WO2010092266A9 - Amplification génique statistique pour l'identification sans a priori de micro-organismes par séquençage sans étape de clonage - Google Patents

Amplification génique statistique pour l'identification sans a priori de micro-organismes par séquençage sans étape de clonage Download PDF

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Sebastien Plumet
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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes

Definitions

  • the present invention relates to a pair of hexamers and a pair of primers, capable of hybridizing sufficiently often on a nucleic acid sequence to amplify a fragment, such as a 400 nucleotide fragment, of any which genome or transcriptome of microorganism.
  • the present invention also relates to a method for obtaining DNA fragments that can be directly sequenced, without a priori on the desired species.
  • the present invention also relates to a microorganism identification kit (s).
  • Microbial infections that is, the infection of a host organism by a microorganism, are one of the major causes of morbidity in populations in general. In order to establish an effective diagnosis of a disease or infection and to determine the appropriate treatment, it is important to quickly and accurately identify the pathogen that causes the infection.
  • the identification of the microorganism causing the infection is important because it can help to determine the source, as well as the mode of transmission of the infection in question.
  • EP 0 077 149 describes a so-called conventional method for the identification of unknown microorganisms.
  • This method consists in adding to a sample containing the unknown microorganism, a transmitting agent such as a radioactive amino acid, in order to obtain a mixture of emitting products, this depending on the metabolic mechanism of the microorganism. After incubation, the reaction is stopped and the emitting products are separated as by electrophoresis on a gel plate. The plate can then be autoradiographed by exposure to a photographic film in order to obtain on it an image of the characteristic bands functioning as a means of identification. of the microorganism.
  • a transmitting agent such as a radioactive amino acid
  • the identification can be carried out by comparing the identification means for the unknown microorganism with a set of means of identification of known microorganisms, in order to find a correspondence with one of these known microorganisms.
  • the comparison can be made by in-depth examination of unknown identification agents to produce a signal that is compared to the signals representing the known identification agents stored in a computer.
  • the emitting products, after separation can be detected by in-depth examination to provide an identification signal for a computer process.
  • EP 0 151 8855 also discloses a conventional method for identifying a microorganism in a sample.
  • the microorganism is exposed to conditions leading to its development in the presence of several growth substrates which are individually inoculated with the microorganism.
  • the presence or absence of carbon dioxide as a by-product of the metabolism of these substrates is detected by infra-red analysis and provides a profile of the unknown microorganism.
  • the identification is carried out by comparing this profile with those of known microorganisms treated in the same way.
  • methods for identifying unknown microorganisms generally include: culturing a sample taken from a sick patient (blood sample), reculture on a selective growth medium. Then take place the biochemical characterizations of the microorganism in question that can be made by: an indole production test, a staining of gram negative or gram positive bacteria, the study of colony morphology, etc.
  • Sequencing has become a simple process today. It requires obtaining double-stranded DNA in quantity sufficient and of sufficient length, which is conventionally carried out by PCR (polymerase chain reaction) or RT-PCR (reverse transcriptase PCR) from nucleic acids extracted from the studied species.
  • PCR polymerase chain reaction
  • RT-PCR reverse transcriptase PCR
  • the RT-PCR is indeed based on the hybridization of two DNA primers complementary to the studied sequence and it is, by definition, impossible to perform a primer whose sequence is complementary to a sequence that is unknown.
  • Allander et al. Performed the PCRs from two-part primers: a hexamer of 6 random nucleotides (6N, random) that hybridizes to any DNA sequence and a fixed sequence tag of 20 nucleotides in 5 ': 5' TAG-NNNNNN-3 '.
  • This degenerate primer allows the synthesis of a first strand of DNA (reverse transcription for example), then a second (with for example a klenow polymerase), initiated randomly.
  • Conventional PCR is then performed with a label targeting primer to amplify the resulting DNAs. It allows the multiplication of the number of strands of DNA, the primers hybridizing on all the possible sequences.
  • the PCR products are deposited on agarose gel.
  • RT-PCR reverse PCR step
  • the cloning step in bacteria is essential. Indeed a very large number of PCR fragments are generated, and must be individualized by cloning into bacteria, which increases the number of sequences to achieve.
  • a sample containing a pure virus gives exactly the same PCR profile as a sample containing nucleic acid from the host, cells, etc. There is therefore no reaction control before the final step of sequencing and sequence comparison, resulting in an additional cost in monopolized working time and in financial cost.
  • the object of the invention is to propose a new method for identifying microorganisms which avoids all or some of the aforementioned drawbacks.
  • the invention relates to a pair of hexamers for PCR for the detection of microorganisms, comprising a first hexamer intended to be placed at the 3 'end of a first primer and a second hexamer intended to be placed at the 3 'end of a second primer, said pair of hexamers being obtainable by the process of:
  • pairs of hexamers having the most represented frequency of occurrence such as the first twenty hexamers, preferably the first ten, even more preferably the first five having the highest frequency of occurrence relative to to the other pairs of hexamers, so as to obtain a pair of primers able to hybridize statistically often on any nucleic acid template.
  • the first and second hexamers are chosen from: First hexamer Second hexamer
  • the hexamers of the second list are the inverse hexamers and complementary to those of the first list (left column) since the hexamers of each of the two lists are intended to belong to the two amplification primers, one acting as the so-called "sense" primer, therefore by sequence convention identical to that of the matrix to be amplified, and the other acting as an antisense primer, therefore by reverse sequence convention and complementary to that of the matrix to amplify, so that the two primers can hybridize in turn to the DNA strands synthesized during PCR cycles from the initial template.
  • the present invention also relates to a pair of primers for the detection of microorganisms, comprising a first sense primer and a second primer, the first primer comprising at its 3 'end a first hexamer as defined above and the second primer comprising its 3 'end, the second hexamer as defined above, the first and second primers being a sense primer and an antisense primer or an antisense primer and a sense primer.
  • the first or second primer comprises at its 5 'end a label chosen from: FR20: 5'-GCCGG AGCTCTGC AGATATC-3' or its Fr20sb variant: 5 'GCCGG AGCTCTGC AG AT ATC AGGGCGTGGT-3', BOP: 5 - CGGTC ATGGTGGCGAATAAA-3 'or its variant BOPsb: 5'-CGGTC ATGGTGGCGA ATAAATCGAGCGGC-3', and provided that the label of the first primer is different from the label of the second primer and does not correspond either to one of its variants.
