FR2941698A1 - Procede d'identification de microorganisme, sans a priori et kit d'identification - Google Patents
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Abstract
La présente invention concerne un couple d'hexamères et un couple d'amorces particuliers pour l'identification de microorganismes, sans a priori, dans un échantillon. La présente invention concerne également un procédé d'identification de microorganisme(s), ainsi qu'un kit d'identification de microorganismes, utilisant les hexamères et amorces susmentionnés.
Description
Domaine de l'invention : La présente invention se rapporte à un couple d'hexamères et un couple d'amorces, aptes à s'hybrider suffisamment souvent sur une séquence d'acide nucléique pour amplifier un fragment, tel qu'un fragment de 400 nucléotides, de n'importe quel génome ou transcriptome de microorganisme. La présente invention se rapporte aussi à un procédé permettant l'obtention de fragments d'ADN susceptibles d'être séquencés directement, sans a priori sur l'espèce recherchée.
La présente invention se rapporte aussi à un kit d'identification de microorganisme(s).
Problématique et état de la technique : Les infections microbiennes, c'est-à-dire l'infection d'un organisme hôte par un microorganisme, sont l'une des causes majeures de morbidité dans les populations en général. Afin d'établir un diagnostic efficace d'une maladie ou d'une infection et de déterminer le traitement approprié, il est important d'identifier rapidement et précisément l'agent pathogène à l'origine de l'infection.
En outre, en épidémiologie, l'identification du microorganisme entrainant l'infection est importante car il peut aider à déterminer la source, ainsi que le mode de transmission de l'infection en question. De plus, la connaissance de la séquence génomique, entière ou partielle, d'un microorganisme est le moyen le plus efficace pour l'identifier et le situer dans la classification des espèces. Le document EP 0 077 149 décrit une méthode dite classique pour l'identification de microorganismes inconnus. Cette méthode consiste à ajouter à un échantillon contenant le microorganisme inconnu, un agent émetteur tel qu'un aminoacide radioactif, afin d'obtenir un mélange de produits émetteurs, ceci dépendant du mécanisme métabolique du microorganisme. Après incubation, la réaction est interrompue et les produits émetteurs sont séparés comme par électrophorèse sur une plaque de gel. La plaque peut être alors autoradiographiée par exposition à un film photographique afin d'obtenir sur celui-ci une image des bandes caractéristiques fonctionnant comme un moyen d'identification du microorganisme. L'identification peut être effectuée en comparant le moyen d'identification pour le microorganisme inconnu avec un ensemble de moyens d'identification de microorganismes connus, afin de trouver une correspondance avec l'un de ces microorganismes connus.
La comparaison peut être réalisée par examen approfondi des agents d'identification inconnus afin de produire un signal qui est comparé aux signaux représentant les agents d'identification connus stockés dans un ordinateur. Alternativement, les produits émetteurs, après séparation, peuvent être détectés par examen approfondi direct afin de fournir un signal d'identification pour un procédé par ordinateur. Le document EP 0 151 8855 décrit également un procédé classique pour l'identification d'un microorganisme dans un échantillon. Le microorganisme est exposé à des conditions conduisant à son développement en présence de plusieurs substrats de croissance qui sont inoculés individuellement avec le microorganisme. La présence ou l'absence d'anhydride carbonique comme sous-produit du métabolisme de ces substrats est détectée par analyse infra-rouge et fournit un profil du microorganisme inconnu. L'identification est effectuée en comparant ce profil avec ceux de microorganismes connus traités de la même manière. Aussi, les méthodes d'indentification de microorganismes inconnues comprennent généralement : la mise en culture d'un échantillon pris chez un patient malade (échantillon de sang), la reculture sur un milieu de croissance sélectif. Ensuite, prennent place les caractérisations biochimiques du microorganisme en question qui peuvent être faites par : un test de production d'indole, une coloration des bactéries gram négatifs ou gram positifs, l'étude de la morphologie des colonies, etc. Ces méthodes nécessitent beaucoup de mises en culture et 30 prennent du temps, notamment lorsque le microorganisme impliqué dans l'infection est à croissance lente. D'autre part, la détection de la présence d'un microorganisme grâce à la technologie liée à l'ADN est devenue importante pour diagnostiquer des maladies. 35 Le séquençage est devenu en effet un processus simple aujourd'hui. Il nécessite l'obtention d'ADN double brin en quantité suffisante et de longueur suffisante, ce qui est réalisé classiquement par PCR (amplification en chaîne par polymérase) ou RT-PCR (la PCR par transcriptase inverse) à partir d'acides nucléiques extraits de l'espèce étudiée.
