EP2391737A2 - Amplification génique statistique pour l'identification sans a priori de micro-organismes par séquençage sans étape de clonage - Google Patents

Amplification génique statistique pour l'identification sans a priori de micro-organismes par séquençage sans étape de clonage

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Publication number
EP2391737A2
EP2391737A2 EP10710066A EP10710066A EP2391737A2 EP 2391737 A2 EP2391737 A2 EP 2391737A2 EP 10710066 A EP10710066 A EP 10710066A EP 10710066 A EP10710066 A EP 10710066A EP 2391737 A2 EP2391737 A2 EP 2391737A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
primer
pcr
hexamer
pair
sample
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP10710066A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Christophe Peyrefitte
Sebastien Plumet
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Direction General pour lArmement DGA
Etat Francais
Original Assignee
Direction General pour lArmement DGA
Etat Francais
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Filing date
Publication date
Application filed by Direction General pour lArmement DGA, Etat Francais filed Critical Direction General pour lArmement DGA
Publication of EP2391737A2 publication Critical patent/EP2391737A2/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes

Definitions

  • the present invention relates to a pair of hexamers and a pair of primers, able to hybridize sufficiently often on a
  • the identification can be carried out by comparing the identification means for the unknown microorganism with a set of means of identification of known microorganisms, in order to find a correspondence with one of these known microorganisms. The comparison can be accomplished by thorough examination / unknown identification of agents to produce a signal which is: bojmparé the signals representing the identifying agents known ..stockés' in a computer. Alternatively, the emitting products, after separation, can be detected by direct examination in order to provide an identification signal for a computer process. ⁇ . '
  • EP 0 151 8855 also describes a conventional method for identifying a microorganism in a sample.
  • the organism is exposed to conditions conducive to its development in the presence of several growth substrates which are individually inoculated with the ⁇ icroor ⁇ ganisme.
  • the presence or absence of carbon dioxide as a by-product of the metabolism of these substrates is detected by infra-red analysis and provides a profile of the unknown microorganism.
  • the identification is made by comparing this profile with those of known microorganisms treated in the same way. .. V.
  • identification of unknown microorganisms typically include: culturing a sample taken tin- ill patient (blood sample), the recultivation of a milf had 'd & selective growth. Then take place the biochemical characterizations of the microorganism in question which can be made p) ar: an indole production test, a staining of Grani negative or gram positive bacteria, the study of the morphology of colomésj etc.
  • PCRinverse (RT-PCR) step After the PCRinverse (RT-PCR) step, the cloning step in bacteria is essential. Indeed a very large number of PCR fragments are; generated, and must be individualized by cloning into bacteria, which increases the number of sequences to be achieved. ' - ⁇ cr- 7
  • a sample containing a pure virus gives exactly the same profile ; PCR sample containing a nucleic acid from the host, cells, etc. There is therefore no reaction control before the final step of sequencing and sequence comparison, at which an additional cost in monopolized working time and in financial cost.
  • the invention relates to a coupleld / hexamer for PCR for the detection of microorganisms, comprising a first hexamer for placing at the 3 'end of the first primer and a second hexamer for placing at the end of the first primer. 3 'end of a second primer, said pair of hexamers is likely to be obtained by the method of: y ? to cut the sequences of.
  • Genes of at least five viruses of different families in groups of six successive nucleotides b) classify the sequences of six nucleotides, so-called hexamers, according to their frequency of occurrence, c) select the pairs of hexamers having the frequency of case the ( ⁇ most represented, such as the first twenty hexamers, preferably the top ten, even more preferably the (five ⁇ firft having the largest frequency of occurrence compared to other pairs of hexamers to so as to "> obtain a pair of primers capable of hybridizing statistically often on any nucleic acid template. '
  • the applicant has indeed discovered non-degenerate hexamers, but which on the contrary, have a fixed sequence, these hexamers being able to hybridize statistically often, but not too much so as not to amplify too many sequences for one source nucleic acid.
  • the present applicant has thus made a choice among the infinite possibility of existing hexamers.
  • the first and second hexamers are chosen from: T FR2010 / 000148
  • the hexamers of the second list are the inverse hexamers and complementary to those of the first list (left column) since the hexamers of each of the two lists are intended to belong to the two amplification primers, one playing the role of so-called "sense" primer, therefore by sequence convention identical to, CeIIe of the matrix to be amplified, and the other playing the role of primer /, aritrsens, therefore by inverse sequence convention and complementary to that of of the matrix to be amplified, so that both.
  • Primers can hybridize in turn to the DNA strands synthesized during PCR cycles from the initial template.
  • the present invention also relates to a pair of primers for the detection of microorganisms, comprising a first sense primer and a second primer, the first primer comprising at its 3 'end a first hexamer as defined above and the second primer comprising its 3 'end, the second hexamer as defined above, the first and second primers being a sense primer and an antisense primer or an antisense primer and a sense primer.