  • first and second primers have the sequence chosen from: BOPsb0.10 5'-
  • the present invention also relates to a method of identifying microorganism (s) in a sample comprising the pair of primers as defined above, said method comprising the steps of:
  • step i) if the sample obtained in step i) is an RNA, performing a reverse transcription step with said first primer or the second primer and an enzyme having a reverse transcriptase activity,
  • a PCR reaction mixture comprising the first and second primer and performing a first pre-amplification PCR with a low temperature hybridization phase, such as around 45 ° C, and optionally a second PCR with a high temperature hybridization, such as 50 ° C,
  • step iv) analyze the results of the PCR.
  • the products obtained in step iv) are analyzed on agarose gel.
  • the PCR bands obtained on said agarose gel are cut, purified and sequenced.
  • At least two of the different steps of the process i), ii), iii) and iv are carried out in the same reaction tube.
  • the first pre-amplification PCR comprises at least 2 cycles.
  • each cycle of the first PCR comprises a denaturation phase at 90 ° C to 99 ° C, preferably 94 ° C for substantially 30s, a low temperature hybridization phase of 30 ° C to 50 ° C, preferably 37 ° C for substantially 30s and an elongation phase of 60 ° C to 80 ° C for substantially 2min.
  • the second PCR is a conventional PCR comprising 35 cycles.
  • An object of the present invention also relates to a microorganism identification kit (s), characterized in that it comprises:
  • FIG. 1 represents PCR bands obtained using the method according to the invention from samples of: virus culture supernatants of St. Louis encephalitis (SLE), tick encephalitis (Tick Borne Encephalitis, TBE), Rift Valley Fever (RVF) and uninfected cells;
  • SLE virus culture supernatants of St. Louis encephalitis
  • TBE tick encephalitis
  • RVF Rift Valley Fever
  • FIG. 2 represents PCR bands obtained using the process according to the invention from samples from a nucleic acid extract made from the blood of a patient (lane 1) and from the supernatant of culturing said blood (lane 2);
  • FIG. 3 represents PCR bands obtained using the method according to the invention from samples derived from: a culture supernatant of an unknown virus originating from a small outbreak of dermatological damage in a seniors' home (collaboration with the Hospital Hospital Virology Unit, samples C1 and C2), donor blood and culture supernatants cultured with this blood (malaria, collaboration with a parasitology laboratory working on malaria, donor blood samples and malaria parasite strains 307, W2, FCR3, BRE1);
  • FIG. 4 represents PCR bands obtained using the method according to the invention from a sample of a virus strain resulting from a case diagnosed as Dengue 3 hemorrhagic from Cambodia. A - debugging
  • primers whose hexamer is of fixed sequence and which "hybridize" frequently have been used with respect to primers with 6N degenerate hexamers which hybridize everywhere described in Allander et al.
  • a hexamer of given sequence is hydrolyzed at least once every 4096 nucleotides (1/4 6 ).
  • all 6 nucleotide sequences are not equivalent (typically a series of 6 guanosines is rare).
  • a number of hexamer sequences have been tested to retain suitable sequences, hybridizing sufficiently often to amplify any nucleic acid, but not too often so as not to amplify too many sequences for an acid nucleic source given.
  • a hexamer is at the base of a first primer (sense or antisense), a second hexamer at the base of a second primer (antisense or sense after the first primer).
  • the pairs of hexamers that can be used are summarized in the table above and in particular.
  • a pair of hexamers suitable for the present invention may be the TTGTAA pair for the first primer and TTAC AA for the second primer, for example.
  • FR20 5'-GCCGGAGCTCTGC AGATATC-3 'or its Fr20sb variant: 5' GCCGGAGCTCTGCAGATATCAGGGCGTGGT-3 '
  • BOP 5'-CGGTC ATGGTGGCGA ATA AA-3'
  • BOPsb variant 5'-CGGTC ATGGTGGCG AT ATAAATCG AGCGGC-3 '.
  • primers allow the amplification of "asymmetric" PCR fragments that can be sequenced directly. Indeed, the use of different and non-complementary tags between the two primers makes it possible to directly sequence the PCR fragment without having a PCR amplicon which folds on itself (difficult to amplify). As a result, symmetrical amplicons are eliminated.
  • the pair of primers used is the following: Fr20sb: 5 'GCCGGAGCTCTGCAGATATCAGGGCGTGGT TTACAA-3 '(first primer) and BOPsb6.10 5'-CGGTC ATGGTGGCGA ATA AATCGAGCGGCTTGTAA-3' (second primer).
  • B-Process of the Process According to the Invention also known as "Method of RT-PCR or Random PCR"
  • the purified nucleic acid is subjected to a first reverse transcription step, with the first primer and an enzyme having reverse transcription activity, such as AMV RT, Promega, etc. (enzymes known to those skilled in the art).
  • This step lasts about 40 minutes and allows the synthesis of a first strand of DNA, when the starting sample is an RNA. If the starting sample contains only DNA, this step has no effect.
  • PCR reaction mixture known to those skilled in the art (Master Mix Qiagen type) which contains the second primer.
  • the whole is subjected to 5 cycles of low selective PCR (denaturation 94 ° C 30 s, hybridization at low temperature 37 ° C 30 s, elongation 72 ° C 2 minutes).
  • This step allows synthesis of the second strand from an RNA sample, or first and second strand from a sample containing DNA. This step lasts about 40 minutes.
  • the two previous PCR steps can be grouped in a single step if the user directly follows the two PCR phases of 5 cycles and 35 cycles on the thermal cycler used, without additional intermediate addition of the two primers, these being supplied in excess at the start of the reaction.
  • Post PCR samples are then analyzed on agarose gel and any PCR bands obtained cut, purified and sequenced. About 80% of the directly sequenced bands lead to a sequence.
  • nucleic acid extraction step is not essential: a few microliters of culture directly in the RT mixture are sufficient to carry out the reaction.
  • the reaction developed by the present applicant makes it possible to amplify, in a single reaction tube, with protocols and standard laboratory equipment, in less than 4 hours, at least one PCR or RT-PCR band from any nucleic acid larger than about 3,000 nucleotides, this band being directly sequenceable in the vast majority of cases.
  • Example 1 Parvovirus and C6 / 36
  • the method according to the invention mentioned in point B was carried out by a laboratory technician on virus culture supernatants of St. Louis encephalitis (SLE), tick encephalitis (Tick Borne Encephalitis, TBE). , Rift Valley fever (RVF) and uninfected cells (see Figure 1).
  • SLE St. Louis encephalitis
  • TBE tick encephalitis
  • RVF Rift Valley fever
  • uninfected cells see Figure 1).
  • the stars indicate the sequenced bands.
  • Aedes Alpopictus Parvovirus (AaPV).
  • AaPV Aedes Alpopictus Parvovirus
  • This blood contained a virus that was previously amplified by culturing.
  • the random RT-PCR protocol according to the invention was applied to two samples: a nucleic acid extract made from the patient's blood (lane 1) and the culture supernatant (lane 2).