Toutefois, dans le cas de microorganismes inconnus, cette étape est le coeur du problème : la RT-PCR repose en effet sur l'hybridation de deux amorces d'ADN complémentaires de la séquence étudiée et il est, par définition, impossible de réaliser une amorce dont la séquence soit complémentaire d'une séquence que l'on ignore.
Les solutions décrites dans l'état de la technique sont de trois types : 1) la PCR par familles : elle repose sur l'utilisation de séquences consensus pour certaines familles de virus. Cette solution n'envisage pas un pathogène réellement inconnu, mais une suspicion d'appartenance à une famille virale. Par ailleurs, toutes les familles virales ne présentent pas de zones conservées sur leur génome. 2) la bioinformatique : qui consiste à un séquençage haut débit, au hasard, de petits fragments d'ADN (Shotgun) et à une reconstruction des séquences par ordinateur. Toutefois, ces processus sont longs, coûteux et requièrent des équipes spécialisées. 3) la PCR au hasard (random PCR) : Allander et collaborateurs ont réalisé les PCR à partir d'amorces en deux parties : un hexamère de 6 nucléotides aléatoires (6N, random) qui s'hybride sur n'importe quelle séquence d'ADN et une étiquette (tag) de séquence fixée de 20 nucléotides en 5' : 5' TAG- -3'. Cette amorce dégénérée permet la synthèse d'un premier brin d'ADN (transcription inverse par exemple), puis d'un second (avec par exemple une klenow polymérase), initiés aléatoirement. Une PCR classique est ensuite réalisée avec une amorce ciblant les étiquettes pour amplifier les ADN obtenus. Elle permet la multiplication du nombre de brins d'ADN, les amorces s'hybridant sur toutes les séquences possibles. Les produits de PCR sont déposés sur gel d'agarose. Les amorces s'hybridant de façon complètement aléatoire, toutes les tailles possibles de fragments des produits de PCR sont obtenues, il n'y a donc pas de bandes isolées (sur le gel d'agarose, on n'observe non pas des bandes isolées mais un continuum de bandes). Les produits de PCR séquençables, de taille 300- 600 nucléotides, sont excisés à partir du morceau de gel correspondant, puis clonés dans des bactéries après purifications. Un certain nombre de clones sont alors analysés par séquençage et un programme informatique réalise automatiquement la comparaison des séquences avec les bases de données génétiques disponibles sur internet, telles que BLAST. BLAST (basic local alignment search tool) est en effet un algorithme utilisé en bio-informatique permettant de trouver les régions similaires entre deux ou plusieurs séquences de nucléotides ou d'acides aminés. Ce programme permet de calculer significativement les pourcentages de similitude entre les séquences en les comparant avec des banques de données. Toutefois, le fait d'avoir une PCR complètement aléatoire, qui génère une infinité de fragments même lorsqu'un seul acide nucléique, typiquement un génome viral, est analysé peut présenter les inconvénients suivants : - Il s'agit ainsi d'une amplification au hasard de n'importe quelle séquence d'acide nucléique. Il y a donc une étape de préparation de l'échantillon avant le traitement par biologie moléculaire, puis une étape de bioinformatique afin de supprimer tous les acides nucléiques et signaux ne relevant pas du pathogène. - Après l'étape de PCR inverse (RT-PCR), l'étape de clonage dans des bactéries est indispensable. En effet un très grand nombre de fragments de PCR sont générés, et doivent être individualisés par le clonage dans des bactéries, ce qui augmente le nombre de séquences à réaliser. - Un échantillon contenant un virus pur donne exactement le même profil de PCR qu'un échantillon contenant un acide nucléique provenant de l'hôte, de cellules, etc. Il n'y a donc pas de contrôle de réaction avant l'étape ultime de séquençage et de comparaison de séquence, d'où un surcoût en temps de travail monopolisé et en coût financier. - Dans le cas ou plusieurs virus pourraient être présents dans l'échantillon de départ, le moins représenté sera perdu lors de l'amplification ou de l'analyse des clones bactériens, dominé par le plus représenté (effet stochastique). - Le processus est lent et nécessite de nombreuses manipulations : il faut deux à trois jours pour réaliser l'intégralité de la réaction en particulier compte tenu des étapes de clonage en bactéries, entraînant un impact en termes de monopolisation des ressources humaines, matérielles et financières.