  • the first or second primer comprises at its 5 'end a label chosen from: FR20: 5'-
  • the first and second) 'arrlb' rc have the sequence selected from: / x '5'BOPsb ⁇ .10
  • the present invention ⁇ e ⁇ also relates to a method of identifying microorganism (s) in a sample comprising the pair of primers as defined above, said method comprising the steps of: -: i) If necessary, prepare said sample to remove nucleic acids not derived from the microorganism (s) searched, ii) if the sample obtained in step i) is an RNA, perform
  • the products obtained in step iv) are analyzed on agarose gel.
  • the PCR bands obtained on said agarose gel are cut, purified and sequenced.
  • at least two of the different steps of process i), ii), iii) and iv are carried out in the same reaction tube. . : ⁇
  • the first pre-amplification PCR comprises at least 2 cycles. ...; ⁇ ⁇ : 'Preferentially, each cycle,> of the; first PCR comprises a denaturation phase at 9O 0 C to 99 ° ⁇ , preferably substantially 94 ° C for 30s, a phase of hybrMatjon low temperature of 30 0 C to 50 0 C, preferably 37 0 C for "( substantially 30s and a phase of elongation of 6O 0 C to 80 0 C for approximately 2min.
  • the second PCR is a conventional PCR comprising 35 cycles. /> ⁇ cv '
  • An object of the present invention is also to provide a microorganism identification kit (s); .characterized in that it comprises: a- the pair of primers as defined above, b - optionally .un ; PCR reaction mixture, c - and instructions for use.
  • FIG. 1 represents PCR bands obtained with the aid of
  • Tick Encephalitis Tick Encephalitis, TBE
  • RVF Rift Valley Fever
  • FIG. 2 represents PCR bands obtained using the process according to the invention from samples from a nucleic acid extract made from the blood of a patient (lane 1) and from the supernatant of culturing said blood (lane 2);
  • FIG. 3 represents PCR bands obtained using the method according to the invention from samples of a culture supernatant of an unknown virus originating from a small outbreak of dermatological damage.
  • a nursing home collaboration with the virology unit of a hospital hospital, samples C1 and C2
  • donor blood and parasite culture supernatants / cultured with this blood malaria, collaboration with , a laboratory parasitology working on pallidisme, donor blood samples and parasitic strains of malaria xdu 307, W2, FCR3, Brel
  • f ::: . : -
  • Figure 4 shows the PCR bands obtained with the process according to the invention- to, from a sample of a virus strain after an AC $ diagnosed as Dengue hemorrhagic 3 ⁇ f from Cambodia.
  • primers whose hexamer is fixed and hybridize "often" have been used with respect to primers with 6N degenerate hexamers which hybridize everywhere described in Allander et al.
  • a hexamer of given sequence hydrides at least; once every 4096 nucleotides (1/4 6 ).
  • a hexamer is at the base of a first primer (sense or antisense), a second hexamer at the base of a second primer (antisense or sense after the first primer).
  • the pairs of hexamers that can be used have summarized in the table above and in particular.
  • a pair of hexamers suitable for the present invention may be the TTGTAA pair for the first primer and TTACAA for the second primer, for example.
  • primers allow the amplification of "asymmetric" PCR fragments that can be directly sequenced. Indeed, the use of different and non-complementary tags between the two primers makes it possible to directly sequence the PCR fragment without having a PCR amplicon which folds on itself (difficult to amplify). As a result, symmetrical amplicons are eliminated.
  • the pair of primers used is the following: Fr20sb: 5 'GCCGGAGCTCTGCAGATATCAGGGCGTGGT R2010 / 000148
  • TTACAA-3 ' (first primer) and BOPsb ⁇ .10 5'-CGGTC ATGGTGGCGAATAAATCGAGCGGCTTGTAA-3' (second primer).
  • the purified nucleic acid is; '- subjected to a first reverse transcription step, with the first a ⁇ riorce and an enzyme having a reverse transcription activity ⁇ as AMV RT, Promega, etc. (known enzymes of those skilled in the' art).
  • This step lasts about 40 minutes and allows the synthesis of a first strand of DNA, when the starting sample is-a-RNA. If the starting sample contains only DNA, this step has no effect.
  • the two previous PCR steps can be grouped in a single step if the user directly follows the two PCR phases of 5 cycles and 35 cycles on the thermal cycler used, without additional intermediate addition of the two primers, these being supplied in excess at the start of the reaction.
  • Post PCR samples are then analyzed on agarose gel and any PCR bands obtained cut, purified and sequenced. About 80% of the directly sequenced bands lead to a sequence. ,,: ' ⁇ - * -' '' /
  • the reaction developed by the present applicant can be amplified in a single reaction tube / avèc.dés protocols and common hardware Laboratories, in less than '4 hours, at least one PCR band or RT-PCR from any nucleic acid larger than about 3,000 nucleotides, this band being directly sequenceable in the majority of cases.
  • Aedes Alpopictiis Parvovirus (AaPV).
  • AaPV Aedes Alpopictiis Parvovirus
  • Example 2 Patient Blood X y ; ; A blood sample whose diagnosis was initially unclear was studied with the present method. ; -. ,; '•'
  • This blood contained a virus that was previously amplified by culturing. /; • ,
  • the random RT-PCR protocol ⁇ el ⁇ n the invention was applied to two samples: a sample of acjdes n ⁇ cléiques made from the blood of the patient (lane 1) and the supernatant-cultivation (T track).
