EP1425420A1 - IDENTIFACTION MOLECULAIRE DES BACTERIES DU GENRE i STAPHYLOCOCCUS /i - Google Patents

IDENTIFACTION MOLECULAIRE DES BACTERIES DU GENRE i STAPHYLOCOCCUS /i

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Publication number
EP1425420A1
EP1425420A1 EP02781366A EP02781366A EP1425420A1 EP 1425420 A1 EP1425420 A1 EP 1425420A1 EP 02781366 A EP02781366 A EP 02781366A EP 02781366 A EP02781366 A EP 02781366A EP 1425420 A1 EP1425420 A1 EP 1425420A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
staphylococcus
sequences
seq
sequence
bacterium
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP02781366A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Didier Raoult
Michel Drancourt
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Biomerieux SA
Original Assignee
Biomerieux SA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Biomerieux SA filed Critical Biomerieux SA
Publication of EP1425420A1 publication Critical patent/EP1425420A1/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/305—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Micrococcaceae (F)
    • C07K14/31—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Micrococcaceae (F) from Staphylococcus (G)

Definitions

  • the present invention relates to the field of diagnostics. More specifically, the invention relates to a method for the molecular identification of bacteria of the genus Staphylococcus by detection and / or amplification and sequencing techniques using probes or oligonucleotide primers applied to strains of this genus bacterial.
  • the bacteria of the genus Staphylococcus are cocciform, Gram-positive and catalase-positive bacteria of which 36 species are currently recognized, 9 of which include subspecies [Euzéby JP. (1997) Int J Syst Bacteriol 47: 590-2]. These species are coagulase-negative, with the exception of Staphylococcus aureus, Staphylococcus intermedius, Staphylococcus delphinii, Staphylococcus schleiferi subsp. coagulans, and some strains of Staphylococcus hyicus [Kloos WE (1995) In Manual of Clinical Microbiology, pp 282-298, ASM Press].
  • Staphylococcus aureus is a coagulase-positive species responsible for food poisoning linked to the production of an enterotoxin, toxic staphylococcal shock, and purulent infections characterized by septic metastases distant from the initial infectious focus.
  • the molecular targets currently proposed for the molecular identification of bacteria of the genus Staphylococcus include the 16S rDNA gene encoding the 16S subunit of ribosomal RNA [Bialkowska-Hobrzanska H et al. (1990) Eur. J. Microbiol. Infect. Dis. 9: 588-594], the spacer of the genes encoding the transfer RNAs [Maes N. et al. (1997) J. Clin. Microbiol. 35: 2477-2481], the hsp60 gene coding for the stress protein 60 [Goh SH et al. (1996) J. Clin. Microbiol. 34: 818-823; Goh SH (1997) J. Clin. Microbiol.
  • Hybridization of oligonucleotides is the technique generally proposed for targeting these identification regions. Detection of the naked gene is limited to bacteria of the species Staphylococcus aureus [Brakstad OG (1992) J. Clin. Microbiol. 30: 1654-1660] and a chromosomal fragment has been reported for the identification of bacteria of the species Staphylococcus epidermidis [Martineau F (1996) J. Clin. Microbiol. 34: 2888-2893].
  • the present invention relates to nucleic acid sequences specific for the genus or for each species of the genus Staphylococcus, the nucleotide sequence of which is taken from the rpoB gene of said bacteria.
  • RNA polymerases are divided into two groups according to their origin, one consisting of the RNA- or DNA-dependent RNA polymerases, and the other consisting of the DNA-dependent RNA polymerases of eukaryotic or prokaryotic origin (archaebacteria and eubacteria).
  • the eubacterial DNA-dependent RNA polymerases are characterized by a simple and conserved multimeric constitution noted "core enzyme", represented by ⁇ ', or "holoenzyme” represented by cc ⁇ ' ⁇ [Yura and Ishihama, Ann. Rev. Broom. (1979) 13: 59-97].
  • the genes which code for the different ⁇ ' ⁇ subunits of DNA-dependent RNA polymerase in eubacteria are classified into different groups comprising the genes coding for proteins constituting the sub - ribosomal units or for enzymes involved in the replication and repair of the genome [Yura and Yshihma, Ann. Rev. Broom. (1979) 13: 59-97].
  • Some authors have shown that the sequences of the rpoB and rpoC genes can be used to construct phylogenetic trees [Rowland et al. Biochem. Soc. Trans. (1992) 21: 40S] making it possible to separate the different branches and sub-branches among the kingdoms of the living.
  • nucleic acid extracted from bacteria means either the total nucleic acid, or genomic DNA, or the messenger RNAs, or even the DNA obtained from the reverse transcription of the messenger RNAs;
  • nucleotide fragment or an “oligonucleotide” are two synonymous terms designating a sequence of nucleotide motifs characterized by an informational sequence of natural (or possibly modified) nucleic acids and capable of hybridizing, like natural nucleic acids, with a complementary or substantially complementary nucleotide fragment, under predetermined conditions of strict stringency.
  • the chain may contain nucleotide motifs with a structure different from that of natural nucleic acids.
  • a nucleotide fragment (or oligonucleotide) can contain, for example, up to 100 nucleotide motifs.
  • a nucleotide motif is derived from a monomer which can be a natural nucleotide of nucleic acid, the constituent elements of which are a sugar, a phosphate group and a nitrogenous base chosen from adenine (A), guanine (G), Puracil (U), cytosine ( C), thymine (T); or the monomer is a nucleotide modified in at least one of the three preceding constituent elements; by way of example, the modification can take place either at the level of the bases, with modified bases such as inosine, which can be hydrated with any base A, T, U, C or G, methyl-5-deoxycytidine , deoxyuridine, dimethylamino-5-deoxyuridine or any other modified base capable of hybridization, either at
  • hybridization means the process during which, under appropriate conditions, two nucleotide fragments having sufficiently complementary sequences are capable of being combined by stable and specific hydrogen bonds, to form a double strand.
  • the hybridization conditions are determined by "stringency", that is to say the rigor of the operating conditions. Hybridization is all the more specific as it is performed at higher stringency.
  • the stringency is a function in particular of the base composition of a probe / target duplex, as well as by the degree of mismatch between two nucleic acids.
  • the stringency can also be a function of the parameters of the hybridization reaction, such as the concentration and the type of ionic species present in the hybridization solution, the nature and the concentration of denaturing agents and / or the temperature of hybridization.
  • the stringency of the conditions under which a hybridization reaction must be carried out depends in particular on the probes used. All these data are well known and the appropriate conditions can possibly be determined in each case by routine experiments. In general, depending on the length of the probes used, the temperature for the hybridization reaction is between about 20 and 65 ° C, in particular between 35 and 65 ° C in saline at a concentration of about 0.8 to 1 M.
  • a “probe” is a nucleotide fragment having a specificity of hybridization under determined conditions to form a hybridization complex with a nucleic acid having, in the present case, a nucleotide sequence included either in a messenger RNA, or in a DNA obtained by reverse transcription of said messenger RNA, transcription product; a probe can be used for diagnostic purposes (in particular capture or detection probes) or for therapy purposes, - a “capture probe” is a probe immobilized or immobilizable on a solid support by any suitable means, for example by covalence, by adsorption, or by direct synthesis on a solid. Examples of carriers include microtiter plates and DNA chips,
  • a “detection probe” is a probe marked by means of a marker agent chosen for example from radioactive isotopes, enzymes, in particular enzymes capable of acting on a chromogenic, fluorigenic or luminescent substrate (in particular a peroxidase or alkaline phosphatase), chromophoric chemical compounds, chromogenic compounds, fluorigenic or luminescent, analogs of nucleotide bases and ligands such as biotin,
  • a marker agent chosen for example from radioactive isotopes, enzymes, in particular enzymes capable of acting on a chromogenic, fluorigenic or luminescent substrate (in particular a peroxidase or alkaline phosphatase), chromophoric chemical compounds, chromogenic compounds, fluorigenic or luminescent, analogs of nucleotide bases and ligands such as biotin,
  • a "species probe” is a probe allowing the specific identification of the species of a bacterium
  • a "genus probe” is a probe allowing the specific identification of the genus of a bacterium
  • a “primer” is a probe comprising for example 10 to 100 nucleotide units and having a specificity of hybridization under conditions determined for the enzymatic amplification reactions
  • amplification reaction means an enzymatic polymerization reaction , for example in an amplification technique such as PCR, initiated by priming oligonucleotides and using DNA polymerase.
  • “sequencing reaction” means obtaining the sequence of a nucleic acid fragment or a complete gene by an abortive polymerization process from oligonucleotide primers and using said dideoxynucleotides (Sanger F, Coulson AR (1975), J. Mol. Biol. 94: 441) or by multiple hybridizations with multiple probes fixed on solid support as used in DNA chips for example.
  • the inventors have determined the complete sequences of the rpoB genes of four species of bacteria of the genus Staphylococcus. These four species have been chosen by the inventors as representing the four main genetic groups determined on the basis of the study of the 16S gene in bacteria of the genus Staphylococcus, namely the phylogenetically most divergent species among all the species currently described. in this genus, so that the alignment of the rpoB sequences obtained in these four species can probably phylogenetically frame all of the rpoB sequences of all the species of this bacterial genus.
  • the inventors have highlighted the consensus and specific sequences SEQ.ID. n ° 7 to 10 described in the sequence listing at the end of the description. The inventors determined said sequences SEQ.ID. n ° 7 to 10 as being not only consensual between all bacteria of the genus
  • Staphylococcus but also specific to the family of bacteria of the genus Staphylococcus, except Staphylococcus schleiferi with regard to the sequence SEQ.ID. # 8.
  • sequences are present in the rpoB genes of any bacteria of the genus Staphylococcus and specific to bacteria of the genus Staphylococcus which can be used as a genes probe to detect any bacterium of the genus Staphylococcus except Staphylococcus schleiferi as regards the sequence SEQ.ID. # 8.
  • nucleotide N mentioned in the sequence listing at the end of the description can represent inosine or an equimolar mixture of 4 different nucleotides chosen from A, T, C and Gt, or A, U, C respectively and G, insofar as, as mentioned in the definitions, an oligonucleotide or a nucleic acid fragment according to the invention may be in the form of an oxyribonucleic acid (DNA) or a ribonucleic acid (RNA) for which, in this case, T is replaced by U.
  • DNA oxyribonucleic acid
  • RNA ribonucleic acid
  • N represents a said equimolar mixture of nucleotides at a given position
  • the nucleotide at said given position indifferently represents A, T, C or G (or respectively the where appropriate A, U, C or G) and that the oligonucleotide according to the invention consists more precisely of an equimolar mixture of 4 groups of oligonucleotides in each of which groups N has a different meaning at said position given and represented each of the 4 bases A, T, C or G (or A, U, C or G respectively).
  • variable nucleotides are found in the complementary target sequences according to the species of the bacteria considered, but all the other nucleotides are conserved in all the species of bacteria of the genus Staphylococcus. Because "N” represents inosine which can hybridize with any base or an equimolar mixture of the 4 bases A, T, C, G, the sequences SEQ.ID. No. 7 and 10 can hybridize with the complementary sequence included in the rpoB gene of all bacteria of the genus Staphylococcus.
  • consensus sequences SEQ.ID. n ° 9 and SEQ ID n ° 10 surround hypervariable sequences whose sequence is specific for each species of bacteria of the genus Staphylococcus. Sequences framed by SEQ.ID. No. 9 and 10 can therefore be used as a species probe for bacteria of the genus Staphylococcus.
  • sequences SEQ.ID. Nos. 9 and 10 were determined to frame a fragment of the rpoB gene comprising an area whose variable length is approximately 500 bp and constitutes the shortest specific sequence for each species of the bacterium of the genus Staphylococcus.
  • the inventors were thus able to highlight species probes for each of the 29 species of bacteria of the genus Staphylococcus studied corresponding to the sequences SEQ.ID. n ° 11 to 39 framed by the SEQ.ID consensus sequences. n ° 9 and 10.
  • the consensus sequences SEQ.ID. No. 7 to 10 identified according to the present invention can be used as an amplification primer or a sequencing reaction in methods for detecting bacteria of the genus Staphylococcus by molecular identification.
  • the SEQ.ID. n ° 7 to 10 therefore make it possible not only to prepare genus probes for bacteria of the genus Staphylococcus but also to detect and identify the species of said bacterium by amplification and sequencing using said sequences as primers. More specifically, the present invention provides a method of detection by identification of a bacterium from one of the species of the genus Staphylococcus, characterized in that:
  • the rpoB gene of said bacteria or a fragment of said rpoB gene of said bacteria comprising a nucleotide sequence chosen from one of the sequences SEQ.ID Nos. 11 to 29 and 31 to 39, the reverse sequences and the complementary sequences, or
  • a fragment of said rpoB gene of said bacterium consisting of the nucleotide sequence SEQ.ID No. 30, the reverse sequence and the complementary sequence, or - an oligonucleotide comprising a sequence of at least 12 consecutive nucleotide motifs, included in the one of the sequences SEQ.ID. n ° 7 to 10, in which N represents a nucleotide chosen from inosine or a equimolar mixture of 4 different nucleotides chosen from A, T, C or G, the reverse sequences and the complementary sequences.
  • Said oligonucleotides preferably comprise from 12 to 35 nucleotide units, and more preferably, said oligonucleotides consist of the sequences SEQ.ID. n ° 7 to 10, the reverse sequences and the complementary sequences.
  • the amplification primers comprising said oligonucleotides comprising a sequence of at least 12 nucleotide motifs included in at least two sequences drawn from the sequences SEQ.ID are brought into contact.