Résumé de l'invention : L'invention a pour but de proposer un nouveau procédé d'identification de microorganismes qui évite tout ou partie des 10 inconvénients précités. A cet effet, l'invention concerne un couple d'hexamères pour PCR pour la détection de microorganismes, comprenant un premier hexamère destiné à être placé à l'extrémité 3' d'une première amorce et un deuxième hexamère destiné à être placé à l'extrémité 3' d'une seconde 15 amorce, ledit couple d'hexamères étant susceptible d'être obtenu par le procédé consistant à : a) découper les séquences de génomes d'au moins cinq virus de familles différentes en groupes de six nucléotides successifs, b) classer les séquences de six nucléotides, dits hexamères, en 20 fonction de leur fréquence d'occurrence, c) sélectionner les couples d'hexamères présentant la fréquence d'occurrence la plus représentée, tels que les vingt premiers hexamères, de préférence les dix premiers, de manière encore plus préférée les cinq premiers présentant une fréquence d'occurrence 25 la plus importante par rapport aux autres couples d'hexamères, de sorte à obtenir un couple d'amorces aptes à s'hybrider statistiquement souvent sur n'importe quelle matrice d'acide nucléique. Le présent demandeur a en effet découvert des hexamères non 30 dégénérés, mais qui au contraire, présentent une séquence fixe, ces hexamères étant aptes à s'hybrider statistiquement souvent, mais pas trop afin de ne pas amplifier un trop grand nombre de séquences pour un acide nucléique source donné. Le présent demandeur a ainsi réalisé un choix parmi l'infinie possibilité d'hexamères existants. 35 Avantageusement, le premier et le deuxième hexamères sont choisis parmi : Premier hexamère Deuxième hexamère (écriture des hexamères de 5' en 3') (écriture des hexamères de 5' en 3') TTGTAA TTACAA TCATCA TTGTAA AAAGAA TTGTAA GGAAAA TTTTCC GAAAGA TCTTTC GGAAGA TCTTCC AGAAAA TTTTCT GGGAAA TTTCCC AAGAAA TTTCTT AACATG CATGTT GAAAAA TTTTTC AAGGAA TTCCTT GGAAAG CTTTCC TGGAAA TTTCCA AAAAAA TTTTTT GAAGAA TTCTTC AGGAGA TCTCCT AAAAAG CTTTTT AAAAGA TCTTTT ACATGG CCATGT AGAAGA TCTTCT TGATGA TCATCA TGGAAG CTTCCA CATGGA TCCATG AGGAAA TTTCCT TGGGAA TTCCCA AGAGAA TTCTCT Les hexamères de la seconde liste (colonne de droite) sont les hexamères inverse et complémentaires de ceux de la première liste (colonne de gauche) puisque les hexamères de chacune des deux listes sont destinés à appartenir aux deux amorces d'amplification, l'une jouant le rôle d'amorce dite sens , donc par convention de séquence identique à celle de la matrice à amplifier, et l'autre jouant le rôle d'amorce antisens, donc par convention de séquence inverse et complémentaire de celle de la matrice à amplifier, de telle sorte que les deux amorces puissent s'hybrider tour à tour sur les brins d'ADN synthétisés lors des cycles de PCR à partir de la matrice initiale. La présente invention concerne également un couple d'amorces pour la détection de microorganismes, comprenant une première amorce sens et une seconde amorce, la première amorce comprenant à son extrémité 3' un premier hexamère tel que défini ci-dessus et la seconde amorce comprenant à son extrémité 3', le deuxième hexamère tel que défini ci-dessus, la première et seconde amorces pouvant être une amorce sens et une amorce anti-sens ou une amorce anti-sens et une amorce sens. De préférence, la première ou seconde amorce comprend à son CGGTCATGGTGGCGAATAAATCGAGCGGC-3', et à la condition que l'étiquette de la première amorce soit différente de l'étiquette de la seconde amorce et ne corresponde pas non plus à une de ses variantes. En particulier, la première et seconde amorces présentent la séquence choisie parmi : BOPsb6.10 5'- CGGTCATGGTGGCGAATAAATCGAGCGGCTTGTAA-3' et Fr20sb : 5' GCCGGAGCTCTGCAGATATCAGGGCGTGGT TTACAA-3' ou FR20 : 5'-GCCGGAGCTCTGCAGATATC TTACAA -3' et BOP : 5'-CGGTCATGGTGGCGAATAAATTGTAA -3'. La présente invention se rapporte aussi à un procédé d'identification de microorganisme(s) dans un échantillon comprenant le couple d'amorces tel que défini ci-dessus, ledit procédé comprenant les étapes consistant à : i) Si nécessaire, préparer ledit échantillon afin d'éliminer les acides nucléiques non issus du ou des microorganismes recherchés, ii) si l'échantillon obtenu à l'étape i) est un ARN, effectuer une étape de transcription inverse avec ladite première amorce ou la seconde amorce et une enzyme possédant une activité transcriptase inverse, iii) ajouter un mélange réactionnel de PCR comprenant la première et seconde amorce et effectuer une première PCR de pré-amplification avec une phase d'hybridation à basse température, telle qu'aux alentours de 45°C, et éventuellement une seconde PCR avec une hybridation à haute température, telle que 50°C, iv) analyser les résultats de la PCR. extrémité 5' une étiquette choisie parmi : FR20 : 5'- GCCGGAGCTCTGCAGATATC-3' ou sa variante Fr20sb : 5' GCCGGAGCTCTGCAGATATCAGGGCGTGGT-3', BOP : 5'- CGGTCATGGTGGCGAATAAA-3' ou sa variante BOPsb : 5'- Avantageusement, les produits obtenus à l'étape iv) sont analysés sur gel d'agarose. De préférence, les bandes PCR obtenues sur ledit gel d'agarose sont découpées, purifiées et séquencées.