  • nucleic acid sequences obtained which are identical, do not correspond to any sequence available in the databases.
  • the translated sequence has homologies with the sequence of the polymerase of a bunyaviridae, CiLV or Citrus Leprosis virus, an arbovirosis of the lemon tree transmitted by a moth.
  • bunyaviridae includes mammalian viruses (bunyaviruses, nairovims, hantavims), it also includes a whole genus of plant viruses, the Tospoviruses.
  • the random RT-PCR therefore gives a track to 'seek a virus of the family bunyaviridae.
  • the method according to the invention gives a very quick result when the sequence obtained is significant homology in the data bases.
  • this séq ⁇ 'ençé obtained is not selected, it may correspond to regions non-sequenced genomes or unknown microorganisms;.. I) n this case, it serves to guide track identification others- means, that will require time, ⁇ ⁇ .; •.. '
  • the method according to the invention is easy to implement in a current laboratory; it is fast, it allows to make controls during the reaction so as not to make unnecessary sequencing, blind.
  • the random RT-PCR method can be applied to search for any microorganism, regardless of the species, as long as it has a nucleic acid.

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Abstract

La présente invention concerne un couple d'hexamères et un couple d'amorces particuliers pour l'identification de microorfanismes, sans a priori, dans un échantillon. La présente invention concerne également un procédé d'identification de microorganisme(s), ainsi qu'un kit "d'identification de microorganismes, utilisant les hexamères et amorces susmentionnés.

Description

10 000148
Domaine de l'invention :
La présente invention se rapporte à un couple d'hexamères et un couple d'amorces, aptes à s'hybrider suffisamment souvent sur une
microorganisme. Après incubation, la réaction est interrompue et les produits émetteurs sont séparés comme par électrophorèse sur une plaque de gel. La plaque peut être alors autoradiographiée par exposition à un film photographique afin d'obtenir sur celui-ci une image des bandes caractéristiques fonctionnant comme un moyen d'identification du microorganisme. L'identification peut être effectuée en comparant le moyen d'identification pour le microorganisme inconnu avec un ensemble de moyens d'identification de microorganismes connus, afin de trouver une correspondance avec l'un de ces microorganismes connus. La comparaison peut être réalisée par examen approfondi/ des agents d'identification inconnus afin de produire un signal qui est: bojmparé aux signaux représentant les agents d'identification connus ..stockés 'dans un ordinateur. Alternativement, les produits émetteurs, après séparation, peuvent être détectés par examen approfondi direct 'afin de fournir un signal d'identification pour un procédé par ordinateur. \. '
Le document EP 0 151 8855 décrit également un procédé classique pour l'identification d'un microorganisrne^dans un échantillon. Le microorganisme est exposé à des conditions conduisant à son développement en présence de plusieurs substrats de croissance qui sont inoculés individuellement avec le φicroorιganisme. La présence ou l'absence d'anhydride carbonique comme sous-produit du métabolisme de ces substrats est détectée par analyse infra-rouge et fournit un profil du microorganisme inconnu. L'identification est effectuée en comparant ce profil avec ceux de miçroorgànismes connus traités de la même manière. .. V.
Aussi, les méthodes : d'indentification de microorganismes inconnues comprennent généralement : la mise en culture d'un échantillon pris chez tin- patient malade (échantillon de sang), la reculture sur un milf eu 'd& croissance sélectif. Ensuite, prennent place les caractérisations biochimiques du microorganisme en question qui peuvent être faites p)ar : un test de production d'indole, une coloration des bactérie^ grâni négatifs ou gram positifs, l'étude de la morphologie des colomésj etc.
Ces méthodes nécessitent beaucoup de mises en culture et prennent du temps, notamment lorsque le microorganisme impliqué dans l'infection est à croissance lente.
D'autre part, la détection de la présence d'un microorganisme grâce à la technologie liée à l'ADN est devenue importante pour diagnostiquer des maladies. Le séquençage est devenu en effet un processus simple aujourd'hui. Il nécessite l'obtention d'ADN double brin en quantité suffisante et de longueur suffisante, ce qui est réalisé classiquement par PCR (amplification en chaîne par polymérase) ou RT-PCR (la PCR par transcriptase inversé) à partir d'acides nucléiques extraits de l'espèce étudiée. Toutefois, dans le cas de microorganismes inconnus,,' cette étape
façon complètement aléatoire, toutes les tailles possibles de fragments des produits de PCR sont obtenues, il n'y a donc pas de bandes isolées (sur le gel d'agarose, on n'observe non pas des bandes isolées mais un continuum de bandes). Les produits de PCR séquençables, de taille 300- 600 nucléotides, sont excisés à partir du morceau de gel correspondant, puis clones dans des bactéries après purifications. Un certain nombre de clones sont alors analysés par séquençage et un programme informatique réalise automatiquement la comparaison des séquences avec les bases de données génétiques disponibles sur internet, telles que BLAST. BLAST (basic local alignment search tool) est en effet un algorithme utilisé en bio-informatique permettant de trouver les régions similaires entre deux ou plusieurs séquences de nucléotides ou d'acides aminés. Ce programme permet de calculer significativement Jes;. pourcentages de similitude entre les séquences en les comparant) avec ;des banques de données. ' : .,;•-/ /)'
Toutefois, le fait d'avoir une PCR çόfnr>lè.tternent aléatoire, qui génère une infinité de fragments même lof&quxun seul acide nucléique, typiquement un génome viral, est ' analysé peut présenter les inconvénients suivants : (V /- ^
- Il s'agit ainsi d'une amplification: au hasard de n'importe quelle séquence d'acide nucléique. Il y 'a tipric une étape de préparation de l'échantillon avant le traitement'pW biologie moléculaire, puis une étape de bioinformatique afin de supprimer tous les acides nucléiques et signaux ne relevant pas du pathogène.