  • the blood sample (1) led to the identification of the ribosomal RNAs of the patient, which were present in the extract. This result only confirmed that the patient was a homo sapiens sapiens, but he stressed the importance of sample preparation before random PCR in order to eliminate nucleic acids that did not originate from the desired microorganism.
  • the viral culture supernatant (lane 2), on the other hand, allowed the identification of the dengue 2 virus, Martinique strain, a result confirming the one that the diagnostic team had had in the meantime.
  • the unique identification method according to the invention was implemented on different samples (see FIG. 3).
  • the reaction principle uses a probability rather than a chance: if for a unknown sample the primers used have a certain probability to hybridize somewhere on the nucleic acid considered, for a given sample, the primers still hybridize in the same place.
  • the same causes produce the same effects: samples containing the same microorganism lead to the amplification of the same sequences, reproducibly, so to obtain the same bands of PCR or RT-PCR.
  • the mycoplasmas of different strains lead to the obtaining of different PCR strips, but the samples of similar origin, samples from the hospital laboratory, on the one hand, of culture with the even blood on the other hand, lead individually to obtaining the same PCR bands resulting in the same sequences in each of the two groups considered.
  • a virus strain from a case diagnosed as Dengue 3 haemorrhagic from Cambodia was then analyzed.
  • Taqman specific RT-PCR tests for dengue 3 were negative, as were tests for other dengue serotypes or even universal dengue tests.
  • the nucleic acid sequences obtained which are identical, do not correspond to any sequence available in the databases (Pubmed).
  • the translated sequence has homologies with the sequence of the polymerase of a bunyaviridae, CiLV or Citrus Leprosis virus, an arbovirosis of the lemon tree transmitted by a moth.
  • bunyaviridae includes mammalian viruses (bunyavirus, nairovirus, hantavirus), it also includes a whole genus of plant viruses, Tospoviruses.
  • Random RT-PCR therefore gives a track to look for a virus of the family of bunyaviridae.
  • the method according to the invention gives a very fast result when the obtained sequence finds a significant homology in the databases. However, since this obtained sequence is not chosen, it may correspond to non-sequenced regions of genomes or to unknown microorganisms. In this case, it serves as a track to guide the identification by other means, which will require delays.
  • the method according to the invention is easy to implement in a current laboratory, it is fast, it allows for checks during the reaction so as not to make unnecessary sequencing, blind.
  • the method according to the invention has demonstrated its effectiveness in terms of molecular biology and its ability to provide information on the pathogens studied.
  • the random RT-PCR method can be applied to search for any microorganism, regardless of the species, as long as it has a nucleic acid.

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Abstract

La présente invention concerne un couple d'hexamères et un couple d'amorces particuliers pour l'identification de microorfanismes, sans a priori, dans un échantillon. La présente invention concerne également un procédé d'identification de microorganisme(s), ainsi qu'un kit "d'identification de microorganismes, utilisant les hexamères et amorces susmentionnés.

Description

Amplification génique statistique pour l'identification sans a priori de microorganismes par séquençage sans étape de clonage
Domaine de l'invention :
La présente invention se rapporte à un couple d'hexamères et un couple d'amorces, aptes à s'hybrider suffisamment souvent sur une séquence d'acide nucléique pour amplifier un fragment, tel qu'un fragment de 400 nucléotides, de n'importe quel génome ou transcriptome de microorganisme.
La présente invention se rapporte aussi à un procédé permettant l'obtention de fragments d'ADN susceptibles d'être séquences directement, sans a priori sur l'espèce recherchée.
La présente invention se rapporte aussi à un kit d'identification de microorganisme(s) .
Problématique et état de la technique :
Les infections microbiennes, c'est-à-dire l'infection d'un organisme hôte par un microorganisme, sont l'une des causes majeures de morbidité dans les populations en général. Afin d'établir un diagnostic efficace d'une maladie ou d'une infection et de déterminer le traitement approprié, il est important d'identifier rapidement et précisément l'agent pathogène à l'origine de l'infection.
En outre, en épidémiologie, l'identification du microorganisme entraînant l'infection est importante car il peut aider à déterminer la source, ainsi que le mode de transmission de l'infection en question.
De plus, la connaissance de la séquence génomique, entière ou partielle, d'un microorganisme est le moyen le plus efficace pour l'identifier et le situer dans la classification des espèces.
Le document EP 0 077 149 décrit une méthode dite classique pour l'identification de microorganismes inconnus. Cette méthode consiste à ajouter à un échantillon contenant le microorganisme inconnu, un agent émetteur tel qu'un aminoacide radioactif, afin d'obtenir un mélange de produits émetteurs, ceci dépendant du mécanisme métabolique du microorganisme. Après incubation, la réaction est interrompue et les produits émetteurs sont séparés comme par électrophorèse sur une plaque de gel. La plaque peut être alors autoradiographiée par exposition à un film photographique afin d'obtenir sur celui-ci une image des bandes caractéristiques fonctionnant comme un moyen d'identification du microorganisme. L'identification peut être effectuée en comparant le moyen d'identification pour le microorganisme inconnu avec un ensemble de moyens d'identification de microorganismes connus, afin de trouver une correspondance avec l'un de ces microorganismes connus. La comparaison peut être réalisée par examen approfondi des agents d'identification inconnus afin de produire un signal qui est comparé aux signaux représentant les agents d'identification connus stockés dans un ordinateur. Alternativement, les produits émetteurs, après séparation, peuvent être détectés par examen approfondi direct afin de fournir un signal d'identification pour un procédé par ordinateur.
Le document EP 0 151 8855 décrit également un procédé classique pour l'identification d'un microorganisme dans un échantillon. Le microorganisme est exposé à des conditions conduisant à son développement en présence de plusieurs substrats de croissance qui sont inoculés individuellement avec le microorganisme. La présence ou l'absence d'anhydride carbonique comme sous-produit du métabolisme de ces substrats est détectée par analyse infra-rouge et fournit un profil du microorganisme inconnu. L'identification est effectuée en comparant ce profil avec ceux de microorganismes connus traités de la même manière.
Aussi, les méthodes d'indentification de microorganismes inconnues comprennent généralement : la mise en culture d'un échantillon pris chez un patient malade (échantillon de sang), la reculture sur un milieu de croissance sélectif. Ensuite, prennent place les caractérisations biochimiques du microorganisme en question qui peuvent être faites par : un test de production d'indole, une coloration des bactéries gram négatifs ou gram positifs, l'étude de la morphologie des colonies, etc.
Ces méthodes nécessitent beaucoup de mises en culture et prennent du temps, notamment lorsque le microorganisme impliqué dans l'infection est à croissance lente.
