suivantes:
- les bactéries marines, telles que celles du genre Shewanella, Photobacterium ou Vibrio, lesdites séquences étant notamment choisies parmi les suivantes:
* la séquence codant pour la protéine TorA de Shewanella massilia représentée sur la figure 1, * la séquence codant pour la protéine TorA de Shewanella putrefaciens représentée sur la figure 1, * la séquence codant pour la protéine TorA de Shewanella c représentée sur la figure 2, * la séquence partielle codant pour la protéine TorA de Photobacterium phosphoreum représentée sur la figure 3, * la séquence codant pour la protéine TorC de Shewanella massilia représentée sur la figure 14, - les bactéries provenant des eaux saumâtres, telles que celles du genre Rhodobacter, ou Roseobacter, lesdites séquences étant notamment choisies parmi les suivantes:
* la séquence codant pour la protéine DorA de Rhodobacter sphaeroides représentée sur la figure 4, * la séquence codant pour la protéine DorA de Rhodobacter capsulatus représentée sur la figure 4, * la séquence codant pour la protéine DorC de Rhodobacter sphaeroides représentée sur la figure 14, - les entérobactéries, telles que celles du genre Escherichia, ou Salmonella, lesdites séquences étant notamment choisies parmi les suivantes:
* la séquence codant pour la protéine TorA de Escherichia coli représentée sur la figure 4, * la séquence partielle codant pour la protéine TorA de Salmonella typhimurium représentée sur la figure 5, * la séquence codant pour la protéine TorC de Escherichia coli représentée sur la figure 14.

4. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que les séquences nucléotidiques sont utilisées sous forme de couples d'amorces choisis parmi l'un quelconque des trois groupes d'amorces suivants:
(1) le groupe d'amorces « DDN » comprenant:
~ les compositions de séquences nucléotidiques « DDN+ » suivantes:
- DDN1+ : 5' CGG vGA yTA CTC bAC hGG TGC 3' : mélange de 54 séquences nucléotidiques, - DDN5+ : 5' ATy GAT GCG ATy CTC GAA CC3' : mélange de 4 séquences nucléotidiques, ~ les compositions de séquences nucléotidiques « DDN- » suivantes:
- DDN2- : 5'CGT Amw sGT CGA kAT CGT TrC GCT C3' : mélange de 32 séquences nucléotidiques, - DDN3- : 5' GAC TCA CAy Awy TGy GAG TG 3' : mélange de 16 séquences nucléotidiques, - DDN4- : 5' TGr CCd CGr kCG TTA AAG AC 3' : mélange de 24 séquences nucléotidiques, - DDN5- : 5' CCv GGT TCG AGr ATC GCA TC 3' : mélange de 6 séquences nucléotidiques, (2) le groupe d'amorces « BN » comprenant:
~ les compositions de séquences nucléotidiques « BN+ » suivantes:
- BN1+ : 5' C bGA yAT CsT rCT GCC 3' : mélange de 16 séquences nucléotidiques, - BN3+ : 5' GGm GAy TAy TCb ACm GGy GC 3' : mélange de 96 séquences nucléotidiques, - BN6+ : 5' Twy GAr CGy AAC GAy mTC GA 3' : mélange de 64 séquences nucléotidiques, ~ les compositions de séquences nucléotidiques « BN- » suivantes:
- BN2- : 5' GG vyC rTA CCA bsC vCC TTC 3' : mélange de 216 séquences nucléotidiques, - BN4- : 5' ATC Arr CCn swv GGC GTG CC 3' : mélange de 192 séquences nucléotidiques, -BN5- : 5'GbC ACr TCd GTy TGy GG 3' : mélange de 72 séquences nucléotidiques, (3) le groupe d'amorces « BC » comprenant:
~ les compositions de séquences nucléotidiques « BC+ » suivantes:
- BC1+ : 5' ACn CCn GAr AAr TTy GAr GC 3' : mélange de 256 séquences nucléotidiques, - BC2+ : 5' TGy ATh GAy TGy CAy AAr GG 3' : mélange de 96 séquences nucléotidiques, ~ les compositions de séquences nucléotidiques « BC- » suivantes:
- BC2- : 5' CCy TTr TGr CAr TCd ATr CA 3': mélange de 96 séquences nucléotidiques, - BC3- : 5' TTn GCr TCr AAr TGn GC 3': mélange de 128 séquences nucléotidiques, dans lesquelles n = (A,C,G,T), y = (C,T), r = (A,G), h = (A,C,T), d = (G,A,T), m = (A,C), w = (A,T), b = (G,T,C), s = (G,C), v = (G,A,C), et k = (G, T), les couples d'amorces étant choisis de telles de telle sorte que l'une des amorces d'un couple correspond à l'une des compositions de séquences nucléotidiques DDN+, BN+ ou BC+
susmentionnées, tandis que l'autre amorce correspond respectivement à l'une des compositions de séquences nucléotidiques DDN-, BN- ou BC- susmentionnées, lesdits couples d'amorces étant notamment choisis parmi l'un quelconque des quatre couples suivants:
(a) le couple DDN1+ / DDN5-, conduisant à l'amplification de fragments du gène codant pour la protéine TorA chez les bactéries, d'une taille d'environ 820 paires de bases (bp), et notamment à l'amplification d'un fragment de 821 bp du gène codant pour la protéine TorA
chez les bactéries du genre Shewanella, tel que le fragment de 821 bp délimité
par les nucléotides situés aux positions 620 à 1450 du gène torA de S. massilia représenté sur la figure 4, (b) le couple BN6+ / BN2-, conduisant à l'amplification de fragments du gène codant pour la protéine TorA chez les bactéries, d'une taille d'environ 710 bp, et notamment à
l'amplification d'un fragment de 727 bp du gène codant pour la protéine TorA
chez les bactéries du genre Shewanella, tel que le fragment de 727 bp délimité par les nucléotides situés aux positions 1657 à 2403 du gène torA de S. massilia représenté sur la figure 4, (c) le couple BN6+ /BN4-, conduisant à l'amplification de fragments du gène codant pour la protéine TorA chez les bactéries, d'une taille d'environ 360 bp, et notamment à
l'amplification d'un fragment de 355 bp du gène codant pour la protéine TorA
chez les bactéries du genre Shewanella, tel que le fragment de 355 bp délimité par les nucléotides situés aux positions 1657 à 2023 du gène torA de S. massilia représenté sur la figure 4, (d) le couple BC1+ /BC2-, conduisant à l'amplification de fragments du gène codant pour la protéine TorC chez les bactéries, d'une taille d'environ 170 bp, et notamment à
l'amplification d'un fragment de 197 bp du gène codant pour la protéine TorC
chez les bactéries du genre Shewanella, tel que le fragment de 197 bp codant pour le fragment polypeptidique délimité par les acides aminés situés aux positions 114 à 179 de la protéine TorC de S. massilia représentée sur la figure 14.

5. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que les hôtes susceptibles d'être porteurs de bactéries impliquées dans le processus de dégradation des chairs d'animaux aquatiques, telles que décrites dans la revendication 3, sont des organismes aquatiques, notamment des organismes marins tels que les poissons et les crustacés, et plus particulièrement les poissons d'Atlantique tels que la sole, le cabillaud, ou les poissons de la mer Méditerranée tels que le rouget de roche, la dorade, ainsi que certains animaux des eaux douces ou saumâtres.

6. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, pour la mise en oeuvre d'une méthode de détection de la présence de toutes bactéries impliquées dans la dégradation des chairs d'animaux aquatiques, dans le cadre d'un procédé d'évaluation de l'état de fraîcheur des animaux aquatiques sur lesquels est prélevé l'échantillon testé, lorsque ces derniers sont extraits de leur environnement naturel.

7. Séquence nucléotidique correspondant à l'une des séquences suivantes - DDN1 + : 5' CGG vGA yTA CTC bAC hGG TGC 3', - DDN5 + : 5' ATy GAT GCG ATy CTC GAA CC 3', - DDN2 - : 5'CGT Amw sGT CGA kAT CGT TrC GCT C 3', - DDN3 - : 5' GAC TCA CAy Awy TGy GAG TG 3', - DDN4 - : 5' TGr CCd CGr kCG TTA AAG AC 3', - DDN5 - : 5' CCv GGT TCG AGr ATC GCA TC 3', - BN1+ : 5' C bGA yAT CsT rCT GCC 3', - BN3+ : 5 ' GGm GAy TAy TCb ACm GGy GC 3 ', - BN6+ : 5' Twy GAr CGy AAC GAy mTC GA 3', - BN2- : 5' GG vyC rTA CCA bsC vCC TTC 3', - BN4- : 5 ' ATC Arr CCn swv GGC GTG CC 3', - BN5- : 5'GbC ACr TCd GTy TGy GG 3', - BC1+ : 5' ACn CCn GAr AAr TTy GAr GC 3', - BC2+ : 5' TGy ATh GAy TGy CAy AAr GG 3', - BC2- : 5' CCy TTr TGr CAr TCd ATr CA 3 ', - BC3- : 5' TTn GCr TCr AAr TGn GC 3', dans lesquelles n = (A,C,G,T), y = (C,T), r = (A,G), h = (A,C,T), d = (G,A,T), m = (A,C), w = (A,T), b = (G,T,C), s = (G,C), v = (G,A,C), et k = (G,T).

