FR2826022A1

FR2826022A1 - Procede de determination de l'existence de melanges d'especes d'origines animales ou vegetales dans des substrats organiques

Info

Publication number: FR2826022A1
Application number: FR0107736A
Authority: FR
Inventors: Gousse Carole Donne; Vincent Laudet; Catherine Hanni
Original assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Current assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Priority date: 2001-06-13
Filing date: 2001-06-13
Publication date: 2002-12-20
Anticipated expiration: 2021-06-13
Also published as: WO2002101090A2; US20050014143A1; WO2002101090A3; EP1430148A2; FR2826022B1

Abstract

L'invention est relative à l'utilisation d'un procédé de clonage pour la détermination de l'existence et l'identification d'un mélange d'origine organique contenant de l'ADN de différentes espèces animales et/ ou différentes espèces végétales et/ ou différents individus humains.

Description

PROCEDE DE DETERMINATION DE L'EXISTENCE DE MELANGES D'ORIGINES ANIMALES OU VEGETALES DANS DES SUBSTRATS ORGANIQUES
L'invention est relative à un procédé de détermination de l'existence de mélanges d'origines animales ou végétales dans des substrats organiques.

Plus particulièrement, l'invention est relative à un procédé de détermination de l'existence de mélanges d'espèces, populations ou races d'origines animales ou végétales ou d'individus humains dans des substrats organiques.

De nombreux domaines font actuellement appel au procédé d'amplification (Polymerase Chain Reaction : PCR) en biologie moléculaire pour détecter et identifier des espèces. En effet, cette technique est couramment utilisée par les laboratoires de biologies moléculaires, les laboratoires de contrôles vétérinaires, les laboratoires d'analyse microbiologique alimentaire, environnemental, pharmaceutiques, les laboratoires réalisant des empreintes génétiques... Toutefois, lorsque plusieurs espèces, ou populations, ou races ou individus sont présents dans un même échantillon, il n'existe aucune technique connue sur le marché qui permette d'une part, de déterminer si on est ou non en présence d'un mélange et d'autre part, de détecter les espèces, populations, races ou individus présents dans ce mélange à moins d'avoir des amorces spécifiques de toutes les espèces populations, races ou individus susceptibles d'être présents dans le mélange. En effet, il arrive très fréquemment que les échantillons analysés ne soient pas composés à partir d'une seule espèce, populations ou races. Par exemple, les préparations alimentaires peuvent être préparées à partir de plusieurs espèces, populations ou races (plats cuisinés, soupe, pâtés, terrine,...). Ce mélange peut être spécifié par le fabricant, mais peut aussi être une adultération. En effet, il peut arriver que ce mélange soit en faveur d'une espèce de'valeur économique moindre par rapport à une autre espèce qui aurait dû se trouver de manière unique dans la préparation (exemple : brandade de morue préparée avec un peu de morue commune (Gadus morhua) et beaucoup de morue du Pacifique (Gadus macrocephalus) moins chère.

Devant l'inexistence de système adéquat de détection et d'identification de mélanges d'espèces, populations ou races animales et végétales dans des substrats organiques, le

demandeur s'est attaché à développer une méthode sensible et fiable permettant de pallier cette absence.

L'invention a pour but de fournir un procédé permettant de déterminer l'existence de mélanges d'ADN de différentes espèces, populations ou races animales et/ou végétales et/ou de différents individus humains.

L'invention a également pour but de fournir un procédé permettant de détecter et/ou d'identifier l'ADN de différentes espèces populations ou races animales et/ou végétales et/ou de différents individus humains.

Dans sa forme la plus générale, l'invention est relative à l'utilisation d'un procédé de clonage pour la détermination de l'existence d'un mélange d'origine organique contenant de l'ADN de différentes espèces, populations ou races animales et/ou différentes espèces, populations ou races végétales et/ou différents individus humains.

Le procédé selon l'invention de détection d'un mélange de plusieurs espèces est simple et exhaustif.

La détermination de l'existence du mélange d'espèces s'effectue par un procédé de clonage. Ce procédé de clonage est utilisé couramment en biologie moléculaire pour l'obtention d'une série de molécules identiques (acides nucléiques) ou de cellules isolées, d'êtres unicellulaires (ex : bactérie) et d'êtres pluricellulaires (ex : mammifère). Le clonage a permis en outre de comprendre le rôle et le fonctionnement de nombreux gènes de par leur manipulation soit pour les produire en grand nombre soit en les transférant d'un organisme à un autre.

L'expression ADN de différentes espèces, populations ou races animales et/ou différentes espèces, populations ou races végétales , désigne l'ADN spécifique de chacune des espèces, populations ou races animales, et/ou végétales présentes dans le mélange.

Cet ADN représente n'importe quelle séquence nucléotidique provenant du génome nucléaire, mitochondrial ou chloroplastique permettant de faire la distinction de manière fiable entre les différentes espèces ou populations ou races étudiées ou les différents individus étudiés. Une espèce est définie comme un groupe d'organismes vivants génétiquement séparés des autres organismes vivants et capables de se reproduire uniquement entre eux.

Une population est un groupe d'individus d'une espèce qui peuvent être reconnus des autres individus de l'espèce par des caractéristiques morphologiques et/ou génétiques précises.

Une espèce comporte donc souvent plusieurs populations distinctes. Une race est un groupe d'individus d'une espèce domestique qui ont été obtenus suite à une longue sélection pour améliorer un trait précis (comme la production de lait pour les vaches, ou la qualité de la

viande pour le porc) et qui peuvent être reconnus des autres individus de cette espèce domestique par des caractéristiques morphologiques ou génétiques précises.

L'expression ADN de différents individus humains , désigne toute séquence d'ADN mitochondrial ou nucléaire d'origine humaine permettant de faire la distinction entre deux individus. On estime que, pour permettre une distinction fiable, une séquence doit comporter au minimum 1 différence par 100 nucléotides.

1
Par mélange d'origine organique , on désigne un mélange contenant l'ADN de différentes espèces, populations ou races provenant de tissus issus d'êtres vivants, animaux ou végétaux. On entend par matière organique toute matière solide ou liquide que l'on suppose avoir au moins partiellement une origine organique
Selon un mode de réalisation avantageux, l'invention est relative à l'utilisation d'un procédé de clonage, pour la détection et/ou l'identification de l'ADN de chacune des différentes espèces, populations ou races animales et/ou de chacune des différentes espèces, populations ou races végétales et/ou de chacun des différents individus humains présent dans un mélange d'origine organique contenant de l'ADN d'espèces animales et/ou d'espèces végétales et/ou d'individus humains.

Par détection de l'ADN de chacune des espèces, populations ou races ou de chacun des individus humains , on désigne le fait de repérer la présence d'ADN spécifique de chacune des espèces ou populations ou races ou individus de façon à pouvoir apprécier la complexité du mélange initial et à pouvoir identifier, dans un second temps les différents composés de ce mélange.

Par identification de l'ADN de chacune des différentes espèces populations, races ou de chacun des individus , on désigne le fait, lorsque la présence d'espèces, a été détectée par la présence de leur ADN spécifique, d'analyser les ADN de chacune des espèces ou populations ou races ou individus de façon à en déduire la composition du mélange initial.

Selon un mode de réalisation avantageux de l'invention l'utilisation du procédé de clonage est telle que chaque espèce, population ou race animale et/ou chaque espèce, population ou race végétale et/ou chaque individu humain est représenté (e) par au moins une séquence d'ADN ou au moins un fragment d'ADN, et notamment par une séquence unique

d'ADN ou un fragment unique d'ADN, chacune desdites séquences d'ADN ou chacun desdits fragments d'ADN provenant de l'ADN extrait du mélange d'origine organique.

Dans ce qui précède et dans ce qui suit, l'expression au moins une séquence ou un fragment d'ADN signifie soit qu'il y a plusieurs copies du même fragment ou de la même séquence d'ADN, soit qu'il y a plusieurs copies de différents fragments ou de différentes séquences d'ADN.

Selon un mode de réalisation avantageux de l'invention, l'utilisation du procédé de clonage a lieu pour la détection et/ou l'identification de l'ADN de chacune des différentes espèces animales présent dans un mélange d'espèces animales, et notamment de l'ADN de chacune des sous-espèces, lignées, races, variétés, souches et/ou populations présent dans ledit mélange, chacune desdites espèces animales, et notamment chacune desdites sousespèces, races, variétés et/ou souches étant représentée par au moins une séquence d'ADN ou au moins un fragment d'ADN, et notamment par une séquence unique d'ADN ou un fragment unique d'ADN.

Par espèces, sous-espèces, lignées, races, variétés, souches et populations animales , on désigne des groupes ou des ensembles d'animaux issus d'une même espèce qui se

ressemblent entre eux sur certains critères. Sous-espèces, populations peuvent etre considérés comme synonyme. Une sous-espèce est une population particulièrement repérable à qui une désignation latine spécifique a été attribuée. Par exemple Otus megalotis everetti et Otus megalotis nigrorum sont deux sous-espèces distinctes de l'espèce Otus megalotis, un oiseau rapace. Les termes races, variétés et souches sont principalement utilisés pour désigner les animaux domestiques et peuvent être considérés comme synonymes.

Selon un autre mode de réalisation avantageux de l'invention, l'utilisation du procédé de clonage a lieu pour la détection et/ou l'identification de l'ADN de chacune des différentes espèces végétales présent dans un mélange d'espèces végétales, et notamment de l'ADN de chacune des sous-espèces, lignées, races, variétés, souches, cépages et/ou populations présent dans ledit mélange, chacune desdites espèces végétales, et notamment chacune desdites sousespèces, races, variétés et/ou souches étant représentée par au moins une séquence d'ADN ou au moins un fragment d'ADN, et notamment par une séquence unique d'ADN ou un fragment unique d'ADN.

Par espèces, sous-espèces, lignées, races, variété, souches, cépages, populations végétales , on désigne des groupes ou des ensembles de végétaux issus d'une même espèce qui se

ressemblent entre eux sur certains critères. Un cépage est le terme spécifiquement employé pour désigner une souche ou une race ou une variété de vigne du genre Vitis.

Selon un autre mode de réalisation avantageux de l'invention, l'utilisation du procédé de clonage a lieu pour la détection et/ou l'identification de l'ADN de chacun des différents individus humains présent dans un mélange d'ADN de différents individus humains, chacun desdits individus humains étant représenté par au moins une séquence d'ADN ou au moins un fragment d'ADN, et notamment par une séquence unique d'ADN ou un fragment unique d'ADN.

Par individus humains , on désigne l'un quelconque des membres de l'espèce Homo sapiens.

Dans un mode de réalisation avantageux de l'invention, l'ADN extrait du mélange d'origine organique est de l'ADN ancien (ou fossile), de l'ADN dégradé ou de l'ADN moderne.

Par ADN ancien , on désigne un ADN extrait d'un organisme après sa mort et ayant déjà subi un processus de dégradation. L'ADN ancien présente très fréquemment des signes de dégradation comme par exemple la présence de molécules d'ADN de petite taille, inférieur ou égal à environ 200 paires de bases
Par ADN dégradé , on désigne un ADN ayant subi des détériorations qui sont liées à des procédés de transformation. L'ADN dégradé se trouve généralement sous forme de petits fragments (inférieur ou égal à environ 200 pb) et en petite quantité.

Par ADN moderne , on désigne un ADN extrait d'un individu vivant ou extrait rapidement après sa mort. L'ADN moderne se caractérise par la présence de très grands fragments de plus de 20 000 paires de bases.

Dans un autre mode de réalisation avantageux de l'invention, l'ADN extrait du mélange d'origine organique est : - de l'ADN non dégradé provenant notamment d'un échantillon organique frais ou, - de l'ADN dégradé, provenant notamment d'un échantillon organique transformé, notamment cuit, lyophilisé, séché, saumuré, appertisé ou pasteurisé.