Selon une caractéristique de l'invention, au moins deux des différentes étapes du procédé i), ii), iii) et iv sont réalisés dans le même tube réactionnel. Selon une autre caractéristique de l'invention, la première PCR de pré-amplification comprend au moins 2 cycles.
De manière préférentielle, chaque cycle de la première PCR comprend une phase de dénaturation à 90°C à 99°C, de préférence 94°C pendant sensiblement 30s, une phase d'hybridation à basse température de 30°C à 50°C, de préférence 37°C pendant sensiblement 30s et une phase d'élongation de 60°C à 80°C pendant sensiblement 2min.
Avantageusement, la deuxième PCR est une PCR classique comprenant 35 cycles. Un but de la présente invention concerne également un kit d'identification de microorganisme(s), caractérisé en ce qu'il comprend : a- le couple d'amorces tel que défini ci-dessus, b - éventuellement un mélange réactionnel de PCR, c - et une notice d'emploi. Description détaillée de l'invention : Pour mieux faire comprendre l'objet de l'invention, des exemples de réalisation vont être décrits. La description de l'invention qui va suivre est donnée à titre d'exemples purement illustratifs et non limitatifs en référence aux dessins annexés : Sur le dessin : - la figure 1 représente des bandes de PCR obtenues à l'aide du procédé selon l'invention à partir d'échantillons de : surnageants de culture virale de l'encéphalite de Saint-Louis (SLE), d'encéphalite à tique (Tick Borne Encéphalitis, TBE), de fièvre de la vallée du Rift (RVF) et des cellules non infectées ; - la figure 2 représente des bandes de PCR obtenues à l'aide du procédé selon l'invention à partir d'échantillons issus d'un extrait d'acides nucléiques réalisé à partir du sang d'un patient (piste 1) et à partir du surnageant de mise en culture dudit sang (piste 2); - la figure 3 représente des bandes de PCR obtenues à l'aide du procédé selon l'invention à partir d'échantillons issus : d'un surnageant de culture d'un virus inconnu provenant d'une petite flambée d'atteinte dermatologique dans un foyer de personnes âgées (collaboration avec l'Unité de virologie d'un hôpital hospitalier, échantillons Cl et C2), de sang de donneur et de surnageants de culture de parasites mis en culture avec ce sang (paludisme, collaboration avec un laboratoire de parasitologie travaillant sur le paludisme, échantillons sang donneur et de souches de parasite du paludisme 307, W2, FCR3, BREI) ; - la figure 4 représente des bandes de PCR obtenues à l'aide du procédé selon l'invention à partir d'un échantillon d'une souche virus issue d'un cas diagnostiqué comme Dengue 3 hémorragique provenant du Cambodge.
A û mise au point des amorces
Séquences d'hybridation Pour pallier les inconvénients susmentionnés, des amorces dont l'hexamère est de séquence fixe et qui s'hybrident souvent ont été utilisées par rapport aux amorces avec hexamères dégénérés 6N qui s'hybrident partout décrits dans Allander et la. Mathématiquement, un hexamère de séquence donnée s'hydride au moins une fois tous les 4096 nucléotides (1/46). Biologiquement, toutes les séquences de 6 nucléotides ne sont pas équivalentes (typiquement une série de 6 guanosines est rare). Par informatique, un découpage des séquences des génomes de cinq virus de familles différentes (rougeole, ebola, dengue 2 (x2), dengue 3, disponibles sous Pubmed) en groupes de 6 nucléotides successifs, a été réalisé. Puis, un classement selon leur fréquence d'occurrence a été effectué, afin de sélectionner les hexamères en moyenne les plus représentés dans les génomes viraux. Le nombre de virus sélectionné (5) est faible, mais dans tous les tests, l'ajout de nouveaux virus n'a pas modifié les hexamères en tête de classement. Il n'a pas été possible de trouver des heptamères (7 nt) et a fortiori des octamères (8 nt) communs à plusieurs virus.
