CN105525019B - 荧光定量pcr对鲐鱼中腐败微生物的检测法及所用引物 - Google Patents

荧光定量pcr对鲐鱼中腐败微生物的检测法及所用引物 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种荧光定量PCR技术对鲐鱼中腐败微生物的检测法及所用的特异性引物，本发明的检测法包括以下步骤：1)、作为待测样品的鲐鱼进行DNA的提取；2)、设计荧光定量PCR中的特异性引物，设置荧光定量PCR体系；3)、以基因组DNA为扩增模板，用上述特异性引物，进行荧光定量PCR扩增；从而检测鲐鱼中的腐败微生物。检测基因无特异性扩增曲线产生、Ct值≥35者，判定结果为阴性，即样品中未检出该基因所对应的微生物；Ct值小于35者，可判定该样品结果为阳性，即样品中能检出该基因所对应的微生物。

Description

荧光定量PCR对鲐鱼中腐败微生物的检测法及所用引物
技术领域
本发明涉及一种适用于鲐鱼贮藏过程中腐败微生物的荧光定量PCR检测方法。
背景技术
鲐鱼(Pneumatophorus japonicus)，鲈形目，鲭科，鲐属。又名：青花鱼，在我国各海域均有生产，以东海产量为多。继大小黄鱼、墨鱼、带鱼资源锐减以后，鲐鱼因其分布广、生长快、产量高已成我国近年主要经济鱼类之一。鲐鱼含有丰富的蛋白质和脂肪等多种营养，鲜食时味美，加工出来的咸品和干品也相当可口。但是食后发生过敏性食物中毒者却屡见不鲜，尤其是食用鲜度较差的鲜鱼，则更易发生中毒。对于食用鲐鱼引起的中毒问题，国内外的学者曾进行过较长时间的研讨，大多数认为：引起中毒的原因是鲐鱼含有的组胺所致。当鱼体变质或鲜度较差时，细菌大量繁殖，可使鱼体内组胺酸脱羧基而形成组胺。在鲐鱼的贮藏过程中，常见的腐败相关微生物有希瓦氏菌、弧菌、李斯特菌等。
如何经济有效地延长鲐鱼的货架期，从而扩大销售半径，是目前鲐鱼冷藏、贮藏产业链面临的一个主要问题。国内外对冷藏鱼类货架期研究表明，新鲜鱼类货架期受鱼种类、大小、生理状况及贮藏条件等多种因素影响，冷藏期间不同种类的鱼品质变化规律不同，货架期也有很大差异。若能正确处理原料鱼，采用冰藏及冷却链流通可以有效延长货架期。
目前，鲐鱼腐败菌的检测常采用微生物平板计数法：分离，提纯菌种，再进行菌落生理生化鉴定是一个比较繁琐的过程，存在检测周期长，工作量大的缺点，不能适应快速检测的需求。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种荧光定量PCR技术对鲐鱼中腐败微生物的检测法及所用的特异性引物，采用本发明的方法可轻易判断鲐鱼的新鲜度。
为了解决上述技术问题，本发明提供荧光定量PCR技术对鲐鱼中腐败微生物的检测法中所用的特异性引物，该特异性引物由以下至少任意一种组成：
表1
上述序列(hdc基因)：D＝G/A/T，Y＝C/T，M＝A/C，H＝A/T/C，R＝A/G。
本发明还同时提供了一种荧光定量PCR技术对鲐鱼中腐败微生物的检测法，依次进行以下步骤：
1)、作为待测样品的鲐鱼进行DNA的提取；
2)、设计荧光定量PCR中的特异性引物，设置(优化)荧光定量PCR体系；
3)、以基因组DNA(步骤1)所得DNA)为扩增模板，用上述特异性引物，进行荧光定量PCR扩增；从而检测鲐鱼中的腐败微生物。
作为本发明的荧光定量PCR技术对鲐鱼中腐败微生物的检测法的改进：所述特异性引物如上表1所述。
作为本发明的荧光定量PCR技术对鲐鱼中腐败微生物的检测法的进一步改进：
所述步骤2)荧光定量PCR扩增体系为：20μL总体积中含有SYBER Green Ex Taq(2×)10μL，上下游引物(10μM)各0.4μL，DNA模板(浓度为1.287×104μg/μL～1.200×108μg/μL)1.0μL，补水至20μL。