Par ADN non dégradé , on désigne un ADN n'ayant subi aucune détérioration et qui est donc intact. Si les conditions d'extraction ont été appropriées, un tel ADN est présent sous forme de molécules d'au moins 20 000 paires de bases.

Des exemples dans lesquels l'ADN se trouve sous forme dégradée sont : - aliments (cuit, lyophylisé, séché, saumuré, appertisé, pasteurisé,...) - engrais, farines, graines (broyé, séché, fermenté,...) - coquilles d'oeuf, ossements, dents, poils, cheveux, plumes, excréments (séchage, action du temps, de la température...) - alcools (alcoolisé, distillé, fermenté,...) - cuirs, peaux, fourrures, tissus momifiés (tanné, taxidermisé, coloré,...) - parchemins, papiers, bois (action du temps, procédé de transformation utilisé en papeterie,...) - ivoire, ambre (action du temps,...) - colles, pigments naturels (peintures), terres, sédiments (procédé de transformation utilisé dans ces domaines).

- cadavres et ossements humains ou animaux (action du temps ou de l'environnement)
Selon un autre mode de réalisation avantageux de l'invention, l'utilisation du procédé de clonage a lieu pour la détection et éventuellement l'identification de l'ADN de chacune des différentes espèces, populations ou races animales et/ou de chacune des différentes espèces, populations ou races végétales et/ou de chacun des différents individus humains présent dans le mélange d'origine organique, dans laquelle l'une au moins desdites espèces, populations ou races et/ou l'un au moins desdits individus est représenté (e) par une séquence d'ADN ancien

ou de l'ADN dégradé ou un fragment d'ADN ancien ou d'ADN dégradé.

1
Selon un autre mode de réalisation avantageux de l'invention, le procédé de clonage est précédé d'une étape d'amplification de chacune des séquences d'ADN ou de chacun des fragments d'ADN caractéristique de chacune des espèces, populations ou races animales et/ou de chacune des espèces, populations ou races végétales et/ou de chacun des individus humains que l'on cherche à détecter et/ou identifier, les séquences d'ADN ou les fragments d'ADN amplifié (e) s obtenu (e) s à l'issue du procédé d'amplification étant contenu (e) s dans un produit d'amplification unique.

L'analyse du génome au moyen de sondes nucléiques représente une approche efficace pour l'identification d'espèces, encore peu développée à l'heure actuelle. Les travaux menés sur l'ADN ancien (ou ADN fossile) depuis le début des années 1990 ont démontré que l'ADN

est une molécule très stable après la mort, malgré l'action du temps et de l'environnement (Brown and Brown., 1994, Bioessays 16 : 719-26). Toutefois, quand il subsiste dans des substrats anciens, cet ADN est très dégradé et présent en petites quantités, sous formes de molécules abîmées et chimiquement modifiées (Pääbo, 1989, Proc. Natl. Sci USA 86 : 1939- 1943). Ces caractéristiques sont dues essentiellement aux phénomènes d'hydrolyse et d'oxydation (Lindahl, 1993, Nature 362 : 709-715). Grâce à la technique de PCR (pour Polymerase Chain Reaction) qui constitue un outil d'une puissance analytique remarquable, il est possible de multiplier" vitro"de façon quasi exponentielle un fragment donné d'ADN.

En amplifiant de l'ADN d'une préparation alimentaire ou autre, qui a subi des modifications comme la cuisson, le fumage..., il sera possible d'identifier des constituants d'origine animale ou végétale. La PCR a ainsi été récemment utilisée pour la caractérisation de la viande de porc cuite (Meyer et al., 1994, Journal of the AOAC International 77 (3), 617-622), de mouton ou de chèvre (Chikuni et al., 1994, Meat Science 37 (3) 337-345). De même, l'amplification de séquences spécifiques du chromosome Y a permis de déterminer le sexe de carcasses de boucherie d'origine bovine et ovine (Apparao et al., 1995, Meat Science 39 (1), 123-126). L'analyse des séquences obtenues se fait par phylogénie moléculaire ce qui permet d'identifier différentes espèces (Wolf, 1999, J Agric Food Chem 47 : 1350-1355).

L'invention consiste en effet, en la détermination d'un mélange. Ceci peut se faire techniquement à différents niveaux. En premier lieu, par le séquençage direct du produit d'amplification, contenant le ou les fragments d'ADN, et en observant les e1ectrophorégrammes obtenus. L'illisibilité de la séquence peut être interprétée : - soit comme une dégradation de l'ADN si celui-ci est en trop mauvais état pour être analysé ou bien - soit comme un mélange d'au moins deux espèces si l'on observe une superposition de séquences au niveau des pics indéterminés représentés par la lettre N.

En deuxième lieu, la détermination d'un mélange peut se faire une fois que le produit d'amplification a été cloné. Si ce produit d'amplification ne contient qu'un seul fragment d'ADN, il n'y a qu'une seule espèce, on obtiendra alors en prélevant par exemple 10 colonies bactériennes, 10 séquences identiques. Par contre, si l'on est en présence d'un mélange d'espèce, on aura alors autant de séquences différentes que d'espèces présentes dans l'échantillon.

Selon un mode de réalisation de l'invention, dans laquelle chaque séquence d'ADN ou chaque fragment d'ADN amplifié (e) est d'origine nucléaire, mitochondriale ou chloroplastique.

Avantageusement, la séquence d'ADN est d'origine mitochondriale pour les animaux et les végétaux ou bien chloroplastique pour les végétaux. L'ADN mitochondrial (ADNmt) s'avère être la molécule la plus appropriée pour ce type d'analyse (Kocher et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 : 6196-6200). D'un point de vue technique, il est plus facile à

détecter que l'ADN génomique car il est présent de 100 à 1000 copies par cellule contre deux copies pour l'ADN nucléaire. Il peut donc être plus sûrement détecté dans des matières organiques dans lesquelles l'ADN est soumis à divers facteurs physiques (température, pression,...) chimiques ou biochimiques tendant à sa dégradation. De plus c'est un excellent marqueur d'espèce qui est souvent utilisé en phylogénie. En effet, selon l'espèce que l'on étudie, certaines régions de l'ADNmt permettent de différencier des espèces entre elles, d'autres ont un pouvoir de résolution plus fin et permettent de distinguer des populations différentes (races géographiques, sous-espèces voire des individus) : région de contrôle de la réplication de l'ADNmt, cytochrome b, cytochrome c oxydase ou ARN mitochondriaux (ARN 12S ou ARN 16S).

Selon un mode de réalisation avantageux de l'invention, chaque séquence d'ADN ou chaque fragment d'ADN amplifié (e) est d'origine nucléaire ou mitochondriale lorsque l'on cherche à détecter et/ou identifier un mélange contenant de l'ADN de différentes espèces animales et/ou différents individus humains, est d'origine nucléaire, mitochondriale ou chloroplastique lorsque l'on cherche à détecter et/ou identifier un mélange contenant de l'ADN de différentes espèces végétales.

L'invention concerne un procédé de détection et/ou d'identification de l'ADN de chacune des différentes espèces, populations ou races animales et/ou de chacune des différentes espèces, populations ou races végétales et/ou de chacun des différents individus humains présent dans un mélange d'origine organique, chacune desdites espèces, populations ou races animales et/ou chacune desdites espèces, populations ou races végétales et/ou chacun desdits individus humains étant représenté (e) par au moins une séquence d'ADN ou au moins un fragment d'ADN, notamment une séquence d'ADN unique ou un fragment d'ADN unique, chacune desdites séquences d'ADN ou chacun desdits fragments d'ADN provenant de l'ADN extrait dudit mélange, ledit procédé étant caractérisé en ce qu'il comporte les étapes suivantes : + amplification de chacune des séquences d'ADN ou de chacun des fragments d'ADN caractéristique de l'espèce, populations ou races animale, de l'espèce, populations ou races végétale ou de l'individu humain que l'on cherche à détecter et/ou identifier, notamment par la méthode d'amplification en chaîne par polymérase (PCR), afin d'obtenir un produit

d'amplification unique contenant les différents fragments d'ADN ou les différentes séquences d'ADN amplifié (e) s, + clonage du produit d'amplification obtenu à l'issue de l'étape d'amplification précédente, afin de séparer les différentes séquences d'ADN ou les différents fragments d'ADN présent (e) s dans le mélange d'origine organique, + séquençage de chacune des séquences d'ADN ou de chacun des fragments d'ADN ainsi séparés dudit mélange.

L'invention concerne également un procédé de détection et/ou d'identification tel que défini ci-dessus, dans lequel : + la méthode d'amplification en chaîne par polymérase (PCR) comprend une répétition du cycle des étapes suivantes : - chauffage de l'ADN extrait du mélange d'origine organique, de façon à séparer l'ADN en deux brins monocaténaires, - hybridation des brins d'ADN monocaténaires à une température adéquate avec les amorces oligonucléotidiques appropriées pour amplifier l'ADN des espèces, populations ou races animales, végétales ou des individus humains que l'on cherche à détecter et/ou identifier, - élongation desdites amorces oligonucléotidiques appropriées par une polymérase à une température adéquate, pour obtenir un produit d'amplification unique contenant chacune desdites séquences d'ADN ou chacun desdits fragments d'ADN caractéristique d'une espèce, population ou race animale ou végétale déterminée, ou d'un individu humain, . le clonage du produit d'amplification obtenu à l'issue de l'étape d'amplification précédente comprenant les étapes suivantes : - insertion, à l'aide d'une enzyme ADN ligase, dudit produit d'amplification unique contenant les différentes séquences d'ADN ou les différents fragments d'ADN amplifié (e) s caractéristiques de l'ADN de l'espèce, population ou race animale, de l'espèce, population ou race végétale ou de l'individu humain que l'on cherche à détecter et/ou identifier, dans un plasmide préalablement linéarisé, afin d'obtenir plusieurs plasmides contenant chacun une séquence unique d'ADN ou un fragment unique d'ADN amplifié (e), - incorporation de chaque plasmide obtenu à l'étape précédente, respectivement dans une bactérie, notamment Escherichia coli (E. coli), - multiplication de chacune des bactéries obtenues à l'étape précédente, par mise en culture desdites bactéries dans un milieu approprié, en présence d'un antibiotique, notamment

l'ampicilline, afin de sélectionner les bactéries ayant incorporées un plasmide dans lequel s'est inséré un fragment d'ADN ou une séquence d'ADN, - séparation de chacun des plasmides contenant une séquence unique d'ADN ou un fragment unique d'ADN, de chacune des bactéries contenant lesdits plasmides, afin de

récupérer l'ensemble des plasmides ou ADN plasmidiques ainsi multipliés, lesdits plasmides contenant chacun une séquence unique d'ADN ou un fragment unique d'ADN, - prélèvement d'un nombre suffisant de plasmides (ou ADN plasmidique ) parmi l'ensemble des plasmides (ou ADN plasmidiques ) obtenus à l'issue de l'étape précédente, afin de détecter et/ou d'identifier au moins deux fragments d'ADN ou séquences d'ADN différent (e) s, chacun (e) desdit (e) s séquences d'ADN ou fragments d'ADN étant caractéristique d'une espèce, population ou race animale ou végétale déterminée, ou d'un individu humain.

On entend par produit d'amplification dans ce qui précède et ce qui suit, le ou les fragments d'ADN ou la ou les séquences d'ADN amplifié (e) s obtenu (e) s à l'issue de la réaction de polymérisation en chaîne (PCR). Le produit d'amplification contient plusieurs copies de différents fragments ou de différentes séquences d'ADN amplifié (e) s lorsque l'échantillon de matière organique à analyser comporte un mélange de différents fragments d'ADN provenant de différentes espèces, populations ou races animales ou végétales ou de différents individus humains.

Selon un mode de réalisation avantageux de l'invention, dans le procédé de détection et/ou d'identification, chacun des ADN plasmidiques obtenu à l'issue du clonage est identifié par séquençage, ce qui permet d'identifier l'ADN caractéristique de chacune des espèces, populations ou races animales et/ou chacune des espèces, populations ou races végétales et/ou chacun des individus humains présent dans le mélange d'origine organique.

