FR2832731A1

FR2832731A1 - Procede de fabrication d'une empreinte genetique au moyen d'une puce a adn universelle

Info

Publication number: FR2832731A1
Application number: FR0210772A
Authority: FR
Inventors: Pierre Taberlet
Original assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Commissariat a lEnergie Atomique CEA; Universite Joseph Fourier Grenoble 1
Current assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Universite Joseph Fourier Grenoble 1; Commissariat a lEnergie Atomique et aux Energies Alternatives CEA
Priority date: 2002-08-30
Filing date: 2002-08-30
Publication date: 2003-05-30

Abstract

La présente invention se rapporte à un procédé de fabrication d'une empreinte génétique au moyen d'une puce universelle.La puce universelle utilisée dans la présente invention est une puce d'hybridation d'une collection de fragments d'acides nucléiques extrait d'un organisme comprenant un support sur lequel est fixée une matrice ordonnée de sondes d'acides nucléiques, lesdites sondes comprenant une première et une deuxième parties de séquence, la première partie de séquence étant constante d'une sonde à l'autre et au moins complémentaire au reste d'une séquence d'un site de restriction déterminé, et la deuxième partie de séquence, contiguë à ladite première partie de séquence, étant variable d'une sonde à l'autre et constituée de combinaisons déterminées de bases azotées choisies de telle manière que la matrice ordonnée de sondes comprennent les sondes capables de s'hybrider spécifiquement aux différents fragments d'acide nucléique de ladite collection.Le procédé de la présente invention utilisant cette puce permet de fabriquer une empreinte génétique d'un organisme, et peut être utile pour d'identifier le sexe, la race, la variété, l'espèce etc d'un individu ou d'un produit dérivé issu de cet individu à partir d'un échantillon de son ADN.

Description

PROCEDE DE FABRICATION D'UNE EMPREINTE GENETIQUE
AU MOYEN D'UNE PUCE A ADN UNIVERSELLE DOMAINE TECHNIQUE
La présente invention se rapporte à une puce à acide désoxyribonucléique (ADN) universelle, en particulier à un procédé de fabrication d'une empreinte génétique au moyen de ladite puce universelle, ainsi qu'à différentes utilisations de ladite puce.

Par puce à ADN universelle, on entend une puce à ADN qui, grâce à son procédé de fabrication selon la présente invention, permet d'identifier très facilement et de manière reproductible tout être vivant muni d'ADN. En effet, la présente invention permet d'obtenir facilement et de manière reproductible une empreinte génétique précise d'un individu donné.

La présente invention s'applique aussi bien aux animaux qu'aux végétaux, elle permet par exemple d'identifier le sexe, la race, la variété, l'espèce etc d'un individu ou d'un produit dérivé issu de cet individu à partir de son ADN. Elle s'applique également aux micro-organismes tels que les bactéries, les levures, les algues, etc.

Elle trouve par exemple une application dans la lutte contre les fraudes sur les dénominations ou les appellations dans le domaine de l'alimentaire, par exemple pour caractériser des variétés de plantes, par exemple du raisin, ou à des fins de traçabilité individuelle des animaux, par exemple des viandes bovines.

Elle trouve par exemple aussi une application dans les enquêtes judiciaires, en médecine légale, en fournissant un outil puissant, rapide et facile à mettre en oeuvre pour identifier un individu.

Elle trouve par exemple aussi une application dans l'identification de gènes intervenant dans des caractères génétiques détectables tels que des maladies d'origine génétiques. En effet, une analyse comparative de plusieurs puces à ADN fabriquées selon le procédé de la présente invention à partir de plusieurs individus porteurs et non porteurs d'un caractère génétique détectable peut permettre de localiser sur la puce des fragments d'ADN liés à ce caractère détectable, et parlà même à isoler et identifier les gènes intervenant dans ce ou ces caractère (s).

Il n'existe actuellement aucune biopuce ou technique de fabrication de celle-ci ayant un potentiel aussi large que celui de la présente invention.

ART ANTERIEUR
En raison de l'intérêt porté, notamment par la médecine, la recherche et les industries pharmaceutiques, à la détection et à l'identification des gènes responsables de maladies génétiques, en raison de la crise de confiance actuelle des consommateurs concernant les viandes, notamment bovines, en raison du nombre de fraudes grandissant concernant les appellations d'origine, en raison de l'intérêt porté, notamment par la justice, à un outil de preuve précis et rapide d'identification d'un

individu ou d'un produit dérivé à partir d'un échantillon biologique de celui-ci, de nombreuses recherches ont été menées et sont menées actuellement pour mettre au point des outils fiables et rapides pour l'identification d'un organisme ou d'un extrait de celui-ci et notamment des outils utilisant l'ADN.

L'information génétique est stockée dans chaque cellule des êtres vivants sous la forme de longues molécules d'acide désoxyribonucléique (ADN) constituant le génome. Il est constitué d'un enchaînement de quatre bases azotées appelées nucléotides qui sont l'adénine, la cytosine, la guanine et la thymine notées respectivement A, C, G et T.

Le postulat de départ concernant les méthodes utilisant l'ADN est qu'il est possible d'identifier un individu par son ADN. En effet, hormis les vrais jumeaux ou les clones, chaque individu est unique au plan génétique du fait du brassage des chromosomes au moment de la reproduction. En combinant toutes les différences possibles sur l'ensemble du génome compte tenu du nombre de bases azotées, il apparaît qu'une infinité de combinaisons sont possibles ce qui rend unique du point de vue génétique chaque individu.

De nombreuses méthodes ont été mises au point pour fabriquer des empreintes génétiques permettant de mettre en évidence cette unicité de chaque individu.

Elles peuvent être classées en deux catégories : les méthodes spécifiques et les méthodes universelles.

Les méthodes spécifiques nécessitent des développements techniques importants et différents pour chaque espèce étudiée. L'analyse du polymorphisme des

microsatellites ou de SNPs ("Single Nucleotide Polymorphisms") sont des méthodes spécifiques qui imposent malheureusement des connaissances sur la séquence du génome avant leur mise en oeuvre.

Les méthodes universelles quant à elles ne requièrent que peu de mise au point, et peuvent s'appliquer sans connaissance préalable du génome. Il s'agit des méthodes suivantes : les sondes minisatellites multilocus, les RAPD ( Randomly

Amplified Polymorphic DNA ou ADN polymorphe amplifié de manière aléatoire), les ISSR ( Inter-Simple Sequence Repeat ou inter-séquence simple répétée), les AFLP ( Amplified Fragment Length Polymorphism ou polymorphine de longueur de fragments amplifiés) et plus récémment, la méthode DArT ("Diversity Array Technology"ou technologie de réseau de densité).

Dans le texte qui suit, les références entre crochets [] renvoient à la liste de références annexée.

La méthode utilisant les sondes minisatellites multilocus a été décrite initialement par Alec JEFFREYS par exemple dans les documents [1] et [2]. Elle ne nécessite pas d'amplification et comporte les étapes suivantes : (i) extraction d'ADN génomique, (ii) digestion avec une enzyme de restriction, (iii) migration sur gel d'agarose, (iv) hybridation avec une sonde s'hybridant avec des séquences minisatellites multilocus (méthode southern blot ).

Cette approche présente de nombreux inconvénients, notamment elle est difficilement automatisable, elle demande beaucoup de main d'oeuvre et possède de

nombreuses limitations, par exemple du fait que ne peuvent être comparés que des profils ayant migrés sur un même gel. Aujourd'hui cette méthode est de moins en moins utilisée.

La méthode utilisant les RAPD a été développée au début des années 1990 par WILLIAMS et al. et par WELSH et McCLELLAND. Elle est décrite par exemple dans les documents [3] à [8]. Elle consiste à amplifier par réaction de polymérase en chaîne (PCR) de l'ADN génomique en utilisant des amorces arbitraires, généralement très courtes d'environ 10 paires de bases.

Une seule amorce est utilisée dans la réaction d'amplification. Les fragments issus de l'amplification sont ensuite analysés sur gel d'agarose. Cette technique, bien que largement utilisée, nécessite cependant l'emploi de très nombreuses amplifications par échantillons et s'avère être délicate à mettre en oeuvre en raison de problèmes de reproductibilité.

La technique ISSR est décrite par exemple par ZIETKIEWICZ et al., 1994 ; KANETY et al., 1995 dans les documents [9] et [10]. Elle se rapproche des RAPD par le fait qu'elle utilise également des amorces arbitraires, mais ces amorces sont particulières. Elles correspondent à des séquences microsatellites, avec quelques bases additionnelles du côté 3'. Après extraction, l'ADN génomique est amplifié, au moyen d'une amorce ISSR, puis les fragments sont visualisés sur gels de polyacrylamide. Le niveau de polymorphisme n'est pas toujours suffisant au niveau intraspécifique, et l'analyse des gels est parfois complexe.