D'autre part, la détection de la présence d'un microorganisme grâce à la technologie liée à l'ADN est devenue importante pour diagnostiquer des maladies.
Le séquençage est devenu en effet un processus simple aujourd'hui. Il nécessite l'obtention d'ADN double brin en quantité suffisante et de longueur suffisante, ce qui est réalisé classiquement par PCR (amplification en chaîne par polymérase) ou RT-PCR (la PCR par transcriptase inversé) à partir d'acides nucléiques extraits de l'espèce étudiée.
Toutefois, dans le cas de microorganismes inconnus, cette étape est le cœur du problème : la RT-PCR repose en effet sur l'hybridation de deux amorces d'ADN complémentaires de la séquence étudiée et il est, par définition, impossible de réaliser une amorce dont la séquence soit complémentaire d'une séquence que l'on ignore.
Les solutions décrites dans l'état de la technique sont de trois types :
1) la PCR par familles : elle repose sur l'utilisation de séquences consensus pour certaines familles de virus. Cette solution n'envisage pas un pathogène réellement inconnu, mais une suspicion d'appartenance à une famille virale. Par ailleurs, toutes les familles virales ne présentent pas de zones conservées sur leur génome.
2) la bioinformatique : qui consiste à un séquençage haut débit, au hasard, de petits fragments d'ADN (Shotgun) et à une reconstruction des séquences par ordinateur. Toutefois, ces processus sont longs, coûteux et requièrent des équipes spécialisées.
3) la PCR au hasard (random PCR) :
Allander et collaborateurs ont réalisé les PCR à partir d'amorces en deux parties : un hexamère de 6 nucléotides aléatoires (6N, random) qui s'hybride sur n'importe quelle séquence d'ADN et une étiquette (tag) de séquence fixée de 20 nucléotides en 5' : 5' TAG-NNNNNN-3'. Cette amorce dégénérée permet la synthèse d'un premier brin d'ADN (transcription inverse par exemple), puis d'un second (avec par exemple une klenow polymérase), initiés aléatoirement. Une PCR classique est ensuite réalisée avec une amorce ciblant les étiquettes pour amplifier les ADN obtenus. Elle permet la multiplication du nombre de brins d'ADN, les amorces s'hybridant sur toutes les séquences possibles. Les produits de PCR sont déposés sur gel d'agarose. Les amorces s'hybridant de façon complètement aléatoire, toutes les tailles possibles de fragments des produits de PCR sont obtenues, il n'y a donc pas de bandes isolées (sur le gel d'agarose, on n'observe non pas des bandes isolées mais un continuum de bandes). Les produits de PCR séquençables, de taille 300- 600 nucléotides, sont excisés à partir du morceau de gel correspondant, puis clonés dans des bactéries après purifications. Un certain nombre de clones sont alors analysés par séquençage et un programme informatique réalise automatiquement la comparaison des séquences avec les bases de données génétiques disponibles sur internet, telles que BLAST. BLAST (basic local alignment search toot) est en effet un algorithme utilisé en bio-informatique permettant de trouver les régions similaires entre deux ou plusieurs séquences de nucléotides ou d'acides aminés. Ce programme permet de calculer significativement les pourcentages de similitude entre les séquences en les comparant avec des banques de données.
Toutefois, le fait d'avoir une PCR complètement aléatoire, qui génère une infinité de fragments même lorsqu'un seul acide nucléique, typiquement un génome viral, est analysé peut présenter les inconvénients suivants :
- Il s'agit ainsi d'une amplification au hasard de n'importe quelle séquence d'acide nucléique. Il y a donc une étape de préparation de l'échantillon avant le traitement par biologie moléculaire, puis une étape de bioinformatique afin de supprimer tous les acides nucléiques et signaux ne relevant pas du pathogène.
- Après l'étape de PCR inverse (RT-PCR), l'étape de clonage dans des bactéries est indispensable. En effet un très grand nombre de fragments de PCR sont générés, et doivent être individualisés par le clonage dans des bactéries, ce qui augmente le nombre de séquences à réaliser.
- Un échantillon contenant un virus pur donne exactement le même profil de PCR qu'un échantillon contenant un acide nucléique provenant de l'hôte, de cellules, etc. Il n'y a donc pas de contrôle de réaction avant l'étape ultime de séquençage et de comparaison de séquence, d'où un surcoût en temps de travail monopolisé et en coût financier.
- Dans le cas ou plusieurs virus pourraient être présents dans l'échantillon de départ, le moins représenté sera perdu lors de l'amplification ou de l'analyse des clones bactériens, « dominé » par le plus représenté (effet stochastique). - Le processus est lent et nécessite de nombreuses manipulations : il faut deux à trois jours pour réaliser l'intégralité de la réaction en particulier compte tenu des étapes de clonage en bactéries, entraînant un impact en termes de monopolisation des ressources humaines, matérielles et financières.
Résumé de l'invention :
L'invention a pour but de proposer un nouveau procédé d'identification de microorganismes qui évite tout ou partie des inconvénients précités.
A cet effet, l'invention concerne un couple d'hexamères pour PCR pour la détection de microorganismes, comprenant un premier hexamère destiné à être placé à l'extrémité 3' d'une première amorce et un deuxième hexamère destiné à être placé à l'extrémité 3 ' d'une seconde amorce, ledit couple d'hexamères étant susceptible d'être obtenu par le procédé consistant à :
a) découper les séquences de génomes d'au moins cinq virus de familles différentes en groupes de six nucléotides successifs, b) classer les séquences de six nucléotides, dits hexamères, en fonction de leur fréquence d'occurrence,
c) sélectionner les couples d'hexamères présentant la fréquence d'occurrence la plus représentée, tels que les vingt premiers hexamères, de préférence les dix premiers, de manière encore plus préférée les cinq premiers présentant une fréquence d'occurrence la plus importante par rapport aux autres couples d'hexamères, de sorte à obtenir un couple d'amorces aptes à s'hybrider statistiquement souvent sur n'importe quelle matrice d'acide nucléique.
Le présent demandeur a en effet découvert des hexamères non dégénérés, mais qui au contraire, présentent une séquence fixe, ces hexamères étant aptes à s'hybrider statistiquement souvent, mais pas trop afin de ne pas amplifier un trop grand nombre de séquences pour un acide nucléique source donné. Le présent demandeur a ainsi réalisé un choix parmi l'infinie possibilité d'hexamères existants.
