FR2975698A1 - Amorces universelles et leur utilisation pour la detection et l’identification d’especes mollusques et/ou arthropodes - Google Patents

Abstract

La présente invention concerne des oligonucléotides et leur utilisation comme amorces universelles pour la détection et l'identification d'espèces mollusques et/ou arthropodes, notamment dans des substrats complexes et dégradés. La présente invention concerne également un procédé de détection et d'identification des espèces mollusques et/ou arthropodes dans des échantillons collectés dans l'environnement (sol, eau, fèces). La présente invention propose également un kit en vue de cette détection.

Description

La présente invention concerne des oligonucléotides et leur utilisation comme amorces universelles pour la détection et l'identification d'espèces de mollusques et arthropodes, notamment dans des substrats complexes et dégradés. L'identification taxonomique basée sur l'analyse de l'ADN est une approche couramment utilisée aujourd'hui pour identifier des espèces au sein d'un mélange. Un consortium international nommé Barcode for Life a été créé avec comme objectif de permettre la détection d'espèces animales ou végétales à partir d'une séquence d'ADN. Pour identifier les animaux, l'approche consiste à amplifier puis à séquencer une séquence de 648 paires de base du gène mitochondrial cytochrome c oxidase 1 ("CO1"). CO1 s'est montré efficace pour l'identification des oiseaux, papillons, poissons, mouches et autres groupes animaux (Hebert et al., 2003). Pour les végétaux, la situation est plus complexe et deux autres séquences d'ADN chloroplastiques, matK and rbcL, ont été proposées (Hollingsworth et al., 2009). Il s'avère néanmoins que les fragments choisis selon cette méthode sont de longueur trop longue (supérieure à 500 nucléotides) pour être utilisés dans des substrats dégradés. Or, dans de très nombreuses situations, les substrats à analyser contiennent de l'ADN dégradé, avec souvent des fragments de moins de 100 nucléotides. C'est le cas notamment des échantillons collectés dans l'environnement (sol, eau, fèces) ou des matrices utilisées dans l'industrie, par exemple les farines animales ou les plats industriels de l'industrie alimentaire. Une solution pour la détection et l'identification spécifique consiste à analyser des fragments d'ADN informatifs de petite taille (Poinar et al., 1998; Willersley et al., 2003 ; Willersley et al., 2007). Des amorces ont ainsi été définies afin d'amplifier des fragments d'ADN végétaux plus courts dans des échantillons de sols gelés. Néanmoins, les amorces permettent d'identifier les familles mais pas les espèces végétales. En outre, les amorces n'ont pas été choisies de manière à amplifier des séquences suffisamment conservées dans le règne végétal pour permettre l'amplification de toute espèce végétale. En d'autres mots, ces amorces ne sont pas véritablement universelles. WO 2006/024751 décrit un procédé permettant de détecter simultanément dans un échantillon de matière biologique la présence éventuelle de matières biologiques par réaction de polymérisation en chaîne (PCR) puis hybridation avec des sondes. Les amorces décrites sont très dégénérées (pratiquement chaque codon comporte un nucléotide dégénéré) et manquent par conséquent de spécificité pour l'amplification de l'ADN de vertébrés. Le brevet EP1797201 propose des oligonucléotides permettant la détection et l'identification de végétaux dans des substrats complexes ou dégradés car la région amplifiée est à la fois courte et très variable. Plus précisément, la région amplifiée correspond à une région variable de l'intron du gène chloroplastique trnL du tabac. A cet égard, référence est faite également à l'article de Taberlet et al., 2007.

Les amorces décrites dans ce brevet sont spécifiques des espèces végétales et elles ne permettent pas l'identification et la détection des espèces de mollusques et arthropodes dans des substrats complexes ou dégradés. La présente invention propose de nouveaux oligonucléotides et leurs utilisations comme amorces universelles pour l'identification et la détection des espèces mollusques et/ou arthropodes. Ces amorces permettent à la fois d'amplifier une région courte (moins de 45 paires de base), une région très variable entre les espèces mollusques - arthropodes et une région présentant dans le même temps des régions flanquantes très conservées permettant l'amplification à l'aide une seule et unique paire d'amorces. Ainsi ces amorces peuvent être utilisées dans des mélanges complexes et dégradés, par exemple des échantillons de sols, de fèces et d'eau. De telles amorces trouvent des applications dans l'analyse de l'ADN environnemental De telles amorces trouvent également des applications dans l'analyse des plats industriels susceptibles de contenir des mélanges de mollusques (escargots, seiches, calmars) et/ou arthropodes (crustacés). Enfin de telles amorces trouvent des applications en agriculture par exemple pour l'identification de ravageurs. Plus précisément, ces amorces permettent d'amplifier une région 16S de l'ADN mitochondrial. Il est particulièrement intéressant de disposer d'amorces permettant l'amplification d'ADN mitochondrial car celui-ci représente une cible très accessible dans le cas de substrats dégradés. De plus, l'ADN mitochondrial est présent de manière répétée dans chaque cellule. Les amorces universelles objet de la présente invention sont particulièrement avantageuses car elles sont extrêmement spécifiques des mollusques et arthropodes et n'amplifient aucun autre groupe taxonomique.