La technique AFLP développée par la société KeyGene produit une véritable empreinte génétique. Elle est décrite par exemple par VOS et al., 1995 dans le

document [11] et par AJMONE-MARSAN P. et al., 1998 dans le document [12]. Ici, après extraction, l'ADN est digéré avec deux enzymes de restriction, l'une reconnaissant six paires de bases et coupant peu fréquemment, par exemple ECO RI, et l'autre reconnaissant quatre paires de bases et coupant beaucoup plus fréquemment, par exemple MSE I. En présence de deux adaptateurs spécifiques de ces deux enzymes de restriction, l'étape suivante est la ligation de ces adaptateurs à l'extrémité des fragments de restriction. Ensuite, l'amplification par la méthode PCR se produit en deux étapes : l'amplification présélective, où sont utilisées des amorces ayant une extension d'une paire de base du côté 31, ce qui fait qu'une partie seulement des fragments de restriction avec adaptateurs vont être amplifiés, suivie de l'amplification sélective, où le produit de l'amplification présélective est à nouveau amplifié, mais cette fois-ci avec des amorces possédant une extension de deux paires de bases supplémentaires du côté 31. Ainsi, le génome est simplifié de manière à n'obtenir qu'une centaine de fragments amplifiés, qui sont ensuite analysés sur gel de polyacrylamide. Cette technique présente l'inconvénient que pour chaque individu analysé, il est nécessaire d'utiliser plusieurs couples d'amorces avec des extensions différentes afin d'obtenir une empreinte génétique fiable.

La méthode DArT, publiée très récemment par JACCOUD et al., 2001 dans le document [13], utilise l'approche"puce à ADN"pour révéler des polymorphismes. Dans cette méthode, les fragments d'ADN d'un organisme déposés sur les micromatrices sont produits de la manière suivante : après une digestion par une enzyme de restriction telle que Eco RI, Pst I, et Msp I, des adaptateurs sont fixés par ligation à chaque extrémité des fragments de restriction. Ensuite ces fragments sont amplifiés par PCR en utilisant une seule amorce qui correspond à la séquence de l'adaptateur, la séquence du site de restriction, et de 1 à 3 bases sélectives. Ces fragments PCR sont ensuite clonés, puis déposés sur des micromatrices ( microarrays ). L'analyse de la diversité s'effectue par hybridation de l'ADN d'un échantillon sur ces micromatrices après une préparation similaire à celle des ADN déposés, c'est-à-dire digestion-ligation puis amplification. Le progrès majeur consiste donc à éviter une électrophorèse. Cependant, le choix des sondes à déposer est différent pour chaque espèce différente. La méthode proposée n'est donc pas universelle et difficile à mettre en oeuvre.

De nombreuses techniques ont donc été développées ces dernières années, mais elles présentent toutes encore de nombreux inconvénients tels que ceux précités, notamment qu'elles requièrent pour obtenir une empreinte génétique, à l'exception de la méthode DarT, plusieurs amplifications et plusieurs migrations sur gel avant de fournir un résultat. Ceci entraîne des

problèmes de mise en oeuvre, de reproductibilité, de précision, de coût etc.

De plus ces expérimentations sont difficilement automatisables, surtout au niveau de l'analyse des gels.

En outre, aucune des solutions proposées jusqu'ici n'est vraiment universelle notamment dans les applications précitées, et elles nécessitent des connaissances sur la séquence du génome avant leur mise en oeuvre.

EXPOSE DE L'INVENTION
La présente invention a précisément pour but de fournir une puce à ADN universelle palliant les inconvénients précités, un procédé de fabrication de cette puce universelle permettant d'obtenir par exemple à partir d'une seule amplification une empreinte génétique basée sur des milliers de marqueurs, et des utilisations de cette puce.

La puce à ADN universelle de la présente invention est une puce d'hybridation d'une collection de fragments monocaténaires d'un acide désoxyribonucléique provenant d'un organisme, ladite collection de fragments étant obtenue notamment par digestion dudit acide désoxyribonucléique par au moins une enzyme de restriction ayant un site de restriction déterminé, chaque fragment comprenant un reste de séquence dudit site de restriction et, contiguë audit reste de séquence, une séquence interne propre à chaque fragment ; ladite puce comprenant un support sur lequel est fixée une matrice ordonnée de sondes d'acides

nucléiques, lesdites sondes comprenant une première et une deuxième parties de séquence, la première partie de séquence étant constante d'une sonde à l'autre et au moins complémentaire au reste de la séquence du site de restriction déterminé, et la deuxième partie de séquence, contiguë à ladite première partie de séquence, étant variable d'une sonde à l'autre et constituée de combinaisons déterminées de bases azotées choisies de telle manière que la matrice ordonnée de sondes comprenne les sondes capables de s'hybrider spécifiquement aux différents fragments d'acide nucléique de ladite collection.

Le terme sonde (s) se réfère aux séquences d'acide désoxyribonucléique fixées sur le support pour former la matrice de sondes selon la présente invention. Le terme puce se réfère à l'ensemble matrice de sondes et support, les sondes étant fixées sur le support sous forme de matrice.

Le terme fragment (s) se réfère aux fragments obtenus notamment par digestion de l'ADN extrait de l'organisme par au moins une enzyme de restriction. En effet, l'ADN extrait peut subir selon la présente invention d'autres modifications que la digestion enzymatique avant d'être hybridé aux sondes de la puce de la présente invention. Ces autres modifications sont exposées ci-dessous.

Le support de la puce selon la présente invention peut être l'un quelconque des supports servant à la fabrication des biopuces à ADN connues de l'homme du métier. De tels supports sont décrits par exemple dans la demande EP-1141391 déposée par le COMMISSARTIAT A

L'ENERGIE ATOMIQUE (France). Les méthodes de fixation des sondes sur le support peuvent être celles qui sont classiquement utilisées dans la technique des biopuces à ADN, par exemple celle décrite dans le document précité.

Les supports utilisables selon l'invention sont par exemple des supports en verre, en silicium, en gel de polyacrylamide, en polymère (voir le brevet américain NO 5 919 523), en plastique (plaques micropuits). Il peut s'agir de membranes en nylon.

En général, le support est traité pour fournir des surfaces d'accrochage ou de greffage pour les molécules biologiques. Ce traitement de surface assure la formation de fonctions chimiques qui sont généralement des fonctions hydroxyles. Ces fonctions permettent d'assurer les étapes chimiques ultérieures de greffage des sondes. De plus, la densité des sites disponibles à cette étape va déterminer la densité finale de sondes biologiques sur le support.

Pour des supports en verre ou en silicium recouvert d'une couche d'oxyde, un nettoyage chimique de la surface permet de lui conférer des groupements hydroxyles, des molécules Si02 de surface donnant du SiOH. Le nettoyage peut être réalisé sous des conditions basiques (au moyen de soude ou d'ammoniaque) ou sous des conditions acides (au moyen d'acide chlorhydrique, d'acide sulfochromique ou d'acide sulfooxygéné). Des mesures faites par la méthode d'angle de goutte permettent de caractériser l'efficacité de la transformation de l'état de surface du support.

L'efficacité du traitement sur l'immobilisation des

sondes est caractérisée par hybridation avec des cibles complémentaires. Les observations de fluorescence montrent que, plus la surface du support est hydrophile, meilleure est l'immobilisation des sondes, ce qui permet l'obtention d'une plus grande densité de sondes sur le support.

De préférence, le support est un support solide présentant une surface pour l'immobilisation d'oligonucléotides, ladite surface étant la surface d'un matériau choisi parmi HfO2, Ti02, Ta2Og, ZrO2 et un mélange comprenant au moins l'un de ces matériaux, ladite surface ayant subi un traitement pour la rendre hydrophile.

Avantageusement, le matériau se présente sous la forme d'une couche déposée sur un substrat. Cette couche peut posséder une épaisseur comprise entre quelques nanomètres et un micromètre. Le substrat peut être un substrat choisi parmi les substrats en verre, en plastique et en semiconducteur, par exemple en silicium. Le matériau présentant cette surface d'immobilisation d'oligonucléotides peut être par exemple un mélange comprenant silos.

La préparation du support comporte avantageusement les étapes de fourniture dudit substrat, de dépôt sur le substrat d'une couche d'un matériau choisi parmi HfOs, TiO, TasOg, ZrCet un mélange comprenant au moins l'un de ces matériaux, et detraitement de la face libre de ladite couche pour la rendre hydrophile. L'étape de dépôt peut par exemple consister à déposer une couche de matériau d'une épaisseur comprise entre quelques nanomètres et un micromètre. L'étape de fourniture du

substrat peut consister à fournir un substrat tel que ceux précités. L'étape de dépôt peut consister à déposer un matériau comprenant Si02.

L'étape de dépôt peut par exemple mettre en oeuvre une méthode de dépôt choisie parmi l'évaporation sous vide, la pulvérisation par faisceau d'ions, la pulvérisation radio-fréquence, la pulvérisation magnétron, le dépôt en phase vapeur de couches atomiques (ALCVD) et le dépôt sol-gel.

L'étape de traitement de la face libre de la couche déposée peut consister à nettoyer la couche par une solution basique ou par une solution acide.

Le procédé peut comporter une étape supplémentaire consistant à structurer la face libre de ladite couche.

Cette étape de structuration peut mettre en oeuvre une technique choisie parmi la gravure sèche, la gravure humide et le"lift-off".

Selon l'invention, la constitution de la collection de fragments monocaténaires de l'acide désoxyribonucléique de l'organisme détermine donc la constitution de la puce. En effet, les sondes fixées sur le support pour former la puce comportent toutes une partie commune, appelée première partie constante d'une sonde à l'autre , qui est au moins complémentaire au reste de la séquence du site de restriction déterminé de l'enzyme de restriction utilisée pour constituer la collection de fragments.

Cette complémentarité doit conduire à une hybridation spécifique et stable des fragments de la collection sur les sondes de la puce.