- Après l'étape de PCRinverse (RT-PCR), l'étape de clonage dans des bactéries est indispensable. En effet un très grand nombre de fragments de PCR sont; générés, et doivent être individualisés par le clonage dans des bïactéries, ce qui augmente le nombre de séquences à réaliser. ' - \ cr-7
- Un écHàntilïon contenant un virus pur donne exactement le même profil; de PCR qu'un échantillon contenant un acide nucléique provenant de l'hôte, de cellules, etc. Il n'y a donc pas de contrôle de réaction .avant l'étape ultime de séquençage et de comparaison de séquence,, à/ où un surcoût en temps de travail monopolisé et en coût financier,/'
- £)ans le cas ou plusieurs virus pourraient être présents dans l'échantillon de départ, le moins représenté sera perdu lors de l'amplification ou de l'analyse des clones bactériens, « dominé » par le plus représenté (effet stochastique). - Le processus est lent et nécessite de nombreuses manipulations : il faut deux à trois jours pour réaliser l'intégralité de la réaction en particulier compte tenu des étapes de clonage en bactéries, entraînant un impact en termes de monopolisation des ressources humaines, matérielles et financières.
Résumé de l'invention : ••/ > ,
L'invention a pour but de proposer un nouveau procédé d'identification de microorganismes qui évite ,|out ou partie des inconvénients précités. // ,Nχ\.;
A cet effet, l'invention concerne un coupleld/hexamères pour PCR pour la détection de microorganismes, compreήâήtùή premier hexamère destiné à être placé à l'extrémité 3' d'tΛÏe ^première amorce et un deuxième hexamère destiné à être placé à l'extrémité 3' d'une seconde amorce, ledit couple d'hexamères éta^t susceptible d'être obtenu par le procédé consistant à : y ? c^ a) découper les séquences de. géfiqnïes d'au moins cinq virus de familles différentes en groitipès idé six nucléotides successifs, b) classer les séquences de six nucléotides, dits hexamères, en fonction de leur fréquence d'occurrence, c) sélectionner les couples d'hexamères présentant la fréquence d'occurrence la (plus ^représentée, tels que les vingt premiers hexamères, de préférence les dix premiers, de manière encore plus préférée les(çinq~prémiers présentant une fréquence d'occurrence la plus importante par rapport aux autres couples d'hexamères, de sorte à">obtènir un couple d'amorces aptes à s'hybrider statistiquement souvent sur n'importe quelle matrice d'acide nucléique.'
Le .ptésent demandeur a en effet découvert des hexamères non dégénérés, mais qui au contraire, présentent une séquence fixe, ces hexàmères étant aptes à s'hybrider statistiquement souvent, mais pas trop afin de ne pas amplifier un trop grand nombre de séquences pour un acide nucléique source donné. Le présent demandeur a ainsi réalisé un choix parmi l'infinie possibilité d'hexamères existants. Avantageusement, le premier et le deuxième hexamères sont choisis parmi : T FR2010/000148
Les hexamères de là seconde liste (colonne de droite) sont les hexamères inverse et complémentaires de ceux de la première liste (colonne de gauchi) puisque les hexamères de chacune des deux listes sont destinés à appartenir aux deux amorces d'amplification, l'une jouant le rôle d'amorce dite « sens », donc par convention de séquence identique à ,CeIIe de la matrice à amplifier, et l'autre jouant le rôle d'amorce/, aritrsens, donc par convention de séquence inverse et complémentaire de celle de la matrice à amplifier, de telle sorte que les deux. ^.amorces puissent s'hybrider tour à tour sur les brins d'ADN synthétisas lors des cycles de PCR à partir de la matrice initiale.
La présente invention concerne également un couple d'amorces pour la détection de microorganismes, comprenant une première amorce sens et une seconde amorce, la première amorce comprenant à son extrémité 3' un premier hexamère tel que défini ci-dessus et la seconde amorce comprenant à son extrémité 3', le deuxième hexamère tel que défini ci-dessus, la première et seconde amorces pouvant être une amorce sens et une amorce anti-sens ou une amorce anti-sens et une amorce sens.