Description de l'invention La présente concerne une paire d'oligonucléotides, selon laquelle le premier oligonucléotide s'hybride de manière sélective à la séquence SEQ ID NO. 3 et le deuxième nucléotide s'hybride de manière sélective à la séquence SEQ ID NO. 4 dans des conditions de stringences suffisantes pour l'amplification d'une région variable du gène mitochondrial 16S des mollusques et arthropodes par réaction de polymérisation en chaîne (PCR). Selon un aspect de l'invention, la région amplifiée du gène mitochondrial 16S comporte moins de 45 nucléotides, par exemple moins de 10 42 nucléotides. Selon un autre aspect de l'invention, le premier oligonucléotide présente une séquence nucléotidique SEQ ID NO. 1 ou SEQ ID NO.40-43 et le deuxième oligonucléotide présente une séquence nucléotidique SEQ ID NO. 2 ou SEQ ID NO.44-59. 15 Selon un autre aspect encore de l'invention, la région amplifiée par réaction de polymérisation en chaîne présente une séquence nucléotidique sélectionnée dans le groupe consistant en SEQ ID NOS. 9-39.

20 La présente invention concerne également un mélange d'amorces pour l'amplification d'une région variable du gène mitochondrial 16S des mollusques et arthropodes par réaction de polymérisation en chaîne (PCR) comprenant les amorces d'amplification selon SEQ ID NO.1 et SEQ ID NO.2, et une amorce de blocage selon SEQ ID NO.5. 25 La présente invention propose un procédé d'amplification d'une région du gène mitochondrial 16S d'espèces mollusques ou arthropodes, comprenant les étapes suivantes : a) on dispose d'un échantillon susceptible de contenir de l'ADN 30 d'espèces mollusques et/ou arthropodes ; b) on réalise une réaction d'amplification en chaîne en utilisant une paire d'oligonucléotides selon l'invention ou un mélange d'amorces selon l'invention.

La présente invention propose aussi un procédé de détection d'une espèce mollusque et/ou arthropode dans un échantillon, comprenant les étapes suivantes : a) on dispose d'un échantillon susceptible de contenir de l'ADN 5 d'espèces mollusques et/ou arthropodes ; b) on isole l'ADN total contenu dans l'échantillon ; c) on réalise une réaction d'amplification en chaîne en utilisant une paire d'oligonucléotides selon l'invention ou un mélange d'amorces selon l'invention; et 10 d) on détecte l'éventuelle présence d'un produit d'amplification.

L'invention se rapporte également à un procédé de détection et d'identification d'une espèce mollusque et/ou arthropode dans un échantillon, comprenant les étapes suivantes : 15 a) on dispose d'un échantillon susceptible de contenir de l'ADN d'espèces mollusques et/ou arthropodes ; b) on isole l'ADN total contenu dans l'échantillon ; c) on réalise une réaction d'amplification en chaîne en utilisant une paire d'oligonucléotides selon l'invention ou un mélange d'amorces selon 20 l'invention; d) on détecte la présence d'un produit d'amplification ; et e) on détermine la séquence du produit d'amplification pour identifier l'espèce mollusque et/ou arthropode contenue dans l'échantillon.

25 L'invention concerne aussi un kit pour la détection d'une espèce mollusque et/ou arthropode dans un échantillon, comprenant une paire d'oligonucléotides selon l'invention ou un mélange d'amorces selon l'invention et au moins un réactif additionnel. Selon un aspect de l'invention, le kit comprend une autre paire 30 d'oligonucléotides selon laquelle le premier oligonucléotide présente la séquence SEQ ID NO.6 et le second oligonucléotide présente la séquence SEQ ID NO.7. Selon un autre aspect de l'invention, le kit comprend en outre une amorce de blocage selon la séquence SEQ ID NO.8. 35 L'invention concerne enfin l'utilisation d'au moins une partie de la région du gène mitochondrial 16S des mollusques et arthropodes correspondant aux positions 12924 à 12996 du gène 16S mitochondrial de Drosophila melanogaster (NC_001709) pour détecter des espèces de mollusques et/ou arthropodes. Selon un aspect de l'invention, la partie de ladite région correspond à la région variable correspondant aux positions 12941 à 12977 du gène 16S mitochondrial de Drosophila melanogaster (NC_001709) et est sélectionnée dans le groupe consistant en SEQ ID NOS. 9-39.

Description du listaqe de séquences SEQ ID NO.1 : amorce MAV F SEQ ID NO.2 : amorce MAV R SEQ ID NO.3 : séquence de la région complémentaire de l'amorce MAV_F SEQ ID NO.4 : séquence de la région complémentaire de l'amorce MAV R 15 SEQ ID NOS.5, 8 : amorces de blocage SEQ ID NOS.6-7 : paire d'amorces d'amplification additionnelles pouvant être ajoutées au kit de détection selon l'invention SEQ ID NOS.9-39 : exemples de séquences variables amplifiées de différentes espèces de mollusques et arthropodes 20 SEQ ID NOS. 40-43 : variants de l'amorce MAV_F SEQ ID NOS. 44-59 : variants de l'amorce MAV R SEQ ID NOS. 60-62 : séquences variables identifiées dans l'exemple

Paire d'oliqonucléotides 25 La présente invention concerne donc des oligonucléotides dérivés de deux régions conservées d'un gène 16S mitochondrial présent chez les mollusques et arthropodes. Ces oligonucléotides peuvent être utilisés comme amorces pour l'amplification et donc la détection de l'ADN de mollusques et arthropodes dans un échantillon susceptible de contenir un tel ADN. En effet, 30 les régions conservées dont sont dérivés les polynucléotides de la présente invention flanquent une région à la fois courte et très variable de l'ADN des mollusques et/ou arthropodes, plus précisement une région courte et variable dans le gène 16S mitochondrial des mollusques et/ou arthropodes. La variablité de cette région entre espèces de mollusques et arthropodes peut 35 donc être utilisée pour détecter et identifier les espèces de mollusques et/ou arthropodes.