  • n ° 7 to 10 reverse sequences and complementary sequences, with a sample containing or likely to contain nucleic acids of at least one such bacterium of the genus Staphylococcus, with:
  • an oligonucleotide chosen from oligonucleotides comprising a sequence included in one of the sequences SEQ.ID. No. 7 or 9 or the complementary sequences, preferably an oligonucleotide consisting of the said complete sequences, and
  • an oligonucleotide comprising a sequence included in one of the sequences SEQ.ID. n ° 10 or 8 or respectively a sequence complementary, preferably an oligonucleotide consisting of said complete sequences.
  • an amplification of nucleic acids is carried out by enzymatic polymerization reaction and the appearance or absence of an amplification product is determined, and the presence of said bacteria in the sample is thus determined if a product d amplification appeared.
  • an oligonucleotide of sequence SEQ.ID # 7 or 9 or a complementary sequence is used as primer 5 "and an oligonucleotide of sequence SEQ.ID.n ° 10 or respectively a complementary sequence.
  • a bacterium of the genus Staphylococcus chosen from the species Staphylococcus xylosus, Staphylococcus warneri, Staphylococcus simulans, Staphylococcus sciuri, Staphylococcus schleiferi, Staphylococcus saphrophyticus, Staphylococcus saccharolyticus, Staphylococcus pulveris, Staphylococcus muscae, Staphylococcus lugdunensis, Staphylococcus lentis, Staphylococcus kloosii, Staphylococcus intermedius, Staphylococcus hyicus, Staphylococcus hominis, Staphylococcus haemolyticus, Staphylococcus gallinarum, Staphylococcus felis Staphylococcus
  • a sample containing or likely to contain nucleic acids from at least one such bacterium is brought into contact with at least one species probe consisting of a said gene fragment comprising a sequence included in one of the sequences SEQ .ID. Nos. 11 to 39, the reverse sequences and complementary sequences, preferably an oligonucleotide consisting of one of said sequences SEQ.ID. n ° 11 to 39, or an oligonucleotide of reverse or complementary sequence, and
  • the method comprises the steps in which, in a sample containing or likely to contain nucleic acids from at least one said bacterium: a) a sequencing reaction of a fragment of the amplified rpoB gene of a said given bacterium is carried out using the nucleotide primers consisting of oligonucleotides comprising a sequence included in the sequences SEQ.ID.
  • step a) the steps are carried out comprising:
  • 2- a sequencing reaction of the amplifiers determined in step 1 with the primers 5 'and 3' consisting of oligonucleotides comprising the sequences SEQ.ID. n ° 9 and respectively SEQ.ID. # 10, preferably consisting of said sequences SEQ.ID. Nos. 7 and 10 or their complementary sequences, preferably consisting of the said sequences SEQ.ID. n ° 9 and 10 or their complementary sequences, and
  • step b) the sequences obtained are compared with one of the sequences SEQ.ID respectively. n ° 1 1 to 39 or their complementary sequences.
  • Another object of the present invention is a rpoB gene or gene fragment of a bacterium of the genus Staphylococcus, characterized in that it comprises a sequence as described in the sequences SEQ.ID. n ° 11 to 29 and 30 to
  • Another subject of the present invention is the complete sequence of the rpoB gene of the bacteria Staphylococcus saccharolyticus, Staphylococcus lugdunensis, Staphylococcus caprae, and Staphylococcus intermedius as described in the sequences SEQ.ID. n ° 3 to 6, as mentioned previously, these fragments of rpoB genes and complete genes are useful in particular for a method according to the invention.
  • the complete sequence of the rpoB gene can be used to identify the bacterium not only by studying its primary sequence, but also, by studying the secondary and tertiary structures of messenger RNA originating from the transcription of the complete sequence d DNA.
  • Another object of the present invention is a so-called rpoB gene fragment or oligonucleotide chosen from oligonucleotides having a sequence consisting of sequences SEQ ID No. 1 1 to 39 and from oligonucleotides of reverse sequences and complementary sequences as defined above above.
  • Another object of the present invention is an oligonucleotide comprising a sequence of at least 12, preferably 12 to 35, consecutive nucleotide motifs included in one of the sequences SEQ.ID.
  • N represents a nucleotide chosen from inosine and an equimolar mixture of 4 different nucleotides chosen from A, T, C or G, and the oligonucleotides of reverse sequences and complementary sequences, preferably consisting of SEQ.ID sequences n ° 7 and 10 and the reverse sequences and complementary sequences in which N represents inosine.
  • the sequences SEQ ID No. 7 to 39 can be prepared by chemical synthesis using the techniques well known to those skilled in the art and described for example in the article by Itakura K. et al. [(1984) Annu. Rev. Biochem. 53: 323].
  • a first application of an oligonucleotide according to the invention is its use as a probe for the detection, in a biological sample, of bacteria of one of the species of the genus Staphylococcus which comprises a nucleotide sequence of at least 12 consecutive nucleotide motifs included in one of the sequences SEQ ID No. 7 to 39, and their reverse or complementary sequences.
  • a probe comprising the sequences SEQ.ID. No. 7 to 10 will be used as a gender probe and a probe comprising one of the sequences SEQ.ID. n ° 1 1 to 39 will be used as a species probe.
  • the probes according to the invention can be used, for diagnostic purposes, as mentioned above, by determining the formation or absence of formation of a hybridization complex between the probe and a target nucleic acid in a sample, according to all the known hybridization techniques and in particular the point deposition techniques on a filter, called "DOT-BLOT” [Maniatis et al. (1982) Molecular Cloning, Cold Spring Harbor], so-called “SOUTHERN BLOT” DNA transfer techniques [Southern EM, J. Mol. Biol.
  • the nucleic acid to be detected can be DNA or RNA (the first obtained after amplification by PCR).
  • the target nucleic acid can be obtained by extraction, according to known methods, from the nucleic acids of a sample to be examined.
  • the denaturation of a double-stranded nucleic acid can be carried out by known methods of chemical, physical or enzymatic denaturation, and in particular by heating to an appropriate temperature, above 80 ° C.
  • a probe of the invention called the capture probe is immobilized on a solid support, and another probe of the invention, called the detection, is labeled with a labeling agent.
  • a labeling agent is labeled with support and of labeling agent.
  • a species probe is immobilized on a solid support, and another species probe is labeled with a labeling agent.
  • Another application of an oligonucleotide of the invention is its use as a nucleotide primer comprising a single-stranded oligonucleotide chosen from oligonucleotides having a sequence of at least 12 nucleotide motifs included in one of the sequences SEQ ID Nos. 7 to 39, which can be used in the synthesis of a nucleic acid in the presence of a polymerase by a process known per se, in particular in amplification methods using such a synthesis in the presence of a polymerase (PCR, RT-PCR, etc. ).
  • a primer of the invention can be used for the specific reverse transcription of a messenger RNA sequence of bacteria of a species of the genus Staphylococcus to obtain a corresponding complementary DNA sequence.
  • a reverse transcription can constitute the first stage of the RT-PCR technique, the next stage being the amplification by PCR of the complementary DNA obtained.
  • the primers of the invention can also be used for the specific amplification by polymerase chain reaction of the total DNA sequence of the rpoB gene of a species of the genus Staphylococcus.
  • said primer comprising an oligonucleotide of the invention further comprises the sense or antisense sequence of a promoter recognized by an RNA polymerase (promoters T7, T3, SP6 for example [Studier FW, BA Moffatt (1986) J. Mol. Biol. 189: 1 13]: such primers are usable in nucleic acid amplification methods involving a transcription step, such as, for example, the NASBA or 3SR techniques [Van Gemen B. et al. Abstract MA 1091, 7 th International Conference on AIDS (1991) Florence, Italy].
  • nucleotide primer comprising a single-stranded oligonucleotide chosen from oligonucleotides having a sequence comprising one of the sequences SEQ ID No. 11 to 29 and 31 to 39, or preferably consisting of one of SEQ.ID sequences n ° 11 to 39 which can be used for the total or partial sequencing of the rpoB gene of any strain of a species of the genus Staphylococcus.
  • the sequencing of the partial or complete rpoB gene in any bacteria of the genus Staphylococcus allows the identification of any Staphylococcus bacteria by bioinformatic analysis of this sequence and the recognition of new species of unknown Staphylococcus bacteria.
  • the sequences SEQ ID No. 7 to SEQ ID No. 10 are used, in which N is inosine preferably, the sequences SEQ ID No. 7 and SEQ .ID. # 10.
  • the present invention also relates to a diagnostic kit useful in a method according to the invention comprising at least one said gene fragment of said oligonucleotide consisting of the sequences SEQ.ID. No. 7 to 39 and the reverse sequences and complementary sequences or a said oligonucleotide comprising a sequence included in one of the sequences SEQ.ID. n ° 7 to 10, and / or at least one said rpoB gene fragment of a said bacterium comprising the sequences SEQ.ID. nos. 11 to 39, and the oligonucleotides and gene fragments of reverse sequences and complementary sequences, as defined above.
  • reverse sequences and complementary sequences means the following sequences:
  • a final object of the invention is a gene therapy probe for treating infections caused by a strain belonging to a species. of the genus Staphylococcus, said probe comprising an oligonucleotide as defined above.
  • This gene therapy probe capable of hybridizing to messenger RNA and / or to the genomic DNA of said bacteria, can block the phenomena of translation and / or transcription and / or replication.
  • the principle of gene therapy methods is known and is based in particular on the use of a probe corresponding to an antisense strand: the formation of a hybrid between the probe and the sense strand is capable of disturbing at least one stages of deciphering genetic information.
  • Gene therapy probes can therefore be used as antibacterial drugs, making it possible to fight against infections caused by bacteria of species of the genus Staphylococcus.
  • FIG. 1 represents the visualization of the amplification products by staining with ethidium bromide after electrophoresis on an agarose gel obtained in Example 3.
  • Example 1 Sequence of the rpoB gene of four species of the genus Staphylococcus: Staphylococcus saccharolyticus, Staphylococcus lugdunensis, Staphylococcus caprae and Staphylococcus intermedius.
  • the complete sequence of the rpoB gene of bacteria of the species Staphylococcus saccharolyticus, Staphylococcus lugdunensis, Staphylococcus caprae and Staphylococcus intermedius was determined by enzymatic amplification and direct automatic sequencing using primers consensus between the sequences of the rpoB gene in Staphylococcus aureus (GenBank n ° access X64172) Bacillus subtillis (GenBank access number L43593). The latter bacterial species was chosen as the Gram-positive species of low guanosine plus cytosine content closest to the species of the genus Staphylococcus (phylogenetic proximity based on the comparison of the 16S rDNA gene sequences).
  • Several potential consensus primers have been investigated to obtain a fragment capable of leading to the complete sequence of rpoB genes by successive extensions from a series of specific primers. These consensus primers have the following sequences:
  • the amplifications were carried out under a final volume of 50 ⁇ l comprising 2.5 ⁇ 10 ⁇ 2 2 U of Taq polymerase, 1 X of Taq buffer and 1.8 mM of MgCl 2 , 200 ⁇ M of dATP, dTTP, dGTP, dCTP and 0.2 ⁇ M of each primer They were carried out according to the following program: 35 cycles comprising a denaturation step at 94 ° C for 30 seconds, hybridization of the primers at 52 ° C for 30 seconds and extension at 72 ° C for 60 seconds
  • the amplification products were purified on a column and then sequenced using the oligonucleotide sequencing primers presented in the following table: 0
  • the sequencing reactions were carried out using the reagents of the ABI Prism dRhodamine Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (Perkin Elmer Applied Biosystems) kit according to the supplier's recommendations according to the following program: 30 cycles including a denaturation step at 94 ° C for 10 sec, a step of hybridization of the primer at 50 ° C for 10 sec. and an extension step at 60 ° C for 2 minutes.
  • the sequencing products were separated by electrophoresis on a polyacrylamide gel on a 377 DNA Sequencer (Perkin) and analyzed to form 0 consensus sequences by the Sequence Assembler software (Applied Biosystems). This approach allowed us to determine the complete sequence of the rpoB gene in four species of the genus Staphylococcus:
  • SEQ ID N ° 3 Sequence of the rpoB gene of Staphylococcus 5 saccharolyticus. This sequence measures 3,791 base pairs and has a cytosine plus guanosine content of 36.8% and is deposited in GenBank under the number GenBank accession AF325871.
  • SEQ ID N ° 4 Sequence of the rapB gene of Staphylococcus lugdunensis This sequence measures 3,855 base pairs and has a cytosine plus guanosine content of 36.4% is deposited in GenBank under the number GenBank accession AF325870.
  • SEQ ID N ° 5 Sequence of the rpoB gene of Staphylococcus caprae This sequence measures 3,698 base pairs and has a cytosine plus guanosine content of 37.4% is deposited in GenBank under the number GenBank accession AF325868.
  • SEQ ID N ° 6 Sequence of the rpoB gene of Staphylococcus intermedius This sequence measures 3.851 base pairs and has a cytosine plus guanosine content of 39.2%, it is deposited in GenBank under the number GenBank accession AF325869).
  • This sequence measures 3.852 base pairs and has a cytosine plus guanosine content of 39.2%, it is deposited in GenBank under the number GenBank accession AF325869.
  • Example 2 Partial sequencing of the rpoB gene of 26 species of the genus Staphylococcus.