De préférence, la première ou seconde amorce comprend à son extrémité 5' une étiquette choisie parmi : FR20 : 5'-
GCCGGAGCTCTGC AGATATC-3' ou sa variante ; Friόsp : 5'
GCCGGAGCTCTGCAGAT ATCAGGGCGTGGT-3', ; BÔP : 5'-
CGGTC ATGGTGGCG AATAAA-3' ou sa variante. . BOPsb : 5'-
CGGTCATGGTGGCGAATAAATCGAGCGGC-3;, ;et à la condition que l'étiquette de la première amorce soit différente de l'étiquette de la seconde amorce et ne corresponde pas non plus à une de ses variantes.
En particulier, la première et seconde) 'arrlb'rces présentent la séquence choisie parmi : / x' BOPsbό.10 5'-
CGGTCATGGTGGCGAATAAATCGAOCGGCTTGTAA-3 ' et Fr20sb : 5' GCCGGAGCTQTGGAGATATCAGGGCGTGGT TTAÇAA-3' ou_FR20 : 5 '-GCCGGAQOTCTGC AGATATC TTACAA -3' et BOP : 5 ' -CGGTC ATGGTGGCGAÂT AAATTGT AA -3 ' .
La présente invention ^e ~; rapporte aussi à un procédé d'identification de microorganismé(s) dans un échantillon comprenant le couple d'amorces tel que défini ci-dessus, ledit procédé comprenant les étapes consistant à : — : .-_• i) Si nécessaire, préparer ledit échantillon afin d'éliminer les acides nucléiques non issus du ou des microorganismes recherches, ii) si P échantillon obtenu à l'étape i) est un ARN, effectuer
,ùne éiàpe de transcription inverse avec ladite première < ' amorce ou la seconde amorce et une enzyme possédant // / une activité transcriptase inverse,
: iii'j ajouter un mélange réactionnel de PCR comprenant la /;"": , > première et seconde amorce et effectuer une première
, J) PCR de pré-amplification avec une phase d'hybridation à basse température, telle qu'aux alentours de 450C, et éventuellement une seconde PCR avec une hybridation à haute température, telle que 500C, iv) analyser les résultats de la PCR. R2010/000148
Avantageusement, les produits obtenus à l'étape iv) sont analysés sur gel d'agarose.
De préférence, les bandes PCR obtenues sur ledit gel d'agarose sont découpées, purifiées et séquencées. Selon une caractéristique de l'invention, au moins deux des différentes étapes du procédé i), ii), iii) et iv sont réalisés d'ans le-même tube réactionnel. . : ^
Selon une autre caractéristique de l'invention, là première PCR de pré-amplification comprend au moins 2 cycles. .. .; ~ ~: ' De manière préférentielle, chaque cycle, >de la; première PCR comprend une phase de dénaturation à 9O0C à 99°ό, de préférence 94°C pendant sensiblement 30s, une phase d'hybrMatjon a basse température de 300C à 500C, de préférence 370C pendant" (sensiblement 30s et une phase d'élongation de 6O0C à 800C pendant sensiblement 2min. Avantageusement, la deuxième PCR est une PCR classique comprenant 35 cycles. />' ~ c-v'
Un but de la présente inyèntiofi concerne également un kit d'identification de microorganisnlQ(s); .caractérisé en ce qu'il comprend : a- le couple d'amorces tel que défini ci-dessus, b - éventuellement .un ;mélange réactionnel de PCR, c - et une notice d'emploi.
Description détaillée de! l'invention :
Pour mieux /faite- comprendre l'objet de l'invention, des exemples de réalisation vont être' décrits. La description de l'invention qui va suivre est donnée à titre d'exemples purement illustratifs et non limitatifs en référence aux dessins annexés : Sur le dessin :
-- 4a'<figure 1 représente des bandes de PCR obtenues à l'aide du
_; procédé selon l'invention à partir d'échantillons de : •'' .. Surnageants de culture virale de l'encéphalite de Saint-Louis
'' (SLE), d'encéphalite à tique (Tick Borne Encéphalitis, TBE), de fièvre de la vallée du Rift (RVF) et des cellules non infectées ;
- la figure 2 représente des bandes de PCR obtenues à l'aide du procédé selon l'invention à partir d'échantillons issus d'un extrait d'acides nucléiques réalisé à partir du sang d'un patient (piste 1) et à partir du surnageant de mise en culture dudit sang (piste 2) ;
- la figure 3 représente des bandes de PCR obtenues à l'aide du procédé selon l'invention à partir d'échantillons ..issus : d'un surnageant de culture d'un virus inconnu provenant d'une petite flambée d'atteinte dermatologique dans -un foyer de personnes âgées (collaboration avec l'Unité de virologie d'un hôpital hospitalier, échantillons Cl et C2), de sang de donneur et de surnageants de culture de parasites/mis en culture avec ce sang (paludisme, collaboration avfeç ,' un laboratoire de parasitologie travaillant sur le pallidisme, échantillons sang donneur et de souches de parasite xdu paludisme 307, W2, FCR3, BREl) ; f : :.:, - la figure 4 représente des bandes de PCR obtenues à l'aide du procédé selon l'invention- à, partir d'un échantillon d'une souche virus issue d'un ca$ diagnostiqué comme Dengue 3 hémorragique provenant φf Cambodge.