Les enzymes de restriction ont la propriété de couper les molécules d'ADN bicaténaires au niveau de séquences nucléotidiques très particulières, appelées sites de restriction, caractérisés par une symétrie des bases azotées au niveau du point de coupure. Ces sites n'étant présents qu'en nombre restreint dans les molécules d'ADN, les points de coupure sont limités, et donc le nombre de fragments d'ADN obtenu après coupure par l'enzyme de restriction. Une fois que l'enzyme a reconnu ses séquences de restriction sur l'ADN à couper, il coupe l'ADN au niveau de ces séquences en laissant de chaque côté de la coupure, ou d'un côté seulement pour certaines enzymes de restriction qui coupent l'ADN avant ou après le site de restriction, un reste de séquence dudit site de restriction. Ce reste de séquence a donc une séquence connue pour une enzyme de restriction connue.

Les inventeurs ont utilisé cette propriété des enzymes de restriction pour réaliser la présente invention.

En effet, la première partie de séquence constante d'une sonde à l'autre est synthétisée de manière à être au moins complémentaire au reste du site de restriction de l'enzyme utilisée pour digérer l'ADN extrait de l'organisme, c'est-à-dire à s'hybrider audit reste du site de restriction présent sur chaque fragment de la collection. Par exemple, si le reste de séquence du site de restriction présent sur chaque fragment a la séquence 5'AATTC 3', la partie constante d'une sonde à l'autre sur la puce de la présente invention devra comprendre la séquence complémentaire 3'TTAAG 5'.

Les enzymes de restrictions utilisables dans la présente invention et leur site de restriction sont exposées plus en détail ci-dessous en relation avec l'exposé du procédé de fabrication d'une empreinte génétique de la présente invention.

Lorsque le reste de séquence du site de restriction est trop court et que l'hybridation de ce reste avec sa séquence complémentaire fabriquée et présente sur la puce ne semble pas pouvoir offrir une hybridation suffisamment stable et spécifique, selon la présente invention, un oligonucléotide adaptateur ayant une séquence connue peut être lié audit reste du site de restriction sur chaque fragment. La fabrication, la fonction et la fixation de l'adaptateur sont exposés plus en détail ci-dessous.

Ainsi, selon un mode particulier de réalisation de la présente invention, ladite collection de fragments monocaténaires de l'ADN provenant de l'organisme peut être obtenu en outre notamment par ligation d'un oligonucléotide adaptateur à séquence déterminée aux extrémités des fragments dudit acide désoxyribonucléique de l'organisme obtenu par digestion par l'enzyme de restriction déterminée.

En relation avec ce mode particulier de réalisation de la présente invention, la première partie de séquence qui est constante d'une sonde à l'autre sur la puce est fabriquée de manière à ce qu'elle soit complémentaire au reste de la séquence du site de restriction de l'enzyme de restriction utilisée et audit oligonucléotide adaptateur de séquence déterminée.

Par exemple, si le reste du site de restriction a la séquence 5'-AATTC-3'et si un adaptateur de séquence 3'-ATGG-5'est lié audit reste de manière a obtenir des fragments 5'-TACCAATTCXXXXXX...-3', X représentant les bases azotées de la séquence interne propre à chaque fragment, la première partie constante d'une sonde à l'autre des sondes fixées sur le support pour former la puce de la présente invention a la séquence complémentaire 3'-ATGGTTAAG-5'. Cette première partie de sonde, commune à toutes les sondes s'hybridera donc spécifiquement aux fragments 5'-TACCAATTCXXXXXX...-3', précités.

La partie constante est alors une séquence de bases azotées complémentaire au reste du site de restriction et à l'adaptateur.

Ce mode de réalisation de la présente invention permet d'obtenir une hybridation plus stable des fragments de la collection de fragments d'ADN sur la puce, et une plus grande spécificité de la puce pour les fragments obtenus avec l'enzyme de restriction.

Par exemple, selon la présente invention, lorsque l'enzyme de restriction utilisée pour préparer la collection de fragments est EcoRI, l'oligonucléotide adaptateur peut être une séquence complémentaire à un ou à une partie d'un des deux oligonucléotides suivants :
5'-CTCGTAGACTGCGTACC-3' ; et 5'-AATTGGTACGCAGTCTAC-3'.

L'adaptateur n'est pas obligatoirement nécessaire si le reste de séquence du site de restriction est

assez long pour une hybridation spécifique et stable sur la puce de la présente invention. Une longueur est estimée suffisante si elle comprend au moins six paires de bases environ.

Après digestion de l'ADN provenant de l'organisme avec l'enzyme de restriction, les fragments obtenus comprennent donc une partie de leur séquence qui est un reste du site de restriction de l'enzyme de restriction déterminée, et une partie de leur séquence qui est propre à chaque fragment et qui dépend spécifiquement de l'organisme et de l'endroit de coupure par l'enzyme de restriction.

Considérant que l'ADN d'un organisme est constitué d'un enchaînement des quatre bases azotées qui sont l'adénine, la cytosine, la guanine et la thymine notées respectivement A, C, G et T, la deuxième partie de séquence est fabriquée variable d'une sonde à l'autre et constituée de combinaisons déterminées de bases azotées choisies de telle manière que l'ensemble des sondes constitué par la matrice ordonnée de sondes comprenne les sondes capables de s'hybrider spécifiquement aux différents fragments d'acide nucléique de la collection de fragments.

Le nombre de bases azotées constituant chaque partie variable des sondes est choisi, selon l'invention, de manière à ce que la sonde complémentaire à un fragment de la collection, munie également de la séquence complémentaire au reste du site de restriction dudit fragment, puisse reconnaître spécifiquement et s'hybrider de manière stable à ce fragment.

Le nombre de sondes ou plots de la puce de la présente invention dépend donc du nombre choisi de bases azotées constituant la séquence variable. Plus le nombre choisi de bases azotées constituant la séquence variable est grand plus le nombre de plots sera important pour que, conformément à la présente invention, les différentes combinaisons possibles de bases azotées nécessaires pour une hybridation spécifique de l'ensemble des fragments de la collection de fragments soient présentes.

Par exemple, une séquence variable de n bases azotées, n étant un nombre entier pouvant aller par exemple de 4 à 15, choisies parmi A, C, G et T conduit à 4n combinaisons possibles, c'est à dire aussi à 4n, séquences variables possibles. Le tableau I suivant donne des exemples à titre non limitatifs du nombre de sondes pour représenter toutes les combinaisons possibles de bases choisies parmi A, C, G et T.

Tableau 1

<tb>
<tb> Longueur <SEP> de
<tb> Bases <SEP> Nombre <SEP> de <SEP> Nombre <SEP> de
<tb> la <SEP> séquence
<tb> azotées <SEP> combinaisons <SEP> sondes
<tb> variable
<tb> 4 <SEP> 44 <SEP> 256
<tb> Les <SEP> quatre <SEP> 6 <SEP> 46 <SEP> 4096
<tb> bases <SEP> 7 <SEP> 47 <SEP> 16384
<tb> A, <SEP> T, <SEP> C <SEP> et <SEP> G <SEP> 8 <SEP> 48 <SEP> 65536
<tb> 10 <SEP> 410 <SEP> 1048576
<tb>

Selon la présente invention, chaque deuxième partie de séquence variable d'une sonde à l'autre peut

avoir par exemple une longueur constante choisie de 4 à 12 bases azotées, par exemple de 4 à 10 bases azotées.

Avantageusement la longueur de la séquence variable est de 6 bases azotées compte tenu des techniques actuelles et du coût de fabrication des puces à ADN. Selon la présente invention, les bases azotées peuvent être celles présentées dans le tableau (I) ci-dessus.

La puce de la présente invention peut comprendre toutes les sondes représentant toutes les combinaisons possibles compte tenu du nombre et du type de bases constituant la séquence variable selon la présente invention ou seulement une partie de ces sondes. Il suffit, selon la présente invention, que la matrice de sondes comprenne les sondes capables de s'hybrider spécifiquement aux différents fragments de la collection, ou même à une partie seulement desdits fragments, pourvu que l'empreinte génétique formée à partir de la collection de fragments permette d'identifier l'organisme duquel a été extrait l'ADN ou un caractère génétique, ou marqueur, déterminé.

Cette réduction du nombre de sondes sur la puce permet de diminuer le prix de fabrication de la puce, pour un organisme donné, tout en gardant son efficacité pour identifier ledit organisme.

En effet, selon la présente invention, après fabrication d'une première empreinte génétique d'un organisme déterminé avec un enzyme de restriction déterminée, sur une puce selon la présente invention comportant toutes les combinaisons possibles de la partie variable des sondes, avantageusement, le nombre de sondes présentes sur la puce peut être

judicieusement réduit pour la fabrication d'autres puces destinées à fabriquer des empreintes du même organisme, à partir de la même enzyme de restriction déterminée, à celles nécessaires et suffisantes pour l'identification dudit l'organisme.

De la même manière, le nombre de sondes peut être réduit sur une puce de la présente invention pour l'identification d'une caractéristique génétique détectable, à celles nécessaires et suffisantes pour l'identification de ladite caractéristique. Il peut s'agir par exemple des caractéristiques génétiques permettant d'identifier le sexe, la race, la variété, l'espèce etc. d'un individu ou d'un produit dérivé issu de cet individu à partir de son ADN. Ces caractéristiques génétiques sont appelées aussi marqueurs. Par détectable, on entend détectable avec la puce de la présente invention, en rapport ou non à des caractéristiques directement détectables sur l'organisme visuellement, et/ou par une analyse biochimique etc.