Avantageusement, le premier et le deuxième hexamères sont choisis parmi : Premier hexamère Deuxième hexamère
(écriture des hexamères de 5' en 3') (écriture des hexamères de 5' en 3')
TTGTAA TTACAA
TCATCA TTGTAA
AAAGAA TTGTAA
GGAAAA TTTTCC
TCTTTC
GAAAGA
GGAAGA TCTTCC
AGAAAA TTTTCT
GGGAAA TTTCCC
AAGAAA TTTCTT
AACATG CATGTT
GAAAAA TTTTTC
AAGGAA TTCCTT
GGAAAG CTTTCC
TGGAAA TTTCCA
AAAAAA TTTTTT
GAAGAA TTCTTC
AGGAGA TCTCCT
AAAAAG CTTTTT
AAAAGA TCTTTT
ACATGG CCATGT
AGAAGA TCTTCT
TGATGA TCATCA
TGGAAG CTTCCA
CATGGA TCCATG
AGGAAA TTTCCT
TGGGAA TTCCCA
AGAGAA TTCTCT
Les hexamères de la seconde liste (colonne de droite) sont les hexamères inverse et complémentaires de ceux de la première liste (colonne de gauche) puisque les hexamères de chacune des deux listes sont destinés à appartenir aux deux amorces d'amplification, l'une jouant le rôle d'amorce dite « sens », donc par convention de séquence identique à celle de la matrice à amplifier, et l'autre jouant le rôle d'amorce antisens, donc par convention de séquence inverse et complémentaire de celle de la matrice à amplifier, de telle sorte que les deux amorces puissent s'hybrider tour à tour sur les brins d'ADN synthétisés lors des cycles de PCR à partir de la matrice initiale.
La présente invention concerne également un couple d'amorces pour la détection de microorganismes, comprenant une première amorce sens et une seconde amorce, la première amorce comprenant à son extrémité 3 ' un premier hexamère tel que défini ci-dessus et la seconde amorce comprenant à son extrémité 3 ', le deuxième hexamère tel que défini ci-dessus, la première et seconde amorces pouvant être une amorce sens et une amorce anti-sens ou une amorce anti-sens et une amorce sens.
De préférence, la première ou seconde amorce comprend à son extrémité 5' une étiquette choisie parmi : FR20 : 5'- GCCGG AGCTCTGC AGATATC-3 ' ou sa variante Fr20sb : 5' GCCGG AGCTCTGC AG AT ATC AGGGCGTGGT-3 ' , BOP : 5'- CGGTC ATGGTGGCGAATAAA-3 ' ou sa variante BOPsb : 5'- CGGTC ATGGTGGCGA ATAAATCGAGCGGC-3 ' , et à la condition que l'étiquette de la première amorce soit différente de l'étiquette de la seconde amorce et ne corresponde pas non plus à une de ses variantes.
En particulier, la première et seconde amorces présentent la séquence choisie parmi : BOPsbô.10 5'-
CGGTCATGGTGGCGAATAAATCGAGCGGCTTGTAA-3 ' et Fr20sb : 5' GCCGGAGCTCTGCAGATATCAGGGCGTGGT TTACAA-3' ou_FR20 : 5' -GCCGG AGCTCTGC AGATATC TTACAA -3' et BOP : 5 ' -CGGTC ATGGTGGCGA ATA A ATTGT A A -3 ' .
La présente invention se rapporte aussi à un procédé d'identification de microorganisme(s) dans un échantillon comprenant le couple d'amorces tel que défini ci-dessus, ledit procédé comprenant les étapes consistant à :
i) Si nécessaire, préparer ledit échantillon afin d'éliminer les acides nucléiques non issus du ou des microorganismes recherchés,
ii) si l'échantillon obtenu à l'étape i) est un ARN, effectuer une étape de transcription inverse avec ladite première amorce ou la seconde amorce et une enzyme possédant une activité transcriptase inverse,
iii) ajouter un mélange réactionnel de PCR comprenant la première et seconde amorce et effectuer une première PCR de pré-amplification avec une phase d'hybridation à basse température, telle qu'aux alentours de 45 °C, et éventuellement une seconde PCR avec une hybridation à haute température, telle que 50°C,
iv) analyser les résultats de la PCR. Avantageusement, les produits obtenus à l'étape iv) sont analysés sur gel d'agarose.
De préférence, les bandes PCR obtenues sur ledit gel d'agarose sont découpées, purifiées et séquencées.
Selon une caractéristique de l'invention, au moins deux des différentes étapes du procédé i), ii), iii) et iv sont réalisés dans le même tube réactionnel.
Selon une autre caractéristique de l'invention, la première PCR de pré-amplification comprend au moins 2 cycles.
De manière préférentielle, chaque cycle de la première PCR comprend une phase de dénaturation à 90°C à 99°C, de préférence 94°C pendant sensiblement 30s, une phase d'hybridation à basse température de 30°C à 50°C, de préférence 37°C pendant sensiblement 30s et une phase d'élongation de 60°C à 80°C pendant sensiblement 2min.
Avantageusement, la deuxième PCR est une PCR classique comprenant 35 cycles.
Un but de la présente invention concerne également un kit d'identification de microorganisme(s), caractérisé en ce qu'il comprend :
a- le couple d'amorces tel que défini ci-dessus,
b - éventuellement un mélange réactionnel de PCR,
c - et une notice d'emploi.
Description détaillée de l'invention :
Pour mieux faire comprendre l'objet de l'invention, des exemples de réalisation vont être décrits. La description de l'invention qui va suivre est donnée à titre d'exemples purement illustratifs et non limitatifs en référence aux dessins annexés :
Sur le dessin :
- la figure 1 représente des bandes de PCR obtenues à l'aide du procédé selon l'invention à partir d'échantillons de : surnageants de culture virale de l'encéphalite de Saint-Louis (SLE), d'encéphalite à tique (Tick Borne Encéphalitis, TBE), de fièvre de la vallée du Rift (RVF) et des cellules non infectées ;
- la figure 2 représente des bandes de PCR obtenues à l'aide du procédé selon l'invention à partir d'échantillons issus d'un extrait d'acides nucléiques réalisé à partir du sang d'un patient (piste 1) et à partir du surnageant de mise en culture dudit sang (piste 2) ;
- la figure 3 représente des bandes de PCR obtenues à l'aide du procédé selon l'invention à partir d'échantillons issus : d'un surnageant de culture d'un virus inconnu provenant d'une petite flambée d'atteinte dermatologique dans un foyer de personnes âgées (collaboration avec l'Unité de virologie d'un hôpital hospitalier, échantillons Cl et C2), de sang de donneur et de surnageants de culture de parasites mis en culture avec ce sang (paludisme, collaboration avec un laboratoire de parasitologie travaillant sur le paludisme, échantillons sang donneur et de souches de parasite du paludisme 307, W2, FCR3, BRE1) ;
- la figure 4 représente des bandes de PCR obtenues à l'aide du procédé selon l'invention à partir d'un échantillon d'une souche virus issue d'un cas diagnostiqué comme Dengue 3 hémorragique provenant du Cambodge. A - mise au point des amorces
Séquences d 'hybridation :
Pour pallier les inconvénients susmentionnés, des amorces dont l'hexamère est de séquence fixe et qui s'hybrident « souvent » ont été utilisées par rapport aux amorces avec hexamères dégénérés 6N qui s'hybrident partout décrits dans Allander et la.