Le procédé de clonage n'a jamais été décrit comme technique pour séparer des espèces, populations races ou individus présentes dans un mélange. Le clonage moléculaire est une technique de base de biologie moléculaire permettant de sélectionner une colonie de cellules contenant des séquences particulières d'ADN. Dans le cas présent, elle est utilisée pour séparer des fragments d'ADN. Ces fragments sont obtenus par une stratégie globale telle que définie ci-après. Le choix des amorces dépend de la question posée. En général, on recherche des espèces proches qui sont mélangées les unes aux autres mais de valeurs commerciales différentes. Ainsi, les amorces utilisées sont les plus larges possibles c'est-à-dire pouvant amplifier, un ordre, une famille ou un groupe d'espèce bien particulier. Le procédé d'extraction de l'ADN est identique à celui décrit en détail dans l'exemple 6 ci-après. C'est à

partir de l'amplification que le procédé de clonage est utilisé. On peut alors repartir du fragment d'amplification obtenu avec le couple d'amorce de la stratégie globale et le cloner. Mais dans la majorité des cas, la détection du mélange est demandée et on n'effectue donc pas de séquençage avant la phase de clonage.

Pour effectuer le clonage, on peut utiliser le kit de clonage d'Invitrogen"TOPO TA Cloning"dont le principe est le suivant. Les fragments d'ADN obtenus après amplification sont purifiés puis introduits dans un plasmide préalablement linéarisé par le fournisseur. Le plasmide est un ADN circulaire dont la réplication au sein d'une cellule s'effectue de manière indépendante de la réplication du génome de cette cellule. Une fois le fragment d'ADN introduit dans le plasmide grâce à l'enzyme ADN ligase, les plasmides sont introduits dans des bactéries comme Escherichia Coli (par un procédé appelé"transformation"qui fait intervenir un choc osmotique et un choc de température ou un choc électrique). Celles-ci sont alors reproduites et sélectionnées selon la technique du clonage. Les plasmides codent souvent pour une enzyme capable de dégrader ou d'altérer chimiquement une substance antibiotique, conférant aux bactéries dans lesquelles ils sont introduits une certaine résistance à un antibiotique (comme l'ampicilline). Cette résistance est utilisée en génie génétique pour sélectionner les bactéries contenant le plasmide, en présence d'antibiotique. Il est à noter que ces résistances aux antibiotiques sont présentes naturellement. Les cellules sont alors cultivées sur boîte en milieu nutritif pour la production de bactéries, de sorte que chaque cellule conduise, en se répliquant, à une colonie clonale. Habituellement, la culture se fait en présence d'un antibiotique dont les plasmides possèdent un gène de résistance, ce qui permet d'éliminer les clones n'ayant pas reçu de plasmide. Chaque colonie contient un seul type de plasmide. Un système visuel est utilisé pour repréer les bactéries ayant incorporées les plamisdes qui eux même ont incorposérs un fragment d'ADN. Sur la boîte de gélose pousse des colonies bleues et d'autres blanches. En effet, dans le milieu gélosé sont introduits deux réactifs (IPTG et X-Gal) qui en contact avec la ss-galactosidase vont produire une coloration bleue. Si il y a synthèse (coloration bleue), de cette enzyme la ss-galactosidase, le fragment d'ADN ne s'est pas ligué au plasmide car lorsqu'il y a ligation, le fragment d'ADN doit se positionner au centre du gène codant pour la ss-galactosidase bloquant ainsi sa synthèse, d'où une coloration blanche des colonies bactériennes. Ces colonies sont analysées, et celle qui contient le plasmide recherché est mise en culture et amplifiée. Le plasmide est extrait de la bactérie puis séquencé.

Les séquences obtenues sont comparées entre elles ; si deux séquences sont différentes, on est alors en présence de deux espèces. On se rend compte que dans la plupart des cas le prélèvement de dix clones (colonies blanches) suffit pour détecter deux espèces. Le prélèvement s'effectuant au hasard, il peut arriver que sur les dix clones on n'obtienne qu'une seule espèce, alors que le mélange en contient au moins deux. Si l'on suspecte plus de deux espèces dans le mélange, on prélève alors plus de clones (15,20 ou même 30). On compte en général, cinq clones pris au hasard pour détecter une espèce. En général, on récupère une dizaine d'ADN plasmidiques provenant donc de dix colonies bactériennes blanches indépendantes sélectionnées au hasard. Ces dix ADN plasmidiques sont donc séquencés et l'on obtient dix séquences. Ces séquences sont analysées de manières à identifier si l'on a des profils différents. Si l'on a qu'une seule espèce dans l'ADN extrait à partir de l'échantillon de matières organiques, on obtient donc un seul profil de séquence pour les dix clones séquencés et en comparant cette séquence avec les séquences de références, on peut identifier l'espèce présente. Si au contraire, on est en présence plusieurs espèces dans l'ADN extrait à partir de l'échantillon de matières organiques, on obtient donc le nombre de profils correspondant au nombre d'espèces présentes dans l'échantillon. En comparant ces séquences avec les séquences de références, on peut identifier les espèces présentes. Le nombre de clones sélectionnés peut être augmenté si l'on suspecte un nombre important d'espèces à identifier.

Cette technique peut être appliquée à tous les substrats organiques.

Ainsi, selon un mode de réalisation avantageux du procédé de l'invention, le séquençage de chacun des différents fragments d'ADN amplifiés est précédé par un procédé de clonage lorsque l'échantillon de matière organique comporte un mélange de différents fragments d'ADN provenant de différentes espèces animales ou végétales ou de différents individus humains, ledit procédé de clonage permettant de séparer dudit mélange les différents fragments d'ADN provenant de différentes espèces animales ou végétales ou de différents individus humains.

L'invention concerne également les oligonucléotides caractérisés en ce qu'ils sont choisis parmi ceux :
1) présentant une identité de séquence d'au moins 80%, préférentiellement 90% et avantageusement 95% avec un oligonucléotide constitué d'une séquence d'environ 15 à 25 nucléotides, notamment 20 à 25 nucléotides, comprise dans la séquence SEQ ID ? 21 suivante (position 16123 à 16144 de l'ADN mitochondrial du saumon-région de contrôle de la réplication-d'après Hurst, et al., 1999. Gene 239 : 237-242) :

GCC GAA TGT AAA GCA TCT GG
2) ou ceux présentant une identité de séquence d'au moins 80%, préférentiellement 90% et avantageusement 95% avec un oligonucléotide constitué d'une séquence d'environ 15 à 25 nucléotides, notamment 20 à 25 nucléotides, comprise dans la séquence SEQ ID ? 22 suivante (position 16341 à 16361 de l'ADN mitochondrial du saumon-région de contrôle de la réplication-d'après Hurst, et al., 1999. Gene 239 : 237-242) : ACC TTA TGC ACT TGA TAT CC
3) ou ceux présentant une identité de séquence d'au moins 80%, préférentiellement 90% et avantageusement 95% avec un oligonucléotide constitué d'une séquence d'environ 15 à 25 nucléotides, notamment 20 à 25 nucléotides, comprise dans la séquence SEQ ID ? 24 suivante (position 14985 à 14996 de l'ADN mitochondrial du saumon-cytochrome b-d'après Hurst, et al., 1999. Gene 239 : 237-242) :
ACC GGG TCT AAT AAC CCA GC
4) ou ceux présentant une identité de séquence d'au moins 80%, préférentiellement 90% et avantageusement 95% avec un oligonucléotide constitué d'une séquence d'environ 15 à 25 nucléotides, notamment 20 à 25 nucléotides, comprise dans la séquence SEQ ID ? 25 suivante (position 15409 à 15430 de l'ADN mitochondrial du saumon-cytochrome b-d'après Hurst, et al., 1999. Gene 239 : 237-242) :
ATG ATA ATG AAT GGG TGT TC
5) ou ceux présentant une identité de séquence d'au moins 80%, préférentiellement 90% et avantageusement 95% avec un oligonucléotide constitué d'une séquence d'environ 15 à 25 nucléotides, notamment 20 à 25 nucléotides, comprise dans la séquence SEQ ID ? 28 suivante (position 356 à 375 de l'ADN mitochondrial du saumon-région de contrôle de la réplication-d'après Albert, et al., 1992, Science 257 (5076), 1491-1495) :
AAA GCT CTG CGC GCT CTA CG

6) ou ceux présentant une identité de séquence d'au moins 80%, préférentiellement 90% et avantageusement 95% avec un oligonucléotide constitué d'une séquence d'environ 15 à 25 nucléotides, notamment 20 à 25 nucléotides, comprise dans la séquence SEQ ID ? 29 suivante (position 539 à 558 de l'ADN mitochondrial du saumon-région de contrôle de la réplication-d'après Albert, et al., 1992, Science 257 (5076), 1491-1495) :
CCG CGG AGA CAT TCA TAA AC
L'invention concerne également les couples d'amorces caractérisés en ce qu'ils sont constitués : - par les oligonucléotides SEQ ID ? 21 et SEQ ID ? 22 - par les oligonucléotides SEQ ID ? 24 et SEQ ID ? 25 - par les oligonucléotides SEQ ID ? 28 et SEQ ID ? 29
L'invention concerne également un fragment d'ADN tel qu'amplifié à l'aide des couples d'amorces définis ci-dessus, et comprenant d'environ 100 à environ 500 paires de base.

L'invention concerne également un fragment d'ADN tel que défini ci-dessus, caractérisé en ce qu'il présente une identité de séquence d'au moins 80%, préférentiellement 90% et avantageusement 95% avec l'une au moins des séquences contenues dans : - la SEQ ID N 23 suivante :
GCCBWWHDWR VVRCAYSTKB BBMWTRVWKH MRATCWYRWT GCSCGTTRMT CRCVRMRYCK
DBCRBYYTHT TRWVYRCHYM BGGKWSYYYT YHWTKYWTYY TTWYCKYHYR GSKKGYMYDY

1 MCMRRTRSMA BYDMRRRRSK CYVRMRMBSK MRVMCYVKAY STYGMATTCC AGAGARYMYM TGYVTYWKVK YSMWRYSHYA THCTMTHADK DATYRCWYMH TKRGAYRKYH RARYATAHRG KBRAT

dans laquelle B est C, G ou T, W est A ou T, H est A, C ou T, D est A, G ou T, R est A ou G, V est A, C ou G, Y est C ou T, S est C ou G, K est G ou T, M est A ou C, - la SEQ ID ? 26 suivante : 1 WCVGGVTCHA AYAACCCMVY AGGHATYWMM TCMSAYKYHG AYAAAATYHC MTTYCACCCH TACTWYWCMW WYAARGACVY YYTNGGMTTN VYHSYYWTMC THMYYKBHMT RAYAYYMYTA

RYHCTRTTCK CMCCMRACCT CCTMGGVGAC CCRGAHAAYT WYACVCYWGC MAAYCCMYTM RWHACHCCHC CHCAWATCAA RCCHGARTGA TAYTTYYTAT TYGCMTAYRC MATYYTHCGM TCMRTYCYAA YAAACTWGGM GGHGTMCTHG CCCTMKYMBY MTCNRTCCTV RTYCTHDYHV TMRTYCCYHT MCTMCAYAHM TCYAARCAAC RMRSMMTRAY MTTYCGMCCM CTMWSCCAAW BMYTWTWYTG RVYYCTRGYM GCVRACMTHC TNAYHCTHAC MTGAATYGGR RGVMWACCHG TVRRMYACCC HTWYAYYAYC ATYGG

dans laquelle W est A ou T, V est A, C ou G, H est A, C ou T, Y est C ou T, M est A ou C, S est C ou G, K est G ou T, R est A ou G, N est A, C, G ou T, D est A, G ou T, B est C, G ou T, - la SEQ ID ? 30 suivante :
AAAGCTCTGC GCGCTCTACG TCTARAGGAT CTGCGAATCC CCCTGCTTAT ACTAAAACTT
TCCAAGGCCC GCCTCATGGC ATCCAAGTTG AGAGAGATAA ATTGAACAAG TATGGTCGTC
CCCTATTGGG ATGTACTATT AAACCTAAAT TGGGGTTATC CGCTAAGAAC TATGGTAGAG
CWGTTTATGA ATGTCTCCGC GG dans laquelle R est A ou G, W est A ou T.