La puce de la présente invention est donc universelle lorsqu'elle comprend toutes les combinaisons possibles de la partie variable de ses sondes car elle permet de former une empreinte génétique spécifique à partir de l'ADN de n'importe quel organisme.

La puce de la présente invention est spécifique d'un organisme lorsque le nombre de sondes pour la détection a été réduit pour ne garder que celles qui sont nécessaires et suffisantes pour identifier ledit organisme.

Bien entendu aussi, certaines combinaisons possibles peuvent être éliminées en raison de déviations par rapport aux conditions d'hybridation standard exposées ci-dessous sur la puce de la présente invention. C'est le cas par exemple pour les combinaisons trop riches en A/T ou en C/G. Ce problème est connu par l'homme du métier
C'est la combinaison de la partie variable des sondes de la puce et de la matrice ordonnée des sondes qui va permettre de former une empreinte spécifique d'un organisme. En effet la partie variable permet une hybridation spécifique avec les différentes séquences internes des différents fragments de la collection, et du fait de la disposition en matrice ordonnée des différentes sonde une véritable empreinte génétique de l'organisme peut être révélée.

Par matrice ordonnée de sondes, on entend dans la présente une matrice constituée de sondes disposées de manière déterminée en regard de leur partie de séquence variable, et reproductible à l'identique afin de pouvoir reproduire la même matrice avec la même disposition déterminée des sondes en regard de leur partie variable. Par matrice, on entend toute disposition géométrique ou non des sondes sur le support pourvu que la matrice permette de distinguer les sondes hybridées des sondes non hybridées sur ce support lorsque la puce est utilisée pour fabriquer une empreinte génétique. Il peut s'agir, à titre d'exemple, d'une matrice à m colonnes et à p lignes, m et p étant des nombres entiers, d'une matrice formée d'une

disposition des sondes en escargot ou suivant des cercles concentriques, etc.

Le fait que la matrice de sondes soit ordonnée conformément à la présente invention permet de pouvoir confronter différentes empreintes génétiques, fabriquées avec la puce de la présente invention, à partir de différents extraits d'ADN, préparés avec une enzyme de restriction identique pour ces différents extraits, et de conclure objectivement à l'identité ou à la non-identité des empreintes. Le procédé de fabrication des empreintes de la présente invention est exposé ci-dessous.

Chaque fragment d'ADN de la collection de fragments ayant sa sonde complémentaire sur la puce de la présente invention, la mise en présence de la collection de fragments avec la puce comportant sa matrice ordonnée de sonde, dans des conditions adéquates pour une hybridation, fournit donc une empreinte génétique spécifique dudit organisme.

Les inventeurs ont noté qu'une puce universelle selon la présente invention avec une matrice de 10000 sondes ou plots suffit pour garantir une identification individuelle fiable. Avec une telle puce, il est possible d'analyser selon la présente invention en une seule expérimentation plusieurs centaines de marqueurs polymorphes chez n'importe qu'elle espèce.

La présente invention fournit en particulier un procédé de fabrication d'une empreinte génétique d'un organisme comprenant les étapes suivantes :

extraction de l'ADN bicaténaire dudit organisme, détermination de la concentration de l'ADN bicaténaire extrait et si nécessaire dilution de l'ADN extrait à une concentration de 1 à 20 ng/ul, digestion de l'ADN extrait avant ou après dilution au moyen d'au moins une enzyme de restriction ayant un site de restriction déterminé de manière à obtenir des fragments bicaténaires comprenant un reste de séquence dudit site de restriction, et, contiguë audit reste de séquence, une séquence interne propre à chaque fragment ; éventuellement ligation d'un oligonucléotide adaptateur bicaténaire à séquence déterminée aux extrémités des fragments bicaténaires obtenus par digestion dudit ADN pour obtenir des fragments bicaténaires adaptés, amplification des fragments bicaténaires, éventuellement liés à l'oligonucléotide adaptateur bicaténaire, par une réaction de polymérisation en chaîne au moyen d'une amorce complémentaire audit reste de séquence dudit site de restriction et éventuellement à l'oligonucléotide adaptateur bicaténaire, marquage des fragments bicaténaires, éventuellement liés à l'oligonucléotide adaptateur bicaténaire, pendant ou après leur amplification, au moyen d'un marqueur, dénaturation des fragments bicaténaires marqués, éventuellement liés à l'oligonucléotide adaptateur bicaténaire, de manière à obtenir une collection de fragments monocaténaires de l'ADN

provenant de l'organisme éventuellement liés à l'oligonucléotide adaptateur monocaténaire, hybridation de ladite collection de fragments sur une puce selon la présente invention, rinçage de la puce pour éliminer notamment les fragments non hybridés et séchage, et lecture de la puce par un moyen de détection du marqueur utilisé.

Lorsque les fragments de la collection sont liés à l'oligonucléotide adaptateur monocaténaire, l'étape d'hybridation est réalisée sur une puce selon la présente invention sur laquelle la première partie de séquence, qui est constante d'une sonde à l'autre de la puce, est complémentaire au reste de la séquence du site de restriction de l'enzyme de restriction utilisée et à l'oligonucléotide adaptateur à séquence déterminée.

L'organisme est un organisme à ADN, animal, végétal, insecte ou microorganisme.

Selon la présente invention, il est préférable que l'ADN soit de bonne qualité, c'est à dire pas trop dégradé et avec peut ou pas d'inhibiteur (s) des enzymes de restriction afin de pouvoir fabriquer une empreinte génétique exploitable. L'extraction de l'ADN de l'organisme peut être effectuée par les méthodes classiques d'extraction d'ADN à partir d'un organisme.

A titre d'exemple non limitatif, les méthodes d'extraction décrites dans l'ouvrage de Sambrook J, Firtsch E. F., Maniatis T., 1989 Molecular cloning : a laboratory manual 2nd edition, New-York : Cold Spring

Harbor Laboratory Press, cold Spring Harbor, New-YorK, peuvent être utilisées.

Selon l'invention, Les extractions peuvent être effectuées par exemple avec les kits d'extraction QIAGEN (marque de commerce), par exemple QIAamp Blood Extraction Kit (marque déposée) pour le sang, QIAamp Tissue Extraction Kit (marque déposée) pour les tissus, ou Dneasy Plant Mini Kit (marque déposée) pour les végétaux, en suivant les protocoles du fabricant.

Selon l'invention, la détermination de la concentration de l'ADN bicaténaire extrait peut être réalisée par les méthodes classiques de dosage de l'ADN dans un extrait. A titre d'exemple, il peut être dosé par fluorimétrie avec du PicoGreen (marque déposée) dans DNA QUANTIFICATION KIT (marque de commerce) ( < < Molecular Probes > > ).

Quelques nanogrammes d'ADN sont suffisants pour appliquer le procédé de la présente invention. Aussi, lorsque l'extrait d'ADN présente une concentration supérieure à 20 ng/ul, avantageusement, selon l'invention, afin de pouvoir fabriquer une empreinte génétique lisible , qui ne sature pas la puce de la présente invention, la concentration de l'extrait peut être ramenée à une concentration de 1 à 20 ng/ul, par exemple de 5 à 15 ng/ul, par exemple à 10 ng/ul (nanogrammes par microlitre).

Avant ou après la dilution, si celle-ci est nécessaire, l'ADN est digéré par au moins une enzyme de restriction pour obtenir des fragments de cet ADN.

Les principaux objectifs de l'étape de digestion du procédé de la présente invention avec l'enzyme de restriction sont de fournir un nombre de fragments de l'ADN extrait raisonnable permettant de fabriquer une empreinte reproductible, et que les fragments fournis présentent des restes de séquence du site de restriction de longueur suffisante pour permettre une hybridation spécifique avec la partie constante des sondes complémentaire avec lesdits restes de séquence du site de restriction, et éventuellement la fixation d'un adaptateur.

De nombreuses enzymes de restriction ont pu être identifiées à ce jour, ainsi que leur séquence de restriction.

L'homme du métier, à la lecture de la présente description, pourra aisément choisir l'enzyme de restriction la plus appropriée pour l'application qu'il réalisera de la présente invention parmi les enzymes de restriction identifiées, et parmi celles qui seront identifiées dans l'avenir. La littérature concernant les enzymes de restriction fournit en général pour chaque enzyme son site de restriction spécifique.

Des enzymes de restriction utilisables selon la présente invention peuvent être trouvées par exemple dans des catalogues de fournisseurs tels que Roche Molecular Biochemicals, New England Biolabs, Stratagene etc.