Mathématiquement, un hexamère de séquence donnée s'hydride au moins une fois tous les 4096 nucléotides (1/46). Biologiquement, toutes les séquences de 6 nucléotides ne sont pas équivalentes (typiquement une série de 6 guanosines est rare).
Par informatique, un découpage des séquences des génomes de cinq virus de familles différentes (rougeole, ebola, dengue 2 (x2), dengue 3, disponibles sous Pubmed) en groupes de 6 nucléotides successifs, a été réalisé. Puis, un classement selon leur fréquence d'occurrence a été effectué, afin de sélectionner les hexamères en moyenne les plus représentés dans les génomes viraux. Le nombre de virus sélectionné (5) est faible, mais dans tous les tests, l'ajout de nouveaux virus n'a pas modifié les hexamères en tête de classement.
Il n'a pas été possible de trouver des heptamères (7 nt) et a fortiori des octamères (8 nt) communs à plusieurs virus.
Un certain nombre de séquences d'hexamères ont été testées afin de retenir des séquences convenables, s'hybridant suffisamment souvent pour amplifier n'importe quel acide nucléique, mais pas trop souvent afin de ne pas amplifier un trop grand nombre de séquences pour un acide nucléique source donné. Un hexamère est à la base d'une première amorce (sens ou anti-sens), un second hexamère à la base d'une seconde amorce (anti-sens ou sens suivant la première amorce). En particulier, les couples d'hexamères qui peuvent être utilisés sont récapitulés dans le tableau ci-dessus et en particulier. Un couple d'hexamères convenant pour la présente invention peut être le couple TTGTAA pour la première amorce et TTAC AA pour la seconde amorce par exemple.
Séquences d'étiquette :
Dans la technique utilisée par Allander, une seule étiquette est utilisée pour la PCR. Les fragments de PCR amplifiés possèdent donc les mêmes extrémités (l'étiquette et son complémentaire). Cette symétrie des extrémités empêche un séquençage direct des produits de PCR obtenus (il y aurait séquençage du fragment de PCR dans les deux sens concomitamment donc impossibilité de résoudre la double séquence).
Deux étiquettes différentes ont été sélectionnées : FR20 : 5'- GCCGGAGCTCTGC AGATATC-3 ' ou sa variante Fr20sb : 5' GCCGGAGCTCTGCAGATATCAGGGCGTGGT-3', BOP : 5'- CGGTC ATGGTGGCGA ATA AA-3 ' ou sa variante BOPsb : 5'- CGGTC ATGGTGGCG A ATAAATCG AGCGGC-3 ' .
Ces amorces permettent l'amplification de fragments de PCR « asymétriques », susceptibles d'être séquencés directement. En effet, l'utilisation d'étiquettes différentes et non complémentaires entre les deux amorces permet de séquencer directement le fragment de PCR sans avoir un amplicon de PCR qui se replie sur lui même (difficile à amplifier). Par conséquent, les amplicons symétriques sont éliminés.
Pour la suite des exemples, le couple d'amorces utilisé est le suivant : Fr20sb : 5' GCCGGAGCTCTGCAGATATCAGGGCGTGGT TTACAA-3' (première amorce) et BOPsb6.10 5'- CGGTC ATGGTGGCGA ATA AATCGAGCGGCTTGTAA-3 ' (seconde amorce). B- Déroulement du procédé selon l'invention, dit aussi « procédé de la RT-PCR ou PCR aléatoire »
Comme pour Allander et collaborateurs, dans la mesure où la technique utilisée amplifie n'importe quel acide nucléique, il convient d'avoir comme matériel initial un échantillon ne contenant que le micro organisme étudié. Typiquement des cellules infectées sont un mauvais matériel de départ car les ARNs ribosomaux de l'hôte sont fortement majoritaires, en revanche le surnageant clarifié de ces mêmes cellules non lysées est un échantillon convenable, et c'est ce type d'échantillon qui sera illustré dans les exemples.
L'acide nucléique purifié est soumis à une première étape de transcription inverse, avec la première amorce et une enzyme possédant une activité de transcription inverse, telle que AMV RT, Promega, etc (enzymes connues de l'homme du métier). Cette étape dure environ 40 minutes et permet la synthèse d'un premier brin d'ADN, lorsque l'échantillon de départ est un ARN. Si l'échantillon de départ contient uniquement de l'ADN, cette étape est sans effet.
Dans le même tube est ajouté un mélange réactionnel de PCR connu de l'homme du métier (type Master Mix Qiagen) qui contient la seconde amorce. Le tout est soumis à 5 cycles de PCR peu sélectifs (dénaturation 94°C 30 s, hybridation à basse température 37°C 30 s, élongation 72°C 2 minutes). Cette étape permet la synthèse du second brin à partir d'un échantillon d'ARN, ou du premier puis du second brin à partir d'un échantillon contenant de l'ADN. Cette étape dure environ 40 minutes.
Dans le même tube sont ajoutées enfin une nouvelle fois les deux amorces, afin de réaliser l'amplification, par 35 cycles de PCR classique. Cette étape dure environ 2,5 heures.
Selon une variante de réalisation, les deux étapes précédentes de PCR, peuvent être groupées en une seule étape si l'utilisateur fait se suivre directement les deux phases de PCR de 5 cycles puis 35 cycles sur le thermocycleur utilisé, sans ajout supplémentaire intermédiaire des deux amorces, celles-ci étant fournies en excès au départ de la réaction.
Les échantillons post PCR sont ensuite analysés sur gel d'agarose et les éventuelles bandes de PCR obtenues découpées, purifiées et séquencées. Environ 80% des bandes directement séquencées conduisent à l'obtention d'une séquence.
Il est à noter que sur de surnageants de culture virale, l'étape d'extraction des acides nucléiques n'est pas indispensable : quelques microlitres de culture directement dans le mélange de RT suffisent à réaliser la réaction.
Ainsi, la réaction mise au point par le présent demandeur permet d'amplifier dans un tube réactionnel unique, avec des protocoles et des matériels courants de laboratoires, en moins de 4 heures, au moins une bande de PCR ou RT-PCR à partir de n'importe quel acide nucléique de taille supérieure à environ 3 000 nucléotides, cette bande étant directement séquençable dans la grande majorité des cas.