Selon la présente invention, on entend par « oligonucléotide » une chaîne nucléotidique simple brin ou son complémentaire pouvant être de type ADN ou ARN, ou une chaîne nucléotidique double brin pouvant être de type ADN complémentaire ou génomique. Selon un mode réalisation, les oligonucléotides de l'invention sont de type ADN, notamment ADN double brin. Le terme « oligonucléotide » désigne également les polynucléotides modifiés. Les oligonucléotides modifiés sont par exemple des oligonucléotides conjugués à des réactifs de liaison (biotine par exemple) ou à des réactifs marqués (marqueurs fluorescents par exemple). Classiquement, les réactifs de liaison ou les réactifs marqués conjugués aux oligonucléotides facilitent la purification ou la détection de ces oligonucléotides. Les oligonucléotides de la présente invention peuvent être préparés par synthèse chimique ou par des techniques classiques de biologie moléculaire telles que décrites par Sambrook, Fristsch et Maniatis, dans leur ouvrage intitulé "Molecular cloning: a laboratory manual", édition : Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989. Les oligonucléotides de la présente invention peuvent également être isolés ou purifiés de leur environnement naturel. Le terme « polynucléotide » peut ici être utilisé en remplacement du 20 terme « oligonucléotide » avec une signification équivalente. On entend par « amorce » une courte séquence d'oligonucléotides qui, hybridée avec une matrice d'acide nucléique, permet à une polymérase d'entamer la synthèse d'un nouveau brin de l'ADN. Le brin produit à partir de l'amorce est complémentaire au brin utilisé comme matrice. Les amorces sont 25 notamment utilisées dans les réactions de polymérisation en chaîne (PCR). On entend par « espèce mollusque » et « espèce arthropode » tout organisme faisant respectivement partie du règne mollusque ou du règne arthropode. La présente invention concerne donc une paire d'oligonucléotides 30 selon laquelle le premier oligonucléotide s'hybride de manière sélective à une région très conservée du gène mitochondrial 16S des mollusques et/ou arthropodes et le deuxième nucléotide s'hybride de manière sélective à une autre région très conservée du gène mitochondrial 16S des mollusques et/ou arthropodes dans des conditions de stringences suffisantes pour l'amplification 35 de la région variable du gène mitochondrial 16S des mollusques et/ou arthropodes par réaction de polymérisation en chaîne (PCR), par exemple dans des conditions de forte stringence. La séquence de la première région conservée correspond à la séquence de l'amorce MAV_F (SEQ ID NO. 1) et de sa séquence complémentaire (SEQ ID NO. 3). La séquence de la deuxième région conservée correspond à la séquence de l'amorce MAV_R (SEQ ID NO.2) et de sa séquence complémentaire (SEQ ID NO. 4). A titre d'exemple, chez Drosophila melanogaster, le premier oligonucléotide de la présente invention se trouve aux positions 12923 à 12940 de la séquence NC_001709 et le second oligonucléotide de l'invention se trouve aux positions 12978 à 12997 de cette même séquence.

L'homme du métier connaît les réactions d'amplification d'ADN et les conditions de stringence permettant une amplification sélective d'une séquence. L'homme du métier connaît en particulier les conditions de température d'hybridation et les conditions de composition du tampon d'hybridation.

L'homme du métier pourra donc facilement définir différentes variantes des amorces MAV F - (SEQ ID NO. 1) et MAV R - (SEQ ID NO. 2) en utilisant des techniques de routine. Ces variantes s'hybrident aux séquences de référence et permettent l'amplification sélective de la région variable d'intérêt de l'ADN mitochondrial 16S.

Des variantes possibles de l'amorce MAV_F (SEQ ID NO. 1) sont représentées aux SEQ I D NOS. 40-43. Certaines variantes possibles de l'amorce MAV R - (SEQ ID NO.2) sont représentées aux SEQ ID NOS. 44-59. Habituellement, les variations de séquence sont plutôt introduites à l'extrémité 5' des oligonucléotides pour ne pas compromettre la réaction d'amplification.

Classiquement, on peut par exemple introduire des nucléotides supplémentaires à l'extrémité 5' des oligonucléotides. Par « séquence capable de s'hybrider de manière sélective » ou « oligonucléotide capable de s'hybrider de manière sélective », on entend selon l'invention les séquences qui s'hybrident avec la séquence de référence à un niveau supérieur au bruit de fond de manière significative. Le niveau du signal généré par l'interaction entre la séquence capable de s'hybrider de manière sélective et les séquences de référence est généralement 10 fois, de préférence 100 fois plus intense que celui de l'interaction des autres séquences d'ADN générant le bruit de fond. Les conditions d'hybridation stringentes permettant une hybridation sélective sont connues de l'homme du métier. En général, la température d'hybridation et de lavage est inférieure d'au moins 5°C, par exemple 10°C, au Tm de la séquence de référence à un pH donné et pour une force ionique donnée. Typiquement, la température d'hybridation est d'au moins 30°C pour un polynucléotide de 15 à 50 nucléotides et d'au moins 60°C pour un polynucléotide de plus de 50 nucléotides. A titre d'exemple, l'hybridation est réalisée dans le tampon suivant : 6X SSC, 50 mM Tris-HCI (pH 7.5), 1 mM EDTA, 0.02% PVP, 0.02% Ficoll, 0.02% BSA, 500 pg/ml sperme de saumon denaturé DNA. Les lavages sont par exemple réalisés successivement à faible stringence dans un tampon 2X SSC, 0,1% SDS, à moyenne stringence dans un tampon 0,5X SSC, 01% SDS et à forte stringence dans un tampon 0,1X SSC, 0,1%SDS. L'hybridation peut bien entendu être effectuée selon d'autres méthodes usuelles connues de l'homme du métier (voir notamment Sambrook, Fristsch et Maniatis, dans leur ouvrage intitulé "Molecular cloning: a laboratory manual", édition : Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989).