A titre d'exemples non limitatifs d'enzymes de restriction utilisables selon la présente invention, on peut citer EcoRI extraite d'E. Coli, HaeIII extraite de Haemophilus aegyptus et PstI extraite de Providencia

stuari. Ces trois enzymes présentent les sites de restriction sur l'ADN représentés ci-dessous et coupent de la manière suivante : EcoRI :

<tb>
<tb> site <SEP> de <SEP> restriction <SEP> 5'-XXXXXGAATTCXXXX-3'
<tb> 3'-XXXXXCTTAAGXXXXX-5'
<tb> coupe <SEP> en <SEP> libérant <SEP> 5'-XXXXXG <SEP> AATTCXXXXX-3'
<tb> 3'-XXXXXCTTAA <SEP> GXXXXX-5'
<tb> HaeIII <SEP> :
<tb> site <SEP> de <SEP> restriction <SEP> 5'-XXXXXGGCCXXXXX-3'
<tb> 3'-XXXXXCCGGXXXXX-5'
<tb> coupe <SEP> en <SEP> libérant <SEP> 5'-XXXXXGG <SEP> CCXXXXX-3'
<tb> 3'-XXXXXCC <SEP> GGXXXXX-5'
<tb> PstI <SEP> :
<tb> site <SEP> de <SEP> restriction <SEP> 5'-XXXXXCTGCAGXXXXX-3'
<tb> 3'-XXXXXGACGTCXXXXX-5'
<tb> coupe <SEP> en <SEP> libérant <SEP> 5'-XXXXXCTGCA <SEP> GXXXXX-3'
<tb> 3'-XXXXXG <SEP> ACGTCXXXXX-5'
<tb>

Dans ces exemples, les X représentent les bases azotées constituant l'ADN contigu au site de restriction et qui n'interviennent pas dans le site de restriction. Dans la présente, ces bases azotées constituent les séquences internes propres à chaque fraament d'ADN obtenu après digestion par l'enzyme. Cet

exemple montre que l'enzyme de restriction Hae III coupe l'ADN avec des extrémités franches, et que les enzymes EcoRI ou PstI coupent l'ADN avec des extrémités cohésives.

Outre les enzymes précités, on peut utiliser, à titre d'exemple, EcoR I, Aat II, Sno I, Bgl II, Bln I, Bse AI, Cla I.

Selon la présente invention, le choix de l'enzyme de restriction utilisée sera fonction du nombre souhaité de fragments générés à partir de l'ADN de l'organisme dont on souhaite fabriquer l'empreinte. En effet, le nombre de fragments générés par la digestion par l'enzyme de restriction ne doit pas être trop élevé afin de ne pas saturer la puce de la présente invention après amplification.

Les inventeurs ont déterminé que le rapport nombre de fragments amplifiés/nombre de sondes ou plots de la puce se situe avantageusement entre 0,2 et 0,05, de préférence entre 0,5 et 0,01. Le nombre de fragments générés par digestion de l'ADN d'un organisme par une enzyme de restriction peut être déterminé facilement par la méthode AFLP [11].

Lorsqu'une seule enzyme de restriction est utilisée les enzymes de restriction générant entre 106 et 102 fragments de restriction, de toute préférence entre 104 et 103 fragments de restriction de taille amplifiable, de préférence de 500 à 1000 paires de bases, seront particulièrement préférés selon la présente invention.

Selon l'invention, le choix de l'enzyme de restriction utilisée peut aussi être fonction de la

quantité de bases azotées constituant le reste de séquence du site de restriction après coupure par l'enzyme. En effet, comme exposé ci-dessus, il est préférable que le reste de séquence du site de restriction ait une longueur suffisante pour obtenir une hybridation spécifique et stable entre le reste du site de restriction et sa séquence complémentaire sur chaque sonde. Le reste de séquence peut toutefois être complété par un oligonucléotide adaptateur comme exposé ci-dessous.

L'enzyme de restriction peut aussi être choisie en fonction du type de coupure, franche ou cohésive, qu'il génère en coupant l'ADN. Une coupure cohésive est préférée lorsqu'un adaptateur est lié aux fragments comme exposé ci-dessous.

L'étape de digestion enzymatique peut être effectuée par les méthodes classiques de digestion enzymatique mettant en oeuvre les enzymes de restriction. Par exemple, l'ouvrage de Sambrook J, Firtsch E. F., Maniatis T., 1989 Molecular cloning : a laboratory manual 2nd edition, New-York : Cold Spring Harbor Laboratory Press, cold Spring Harbor, New-YorK décrit des méthodes utilisables dans le procédé de la présente invention. En général, on utilise les conditions indiquées par le fabricant fournisseur de l'enzyme de restriction.

Outre les raisons exposées ci-dessus, le choix de l'enzyme de restriction utilisé peut également être fonction de sa disponibilité sur le marché, de son coût, des conditions de son utilisation et du protocole de préparation de la collection de fragments etc.

Le procédé de la présente invention peut comprendre en outre une étape de ligation d'un oligonucléotide adaptateur, appelé aussi, dans la présente, adaptateur. Il peut être utile notamment lorsque le reste de séquence du site de restriction de l'enzyme de restriction utilisée est trop court pour permettre une hybridation stable avec sa séquence complémentaire sur la biopuce. Il peut aussi être utile pour l'étape d'amplification des fragments par la réaction de polymérisation en chaîne (PCR) car il permet de fabriquer une amorce de taille suffisante et complémentaire à cet adaptateur et au reste de la séquence du site de restriction pour l'action de la polymérase dans le procédé de l'invention. Il peut enfin être utile pour réduire le nombre de fragments hybridables sur la puce comme exposé ci-dessous.

Cet adaptateur peut être préparé par les techniques classiques de synthèse d'oligonucléotides double brins, par exemple par synthèse des deux brins d'ADN complémentaires aux extrémités cohésives d'un fragment obtenu par une enzyme de restriction déterminée, et par hybridation des brins synthétisés dans les conditions d'hybridation adéquates. Les adaptateurs sont préparés par exemple en ajoutant des quantités équimolaires de chaque brin, en chauffant à 65 C, et en laissant refroidir lentement durant environ heure jusqu'à 20 C.

L'essentiel est que cet adaptateur soit de séquence connue afin de pouvoir disposer sur les sondes de la puce sa séquence complémentaire. De préférence, il se fixe de manière spécifique sur les extrémités des

fragments d'ADN issus de l'étape de digestion par l'enzyme de restriction.

Aussi, selon un mode de réalisation préféré de la présente invention, l'enzyme de restriction est une enzyme de restriction libérant des extrémités cohésives, et l'adaptateur est un oligonucléotide complémentaire audites extrémités cohésives. Ainsi, l'adaptateur se fixe spécifiquement sur les extrémités cohésives. Ce mode de réalisation permet de sélectionner avec la puce de la présente invention les fragments comportant ces coupures cohésives issues de l'action de l'enzyme de restriction déterminée et l'adaptateur, et donc de réduire le nombre de fragments hybridables sur la puce.

Par exemple, lorsque l'enzyme de restriction utilisée est EcoRI, l'oligonucléotide adaptateur peut avantageusement être constitué de l'oligonucléotide bicaténaire suivant :
5'-CTCGTAGACTGCGTACC-3' 3'-CATCTGACGCATGGTTAA-5'.

D'autres adaptateurs utilisables sont par exemple décrits pour les enzymes de restriction PstI et MspI dans le document [13].

Si une autre enzyme de restriction est utilisée, à la place de EcoRI, avec d'autres extrémités cohésives, alors l'adaptateur devra être modifié de manière à permettre la ligation avec les extrémités cohésives libérées par cette autre enzyme.

Selon la présente invention, La ligation de l'adaptateur obtenu peut être réalisée par les techniques classiques de ligation, par exemple décrites

par Sambrook, Fritsch et Maniatis dans Molecular cloning, A laboratory manual, Second edition. Elle est par exemple réalisée par une ligase, dans les conditions sine qua non pour l'activité de cette enzyme.

Selon la présente invention, les étapes de digestion et de ligation peuvent être effectuées simultanément lorsque la fixation de l'adaptateur sur les extrémités des fragments ne reconstitue pas le site de restriction. C'est par exemple le cas pour EcoRI, par exemple avec l'adaptateur présenté ci-dessus. Il n'est en revanche pas gênant que le site de restriction soit reconstitué avec l'adaptateur lorsque la digestion et la ligation sont effectuées dans des étapes séparées successives.

Selon un mode particulier de réalisation de la présente invention, plusieurs enzymes de restriction peuvent être utilisées. Ceci peut être le cas par exemple lorsque le nombre de fragments obtenus avec une seule enzyme de restriction est trop important et conduirait à une saturation de la puce de la présente invention.

Selon ce mode particulier de réalisation de la présente invention, avantageusement, unz première enzyme de restriction est choisie en fonction de son site de restriction de manière à ce que les séquences des restes de son site de restriction soient suffisamment longues pour les raisons exposées cidessus et de manière à ce que les fragments d'ADN obtenus avec cette enzyme soient à extrémités cohésives pour y fixer spécifiquement un oligonucléotide

adaptateur déterminé. Une deuxième enzyme de restriction est alors utilisée, avant, pendant ou après digestion par la première enzyme de restriction, les extrémités des fragments obtenus avec cette deuxième enzyme étant incompatibles avec l'oligonucléotide adaptateur déterminé.

Ce mode de réalisation permet de sélectionner sur la puce de la présente invention, les fragments comportant les coupures cohésives issues de l'action de la première enzyme de restriction grâce à l'adaptateur spécifique de ces coupures. En effet, seuls les fragments liés audit adaptateur spécifique sont amplifiés lors de l'étape d'amplification, l'amorce étant complémentaire à l'adaptateur. Ceci constitue donc un moyen de réduire le nombre de fragments lors de la fabrication de l'empreinte génétique.

Par exemple, selon la présente invention, Taql et EcoRI peuvent être utilisés ensemble pour digérer l'ADN extrait de l'organisme. En effet EcoRI génère 40000 fragments de moins de 500 paires de bases chez les mammifères. Ce nombre peut être réduit de manière très significative par une digestion supplémentaire de l'ADN extrait par exemple avec une enzyme de restriction reconnaissant quatre paires de bases telle que TaqI, MspI, MaeII, AluI. L'adaptateur précité pour EcoRI peut être utilisé dans cet exemple.