8. Composition de séquences nucléotidiques en mélange, correspondant à l'une des compositions suivantes .cndot. les compositions de séquences nucléotidiques « DDN+ » suivantes - DDN1+: 5' CGG vGA yTA CTC bAC hGG TGC 3' : mélange de 54 séquences nucléotidiques, - DDN5+ : 5' ATy GAT GCG ATy CTC GAA CC 3' : mélange de 4 séquences nucléotidiques, ~ les compositions de séquences nucléotidiques « DDN- » suivantes:
- DDN2- : 5' CGT Amw sGT CGA kAT CGT TrC GCT C 3' : mélange de 32 séquences nucléotidiques, - DDN3- : 5' GAC TCA CAy Awy TGy GAG TG 3' : mélange de 16 séquences nucléotidiques, - DDN4- : 5' TGr CCd CGr kCG TTA AAG AC 3' : mélange de 24 séquences nucléotidiques, - DDN5- : 5' CCv GGT TCG AGr ATC GCA TC 3' : mélange de 6 séquences nucléotidiques, ~ les compositions de séquences nucléotidiques « BN+ » suivantes:
- BN1+ : 5' C bGA yAT CsT rCT GCC 3' : mélange de 16 séquences nucléotidiques, - BN3+ : 5' GGm GAy TAy TCb ACm GGy GC 3' : mélange de 96 séquences nucléotidiques, - BN6+ : 5' Twy GAr CGy AAC GAy mTC GA 3' : mélange de 64 séquences nucléotidiques, ~ les compositions de séquences nucléotidiques « BN- » suivantes:
- BN2- : 5' GG vyC rTA CCA bsC vCC TTC 3' : mélange de 216 séquences nucléotidiques, - BN4- : 5' ATC Arr CCn swv GGC GTG CC 3' : mélange de 192 séquences nucléotidiques, - BN5- : 5'GbC ACr TCd GTy TGy GG 3' : mélange de 72 séquences nucléotidiques, ~ les compositions de séquences nucléotidiques « BC+ » suivantes:
- BC1+ : 5' ACn CCn GAr AAr TTy GAr GC 3' : mélange de 256 séquences nucléotidiques, - BC2+ : 5' TGy ATh GAy TGy CAy AAr GG 3' : mélange de 96 séquences nucléotidiques, ~ les compositions de séquences nucléotidiques « BC- » suivantes:
- BC2- : 5' CCy TTr TGr CAr TCd ATr CA 3' : mélange de 96 séquences nucléotidiques, - BC3- : 5' TTn GCr TCr AAr TGn GC 3' : mélange de 128 séquences nucléotidiques, dans lesquelles n=(A,C,G,T), y=(C,T), r=(A,G), h=(A,C,T), d=(G,A,T), m=(A,C), w=(A,T), b=(G,T,C), s=(G,C), v=(G,A,C), et k=(G,T).