Par « stringence », on entend la rigueur des conditions opératoires (notamment la température et la force ionique) dans lesquelles se déroule une hybridation moléculaire. Le paramètre déterminant dans la spécificité et la réversibilité de l'hybridation moléculaire est le Tm ou température de fusion (melting temperature). C'est la température à laquelle la moitié de l'ADN est sous forme monobrin et l'autre moitié sous forme double brin. Le Tm dépend de nombreux facteurs tels que la longueur du fragment d'ADN considéré, sa richesse en cytosines et guanines et la concentration en sels, notamment en ion Na du milieu réactionnel. En pratique, l'expérimentateur peut créer ou supprimer l'hybridation moléculaire en choisissant une température du milieu réactionnel inférieure, égale ou supérieure au Tm. Les conditions de forte stringence sont celles pour lesquelles la température d'hybridation et de lavage est inférieure d'au moins 5°C et jusqu'à moins 10°C au Tm de la séquence de référence à un pH donné et pour une force ionique donnée.

Par « amplification », on entend toute amplification enzymatique in vitro d'une séquence définie d'ADN, notamment du type réaction de polymérisation en chaîne (ou Polymerase Chain Reaction, PCR). Les amorces selon l'invention peuvent en outre comporter des étiquettes qui vont permettre d'identifier rapidement l'appartenance de chaque séquence amplifiée à un échantillon de départ. Le terme « queue » peut être utilisée de manière équivalente, à la place du terme « étiquette » (« tags » en anglais). Les étiquettes sont de courtes séquences nucléotidiques, généralement de longueur inférieure à 10 nucléotides. Ces étiquettes sont particulièrement utiles lorsqu'il s'agit d'utiliser des séquenceurs de nouvelle génération qui permettent de séquencer près de 100 000 séquences à la fois.

En effet, chaque étiquette correspondant à un échantillon de départ à analyser, on peut ainsi mélanger plusieurs produits d'amplification avant de procéder au séquençage. Ceci est avantageux car mettre en oeuvre un séquençage via un séquenceur de nouvelle génération peut s'avérer être une opération coûteuse. Dans la pratique, les amorces selon l'invention peuvent comporter un fragment nucléotidique additionnel du coté 5' spécifique de chaque échantillon. Après amplification de plusieurs échantillons, mélange des différents produits d'amplification ainsi obtenus, et séquençage, chaque séquence amplifiée est ainsi facilement assignée à un échantillon de départ. Les étiquettes constituent donc un outil particulièrement avantageux lorsqu'il s'agit de séquencer à haut débit (Binladen et al., 2007). Habituellement, l'amplification comporte des cycles successifs (généralement de 20 à 40) d'amplification, eux-mêmes composés de trois phases: après une étape de dénaturation (séparation des deux brins de la double hélice) de l'ADN, le positionnement des amorces (courtes séquences d'oligonucléotides spécifiquement choisies) en face de leurs séquences complémentaires, sur les brins d'ADN, et leur fixation sur ces cibles constitue la deuxième phase du procédé (hybridation). La phase d'extension fait intervenir une enzyme, l'ADN polymérase, qui synthétise, à partir des amorces, le brin complémentaire de celui ayant servi de matrice. La répétition de ce cycle conduit à l'amplification exponentielle du fragment d'ADN, également appelé produit d'amplification ou ADN amplifié. Selon un aspect de l'invention, l'hybridation s'effectue à une température comprise entre 45 et 65°C. Notamment, l'hybridation peut s'effectuer à une température comprise entre 45 et 60°C lorsque les amorces ne comportent pas d'étiquette. Alternativement, l'hybridation peut s'effectuer à une température comprise entre 50 et 65°C lorsque les amorces comportent une étiquette. Selon un autre aspect, l'invention concerne une paire d'oligonucléotides, selon laquelle le premier oligonucléotide s'hybride de manière sélective à la séquence SEQ ID NO. 3 et le deuxième nucléotide s'hybride de manière sélective à la séquence SEQ ID NO. 4 dans des conditions de stringences suffisantes pour l'amplification d'une région variable du gène mitochondrial 16S de Drosophila melanogaster (NC_001709) dont la séquence est représentée à la SEQ ID NO.39 et qui peut être utilisée comme séquence de référence. Selon un aspect de l'invention, la paire d'oligonucléotides permet l'amplification d'une région du gène mitochondrial 16S qui comporte moins de 45 nucléotides, en particulier moins de 42 (par exemple 41 nucléotides) ou moins de 40 nucléotides, amorces non comprises (c'est-à-dire sans compter la longueur des amorces). Disposer d'une paire d'amorce universelle qui permette l'amplification d'une région variable courte est très avantageuse car l'utilisation de telles amorces dans des substrats complexes ou dégradés permet la détection et si besoin l'identification des espèces dans de tels substrats. Les amorces de la présente invention permettent de détecter et identifier plus de 10602 taxons de l'embranchement mollusque et de l'embranchement arthropode. Les tableaux 1 et 2 donnés à la partie expérimentale représentent une partie des séquences susceptibles d'être amplifié avec les amorces de la présente invention. Selon un aspect de la présente invention, la région amplifiée par réaction de polymérisation en chaîne présente une séquence nucléotidique sélectionnée dans le groupe consistant en l'une quelconque des SEQ ID NOS. 9-38. La présente invention concerne également un mélange d'amorces pour l'amplification d'une région variable du gène mitochondrial 16S des mollusques et/ou arthropodes par réaction de polymérisation en chaîne (PCR) comprenant les amorces d'amplification MAN F, MAV _R et l'amorce de blocage selon SEQ ID 5. Alternativement, l'invention concerne également un mélange d'amorces pour l'amplification d'une région variable du gène mitochondrial 16S des mollusques et/ou arthropodes par réaction de polymérisation en chaîne (PCR) comprenant les amorces d'amplification MAV _F et MAV R et une autre paire d'amorces d'amplification selon SEQ ID NO.6 et SEQ ID NO.7.