A — mise au point des amorces -V.
Séquences d'hybridatio^i : ))
Pour pallier les inconvénients susmentionnés, des amorces dont l'hexamère est de(£éqύerice fixe et qui s'hybrident « souvent » ont été utilisées par rapport' aux amorces avec hexamères dégénérés 6N qui s'hybrident partout décrits dans Allander et la.
Mathéinatiquement, un hexamère de séquence donnée s'hydride au moins; une fois tous les 4096 nucléotides (1/46). Biologiquement, toutes les ; séquences de 6 nucléotides ne sont pas équivalentes (typiquement une série de 6 guanosines est rare).
ParV informatique, un découpage des séquences des génomes de cinq virus de familles différentes (rougeole, ebola, dengue 2 (x2), dengue 3, disponibles sous Pubmed) en groupes de 6 nucléotides successifs, a été réalisé. Puis, un classement selon leur fréquence d'occurrence a été effectué, afin de sélectionner les hexamères en moyenne les plus représentés dans les génomes viraux. Le nombre de virus sélectionné (5) 0 000148
10
est faible, mais dans tous les tests, l'ajout de nouveaux virus n'a pas modifié les hexamères en tête de classement.
Il n'a pas été possible de trouver des heptamères (7 nt) et a fortiori des octamères (8 nt) communs à plusieurs virus. Un certain nombre de séquences d'hexamères ont été testées afin de retenir des séquences convenables, s'hybridant suffisamment souvent pour amplifier n'importe quel acide nucléique, mais pas trop souvent afin de ne pas amplifier un trop grand nombre de séquences pour un acide nucléique source donné. Un hexamère est à la base d'une première amorce (sens ou anti-sens), un second hexamère à la base d'une seconde amorce (anti-sens ou sens suivant la première amorce). En particulier, les couples d'hexamères qui peuvent être utilisés s'ont récapitulés dans le tableau ci-dessus et en particulier. Un couple, d'hexamères convenant pour la présente invention peut être le couple TTGTAA pour la première amorce et TTACAA pour la seconde amorce par exemple.
Séquences d'étiquette :
Dans la technique utilisée par -Allander, une seule étiquette est utilisée pour la PCR. Les fragments de PCR amplifiés possèdent donc les mêmes extrémités (l'étiquette _et son complémentaire). Cette symétrie des extrémités empêche un séquençage direct des produits de PCR obtenus (il y aurait séqμença,ge du fragment de PCR dans les deux sens concomitamment donc impossibilité de résoudre la double séquence).
Deux étiquettes" différentes ont été sélectionnées : FR20 : 5'- GCCGGAGCTCTGCAGATATC-3' ou sa variante Fr20sb : 5' GCCGGAGCTCTGC:AGATATCAGGGCGTGGT-3', BOP : 5'- CGGTCATGGTGGCGAATAAA-3' ou sa variante BOPsb : 5'- CGGTC ÂTGGTGGCGAATAAATCGAGCGGC-3 ' .
Ces amorces peπnettent l'amplification de fragments de PCR « asymétriques », susceptibles d'être séquences directement. En effet, l'utilisation d'étiquettes différentes et non complémentaires entre les deux amorces permet de séquencer directement le fragment de PCR sans avoir un amplicon de PCR qui se replie sur lui même (difficile à amplifier). Par conséquent, les amplicons symétriques sont éliminés. Pour la suite des exemples, le couple d'amorces utilisé est le suivant : Fr20sb : 5' GCCGGAGCTCTGCAGATATCAGGGCGTGGT R2010/000148
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TTACAA-3' (première amorce) et BOPsbό.10 5'- CGGTC ATGGTGGCGAATAAATCGAGCGGCTTGTAA-3 ' (seconde amorce).
B- Déroulement du procédé selon l'invention, dit aussi « procédé de la RT-PCR ou PCR aléatoire » > ./' :
Comme pour Allander et collaborateurs, dans la, mesure où la technique utilisée amplifie n'importe quel acide nucléique7, il convient d'avoir comme matériel initial un échantillon ne/Çontenant que le micro organisme étudié. Typiquement des cellules infectées sont un mauvais matériel de départ car les ARNs ribosomauX de. l'hôte sont fortement majoritaires, en revanche le surnageant clarifié . de ces mêmes cellules non lysées est un échantillon convenable, et c'est ce type d'échantillon qui sera illustré dans les exemples. (i _ A
L'acide nucléique purifié est;'- soumis à une première étape de transcription inverse, avec la première aαriorce et une enzyme possédant une activité de transcription invérse^tèlle que AMV RT, Promega, etc (enzymes connues de l'homme du 'métier). Cette étape dure environ 40 minutes et permet la syntHèse d'un premier brin d'ADN, lorsque l'échantillon de départ est-un -ARN. Si l'échantillon de départ contient uniquement de l' ADN, ^ette e)tape est sans effet.