Un certain nombre de séquences d'hexamères ont été testées afin de retenir des séquences convenables, s'hybridant suffisamment souvent pour amplifier n'importe quel acide nucléique, mais pas trop souvent afin de ne pas amplifier un trop grand nombre de séquences pour un acide nucléique source donné. Un hexamère est à la base d'une première amorce (sens ou anti-sens), un second hexamère à la base d'une seconde amorce (anti-sens ou sens suivant la première amorce). En particulier, les couples d'hexamères qui peuvent être utilisés sont récapitulés dans le tableau ci-dessus et en particulier. Un couple d'hexamères convenant pour la présente invention peut être le couple TTGTAA pour la première amorce et TTACAA pour la seconde amorce par exemple.
Séquences d'étiquette Dans la technique utilisée par Allander, une seule étiquette est utilisée pour la PCR. Les fragments de PCR amplifiés possèdent donc les mêmes extrémités (l'étiquette et son complémentaire). Cette symétrie des extrémités empêche un séquençage direct des produits de PCR obtenus (il y aurait séquençage du fragment de PCR dans les deux sens concomitamment donc impossibilité de résoudre la double séquence). Deux étiquettes différentes ont été sélectionnées : FR20 : 5'- GCCGGAGCTCTGCAGATATC-3' ou sa variante Fr20sb : 5' GCCGGAGCTCTGCAGATATCAGGGCGTGGT-3', BOP : 5'-CGGTCATGGTGGCGAATAAA-3' ou sa variante BOPsb : 5'-CGGTCATGGTGGCGAATAAATCGAGCGGC-3'. Ces amorces permettent l'amplification de fragments de PCR asymétriques , susceptibles d'être séquencés directement. En effet, l'utilisation d'étiquettes différentes et non complémentaires entre les deux amorces permet de séquencer directement le fragment de PCR sans avoir un amplicon de PCR qui se replie sur lui même (difficile à amplifier). Par conséquent, les amplicons symétriques sont éliminés.
Pour la suite des exemples, le couple d'amorces utilisé est le suivant : Fr20sb : 5' GCCGGAGCTCTGCAGATATCAGGGCGTGGT TTACAA-3' (première amorce) et BOPsb6.10 5'-CGGTCATGGTGGCGAATAAATCGAGCGGCTTGTAA-3' (seconde amorce).
B- Déroulement du procédé selon l'invention, dit aussi procédé de la RT-PCR ou PCR aléatoire
Comme pour Allander et collaborateurs, dans la mesure où la technique utilisée amplifie n'importe quel acide nucléique, il convient d'avoir comme matériel initial un échantillon ne contenant que le micro organisme étudié. Typiquement des cellules infectées sont un mauvais matériel de départ car les ARNs ribosomaux de l'hôte sont fortement majoritaires, en revanche le surnageant clarifié de ces mêmes cellules non lysées est un échantillon convenable, et c'est ce type d'échantillon qui sera illustré dans les exemples. L'acide nucléique purifié est soumis à une première étape de transcription inverse, avec la première amorce et une enzyme possédant une activité de transcription inverse, telle que AMV RT, Promega, etc (enzymes connues de l'homme du métier). Cette étape dure environ 40 minutes et permet la synthèse d'un premier brin d'ADN, lorsque l'échantillon de départ est un ARN. Si l'échantillon de départ contient uniquement de l'ADN, cette étape est sans effet. Dans le même tube est ajouté un mélange réactionnel de PCR connu de l'homme du métier (type Master Mix Qiagen) qui contient la seconde amorce. Le tout est soumis à 5 cycles de PCR peu sélectifs (dénaturation 94°C 30 s, hybridation à basse température 37°C 30 s, élongation 72°C 2 minutes). Cette étape permet la synthèse du second brin à partir d'un échantillon d'ARN, ou du premier puis du second brin à partir d'un échantillon contenant de l'ADN. Cette étape dure environ 40 minutes. Dans le même tube sont ajoutées enfin une nouvelle fois les deux amorces, afin de réaliser l'amplification, par 35 cycles de PCR classique. Cette étape dure environ 2,5 heures. Selon une variante de réalisation, les deux étapes précédentes de PCR, peuvent être groupées en une seule étape si l'utilisateur fait se suivre directement les deux phases de PCR de 5 cycles puis 35 cycles sur le thermocycleur utilisé, sans ajout supplémentaire intermédiaire des deux amorces, celles-ci étant fournies en excès au départ de la réaction. Les échantillons post PCR sont ensuite analysés sur gel d'agarose et les éventuelles bandes de PCR obtenues découpées, purifiées et séquencées. Environ 80% des bandes directement séquencées conduisent à l'obtention d'une séquence. Il est à noter que sur de surnageants de culture virale, l'étape d'extraction des acides nucléiques n'est pas indispensable : quelques microlitres de culture directement dans le mélange de RT suffisent à réaliser la réaction. Ainsi, la réaction mise au point par le présent demandeur permet d'amplifier dans un tube réactionnel unique, avec des protocoles et des matériels courants de laboratoires, en moins de 4 heures, au moins une bande de PCR ou RT-PCR à partir de n'importe quel acide nucléique de taille supérieure à environ 3 000 nucléotides, cette bande étant directement séquençable dans la grande majorité des cas.