Procédés mettant en oeuvre la paire d'oliqonucléotides La présente invention concerne également un procédé d'amplification d'une région du gène mitochondrial 16S des mollusques et/ou 35 arthropodes, comprenant les étapes suivantes : a) on dispose d'un échantillon contenant de l'ADN de mollusques et/ou arthropodes ; b) on réalise une réaction d'amplification en chaîne en utilisant une paire d'oligonucléotides selon l'invention.

L'échantillon à partir duquel la réaction d'amplification est réalisée peut être collecté dans l'environnement. Dans ce cas, il peut par exemple s'agir d'un échantillon de sol, eau ou fèces. Un avantage du procédé selon l'invention utilisant les amorces ci-dessus décrites est que l'ADN contenu dans l'échantillon peut se trouver sous forme dégradée. Cela est principalement dû au fait que les amorces ont été choisies de manière à ce que la région amplifiée soit courte, par exemple de longueur inférieure à 45 paires de bases. Selon un aspect de l'invention, l'hybridation s'effectue à une température comprise entre 45 et 65°C. En fonction du fait que les paires d'oligonucléotides de l'invention comporte ou non une étiquette tel que cela est décrit précédemment, les conditions de l'amplification, en particulier la température d'hybridation, peut ou non varier. Notamment, l'hybridation peut s'effectuer à une température comprise entre 45 et 60°C lorsque les amorces ne comportent pas d'étiquette. Par exemple, on peut utiliser une température de 51-53°C. Alternativement, l'hybridation peut s'effectuer à une température comprise entre 50 et 65°C lorsque les amorces comportent une étiquette. Par exemple, on peut utiliser une température de 57-58°C. L'homme du métier sait adapter la température d'hybridation aux amorces utilisées. Le procédé d'amplification selon l'invention peut nécessiter une étape d'extraction de l'ADN avant d'effectuer l'amplification. On utilise alors par exemple pour cela un kit d'extraction disponible dans le commerce. La présente invention propose également un procédé de détection d'une espèce de mollusques et/ou arthropodes dans un échantillon. Ce procédé de détection selon l'invention comprend les étapes suivantes : a) on dispose d'un échantillon susceptible de contenir de l'ADN d'espèces mollusques et/ou arthropodes ; b) on isole l'ADN total contenu dans l'échantillon ; c) on réalise une réaction d'amplification en chaîne en utilisant une paire d'oligonucléotides selon l'invention ; et d) on détecte l'éventuelle présence d'un produit d'amplification.

L'invention se rapporte aussi à un procédé de détection et d'identification d'une espèce de mollusques et/ou arthropodes dans un échantillon, comprenant les étapes suivantes : a) on dispose d'un échantillon susceptible de contenir de l'ADN 5 d'espèces mollusques et/ou arthropodes ; b) on isole l'ADN total contenu dans l'échantillon ; c) on réalise une réaction d'amplification en chaîne en utilisant une paire d'oligonucléotides selon l'invention ; d) on détecte la présence d'un produit d'amplification ; et 10 e) on détermine la séquence du produit d'amplification pour identifier l'espèce de mollusque et/ou arthropode contenue dans l'échantillon. L'étape de détermination de la séquence correspond au séquençage de celle-ci. Les méthodes et outils de séquençage sont connus de l'homme du métier et un exemple de ce qui peut être utilisé dans la présente invention est donné 15 dans la partie expérimentale.

Kit de détection L'invention a également trait à un kit pour la détection d'une espèce de mollusques et/ou arthropodes dans un échantillon, ledit kit comprenant une 20 paire d'oligonucléotides selon l'invention. Selon un aspect de l'invention, le kit comprend en outre une amorce de blocage selon l'une quelconque de SEQ ID NO. 5 et 8. Utiliser une amorce de blocage est utile lorsqu'il s'agit d'éviter l'amplification d'une espèce déterminée, par exemple les mammifères. Ces amorces sont choisies à partir 25 de l'extrémité la plus variable du fragment amplifié, et de manière à ce que l'amorce de blocage se chevauche avec l'amorce d'amplification sur au moins 6 nucléotides, par exemple sur 8 nucléotides. Enfin, il est nécessaire que le Tm de l'amorce de bloquage soit nettement supérieur à celui des amorces d'amplification (au moins 5°C, par exemple 10°C). 30 Selon un autre aspect encore de l'invention, le kit comprend au moins une autre paire d'oligonucléotides. Cette au moins une autre paire d'oligonucléotides peut être alors utilisée à titre de vérification du contenu de l'échantillon ou à titre d'alternatives, par exemple si la paire d'oligonucléotides MAV F (SEQ ID NO. 1) et MAV R (SEQ ID NO. 2) ne permettait pas 35 l'amplification.