L'amplification peut être réalisée par l'une quelconque des méthodes de polymérisation en chaîne, appelées techniques PCR . Des techniques de PCR sont par exemple décrites dans Innis MA, Gelfand DH, Sninsky

JJ, White TJ, 1990-PCR Protocols, San Diego, California Academic Press, Inc.

Par exemple, l'amplification peut être réalisée avec une seule amorce dont la séquence correspond à celle de l'adaptateur et du site de restriction de l'enzyme.

Eventuellement, selon la présente invention, une ou deux bases supplémentaire (s) du côté 3'de l'amorce peut (peuvent) être ajoutée (s), ceci afin de n'amplifier que les fragments comportant la base complémentaire à cette base ajoutée.

En effet, il est important que la puce ne soit pas saturée par les fragments amplifiés pour qu'elle puisse être lue et que l'empreinte fabriquée soit reproductible. Avantageusement, le rapport nombre de fragments amplifiés/nombre de sondes sur la puce se situe entre 0,2 et 0,05, de préférence entre 0,5 et 0, 01.

L'ajout d'une ou deux bases azotées à l'amorce est un des moyens permettant de limiter dans le procédé de la présente invention le nombre de fragments à hybrider. Par exemple, si la base azotée A (ou les bases azotées AA) est (sont) ajoutée (s) en 3'de l'amorce, seuls les fragments comportant la base T (les bases TT) complémentaire (s), à la base A (aux bases AA) de l'extrémité 3'de l'amorce, seront amplifiés.

L'ajout d'une seule base permet de réduire par quatre le nombre de fragments amplifiés, et ainsi d'éviter dans certains cas la saturation de la puce selon la présente invention.

Par exemple, si l'enzyme de restriction utilisée est EcoRI, alors la séquence de l'amorce peut être la suivante, avec éventuellement une base supplémentaire A, T, C ou G du côté 3' : 5'-GACTGCGTACCAATTCG-31.

Les fragments amplifiés sont bicaténaires. Ils peuvent être marqués pendant ou après leur amplification avec une molécule fluorescente, soit directement lors de l'amplification par l'utilisation d'une amorce marquée. Les techniques utilisables sont celles classiquement utilisées pour un marquage destiné à mettre en évidence une hybridation sur une biopuce.

Par exemple, il peut être effectué avec du Cy3 ou du Cy5, soit par incorporation d'un fluorochrome après la réaction d'amplification. Dans ce dernier cas, le produit d'amplification est ensuite purifié sur colonne (QIAquick PCR columns (marque déposée) (QIAGEN) de manière à enlever les nucléotides et les amorces restantes avant le marquage.

L'étape suivante consiste à dénaturer les fragments amplifiés marqués bicaténaires de manière à les transformer en fragments marqués monocaténaires.

Cette étape permet une hybridation ultérieure des fragments sur la biopuce. Elle peut être réalisée par toute méthode connue de l'homme du métier qui n'altère pas les fragments et leur marquage. Un simple chauffage suffit, par exemple à une température allant de 85 à 105 C.

Une fois dénaturés, les fragments sont mis à hybrider sur une puce selon la présente invention,

comportant des sondes adaptées aux conditions opératoires du procédé précité. Ainsi, les sondes comprennent une partie constante reconnaissant le reste du site de restriction de l'enzyme de restriction utilisée et le cas échéant l'adaptateur, et une séquence variable d'une sonde à l'autre de telle manière que la matrice de sondes reconnaisse les fragments de la collection.

L'hybridation est effectuée dans des conditions adéquates d'hybridation. Ces conditions sont aisément déterminables par l'homme du métier. Elle aura lieu notamment à une température d'hybridation qui optimise l'hybridation spécifique, c'est à dire une température permettant d'éliminer les hybridations aspécifiques, tout en privilégiant les hybridations spécifiques. En général, la température de fusion se situera de 45 à 55OC, par exemple à 50 C pour une sonde d'environ 20 paires de bases. La température d'hybridation peut être ajustée en fonction des températures de fusion des oligonucléotides présents sur la puce de la présente invention.

La puce est ensuite rincée par un des procédés classiques de rinçage des puces à ADN après hybridation, par exemple à température ambiante pendant cinq minutes avec du tampon 1 x SSC (contenant 0,1% de SDS), 2 minutes avec du tampon 0,2 x SSC, et finalement vingt secondes avec du tampon 0,02 x SSC. Cette étape a pour but d'éliminer les fragments non hybridés et autres résidus qui pourraient gêner la lecture de l'empreinte.

Après séchage, la puce est prête pour la lecture.

Selon l'invention, la lecture de la puce peut être effectuée avec n'importe quel scanner adapté à ce type d'expérimentation. Par exemple le scanner Affymetrix 418 (marque déposée) convient pour la lecture.

Selon une variante de réalisation du procédé de la présente invention, il est possible d'effectuer une hybridation compétitive entre les fragments issus de l'étape d'amplification, c'est-à-dire comportant la séquence interne propre à chaque fragment, et des fragments fixes synthétiques qui ne sont complémentaires qu'à la partie constante des sondes fixées sur la puce, par exemple des fragments de séquence 5'-GTCATCTACCAATTC-3'dans l'exemple de EcoRI et de l'adaptateur EcoRI précité. Les fragments fixes peuvent être marqués avec un fluorochrome différent de celui des fragments issus de l'amplification, par exemple Cy3 ou Cy5 (marque déposée), de la société Pharmacia.

L'hybridation compétitive des fragments fixes s'hybridant sur la partie constante de l'ensemble des sondes et des fragments amplifiés issus de l'ADN de l'organisme (fragments avec les séquences interne propres) permet de prendre en compte l'hybridation relative de ces deux types de fragments, et non pas la valeur absolue de la fluorescence des fragments amplifiés issus de l'ADN de l'organisme. Cela permet de s'affranchir des variations de quantité des fragments déposées sur la puce. Dans le cas de cette variante, les sondes fixées sur la puce sont allongées du côté

5', avec des séquences permettant d'éviter l'hybridation des sondes issues de l'amplification.

Il est bien entendu nécessaire d'ajuster les quantités relatives des deux types de sonde, de manière à obtenir un signal convenable.

Selon le procédé de la présente invention, il est possible de réutiliser une puce de la présente invention sur laquelle une empreinte a été formée selon l'invention, ceci après traitement et lavage de la puce pour en retirer les fragments hybridés.

La présente invention, se rapporte également à une empreinte génétique obtenue par un procédé selon la présente invention. Cette empreinte génétique peut être obtenue à partir de l'ADN d'un organisme choisi parmi un animal, un végétal, un insecte ou un microorganisme.

Par exemple, la matrice de sondes ordonnées de la puce de la présente invention étant standardisée par exemple pour être universelle, ou pour être spécifique pour un marqueur génétique, par exemple un caractère génétiquement détectable, le sexe, la race, l'espèce, la variété, etc choisi, l'empreinte formée selon le procédé de la présente peut servir de témoin ou de standard pour détecter ou non chez d'autres organismes ou produits dérivés l'ADN ayant servi à former l'empreinte, le marqueur génétique ou le caractère génétiquement détectable, le sexe, la race, l'espèce, ou la variété.

Aussi, la présente invention fournit également un procédé d'identification d'un organisme comprenant de l'ADN ou d'un échantillon comprenant de l'ADN, ledit procédé comprenant les étapes suivantes :

- a) la fabrication d'une première empreinte génétique d'un organisme référence par un protocole suivant un premier procédé de la présente invention, ladite première empreinte constituant l'empreinte génétique dudit organisme référence associée au protocole utilisé, - b) la fabrication d'une deuxième empreinte génétique à partir d'un organisme à identifier ou d'un échantillon à identifier suivant le même premier procédé que dans l'étape a), et - c) la comparaison de la première empreinte obtenue à l'étape a) avec la deuxième empreinte obtenue à l'étape b), une identité de la première et de la deuxième empreintes révélant le cas échéant que l'organisme, ou l'échantillon à identifier, présente la même identité que, ou provient de, l'organisme référence.

Pour que deux empreintes de la présente invention puissent être comparées, bien entendu, le même procédé de fabrication de ces empreintes doit être utilisé, c'est à dire les mêmes concentrations d'ADN, le ou les mêmes enzymes de restriction (s), le même adaptateur le cas échéant, et les mêmes conditions d'hybridation.

Les empreintes peuvent être comparées directement ou photographiées pour ensuite être comparées.

L'organisme référence peut être un animal, et l'organisme ou l'échantillon à identifier un animal ou un échantillon d'animal à identifier.

Par exemple, l'organisme référence peut être un animal destiné à produire de la viande pour

l'alimentation humaine, et l'échantillon à identifier un morceau de viande destiné à la vente.

Selon la présente invention, l'organisme référence peut être une plante, et l'organisme ou l'échantillon à identifier une plante ou un échantillon de plante à identifier.

Par exemple, l'individu référence peut être un cépage de vigne référence, et l'échantillon à identifier un échantillon de raisin.

Selon la présente invention, l'individu référence peut être un suspect, et l'échantillon à identifier un tissus ou échantillon humain, par exemple prélevé sur le lieu d'un crime, susceptible de provenir dudit suspect.