Maintenant, des exemples d'identification selon l'invention purement illustratifs et non limitatifs de la portée de l'invention vont être 20 décrits.
Exemple 1 : Parvovirus et C6/36 Le procédé d'identification de microorganisme a été validé sur des virus détenus au laboratoire, recherchés à l'aveugle. 25 Le procédé selon l'invention mentionné au point B a été mis en oeuvre par un technicien de laboratoire sur des surnageants de culture virale de l'encéphalite de Saint-Louis (SLE), d'encéphalite à tique (Tick Borne Encéphalitis, TBE), de fièvre de la vallée du Rift (RVF) et des cellules non infectées (voir figure 1). Les étoiles indiquent les bandes 30 séquencées. Comme le montre cette figure 1, des bandes d'amplification, correspondant après séquençage aux virus attendus dans chacun des cas ont bien été retrouvées. Cette étude a permis en outre, sur l'échantillon RVF d'amplifier 2 35 bandes de PCR, l'une correspondant effectivement au virus RVF attendu, l'autre correspondant à un parvovirus d'insecte, Aedes Alpopictus Parvovirus (AaPV). Après recherche bibliographique, il s'agit d'un parvovirus ayant déjà été trouvé comme infectant de façon chronique une lignée de cellules C6/36, cellules qui proviennent d'Aedes albopictus (Boublik Y . et ai, Cloning, sequencing and infectious plasmid construction of a new parvovirus, the Aedes Albopictus Parvovirus, pathogenic for the mosquito Aedes Aegypti larvae, thèse Université Aix Marseille, 1993).
Exemple 2 : Sang Patient X Un échantillon de sang dont le diagnostic était initialement peu clair a été étudié avec le présent procédé. Ce sang contenait un virus qui a été préalablement amplifié par une mise en culture. Le protocole de RT-PCR aléatoire selon l'invention a été appliqué sur deux échantillons : un extrait d'acides nucléiques réalisé à partir du sang du patient (piste 1) et le surnageant de mise en culture (piste 2). Comme le montre la figure 2, l'échantillon de sang (1) a conduit à l'identification des ARN ribosomaux du patient, qui étaient présents dans l'extrait. Ce résultat a seulement confirmé que le patient était bien un homo sapiens sapiens, il souligne toutefois l'importance de la préparation de l'échantillon avant la PCR aléatoire afin d'éliminer les acides nucléiques non issus du micro organisme recherché. Le surnageant de culture virale (piste 2) a permis en revanche l'identification du virus de la dengue 2, souche martiniquaise, résultat 25 confirmant celui que l'équipe de diagnostic avait eu entre temps.
Exemple 3 : Reproductibilité et microorganismes non viraux (figure 3) Le procédé d'identification unique selon l'invention a été mis en oeuvre sur différents échantillons (voir figure 3). 30 Toutes les bandes séquencées correspondaient à des mycoplasmes ayant contaminé les cultures, de deux souches différentes, une pour les échantillons Cl et C2 d'un laboratoire hospitalier, la seconde pour les échantillons de culture de parasites du paludisme. Cette série d'expériences permet également de valider la 35 reproductibilité du procédé selon l'invention. En effet, le principe réactionnel utilise de fait une probabilité plutôt qu'un hasard : si pour un échantillon inconnu les amorces utilisées ont une certaine probabilité de s'hybrider quelque part sur l'acide nucléique considéré, pour un échantillon donné, les amorces s'hybrident toujours au même endroit. En d'autres termes, les mêmes causes produisent les mêmes effets : des échantillons contenant le même microorganisme conduisent à l'amplification des mêmes séquences, de façon reproductible, donc à l'obtention des mêmes bandes de PCR ou RT-PCR. Ainsi, les mycoplasmes de souches différentes, provenant du laboratoire hospitalier ou de sang du donneur, conduisent à l'obtention de bandes de PCR différentes, mais les échantillons d'origine similaire, échantillons du laboratoire hospitalier d'une part, de culture avec le même sang d'autre part, conduisent individuellement à l'obtention des mêmes bandes de PCR aboutissant aux mêmes séquences dans chacun des deux groupes considérés.