Selon un autre aspect encore de l'invention, le kit comprend en outre une étiquette de moins de 10 nucléotides pour l'identification de l'échantillon de départ après séquençage du produit PCR. Le kit selon l'invention peut également en outre contenir de manière non limitative des réactifs additionnels, par exemple une enzyme DNA polymerase, des dNTP, du Tris-HCI, du KCI, du MgCl2 ou du Bovine Serum Albumin (BSA).

Utilisations La présente invention concerne également l'utilisation d'au moins une partie de la région du gène mitochondrial 16S des mollusques et arthropodes correspondant aux positions 12924 à 12 996 du gène 16S mitochondrial de Drosophila melanogaster (NC_001709) pour détecter des espèces de mollusques et/ou arthropodes.

Selon un aspect de l'invention, ladite partie de la région du gène mitochondrial 16S des mollusques et/ou arthropodes correspond à la région variable, par exemple aux positions 12941 à 12977 du gène mitochondrial 16S de Drosophila melanogaster (NC_001709) pour détecter et/ou identifier des espèces de mollusques et/ou arthropodes. Par exemple, cette région variable est sélectionnée dans le groupe consistant en SEQ ID NO.9-39 ou 60-62. A partir de la séquence du gène 16S de Drosophila melanogaster (NC_001709) et des positions indiquées, l'homme du métier sait comment identifier les séquences correspondantes dans d'autres espèces mollusques et/ou arthropodes.

Exemple 1 Matériels et méthodes PCR Les amorces MAV ont été testées pour l'analyse du régime alimentaire de l'ours brun (Ursus arctos) en utilisant des fèces comme source d'ADN, avec comme objectif de révéler les espèces de mollusques et d'arthropodes entrant dans la composition de son alimentation. Les extractions d'ADN ont été effectuées à partir de 15 mg de matière, en 35 utilisant un kit d'extraction classique et en suivant les instructions du fabricant (DNeasy Blood and Tissue Kit, QlAgen GmbH, Hilden, Germany).

Les extraits d'ADN ont été récupérés dans un volume de 250 pL. Les amplifications d'ADN ont été faites dans un volume de 20 pL, en utilisant 2 pL d'extrait par réaction. Le mélange d'amplification contenait 1 U d'AmpliTaq Gold DNA Polymerase (Applied Biosystems, Foster City, CA), 10 mM Tris-HCI, 50 mM KCI, 2 mM MgCl2, 0.1 mM de chaque dNTP, 0.2 pM de chaque amorce (MAV F/R + une étiquette ou fragment additionnel de 6 nucléotides du côté 5' spécifique de chaque échantillons), 2 pM de l'amorce de bloquage des vertébrés (SEQ ID NO.5), et 5 pg de "bovine serum albumin" (BSA, Roche Diagnostic, Basel, Switzerland).

Le mélange PCR a été dénaturé pendant 10 min à 95°C, suivi de 45 cycles de 30 s à 95°C (dénaturation) et 30 s à 55°C (hybridation). Comme les séquences cibles sont plus courtes que 50 paires de bases, l'étape d'élongation a été supprimée de manière à réduire la production de l'artefact +A (Brownstein et al. 1996; Magnuson et al. 1996) qui réduit l'efficacité de la première étape de séquençage (ligation à bouts francs).

Séquençaqe Le séquençage a été effectué sur un séquenceur Roche GS Junior (Roche Diagnostic), en utilisant GS FLX Titanium Rapid Library Preparation kit, GS Junior Titanium emPCR kit (Lib-L), GS Junior Titanium Sequencing kit, en suivant les instructions du fabriquant. Les lectures ont été analysées avec les OBITools (http://www.prabi.grenoble.fr/trac/OBITools): (i) les amorces et les fragments additionnels pour identifier les échantillons ont 25 été identifiés avec le programme ngsfilter; (ii) seules les régions amplifiées, sans les amorces, ont été conservées pour les analyses ultérieures; (iii) les séquences strictement identiques ont été regroupées avec le programme obiuniq; 30 (iv) les séquences plus courtes que 10 paires de bases, ou contenant des ambiguïtés, ont été retirées avec le programme obigrep; (v) l'assignation à un taxon a été réalisée avec le programme ecoTag (Pégard et al. 2009); ce programme est basé sur FASTA35 (Pearson et Lipman 1988) pour trouver des séquences hautement similaires dans une base de référence 35 qui a été construite à partir des données EMBL en utilisant le programme ecoPCR (Ficetola et al. 2010).

Résultats Lors de cette expérimentation, les séquences suivantes ont pu être identifiées: Formica sp. SEQ ID NO.61 Camponotus sp. SEQ ID NO.62 Lasius sp. SEQ ID NO.60

Le tableau ci-dessous présente les nombre de chaque séquence obtenue pour les trois échantillons (expérience avec l'amorce de blocage pour les vertébrés). Fèces 1 (B21) Fèces 2 (A24) Fèces 3 (B22) Formica sp. 239 5 - Camponotus sp. - 235 - Lasius sp. - - 338 Ursus arctos - 8 - Discussion Ces résultats démontrent clairement que le système fonctionne, même pour 15 l'analyse d'ADN très dégradé comme celui issu de fèces de carnivores. Les trois genres Formica, Camponotus, et Lasius sont des genres de fourmis régulièrement consommés par l'ours brun.