La présente invention se rapporte également à l'utilisation d'une puce selon la présente invention, dans un procédé d'identification d'un organisme ou d'un produit issu de cet organisme, du sexe, de la race ou de la variété ou de l'espèce dudit organisme à partir d'un échantillon de son ADN, par exemple à des fins de traçabilité individuelle des animaux ou des plantes et des produits dérivés de ceux-ci.

Elle se rapporte aussi à l'utilisation d'une puce selon l'invention pour détecter en micro-organisme.

L'invention apporte d'une part une simplification des protocoles opératoires par rapport aux techniques de l'art antérieur car elle permet par exemple en une seule opération d'obtenir une empreinte génétique d'un individu, sans aucun développement préalable pour

n'importe quelle espèce, animale ou végétale, et d'autre part, elle apporte une augmentation conséquente du nombre de marqueurs génétiques analysés pour un effort expérimental plus faible.

Il est possible grâce à la présente invention d'analyser plusieurs centaines de marqueurs polymorphes en une seule expérimentation. Il est intéressant de noter que le fait de pouvoir éviter les migrations sur gel et de travailler par hybridation sur une puce permet une automatisation plus poussée du procédé, et de ce fait une industrialisation.

De plus, le fait d'utiliser une puce universelle réduit considérablement les coûts et les temps de développement. Cette approche universelle permet non seulement d'effectuer des empreintes génétiques, c'est- à-dire à réaliser des identifications individuelles, mais aussi à identifier l'espèce, la race et le sexe à partir d'une ou plusieurs empreintes de référence, et ce quel que soit l'organisme dont est issu l'ADN testé.

D'autres caractéristiques et avantages de la présente invention apparaîtront encore à l'homme du métier à la lecture des exemples qui suivent illustrant l'invention, de manière non limitative, en référence aux figures annexées.

BREVE DESCRIPTION DE LA FIGURE - La figure 1 est une représentation schématique d'un mode de réalisation du procédé de la présente invention.

EXEMPLES Exemple 1 : Extraction de l'ADN génomique d'un individu
Plusieurs échantillons sont prélevés sur différents organismes.

L'ADN peut être extrait par la méthode Phénol/Chloroforme (Sambrook et al. 1989) ou à l'aide d'un kit d'extraction du commerce (par exemple QIA amp Tissue Extraction Kit (marque du commerce) (Société Qiageu).

Plusieurs extraits d'ADN des différents organismes sont obtenus.

Les exemples suivants sont réalisés sur ces différents extraits.

La figure 1 est une représentation schématique d'un mode de réalisation du procédé de la présente invention. Sur cette figure l'échantillon extrait comporte la référence 1.

Exemple 2 : Digestion/Ligation
L'enzyme de restriction utilisée dans cet exemple est EcoRI, et la digestion est effectuée en même temps qu'une ligation avec un adaptateur. Ces étapes de procédé sont référencées i) et ii) sur la figure 1, i) représentant la digestion de l'ADN et ii) la ligation d'un adaptateur.

Les conditions sont les suivantes : 5, 5 microlitres d'ADN (lOmg/ul) extrait par la méthode décrite dans l'exemple 1, soit environ 55 nanogrammes d'ADN génomique, sont ajoutés à 5,5 microlitres d'un mélange composé de 100 mM de Tris-HCl à pH 7,8, 20 mM

de MgCl2, 20 mM de dithiothreitol, 2 mM ATP, 50 ug/ml de BSA dz Bovine Serum Albumine ), 100 mM NaCl, 5 unités d'EcoRI, 1 unité de T4-ligase, et 1, 8 uM d'un adaptateur EcoRI. Le tout est soigneusement mélangé. Les fragments d'ADN issus de la digestion enzymatique sont référencés 3 sur la figure 1.

L'adaptateur EcoRI, référencé 5a, 5b sur la figure 1, est constitué à partir des deux oligonucléotides suivants : 5'-CTCGTAGACTGCGTACC-3'et 5'- AATTGGTACGCAGTCTAC-3'. Le mélange de ces deux oligonucléotides après chauffage à 600C suivi d'un refroidissement lent jusqu'à température ambiante (non représenté sur la figure 1) donne l'adaptateur qui est un fragment d'ADN double brin dont une extrémité correspond parfaitement à l'extrémité cohésive de EcoRI.

Le mélange précité est incubé 2 heures à 37 C, puis dilué 10 fois. Les fragments comportant l'adaptateur sont référencés 7 sur la figure 1.

Exemple 3 : Amplification
L'étape d'amplification, référencée iii) et iv) sur la figure 1, est réalisée avec une seule amorce, référencée 9 sur la figure 1, dont la séquence correspond à celle de l'adaptateur et au site de restriction de l'enzyme qui sont utilisés dans l'exemple 2, avec une base supplémentaire du côté 3' : 5'GACTGCGTACCAATTCG-3'.

Trois microlitres de la digestion/ligation issue de l'exemple 2 sont dilués 10 fois et ajoutés à 22 uL d'un mélange permettant d'obtenir les concentrations

finales suivantes : 10 mM Tris-HCl (pH 8, 3), 50 mM KC1, 1,5 mM MgCl2, 0,12 mM de chacun des dNTP, 0, 2 uM de l'amorce EcoRI (voir séquence ci-dessus), 0,5 unités d'Amplitaq Polymerase (marque de commerce) (PerkinElmer).

La réaction d'amplification en chaîne, référencée iv) sur la figure 1, est composée du profil suivant : 2 minutes d'incubation à 72 C, suivi de 30 cycles

comprenant une dénaturation à 940C pendant 30 secondes, une hybridation à 560C pendant 30 secondes, et une extension de 2 minutes à 72 C ; pour terminer, la solution est incubée à 720C pendant 10 minutes afin de compléter l'élongation de tous les fragments.

Les fragments amplifiés sont référencés 11 sur la figure 1. Un des fragments est représenté agrandi sur cette figure dans la direction 3'5'conventionnelle. Apparaissent dans l'ordre, l'adaptateur 5b, le reste du site de restriction 13, et la séquence interne 13 propre à chaque fragment.

Exemple 4 : Marquages
Une partie des produits d'amplification, 5 1lL, sont marqués avec une molécule fluorescente directement lors de l'amplification décrite dans l'exemple 3 précédent par l'utilisation d'une amorce marquée avec du Cy3 (marque de commerce), de la société Pharmacia en utilisant le Deca-random-prime DNA labelling kit (marque de commerce) de la société Fermentas.

Une autre partie des produits d'amplification, 5 uL, sont marqués par incorporation du fluorochrome après la réaction d'amplification. Dans ce dernier cas,

le produit d'amplification est purifié sur colonne (QIAquick PCR columns (marque de commerce) de la société QIAGEN, de manière à enlever les nucléotides et les amorces restantes avant le marquage.

Les résultats de ces marquages sont concluants dans les deux cas.

Exemple 5 : Dénaturation et hybridation
L'hybridation est réalisée sur une puce universelle de la présente invention comprenant toutes les combinaisons de la partie variable pour une séquence de 6 bases azotées choisies parmi A, T, C et G. Cette puce est référencée 20 sur la figure 1. La référence 22 indique la séquence complémentaire à l'adaptateur, la référence 24 indique la séquence complémentaire au site de restriction, et la référence 26 la séquence variable. Les références 22 et 24 indiquent donc la partie constante d'une sonde à l'autre.

Les séquences des sondes fixées correspondent à une partie de l'adaptateur décrit dans l'exemple 2, à la partie non modifiée du site de restriction, et à une partie variable de 6 nucléotides.

Cinq microlitres des fragments d'ADN amplifiés marqués au Cy3 sont mélangés avec 2 microlitres d'ADN de sperme de hareng (société Sigma) à 20 pg/uL dissout dans une solution d'hybridation ExpressHyb (marque déposée) (Clontech), et dénaturés à 960C pendant trois minutes.

Ces fragments dénaturés marqués sont mélangées avec 15 microlitres de la solution d'hybridation, et

déposés sur la puce à ADN avec un dispositif pour éviter l'évaporation.

L'hybridation est effectuée à 500C sur la nuit.

Après hybridation, les puces à ADN sont rincées à température ambiante pendant cinq minutes avec du tampon 1 x SSC contenant 0, 1% de SDS, 2 minutes avec du tampon 0,2 x SSC, et finalement vingt secondes avec du tampon 0,02 x SSC.

Après séchage complet, les puces et l'empreinte qu'elles comportent sont prêtes pour la lecture.

Sur la figure 1, la référence 28 indique une sonde hybridée par un fragment.

Exemple 6 : Lecture
La lecture des puces est effectuée avec le scanner Affymetrix 418 (marque de commerce).

Les empreintes obtenues sont lisibles et reproductibles. Elles permettent en effet de déterminer si deux empreintes obtenues à partir de deux ADN proviennent d'organismes identiques ou différents. En outre, elles permettent d'obtenir à deux empreintes identiques à partir de deux échantillons différents provenant d'un même organisme.

Exemple 7 : Préparation d'un support pour fabriquer la puce de la présente invention.

Le substrat utilisé est en silicium.

Une couche précurseur d'accrochage pour les oligonucléotides sondes est déposée sur le substrat.

Elle est constituée d'un oxyde de métal réfractaire choisi parmi Ti02, Zr02, Hf02 ou Tua205.

La couche déposée est une couche mince d'épaisseur comprise entre quelques nm et 1 um.