Ceci représente le net avantage par rapport au protocole d'Allander et collaborateurs : sur les séries présentant une origine similaire, il n'est pas nécessaire de séquencer toutes les bandes identiques, car elles conduiront avec certitude aux mêmes séquences finales.
Exemple 4 : Virus inconnus Une souche virus issue d'un cas diagnostiqué comme Dengue 3 hémorragique provenant du Cambodge a ensuite été analysée. Rapidement il est apparu que le comportement du virus en culture cellulaire était surprenant pour une dengue (effet cythopathogène particulièrement marqué et rapidement développé). Les tests en RT-PCR Taqman spécifiques de la dengue 3 se sont révélés négatifs, de même que les tests des autres sérotypes de dengue ou même que les tests dengue universels réalisés.
Le procédé de RT-PCR aléatoire a été appliqué : à deux extraits de surnageant de culture sur cellules VERO de ce virus (24h post infection =24h p. i et 48h post infection = 48h p. i.) et contrôle sur un surnageant de cellules non infectées (-) (figure 4). Les séquences d'acide nucléique obtenues, identiques, ne correspondent à aucune séquence disponible dans les bases de données (Pubmed). La séquence traduite présente toutefois des homologies avec la séquence de la polymérase d'un bunyaviridae, CiLV ou Citrus Leprosis virus, une arbovirose du citronnier transmise par une mite. Ce résultat peut paraître surprenant, homologie avec un virus végétal pour une hémorragie humaine. Toutefois, si la famille des bunyaviridae comprend des virus de mammifères (bunyavirus, nairovirus, hantavirus), elle comprend également tout un genre de virus de plantes, les Tospovirus. La RT-PCR aléatoire donne donc une piste pour chercher un virus de la famille des bunyaviridae.
Le procédé selon l'invention donne un résultat très rapide lorsque la séquence obtenue trouve une homologie significative dans les bases de données. Toutefois, étant donné que cette séquence obtenue n'est pas choisie, elle peut correspondre à des régions non séquencées de génomes ou à des microorganismes non connus. Dans ce cas, elle sert de piste pour orienter l'identification par d'autres moyens, qui demandera des délais. Par conséquent, le procédé selon l'invention est facile de mise en oeuvre dans un laboratoire courant, il est rapide, il permet de faire des contrôles en cours de réaction afin de ne pas faire de séquençages inutiles, en aveugle. De plus, sur les différents exemples présentés ici, le procédé selon l'invention a démontré son efficacité en terme de biologie moléculaire et sa capacité à fournir des informations sur les pathogènes étudiés. En outre, le procédé de RT-PCR aléatoire peut être appliqué à la 25 recherche de tout micro organisme, quelle que soit l'espèce, tant qu'il possède un acide nucléique.
Bien que l'invention ait été décrite en relation avec un mode de réalisation particulier, il est bien évident qu'elle n'y est nullement limitée 30 et qu'elle comprend tous les équivalents techniques des moyens décrits ainsi que leurs combinaisons si celles-ci entrent dans le cadre de l'invention.
Claims (13)
- REVENDICATIONS1. Couple d'hexamères pour PCR pour l'identification et la détection d'un microorganisme, comprenant un premier hexamère destiné à être placé à l'extrémité 3' d'une première amorce et un deuxième hexamère présentant une séquence inverse et complémentaire dudit premier hexamère et destiné à être placé à l'extrémité 3' d'une seconde amorce, ledit premier hexamère étant susceptible d'être obtenu par le procédé consistant à : a) découper les séquences de génomes d'au moins cinq virus de familles différentes en groupe de six nucléotides successifs formant des groupes d'hexamères, b) classer les groupes d'hexamères en fonction de leur fréquence d' occurrence, c) sélectionner les groupes d'hexamères présentant la fréquence d'occurrence la plus représentée dans les génomes viraux par rapport aux autres groupes d'hexamères, tels que les vingt premiers hexamères, de sorte à obtenir au moins un groupe d'hexamères formant ledit premier hexamère, apte à s'hybrider sur la séquence d'acides nucléiques du microorganisme à détecter.