20 16 Tableau 1 - Mollusques Tableau élaboré à partir de la version 103 de la base de données EMBL Nom scientifique Numéro Séquence Séquence amplifiée Séquence correspondant d'accession correspondant à à MAV F MAV _R Arion alpinus AY947346 CCAACATCGAGGTCACAA TCTTAATTATAAATTATG AACTACCTAAGGGATAACAG (SEQ ID NO.9) Clausilia bidentata AF012082 CCAACATCGAGGTCACAA TCTTAAATGAAAAATTATG AATTACTATAGGGATAACAG (SEQ ID NO.10) Conus abbreviatus AF174140 CCAACATCGAGGTCACAA ACCTTTTTTTCGATATGGGCTCTCAAAAAAGATAATG AGTTACCGTAGGGATAACAG (SEQ ID NO.11) Crassostrea angulata EU672832 TCAACATCGAGGTGCCAA TCCCTTTAGCCAATACGAACTCTACTAAAGGATTAGC AGTTACGCCGGGGATAACAG (SEQ ID NO.12) Crepidula adunca AF545987 CCAACATCGAGGTCACAA ACCTTTTTTTCGATTAGAGCTCTCAAAAAAGATAATG AGTTACCGTAGGGATAACAG (SEQ ID NO.13) Dentalium E Q280026 CCAACATCGAGGTCACAA ACTTTATTTAAAATAAGAACTTCAAAATAAAATAGTG AAATACTGTAGGGATAACAG inaequicostatum (SEQ ID NO.14) Helix aperta AY741407 CCAACATCGAGGTCACAA ACTATATAAATTATG AGTTACTCTAGGGATAACAG (SEQ ID NO.15) Littorina aleutica U46788 CCAACATCGAGGTCACAA ACCTTTTTTTCGATGAGAACTCTCAAAAAAGATTATG AGTTACCGTAGGGATAACAG (SEQ ID NO.16) Mya arenaria AF149119 CCAACATCGAGGTCGCAA ACCTTCTTTTCGATTAGTCCTCTAAAAGAAGATAACG AGTTACCCTGGGGATAACAG (SEQ ID NO.17) Mytilus californianus AF023600 CCAACATCGAGGTCGCAA TCTTCCCCTCCAATACCATCTTTCGGGAGAAATTGCG AGTTACTCTAGGGATAACAG (SEQ ID NO.18) Nucella lapillus DQ501582 CCAACATCGAGGTCACAA ACCTTTTTTTCGATTAGAACTCTCAAAAAAGATAATG AGTTACCGTAGGGATAACAG (SEQ ID NO.19) Octopusaegina AB191111 CCAACATCGAGGTCGCAA TCTCTTTTTTCAATATGAACTTTCAAAAAAAATTACG AGTTACCATAGGGATAACAG (SEQ ID NO.20) Patella aspera AF058249 CCAACATCGAGGTCGCAA ACTCTTTTGTTAATAAGAACTCACAAAAAGAATTACG AGTTACCGTAGGGATAACAG (SEQ ID NO.21) Planorbis planorbis AY577476 CCAACATCGAGGTCACAA ACTAAATAATTAATTATG AATTACCTTAGGGATAACAG (SEQ ID NO.22) 17 Pomatiaselegans GQ370419 CCAACATCGAGGTCACAA ACCCTTTTTTCGATATGAACTCTCAAAAAGAATTATG AGTTACCGTAGGGATAACAG (SEQ ID NO.23) Sepia aculeata AF369113 CCAACATCGAGGTCGCAA TCTCATTTTTTAATAAGAACTCTCTAAATAAATTACG AGTTACCATAGGGATAACAG (SEQ ID NO.24) Tapesdorsatus DQ356371 CCAACATCGAGGTCGCAA ACCTTTCCCTCAATAAGATCTTTCAAGAAAGATTACG AGCTACCGCAGGGATAACAG (SEQ ID NO.25) 18 Tableau 2 - Arthropodes Tableau élaboré à partir de la version 103 de la base de données EMBL Nom scientifique Numéro Séquence Séquence amplifiée Séquence correspondant à d'accession correspondant à MAV_F MAV F Aedesaegypti AF034475 CCAACATCGAGGTCGCAA TCTTTTTTCTCGATATGAACTCTAAAAAAAAATTA AGTTACCTTAGGGATAACAG CG (SEQ ID NO. 2 6) Aphisargrimoniae GU205373 TCAACATCGAGGTCGCAA ACTAATTTTTAAATTTGGACTTAAAAAATTAATTA AGTTACTTTAGGGATAACAG CG (SEQ ID NO. 27) Araneusdiadematus FJ525363 TCAACATCGAGGTCGCAA TCATTTTTTTTAATAAGAGCTTTAAAAAAATATTA AGTTACCATAGGGATAACAG CG (SEQ ID NO.28) Astacusastacus AF235983 TCAACATCGAGGTCGCAA ACTTTCTTGTCGATAAGAACTCTCAAAGAAAATTA AGTTACTTTAGGGATAACAG CG (SEQ ID NO.29) Blatta orientalis EF363264 CCAACATCGAGGTCGCAA ACCAATTTATCGATAAGAACTCTCAAAAAAGATTA AATTACCTTAGGGATAACAG CG (SEQ ID NO.30) Bombyx mandarina AB070263 CCAACATCGAGGTCGCAA ACTTTTCTTTTTATTTGAACTAAAAAGAAAAATTA AATTACCTTAGGGATAACAG CG (SEQ ID NO.31) Camponotus AM910848 TCAACATCGAGGTCGCAA TCATTTTTATCAATAAGATCTTTTTAAAAATATTA AATTACCTTAGGGATAACAG herculeanus CG (SEQ ID NO.32) Carcinusaestuarii U74326 TCAACATCGAGGTCGCAA TCTTTTTCTTCGATATGGACTCTTAGAAAAAATTA AGTTACTTTAGGGATAACAG CG (SEQ ID NO. 33) Crangoncrangon EU868649 TCAACATCGAGGTCACAA CTACTCCTGTCGATAAGAACTCTCAAGGAAAATTA AGTTACTTTAGGGATAACAG TG (SEQ ID NO.34) Ixodes abrocomae GU188043 CCAACATCGAGGTCGCAA ACTATTTTATCAATATGAACTTTCCAAAATTATTA AAATACTCTAGGGATAACAG CG (SEQ ID NO.35) Paralamyctesasperulus AY214379 TCAACATCGAGGTCGCAA TCCTTATTATCAATAAGAACTCTCCAATAAGATTA AGTTACTATAGGGATAACAG CG (SEQ ID N0.36) Podismapedestris AF260541 CCAACATCGAGGTCGCAA TCTATTTTGTCGATATGAGCTCTTAAAAATAATTA AGTTACCTTAGGGATAACAG CG (SEQ ID NO.37) Tenebriomolitor AJ438153 CCAACATCGAGGTCGCAA ACTTTTTTATAAATATGAACTTTCCAAAAAAATTA AATTACCTTAGGGATAACAG CG (SEQ ID NO. 38) Drosophila NC_001709 CCAACATCGAGGTCGCAA TCTTTTTTATCGATATGAACTCTCCAAAAAAATTA AGTTACTTTAGGGATAACAG melanogaster CG (SEQ ID NO.39)