Maintenant, des exemples d'identification selon l'invention purement illustratifs et non limitatifs de la portée de l'invention vont être décrits.
Exemple 1 : Parvovirus et C6/36
Le procédé d'identification de microorganisme a été validé sur des virus détenus au laboratoire, recherchés à l'aveugle.
Le procédé selon l'invention mentionné au point B a été mis en œuvre par un technicien de laboratoire sur des surnageants de culture virale de l'encéphalite de Saint-Louis (SLE), d'encéphalite à tique (Tick Borne Encéphalitis, TBE), de fièvre de la vallée du Rift (RVF) et des cellules non infectées (voir figure 1). Les étoiles indiquent les bandes séquencées.
Comme le montre cette figure 1, des bandes d'amplification, correspondant après séquençage aux virus attendus dans chacun des cas ont bien été retrouvées.
Cette étude a permis en outre, sur l'échantillon RVF d'amplifier 2 bandes de PCR, l'une correspondant effectivement au virus RVF attendu, l'autre correspondant à un parvovirus d'insecte, Aedes Alpopictus Parvovirus (AaPV). Après recherche bibliographique, il s'agit d'un parvovirus ayant déjà été trouvé comme infectant de façon chronique une lignée de cellules C6/36, cellules qui proviennent 'Aèdes albopictus (Boublik Y . et al, Cloning, sequencing and infectious plasmid construction of a new parvovirus, the Aedes Albopictus Parvovirus, pathogenic for the mosquito Aedes Aegypti larvae, thèse Université Aix Marseille, 1993).
Exemple 2 : Sang Patient X
Un échantillon de sang dont le diagnostic était initialement peu clair a été étudié avec le présent procédé.
Ce sang contenait un virus qui a été préalablement amplifié par une mise en culture.
Le protocole de RT-PCR aléatoire selon l'invention a été appliqué sur deux échantillons : un extrait d'acides nucléiques réalisé à partir du sang du patient (piste 1 ) et le surnageant de mise en culture (piste 2).
Comme le montre la figure 2, l'échantillon de sang (1) a conduit à l'identification des ARN ribosomaux du patient, qui étaient présents dans l'extrait. Ce résultat a seulement confirmé que le patient était bien un homo sapiens sapiens, il souligne toutefois l'importance de la préparation de l'échantillon avant la PCR aléatoire afin d'éliminer les acides nucléiques non issus du micro organisme recherché.
Le surnageant de culture virale (piste 2) a permis en revanche l'identification du virus de la dengue 2, souche martiniquaise, résultat confirmant celui que l'équipe de diagnostic avait eu entre temps.
Exemple 3 : Reproductibilité et microorganismes non viraux (figure 3)
Le procédé d'identification unique selon l'invention a été mis en uvre sur différents échantillons (voir figure 3).
Toutes les bandes séquencées correspondaient à des mycoplasmes ayant contaminé les cultures, de deux souches différentes, une pour les échantillons Cl et C2 d'un laboratoire hospitalier, la seconde pour les échantillons de culture de parasites du paludisme.
Cette série d'expériences permet également de valider la reproductibilité du procédé selon l'invention. En effet, le principe réactionnel utilise de fait une probabilité plutôt qu'un hasard : si pour un échantillon inconnu les amorces utilisées ont une certaine probabilité de s'hybrider quelque part sur l'acide nucléique considéré, pour un échantillon donné, les amorces s'hybrident toujours au même endroit. En d'autres termes, les mêmes causes produisent les mêmes effets : des échantillons contenant le même microorganisme conduisent à l'amplification des mêmes séquences, de façon reproductible, donc à l'obtention des mêmes bandes de PCR ou RT-PCR.
Ainsi, les mycoplasmes de souches différentes, provenant du laboratoire hospitalier ou de sang du donneur, conduisent à l'obtention de bandes de PCR différentes, mais les échantillons d'origine similaire, échantillons du laboratoire hospitalier d'une part, de culture avec le même sang d'autre part, conduisent individuellement à l'obtention des mêmes bandes de PCR aboutissant aux mêmes séquences dans chacun des deux groupes considérés.
Ceci représente le net avantage par rapport au protocole d'Allander et collaborateurs : sur les séries présentant une origine similaire, il n'est pas nécessaire de séquencer toutes les bandes identiques, car elles conduiront avec certitude aux mêmes séquences finales.
Exemple 4 : Virus inconnus
Une souche virus issue d'un cas diagnostiqué comme Dengue 3 hémorragique provenant du Cambodge a ensuite été analysée.
Rapidement il est apparu que le comportement du virus en culture cellulaire était surprenant pour une dengue (effet cythopathogène particulièrement marqué et rapidement développé).
Les tests en RT-PCR Taqman spécifiques de la dengue 3 se sont révélés négatifs, de même que les tests des autres sérotypes de dengue ou même que les tests dengue universels réalisés.
Le procédé de RT-PCR aléatoire a été appliqué : à deux extraits de surnageant de culture sur cellules VERO de ce virus (24h post infection =24h p. i et 48h post infection = 48h p.i.) et contrôle sur un surnageant de cellules non infectées (-) (figure 4).
Les séquences d'acide nucléique obtenues, identiques, ne correspondent à aucune séquence disponible dans les bases de données (Pubmed). La séquence traduite présente toutefois des homologies avec la séquence de la polymérase d'un bunyaviridae, CiLV ou Citrus Leprosis virus, une arbovirose du citronnier transmise par une mite.
Ce résultat peut paraître surprenant, homologie avec un virus végétal pour une hémorragie humaine. Toutefois, si la famille des bunyaviridae comprend des virus de mammifères (bunyavirus, nairovirus, hantavirus), elle comprend également tout un genre de virus de plantes, les Tospovirus.
La RT-PCR aléatoire donne donc une piste pour chercher un virus de la famille des bunyaviridae.
Le procédé selon l'invention donne un résultat très rapide lorsque la séquence obtenue trouve une homologie significative dans les bases de données. Toutefois, étant donné que cette séquence obtenue n'est pas choisie, elle peut correspondre à des régions non séquencées de génomes ou à des microorganismes non connus. Dans ce cas, elle sert de piste pour orienter l'identification par d'autres moyens, qui demandera des délais.
Par conséquent, le procédé selon l'invention est facile de mise en œuvre dans un laboratoire courant, il est rapide, il permet de faire des contrôles en cours de réaction afin de ne pas faire de séquençages inutiles, en aveugle. De plus, sur les différents exemples présentés ici, le procédé selon l'invention a démontré son efficacité en terme de biologie moléculaire et sa capacité à fournir des informations sur les pathogènes étudiés.