Description des figures
Figure 1 : La figure 1 représente le procédé de clonage utilisé dans le cadre de l'invention afin de séparer les différents fragments d'ADN provenant de différentes espèces de poissons dans un même mélange.

La partie 1 de la figure 1 représente le plasmide par&commat;2. 1-TOPO. Le produit d'amplification de l'invention, qui contient plusieurs copies de différents fragments d'ADN, est mis en contact avec le plasmide pCR'2. 1-TOPO coupé, à l'aide d'une enzyme ADN ligase.

La partie 2 représente une partie de chacun des fragments d'ADN (initialement contenus dans le produit d'amplification) ligués dans un plasmide pCR2. 1-TOPO. A chaque fragment d'ADN correspond un plasmide.

La partie 3 représente les cellules bactériennes Escherichia coli (E. coli).

Dans la partie 4, les bactéries E. coli sont transformées par introduction des plasmides représentés dans la partie 2. A chaque bactérie E. coli correspond un plasmide.

La partie 5 (symbolisée par une flèche) représente l'étalement des bactéries E. coli sur un milieu contenant un antibiotique (par exemple l'ampicilline), afin de sélectionner les bactéries ayant incorporé un plasmide.

La partie 6 représente une boîte de gélose sur laquelle ont poussé des colonies bleues (symbolisées par.) et blanches (symbolisées par o). Les colonies bleues sont

1

caractéristiques des cellules bactériennes dans lesquelles les fragments d'ADN ne se sont pas ligués au plasmide, tandis que les colonies blanches sont caractéristiques des cellules bactériennes dans lesquelles les fragments d'ADN se sont ligués au plasmide.

La partie 7 représente le prélèvement individuel des colonies de bactéries blanches (par exemple 10 colonies bactériennes sélectionnées au hasard et symbolisées par les lettres A à J) qui sont mises en culture individuellement car, à chaque colonie bactérienne correspond un plasmide et donc un fragment d'ADN spécifique (symbolisé respectivement par les lettres A, B, C, D, E, F, G, H, IetJ).

Dans la partie 8, les bactéries ont été éliminées afin de récupérer les plasmides et leurs fragments d'ADN (A à J). On obtient ainsi suffisamment d'ADN plasmidique afin de le séquencer.

La partie 9 représente le résultat du séquençage des différents fragments d'ADN A à J, effectué à l'aide de deux amorces spécifiques du plasmide qui encadrent le fragment d'ADN que l'on veut séquencer. Sur les dix fragments séquencés, on obtient deux types différents de séquences. Ainsi, le mélange analysé comporte deux espèces différentes de gadiformes, en l'occurrence Gadus morhua (fragments A, B, D, E, F, G, 1 et J), et Merluccius hubbsi (fragments C et H).

Figure 2 : La figure 2 représente le résultat du séquençage des différents fragments d'ADN A à T, effectué à l'aide de deux amorces spécifiques du plasmides qui encadrent le fragment d'ADN que l'on veut séquencer. Sur les 20 fragments séquencés, on obtient quatre types différents de séquences. Ainsi, le mélange analysé comporte quatre espèces différentes de vertébrés, en l'occurrence Bos taurus (le boeuf : fragments A, B, C, E, J et T), Ovnis aries

(le mouton : fragments D, I, K, 0, P et S), Sus scrofa (le porc : fragments L, M et R) et Gallus gallus (le poulet : fragments F, G, H, N, N et Q).

Figure 3 : Les figures 3-a et 3-b représentent les résultats obtenus pour la détection et l'identification de mélange d'espèces dans un échantillon provenant d'une boîte d'aliment pour animaux de compagnie à l'aide de deux stratégies d'analyse des espèces.

Dans la figure 3-a, l'ADN extrait a été amplifié à l'aide de différents couples d'amorces spécifiques d'espèces animales et déposé sur un gel d'agarose coloré par du bromure d'éthidium. Un marqueur de taille de 100 paires de bases (M) est déposé sur le gel. Le puits 2 est le produit d'amplification obtenu à l'aide des amorces transvertébrés qui migre en formant une bande de 380 paires de bases. Le puits 3 est le produit d'amplification obtenu à l'aide des amorces spécifiques du poulet qui migre en formant une bande de 160 paires de bases. Le puits 4 est le produit d'amplification obtenu à l'aide des amorces spécifiques des gadiformes

qui migre en formant une bande de 340 paires de bases. Le puits 5 est le produit d'amplification obtenu à l'aide des amorces spécifiques du canard de barbarie qui migre en

1 formant une bande de 360 paires de bases. Le puits 6 est le produit d'amplification obtenu à l'aide des amorces spécifiques du boeuf qui migre en formant une bande de 480 paires de bases. Le puits 7 est le produit d'amplification obtenu à l'aide des amorces spécifiques du porc qui migre en formant une bande de 407 paires de bases. Les amorces spécifiques du mouton n'ont pas donné de produit d'amplification, il n'y a pas de mouton dans l'échantillon (puits 8). Le puits 9 est le produit d'amplification obtenu à l'aide des amorces spécifiques du saumon qui migre en formant une bande de 245 paires de bases. Les amorces spécifiques du rat et de la souris n'ont pas donné de produit d'amplification, il n'y a pas de rat et de souris dans l'échantillon (puits 10). Le puits 1 est un témoin négatif d'amplification.

Dans la figure 3-b, le séquençage des différents fragments d'ADN A à AE à été effectué à l'aide de deux amorces spécifiques du plasmides qui encadrent le fragment d'ADN que l'on veut séquencer. Sur les 30 fragments séquencés, on obtient sept types différents de séquences.

Ainsi, le mélange analysé comporte un mélange de sept espèces, en l'occurrence Bos taurus (le boeuf : fragments A, F, H, K, 0, Q et V), Sus scrofa (le porc : fragments C, I, J et M)), Gallus gallus (le poulet : fragments B, D, P, R, S, U et X), Cairina moschata (le canard de barbarie : fragments : E, G, L, AA et AD), Salmo trutta (le saumon : fragments : T, Z et AE) et Theragra chalcogramma (le colin : N, Y, AB et AC).

Figure 4 : représente l'alignement d'une partie de la région de contrôle de l'ADN mitochondrial humain permettant l'identification individuelle (Anderson et al. Sequence and organization of the human mitochondrial gnome Nature 1981 vol 290,457-465). SEQ ID NO 33, SEQ ID ? 34 et SEQ ID ? 35 sont des séquences de clones différents obtenus après amplification pour les oligonucléotides correspondants aux SEQ ID ? 31 et SEQ ID ? 32. DIRECT correspond à la séquence directe du produit PCR.

EXEMPLES
Exemple 1 : détection et identification d'un mélange d'au moins trois espèces
Il existe des amorces qui permettent d'amplifier tous les vertébrés (mammifères, poissons, oiseaux,...). Ces amorces ont été définis par Kocher (Kocher, T. D., Thomas, W. K., Meyer, A., Edwards, S. V., Paabo, S., Villablanca, F. X., and Wilson, A. C. 1989.

Dynamics of mitochondrial DNA evolution in animals : amplification and sequencing with conserved primers. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 86 : 6196-6200) et donnent un fragment

d'amplification de 360 pb (SEQ ID N027) du cytochrome b de l'ADN mitochondrial. Ces amorces sont appélées"amorces transvertébrés".

Les séquences des amorces sont les suivantes :
5'-AAA CTG CAG CCC CTC AGA ATG ATA TTT GTC CTC A-3' (SEQ ID NO I)
5'-AAA AAG CTT CCA TCC AAC ATC TCA GCA TGA TGA AA-3' (SEQ ID N02)
La séquence amplifiée SEQ ID ? 27 répond à la formule suivante :
TYCCHRCBCC VTCHAAYATY TCHKYHTGAT GRAAYTTYGG HTCHYTHYTD GSMVYNTGCY
TNATNMYHCA RMTYHYMACH GGHYTAYTHY TAGCHATRCA CTAYWCMBCN GACRYMDMVM
YMGCHTTYTC MTCHRTHRYC CAYAYYWSYC GDRAYGTDMA HTAYGGCTGA MTHATYCGVW
AYMTNCAYGC HAAYGGHGCH TCHWTVTTYT TYATYTGYWT HTWYMTDCAY RTHGSVCGMG
GHHTMTAYTA YGGNTCHTWY VYHTWYNHRG ARACMTGAAA YAYHGGVRTH RTMCTHYTVY
TYDYARYHAT ARYMACMKCH TTYTYRTRGG HTAYGTHCTM CCVTGRGGMC AAATATCATT dans laquelle Y est C ou T, H est A, C ou T, R est A ou G, V est A, C ou G, K est G ou T, D est A, G ou T, S est C ou G, M est A ou C, N est A, C, GouT, WestAouT, B est C, G ou T.

Ces amorces sont utilisées lorsque l'on suspecte un mélange entre différents groupes animaux, car cela évite d'effectuer plusieurs amplifications avec des couples d'amorces pouvant amplifier ces différents groupes et donc d'effectuer plusieurs clonages. Ainsi, on peut par exemple détecter un mélange d'espèce dans une viande entre du boeuf, du porc, mouton, poulet, canard,...

Afin de pouvoir mettre au point une méthode de détection et d'identification de mélange d'espèce par clonage, il faut au préalable effectué une extraction d'ADN suivie d'une amplification génique de matières biologiques.

- Extraction
1) Extraction d'ADN par la méthode au phénol/chloroforme
Cette méthode s'adresse à tous les types d'échantillons susceptibles de contenir de la matière organique, tels que filet, soupe, terrine, pâté, graisse, farine, préparations à base de poissons etc....

Cette méthode fait appel à des techniques décrites dans les références HÂNNI et al., 1990, C. R. Acad. Sci. Paris., 310,365-370 et HÂNNI et al., 1995, Nucl. Acids Res., 23,881- 882, concernant l'extraction d'ADN à partir d'os et de dents.

Une quantité d'environ 1 à 2 g d'échantillon de matière organique est incubée pendant deux heures à 37 C dans 400 al de tampon de lyse de composition suivante : - STE IX (NaCl lOOmM, Tris 10mM à pH 7,4, EDTA (acide éthy lènediaminetétraacétique) 1 mM), - SDS 2%, - protéinase K à 0, 5mg/ml.

La protéinase K permet de dégrader les protéines et de libérer les acides nucléiques. Le lysat est ensuite extrait deux fois par un volume de phénol/chloroforme (1/1). On centrifuge pendant 15 minutes à 1000 g, la phase organique est éliminée ce qui permet de se débarrasser de la partie protéique du lysat. L'ADN est précipité par 1/10 de volume d'acétate de sodium 2M puis par 2,5 volumes d'isopropanol et centrifugé 30 minutes à 10 000 g. L'ADN est repris dans de l'eau : on obtient ainsi un extrait d'ADN. Le volume d'eau est fonction de la quantité d'ADN récupéré.

La migration des ADN provenant des divers échantillons donne des traînées caractéristiques d'un ADN dégradé, qui est cependant parfaitement amplifiable.

2) Extraction d'ADN par la méthode de la trousse ou du kit d'extraction
Cette méthode est réalisée dans les conditions décrites par le fournisseur Qiagen.

- Amplification :

La PCR est effectuée avec le couple d'amorces SEQ ID ? 2 et SEQ ID ? 8 tel que défini ci-dessus. Les amplifications sont réalisées dans un volume total de 50 I-ll contenant :
200 j-ig/ml de BSA (Sérum Albumine Bovine),
250 mM de dNTP (désoxynucléotide Triphosphate),
300 ng de chaque amorce,
1,5 mM de chlorure de magnésium (MgC12), tampon de PCR 10X (lOOmM Tris-HCl pH 8, 3 ; 500 mM KCI),
1 unité de Taq Polymerase, qsp 50 J. l d'eau distillée stérile, dz d'extrait d'ADN.