  • the alignment of the rpoB sequence determined in the bacteria of the species Staphylococcus aureus, Staphylococcus lugdunensis (GenBank accession AF325870), Staphylococcus intermedius (GenBank accession AF325869), Staphylococcus saccharolyticus (GenBank accession AF325871) and Staphyl3bocankus accession) determine the consensus sequences of the following oligonucleotides positioned respectively in positions 2491-2511 and 3554-3573 of the rpoB gene in Staphylococcus aureus:
  • SEQ ID No. 8 5 '- CCGTCCCAAGTCATGAAAC - 3' theoretically determining the amplification of a fragment of 1,063 base pairs in any species of the genus Staphylococcus.
  • SEQ.ID. No. 8 is used as a 3 ′ primer and therefore represents the reverse sequence complementary to the direct strand represented in the sequences SEQ.ID. n ° 3 to 6 in position 3554-3573 in Staphylococcus aureus.
  • the inventors determined the position of these two primers SEQ.ID. n ° 7 and SEQ.ID. n ° 8, in order to respect the following criteria:
  • the inventors therefore by trial and error determined a new oligonucleotide of sequence SEQ ID No. 10 positioned at position 3241-3261 in Staphylococcus aureus, which combined with the oligonucleotide SEQ ID No. 7 in a PCR amplification reaction, has effectively made it possible to '' obtain an amplicon of the rpoB gene with a size of 771 base pairs (size for the species Staphylococcus aureus) in the 29 species of the genus Staphylococcus tested by the inventors.
  • SEQ ID n ° 10 5'- GCIACITG ITCCATACCTGT - 3 'SEQ.ID. # 10 is used as a 3 'primer. This is why it corresponds to the reverse sequence complementary to the sequences of the direct strand represented on the sequences SEQ.ID. n ° 3 to 6.
  • This last primer was determined to respect the constraints of a sequencing primer, that is to say of a size greater than 15 mothers, not hybridizing with the second primer used for sequencing, and framing a zone d generally about 500 base pairs whose sequence is specific for each species in the genus Staphylococcus.
  • the inventors were therefore finally able to determine the partial sequence of the rpoB gene in 29 species of the genus Staphylococcus presented below (SEQ ID No. 11 to SEQ ID No. 39).
  • the fragment of the rpoB gene was amplified by the PCR technique using 35 amplification cycles each comprising a denaturation phase of 94 ° C for 10 seconds, a phase of hybridization of the primers SEQ ID No. 7 and 8 or SEQ ID n ° 7 and 10 at 52 ° C for 20 seconds and an extension phase at 72 ° C for 60 seconds.
  • the amplification product is visualized after coloring with ethidium bromide.
  • the bacteria representing these 29 species of the genus Staphylococcus are as follows:
  • the fragments in general about 500 base pairs of the rpoB gene of bacteria of species of the genus Staphylococcus, the sequence of which is specific for each species of this genus and therefore allowing the molecular identification of the bacteria of the 29 species tested are: SEQ ID N ° 11: Partial sequence of the rpoB gene in Staphylococcus xylosus, measuring 518 base pairs:
  • SEQ ID N ° 12 Partial sequence of the rpoB Staphylococcus warneri gene measuring 507 base pairs:
  • SEQ ID NO 13 Partial sequence of gene rpoB Staphylococcus simulans, measuring 518 base pairs: 5'TTCAGGGTTCATCAATGGTACTGCTTGACGTTGCATGTTCGCACCCATTAA CGCACGGTTAGAGTCATCGTTTTCTAAGAATGGGATACATGCTGTCGCTGC AGATACAACTTGTTTAGGAGAAACGTCCATATAGTCCATTTTCTCTCTATCCA TAGTTGTGTTGTTACCACGGAAACGACAAACGATTTCTTCGTCTAAGAAACG ACCTTCGTCATCTAAACGTGAGTTCGCTTGCGCACCGCAACAACATAGCTGTCTTCT TCGTCTGCAGTAAGGTAATCGATTTGATCTGTTACCGCATTTTTCTCATGGT CAACTTTACGATATGGTGTTTCAATGAAACCAAATTCATTAACACGCGCATAA CTTGATAATGAGTTGATTAAACCGATGTTCGGACCCTGGTGTCTCGATTG GACACATACGGCCATAGTGAGAGTAATGCACGTCACGT
  • SEQ ID N ° 14 Partial sequence of the rpoB gene in Staphylococcus sciuri, measuring 507 base pairs:
  • SEQ ID NO 15 Partial sequence of the rpoB gene in Staphylococcus schleiferi, measuring 518 base pairs: 5TTCTGGGTTTAACAATGGTACTGCTTGACGTTGCATGTTCGCACCCATCAA TGCACGGTTAGAGTCATCGTTTTCTAAAAACGGAATACATGCTGTCGCAGCT GAAACAACTTGTTTAGGCGATACGTCCATGTAGTCCATTTTTTCTTTAGCCAT AGTTGTGTTGTTACCACGGAAACGACAAACGATTTCGTCATCGATAAAACGT CCGTTTTCATCAAGTCTTGAGTTCGCTTGGGCAACAACATAACTGTCTTCTT CATCAGCAGTAAGGTAATCAATACGGTCTGTAATTGTGTTTGTTTCAAGGTC TACTTTTCTGTATGGAGTTTCAATGAAACCAAATTCATTCACACGTGCATAAC TTGAAAGTGAGTTGATCAAACCAATGTTTGGACCCTCTGGTGTCTCGATTGG ACACATACGGCCATAGTGAGAATAGTGTACG
  • SEQ ID N ° 17 Partial sequence of the rpoB gene in Staphylococcus saccharolyticus, measuring 556 base pairs:
  • SEQ ID NO 18 Partial sequence of the rpoB gene in Staphylococcus pulveris, measuring 508 base pairs: 5TTCAGGATTCATTAAAGGCACTGCTTGACGTTGCATGTTTGCACCCATAAG CGCACGGTTAGAGTCATCGTTTTCTAAGAAAGGAATACATGCTGTCGCAGC AGAAACAACCTGTTTAGGTGATACATCCATGTAATCCATACGTTCTTTAGGTT TCGTAGTATTATCCCCACGGAAACGACAAAGTACTTCATCATCATCAACGAATTT ACCTGTTTCATCAAGTACTGAGTTTGCTTGCGCTACAACATAGCTGTCTTCT TCGTCAGCTGTTAAATAGTCAATTCTGTCAGTAACTTGGTTTGTTTCGATATT AACCTTACGATAAGGCGTTTCAATAAAACCAAATTCATTAACTCTCGCATAAC TTGATAAAGAGTTAATTAAACCAAATTCATTAACTCTCGCATAAC TTGATAAAGAGTTAATTAAACCAAATGTTTGGTCCCTCAGGTTTGTTTCG
  • SEQ ID NO 19 Partial sequence of the rpoB gene in Staphylococcus muscae, measuring 518 base pairs: 5TTCAGGATTCAACAATGGCACCGCTTGACGTTGCATGTTCGCACCCATTAA GGCACGGTTAGAGTCATCGTTTTCTAAGAATGGAATACATGCTGTCGCAGC AGAAACAACTTGCTTCGGCGATACGTCCATGTAGTCCATTTTCTCTTTTGCC ATTGTTGTGTTGTTACCACGGAAACGACATACAATCTCATCATCAATAAAGC GACCATTTTCATCTAAACGTGAGTTCGCTTGTGCAACCACATAACTATCTTCT TCATCAGCAGTTAAATAGTCGATTTGATCAGTGATTGTGTTCGTCTCGATAT CAACTTTACGATATGGTGTTTCAATGAAACCAAATTCATTAACACGTGCATAA CTAGATAGTGAGTTGATCAAACCAATGTTCAGTCCCTCTGGTGTCTCAATCG GACACATACGACCATAGTGAGAGTAGTGAAACCAATGTTCAGTC
  • SEQ ID NO 20 Partial sequence of the rpoB gene in Staphylococcus lugdunensis, measuring 556 base pairs: 5TAACCCATTAGCAGAATTAACACACAAACGTCGTTTATCTGCGTTAGGACC TGGTGGTTTAACACGTGAACGTGCACAAATGGAAGTTCGTGACGTGCATTA TTCTCACTATGGCCGTATGTGTCCGATTGAAACACCAGAGGGTCCAAACATT GGTTTGATTAACTCATTATCTAGTTATGCGCGTGTCAACGAGTTTGGCTTTAT TGAAACGCCTTATCGTAAAGTAGATATTGATACAAATGCAATCACAGATCAA ATTGACTACTTAACTGCTGATGAAGAAGACAGTTATGTCGTTGCACAAGCGA ACTCTCGCCTTGATGAAAATGGTCGTTTCTTAGATGATGAAGTAGTATGCCG TTTCCGCGGTAATAATACTGTTATGGCTAAAGAAAATGGACTACATGGAT GTATCCTAAACAAGTTGG
  • SEQ ID N ° 21 Partial sequence of the rpoB gene in Staphylococcus lentus, measuring 507 base pairs:
  • SEQ ID NO 22 Partial sequence of the rpoB gene in Staphylococcus kloosii, measuring 505 base pairs: 5TTCACGGTTCATCAATGGTACCGCTTGACGTTGCATGTTCGCACCCATTAA GGCACGGTTAGAGTCATCGTTTTCTAAGAAAGGAATACATGCTGTCGCAGC CGAAACAACTTGTTTTGGTGATACGTCCATGTAGTCCATTTTTTCTTTCGCCA TAACTGTGTTGTTACCACGGAAACGACAAACTACTTCATCATCTAAGAAACG ACCATTTTCATCTAATTTAGAGTTAGCTTGCGCTACCACATAGCTATCTTCTT CATCAGCTGTTAAATAGTCAATTTGATCTGTGATTGAATTAGTTTCTAAATCA ACTTTACGGTATGGTGTTTCGATAAAGCCAAATTCATTAACACGTGCATAAC TTGATAATGAGTTGATAAGTCCAATGTTTGGACCCTCTGGCGTTTCGATTGG ACACATACGACCATAGTGAGAATAGTAACGTCAC
  • SEQ ID N ° 23 Partial sequence of the rpoB gene in Staphylococcus intermedius, measuring 556 base pairs:
  • SEQ ID N ° 24 Partial sequence of the rpoB gene in Staphylococcus hyicus, measuring 518 base pairs:
  • SEQ ID N ° 25 Partial sequence of the rpoB gene in Staphylococcus hominis, measuring 518 base pairs:
  • SEQ ID N ° 26 Partial sequence of the rpoB gene in Staphylococcus haemolyticus, measuring 507 base pairs:
  • SEQ ID NO 27 Partial sequence of the rpoB gene in Staphylococcus gallinarum, measuring 507 base pairs: 5TTCAGGATTCATCAAAGGTACAGCTTGACGTTGCATGTTCGCACCCATCAA TGCACGGTTAGAGTCATCGTTTTCTAAGAAAGGAATACATGCTGTCGCAGCA GATACAACCTGTTTAGGTGATACATCCATGTAGTCCATTTTTTCTTTTGCCAT TACAGTGTTGTTACCACGGAAACGACAAACGACTTCATCTTCTACGAAACGA CCATTTTCATCTAATACAGAGTTTGCTTGTGCTACTACATAACTGTCTTCTTC ATCAGCTGTTAAGTAGTCAATTTGATCTGTAATAGATTGTGTTTCAATATCAA CTTTACGATATGGTGTTTCAATGAAACCAAATTCATTTACACGCGCATAACTT GATAATGAGTTGATAAGTCCGATGTTTGGACCCTCAGGTGTTTCGATTGGAC ACATACGGCCATAGTGAATAGTGAATAGTGAACGTCACGT
  • SEQ ID NO 30 Partial sequence of the rpoB gene in Staphylococcus epidermidis, measuring 518 base pairs: 5TTCAGGATTCATTAAAGGCACCGCTTGACGTTGCATGTTTGCTCCCATTAA CGCACGGTTAGAGTCGTCATTTTCTAAGAATGGAATACATGCTGTTGCTGCT GAAACAACTTGTTTTGGTGATACGTCCATGTAATCCATTTTTTCTTTAGCCAT AACAGTGTTATTACCACGGAAACGACAAACAACTTCATCATCTAAGAAACGA CCATTCATCAAGTCTAGAATTAGCCTGTGCAACAACGTAGCTATCCTCTT CATCAGCTGTCAAATAATCTATTTGATCAGTGATTGAGTTTGTATCTAAATCC ACTTTACGATATGGCGTTTCAATAAAACCAAATTCATTCACTCTAGCATAACT TGACAATGAGTTTATTAAACCAATATTAGGACCCTCAGGTGTTTCAATTGGA CACATACGTGGCATTCCATTCACTCTAGCATAACT TGACAATGAGT
  • SEQ ID NO 31 Partial sequence of the rpoB gene in Staphylococcus cohnii, measuring 507 base pairs: 5'TTCTGGATTCATCAATGGGACTGCTTGACGTTGCATGTTCGCACCCATTAA TGCACGGTTAGAGTCATCGTTTTCTAAGAATGGAATACATGCTGTTGCTGCA GAAACAACCTGTTTAGGAGATACATCCATGTAATCCATTTTTTCTTTTGCCAT AACTGTGTTATTACCACGGAAACGACAAACAACTTCATCATCTAAGAAGCGA CCATTTTCATCTAACTTAGAATTTGCTTGTGCTACTACATAGCTATCTTCTTC GTCAGCTGTTAAATAATCAATTTGATCTGTGATACTATTCGTTTCAAGATCTA CTTTACGATATGGCGTTTCAATGAAACCAAATTCATTTACACGTGCATAACTT GATAATGAGTTAATCAAACCAATGTTTGGTCCCTCTGGTGTTTCGATTGGACACACAC
  • SEQ ID N ° 32 Partial sequence of the rpoB gene in Staphylococcus chromogenes, measuring 507 base pairs:
  • SEQ ID N ° 34 Partial sequence of the rpoB gene in Staphylococcus capitis, measuring 518 base pairs:
  • SEQ ID N ° 35 Partial sequence of the rpoB gene in Staphylococcus auricularis, measuring 507 base pairs:
  • SEQ ID NO 36 Partial sequence of the rpoB gene in Staphylococcus aureus, measuring 518 base pairs: 5TTCTGGATTCATCAAAGGCACTGCTTGACGTTGCATGTTCGCACCCATCAA TGCACGGTTTGAGTCATCATTTTCTAAGAATGGAATACATGCTGTCGCTGCT GAAACAACTTGCTTCGGCGATACATCCATATAATCCATTTTTTCTTTAGCCAT AACTGTGTTGTTACCACGGAAACGACATACAACTTCATCATCATCCATGAAACGA CCATTTTCATCTAATTTAGAGTTTGCTTGTGCTACAACATAGCTATCTTCTTC GTCAGCTGTTAAATAGTCAATTTGATCAGTGATAGCATGTGTATCTAAATCAA CTTTACGATATGGTGTTTCAATAAAGCCGAATTCATTTACACGTGCATAACTT GATAATGAGTTAATCAATCCAATGTTTGGTCCCTCAGGTGTTTCAATTGGAC ACATACGGCCATAGTGAGTAGTGAACGTCACGTACTTCCAT
  • SEQ ID N ° 38 Partial sequence of the rpoB gene in Staphylococcus arlettae, measuring 518 base pairs:
  • SEQ ID N ° 39 Partial sequence of the rpoB gene in Staphylococcus caprae, measuring 556 base pairs:
  • Example 3 Blind identification of a collection of 20 bacterial strains comprising 10 strains of bacteria belonging to the genus Staphylococcus.