9. Couple d'amorces caractérisé en ce qu'il est choisi au sein de l'un des groupes d'amorces suivants:
(1) le groupe d'amorces « DDN » comprenant:
~ les compositions de séquences nucléotidiques « DDN+ » suivantes:
- DDN1+ : 5'CGG vGA yTA CTC bAC hGG TGC 3': mélange de 54 séquences nucléotidiques, - DDN5+ : 5' ATy GAT GCG ATy CTC GAA CC 3': mélange de 4 séquences nucléotidiques, ~ les compositions de séquences nucléotidiques « DDN- » suivantes:
- DDN2-: 5'CGT Amw sGT CGA kAT CGT TrC GCT C 3': mélange de 32 séquences nucléotidiques, - DDN3-: 5'GAC TCA CAy Awy TGy GAG TG 3': mélange de 16 séquences nucléotidiques, - DDN4-: 5'TGr CCd CGr kCG TTA AAG AC 3': mélange de 24 séquences nucléotidiques, - DDN5-: 5'CCv GGT TCG AGr ATC GCA TC 3': mélange de 6 séquences nucléotidiques, (2) le groupe d'amorces « BN » comprenant:
~ les compositions de séquences nucléotidiques « BN+ » suivantes:
-BN1+: 5'C bGA yAT CsT rCT GCC 3': mélange de 16 séquences nucléotidiques, -BN3+: 5'GGm GAy TAy TCb ACm GGy GC3': mélange de 96 séquences nucléotidiques, - BN6+: 5'Twy GAr CGy AAC GAy mTC GA 3': mélange de 64 séquences nucléotidiques, ~ les compositions de séquences nucléotidiques « BN- » suivantes:
-BN2-: 5'GG vyC rTA CCA bsC vCC TTC 3': mélange de 216 séquences nucléotidiques, -BN4-: 5'ATC Arr CCn swv GGC GTG CC 3': mélange de 192 séquences nucléotidiques, -BN5-: 5'GbC ACr TCd GTy TGy GG3': mélange de 72 séquences nucléotidiques, (3) le groupe d'amorces « BC » comprenant:
~les compositions de séquences nucléotidiques « BC+ » suivantes:
- BC1+: 5'ACn CCn GAr AAr TTy GAr GC3': mélange de 256 séquences nucléotidiques, - BC2+: 5'TGy ATh GAy TGy CAy AAr GG3': mélange de 96 séquences nucléotidiques, ~ les compositions de séquences nucléotidiques « BC- » suivantes:
-BC2-: 5'CCy TTr TGr CAr TCd ATr CA 3': mélange de 96 séquences nucléotidiques, -BC3-: 5'TTn GCr TCr AAr TGn GC3': mélange de 128 séquences nucléotidiques, dans lesquelles n = (A,C,G,T), y = (C,T), r = (A,G), h = (A,C,T), d = (G,A,T), m = (A,C), w = (A,T), b = (G,T,C), s = (G,C), v = (G,A,C), et k = (G,T), les couples d'amorces étant choisis de telles de telle sorte que l'une des amorces d'un couple correspond à l'une des compositions de séquences nucléotidiques DDN+, BN+ ou BC+
susmentionnées, tandis que l'autre amorce correspond respectivement à l'une des compositions de séquences nucléotidiques DDN-, BN- ou BC- susmentionnées, lesdits couples d'amorces étant notamment choisis parmi l'un quelconque des quatre couples suivants:
(a) le couple DDN1+ / DDN5-, conduisant à l'amplification de fragments du gène codant pour la protéine TorA chez les bactéries, d'une taille d'environ 820 paires de bases (bp), et notamment à l'amplification d'un fragment de 821 bp du gène codant pour la protéine TorA
chez les bactéries du genre Shewanella, tel que le fragment de 821 bp délimité
par les nucléotides situés aux positions 620 à 1450 du gène torA de S. massilia représenté sur la figure 4, (b) le couple BN6+ / BN2-, conduisant à l'amplification de fragments du gène codant pour la protéine TorA chez les bactéries, d'une taille d'environ 710 bp, et notamment à
l'amplification d'un fragment de 727 bp du gène codant pour la protéine TorA
chez les bactéries du genre Shewanella, tel que le fragment de 727 bp délimité par les nucléotides situés aux positions 1657 à 2403 du gène torA de S. massilia représenté sur la figure 4, (c) le couple BN6+ /BN4-, conduisant à l'amplification de fragments du gène codant pour la protéine TorA chez les bactéries, d'une taille d'environ 360 bp, et notamment à
l'amplification d'un fragment de 355 bp du gène codant pour la protéine TorA
chez les bactéries du genre Shewanella, tel que le fragment de 355 bp délimité par les nucléotides situés aux positions 1657 à 2023 du gène torA de S. massilia représenté sur la figure 4, (d) le couple BC1+ /BC2-, conduisant à l'amplification de fragments du gène codant pour la protéine TorC chez les bactéries, d'une taille d'environ 170 bp, et notamment à
l'amplification d'un fragment de 197 bp du gène codant pour la protéine TorC
chez les bactéries du genre Shewanella, tel que le fragment de 197 bp codant pour le fragment polypeptidique délimité par les acides aminés situés aux positions 114 à 179 de la protéine TorC de S. massilia représentée sur la figure 14.