备注说明：上述上下游引物如表1所述。
作为本发明的荧光定量PCR技术对鲐鱼中腐败微生物的检测法的进一步改进：
所述步骤2)荧光定量PCR反应程序：
95℃预变性30sec；95℃变性5sec，60℃退火并延伸31sec，40个循环，在每个循环的60℃退火并延伸阶段收集荧光信号。
作为本发明的荧光定量PCR技术对鲐鱼中腐败微生物的检测法的进一步改进：根据荧光定量PCR反应中的特异性扩增曲线与对应的阈值进行判断；
检测基因无特异性扩增曲线产生且Ct值≥35者，判定结果为阴性，即样品中未检出该基因所对应的微生物；Ct值小于35者，可判定该样品结果为阳性，即样品中能检出该基因所对应的微生物。
作为本发明的荧光定量PCR技术对鲐鱼中腐败微生物的检测法的进一步改进：
当hdc、tora、tlh、inlA这4种基因的ct均大于27.5(一般为27.5<Ct<35)，判定该鲐鱼属于新鲜(即，处于高品质期)；
当任一基因的Ct≤27.5时，判定该鲐鱼已变质(即鲐鱼已经不新鲜，品质已经严重变化)。
作为本发明的荧光定量PCR技术对鲐鱼中腐败微生物的检测法的进一步改进：
步骤1)中，DNA的提取采用Axygen基因组DNA小量提取试剂盒。
在本发明中，鲐鱼样品菌液采用Axygen基因组DNA小量提取试剂盒。DNA浓度及纯度通过ND-2000C核酸蛋白分析仪检测。
本发明使用荧光定量PCR技术，利用该技术灵敏准确的特性，分别检测鲐鱼样品(或者贮藏过程中的鲐鱼样品)产组胺菌的hdc基因、希瓦式氏菌的tora基因、弧菌的tlh基因和李斯特菌的inlA基因，并制作标准曲线，通过计算其拷贝数来定量检测产组胺菌、希瓦氏菌、弧菌和李斯特菌在鲐鱼贮藏过程中的生长模型，旨在为检测鲐鱼新鲜度提供参考。
本发明的技术方案为：
1)、分别在4℃、15℃和25℃温度条件下贮藏鲐鱼样品并进行鲐鱼样品鲜度实验、平板微生物计数和微生物基因组DNA的提取；
2)、荧光定量PCR中扩增引物(特异性引物)的设计(如表1所述)，荧光定量PCR体系的优化；
3)、普通PCR扩增hdc、tora、tlh和inlA基因，PCR产物构建质粒，测序并验证；
4)、以质粒作为标准品，制作各检测基因的荧光定量PCR标准曲线；
5)、利用所建立的荧光定量PCR体系，检测鲐鱼样品中腐败微生物。并将荧光PCR的结果与鲜度评定及平板微生物计数相结合，推算鲐鱼的新鲜度。
具体如下：
步骤1)所述的分别在4℃、15℃和25℃温度条件下贮藏鲐鱼样品并进行鲐鱼样品鲜度实验、平板微生物计数和微生物基因组DNA的提取的方法为：将待测的鲐鱼样品先采用GB/T18108-2008的方法取样后分三组贮藏，分别放置于高精度低温培养箱中控制温度(4±0.1)℃、(15±0.1)℃和(25±0.1)℃贮藏(4℃是冰鲜贮藏温度，15℃是常温贮藏温度，25℃是高温贮藏温度)。由5名评价员组成鲜度评定小组，根据鲐鱼鲜度评价表，以鱼体表、气味、鳃、肌肉、肉味为主要评价指标进行进行鲜度评定。根据鲜度小组的评定结果，分别在贮藏在(4±0.1)℃、(15±0.1)℃和(25±0.1)℃条件下的鲐鱼样品贮藏48h、12h和6h后，在无菌条件下取鲐鱼背部肌肉10g置于90mL生理盐水中，摇匀后静置5分钟，根据GB/4789.2-2010取样品悬浊液，在铁琼脂培养基进行平板微生物计数。另取500μL样品悬浊液接种到5mL的液体肉汤培养基中，30℃、150r/min摇床培养微生物菌液3h。培养的菌液根据细菌基因组DNA提取试剂盒(康宁生命科学(吴江)有限公司)步骤提取基因组DNA。