  • strains belonging to the following bacterial species Staphylococcus aureus (strain sensitive to rifampicin), Staphylococcus aureus (strain resistant to rifampicin), Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus haemolyticus, Staphylococcus saprophyticus Staphylococcus Staphylocus lugdunensis, Staphylococcus gallinarum, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Streptococcus pneumoniae, Enterococcus faecalis, Steptococcus pyogenes, Corynebacterium amycolatum, Gemella morbilorum, Acinetobacter anitratus, aceticibular acupuncture and Micrococcus luteusea Acionibacter luteusea and Propionibea luteusea not knowing a priori the identity of the strains) of the strain
  • the extraction of the nucleic acids as well as the amplification of the 751 base pair fragment of the rpoB gene were carried out as described in Example No. 2 by incorporating the primers SEQ ID No. 7 (as primer 5 ') and SEQ ID No. 10 (as 3 'primer) in PCR amplification (Fig. 1).
  • the sequencing of these 10 amplifiers was carried out by incorporating into the sequencing reaction the primers SEQ ID No. 9 (primer 5 ') and SEQ ID No. 10 (primer 3') as described in Example No. 2 and the comparison of the sequences obtained with the sequences of the SEQ.ID sequence database.
  • n ° 11 to 39 identified the ten amplified strains as: Staphylococcus aureus, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus haemolyticus, Staphylococcus saprophyticus, Staphylococcus intermedius, Staphylococcus equorum, Staphylococcus schleiferi, Staphylococcus lugdunensis and Staphylococcus gallinarum.
  • the decoding of these 20 strains showed 100% agreement between the molecular identification according to the process which is the subject of the present invention and the identification previously established by standard phenotypic methods.
  • the other bacteria chosen for being frequently isolated from human or animal clinical samples which may also contain bacteria of the genus Staphylococcus, were not amplified, thus demonstrating the specificity of the primers used for the genus Staphylococcus under the conditions of use for the detection of bacteria of the genus Staphylococcus according to the invention. compared to bacteria of another genus.
  • FIG. 1 are represented the PCR amplification products obtained from fifteen coded bacterial strains, comprising 10 strains belonging to the genus Staphylococcus (columns 2 to 5, 8, 9, 11 to 13 and 16) and 5 bacterial strains of genera bacteria other than Staphylococcus (columns 6, 7, 10, 14 and 15).
  • Columns 1 and 17 represent the molecular weight marker.
  • Columns corresponding to the negative amplification controls (sterile water) and to other strains other than Staphylococcus are not shown.
  • the amplification products are obtained after incorporation of the primers SEQ ID No. 7 and SEQ ID No. 10 according to the invention and are visualized by staining with ethidium bromide after electrophoresis on an agarose gel.

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Abstract

Procédé de détection par identification moléculaire d'une bactérie de l'une des espèces du genre Staphylococcus caractérisé en ce qu'on utilise : un fragment dudit gène rpoB de ladite bactérie, comprenant une séquence nucléotidique choisie parmi l'une des séquences SEQ.ID. n DEG 11 à 39, les séquences inverses et les séquences complémentaires, ou un oligonucléotide comprenant une séquence d'au moins 12 motifs nucléotidiques consécutifs incluse dans l'une des séquences SEQ.ID. n DEG 7 à 10, dans lesquelles N représente un nucléotide choisi parmi l'inosine et un mélange équimolaire de 4 nucléotides différents choisis parmi A, T, C ou G, et parmi les oligonucléotides des séquences inverses et séquences complémentaires.

Description

Identification moléculaire des bactéries du genre Staphylococcus
La présente invention concerne le domaine du diagnostic. Plus précisément, l'invention concerne une méthode pour l'identification moléculaire des bactéries du genre Staphylococcus par les techniques de détection et/ou d'amplification et séquençage à l'aide de sondes ou d'amorces oligonucléotidiques appliquées à des souches de ce genre bactérien.
Les bactéries du genre Staphylococcus sont des bactéries cocciformes, Gram-positive et catalase-positive dont on reconnaît actuellement 36 espèces dont 9 comprennent des sous-espèces [Euzéby JP. (1997) Int J Syst Bacteriol 47 :590-2]. Ces espèces sont coagulase-négative, à l'exception de Staphylococcus aureus, Staphylococcus intermedius, Staphylococcus delphinii, Staphylococcus schleiferi subsp. coagulans, et quelques souches de Staphylococcus hyicus [Kloos WE (1995) In Manual of Clinical Microbiology, pp 282-298, ASM Press]. Ces espèces sont facilement et fréquemment isolées et cultivées à partir de prélèvements environementaux, de prélèvements cliniques vétérinaires et de prélèvements cliniques humains [Kloos WE (1986) in Bergey's manual of Systematic Bacteriology, pp. 1013-1035, Williams & Wilkins]. Chez l'homme, Staphylococcus aureus est une espèce coagulase-positive responsable d'intoxication alimentaire liée à la production d'une enterotoxine, du choc toxique staphylococcique, et d'infections purulentes caractérisées par des métastases septiques à distance du foyer infectieux initial. Les souches de Staphylococcus aureus résistantes à la méthicilline, qui est l'antibiotique de première ligne pour combattre ces infections, représentent un problème important de santé publique dans le cadre des infections nosocomiales, c'est à dire des infections contractées par les patients dans le cours de leur hospitalisation dans un établissement de soins. Les bactéries des espèces du genre Staphylococcus coagulase-négative font partie de la flore normale chez l'homme. Ces espèces sont également responsables d'infections nosocomiales, en particulier d'infection des matériels étrangers implantés en particulier des prothèses implantées [Kloos WE (1994) Clin. Microbiol. Rev. 7 :117-140].
Ces différentes espèces posent le problème de leur identification. Les méthodes conventionnelles d'identification phénotypique sont les plus couramment utilisées pour l'identification des bactéries des espèces du genre Staphylococcus [Kloos WE (1991) J. Clin. Microbiol. 29 :738-744] et plusieurs trousses d'identification ainsi que des automates ont été développés pour aider à l'identification phénotypique des bactéries du genre Staphylococcus. Cependant, le degré d'identification en pratique courante est variable [Grant CE (1994) Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 18 :1-5 ; Perl TM (1994) Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 18,151-5 ; Refshal K (1992) J. Hosp. Infect. 22,19-31] : par exemple, les bactéries appartenant aux espèces Staphylococcus hominis et Staphylococcus warneri sont confondues par la plupart de ces systèmes, avec des taux d'erreurs de 27 à 36% [Gran CE (1994) Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 18 :1-5 ; leven M (1995) J. Clin. Microbiol. 33 : 1060-3]. De même, Staphylococcus schleiferi peut être mal identifié par les systèmes d'identification automatique [Calvo J (2000) J. Clin. Microbiol. 38 :3887-9]. Les méthodes moléculaires peuvent donner en théorie de meilleurs résultats pour l'identification des bactéries du genre Staphylococcus du fait de leurs qualités de sensibilité et de spécificité. Les cibles moléculaires actuellement proposées pour l'identification moléculaire des bactéries du genre Staphylococcus comprennent le gène 16S rADN codant la sous-unité 16S de l'ARN ribosomal [Bialkowska-Hobrzanska H et al. (1990) Eur. J. Microbiol. Infect. Dis. 9:588-594], l'entretoise des gènes codant les ARN de transfert [Maes N. et al. (1997) J. Clin. Microbiol. 35 :2477-2481], le gène hsp60 codant pour la protéine de stress 60 [Goh SH et al. (1996) J. Clin. Microbiol. 34 :818-823 ; Goh SH (1997) J. Clin. Microbiol. 35,3116-3121 ; Kwok AY (1999) Int J Syst Bacteriol 49,1181-1192] et le gène femA [Vannuffel P et al. Res. Microbiol. 150 :129-141]. L'hybridation d'oligonucléotides est la technique généralement proposée pour cibler ces régions d'identification. La détection du gène nue est limitée aux bactéries de l'espèce Staphylococcus aureus [Brakstad OG (1992) J. Clin. Microbiol. 30 : 1654-1660] et un fragment chromosomique a été rapporté pour l'identification des bactéries de l'espèce Staphylococcus epidermidis [Martineau F (1996) J. Clin. Microbiol. 34 :2888-2893]. Il existe donc toujours une demande d'un outil d'identification moléculaire des bactéries des espèces du genre Staphylococcus utilisable en routine au laboratoire de bactériologie [Kleeman KT (1993) J. Clin. Microbiol. 31 ,1318-1321]. Les inventeurs ont démontré selon la présente invention, que le gène rpoB constitue un marqueur génétique permettant la détection et l'identification spécifique de la bactérie de chaque espèce du genre Staphylococcus.
Plus particulièrement, la présente invention concerne des séquences d'acides nucléiques spécifiques du genre ou de chaque espèce du genre Staphylococcus dont la séquence nucléotidique est tirée du gène rpoB des dites bactéries.
Selon Lazcano et al. [J. Mol. Evol. (1988) 27 :365-376], les ARN polymerases sont divisées en deux groupes selon leur origine, l'un constitué par les ARN polymerases virales ARN- ou ADN-dépendantes, et l'autre constitué par les ARN polymerases ADN-dépendantes d'origine eucaryote ou procaryotes (archaébactéries et eubactéries). Les ARN polymerases ADN-dépendantes eubactériennes sont caractérisées par une constitution multimérique simple et conservée notée « core enzyme », représentée par αββ', ou « holoenzyme » représentée par ccββ'σ [Yura and Ishihama, Ann. Rev. Genêt. (1979) 13 :59-97]. De nombreux travaux ont mis en évidence le rôle fonctionnel, au sein du complexe enzymatique multimérique, de la sous-unité β de l'ARN polymérase eubactérienne. Les ARN polymerases archaébactérienne et eucaryote présentent, pour leur part, une structure plus complexe pouvant atteindre une dizaine, voire une trentaine de sous-unités [Pϋhlet et al. Proc . Natl. Acad. Sci. USA (1989) 86 :4569-4573].
Les gènes qui codent les différentes sous-unités αββ'σ de l'ARN polymérase ADN-dépendante chez les eubactéries, respectivement les gènes rpoA, rpoB, rpoC et rpoD, ssont classés en différents groupes comprenant les gènes codant pour des protéines constitutives des sous-unités ribosomiques ou pour des enzymes impliqués dans la réplication et la réparation du génome [Yura and Yshihma, Ann. Rev. Genêt. (1979) 13 :59-97]. Certains auteurs ont montré que les séquences des gènes rpoB et rpoC pouvaient être utilisées afin de construire des arbres phylogénétiques [Rowland et al. Biochem. Soc. Trans. (1992) 21 :40S] permettant de séparer les différents embranchements et sous- embranchements parmi les règnes du vivant.