Le mélange réactionnel est effectué dans une pièce stérile sous hotte à flux horizontal, pour éviter autant que possible les contaminations. Les PCR sont effectuées sur un appareil PCR Ependorff. Chaque PCR est découpée comme suit :

- 1 cycle initial à une température de 94 C pendant 2 minutes puis, - 40 cycles à une température de 94 C pendant 1 minute, à une température de 55 C à 63 C pendant 1 minute, à une température de 72 C pendant 2 minutes ; au dernier cycle on effectue une élongation terminale à une température de 72 C pendant 7 minutes.

Les produits d'amplification sont analysés par électrophorèse sur gel d'agarose à 2 % sous tension constante de 100 V pendant 30 min, et à l'aide de bromure d'éthidium pour la visualisation des amplifications obtenues.

La totalité du produit d'amplification de PCR (produit d'amplification) peut être purifié directement grâce au système"QIAquick PCR purification Kit"de Qiagen selon les conditions annoncées. La totalité du produit de PCR est passée sur une collone de gel de silice. Les acides nucléiques sont retenus sur la colonne alors que les autres résidus de la PCR

sont élués à la microcentrifugation. Les impuretés sont éliminées et l'ADN est élué par du tampon Tris ou de l'eau. L'ADN ainsi purifié est visualié et quantifié sur gel d'agarose 2%.

- Séquence directe du produit d'amplification
Le séquençage automatique est effectué sur les produits de PCR purifiés.

Les amorces utilisées sont celles qui ont servi à amplifier le ou les fragments d'ADN que l'on cherche à caractériser. Le Kit Perkin-Elmer est utilisé pour la réaction de PCR, qui est effectuée sur 25 cycles dans les conditions énoncées par le fournisseur. Chaque produit d'amplification obtenu à l'issue de la réaction PCR est précipité à l'éthanol et déposé sur un gel de polyacrylamide. Les séquences obtenues sont alors comparées avec celles des banques ou avec les séquences déjà obtenues.

L'extraction et l'amplification de l'ADN contenu dans un échantillon de matière organique contenant un mélange de différentes espèces de vertébrés est effectuée de la manière décrite ci-dessus. On observe à l'issu de la réaction de PCR un produit d'amplification unique (contenant au moins un fragment d'ADN représenté par un fragment de 360 paires de bases), obtenu à l'aide du couple d'amorce (SEQ ID Wl, SEQ ID N02) permettant d'amplifier tous les vertébrés (voir figure 3, puits 2). Ledit produit d'amplification est donc susceptible de contenir différents fragments d'ADN caractéristiques de différentes espèces de vertébrés.

- Clonage
Après purification du produit d'amplification, ce dernier est cloné grâce au système TOPO TA cloning kit d'Invitrogen selon les conditions annoncées, afin d'isoler et d'obtenir de nombreuses copies identiques de l'ensemble des différents fragments d'ADN

contenus dans le produit d'amplification. A cet égard, le produit d'amplification est inséré par ligation dans le plasmide pCR&commat;2. 1-TOPO&commat; 3.9 kb commercialisé par Invitrogen, (Figure 1-1). Chaque fragment d'ADN contenu dans le produit d'amplification va s'insérer dans un plasmide pCR (D2. 1-TOPO&commat; grâce à l'enzyme ADN ligase (Figure 1-2). A chaque fragment d'ADN correspond donc un plasmide. L'ensemble des fragments d'ADN contenus dans le produit d'amplification sont ainsi séparés lors de cette étape.

Après ligation de chacun des fragments d'ADN dans un plasmide, chaque plasmide est introduit dans une bactérie, par exemple Escherichia coli (E. coli) (Figure 1-4), par un procédé appelé transformation qui fait intervenir un choc osmotique et un choc de température ou un choc électrique. Les bactéries E. coli ainsi obtenues sont mises en culture sur gélose afin d'être multipliées, en présence d'un antibiotique (par exemple l'ampicilline).

La présence de l'antibiotique permet de sélectionner les bactéries E. coli ayant incorporé un plasmide, car les plasmides possèdent naturellement un gène de résistance à un antibiotique.

Ainsi, les bactéries E. coli n'ayant pas incorporé un plasmide ne pourront pas se développer.

Pour sélectionner les bactéries E. coli ayant incorporé un plasmide dans lequel s'est

ligué un fragment d'ADN, on utilise un système visuel. En effet, dans le milieu gélosé ont été introduits deux réactifs (IPTG et X-Gal) qui, en contact avec l'enzyme ss-galactosidase, vont produire une coloration bleue. Les colonies de bactéries bleues obtenues sont celles qui synthétisent de la ss-galactosidase, et qui contiennent un plasmide dans lequel ne s'est pas ligué un fragment d'ADN. Les colonies de bactéries blanches obtenues sont celles qui ne synthétisent pas de la ss-galactosidase, et qui contiennent un plasmide dans lequel s'est ligué un fragment d'ADN. Ceci est lié au fait que le fragment d'ADN s'insert dans le plasmide au milieu d'un gène codant pour l'enzyme ss-galactosidase dont il bloque la synthèse.

Chaque colonie bactérienne blanche obtenue contient un seul fragment ou une seule séquence d'ADN amplifié (e), ledit fragment ou ladite séquence d'ADN correspondant à une seule et même espèce de gadiformes. Les ADN plasmidiques contenant les fragments d'ADN doivent ensuite être récupérés, c'est-à-dire séparés des ADN bactériens pour être séquencés.

Dans cet exemple, nous cherchons à détecter au moins 3 espèces de vertébrés.

Selon un mode de réalisation avantageux du procédé de l'invention, on récupère environ une vingtaine d'ADN plasmidique (symbolisés respectivement par les lettres A, B, C, D, E, F, G, H, I, J, K, L, M, N, 0, P, Q, R, S, et T sur la figure 1) provenant de 20 colonies bactériennes blanches indépendantes sélectionnées au hasard.

Les 20 ADN plasmidiques (symbolisés par les lettres A à T sur la figure 2) ainsi récupérés sont ensuite séquencés avec les amorces fournies dans le kit Invitrogen. Les séquences obtenues sont analysées de manière à identifier si l'on a des profils différents ou non. Les résultats obtenus (figure 2) indiquent que l'échantillon de matière organique comporte un mélange de quatre espèces, en l'occurrence Bos taurus (le boeuf : fragments A, B, C, E, J et T), Ovis aries (le mouton :, fragments D, I, K, 0, P et S), Sus scrofa (le porc : fragments L, M et R) et Gallus gallus (le poulet : fragments F, G, H, N, N et Q).

Exemple 2 : détection et identification d'un mélange d'espèces : les gadiformes
Certaines préparations alimentaires peuvent être préparées à partir de plusieurs espèces de poissons (plats cuisinés, soupe, pâtés, terrine,...). Ce mélange peut être spécifié par le fabricant, mais peut aussi être une adultération. En effet, il peut arriver que ce mélange soit en faveur d'une espèce de poisson de valeur économique moindre par rapport à une autre espèce qui aurait dû se trouver de manière unique dans la préparation (exemple : brandade de morue préparée avec un peu de morue (Gadus morgua) et beaucoup de morue du Pacifique (Gadus macrocephalus) moins chère.

Lorsque l'on ne sait pas si l'échantillon contient plusieurs espèces de gadiformes on utilise les couples d'amorces qui permettent de tous les amplifier.

Le couple d'amorces SEQ ID ? 3 et SEQ ID ? 4 donne le fragment SEQ ID ? 5 de 442 pb.

SEQ ID ? 3 répond à la formule suivante :
AYC ARC AYY TRT TYT GRT TCT dans laquelle Y est C ou T, R est A ou G.

SEQ ID ? 4 répond à la formule suivante :
TAY GTW GTN GCN CAY TTY CA dans laquelle Y est C ou T, W est A ou T, N est A, C, G ou T.

SEQ ID ? 5 répond à la formule suivante :
AYCARCAYYT RTTCTGATTC TKCGGNCAYC CYGAAGTHTA YATHCTNATY YTMCCHGGMT
TCGGRATAAT YTCYCAYATY GTAGCVTAYT AYTCAGGNAA RMAAGARCCN TTYGGRYAYA
TRGGHATRGT NTGAGCYATR ATRGCYATYG GMCTYCTYGG YTTTATYGTV TGRGCYCAYC
ACATRTTYAC AGTBGGRATR GAYGTDGAYA CMCGWGCHTA CTTYACATCY GCAACBATAA
TYATYGCYAT YCCRACAGGY GTWAAAGTYT TYAGYTGAYT AGCAACYYTV CAYGGRGGCT
CARTTAARTG RGAVACHCCB MTMCTBTGRG CCCTDGGYTT YATYTTYCTM TTYACMGTHG
GVGGMYTWAC AGGNATYRTH YTRGCYAAYT CYTCYCTAGA YATYGTDCTY CAYGAYACRT
AYTAMGTAGT MGCYCAYTTY CA

dans laquelle Y est C ou T, R est A ou G, K est G ou T, N est A, C, G ou T, H est A, C ou T, M est A ou C, V est A, C ou G, B est C, G ou T, D est A, G ou T, W est A ou T.

Le couple d'amorces SEQ ID ? 6 et SEQID ? 4 donne le fragment SEQ ID ? 7 de 328 pb.

SEQ ID ? 6 répond à la formule suivante :
GGN YAY ATR GGN ATR GTN TGA GC dans laquelle N est A, C, G ou T, Y est C ou T, R est A ou G.

SEQ ID ? 7 répond à la formule suivante :
GGRYAYATRG GHATRGTNTG AGCYATRATR GCYATYGGMC TYCTYGGYTT TATYGTVTGR
GCYCAYCACA TRTTYACAGT BGGRATRGAY GTDGAYACMC GWGCHTACTT YACATCYGCA
ACBATAATYA TYGCYATYCC RACAGGYGTW AAAGTYTTYA GYTGAYTAGC ACYYTVCAYG
GRGGCTCART TAARTGRGAV ACHCCBMTMC TBTGRGCCCT DGGYTTYATY TTYCTMTTYA
CMGTHGGVGG MYTWACAGGN ATYRTHYTRG CYAAYTCYTC YCTAGAYATY GTDCTYCAYG
AYACRTAYTA MGTAGTMGCY CAYTTYCA dans laquelle R est A ou G, Y est C ou T, K est G ou T, N est A, C, G ou T, H est A, C ou T, M est A ou C, V est A, C ou G, B est G, B est C, G out T, D est A, G ou T, W est A ou T.

Lorsque l'on souhaite détecter un mélange de gadidés on peut utiliser les amorces précédentes qui permettent d'identifier tous les gadiformes, mais aussi les amorces permettant d'amplifier tous les gadidés.

Le coupe d'amorces SEQ ID ? 8 et SEQ ID N 9 donne le fragment SEQ ID N'IO de 386 pb.

SEQ ID N 8 répond à la formule suivante :
ACC AAC ACT TAT TCT GAT TCT
SEQ ID N 9 répond à la formule suivante :
GGC TTA ACA GGA ATT GTA CTA GCT
SEQ ID ? 10 répond à la formule suivante :
AYCARCAYYT RTTCTGATTC TKCGGNCAYC CYGAAGTHTA YATHCTNATY YTMCCHGGMT
TCGGRATAAT YTCYCAYATY GTAGCVTAYT AYTCAGGNAA RMAAGARCCN TTYGGRYAYA
TRGGHATRGT NTGAGCYATR ATRGCYATYG GMCTYCTYGG YTTTATYGTV TGRGCYCAYC
ACATRTTYAC AGTBGGRATR GAYGTDGAYA CMCGWGCHTA CTTYACATCY GCAACBATAA
TYATYGCYAT YCCRACAGGY GTWAAAGTYT TYAGYTGAYT AGCAACYYTV CAYGGRGGCT
CARTTAARTG RGAVACHCCB MTMCTBTGRG CCCTDGGYTT YATYTTYCTM TTYACMGTHG
GVGGMYTWAC AGGNATYRTH YTRGCY

Le couple d'amorces SEQ ID ? 11 et SEQ ID ? 9 donne le fragment SEQ ID ? 12 de 237 pb.