- 2. Couple d'hexamères selon la revendication 1, dans lequel le premier et le deuxième hexamères sont choisis parmi : Premier hexamère Deuxième hexamère (écriture des hexamères de 5' en 3') (écriture des hexamères de 5' en 3') TTGTAA TTACAA TCATCA TTGTAA AAAGAA TTGTAA GGAAAA TTTTCC GAAAGA TCTTTC GGAAGA TCTTCC AGAAAA TTTTCT GGGAAA TTTCCC AAGAAA TTTCTT AACATG CATGTT GAAAAA TTTTTC AAGGAA TTCCTT GGAAAG CTTTCC TGGAAA TTTCCA AAAAAA TTTTTT GAAGAA TTCTTC AGGAGA TCTCCTAAAAAG CTTTTT AAAAGA TCTTTT ACATGG CCATGT AGAAGA TCTTCT TGATGA TCATCA TGGAAG CTTCCA CATGGA TCCATG AGGAAA TTTCCT TGGGAA TTCCCA AGAGAA TTCTCT
- 3. Couple d'amorces pour la détection de microorganismes, comprenant une première amorce sens et une seconde amorce, la première amorce comprenant à son extrémité 3' un premier hexamère tel que défini dans les revendications 1 à 2 et la seconde amorce comprenant à son extrémité 3', le deuxième hexamère tel que défini selon les revendications 1 à 2, la première et seconde amorces pouvant être une amorce sens et une amorce anti-sens ou une amorce anti-sens et une amorce sens.
- 4. Couple d'amorces selon la revendication 3, dans lequel la première ou seconde amorce comprend à son extrémité 5' une étiquette choisie parmi : FR20 : 5'-GCCGGAGCTCTGCAGATATC-3' ou sa variante Fr20sb : 5' GCCGGAGCTCTGCAGATATCAGGGCGTGGT-3', BOP : 5'-CGGTCATGGTGGCGAATAAA-3' ou sa variante BOPsb : 5'-CGGTCATGGTGGCGAATAAATCGAGCGGC-3', et à la condition que l'étiquette de la première amorce soit différente de l'étiquette de la seconde amorce et ne corresponde pas non plus à une de ses variantes.
- 5. Couple d'amorces selon l'une des revendications 3 à 4, dans lequel la première et seconde amorces présentent la séquence choisie parmi : BOPsb6.10 5'- CGGTCATGGTGGCGAATAAATCGAGCGGCTTGTAA-3' et Fr20sb : 5' GCCGGAGCTCTGCAGATATCAGGGCGTGGT TTACAA-3' ou FR20 : 5'-GCCGGAGCTCTGCAGATATC TTACAA -3' et BOP : 5'-CGGTCATGGTGGCGAATAAATTGTAA -3'.
- 6. Procédé d'identification de microorganisme(s) dans un échantillon comprenant le couple d'amorces selon l'une des revendications 3 à 5, ledit procédé comprenant les étapes consistant à :18 i) Si nécessaire, préparer ledit échantillon afin d'éliminer les acides nucléiques non issus du ou des microorganismes recherchés, ii) si l'échantillon obtenu à l'étape i) est un ARN, effectuer 5 une étape de transcription inverse avec ladite première amorce ou la seconde amorce et une enzyme possédant une activité reverse transcriptase, iii) ajouter un mélange réactionnel de PCR comprenant la première et seconde amorces et effectuer une première 10 PCR de pré-amplification avec une phase d'hybridation à basse température, telle qu'aux alentours de 45°C, et éventuellement une seconde PCR avec une hybridation à haute température, telle que 50°C, iv) analyser les résultats de la PCR. 15
- 7. Procédé d'identification de microorganisme(s) selon la revendication 6, dans lequel les produits obtenus à l'étape iv) sont analysés sur gel d'agarose.
- 8. Procédé d'identification de microorganisme(s) selon la revendication 7, dans lequel les bandes PCR obtenues sur ledit gel 20 d'agarose sont découpées, purifiées et séquencées.
- 9. Procédé d'identification de microorganisme(s) selon l'une des revendications 6 à 8, dans lequel au moins deux des différentes étapes du procédé i), ii), iii) et iv) sont réalisés dans le même tube réactionnel. 25
- 10. Procédé d'identification de microorganisme(s) selon l'une des revendications 6 à 9, dans lequel la première PCR de pré-amplification comprend au moins 2 cycles.
- 11. Procédé d'identification de microorganisme(s) selon la revendication 10, dans lequel chaque cycle de la première PCR 30 comprend une phase de dénaturation à 90°C à 99°C, de préférence 94°C pendant sensiblement 30s, une phase d'hybridation à basse température de 30°C à 50°C, de préférence 37°C pendant sensiblement 30s et une phase d'élongation de 60°C à 80°C pendant sensiblement 2min.
- 12. Procédé d'identification de microorganisme(s) selon l'une 35 des revendications 6 à 11, dans lequel la deuxième PCR est une PCR classique comprenant 35 cycles.
- 13. Kit d'identification de microorganisme(s), caractérisé en ce qu'il comprend : a- le couple d'amorces selon l'une des revendications 3 à 5, b - éventuellement un mélange réactionnel de PCR, c - et une notice d'emploi.
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Non-Patent Citations (7)
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