Avant d'exposer plus en détail l'invention, différents termes, utilisés dans la description et les revendications, sont définis ci-après: - par « acide nucléique extrait de bactéries » on entend soit l'acide nucléique total, soit PADN génomique, soit les ARN messagers, soit encore l'ADN obtenu à partir de la transcription inverse des ARN messagers ;
- un « fragment nucléotidique » ou un « oligonucleotide » sont deux termes synonymes désignant un enchaînement de motifs nucléotidiques caractérisé par une séquence informationnelle des acides nucléiques naturels (ou éventuellement modifiés) et susceptibles de s'hybrider, comme les acides nucléiques naturels, avec un fragment nucléotidique complémentaire ou sensiblement complémentaire, dans des conditions prédéterminées de stringence stricte. L'enchaînement peut contenir des motifs nucléotidiques de structure différente de celle des acides nucléiques naturels. Un fragment nucléotidique (ou oligonucleotide) peut contenir par exemple jusqu'à 100 motifs nucléotidiques. Il contient généralement au moins 10, et en particulier au moins 12 motifs nucléotidiques et peut être obtenu à partir d'une molécule d'acide nucléique naturelle et/ou par recombinaison génétique et/ou par synthèse chimique, un motif nucléotidique est dérivé d'un monomère qui peut être un nucleotide naturel d'acide nucléique dont les éléments constitutifs sont un sucre, un groupement phosphate et une base azotée choisie parmi l'adénine (A), la guanine (G), Puracile (U), la cytosine (C), la thymine (T) ; ou bien le monomère est un nucleotide modifié dans l'un au moins des trois éléments constitutifs précédents ; à titre d'exemple, la modification peut intervenir soit au niveau des bases, avec des bases modifiées telles que l'inosine, qui peut s'hydrider avec toute base A, T, U, C ou G, la méthyl-5-désoxycytidine, la désoxyuridine, la diméthylamino-5-désoxyuridine ou toute autre base modéfiée capable d'hybridation, soit au niveau du sucre, par exemple le ermplacement d'ua moins un désoxyribose par un polyamide [Nielsen PE et al., Science (1991) 254 : 1497-1500], soit encore au niveau du groupement phosphate, par exemple par remplacement par des esters choisis notamment parmi les diphosphates, les alkylphosphonates et les phosphorothioates,
- par « hybridation », on entend le processus au cours duquel, dans des conditions appropriées, deux fragments nucléotidiques ayant des séquences suffisamment complémentaires sont suscpetibles de cs'associer par des liaisons hydrogène stables et spécifiques, pout former un double brin. Les conditions d'hybridation sont déterminées par la « stringence », c'est à dire la rigueur des conditions opératoires. L'hybridation est d'autant plus spécifique qu'elle est effectuée à plus forte stringence. La stringence est fonction notamment de la composition en bases d'un duplex sonde/cible, ainsi que par le degré de mésappariement entre deux acides nucléiques. La stringence peut également être fonction des paramètres de la réaction d'hybridation, tels que la concentration et le type d'espèces ioniques présentes dans la solution d'hybridation, la nature et la concentration d'agents dénaturants et/ou la température d'hybridation. La stringence des conditions dans lesquelles une réaction d 'hybridation doit être réalisée dépend notamment des sondes utilisées. Toutes ces données sont bien connues et les conditions appropriées peuvent éventuellement être déterminées dans chaque cas par des expériences de routine. En général, selon la longueur des sondes utilisées, la température pour la réaction d'hybridation est comprise entre environ 20 et 65°C, en particulier entre 35 et 65°C dans une solution saline à une concentration d'environ 0,8 à 1 M.
- une « sonde » est un fragment nucléotidique possédant une spécificité d'hybridation dans des conditions déterminées pour former un complexe d 'hybridation avec un acide nucléique ayant, dans le cas présent, une séquence nucléotidique comprise soit dans un ARN messager, soit dans un ADN obtenu par transcription inverse dudit ARN messager, produit de transcription ; une sonde peut être utilisée à des fins de diagnostic (notamment sondes de capture ou de détection) ou à des fins de thérapie, - une « sonde de capture » est une sonde immobilisée ou immobilisable sur un support solide par tout moyen approprié, par exemple par covalence, par adsorption, ou par synthèse directe sur un solide. Des exemples de supports comprennent les plaques de microtitration et les puces à ADN,
- une « sonde de détection » est une sonde marquée au moyen d'un agent marqueur choisi par exemple parmi les isotopes radioactifs, les enzymes, en particulier les enzymes susceptibles d'agir sur un substrat chromogéne, fluorigène ou luminescent (notamment une peroxydase ou une phosphatase alcaline), les composés chimiques chromophores, les composés chromogènes, fluorigènes ou luminescents, les analogues des bases nucléotidiques et les ligands tels que la biotine,
- une « sonde d'espèce » est une sonde permettant l'identification spécifique de l'espèce d'une bactérie, - une « sonde de genre » est une sonde permettant l'identification spécifique du genre d'une bactérie,
- une « amorce » est une sonde comprenant par exemple 10 à 100 motifs nucléotidiques et possédant une spécificité d'hybridation dans des conditions déterminées pour les réactions d'amplification enzymatique, - par « réaction d'amplification » on entend une réaction de polymérisation enzymatique, par exemple dans une technique d'amplification telle que la PCR, initiée par des oligonucléotides amorces et utilisant une ADN polymérase.
- par « réaction de séquençage », on entend l'obtention de la séquence d'un fragment d'acide nucléique ou d'un gène complet par un procédé de polymérisation abortive à partir d'amorces oligonucléotidiques et utilisant lesdits didésoxynucléotides (Sanger F, Coulson AR (1975), J.Mol.Biol. 94 : 441) ou par hybridations multiples avec des sondes multiples fixées sur support solide telles qu'utilisées dans les puces ADN par exemple.
Les inventeurs ont déterminé les séquences complètes des gènes rpoB de quatre espèces de bactéries du genre Staphylococcus . Ces quatre espèces ont été choisies par les inventeurs comme représentant les quatre principaux groupes génétiques déterminés sur la base de l'étude du gène 16S dans les bactéries du genre Staphylococcus, à savoir les espèces phylogénétiquement les plus divergentes parmi l'ensemble des espèces actuellement décrites dans ce genre, de sorte que l'alignement des séquences rpoB obtenues chez ces quatre espèces puisse encadrer phylogénétiquement vraisemblablement l'ensemble des séquences rpoB de toutes les espèces de ce genre bactérien.
Les inventeurs ont mis en évidence les séquences consensus et spécifiques SEQ.ID. n° 7 à 10 décrites dans le listage des séquences en fin de description. Les inventeurs ont déterminé lesdites séquences SEQ.ID. n° 7 à 10 comme étant non seulement consensuelles entre toutes les bactéries du genre
Staphylococcus mais en outre spécifiques de la famille des bactéries du genre Staphylococcus, excepté Staphylococcus schleiferi en ce qui concerne la séquence SEQ.ID. n°8.
Ces séquences sont présentes dans les gènes rpoB de toute bactérie du genre Staphylococcus et spécifiques des bactéries du genre Staphylococcus pouvant être utilisées à titre de sonde de genre pour détecter toute bactérie du genre Staphylococcus excepté Staphylococcus schleiferi en ce qui concerne la séquence SEQ.ID. N° 8.
Dans les séquences SEQ.ID. n° 7 et 10, le nucleotide N mentionné dans le listage de séquences en fin de description, peut représenter l'inosine ou un mélange équimolaire de 4 nucléotides différents choisis parmi A, T, C et Gt, ou respectivement A, U, C et G, dans la mesure où, comme mentionné dans les définitions, un oligonucleotide ou un fragment d'acide nucléique selon l'invention peut être sous forme d'un acide des oxyribonucléiques (ADN) ou d'un acide ribonucléique (ARN) pour lesquels, dans ce cas, T est remplacé par U. Lorsque "N" représente un dit mélange équimolaire de nucléotides à une position donnée, cela signifie que le nucleotide à ladite position donnée représente indifféremment A, T, C ou G (ou respectivement le cas échéant A, U, C ou G) et que l'oligonucléotide selon l'invention est constitué plus précisément d'un mélange équimolaire de 4 groupes d'oligonucléotides dans chacun desquels groupes N a une signification différente à ladite position donnée et représente respectivement chacun des 4 bases A, T, C ou G (ou respectivement A, U, C ou G).
A la position correspondant à un nucleotide N dans les séquences SEQ.ID. n° 7 et 10 on trouve des nucléotides variables dans les séquences cibles complémentaires en fonction de l'espèce de la bactérie considérée, mais tous les autres nucléotides sont conservés dans toutes les espèces des bactéries du genre Staphylococcus. Du fait que "N" représente l'inosine qui peut s'hybrider avec toute base ou un mélange équimolaire des 4 bases A, T, C, G, les séquences SEQ.ID. n° 7 et 10 peuvent s'hybrider avec la séquence complémentaire incluse dans le gène rpoB de toutes les bactéries du genre Staphylococcus.
En outre, les séquences consensus SEQ.ID. n° 9 et SEQ ID n°10 encadrent des séquences hypervariables dont la séquence est spécifique pour chaque espèce de bactérie du genre Staphylococcus. Les séquences encadrées par SEQ.ID. n° 9 et 10 peuvent donc être utilisées à titre de sonde d'espèce des bactéries du genre Staphylococcus.
De plus, les séquences SEQ.ID. n° 9 et 10 ont été déterminées comme encadrant un fragment du gène rpoB comprenant une zone dont la longueur variable est d'environ 500 pb et constitue la plus courte séquence spécifique pour chaque espèce de la bactérie du genre Staphylococcus .
Les inventeurs ont ainsi pu mettre en évidence des sondes d'espèce pour chacune des 29 espèces de bactérie du genre Staphylococcus étudiées correspondant aux séquences SEQ.ID. n° 11 à 39 encadrées par les séquences consensus SEQ.ID. n° 9 et 10.
Les séquences consensus SEQ.ID. N° 7 à 10 mises en évidence selon la présente invention, peuvent être utilisées à titre d'amorce d'amplification ou de réaction de séquençage dans des procédés de détection de bactérie du genre Staphylococcus par identification moléculaire.
Les séquences SEQ.ID. n° 7 à 10 permettent donc non seulement de préparer des sondes de genre des bactérie du genre Staphylococcus mais aussi de détecter et identifier l'espèce de ladite bactérie par amplification et séquençage en utilisant lesdites séquences comme amorces. Plus précisément, la présente invention fournit un procédé de détection par identification d'une bactérie de l'une des espèces du genre Staphylococcus caractérisé en ce qu'on utilise :
- le gène rpoB de ladite bactérie ou un fragment dudit gène rpoB de ladite bactérie, comprenant une séquence nucléotidique choisie parmi l'une des séquences SEQ.ID n°11 à 29 et 31 à 39, les séquences inverses et les séquences complémentaires, ou
- un fragment dudit gène rpoB de ladite bactérie, consistant dans la séquence nucléotidique SEQ.ID n°30, la séquence inverse et la séquence complémentaire, ou - un oligonucleotide comprenant une séquence d'au moins 12 motifs nucléotidiques consécutifs, incluses dans l'une des séquences SEQ.ID. n° 7 à 10, dans lesquelles N représente un nucleotide choisi parmi l'inosine ou un mélange équimolaire de 4 nucléotides différents choisis parmi A, T, C ou G, les séquences inverses et les séquences complémentaires.
Lesdits oligonucléotides comprennent de préférence de 12 à 35 motifs nucléotidiques, et de préférence encore, lesdits oligonucléotides consistent dans les séquences SEQ.ID. n° 7 à 10, les séquences inverses et les séquences complémentaires.
Dans un premier mode de réalisation d'un procédé de détection selon l'invention, on cherche à mettre en évidence la présence d'une bactérie du genre Staphylococcus et, dans une première variante, on réalise les étapes dans lesquelles :
1- on met en contact au moins une sonde de genre comprenant un dit oligonucleotide comprenant une séquence incluse dans l'une des séquences SEQ.ID. n° 7 à 10, les séquences inverses et les séquences complémentaires, et 2- on détermine la formation ou l'absence de formation d'un complexe d'hybridation entre ladite sonde de genre et les acides nucléiques de l'échantillon, et on détermine la présence d'une dite bactérie du genre Staphylococcus s'il y a formation d'un complexe d'hybridation.
Dans une deuxième variante de réalisation d'un procédé de détection d'une bactérie du genre Staphylococcus, on réalise les étapes dans lesquelles :
1- on met en contact les amorces d'amplification comprenant desdits oligonucléotides comprenant une séquence d'au moins 12 motifs nucléotidiques incluse dans au moins deux séquences tirées des séquences SEQ.ID. n° 7 à 10, séquences inverses et séquences complémentaires, avec un échantillon contenant ou susceptible de contenir des acides nucléiques d'au moins une telle bactérie du genre Staphylococcus, avec :
- comme amorce 5' : un oligonucleotide choisi parmi les oligonucléotides comprenant une séquence incluse dans l'une des séquences SEQ.ID. n° 7 ou 9 ou les séquences complémentaires, de préférence un oligonucleotide consistant dans lesdites séquences complètes, et
- comme amorce 3' : un oligonucleotide comprenant une séquence incluse dans l'une des séquences SEQ.ID. n° 10 ou 8 ou respectivement une séquence complémentaire, de préférence un oligonucleotide consistant dans lesdites séquences complètes.
2- on réalise une amplification d'acides nucléiques par réaction de polymérisation enzymatique et on détermine l'apparition ou l'absence d'un produit d'amplification, et on détermine ainsi la présence de ladite bactérie dans l'échantillon si un produit d'amplification est apparu.
Plus particulièrement dans cette deuxième variante du premier mode de réalisation, on utilise comme amorce 5" un oligonucleotide de séquence SEQ.ID. n° 7 ou 9 ou une séquence complémentaire, et comme amorce 3' un oligonucleotide de séquence SEQ.ID. n° 10 ou respectivement une séquence complémentaire.
Dans un deuxième mode de réalisation du procédé de détection d'une bactérie selon l'invention, on cherche à détecter spécifiquement une espèce donnée d'une bactérie du genre Staphylococcus choisie parmi les espèces Staphylococcus xylosus, Staphylococcus warneri, Staphylococcus simulans, Staphylococcus sciuri, Staphylococcus schleiferi, Staphylococcus saphrophyticus, Staphylococcus saccharolyticus, Staphylococcus pulveris, Staphylococcus muscae, Staphylococcus lugdunensis, Staphylococcus lentis, Staphylococcus kloosii, Staphylococcus intermedius, Staphylococcus hyicus, Staphylococcus hominis, Staphylococcus haemolyticus, Staphylococcus gallinarum, Staphylococcus felis, Staphylococcus equorum, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus cohni, Staphylococcus chromogenes, Staphylococcus carnosus, Staphylococcus capitis, Staphylococcus auπcularis, Staphylococcus aureus subs. aureus, Staphylococcus aureus subs. anaerobius, Staphylococcus arlettae, Staphylococcus caprae.