SEQ ID ? 11 répond à la formule suivante :
GGC CTC CTT GGC TTT ATT GTA
SEQ ID ? 12 répond à la formule suivante :
GGMCTYCTYG GYTTTATYGT VTGRGCYCAY CACATRTTYA CAGTBGGRAT RGAYGTDGAY
ACMCGWGCHT ACTTYACATC YGCAACBATA ATYATYGCYA TYCCRACAGG YGTWAAAGTY
TTYAGYTGAY TAGCAACYYT VCAYGGRGGC TCARTTAART GRGAVACHCC BMTMCTBTGR
GCCCTDGGYT TYATYTTYCT MTTYACMGTH GGVGGMYTWA CAGGNATYRT HYTRGCY

Lorsque l'on souhaite détecter un mélange de merluccidés, on peut utiliser les amorces précédentes qui permettent d'identifier tous les gadiformes, mais aussi les amorces permettant d'amplifier tous les merluccidés.

Le couple d'amorces SEQID NO 13 et SEQ ID ? 14 donne le fragment SEQ ID ? 15 de 318 pb.

SEQ ID NO 13 répond à la formule suivante :
TAA TYT CYC AYA TYG TAG CC dans laquelle Y est C ou T.

SEQ ID NO 14 répond à la formule suivante :
ACT TAC AGG NAT YRT HCT RG dans laquelle N est A, C, G ou T, Y est C ou T, R est A ou G, H est A, C ou T.

SEQ ID ? 15 répond à la formule suivante :
TAATYTCYCA YATYGTAGCV TAYTAYTCAG GNAARMAAGA RCCNTTYGGR YAYATRGGHA
TRGTNTGAGC YATRATRGCY ATYGGMCTYC TYGGYTTTAT YGTVTGRGCY CAYCACATRT
TYACAGTBGG RATRGAYGTD GAYACMCGWG CHTACTTYAC ATCYGCAACB ATAATYATYG
CYATYCCRAC AGGYGTWAAA GTYTTYAGYT GAYTAGCAAC YYTVCAYGGR GGCTCARTTA
ARTGRGAVAC HCCBMTMCTB TGRGCCCTDG GYTTYATYTT YCTMTTYACM GTHGGVGGMY
TWACAGGNAT YRTHYTRG

Le couple d'amorces SEQ ID ? 16 et SEQ ID N014 donne le fragment SEQ ID ? 17 de 189pb.

SEQ ID ? 16 répond à la formule suivante :
GRA TRG AYG TDG AYA CMC GT dans laquelle R est A ou G, Y est C ou T, D est A, G ou T, M est A ou C.

SEQ ID NO 17 répond à la formule suivante :
GRATRGAYGT DGAYACMCGW GCHTACTTYA CATCYGCAAC BATAATYATY GCYATYCCRA
CAGGYGTWAA AGTYTTYAGY TGAYTAGCAA CYYTVCAYGG RGGCTCARTT AARTGRGAVA
CHCCBMTMCT BTGRGCCCTD GGYTTYATYT TYCTMTTYAC MGTHGGVGGM YTWACAGGNA
TYRTHYTRG dans laquelle R est A ou G, Y est C ou T, D est A, G ou T, M est A ou C, W est A ou T, B est C, G ou T, V est A, C ou G, H est A, C ou T, N est A, C, G ou T.

À partir de ce système, voici plusieurs exemples de types de mélanges d'espèces pouvant être identifié.

Le premier est un mélange entre gadiformes par exemple du colin d'Alaska (Theragra chalcogramma) qui est un gadidé et du merlu Argentin (Merluccius hubbsi) qui est un

merluccidé. Le couple d'amorce (SEQ ID ? 6 et SEQ ID N'4) qui permet d'amplifier tous les gadiformes et donnant un fragment (SEQ ID N'7) de 328 pb est utilisé. On observe deux profils de séquences sur les dix clones analysés. Ces deux profils lorsqu'ils sont comparés à des séquences de références regroupées dans une banque de séquences (Genebank par exemple), correspondent à une espèce de gadidés : le colin d'Alaska (Theragra chalcogramma) et une espèce de merluccidés : le merlu Argentin (Merluccius hubbsi)
Le deuxième est un mélange entre gadidés par exemple de la morue commune (Gadus iiiorhua) et la lingue (Molva molva). Le couple d'amorce (SEQ ID ? 11 et SEQ ID N'9) qui permet d'amplifier tous les gadidés et donnant un fragment (SEQ ID NO 12) de 237 pb est utilisé. Ce fragment est cloné puis séquencé. On observe deux profils de séquences sur les dix clones analysés. Ces deux profils lorsqu'ils sont comparés à des séquences de références regroupées dans une banque de séquences (Genebank par exemple), correspondent à deux espèces de gadidés : la morue (Gadus morhua) et la lingue (Molva molva).

Le troisième type de mélange est un mélange entre merluccidés comme par exemple le merlu du Cap (Merluccius capensis) et le merlu commun (Merluccius merluccius). Le couple

d'amorce (SEQ ID NO 16 et SEQ ID N014) qui permet d'amplifier tous les merluccidés et donnant un fragment (SEQ ID N017) de 189 pb est utilisé. Ce fragment est cloné puis séquence. On observe deux profils de séquences sur les dix clones analysés. Ces deux profils lorsqu'ils sont comparés à des séquences de références regroupées dans une banque de séquences (Genebank par exemple), correspondent à deux espèces de merluccidés : le merlu

du Cap (Merluccius capensis) et le merlu commun (Merluccius merluccius).

1
Exemple 3 : détection et identification d'un mélange d'espèces : les ansériformes
Pour ce qui est des ansériformes, il peut exister différentes formes de mélange. La première concerne les produits comme le foie gras où l'oie peut être remplacé en grande partie par du canard de valeur commerciale moins grande et le foie gras de canard peut quant à lui aussi être substitué par du poulet dans des proportions variées. Ces mélanges d'espèces dans les foie gras concernent surtout les blocs de foie gras qui sont des foies reconstitués à partir de plusieurs foies et non pas les foies gras entiers qui eux sont issus d'un seul individu.

Les autres types de mélanges concernent les plats cuisinés, préparés à partir de différentes espèces.

La détection de mélanges d'espèces d'ansériformes est effectuée par le procédé de clonage du fragment obtenu par le couple d'amorce défini dans le brevet pour détecter les ansériformes. Ce couple d'amorce (SEQ ID ? 18 et SEQ ID ? 19) donne un fragment (SEQ ID N020) de 203 pb. Toutes les espèces d'ansériformes pourront alors être détectées dans n'importe quel mélange.

SEQ ID ? 18 répond à la formule suivante :
ACT AGC TTC AGG CCC ATA CG
SEQ ID ? 19 répond à la formule suivante :
AAA AAT AAA AGG AAC CAG AG
SEQ ID ? 20 répond à la formule suivante :
ACYAGCTTCA GGCCCATACG TTCCCCCTAA ACCCCTCGCC CTCCTCACAT TTTTGCGCCT
CTGGTTCCTC GGTCAGGGCC ATCMATTGGG TTCACTCACC YCYMYTYGCC YTTCAAAGTG
GCATCTGTGG ANKACBTYCA CCWYYYCRRT GCGTWATCGC GGCATBYTYM ASYWTTTWSM
CGCCTYTGGT TCYMYTTHTY TYT

dans laquelle Y est C ou T, M est A ou C, N est A, C, G ou T, K est G ou T, B est C, G ou T, W est A ou T, R est A ou G, S est C ou G.

Exemple 4 : détection et identification d'un mélange d'espèces : les saumons
Il existe une fraude entre la seule espèce de saumons de l'Atlai-itique Salillo salar et les cinq espèces de saumons du Pacifique du genre Oncorhynchus. En Europe, deux espèces sont

élevées industriellement, le saumon atlantique (Salmo salar) et de la truite arc en ciel (Oco/McÂM/'). Ces espèces sont généralement fumées or une fois fumée, il est très difficile de faire la distinction entre ces deux espèces aussi bien d'un point de vue visuel que tactile sur leur texture. Or ces deux espèces ne sont pas commercialisées au même prix puisque le saumon est bien plus cher que la truite. Il existe donc une fraude pour ce produit, lorsque le saumon n'est pas vendu sous forme de filet mais dans un autre conditionnement, surtout en période de fête.

Plusieurs couples d'amorces ont été définis afin d'amplifier tous les salmonidés. Deux marqueurs moléculaires ont été choisis.

Pour la région de contrôle de la réplication de l'ADNmt, le couple d'amorce :
SEQ ID ? 21 répondant à la formule suivante :
GCC GAA TGT AAA GCA TCT GG
SEQ ID ? 22 répondant à la formule suivante :
ACC TTA TGC ACT TGA TAT CC donne un fragment de 245 pb (SEQ ID N023)
SEQ ID ? 23 répond à la formule suivante :
GCCBWWHDWR VVRCAYSTKB BBMWTRVWKH MRATCWYRWT GCSCGTTRMT CRCVRMRYCK
DBCRBYYTHT TRWVYRCHYM BGGKWSYYYT YHWTKYWTYY TTWYCKYHYR GSKKGYMYDY
MCMRRTRSMA BYDMRRRRSK CYVRMRMBSK MRVMCYVKAY STYGMATTCC AGAGARYMYM
TGYVTYWKVK YSMWRYSHYA THCTMTHADK DATYRCWYMH TKRGAYRKYH RARYATAHRG
KBRAT dans laquelle B est C, G ou T, W est A ou T, H est A, C ou T, D est A, G ou T, R est A ou G, V est A, C ou G, Y est C ou T, S est C ou G, K est G ou T, M est A ou C.

Pour le cytochrome b de l'ADNmt, le couple d'amorce :
SEQ ID ? 24 répondant à la formule suivante :
ACC GGG TCT AAT AAC CCA GC
SEQ ID ? 25 répondant à la formule suivante : ATG ATA ATG AAT GGG TGT TC donne un fragment de 442 pb (SEQ ID N 26) la SEQ ID N 26 répond à la formule suivante :
WCVGGVTCHA AYAACCCMVY AGGHATYWMM TCMSAYKYHG AYAAAATYHC MTTYCACCCH

TACTWYWCMW WYAARGACVY YYTNGGMTTN VYHSYYWTMC THMYYKBHMT RAYAYYMYTA RYHCTRTTCK CMCCMRACCT CCTMGGVGAC CCRGAHAAYT WYACVCYWGC MAAYCCMYTM RWHACHCCHC CHCAWATCAA RCCHGARTGA TAYTTYYTAT TYGCMTAYRC MATYYTHCGM TCMRTYCYAA YAAACTWGGM GGHGTMCTHG CCCTMKYMBY MTCNRTCCTV RTYCTHDYHV TMRTYCCYHT MCTMCAYAHM TCYAARCAAC RMRSMMTRAY MTTYCGMCCM CTMWSCCAAW BMYTWTWYTG RVYYCTRGYM GCVRACMTHC TNAYHCTHAC MTGAATYGGR RGVMWACCHG TVRRMYACCC HTWYAYYAYC ATYGG

dans laquelle W est A ou T, V est A, C ou G, H est A, C ou T, Y est C ou T, M est A ou C, S est C ou G, K est G ou T, R est A ou G, N est A, C, G ou T, D est A, G ou T, B est C, G ou T.

Le couple d'amorces défini à partir de la région de contrôle est choisi préférentiellement car le fragment étant de plus petite taille, il a plus de chance de l'obtenir pour des aliments dégradés.