10. Méthode de détection de toutes bactéries impliquées dans la dégradation des chairs d'animaux aquatiques chez un hôte susceptible d'être porteur de telles bactéries, ladite méthode étant effectuée à partir d'un échantillon biologique prélevé sur cet hôte, cet échantillon biologique correspondant notamment à un fragment sous-cutané de chair de l'animal aquatique en question, et étant caractérisée en ce qu'elle comprend une étape d'hybridation d'au moins une séquence nucléotidique telle que définie dans l'une quelconque des revendications 1 à 9, avec des fragments des gènes codant pour une protéine du système TMAO-réductase de bactéries impliquées dans la dégradation des chairs d'animaux aquatiques susceptibles d'être présentes dans l'échantillon biologique prélevé sur ledit hôte, suivie d'une étape de révélation, notamment par électrophorèse, de la présence éventuelle dans ledit échantillon de gènes codant pour une protéine du système TMAO-réductase, ou de fragments de ces gènes, dont le nombre de copies a été le cas échéant amplifié.

11. Méthode de détection selon la revendication 10, caractérisée en ce qu'elle comprend les étapes suivantes :
- le traitement d'un échantillon biologique prélevé sur cet hôte afin d'extraire l'ADN total de cet hôte et de rendre le génome de ces bactéries accessible aux séquences nucléotidiques ou amorces définies selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, ce traitement étant notamment effectué à l'aide d'une technique d'extraction rapide de l'ADN basée sur la fixation des acides nucléiques à des billes de silice, - l'amplification du nombre de copies de gènes codant pour les protéines du système TMAO-réductase de bactéries impliquées dans la dégradation des chairs d'animaux aquatiques, ou de fragments de ces gènes, susceptibles d'être présents dans cet échantillon, à l'aide des séquences nucléotidiques ou amorces susmentionnées hybridant avec les gènes ou fragments de gènes susmentionnés, - la détection de la présence éventuelle d'un nombre amplifié de copies de gènes codant pour une protéine du système TMAO-réductase des bactéries susmentionnées, ou de fragments de ces gènes, et donc de la présence de telles bactéries dans l'échantillon biologique étudié.

12. Méthode de détection selon la revendication 11, caractérisée en ce que l'amplification du nombre de gènes codant pour la TMAO-réductase comprend les étapes suivantes:
- la prédénaturation de l'ADN double brin total de l'hôte en ADN mono-brin, de préférence dans un tampon constitué de 10mM Tris-HCl pH 8,3, 50mM KCl, 1,5mM
MgCl2, 0,01 % de gélatine, des 4 désoxynucléotides constitutifs des ADN (dCTP, dATP, dGTP, dTTP) à une concentration de 100 µM chacun, et des couples d'amorces, tels que définis dans les revendications 1 à 9, par chauffage entre environ 90 °C et environ 100 °C, avantageusement à
94 °C, pendant environ 1,5 minute, - l'amplification proprement dite par addition au milieu obtenu à l'étape précédente d'ADN polymérase, par exemple la Taq polymérase, ~ chauffage à environ 94°C pendant environ 30 secondes, ce qui correspond à
l'étape de dénaturation proprement dite, ~ puis chauffage entre environ 35°C à environ 60 °C, et notamment à environ 45°C
ou 55°C, pendant environ 30 secondes, ce qui correspond à l'étape d'hybridation des amorces avec les gènes codant pour les protéines du système TMAO-réductase de bactéries, ou des fragments de ces gènes, susceptibles d'être présents dans l'échantillon biologique étudié, ~ et enfin, chauffage à 72 °C, pendant environ 45 secondes, ce qui correspond à
l'étape d'élongation des amorces, hybridées à l'étape précédente, l'une vers l'autre, produisant ainsi des séquences nucléotidiques complémentaires de fragments de gènes codant pour les protéines du système TMAO-réductase de bactéries, ces dernières séquences étant délimitées par les nucléotides s'hybridant avec les amorces susmentionnées, - la répétition de l'étape d'amplification précédente entre environ 15 et environ 35 fois, avantageusement environ 30 fois.

13. Kit pour la mise en oeuvre d'une méthode de détection selon l'une des revendications à 12, caractérisé en ce qu'il comprend:
- une ou plusieurs séquences nucléotidiques ou amorces définies dans l'une des 47~

revendications 1 à 9, - une ADN polymérase, - un milieu réactionnel avantageusement constitué de 10mM Tris-HCl pH 8,3, 50mM
KCl, 1,5mM MgCl2, 0,01 % de gélatine, des 4 désoxynucléotides constitutifs des ADN (dCTP, dATP, dGTP, dTTP) à une concentration de 100 µM chacun.