Dans une première variante de ce deuxième mode de réalisation du procédé selon l'invention, on réalise les étapes dans lesquelles :
1- on met en contact un échantillon contenant ou susceptible de contenir des acides nucléiques d'au moins une telle bactérie, avec au moins une sonde d'espèce consistant dans un dit fragment de gène comprenant une séquence incluse dans l'une des séquences SEQ.ID. n° 11 à 39, les séquences inverses et séquences complémentaires, de préférence un oligonucleotide consistant dans l'une desdites séquences SEQ.ID. n° 11 à 39, ou un oligonucleotide de séquence inverse ou complémentaire, et
2- on détermine la formation ou l'absence d'un complexe d'hybridation entre ladite sonde et les acides nucléiques de l'échantillon. Dans une seconde variante de ce dit deuxième mode de réalisation du procédé selon l'invention dans lequel on cherche à détecter spécifiquement une espèce donnée d'une bactérie du genre Staphylococcus choisie parmi les 29 espèces citées ci-dessus, le procédé comprend les étapes dans lesquelles, dans un échantillon contenant ou susceptible de contenir des acides nucléiques d'au moins une dite bactérie : a) on réalise une réaction de séquençage d'un fragment du gène rpoB amplifié d'une dite bactérie donnée à l'aide des amorces nucléotidiques consistant dans des oligonucléotides comprenant une séquence incluse dans les séquences SEQ.ID. n°7 ou 9 comme amorce 5', et SEQ.ID. n°10 comme amorce 3', de préférence des oligonucléotides consistant dans lesdites séquences SEQ.ID. n° 7 ou 9 et 10, ou leurs séquences complémentaires, et b) on détermine la présence ou l'absence de l'espèce donnée de ladite bactérie en comparant la séquence dudit fragment obtenu avec la séquence du gène complet rpoB de ladite bactérie ou la séquence d'un fragment du gène rpoB de ladite bactérie comprenant respectivement lesdites séquences n° 1 1 à 39 et séquences complémentaires, et on détermine ainsi la présence de ladite bactérie dans l'échantillon si la séquence du fragment obtenue est identique à la séquence connue du genre ou du fragment de gène rpoB de ladite bactérie. Plus particulièrement dans cette seconde variante: - à l'étape a) on réalise les étapes comprenant :
1- une première amplification de l'acide nucléique dudit échantillon avec un couple d'amorces 5' et 3' choisi parmi des oligonucléotides comprenant respectivement les séquences SEQ.ID. n° 7 et respectivement SEQ.ID. n° 10 ou leurs séquences complémentaires, et on détermine l'apparition ou l'absence d'un produit d'amplification à l'étape 1 , et
2- une réaction de séquençage des amplifiats déterminés à l'étape 1 avec les amorces 5' et 3' consistant dans des oligonucléotides comprenant les séquences SEQ.ID. n° 9 et respectivement SEQ.ID. n°10, de préférence consistant dans lesdites séquences SEQ.ID. n° 7 et 10 ou leurs séquences complémentaires, de préférence consistant dans lesdites séquences SEQ.ID. n° 9 et 10 ou leurs séquences complémentaires, et
- à l'étape b), on compare les séquences obtenues avec respectivement l'une des séquences SEQ.ID. n° 1 1 à 39 ou leurs séquences complémentaires.
Un autre objet de la présente invention est un gène ou fragment de gène rpoB d'une bactérie du genre Staphylococcus , caractérisé en ce qu'il comprend une séquence telle que décrite dans les séquences SEQ.ID. n° 11 à 29 et 30 à
39. Un autre objet de la présente invention est la séquence complète du gène rpoB des bactéries Staphylococcus saccharolyticus, Staphylococcus lugdunensis, Staphylococcus caprae, et Staphylococcus intermedius telles que décrites dans les séquences SEQ.ID. n° 3 à 6, comme mentionné précédemment ces fragments de gènes rpoB et gènes complets sont utiles notamment pour un procédé selon l'invention.
La séquence complète du gène rpoB peut être utilisée pour identifier la bactérie pas seulement par l'étude de sa séquence primaire, mais aussi, par l'étude des structures secondaire et tertiaire de l'ARN messager provenant de la transcription de la séquence complète d'ADN. Un autre objet de la présente invention est un dit fragment de gène rpoB ou oligonucleotide choisi parmi les oligonucléotides ayant une séquence consistant dans les séquences SEQ ID n° 1 1 à 39 et parmi les oligonucléotides de séquences inverses et séquences complémentaires tels que définis ci- dessus. Un autre objet de la présente invention est un oligonucleotide comprenant une séquence d'au moins 12, de préférence de 12 à 35, motifs nucléotidiques consécutifs incluse dans l'une des séquences SEQ.ID. n° 7 à 10, dans lesquelles N représente un nucleotide choisi parmi l'inosine et un mélange équimolaire de 4 nucléotides différents choisis parmi A, T, C ou G, et les oligonucléotides de séquences inverses et séquences complémentaires, de préférence consistant dans les séquences SEQ.ID. n° 7 et 10 et les séquences inverses et séquences complémentaires dans lesquelles N représente l'inosine. Les séquences SEQ ID n° 7 à 39 peuvent être préparées par synthèse chimique en utilisant les techniques bien connues de l'homme du métier et décrites par exemple dans l'article de Itakura K. et al. [(1984) Annu. Rev. Biochem. 53 :323]. Une première application d'un oligonucleotide selon l'invention est son utilisation comme sonde pour la détection, dans un échantillon biologique, de bactéries de l'une des espèces du genre Staphylococcus qui comprend une séquence nucléotidique d'au moins 12 motifs nucléotidiques consécutifs incluse dans l'une des séquences SEQ ID n° 7 à 39, et leurs séquences inverses ou complémentaires.
Une sonde comprenant les séquences SEQ.ID. n° 7 à 10 sera utilisée à titre de sonde de genre et une sonde comprenant l'une des séquences SEQ.ID. n° 1 1 à 39 sera utilisée à titre de sonde d'espèce.
Les sondes selon l'invention peuvent être utilisées, à des fins de diagnostic, comme mentionné précédemment, par la détermination de la formation ou de l'absence de formation d'un complexe d'hybridation entre la sonde et un acide nucléique cible dans un échantillon, selon toutes les techniques d'hybridation connues et notamment les techniques de dépôt ponctuel sur filtre, dites « DOT-BLOT » [Maniatis et al. (1982) Molecular Cloning, Cold Spring Harbor], les techniques de transfert d'ADN dites « SOUTHERN BLOT » [Southern E.M., J. Mol. Biol. (1975) 98 :503], les techniques de transfert d'ARN dites « NORTHERN BLOT », ou les techniques dites « sandwich », en particulier avec une sonde de capture et/ou une sonde de détection, lesdites sondes étant capables de s'hybrider avec deux régions différentes de l'acide nucléique cible, et l'une au moins desdites sondes (généralement la sonde de détection) étant capable de s'hybrider avec une région de la cible qui est spécifique de l'espèce, étant entendu que la sonde de capture et al sonde de détection doivent avoir des séquences nucléotidiques au moins partiellement différentes. L'acide nucléique à détecter (cible) peut être de l'ADN ou de l'ARN (le premier obtenu après amplification par PCR). Dans le cas de la détection d'une cible de type acide nucléique double brin, il convient de procéder à la dénaturation de ce dernier avant la mise en oeuvre du procédé de détection. L'acide nucléique cible peut être obtenu par extraction selon les méthodes connues des acides nucléiques d'un échantillon à examiner. La dénaturation d'un acide nucléique double brin peut pêtre effectuée par les méthodes connues de dénaturation chimique, physique ou enzymatique, et en particulier par chauffage à une température appropriée, supérieure à 80°C.
Pour mettre en œuvre les techniques d'hybridation précitées, et en particulier les techniques « sandwich », une sonde de l'invention, appelée sonde de capture est immobilisée sur un support solide, et une autre sonde de l'invention, appelée sonde de détection, est marquée avec un agent marqueur. Les exemples de support et d'agent marqueur sont tels que définis précédemment.
De manière avantageuse, une sonde d'espèce est immobilisée sur un support solide, et une autre sonde d'espèce est marquée par un agent marqueur. Une autre application d'un oligonucleotide de l'invention est son utilisation comme amorce nucléotidique comprenant un oligonucleotide monocaténaire choisi parmi les oligonucléotides ayant une séquence d'au moins 12 motifs nucléotidiques incluses dans l'une des séquences SEQ ID n° 7 à 39, qui est utilisable dans la synthèse d'un acide nucléique en présence d'une polymérase par un procédé connu en soi, notamment dans des méthodes d'amplification utilisant une telle synthèse en présence d'une polymérase (PCR, RT-PCR, etc .). En particulier, une amorce de l'invention peut être utilisée pour la transcription inverse spécifique d'une séquence d'ARN messager de bactérie d'une espèce du genre Staphylococcus pour obtenir une séquence d'ADN complémentaire correspondante. Une telle transcription inverse peut constituer le premier stade de la technique RT-PCR, le stade suivant étant l'amplification par PCR de l'ADN complémentaire obtenu. On peut également utiliser les amorces de l'invention pour l'amplification spécifique par réaction de polymérisation en chaîne de la séquence totale de l'ADN du gène rpoB d'une espèce du genre Staphylococcus. Selon un cas particulier ladite amorce comprenant un oligonucleotide de l'invention comprend en outre la séquence sens ou anti-sens d'un promoteur reconnu par une ARN polymérase (promoteurs T7, T3, SP6 par exemple [Studier FW, BA Moffatt (1986) J. Mol. Biol. 189 :1 13] : de telles amorces sont utilisables dans des procédés d'amplification d'acide nucléique faisant intervenir une étape de transcription, tels que, par exemple, les techniques NASBA ou 3SR [Van Gemen B. et al. Abstract MA 1091 , 7th International Conférence on AIDS (1991) Florence, Italy]. Un autre objet de l'invention est une amorce nucléotidique comprenant un oligonucélotide monocaténaire choisi parmi les oligonucléotides ayant une séquence comprenant l'une des séquences SEQ ID n° 11 à 29 et 31 à 39, ou de préférence, consistant dans l'une des séquences SEQ.ID. n° 11 à 39 qui est utilisable pour le séquençage total ou partiel du gène rpoB d'une souche quelconque d'une espèce du genre Staphylococcus.
Le séquençage du gène rpoB partiel ou complet chez toute bactérie du genre Staphylococcus perrmet l'identification de toute bactérie Staphylococcus par analyse bioinformatique de cette séquence et la reconnaissance de nouvelles espèces de bactéries Staphylococcus inconnues. De préférence, dans une utilisation comme amorce ou pour le séquençage des gènes rpoB on utilise les séquences SEQ ID n°7 à SEQ ID n°10, dans lesquelles N est l'inosine de préférence, les séquences SEQ ID n°7 et SEQ.ID. n° 10.
La présente invention a également pour objet une trousse de diagnostic utile dans un procédé selon l'invention comprenant au moins un dit fragment de gène dudit oligonucleotide consistant dans les séquences SEQ.ID. n° 7 à 39 et les séquences inverses et séquences complémentaires ou un dit oligonucleotide comprenant une séquence incluse dans une des séquences SEQ.ID. n° 7 à 10, et/ou au moins un dit fragment de gène rpoB d'une dite bactérie comprenant les séquences SEQ.ID. n° 11 à 39, et les oligonucléotides et fragments de gènes de séquences inverses et séquences complémentaires, tels que définis ci-dessus.
Dans la présente description, on entend par "séquences inverses et séquences complémentaires" les séquences suivantes :
- la séquence inverse de ladite séquence, - la séquence complémentaire de ladite séquence, et
- la séquence complémentaire de la séquence inverse de ladite séquence. Enfin, un dernier objet de l'invention est une sonde de thérapie génique pour traiter les infections provoquées par une souche appartenant à une espèce du genre Staphylococcus, ladite sonde comprenant un oligonucleotide tel que défini précédemment. Cette sonde de thérapie génique, capable de s'hybrider sur l'ARN messager et/ou sur l'ADN génomique desdites bactéries, peut bloquer les phénomènes de traduction et/ou transcription et/ou de réplication. Le principe des méthodes de thérapie génique est connu et repose notamment sur l'utilisation d'une sonde correspondant à un brin anti-sens : la formation d'un hybride entre la sonde et le brin sens est capable de perturber au moins l'une des étapes du décryptage de l'information génétique. Les sondes de thérapie génique sont donc utilisables comme médicaments antibactériens, permettant de lutter contre les infections causées par les bactéries des espèces du genre Staphylococcus.
L'invention sera mieux comprise à l'aide de l'exposé ci-après, divisé en exemples, qui concernent des expériences effectuées dans le but de réaliser l'invention et qui sont données à titre purement illustratif. La figure 1 représente la visualisation des produits d'amplification par coloration au bromure d'éthidium après électrophorèse sur un gel d'agarose obtenu à l'exemple 3.
Exemple 1. Séquence du gène rpoB de quatre espèces du genre Staphylococcus : Staphylococcus saccharolyticus, Staphylococcus lugdunensis, Staphylococcus caprae et Staphylococcus intermedius.