Exemple 5 : détection et identification d'un mélange d'individus
Ce type de détection peut aussi s'appliquer à une seule espèce qui est composée de plusieurs individus. C'est le cas de l'espèce humaine où l'on a pu démontrer que la région de contrôle de son ADNmt permettait de faire la distinction entre les individus selon la lignée maternelle. Cette observation est très largement utilisée dans les laboratoires qui réalisent des empreintes génétiques pour le typage d'ADN individuel.

Ainsi, quand plusieurs ADN humains sont retrouvés sur un échantillon à analyser, le procédé de clonage permet de faire le tri entre les individus dont l'ADN a été retrouvé et d'identifier indépendamment chacun des individus par son ADN.

Une telle situation peut subvenir lorsque les restes organiques de plusieurs individus sont mélangés (par exemple cas de plusieurs personnes ayant bu dans le même verre, laissant ainsi plusieurs types de traces différentes. Lorsque l'on souhaite utiliser l'ADN mitochondrial pour réaliser une identification dans un tel cas, on obtient une séquence contenant de nombreuses indéterminations rendant l'identification de chaque personne impossible. Le clonage permet de circonvenir ce problème en séparant chaque séquence ce qui permet d'obtenir plusieurs signatures distinctes et spécifiques.

Le clonage permet en outre de détecter la présence de plusieurs individus alors que l'analyse de la séquence directe ne le laissait pas prévoir. Ainsi si l'on retrouve des traces anciennes de restes organiques (une tache de sang vieille de plusieurs années par exemple) et que ces restes ont été mélangés à des restes organiques récents (des pellicules capillaires de toute personne intervenue récemment) on obtient un extrait d'ADN contenant un ADN ancien

très dégradé et un ADN moderne en bon état. Dans un tel cas, l'ADN moderne étant préférentiellement amplifié, il est très majoritaire et on obtiendra une seule signature visible en séquence directe. Cependant, si on réalise un clonage et qu'on analyse un grand nombre de clones (par exemple 30) on peut obtenir une majorité de clones provenant de l'ADN moderne contaminant (par exemple 28) et une minorité (par exemple 2) qui provient de l'ADN dégradé. Le clonage permet donc de révéler la présence d'un mélange, alors qu'aucune analyse classique ne le laissait prévoir. Cette méthode permet donc de réaliser une analyse beaucoup plus fine des échantillons organiques, et de détecter et/ou de révéler la présence de séquences non soupçonnées correspondant à des individus.

Dans l'exemple présenté des fragments osseux ont été extraits par les méthodes classiques utilisées en archéologie moléculaire (Anderson et al. Sequence and organization of the human mitochondrial gnome Nature 1981 vol 290,457-465). Une région de 382 bp de la région de contrôle de l'ADN mitochondrial a été amplifié avec les oligonucléotides suivants :

AAG CAG ATT TGG GTA CCA C-3' (SEQ ID N031) GAT TTC ACG GAG GAT GGT G-3' (SEQ ID N032)
La région amplifiée correspond aux positions 16037 (SEQ ID N031) à 16419 (SEQ ID N032) de l'ADN mitochondrial humain déterminé par Anderson en 1981 (Nature 1981).

Cette région est comparée aux 3 séquences issues du clonage de ce fragment (respectivement SEQ ID N033, SEQ ID NO 34, et SEQ ID N035) et avec la séquence directe du fragment issu de la PCR (DIRECT). On voit bien qu'à chaque différence entre une des 3 séquences correspond un N dans la séquence directe. On en conclu que les fragments osseux contient du matériel génétique issus de 3 individus différents.

Exemple 6 : détection et identification d'un mélange de vertébrés dans une boîte d'aliment pour animaux de compagnie :
On retrouve les mêmes étapes que celles définies dans l'exemple 1 : extraction, amplification avec le couple d'amorces transvertébrées, clonage, séquençage. Ce qui diffère est l'analyse des résultats car dans cet exemple en plus d'avoir séquencé le produit d'amplification obtenu par le couple d'amorces transvertébrées (figure 3 puits 2), on a confirmé les résultats à l'aide d'amorces spécifiques des espèces de vertébrés que l'on a trouvé après séquençage des ADN plasmidiques.

Les amorces"transvertébrées"sont utilisées afin d'amplifier un fragment du cytochrome b de l'ADN mitochondrial dans un échantillon provenant d'une boîte d'aliment pour animaux de compagnies.

Dans cet exemple, on cherche un mélange dont on ne sait pas le nombre d'espèce. Sur l'étiquette est noté"émincés en gelée au poulet et au canard", puis ingrédients (viandes et sous-produits animaux). On suppose donc qu'il y a certainement plus de deux espèces en plus du poulet et du canard comme du porc et&commat; du boeuf
Selon un mode de réalisation avantageux du procédé de l'invention, on récupère environ une trentaine d'ADN plasmidique (symbolisés respectivement par les lettres A, B, C, D, E, F, G, H, I, J, K, L, M, N, 0, P, Q, R, S, T, U, V, W, X, Y, Z, AA, AB, AC, AD, AE sur la figure 3-b) provenant de 30 colonies bactériennes blanches indépendantes sélectionnées au hasard.

Les 30 ADN plasmidiques (symbolisés par les lettres A à AE sur la figure 3-b) ainsi récupérés sont ensuite séquencés avec les amorces fournies dans le kit Invitrogen. Les séquences obtenues sont analysées de manière à identifier si l'on a des profils différents ou

non. Les résultats obtenus (figure 3-b) indiquent que l'échantillon de matière organique ZD comporte un mélange de sept espèces, en l'occurrence Bos taurus (le boeuf : fragments A, F, H, K, 0, Q et V), Sus scrofa (le porc : fragments C, I, J et M)), Gallus gallus (le poulet : fragments B, D, P, R, S, U et X), Cairina moschata (le canard de barbarie : fragments : E, G, L, AA et AD), Salvo trutta (le saumon : fragments : T, Z et AE) et Theragra chalcogramma (le colin : N, Y, AB et AC).

Exemple 7 : détection et identification d'un mélange de végétaux :
Un couple d'amorce a été defini sur le génome chloroplastique pour amplifier le gène codant pour la sous-unité de la ribulose 1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase (rbcL) présent chez tous les végétaux. Le produit d'amplification obtenu permet de détecter et d'identifier les différentes espèces végétales.

Un exemple porte sur un système de détection et d'identification des cépages puisque en général plusieurs cépages entrent dans la composition du vin. Les cépages, comme par exemple le cabernet franc, le chardonnay, le chasselas, le gamay, le sauvignon, ou bien le syrah, sont tous issus de la même espèce (Vitis vinifiera). Les séquences des amorces sont les suivantes : - AAA GCT CTG CGC GCT CTA CG (SEQ ID N028) - CCG CGG AGA CAT TCA TAA AC (SEQ ID N'29)

SEQ ID N028 et SEQ ID ? 29 donnent un fragment de 202 pb (SEQ ID N030)
La SEQ ID 30 répond à la formule suivante :
AAAGCTCTGC GCGCTCTACG TCTARAGGAT CTGCGAATCC CCCTGCTTAT ACTAAAACTT
TCCAAGGCCC GCCTCATGGC ATCCAAGTTG AGAGAGATAA ATTGAACAAG TATGGTCGTC
CCCTATTGGG ATGTACTATT AAACCTAAAT TGGGGTTATC CGCTAAGAAC TATGGTAGAG
CWGTTTATGA ATGTCTCCGC GG dans laquelle R est A ou G, W est A ou T.

Afin de pouvoir mettre au point une méthode de détection et d'identification de mélange de cépage par clonage, il faut au préalable effectué une extraction d'ADN suivie d'une amplification génique de matières biologiques.

- Extraction CTAB (bromure de cétyltriméthylammonium).

Cette méthode décrite par MURRAY (Nucleic Acid Res. 8 (19), 4321-4325 (1980)) s'adresse préférentiellement aux échantillons végétaux.

19 d'échantillon est incubé 3 heures à 56 C dans 2,5 ml de tampon de lyse dont la composition est :
Tris 10 mM pH8
EDTA 0, 1 mM dodécylsulfate de sodium 1% protéinase K 100). tg/ml

450 tl de NaCl 5 M et 375 ut de CTAB 10% NaCl 0, 7 M, préchauffés à 65 C, sont 1 ajoutés et le tout incubé 20 mn à 65 C. Un volume de chloroforme est alors ajouté. Après agitation et centrifugation (10 mn à 12000 rpm à 4 C), la phase aqueuse est récupérée et réextraite une deuxième fois pour la rendre claire. Elle est de nouveau extraite par un volume de phénol/chloroforme. La suite de l'extraction s'effectue comme indiqué dans le paragraphe 1.

- Amplification : (voir exemple 1 ci-dessus) - Clonage (voir exemple 1 ci-dessus)

Claims

REVENDICATIONS

1. Utilisation d'un procédé de clonage pour la détermination de l'existence d'un mélange d'origine organique contenant de l'ADN de différentes espèces, populations ou races animales et/ou différentes espèces, populations ou races végétales et/ou différents individus humains.

2. Utilisation d'un procédé de clonage selon la revendication 1 pour la détection et/ou l'identification de l'ADN de chacune des différentes espèces, populations ou races animales et/ou de chacune des différentes espèces, populations ou races végétales et/ou de chacun des différents individus humains présent dans un mélange d'origine organique contenant de l'ADN d'espèces, populations ou races animales et/ou d'espèces, populations ou races végétales et/ou d'individus humains.

3. Utilisation selon la revendication 1 ou la revendication 2, dans laquelle chaque espèce, population ou race animale et/ou chaque espèce, population ou race végétale et/ou chaque individu humain est représenté (e) par au moins une séquence d'ADN ou au moins un fragment d'ADN, et notamment par une séquence unique d'ADN ou un fragment unique d'ADN, chacune desdites séquences d'ADN ou chacun desdits fragments d'ADN provenant de l'ADN extrait du mélange d'origine organique.

4. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 3 pour la détection et/ou l'identification de l'ADN de chacune des différentes espèces animales présent dans un mélange d'espèces animales, et notamment de l'ADN de chacune des sous-espèces, lignées, races, variétés et/ou souches et/ou populations présent dans ledit mélange.

5. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 3 pour la détection et/ou l'identification de l'ADN de chacune des différentes espèces végétales présent dans un mélange d'espèces végétales, et notamment de l'ADN de chacune des sous-espèces, lignées, races, variétés et/ou souches, cépages et/ou populations présent dans ledit mélange, chacune desdites espèces

végétales, et notamment chacune desdites sous-espèces, races, variétés et/ou souches étant Z : D représentée par au moins une séquence d'ADN ou au moins un fragment d'ADN, et notamment par une séquence unique d'ADN ou un fragment unique d'ADN.

6. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 3 pour la détection et/ou l'identification de l'ADN de chacun des différents individus humains présent dans un mélange d'ADN de différents individus humains, chacun desdits individus humains étant représenté par au moins une séquence d'ADN ou au moins un fragment d'ADN, et notamment par une séquence unique d'ADN ou un fragment unique d'ADN.

7. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 6, dans laquelle l'ADN extrait du mélange d'origine organique est de l'ADN ancien (ou fossile), de l'ADN dégradé ou de l'ADN moderne.

8. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 7, dans laquelle l'ADN extrait du mélange d'origine organique est : - de l'ADN non dégradé provenant notamment d'un échantillon organique frais ou, - de l'ADN dégradé, provenant notamment d'un échantillon organique transformé, notamment cuit, lyophilisé, séché, saumuré, appertisé ou pasteurisé.

1

9. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 8 pour la détection et éventuellement l'identification de l'ADN de chacune des différentes espèces, populations ou races animales et/ou de chacune des différentes espèces, populations ou races végétales et/ou de chacun des différents individus humains présent dans le mélange d'origine organique, dans laquelle l'une au moins desdites espèces, populations ou races et/ou l'un au moins desdits individus est représenté (e) par une séquence d'ADN ancien ou un fragment d'ADN ancien.

10. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 9, dans laquelle le procédé de clonage est précédé d'une étape d'amplification de chacune des séquences d'ADN ou de chacun des fragments d'ADN caractéristique de chacune des espèces, populations ou races animales et/ou de chacune des espèces, populations ou races végétales et/ou de chacun des individus humains que l'on cherche à détecter et/ou identifier, les séquences d'ADN ou les fragments d'ADN

1 amplifié (e) s obtenu (e) s à l'issue du procédé d'amplification étant contenu (e) s dans un produit d'amplification unique.

11. Utilisation selon la revendication 10, dans laquelle chaque séquence d'ADN ou chaque fragment d'ADN amplifié (e) est d'origine nucléaire, mitochondriale ou chloroplastique.

12. Utilisation selon la revendication 11, dans laquelle chaque séquence d'ADN ou chaque fragment d'ADN amplifié (e) est d'origine nucléaire ou mitochondriale lorsque l'on cherche à détecter et/ou identifier un mélange contenant de l'ADN de différentes espèces animales et/ou différents individus humains, est d'origine nucléaire, mitochondriale ou chloroplastique lorsque l'on cherche à détecter et/ou identifier un mélange contenant de l'ADN de différentes espèces végétales.

13. Procédé de détection et/ou d'identification de l'ADN de chacune des différentes espèces, populations ou races animales et/ou de chacune des différentes espèces, populations ou races végétales et/ou de chacun des différents individus humains présent dans un mélange d'origine organique, chacune desdites espèces, populations ou races animales et/ou chacune desdites espèces, populations ou races végétales et/ou chacun desdits individus humains étant représenté (e) par au moins une séquence d'ADN ou au moins un fragment d'ADN, notamment une séquence d'ADN unique ou un fragment d'ADN unique, chacune desdites séquences d'ADN ou chacun desdits fragments d'ADN provenant de l'ADN extrait dudit mélange, ledit procédé étant caractérisé en ce qu'il comporte les étapes suivantes : . amplification de chacune des séquences d'ADN ou de chacun des fragments d'ADN caractéristique de l'espèce, population ou race animale, de l'espèce, population ou race végétale ou de l'individu humain que l'on cherche à détecter et/ou identifier, notamment par la méthode d'amplification en chaîne par polymérase (PCR), afin d'obtenir un produit d'amplification unique contenant les différents fragments d'ADN ou les différentes séquences d'ADN amplifié (e) s, . clonage du produit d'amplification obtenu à l'issue de l'étape d'amplification précédente, afin de séparer les différentes séquences d'ADN ou les différents fragments d'ADN présent (e) s dans le mélange d'origine organique, . séquençage de chacune des séquences d'ADN ou de chacun des fragments d'ADN ainsi séparés dudit mélange.

14. Procédé de détection et/ou d'identification selon la revendication 13, dans lequel :

+ la méthode d'amplification en chaîne par polymérase (PCR) comprend une répétition du cycle des étapes suivantes : - chauffage de l'ADN extrait du mélange d'origine organique, de façon à séparer l'ADN en deux brins monocaténaires, - hybridation des brins d'ADN monocaténaires à une température adéquate avec les amorces oligonucléotidiques appropriées pour amplifier l'ADN des espèces, populations ou races animales, végétales ou des individus humains que l'on cherche à détecter et/ou identifier, - élongation desdites amorces oligonucléotidiques appropriées par une polymérase à une température adéquate, pour obtenir un produit d'amplification unique contenant chacune desdites séquences d'ADN ou chacun desdits fragments d'ADN caractéristique d'une espèce animale ou végétale déterminée, ou d'un individu humain, + le clonage du produit d'amplification obtenu à l'issue de l'étape d'amplification précédente comprenant les étapes suivantes : - insertion, à l'aide d'une enzyme ADN ligase, dudit produit d'amplification unique contenant les différentes séquences d'ADN ou les différents fragments d'ADN amplifié (e) s caractéristiques de l'ADN de l'espèce, population ou race animale, de l'espèce, population ou race végétale ou de l'individu humain que l'on cherche à détecter et/ou identifier, dans un plasmide préalablement linéarisé, afin d'obtenir plusieurs plasmides contenant chacun une séquence unique d'ADN ou un fragment unique d'ADN amplifié (e), - incorporation de chaque plasmide obtenu à l'étape précédente, respectivement dans une bactérie, notamment Escherichia coli (E. coli), - multiplication de chacune des bactéries obtenues à l'étape précédente, par mise en culture desdites bactéries dans un milieu approprié, en présence d'un antibiotique, notamment l'ampicilline, afin de sélectionner les bactéries ayant incorporées un plasmide dans lequel s'est inséré un fragment d'ADN ou une séquence d'ADN, - séparation de chacun des plasmides contenant une séquence unique d'ADN ou un fragment unique d'ADN, de chacune des bactéries contenant lesdits plasmides, afin de récupérer l'ensemble des plasmides ou ADN plasmidiques ainsi multipliés, lesdits plasmides contenant chacun une séquence unique d'ADN ou un fragment unique d'ADN, - prélèvement d'un nombre suffisant de plasmides (ou ADN plasmidique ) parmi l'ensemble des plasmides (ou ADN plasmidiques ) obtenus à l'issue de l'étape précédente, afin de détecter et/ou d'identifier au moins deux fragments d'ADN ou séquences d'ADN différent (e) s, chacun (e) desdit (e) s séquences d'ADN ou fragments d'ADN étant

caractéristique a une espèce, population ou race ammale ou végétale déterminée, ou u un individu humain.

15. Procédé de détection et/ou d'identification selon la revendication 14, dans lequel chacun des ADN plasmidiques obtenu à l'issue du clonage est identifié par séquençage, ce qui permet d'identifier l'ADN caractéristique de chacune des espèces, populations ou races animales et/ou chacune des espèces, populations ou races végétales et/ou chacun des individus humains présent dans le mélange d'origine organique.

16. Oligonucléotides caractérisés en ce qu'ils sont choisis parmi ceux :

1) présentant une identité de séquence d'au moins 80%, préférentiellement 90% et avantageusement 95% avec un oligonucléotide constitué d'une séquence d'environ 15 à 25 nucléotides, notamment 20 à 25 nucléotides, comprise dans la séquence SEQ ID ? 21 suivante (position 16123 à 16144 d'après Hurst, et al., 1999. Gene 239 : 237-242) :

GCC GAA TGT AAA GCA TCT GG

2) ou ceux présentant une identité de séquence d'au moins 80%, préférentiellement 90% et avantageusement 95% avec un oligonucléotide constitué d'une séquence d'environ 15 à 25 nucléotides, notamment 20 à 25 nucléotides, comprise dans la séquence SEQ ID ? 22 suivante (position 16341 à 16361 d'après Hurst, et al., 1999. Gene 239 : 237-242) :

ACC TTA TGC ACT TGA TAT CC

3) ou ceux présentant une identité de séquence d'au moins 80%, préférentiellement 90% et avantageusement 95% avec un oligonucléotide constitué d'une séquence d'environ 15 à 25 nucléotides, notamment 20 à 25 nucléotides, comprise dans la séquence SEQ ID ? 24 suivante (position 14985 à 14996 d'après Hurst, et al., 1999. Gene 239 : 237-242) :

ACC GGG TCT AAT AAC CCA GC

4) ou ceux présentant une identité de séquence d'au moins 80%, préférentiellement 90% et avantageusement 95% avec un oligonucléotide constitué d'une séquence d'environ 15 à 25

17. Couple d'amorces caractérisés en ce qu'ils sont constitués : - par les oligonucléotides SEQ ID ? 21 et SEQ ID N022 - par les oligonucléotides SEQ ID ? 24 et SEQ ID N025 - par les oligonucléotides SEQ ID N028 et SEQ ID ? 29

CCG CGG AGA CAT TCA TAA AC

nucléotides, notamment 20 à 25 nucléotides, comprise dans la séquence SEQ ID ? 29 suivante (position 539 à 558 d'après Albert, et al 1992, Science 257 (5076), 1491-1495) :

6) ou ceux présentant une identité de séquence d'au moins 80%, préférentiellement 90% et avantageusement 95% avec un oligonucléotide constitué d'une séquence d'environ 15 à 25

AAA GCT CTG CGC GCT CTA CG

5) ou ceux présentant une identité de séquence d'au moins 80%, préférentiellement 90% et avantageusement 95% avec un oligonucléotide constitué d'une séquence d'environ 15 à 25 nucléotides, notamment 20 à 25 nucléotides, comprise dans la séquence SEQ ID ? 28 suivante (position 356 à 375 d'après Albert, et al 1992, Science 257 (5076), 1491-1495) :

ATG ATA ATG AAT GGG TGT TC

nucléotides, notamment 20 à 25 nucléotides, comprise dans la séquence SEQ ID ? 25 suivante (position 15409 à 15430 d'après Hurst, et al., 1999. Gene 239 : 237-242) :

18. Fragment d'ADN tel qu'amplifié à l'aide des couples d'amorces selon la revendication 17, et comprenant environ 100 à environ 500 paires de base.

19. Fragment d'ADN selon la revendication 18, caractérisé en ce qu'il présente une identité de séquence d'au moins 80%, préférentiellement 90% et avantageusement 95% avec l'une au moins des séquences contenues dans : - la SEQ ID N023 suivante :

GCCBWWHDWR VVRCAYSTKB BBMWTRVWKH MRATCWYRWT GCSCGTTRMT CRCVRMRYCK

DBCRBYYTHT TRWVYRCHYM BGGKWSYYYT YHWTKYWTYY TTWYCKYHYR GSKKGYMYDY

MCMRRTRSMA BYDMRRRRSK CYVRMRMBSK MRVMCYVKAY STYGMATTCC AGAGARYMYM

TGYVTYWKVK YSMWRYSHYA THCTMTHADK DATYRCWYMH TKRGAYRKYH RARYATAHRG

CWGTTTATGA ATGTCTCCGC GG dans laquelle R est A ou G, W est A ou T.

CCCTATTGGG ATGTACTATT AAACCTAAAT TGGGGTTATC CGCTAAGAAC TATGGTAGAG

TCCAAGGCCC GCCTCATGGC ATCCAAGTTG AGAGAGATAA ATTGAACAAG TATGGTCGTC

AAAGCTCTGC GCGCTCTACG TCTARAGGAT CTGCGAATCC CCCTGCTTAT ACTAAAACTT

dans laquelle W est A ou T, V est A, C ou G, H est A, C ou T, Y est C ou T, M est A ou C, S est C ou G, K est G ou T, R est A ou G, N est A, C, G ou T, D est A, G ou T, B est C, G ou T, - ou la SEQ ID ? 30 suivante :

TVRRMYACCC HTWYAYYAYC ATYGG

BMYTWTWYTG RVYYCTRGYM GCVRACMTHC TNAYHCTHAC MTGAATYGGR RGVMWACCHG

TMRTYCCYHT MCTMCAYAHM TCYAARCAAC RMRSMMTRAY MTTYCGMCCM CTMWSCCAAW

TCMRTYCYAA YAAACTWGGM GGHGTMCTHG CCCTMKYMBY MTCNRTCCTV RTYCTHDYHV

RWHACHCCHC CHCAWATCAA RCCHGARTGA TAYTTYYTAT TYGCMTAYRC MATYYTHCGM

RYHCTRTTCK CMCCMRACCT CCTMGGVGAC CCRGAHAAYT WYACVCYWGC MAAYCCMYTM

TACTWYWCMW WYAARGACVY YYTNGGMTTN VYHSYYWTMC THMYYKBHMT RAYAYYMYTA

WCVGGVTCHA AYAACCCMVY AGGHATYWMM TCMSAYKYHG AYAAAATYHC MTTYCACCCH

KBRAT dans laquelle B est C, G ou T, W est A ou T, H est A, C ou T, D est A, G ou T, R est A ou G, V est A, Cou G, Y est C ou T, S est C ou G, K est G ou T, M est A ou C, - ou la SEQ ID ? 26 suivante :