步骤2)所述的荧光定量PCR中扩增引物的设计，荧光定量PCR体系的优化方法为：根据相关的文献与报道及NCBI数据库中这4种基因的序列信息，经DNAstar软件的MegAlign功能比对，筛选出合理的目的片段基因后导入Primer premier 5.0进行上述4种基因特异性引物的设计。以上设计的引物和探针序列均委托Sangon Biotech(上海，中国)公司合成。
所述的4种基因的特异性引物如表1所述。
SYBER Green I嵌合荧光染料反应体系：总体积20μL，SYBER Green Ex Taq(2×)10μL，正向引物0.4μL，反向引物0.4μL，ddH208.2μL，DNA 1μL。
荧光定量PCR扩增反应条件：95℃30s，然后95℃5s，60℃31s，40个循环。在每个循环的60℃退火并延伸阶段收集荧光信号。
步骤3)所述的普通PCR扩增，PCR产物构建质粒，测序并验证hdc、tora、tlh和inla基因方法为：采用试剂盒提取30℃、150r/min摇床培养3小时的细菌DNA，并将其作为模板，利用荧光定量PCR引物，进行普通PCR扩增：总体系50μL，ddH2O 37.5μL，10×Buffer缓冲液5μL，dNTP(浓度为2.5mM)4μL，正向引物(浓度为10μM)1.0μL，反向引物(浓度为10μM)1.0μL，rTaq(浓度为5U/μL)0.5μL，DNA模板(浓度为1.287×104μg/μL–1.200×108μg/μL)1.0μL。
PCR反应扩增条件：预变性94℃、5min；变性94℃、5s，退火55℃、30s，延伸72℃、30s，35个循环；最后72℃延伸10min。
上述普通PCR扩增所用的引物如表1所述。用于测序验证这四种引物是否是扩增产组胺菌的hdc基因、希瓦式氏菌的tora基因、弧菌的tlh基因和李斯特菌的inlA基因这4种基因。
PCR产物利用1.8％琼脂糖凝胶电泳检测后进行清洁纯化，再与PGM-T载体相连，并导入JM-109感受态细胞中，37℃培养过夜，每个基因片段挑取3-4个白色单菌落，提取质粒并委托Sangon Biotech(上海，中国)公司进行测序。测序结果在NCBI中进行比对，确认是hdc、tora、tlh和inlA基因。
步骤4)所述以质粒作为标准品，制作各检测基因的荧光定量PCR标准曲线方法为：经确认的重组质粒通过ND-2000C核酸蛋白分析仪检测，根据OD260值计算其拷贝数(copies/mL)：
注：扩增碱基数即PCR扩增产物的长度。
根据该计算公式，得出4种基因的质粒拷贝数分别为hdc基因1.287×1012(copies/mL)、tora基因1.844×1013(copies/mL)、tlh基因1.027×1013(copies/mL)、inlA基因8.373×1012(copies/mL)。将上述四种标准品分别稀释10-3-10-108个梯度，作为荧光定量PCR的模板，构建这4种基因的标准曲线(以DNA稀释梯度的对数作为横坐标，以荧光PCR的Ct值作为纵坐标)。并根据检测样品的荧光定量PCR扩增曲线得到其Ct值，再根据标准曲线计算得到4℃、15℃、25℃条件下培养菌液中的hdc基因、tora基因、tlh基因和inlA基因的拷贝数。
步骤5)所述利用所建立的荧光定量PCR体系，检测鲐鱼样品中腐败微生物。并将荧光PCR的检测结果与鲜度评定及平板微生物计数(作为验证试验)相结合，推算鲐鱼的新鲜度的方法为：根据检测样品的荧光定量PCR扩增曲线得到其Ct值，再根据标准曲线计算得到4℃、15℃、25℃条件下培养菌液中的hdc基因、tora基因、tlh基因和inlA基因的拷贝数(图2)，得到上述4种基因在鲐鱼样品贮藏过程中的拷贝数变化，并由此推算腐败微生物的生长模型。结合感官鲜度评定和平板微生物计数结果，评定4℃、15℃和25℃贮藏条件下鲐鱼高品质的货架期分别为144h、24h和12h。并且根据4种基因的标准曲线，计算得到在鲐鱼货架期终点时，hdc基因Ct值为24.2，对应拷贝数的对数值为4.9lg(cfu/g)，tora基因Ct值为25.7，对应拷贝数的对数值为5.0lg(cfu/g)；tlh基因Ct值为27.2，对应拷贝数的对数值为3.2lg(cfu/g)；inlA基因Ct值为27.5，对应拷贝数的对数值为3.0lg(cfu/g)。