La séquence complète du gène rpoB des bactéries des espèces Staphylococcus saccharolyticus, Staphylococcus lugdunensis, Staphylococcus caprae et Staphylococcus intermedius a été déterminée par amplification enzymatique et séquençage automatique direct utilisant des amorces consensus entre les séquences du gène rpoB chez Staphylococcus aureus (GenBank n° d'accès X64172) Bacillus subtillis (GenBank n° d'accès L43593). Cette dernière espèce bactérienne a été choisie comme l'espèce Gram-positive de bas contenu en guanosine plus cytosine la plus proche des espèces du genre Staphylococcus (proximité phylogénétique basée sur la comparaison des séquences du gène 16S rADN). Plusieurs amorces consensus potentielles ont fait l'objet d'investigations pour obtenir un fragment susceptible de conduire à la séquence complète de gènes rpoB par élongations successives à partir d'une série d'amorces spécifiques. Ces amorces consensus ont les séquences suivantes :
SEQ ID n°1 : 5'-AAA CTT AAT AGA AAT TCA AAC TAA A -3' SEQ ID n°2 : 5'-ATC TGG TAA AGC ATT ACC AA - 3' et ont permis d'obtenir un premier fragment F1 d'une longueur de 1.007 paires de bases chez ces quatre espèces. A partir de l'alignement de la séquence de ce premier fragment F1 sur les séquences de Staphylococcus aureus et Bacillus subtilis, un grand nombre de tentatives avec des amorces théoriquement ou potentiellement appropriées ont échoué et finalement une succession d'amorces oligonucleotidiques a été déterminée pour permettre d'amplifier et de sequencer par étapes successives la totalité du gène rpoB chez les quatre espèces Staphylococcus saccharolyticus, Staphylococcus lugdunensis, Staphylococcus caprae et Staphylococcus intermedius. La séquence, la position relative à la séquence du gène rpoB de Staphylococcus aureus dans GenBank (numéro d'accès X64172) et la température d'hybridation de ces amorces sont présentées dans le tableau suivant :
Les amplifications ont été réalisées sous un volume final de 50 μl comprenant 2,5 x 10"2 U de Taq polymérase, 1 X de tampon de Taq et 1 ,8 mM de MgCI2, 200 μM de dATP, dTTP, dGTP, dCTP et 0,2 μM de chaque amorce. Elles ont été réalisées suivant le programme suivant : 35 cycles comportant une étape de dénaturation à 94°C pendant 30 secondes, hybridation des amorces à 52°C pendant 30 secondes et extension à 72°C pendant 60 secondes. Les produits d'amplification ont été purifiés sur colonne puis séquences à l'aide des amorces oligonucleotidiques de séquençage présentées dans le tableau suivant : 0
Les réactions de séquençage ont été réalisées en utilisant les réactifs du kit ABI Prism dRhodamine Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (Perkin Elmer Applied Biosystems) selon les recommandations du fournisseur suivant le programme suivant : 30 cycles comprenant une étape de dénaturation à 94°C pendant 10 sec, une étape d'hybridation de l'amorce à 50°C pendant 10 sec. et une étape d'extension à 60°C pendant 2 minutes. Les produits de séquençage ont été séparés par électrophorèse sur un gel de polyacrylamide sur un séquenceur 377 DNA Sequencer (Perkin) et analysés pour former des 0 séquences consensus par le logicel Séquence Assembler (Applied Biosystems). Cette approche nous a permis de déterminer la séquence complète du gène rpoB chez quatre espèces du genre Staphylococcus :
SEQ ID N°3 : Séquence du gène rpoB de Staphylococcus 5 saccharolyticus. Cette séquence mesure 3.791 paires de bases et possède un contenu en cytosine plus guanosine de 36,8% est déposée dans GenBank sous le numéro GenBank accession AF325871.
5'ATGAAACTTAATAGAAATTCAAACTAAATCTTATGATTGGTTCCTTAAAGAA
GGGTTATTAGAAATGTTTAGAGACATTTCACCAATTGAAGATTTCACAGGCA 0 ACCTATCTTTAGAATTTGTAGATTATAGATTAGGTGAACCAAATTATGATTTA GAAGAATCTAAAAATCGTGACGCTACTTATGCTGCACCTCTTCGTGTCAAAG TACGTCTCATTATTAAAGAAACAGGCGAAGTAAAAGAACAAGAAGTCTTCAT GGGTGATTTCCCATTAATGACAGACACAGGTACATTTGTTATCAATGGTGCT GAGCGTGTTATCGTGTCTCAATTAGTACGTTCACCATCTGTTTATTTCAACG AAAAAATTGATAAAAACGGTCGTGAAAATTATGATGCGACTATTATTCCTAAC CGTGGTGCTTGGTTAGAATATGAAACAGATGCTAAAGATGTCGTTTATGTTC GTATCGATAGAACACGTAAATTACCATTAACTGTATTGTTACGTGCGCTAGG TTTCTCAACTGATCAAGAAATCGTTGATTTAATAGGAGACAGTGAATATTTAC GTAATACATTAGAAAAAGATGGAACTGAAAATACAGAACAAGCTTTATTAGA AATTTATGAACGTTTGCGTCCTGGCGAACCACCAACAGTAGAAAATGCTAAA AGCTTATTATATTCACGTTTCTTCGATCCTAAACGCTATGATTTAGCAAGTGT AGGTCGTTATAAAGCTAACAAAAAGTTACATTTAAAACACCGTTTATTTAATC AAAAACTAGCAGAACCAATTGTTAATAGTGAAACAGGTGAGATTGTAGCGGA AGAAGGTACTGTACTTGATCGTCGTAAACTAGATGAAATCATGGACGTATTG GAGACAAACGCTAATAGCGAAGTCTTTGAACTTGAAGGTAGTGTCATTGATG AACCAGTAGAAATTCAATCAATTAAAGTATATGTTCCTAATGATGAAGAAGGT CGAACTACTACTGTTATTGGTAATGCATTACCAGACTCAGAAGTTAAATGTAT TACTCCGGCTGATATTATCGCCTCAATGAGTTACTTCTTTAACTTATTGAATG GAATTGGTTATACAGATGATATTGACCACTTAGGTAATCGTCGTTTACGTTC AGTTGGTGAATTACTACAAAACCAATTCCGTATCGGTTπSEQIDN°7)GTCTA GAATGGAACGTGTTGTACGTGAGAGAATGTCAATTCAAGACACTGATTCTAT CACTCCACAACAATTAATTAATATTCGTCCAGTCATTGCATCTATTAAAGAAT TTTTTGGTAGTTCTCAATTATCTCAATTCATGGACCAAGC(SEQIDN°9)AAAC CCATTAGCTGAGTTGACTCATAAACGTCGTTTATCAGCTCTAGGACCTGGT GGTTTAACTCGTGAACGCGCTCAAATGGAAGTACGTGACGTGCATTATTCT CACTACGGTCGTATGTGCCCTATTGAAACACCTGAGGGCCCAAACATTGG ATTAATTAACTCATTATCTAGTTATGCAAGAGTAAATGAATTTGGTTTTATT GAAACACCTTATCGTAAAGTTGATTTAGATACTAATTCAATCACTGACCAA ATTGACTACTTAACTGCTGATGAAGAAGATAGTTATGTTGTTGCACAAGCA AACTCACGTCTTGATGAAAATGGGTGCTTCTTAGATGATGAAGTTGTTTGT CGTTTTCGTGGCAATAACACAGTGATGGCTAAAGAAAAAATGGACTATAT GGACGTATCACCTAAACAAGTAGTTTCAGCAGCTACTGCATGTATCCCATT CTTAGAAAACGATGACTCAAACCGAGCATTAATGGGTGCAAACATGCAAC GTCAAGCAGTACCATTAATGAACCCAGAAGCGCCATTTGTTGGAACAGGT
ATGGAACATGTAGC(SEQIDN°10)AGCGCGTGACTCAGGTGCAGCAATTACT GCTAAGCATAGAGGACGTGTTGAACATGTTGAGTCTAATGAAGTTTTAGTTC GTCGTTTAGTAGAAGAAAATGGTATTGAACATGAAGGTGAATTAGATCGCTA TCCATTAGCAAAATTCAAACGTTCAAACTCTGGTACATGTTATAACCAACGC CCAATTGTTTCTGTTGGAGACGTTGTTGAATATAACGAAATTTTAGCAGACG GTCCTTCAATGGAACTAGGTGAAATGGCTTTAGGTCGTAACGTAGTTGTAG GTTTCATGACTTGGGACGG(SEQIDN°8)TTATAACTATGAGGATGCCGTTATC ATGAGCGAACGTTTAGTTAAAGATGATGTCTATACATCTATTCATATCGAAGA ATACGAATCAGAAGCACGTGACACTAAATTAGGACCTGAAGAAATTACTCGT GATATTCCTAATGTGTCTGAAAGTGCGCTTAAAAACTTAGACGATCGTGGTA TCGTTTATGTTGGTGCCGAAGTTAAAGATGGTGACATCTTAGTAGGCAAAGT AACGCCTAAAGGTGTAACGGAACTAACAGCAGAAGAAAGATTATTACATGCT ATTTTCGGTGAAAAGGCTCGTGAAGTTCGTGATACTTCATTACGTGTACCAC ATGGTGCAGGGGGCATCGTATTAGATGTAAAAGTCTTCAACCGTGAAGAGG GCGATGACACTTTATCTCCTGGTGTAAATCAATTAGTACGTGTTTATATCGTT CAAAAACGTAAAATTCATGTAGGGGATAAAATGTGCGGTCGTCATGGTAATA AAGGTGTTATTTCTAAAATTGTTCCTGAAGAAGATATGCCATACTTACCTGAT GGTCGACCAATCGACATCATGTTAAATCCACTTGGTGTACCTTCACGTATGA ACATTGGACAAGTGCTAGAATTACACTTAGGTATGGCTGCTAAAAACTTAGG CATCCACATTGCATCACCAGTATTTGATGGTGCTAATGATGATGATGTTTGG TCTACAATCGAAGAGGCCGGCATGGCACGTGATGGTAAGACTGTATTATAT GATGGGCGTACGGGTGAACCGTTTGATAACCGTATTTCTGTAGGTGTAATG TACATGCTTAAACTTGCTCACATGGTTGATGACAAATTGCATGCACGTTCAA CAGGACCATACTCACTCGTTACACAACAACCACTCGGTGGTAAAGCACAATT TGGTGGACAACGTTTCGGTGAGATGGAGGTATGGGCACTTGAAGCATATGG TGCTGCTTATACTTTACAAGAAATCTTAACTTATAAATCTGACGATACAGTAG GACGTGTTAAAACTTACGAATCTATCGTTAAAGGTGAAAACATCTCTAGACC AAGTGTTCCTGAGTCATTCCGAGTACTGATGAAAGAATTACAAAGTTTAGGA TTAGATGTTAAAGTAATGGATGAGCATGATAATGAAATTGAAATGGCAGATG TTGATGATGAAGATGCAACGGAACGCAAAGTAGATTTACAACAAAAAAATGC TCCGGAATCACAAAAAGAAACAACTGATTAATAAGCACTTAAGATAAATGAA TACTTAAAGGGTATGAAATGATTATCATTTCAACTTCTTTAGGTATTCGATTT CAATGAAAGTAATCAATCAAATAGCACAGCTAATCTAAATTGAAGGAGGTAG GCTCCTTGATTGATGTAAATAATTTCCATTATATGAAAATAGGATTAGCTTCA CCTGAAAAGATTCGTTCTTGGTCATATGGTGAAGTTAAGAAACCTGAAACAA TAAACTATCGTACTTTAAAGCCAGAAAAAGATGGTCTTTTCTGTGAAAGAATT TTCGGACCTACAAAAGACTGGGAAATTTTTAA-3'
SEQ ID N°4 : Séquence du gène rpoB de Staphylococcus lugdunensis Cette séquence mesure 3.855 paires de bases et possède un contenu en cytosine plus guanosine de 36,4% est déposée dans GenBank sous le numéro GenBank accession AF325870.