14. Séquence nucléotidique comprenant:
- la séquence représentée sur la figure 2 du gène torA codant pour la protéine TorA de la bactérie marine Shewanella c, * ou toute séquence dérivée de la séquence susmentionnée par dégénérescence du code génétique, et codant pour la protéine TorA de Shewanella c, dont la séquence peptidique est représentée sur la figure 6, * ou toute séquence dérivée de la séquence nucléotidique susmentionnée, notamment par substitution, suppression ou addition d'un ou plusieurs nucléotides, ladite séquence dérivée ayant de préférence une homologie d'environ 35 % à 100 % avec la séquence nucléotidique susmentionnée représentée sur la figure 2, * ou tout fragment de la séquence nucléotidique susmentionnée, ou d'une séquence dérivée de cette dernière telle que définie ci-dessus, ledit fragment étant de préférence constitué
d'au moins environ 15 nucléotides, - la séquence partielle représentée sur la figure 3 du gène codant pour la protéine TorA de la bactérie marine Photobacterium phosphoreum, * ou toute séquence dérivée de la séquence susmentionnée par dégénérescence du code génétique; et codant pour la protéine TorA de Photobacterium phosphoreum dont la séquence peptidique est représentée sur la figure 7, * ou toute séquence dérivée de la séquence nucléotidique susmentionnée, notamment par substitution, suppression ou addition d'un ou plusieurs nucléotides, ladite séquence dérivée ayant de préférence une homologie d'environ 35 % à 100 % avec la séquence nucléotidique susmentionnée représentée sur la figure 3, * ou tout fragment de la séquence nucléotidique susmentionnée, ou d'une séquence dérivée de cette dernière telle que définie ci-dessus, ledit fragment étant de préférence constitué
d'au moins environ 15 nucléotides, - la séquence partielle représentée sur la figure 5 du gène codant pour la protéine TorA
de la bactérie marine Salmonella typhimurium, * ou toute séquence dérivée de la séquence susmentionnée par dégénérescence du code génétique, et codant pour la protéine TorA de Salmonella typhimurium dont la séquence peptidique est représentée sur la figure 8, * ou toute séquence dérivée de la séquence nucléotidique susmentionnée, notamment par substitution, suppression ou addition d'un ou plusieurs nucléotides, ladite séquence dérivée ayant de préférence une homologie d'environ 35 % à 100 % avec la séquence nucléotidique susmentionnée représentée sur la figure 5, * ou tout fragment de la séquence nucléotidique susmentionnée, ou d'une séquence dérivée de cette dernière telle que définie ci-dessus, ledit fragment étant de préférence constitué
d'au moins environ 15 nucléotides.

15. Séquence peptidique codée par une séquence nucléotidique selon la revendication 14, et comprenant - la séquence en acides aminés représentée sur la figure 6 de la protéine TorA
de Shewanella c, * ou une. séquence dérivée de la séquence peptidique susmentionnée, notamment par substitution, suppression ou addition d'un ou plusieurs acides aminés, ladite séquence dérivée ayant de préférence une homologie d'environ 35 % à 100 % avec la séquence peptidique susmentionnée représentée sur la figure 6, * ou un fragment de la séquence peptidique susmentionnée, ou d'une séquence dérivée de cette dernière telle que définie ci-dessus, ledit fragment étant de préférence constitué d'au moins environ 5 acides aminés, - la séquence partielle en acides aminés représentée sur la figure 7 de la protéine TorA de Photobacterium phosphoreum, * ou une séquence dérivée de la séquence peptidique susmentionnée, notamment par substitution, suppression ou addition d'un ou plusieurs acides aminés, ladite séquence dérivée ayant de préférence une homologie d'environ 35 % à 100 % avec la séquence peptidique susmentionnée représentée sur la figure 7, * ou un fragment de la séquence peptidique susmentionnée, ou d'une séquence dérivée de cette dernière telle que définie ci-dessus, ledit fragment étant de préférence constitué d'au moins environ 5 acides aminés, - la séquence partielle en acides aminés représentée sur la figure 8 de la protéine TorA de Salmonella typhimurium, * ou une séquence dérivée de la séquence peptidique susmentionnée, notamment par substitution, suppression ou addition d'un ou plusieurs acides aminés, ladite séquence dérivée ayant de préférence une homologie d'environ 35% à 100% avec la séquence peptidique susmentionnée représentée sur la figure 8, * ou un fragment de la séquence peptidique susmentionnée, ou d'une séquence dérivée de cette dernière telle que définie ci-dessus, ledit fragment étant de préférence constitué d'au moins environ 5 acides aminés.