因此，样本中检测基因无扩增曲线产生或Ct值≥35者，判定结果为阴性，可直接报告未检出；Ct值小于35者，可判定鲐鱼样品中该检测基因结果为阳性。进一步分析，4种基因ct均大于27.5(27.5<Ct<35)，证明鲐鱼样品处于高品质期；当任一基因的Ct≤27.5时，证明鲐鱼品质已经严重变化，鲐鱼已经不新鲜。
本发明具有良好的特异性、准确性和灵敏度，操作简便，且检测时间短。本发明为鲐鱼贮藏过程中腐败微生物的荧光定量PCR检测提供了有效方法。
综上所述，选择产组胺菌脱羧酶(histidine decarboxylase,hdc)基因、希瓦式氏菌氧化三甲胺还原酶(trimethylamine oxide reductase,tora)基因、弧菌不耐热溶血素(thermolab ile hemolysin，tlh)基因和李斯特氏菌内化素A(Internalin A,inlA)作为检测的目标基因，针对这4种基因设计荧光定量PCR引物，并制作标准曲线，通过计算其拷贝数来定量检测产组胺菌、希瓦氏菌、弧菌和李斯特菌在鲐鱼贮藏过程中的生长模型，旨在为鲐鱼冷链保鲜提供参考。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
图1为hdc基因、tora基因、tlh基因和inlA基因的荧光PCR扩增结果。
图1.a，hdc基因标准曲线扩增结果，即，以hdc基因的质粒标准品(即，hdc基因的质粒标准品浓度梯度的若干重复)为阳性对照；以灭菌蒸馏水为模板的空白对照。
图1.b，tora基因标准曲线扩增结果，即，以tora基因的质粒标准品为阳性对照；以灭菌蒸馏水为模板的空白对照。
图1.c，tlh基因标准曲线扩增结果，即，以tlh基因的质粒标准品为阳性对照；以灭菌蒸馏水为模板的空白对照。
图1.d，inlA基因标准曲线扩增结果，即，以inlA基因的质粒标准品为阳性对照；以灭菌蒸馏水为模板的空白对照。
图1.a-d：qPCR扩增体系为：SYBR Premix EX Taq(2×)10μL，正向特异性引物(10μM)0.4μL，反向特异性引物(10μM)0.4μL，补无菌ddH2O至20μL；基因组DNA模板1μL。实时荧光PCR反应程序：95℃预变性30s；95℃变性5s，60℃退火并延伸31s，40个循环。在每个循环的60℃退火并延伸阶段收集荧光信号。
图2为hdc基因、tora基因、tlh基因和inlA基因的标准曲线。
所做的4种基因的标准曲线根据横坐标为DNA稀释梯度的对数，纵坐标为荧光PCR的Ct值。并且每个点数值由三个平行试验Ct值计算得到的平均值，每个点的标准差误差计算来自三个平行实验数据。hdc：Y＝-4.3452X-4.4564 R2＝0.9980；tora：Y＝-3.2061X-1.4007 R2＝0.9962；tlh：Y＝-3.3357X-4.7138 R2＝0.9968；inlA：Y＝-3.5471X-0.8310 R2＝0.9940。证明了上述4种基因的稀释梯度的对数值与平均Ct值具有较强的线性相关性。
图3为荧光定量PCR对4种基因的特异性检测图谱；
图3.a，hdc基因特异性检测图谱，即，以hdc基因的样品为阳性对照；以灭菌蒸馏水为模板的空白对照。
图3.b，tora基因特异性检测图谱，即，以tora基因的样品为阳性对照；以灭菌蒸馏水为模板的空白对照。