En outre, le procédé de RT-PCR aléatoire peut être appliqué à la recherche de tout micro organisme, quelle que soit l'espèce, tant qu'il possède un acide nucléique.
Bien que l'invention ait été décrite en relation avec un mode de réalisation particulier, il est bien évident qu'elle n'y est nullement limitée et qu'elle comprend tous les équivalents techniques des moyens décrits ainsi que leurs combinaisons si celles-ci entrent dans le cadre de l'invention.

Claims

REVENDICATIONS
1. Couple d'hexamères pour PCR pour la détection de microorganismes, comprenant un premier hexamère destiné à être placé à l'extrémité 3' d'une première amorce et un deuxième hexamère destiné à être placé à l'extrémité 3' d'une seconde amorce, ledit couple d'hexamères étant susceptible d'être obtenu par le procédé consistant à : d) découper les séquences de génomes d'au moins cinq virus de familles différentes en groupe de six nucléotides successifs, e) classer les séquences de six nucléotides, dits hexamères, en fonction de leur fréquence d'occurrence,
f) sélectionner les couples d'hexamères présentant la fréquence d'occurrence la plus représentée, tels que les vingt premiers hexamères, de préférence les dix premiers, de manière encore plus préférée les cinq premiers présentant une fréquence d'occurrence la plus importante par rapport aux autres couples d'hexamères, de sorte à obtenir un couple d'amorces aptes à s'hybrider statistiquement souvent sur n'importe quelle matrice d'acide nucléique.
2. Couple d'hexamères selon la revendication 1, dans lequel le premier et le deuxième hexamères sont choisis parmi :
Premier hexamère Deuxième hexamère (écriture des hexamères de 5' en 3') (écriture des hexamères de 5' en 3')
TTGTAA TTACAA
TCATCA TTGTAA
AAAGAA TTGTAA
GGAAAA TTTTCC
TCTTTC
GAAAGA
GGAAGA TCTTCC
AGAAAA TTTTCT
GGGAAA TTTCCC
AAGAAA TTTCTT
AACATG CATGTT
GAAAAA TTTTTC
AAGGAA TTCCTT
GGAAAG CTTTCC
TGGAAA TTTCCA
AAAAAA TTTTTT
GAAGAA TTCTTC
AGGAGA TCTCCT
AAAAAG CTTTTT
AAAAGA TCTTTT ACATGG CCATGT
AGAAGA TCTTCT
TGATGA TCATCA
TGGAAG CTTCCA
CATGGA TCCATG
AGGAAA TTTCCT
TGGGAA TTCCCA
AGAGAA TTCTCT
3. Couple d'amorces pour la détection de microorganismes, comprenant une première amorce sens et une seconde amorce, la première amorce comprenant à son extrémité 3' un premier hexamère tel que défini dans les revendications 1 à 2 et la seconde amorce comprenant à son extrémité 3', le deuxième hexamère tel que défini selon les revendications 1 à 2, la première et seconde amorces pouvant être une amorce sens et une amorce anti-sens ou une amorce anti-sens et une amorce sens.
4. Couple d'amorces selon la revendication 3, dans lequel la première ou seconde amorce comprend à son extrémité 5' une étiquette choisie parmi : FR20 : 5'-GCCGGAGCTCTGCAGATATC-3 ' ou sa variante Fr20sb : 5' GCCGGAGCTCTGCAGATATCAGGGCGTGGT- 3', BOP : 5 ' -CGGTC ATGGTGGCG A ATA A A-3 ' ou sa variante BOPsb : 5 ' -CGGTC ATGGTGGCGAATA AATCGAGCGGC-3 ' , et à la condition que l'étiquette de la première amorce soit différente de l'étiquette de la seconde amorce et ne corresponde pas non plus à une de ses variantes.
5. Couple d'amorces selon l'une des revendications 3 à 4, dans lequel la première et seconde amorces présentent la séquence choisie parmi : BOPsbô.10 5'-
CGGTC ATGGTGGCG AATAAATCGAGCGGCJJOTAA-3 ' et Fr20sb : 5' GCCGGAGCTCTGCAGATATCAGGGCGTGGT TTACAA-3' .ou FR20 : 5 ' -GCCGGAGCTCTGC AG ATATC TTACAA -3' et BOP : 5 '-CGGTCATGGTGGCGAATAAATTGTAA -3'.
6. Procédé d'identification de microorganisme(s) dans un échantillon comprenant le couple d'amorces selon l'une des revendications 3 à 5, ledit procédé comprenant les étapes consistant à :
v) Si nécessaire, préparer ledit échantillon afin d'éliminer les acides nucléiques non issus du ou des microorganismes recherchés, vi) si l'échantillon obtenu à l'étape i) est un ARN, effectuer une étape de transcription inverse avec ladite première amorce ou la seconde amorce et une enzyme possédant une activité transcriptase inverse,
vii) ajouter un mélange réactionnel de PCR comprenant la première et seconde amorces et effectuer une première PCR de pré-amplification avec une phase d'hybridation à basse température, telle qu'aux alentours de 45°C, et éventuellement une seconde PCR avec une hybridation à haute température, telle que 50°C,
viii) analyser les résultats de la PCR.
7. Procédé d'identification de microorganisme(s) selon la revendication 6, dans lequel les produits obtenus à l'étape iv) sont analysés sur gel d'agarose.
8. Procédé d'identification de microorganisme(s) selon la revendication 7, dans lequel les bandes PCR obtenues sur ledit gel d'agarose sont découpées, purifiées et séquencées.
9. Procédé d'identification de microorganisme(s) selon l'une des revendications 6 à 8, dans lequel au moins deux des différentes étapes du procédé i), ii), iii) et iv sont réalisés dans le même tube réactionnel.
10. Procédé d'identification de microorganisme(s) selon l'une des revendications 6 à 9, dans lequel la première PCR de pré- amplification comprend au moins 2 cycles.
1 1. Procédé d'identification de microorganisme(s) selon la revendication 10, dans lequel chaque cycle de la première PCR comprend une phase de dénaturation à 90°C à 99°C, de préférence 94°C pendant sensiblement 30s, une phase d'hybridation à basse température de 30°C à 50°C, de préférence 37°C pendant sensiblement 30s et une phase d'élongation de 60°C à 80°C pendant sensiblement 2min.
12. Procédé d'identification de microorganisme(s) selon l'une des revendications 6 à 1 1 , dans lequel la deuxième PCR est une PCR classique comprenant 35 cycles.
13. Kit d'identification de microorganisme(s), caractérisé en ce qu'il comprend :
a - le couple d'amorces selon l'une des revendications 3 à 5, b - éventuellement un mélange réactionnel de PCR, c - et une notice d'emploi.
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