Claims (7)

1. REVENDICATIONS1. Paire d'oligonucléotides, selon laquelle le premier oligonucélotide s'hybride de manière sélective à la séquence SEQ ID NO. 3 et le deuxième nucléotide s'hybride de manière sélective à la séquence SEQ ID NO. 4 dans des conditions de stringences suffisantes pour l'amplification d'une région variable du gène mitochondrial 16S des mollusques et arthropodes par réaction de polymérisation en chaîne (PCR).
2. 2. Paire d'oligonucléotides selon la revendication 1, selon laquelle la région amplifiée du gène mitochondrial 16S comporte moins de 45 nucléotides.
3. 3. Paire d'oligonucléotides selon la revendication 1 ou 2, selon laquelle le premier oligonucléotide présente une séquence nucléotidique SEQ ID NO. 1 ou SEQ ID NO.40-43 et le deuxième oligonucléotide présente une séquence nucléotidique SEQ ID NO. 2 ou SEQ ID NO.44-59.
4. 4. Paire d'oligonucléotides selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que la région amplifiée par réaction de polymérisation en chaîne présente une séquence nucléotidique sélectionnée dans le groupe consistant en SEQ ID NOS. 9-39.
5. 5. Mélange d'amorces pour l'amplification d'une région variable du gène mitochondrial 16S des mollusques et arthropodes par réaction de polymérisation en chaîne (PCR) comprenant les amorces d'amplification selon SEQ ID NO.1 et SEQ ID NO.2, et une amorce de blocage selon SEQ ID NO.5.
6. 6. Procédé d'amplification d'une région du gène mitochondrial 16S d'espèces mollusques ou arthropodes, comprenant les étapes suivantes : a) on dispose d'un échantillon susceptible de contenir de l'ADN d'espèces mollusques et/ou arthropodes ; b) on réalise une réaction d'amplification en chaîne en utilisant une paire d'oligonucléotides selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 ou un mélange d'amorces selon la revendication 5.
7. 7. Procédé de détection d'une espèce mollusque et/ou arthropode dans un échantillon, comprenant les étapes suivantes : a) on dispose d'un échantillon susceptible de contenir de l'ADN d'espèces mollusques et/ou arthropodes ; b) on isole l'ADN total contenu dans l'échantillon ; c) on réalise une réaction d'amplification en chaîne en utilisant une paire d'oligonucléotides selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 ou un mélange d'amorces selon la revendication 5; et d) on détecte l'éventuelle présence d'un produit d'amplification.. Procédé de détection et d'identification d'une espèce mollusque et/ou arthropode dans un échantillon, comprenant les étapes suivantes : a) on dispose d'un échantillon susceptible de contenir de l'ADN d'espèces mollusques et/ou arthropodes ; b) on isole l'ADN total contenu dans l'échantillon ; c) on réalise une réaction d'amplification en chaîne en utilisant une paire d'oligonucléotides selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 ou un mélange d'amorces selon la revendication 5; d) on détecte la présence d'un produit d'amplification ; et e) on détermine la séquence du produit d'amplification pour identifier l'espèce mollusque et/ou arthropode contenue dans l'échantillon. 9. Kit pour la détection d'une espèce mollusque et/ou arthropode dans un échantillon, comprenant une paire d'oligonucléotides selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 ou un mélange d'amorces selon la revendication 5 et au moins un réactif additionnel. 10. Kit selon la revendication 9, comprenant une autre paire d'oligonucléotides selon laquelle le premier oligonucléotide présente la séquence SEQ ID NO.6 et le second oligonucléotide présente la séquence SEQ ID NO.7. 11. Kit selon la revendication 10, comprenant en outre une amorce de blocage selon la séquence SEQ ID NO.8. 12. Utilisation d'au moins une partie de la région du gène mitochondrial 16S des mollusques et arthropodes correspondant aux positions 12924 à 12996 du gène 16S mitochondrial de Drosophila melanogaster (NC 001709) pour détecter des espèces de mollusques et/ou arthropodes. 13. Utilisation selon la revendication 12, selon laquelle la partie de ladite région correspond à la région variable correspondant aux positions 12941 à 12977 du gène 16S mitochondrial de Drosophila melanogaster (NC_001709) et est sélectionnée dans le groupe consistant en SEQ ID NOS. 9-39.