Cette couche est déposée par évaporation sous vide par canons à électrons à une température comprise entre 50 et 2000C environ.

Dans d'autres essais, elle a été déposée par pulvérisation par faisceau d'ions (IBS), par pulvérisation radio-fréquence ou magnétron. Le dépôt en phase vapeur de couches atomiques (ALCVD) ou le dépôt sol-gel peuvent également être utilisés.

Les matériaux pouvant constituer la couche mince selon l'invention peuvent être déposés, par les techniques d'évaporation PVD (canons à électrons, IBS, pulvérisation...), indifféremment sur du verre, du plastique, du silicium.

Les oxydes de ces métaux sont très stables vis-àvis de solutions basiques, ce qui permet une transformation lente et uniforme de la surface.

Sans aucun traitement de surface, ces matériaux sont hydrophobes. Dans le cas de l'oxyde d'hafnium, la mesure d'angle de goutte d'eau conduit à une valeur de 60 . Selon le traitement basique effectué, l'angle de goutte varie de 350 à 60.

Des supports ainsi traités ont été utilisés pour faire croître des oligonucléotides par synthèse in situ sur un support constitué d'une couche de HfOs sur un substrat en silicium.

Pour un échantillon de faible hydrophilie (350), le signal de fluorescence, après hybridation de sondes

de 20 mères par des cibles complémentaires, est faible et non uniforme. Un échantillon fortement hydrophile (60) présente une nette amélioration, principalement en terme d'uniformité.

L'uniformité obtenue a été comparée à celle d'un support solide couramment utilisé à savoir un support formé d'un substrat en silicium recouvert d'une couche d'oxyde thermique de 0,5 um d'épaisseur. Par rapport à ce support solide de l'art connu, le support selon l'invention (HfOs sur Si) procure une amélioration de l'uniformité du signal de fluorescence.

Le même résultat a été obtenu avec un substrat en verre recouvert d'une couche de HfOs après immobilisation par liaison covalente de sondes de 20 mères présynthétisées.

Ce type de dépôt peut aussi être utilisé pour des biopuces employant la méthode d'immobilisation de sondes par interactions électrostatiques.

Le dépôt de ces oxydes de métaux réfractaires permet tous les types de greffage utilisés dans les technologies des biopuces, à savoir tout support (verre, silicium, plastique) et tout type de technique de greffage biologique (synthèse in situ, immobilisation par liaison covalente ou liaisons électrostatiques).

Les résultats des mesures montrent une amélioration de l'uniformité des signaux de fluorescence par rapport à l'état de l'art.

Cette technique permet de fabriquer les matrices de sondes de la présente invention, et donc une puce universelle selon l'invention.

LISTE DE REFERENCES Sondes minisatellites

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DArT [13] JACCOUD D, PENG K, FEINSTEIN D, KILIAN A (2001), Diversity arrays : a solid state technology for sequence information independent genotyping, Nucleic Acids Research, 29, e25.

Claims

REVENDICATIONS

1. Procédé de fabrication d'une empreinte génétique d'un organisme comprenant les étapes suivantes : extraction de, l'ADN bicaténaire dudit organisme, détermination de la concentration de l'ADN

bicaténaire extrait et si nécessaire dilution de l'ADN extrait à une concentration de 1 à 20 ng/1, digestion de l'ADN extrait avant ou après dilution au moyen d'au moins une enzyme de restriction ayant un site de restriction déterminé de manière à obtenir des fragments bicaténaires comprenant un reste de séquence dudit site de restriction, et, contiguë audit reste de séquence, une séquence interne propre à chaque fragment ; éventuellement ligation d'un oligonucléotide adaptateur bicaténaire à séquence déterminée aux extrémités des fragments bicaténaires obtenus par digestion dudit ADN pour obtenir des fragments bicaténaires adaptés, amplification des fragments bicaténaires, éventuellement liés à l'oligonucléotide adaptateur bicaténaire, par une réaction de polymérisation en chaîne au moyen d'une amorce complémentaire audit reste de séquence dudit site de restriction et éventuellement à l'oligonucléotide adaptateur bicaténaire, marquage des fragments bicaténaires, éventuellement liés à l'oligonucléotide adaptateur

bicaténaire, pendant ou après leur amplification, au moyen d'un marqueur,

Dénaturation des fragments bicaténaires marqués, éventuellement liés à l'oligonucléotide adaptateur bicaténaire, de manière à obtenir une collection de fragments monocaténaires de l'acide désoxyribonucléique provenant de l'organisme éventuellement liés à l'oligonucléotide adaptateur monocaténaire, hybridation de ladite collection de fragments sur une puce d'hybridation, ladite puce d'hybridation comprenant un support sur lequel est fixée une matrice ordonnée de sondes d'acides nucléiques, lesdites sondes comprenant une première et une deuxième parties de séquence, la première partie de séquence étant constante d'une sonde à l'autre et au moins complémentaire au reste de la séquence du site de restriction déterminé, et la deuxième partie de séquence, contiguë à ladite première partie de séquence, étant variable d'une sonde à l'autre et constituée de combinaisons déterminées de bases azotées choisies de telle manière que la matrice ordonnée de sondes comprenne les sondes capables de s'hybrider spécifiquement aux différents fragments d'acide nucléique de ladite collection lorsque les fragments ne sont pas liés à l'oligonucléotide adaptateur monocaténaire ; ladite première partie de séquence qui est constante d'une sonde à l'autre de ladite puce et complémentaire au reste de la séquence du site de restriction de l'enzyme de restriction utilisée étant en outre complémentaire à l'oligonucléotide adaptateur

lorsque les fragments sont liés l'oligonucléotide adaptateur monocaténaire, rinçage de la puce notamment pour éliminer les fragments non hybridés et séchage.

2. Procédé selon la revendication 1, dans lequel l'enzyme de restriction utilisée est choisie parmi EcoR I, Aat II, Sno I, Bgl II, Bln I, Bse AI, Cla I.

3. Procédé selon la revendication 1 comprenant l'étape de ligation d'un oligonucléotide adaptateur bicaténaire, dans lequel l'enzyme de restriction utilisée coupe l'ADN en laissant des extrémités cohésives, l'oligonucléotide adaptateur choisi ayant une extrémité qui correspond parfaitement à l'extrémité cohésive de l'enzyme de restriction utilisée.

4. Procédé selon la revendication 1, dans lequel l'enzyme de restriction utilisée est EcoRI.

5. Procédé selon la revendication 3, dans lequel l'oligonucléotide adaptateur est constitué de l'oligonucléotide bicaténaire suivant :

5'-CTCGTAGACTGCGTACC-3' 3'-CATCTGACGCATGGTTAA-5'.

6. Procédé selon la revendication 3, dans lequel les étapes de digestion et de ligation sont effectuées simultanément.

7. Procédé selon la revendication 1, dans lequel deux enzymes de restriction sont utilisées pour digérer l'ADN extrait.

8. Procédé selon la revendication 7, dans lequel les enzymes sont Taql et EcoRI.

9. Procédé selon la revendication 7 ou 8 comprenant l'étape de ligation d'un oligonucléotide adaptateur bicaténaire, dans lequel les deux enzymes de restriction utilisées coupent l'ADN en laissant des extrémités cohésives, l'oligonucléotide adaptateur choisi ayant une extrémité qui correspond parfaitement à l'extrémité cohésive d'un seul des deux enzymes de restriction utilisées.

10. Empreinte génétique obtenue par un procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 9.

11. Empreinte génétique selon la revendication 10, dans laquelle l'organisme est choisi parmi un animal, un végétal, un insecte ou un microorganisme.

12. Procédé d'identification d'un organisme comprenant de l'ADN ou d'un échantillon comprenant de l'ADN, ledit procédé comprenant les étapes suivantes : - a) la fabrication d'une première empreinte génétique d'un organisme référence par un protocole suivant le procédé selon la revendication 1, ladite première empreinte

constituant l'empreinte génétique dudit organisme référence associée au protocole utilisé, - b) la fabrication d'une deuxième empreinte génétique à partir d'un organisme à identifier ou d'un échantillon à identifier suivant le même protocole que dans l'étape a), et - c) la comparaison de la première empreinte obtenue à l'étape a) avec la deuxième empreinte obtenue à l'étape b), une identité de la première et de la deuxième empreintes révélant le cas échéant que l'organisme, ou l'échantillon à identifier, présente la même identité que, ou provient de, l'organisme référence.

13. Procédé selon la revendication 12, dans lequel l'organisme référence est un animal, et dans lequel l'organisme ou l'échantillon à identifier est un animal ou un échantillon d'animal à identifier.

14. Procédé selon la revendication 12, dans lequel l'organisme référence est un animal destiné à produire de la viande pour l'alimentation humaine, et l'échantillon à identifier est un morceau de viande destiné à la vente.

15. Procédé selon la revendication 12, dans lequel l'organisme référence est une plante, et dans lequel l'organisme ou l'échantillon à identifier est une plante ou un échantillon de plante à identifier.

ib. procede selon la revendication i, dans lequel l'individu référence est un cépage de vigne référence, et dans lequel l'échantillon à identifier est un échantillon de raisin ou de vin.

17. Procédé selon la revendication 12, dans lequel l'individu référence est un suspect, et l'échantillon à identifier est un tissu humain susceptible de provenir dudit suspect.

18. Utilisation d'un procédé selon la revendication 1 dans l'identification de gènes intervenant dans des caractères détectables tels que des maladies d'origine génétique.