Dans le même tube est ajouté un mélange réactionnel de PCR connu de l'homméi du métier (type Master Mix Qiagen) qui contient la seconde amorcel Le tout est soumis à 5 cycles de PCR peu sélectifs (dénaturatioη $4°Ç BO s, hybridation à basse température 37°C 30 s, élongation 7'2°C 2 minutes). Cette étape permet la synthèse du second brin à partir, d'un échantillon d' ARN, ou du premier puis du second brin à partie d'uh .échantillon contenant de l'ADN. Cette étape dure environ 40 minutes". -
^Dans le même tube sont ajoutées enfin une nouvelle fois les deux amorces, afin de réaliser l'amplification, par 35 cycles de PCR classique. Cette étape dure environ 2,5 heures.
Selon une variante de réalisation, les deux étapes précédentes de PCR, peuvent être groupées en une seule étape si l'utilisateur fait se suivre directement les deux phases de PCR de 5 cycles puis 35 cycles sur le thermocycleur utilisé, sans ajout supplémentaire intermédiaire des deux amorces, celles-ci étant fournies en excès au départ de la réaction.
Les échantillons post PCR sont ensuite analysés sur gel d'agarose et les éventuelles bandes de PCR obtenues découpées, purifiées et séquencées. Environ 80% des bandes directement séquencée^ conduisent à l'obtention d'une séquence. ,, : '<- *- '•' /
II est à noter que sur de surnageants de culture : virale; l'étape d'extraction des acides nucléiques n'est pas indispensable '. quelques microlitres de culture directement dans le mélangé ~<i.e" RT suffisent à réaliser la réaction. // x. C~
Ainsi, la réaction mise au point par le présent demandeur permet d'amplifier dans un tube réactionnel unique/avèc.dés protocoles et des matériels courants de laboratoires, en moins de' 4 heures, au moins une bande de PCR ou RT-PCR à partir de n'importe quel acide nucléique de taille supérieure à environ 3 OOO i fnucléiotides, cette bande étant directement séquençable dans la gra /ή/ de.majorité des cas.
Maintenant, des exemples; dvîdentification selon l'invention purement illustratifs et non limitatifs. de la portée de l'invention vont être décrits. . .....Vi .
Exemple 1 : Parvoviruψet C6/36
Le procédé d'identification de microorganisme a été validé sur des virus détenus au laboratoire, recherchés à l'aveugle. Le procédé selon l'invention mentionné au point B a été mis en œuvre par un, technicien de laboratoire sur des surnageants de culture virale de P encéphalite de Saint-Louis (SLE), d'encéphalite à tique (Tick Borne Encéplialitis, TBE), de fièvre de la vallée du Rift (RVF) et des cellulesVnori infectées (voir figure 1). Les étoiles indiquent les bandes séquéneées.:
" Coiήme le montre cette figure 1, des bandes d'amplification, correspondant après séquençage aux virus attendus dans chacun des cas ont bien été retrouvées.
Cette étude a permis en outre, sur l'échantillon RVF d'amplifier 2 bandes de PCR, l'une correspondant effectivement au virus RVF attendu, l'autre correspondant à un parvovirus d'insecte, Aedes Alpopictiis Parvovirus (AaPV). Après recherche bibliographique, il s'agit d'un parvovirus ayant déjà été trouvé comme infectant de façon chronique une lignée de cellules C6/36, cellules qui proviennent d'Aedes albopictus (Boublik Y . et al, Cloning, sequencing and infections plasmid construction of a new parvovirus, the Aedes Albopictus /Parvovirus, pathogenic for the mosquito Aedes Aegypti larvae, thèse Université Aix Marseille, 1993). . .. .. : '
Exemple 2 : Sang Patient X y ;; Un échantillon de sang dont le diagnostic/était Initialement peu clair a été étudié avec le présent procédé. ; -. ,;'•'
Ce sang contenait un virus qui a été préalablement amplifié par une mise en culture. / ;• ,
Le protocole de RT-PCR aléatoire '^elόn l'invention a été appliqué sur deux échantillons : un extrait d'acjdes nμcléiques réalisé à partir du sang du patient (piste 1) et le surnageant de-mise en culture (piste T).
Comme le montre la figure 2, F échantillon de sang (1) a conduit à l'identification des ARN ribosoinHùX- du patient, qui étaient présents dans l'extrait. Ce résultat a seulement confirmé que le patient était bien un homo sapiens sapiens., _ if; souligne toutefois l'importance de la
échantillons Cl et C2 d'un laboratoire hospitalier, la seconde pour les échantillons de culture de parasites du paludisme.
Cette série d'expériences permet également de valider la reproductibilité du procédé selon l'invention. En effet, le principe réactionnel utilise de fait une probabilité plutôt qu'un hasard : si pour un R2010/000148
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échantillon inconnu les amorces utilisées ont une certaine probabilité de s'hybrider quelque part sur l'acide nucléique considéré, pour un échantillon donné, les amorces s'hybrident toujours au même endroit. En d'autres termes, les mêmes causes produisent les mêmes effets : des échantillons contenant le même microorganisme conduisent à
surnageant de cellules non infectées (-) (figure 4).
Les séquences d'acide nucléique obtenues, identiques, ne correspondent à aucune séquence disponible dans les bases de données
(Pubmed). La séquence traduite présente toutefois des homologies avec la séquence de la polymérase d'un bunyaviridae, CiLV ou Citrus Leprosis virus, une arbovirose du citronnier transmise par une mite.