图3.c，tlh基因特异性检测图谱，即，以tlh基因的样品为阳性对照；以灭菌蒸馏水为模板的空白对照。
图3.d，inlA基因特异性检测图谱，以inlA基因的样品为阳性对照；以灭菌蒸馏水为模板的空白对照。
具体如下：
鲐鱼样品在4℃、15℃和25℃温度条件下分别贮藏48h、12h和6h后取样，将稀释10倍菌液500μL，接种于5ml的微生物液体培养基中，30℃，150r摇床培养3个小时，根据细菌基因组DNA提取试剂盒步骤提取DNA作为qPCR模板，进行qPCR扩增。扩增结束后由扩增曲线得到Ct值，再根据对应基因的标准曲线计算得到产组胺菌的hdc基因、希瓦式氏菌的tora基因、弧菌的tlh基因和李斯特菌的inlA基因的拷贝数。
SYBER Green I嵌合荧光染料反应体系：总体积20μL，SYBER Green Ex Taq(2×)10μl,正向引物0.4μL，反向引物0.4μL，ddH2O 8.2μL，DNA 1μL。
荧光定量PCR扩增反应条件：95℃30s，然后95℃5s，60℃31s，40个循环。得到hdc基因、tora基因、tlh基因和inlA基因的qPCR特异性检测图谱如图3(a、b、c、d)所示。
以图3(a)为例，qPCR的扩增体系为实时荧光PCR反应(荧光染料)20μL体系：SYBRPremix EX Taq(2×)10μL，正向引物(10μM)0.4μL，反向引物(10μM)0.4μL，补无菌ddH2O至20μL；基因组DNA模板1μL。实时荧光PCR反应程序：95℃预变性30s；95℃变性5s，60℃退火并延伸31s，40个循环。
图3(a、b、c、d)所示的4种基因的特异性扩增图谱中，当Ct值<35时，说明样品均能有效的扩增；当Ct值>35时，说明样品所含4种基因的浓度太低不能有效扩增或者扩增结果特异性不强。空白对照的无扩增结果说明了实验组中加入的无菌ddH2O无DNA模板影响。
上述每幅图中，每个样品的qPCR扩增均设置了3个重复。
具体实施方式
实施例1、采用上述荧光定量PCR检测方法对鲐鱼进行新鲜度鉴定，依次进行以下步骤：
1)、先采用GB/T18108-2008的取样方法选取鲐鱼背部鱼肉10g在无菌条件下置于90mL的生理盐水中，摇匀后静置5分钟，得样品悬浊液。
然后取500μL样品悬浊液接种到5mL的液体培养基(液体肉汤培养基)中，30℃、150r/min摇床培养微生物菌液3h，采用Axygen基因组DNA小量提取试剂盒提取样品DNA，作为荧光定量PCR的模板。
2)、以基因组DNA为扩增模板，进行荧光定量PCR检测；即，利用荧光定量PCR技术对其进行hdc、tora、tlh和inlA四种基因的检测。
荧光定量PCR扩增体系为：20μL总体积中含有SYBER Green Ex Taq(2×)10μL，上下游引物(10μM)各0.4μL，DNA模板1.0μL，补水至20μL。
上下游引物如表1所述。
荧光定量PCR反应程序：
95℃预变性30sec；95℃变性5sec，60℃退火并延伸31sec，40个循环，在每个循环的60℃退火并延伸阶段收集荧光信号。
3)、根据荧光定量PCR反应中的特异性扩增曲线与对应的阈值进行判断：
检测基因无特异性扩增曲线产生且Ct值≥35者，判定结果为阴性，即样品中未检出该基因所对应的微生物；Ct值小于35者，可判定该样品结果为阳性，即样品中能检出该基因所对应的微生物。
具体而言：
当hdc、tora、tlh、inlA这4种基因的ct均大于27.5(27.5<Ct<35)，判定该鲐鱼属于新鲜(即，处于高品质期)
当任一基因的Ct≤27.5时，判定该鲐鱼已变质(即鲐鱼已经不新鲜，品质已经严重变化)。
实验1、对海鲜市场上随机购买的10个批次的鲐鱼采用实施例1所述方法进行检测，所得结果为表2所示。