Ce résultat peut paraître surprenant, homologie avec un virus végétal pour une hémorragie humaine. Toutefois, si la famille des bunyaviridae comprend des virus de mammifères (bunyavirus, nairovims, hantavims), elle comprend également tout un genre de virus de plantes, les Tospovirus.
La RT-PCR aléatoire donne donc une piste pour' chercher un virus de la famille des bunyaviridae. Λ " / Le procédé selon l'invention donne un résultat très rapide lorsque la séquence obtenue trouve une homologie significative dans les bases de données. Toutefois, étant donné que cette séqμ'ençé obtenue n'est pas choisie, elle peut correspondre à des régions' non séquencées de génomes ou à des microorganismes non connus. ;î)ans . ce cas, elle sert de piste pour orienter l'identification par d'autres- moyens, qui demandera des délais. , Λ. <.;• '
Par conséquent, le procédé selon l'invention est facile de mise en œuvre dans un laboratoire courant; il est rapide, il permet de faire des contrôles en cours de réaction afin de ne pas faire de séquençages inutiles, en aveugle. De plμs, sur les différents exemples présentés ici, le procédé selon l'invention. a:démontré son efficacité en tenne de biologie moléculaire et sa capacité à fournir des informations sur les pathogènes étudiés. ,-
En outre, le(procedé de RT-PCR aléatoire peut être appliqué à la recherche de tout micro organisme, quelle que soit l'espèce, tant qu'il possède un acide nucléique.
Bien .qύe-l' invention ait été décrite en relation avec un mode de réalisation particulier, il est bien évident qu'elle n'y est nullement limitée et qu/ellex comprend tous les équivalents techniques des moyens décrits ainsi- que-' leurs combinaisons si celles-ci entrent dans le cadre de l'invention.

Claims

REVENDICATIONS
1. Couple d'hexamères pour PCR pour la détection de microorganismes, comprenant un premier hexamère destiné à être placé à l'extrémité 3' d'une première amorce et un deuxième hexamère destiné à être placé à l'extrémité 3' d'une seconde amorce, ; ledit - couple d'hexamères étant susceptible d'être obtenu par le procédé consistant à : d) découper les séquences de génomes d'au moins cinq virus de familles différentes en groupe de six nucléotides; successifs,
3. Couple d'amorces pour la détection de rmcroorganismes, comprenant une première amorce sens et une secoïide amorce, la première amorce comprenant à son extrémité 3' un prprnier hexamère tel que défini dans les revendications 1 à 2 et la seconde; aïnorce comprenant à son extrémité 3', le deuxième hexamère . tèK que défini selon les revendications 1 à 2, la première et secondé arjiof ces pouvant être une amorce sens et une amorce anti-sens ou Vune amorce anti-sens et une amorce sens. -;• 4. Couple d'amorces selon1 la revendication 3, dans lequel la première ou seconde amorce comprend Çs'on extrémité 5' une étiquette choisie parmi : FR20 : 5'-GCÇGGAfiCTCTGCAGATATC-3' ou sa variante Fr20sb : 5' GCCGGAGGTCTGCAGATATCAGGGCGTGGT- 3', BOP : 5' -CGGTC ATGGTGOCG AATAAA-3' ou sa variante BOPsb : 5'-CGGTCATGQTGGCGAATAAATCGAGCGGC-S', et à la condition que l'étiquette" de la première amorce soit différente de l'étiquette de la secondé amorce et ne corresponde pas non plus à une de ses variantes. ,-r-/ "^V-T
5. Couple d/amorces selon l'une des revendications 3 à 4, dans lequel Ja "première et seconde amorces présentent la séquence // \ choisie parmi : BOPsbβ.10 5'-
CGGTCAtOGTGGCGAATAAATCGAGCGGCTTGTAA-3 ' et
Fr20sb : ^J/ 5 ' GCCGGAGCTCTGCAGATATCAGGGCGTGGT TTACAA-3;' ou FR20 : 5'-GCCGGAGCTCTGCAGATATC TTACAA -3 ' et BOP1 : 5 ' -CGGTC ATGGTGGCGAATAAATTGTAA -3 ' .
X./6. Procédé d'identification de microorganisme(s) dans un échantillon comprenant le couple d'amorces selon l'une des revendications 3 à 5, ledit procédé comprenant les étapes consistant à : v) Si nécessaire, préparer ledit échantillon afin d'éliminer les acides nucléiques non issus du ou des microorganismes recherchés, vi) si l'échantillon obtenu à l'étape i) est un ARN, effectuer une étape de transcription inverse avec ladite première amorce ou la seconde amorce et une enzyme possédant une activité transcriptase inverse, vii) ajouter un mélange réactionnel de PCR comprenant la
classique comprenant 35 cycles.
13. Kit d'identification de microorganisme(s), caractérisé en ce qu'il comprend : a - le couple d'amorces selon l'une des revendications 3 à 5, b - éventuellement un mélange réactionnel de PCR, c - et une notice d'emploi.
•-..*-•' /
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