验证实验1、对实验1中的10个批次的鲐鱼采用常规的微生物平板计数法进行检测，选取鲐鱼背部鱼肉10g在无菌条件下置于90mL生理盐水中，摇匀后静置5分钟，根据GB/4789.2-2010取样品悬浊液进行平板微生物计数，结果如表2所示。当平板计数结果对数值>5.0lg(cfu/g)时，表明鲐鱼品质已经开始变化，证明鲐鱼已经不新鲜了。
表2
实验2、随机选取海关进出口的8个批次的鲐鱼采用实施例1所述方法进行检测，所得结果如表3所述。
验证实验2、依据验证实验1所述方法，对实验2中的8个批次的鲐鱼采用微生物平板计数法进行检测，所得结果如表3所述。
表3
对比例1、将实施例1中的引物改成如下表4；其余等同于实施例1。
表4
将完全同实验1的10个批次鲐鱼采用对比例1所述方法进行检测，所得结果为：产组胺菌的hdc基因、希瓦式氏菌的tora基因、弧菌的tlh基因和李斯特菌的inlA基因的荧光PCR检测过程中并未有明显的扩增现象，证明上述4种基因的引物虽然与本发明引物相近，但并没有相应的特异性扩增的能力。具体如表5所述。
表5
样品 商品名称 荧光PCR检测检测结果
1 鲐鱼样品1 荧光PCR检测过程中并未出现特异性扩增结果。
2 鲐鱼样品2 荧光PCR检测过程中并未出现特异性扩增结果。
3 鲐鱼样品3 荧光PCR检测过程中并未出现特异性扩增结果。
4 鲐鱼样品4 荧光PCR检测过程中并未出现特异性扩增结果。
5 鲐鱼样品5 荧光PCR检测过程中并未出现特异性扩增结果。
6 鲐鱼样品6 荧光PCR检测过程中并未出现特异性扩增结果。
7 鲐鱼样品7 荧光PCR检测过程中并未出现特异性扩增结果。
8 鲐鱼样品8 荧光PCR检测过程中并未出现特异性扩增结果。
9 鲐鱼样品9 荧光PCR检测过程中并未出现特异性扩增结果。
10 鲐鱼样品10 荧光PCR检测过程中并未出现特异性扩增结果。
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims (4)

1.利用特异性引物进行的荧光定量PCR技术对鲐鱼中腐败微生物的非诊断检测法，其特征是包括以下步骤：
1)、作为待测样品的鲐鱼进行DNA的提取；
2)、利用荧光定量PCR中的特异性引物，设置荧光定量PCR体系；
特异性引物由以下四种组成：
3)、以基因组DNA为扩增模板，用上述特异性引物，进行荧光定量PCR扩增；从而检测鲐鱼中的腐败微生物：
根据荧光定量PCR反应中的特异性扩增曲线与对应的阈值进行判断；
检测基因无特异性扩增曲线产生、Ct值≥35者，判定结果为阴性，即样品中未检出该基因所对应的微生物；Ct值小于35者，可判定该样品结果为阳性，即样品中能检出该基因所对应的微生物；
当hdc、tora、tlh、inlA这4种基因的ct均大于27.5，判定该鲐鱼属于新鲜；
当任一基因的Ct≤27.5时，判定该鲐鱼已变质。
2.根据权利要求1所述的荧光定量PCR技术对鲐鱼中腐败微生物的非诊断检测法，其特征是：
所述荧光定量PCR扩增体系为：20μL总体积中含有SYBER Green Ex Taq(2×)10μL，上下游引物各0.4μL，DNA模板1.0μL，补水至20μL。
3.根据权利要求2所述的荧光定量PCR技术对鲐鱼中腐败微生物的非诊断检测法，其特征是荧光定量PCR反应程序：
95℃预变性30sec；95℃变性5sec，60℃退火并延伸31sec，40个循环，在每个循环的60℃退火并延伸阶段收集荧光信号。
4.根据权利要求1所述的荧光定量PCR技术对鲐鱼中腐败微生物的非诊断检测法，其特征是：
步骤1)中，DNA的提取采用Axygen基因组DNA小量提取试剂盒。
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