5'ATGTCTTATGATTGGTTCCTAAAAGAAGGTTTACTAGAAATGTTCCGTGAT ATCTCACCAATTGAAGATTTCACAGGTAACCTATCATTAGAGTTTGTAGATTA CAGATTAGGTGAACCAAAGTATGATTTAGAAGAATCGAAAAATCGTGACGCT ACTTATGCTGCACCTCTTCGTGTTAAAGTGCGTCTCGTTATAAAAGAAACAG GTGAAGTTAAAGAGCAAGAAGTATTTATGGGAGACTTCCCATTAATGACAGA TACAGGTACGTTTGTTATTAATGGTGCAGAGCGTGTTATTGTATCGCAATTA GTACGTTCACCATCCGTTTACTTTAATGAAAAAATTGACAAAAACGGACGAG AAAATTATGATGCTACAATCATTCCTAACCGTGGTGCCTGGTTAGAATACGA AACAGATGCTAAAGATGTTGTCTATGTTCGTATTGATAGAACTCGTAAATTG CCATTAACTGTCTTATTACGCGCATTAGGCTTTTCAACTGATCAAGAAATTGT TGAGTTGTTAGGCGATAACGAATACTTGCGTAATACATTAGAAAAAGACGGA ACAGAAAACACTGAACAAGCGTTATTAGAAATTTATGAACGTTTACGTCCTG GTGAACCACCAACAGTTGAAAATGCAAAAAGTTTATTATATTCTCGCTTCTTC GATCCGAAACGCTATGATTTAGCAAGCGTTGGACGTTATAAAGCGAACAAAA AATTGCATCTAAAACACCGTTTATTTAATCAAAAATTAGCAGAGCCTATCGTA AACAGCGAAACAGGTGAAATTGTTGCTGAAGAAGGTACTGTATTAGATCGTC GCAAATTAGACGAAATTATGGACGTTCTTGAAACAAATGCGAATAGTGAAGT ATTCGAATTAGAAGGAACAGTAATAGACGAACCGGTTGAAATTCAATCAATC AAAGTCTATGTACCAAATGATGAAGAAGGTTGTACAACAACGATAATTGGTA ATGCTTTACCAGATTCAGAAGTGAAATGTATCACACCTGCAGATATTATTTCT TCTATGAGTTACTTCTTCAACTTATTAGCTGGCATTGGTTACACGGATGATAT CGATCATTTAGGTAACCGTCGTTTACGTTCAGTTGGTGAGTTATTGCAAAAC CAATTCCGTATTGGTTT(SEQ ID N°7)ATCAAGAATGGAACGTGTTGTGCGT GAAAGAATGTCAATTCAAGATACCGAATCTATCACACCACAACAATTAATTAA TATTAGACCAGTTATTGCATCAATTAAAGAATTCTTTGGTAGTTCTCAATTAT CACAATTCATGGACCAAGC(SEQIDN°9)TAACCCATTAGCAGAATTAACACA CAAACGTCGTTTATCTGCGTTAGGACCTGGTGGTTTAACACGTGAACGTG CACAAATGGAAGTTCGTGACGTGCATTATTCTCACTATGGCCGTATGTGTC CGATTGAAACACCAGAGGGTCCAAACATTGGTTTGATTAACTCATTATCTA GTTATGCGCGTGTCAACGAGTTTGGCTTTATTGAAACGCCTTATCGTAAAG TAGATATTGATACAAATGCAATCACAGATCAAATTGACTACTTAACTGCTG ATGAAGAAGACAGTTATGTCGTTGCACAAGCGAACTCTCGCCTTGATGAA AATGGTCGTTTCTTAGATGATGAAGTAGTATGCCGTTTCCGCGGTAATAAT ACTGTTATGGCTAAAGAAAAAATGGACTACATGGATGTATCTCCTAAACAA GTTGTTTCAGCTGCGACAGCATGTATTCCATTCTTAGAGAACGATGACTCT AACCGTGCATTGATGGGTGCAAACATGCAACGTCAAGCAGTTCCGTTGAT GAACCCTGAAGCGCCGTTCGTAGGAACAGGTATGGAGCATGTTGC(SEQ1D N°1 OJTGCTCGTGACTCTGGTGCTGCGATTACTGCAAAATACAGAGGTCGTGT AGAACACGTTGAATCTAATGAAATCCTAGTGCGTCGATTAATTGAAGAAAAT GGAAAAGAATATGAAGGCGAACTTGATCGCTATCCATTAGCGAAGTTTAAAC GCTCTAACTCTGGTACATGTTATAACCAACGTCCAATTGTTTCTATTGGCGA CGTTGTAGAATACAATGAAATTCTAGCTGACGGTCCATCAATGGAGCTTGGT GAAATGGCATTAGGCCGCAACGTTGTAGTTGGTTTCATGACTTGGGACGGf SEQIDN°8)CTATAACTATGAAGATGCTGTCATCATGAGTGAACGTTTAGTCAA AGATGACGTTTACACATCTATTCATATTGAAGAATATGAATCAGAAGCACGT GATACGAAATTAGGACCTGAGGAAATCACACGTGATATTCCTAACGTCTCTG AAAGTGCACTTAAAAACTTAGACGATCGCGGTATTGTTTATGTAGGTGCAGA AGTTAAAGATGGCGATATTTTAGTAGGTAAAGTAACGCCTAAAGGTGTCACA GAGCTAACAGCTGAAGAACGTCTATTACATGCAATCTTTGGTGAAAAAGCAC GTGAAGTGCGTGACACTTCATTGCGTGTACCACATGGTGCTGGCGGTATTG TGCTAGATGTTAAAGTCTTCAACCGTGAAGAAGGAGATGACACACTTTCTCC AGGTGTTAACCAATTAGTACGCGTATATATTGTGCAGAAACGTAAAATACAC GTTGGGGACAAAATGTGTGGTCGTCATGGTAACAAAGGTGTCATTTCTAAG ATTGTTCCAGAAGAGGACATGCCTTATTTACCAGATGGACGTCCAATTGATA TTATGTTAAACCCACTTGGTGTGCCATCACGTATGAACATTGGACAAGTTCT AGAGTTGCATTTAGGTATGGCTGCTAAAAACTTAGGTATTCATGTTGCGTCA CCAGTATTTGATGGTGCGAACGATGAAGATGTATGGTCAACAATTGAAGAA GCTGGTATGGCACGTGACGGTAAAACCGTATTATATGATGGCCGTACAGGT GAGCCATTCGACAACCGTATCTCAGTTGGAGTTATGTACATGCTTAAACTTG CACATATGGTTGATGACAAATTACATGCTCGTTCAACAGGTCCATACTCATT AGTTACACAACAACCACTTGGTGGTAAAGCACAATTTGGTGGACAACGTTTC GGTGAGATGGAAGTATGGGCACTTGAAGCTTATGGTGCTGCCTATACATTG CAAGAAATCCTTACTTATAAATCTGATGATACGGTAGGCCGTGTTAAAACAT ACGAAGCTATCGTTAAAGGTGAAAACATTTCTAGACCAAGTGTTCCTGAATC ATTCCGTGTATTGATGAAAGAACTTCAAAGTTTAGGTTTAGATGTGAAAGTG ATGGATGAGCACGATAACGAAATCGAAATGGCAGATGTTGAAGATGAAGAT ACAACAGAGCGCAAAGTAGATTTGCAACAAAAAGATGCGCCACAATCTCAA CAAGAAGAAACTGCTGATTAGTCAATATATTAGATATAAGGAATGGTGTTAG GAACAAGTGCTACGGATGTTTAAACATAATGTGTTTTGAGTTGCATCCATCC TAACCTTTCCTTAATTTCAATAGATGTAAATCAATCAAATGGCACAGCTAATC TAAATTGAAGGAGGTAGGCTCCTTGATTGATGTAAATAATTTCCATTATATGA AAATCGGTTTAGCCTCACCTGAAAAAATTCGTTCATGGTCATATGGTGAAGT GAAAAAACCAGAAACAATTAATTATCGTACGTTAAAACCAGAAAAAGATGGC TTATTCTGTGAGAGAATATTCGGCCCAACTAAAGATTGGGAATGTAGTTGTG GTAAATACAAACGTGTGCGTTATAAAGGCATGGTTTGTGATAGATGTGGTGT TGTAA - 3'
SEQ ID N°5 : Séquence du gène rpoB de Staphylococcus caprae Cette séquence mesure 3.698 paires de bases et possède un contenu en cytosine plus guanosine de 37,4% est déposée dans GenBank sous le numéro GenBank accession AF325868.
5'ATGAAACTTAATAGAAATTCAAACTAAATCTTACGATTGGTTCCTTAAAGAA GGTTTATTAGAAATGTTTAGAGACATTTCTCCAATTGAAGATTTCACAGGTAA CCTATCTTTAGAATTTGTAGATTATAGATTAGGTGATCCGAAATACGATTTAG AAGAATCTAAAAACCGTGACGCTACTTATGCTGCACCTCTTCGTGTGAAAGT ACGTCTCATTATTAAAGAAACAGGCGAAGTGAAGGAACAAGAAGTCTTCATG GGTGATTTCCCATTAATGACTGACACAGGTACATTCGTTATCAATGGTGCTG AACGTGTTATCGTTTCTCAATTAGTACGTTCACCATCCGTTTATTTCAACGAG AAAATTGATAAAAATGGACGCGAAAACTACGATGCAACTATCATTCCTAACC GTGGTGCTTGGTTAGAATATGAAACAGATGCGAAAGATGTAGTATACGTTCG TATCGATAGAACTCGTAAATTACCATTGACAGTATTATTACGTGCACTAGATT TCTCAACTGATCAAGAAATTGTTGATTTACTAGGTGAGAGTGAATATTTACGT AATACATTAGAAAAAGATGGTACTGAAAATACTGAACAAGCATTATTAGAAAT TTATGAACGTTTACGTCCTGGCGAACCACCAACAGTTGAAAATGCTAAAAGC TTATTATACTCACGCTTCTTCGACCCTAAACGTTATGATTTAGCAAGTGTTGG TCGTTACAAAGCTAACAAAAAGTTACATTTAAAACACCGTTTATTTAATCAAA AATTAGCAGAACCTATTGTTAATAGTGAAACAGGTGAGATTGTAGCTGAAGA AGGTACTGTATTAGATCGTCGTAAAATTGACGAAATCATGGACGTTTTAGAA ACAAACGCTAACAGTGAAGTTTTCGAATTAGAAGGTAGCGTTATTGACGAAC CTGTTGAAATTCAATCAATTAAAGTCTATGTACCTAATGATGAAGAAGGTCG CACAACTACTGTAATTGGTAATGCATTACCAGATTCAGAAGTTAAATGTATTA CTCCAGCTGATATCATTGCGTCAATGAGTTATTTCTTCAACTTATTAAATGGT ATTGGTTATACAGATGATATCGACCACTTAGGTAACCGTCGTTTACGTTCAG TTGGTGAACTTTTACAGAACCAATTCCGTATCGGTTT(SEQIDN°7)ATCAAG AATGGAACGTGTTGTTCGTGAAAGAATGTCTATTCAAGACACTGATTCAATC ACACCACAACAATTAATCAACATTCGTCCGGTTATTGCGTCTATTAAAGAATT CTTCGGAAGTTCACAATTATCGCAATTCATGGACCAAGC(SEQIDN°9)TAAC CCATTAGCTGAGTTGACTCATAAACGTCGTCTATCAGCATTAGGACCTGGT GGTTTAACGCGTGAACGTGCCCAAATGGAAGTGCGTGACGTTCACTATTC TCACTATGGCCGTATGTGTCCAATCGAAACACCTGAGGGACCAAACATTG GTTTAATCAACTCATTATCAAGTTATGCACGAGTAAATGAATTTGGTTTTAT TGAAACACCTTATCGTAAAGTAGATTTAGATACGAATTCTATCACTGACCA AATTGATTACTTAACTGCTGATGAAGAAGATAGTTATGTTGTTGCCCAAGC GAACTCTCGTTTAGACGAAAATGGTCGTTTCTTAGATGACGAAGTTGTTTG TCGTTTCCGTGGTAATAACACAGTTATGGCTAAAGAGAAAATGGACTACAT GGATGTATCTCCTAAACAAGTAGTATCTGCAGCGACAGCTTGTATTCCATT CTTAGAAAATGATGACTCTAACCGTGCATTAATGGGTGCGAACATGCAAC GTCAAGCAGTACCATTGATGAATCCAGAAGCGCCATTTGTTGGTACAGGT ATGGAACATGTAGC(SEQ1DN°10)CGCACGTGATTCAGGTGCAGCGATTACT GCTAAACATAGAGGACGCGTTGAACACGTTGAATCTAACGAAGTATTAGTAC GTCGTTTAGTAGAAGAAAACGGCACTGAACATGAAGGTGAATTAGATCGTTA CCCATTAGCTAAATTCAAACGTTCAAACTCTGGTACATGTTATAACCAACGT CCAATTGTTTCTGTTGGTGATGTAGTAGAATACAATGAAATTTTAGCTGACG GTCCTTCAATGGAATTAAGGTTGAAATGGCATAGGGACGTAACGTTGTTAGT TGGTTTCATGACTTGGGACGG(SEQIDN°8)TTATAACTACGAGGATGCTGTTA TCATGAGTGAACGTTTAGTTAAAGATGACGTTTATACTTCTATTCACATTGAA GAATATGAATCTGAAGCTCGTGATACTAAGTTAGGACCTGAAGAAATTACTC GTGACATTCCTAACGTATCTGAAAGTGCACTTAAAAACTTAGACGATCGCGG TATCGTTTATGTTGGTGCTGAAGTTAAAGACGGTGACATCTTAGTAGGTAAA GTAACGCCTAAAGGTGTAACTGAATTAACAGCTGAAGAAAGATTATTACATG CTATCTTCGGTGAAAAGGCTCGTGAAGTCCGCGATACATCATTACGTGTAC CACATGGTGCAGGCGGTATCGTTCTAGATGTTAAAGTATTCAATCGTGAAGA AGGCGATGATACGTTATCTCCAGGTGTAAACCAATTGGTACGTGTTTATATC GTTCAAAAACGTAAAATTCATGTAGGGGACAAAATGTGTGGTCGTCACGGTA ACAAAGGTGTTATCTCTAAAATTGTTCCTGAAGAAGATATGCCATACTTACCA GATGGTCGTCCAATCGACATCATGTTAAACCCACTTGGTGTACCATCACGTA TGAACATCGGACAAGTACTTGAGTTGCATTTAGGTATGGCTGCTAAGAACTT AGGCATCCATGTAGCATCTCCAGTATTCGATGGTGCAAACGATGATGATGTA TGGTCAACAATTGAAGAAGCAGGTATGGCTCGTGATGGTAAAACTGTATTAT ACGATGGACGTACAGGTGAACCATTCGATAACCGTATTTCTGTAGGTGTCAT GTACATGCTTAAACTTGCTCACATGGTTGACGATAAATTACACGCACGTTCA ACTGGACCATACTCACTTGTTACACAACAACCACTTGGTGGTAAAGCACAAT TCGGTGGTCAACGCTTCGGTGAGATGGAGGTATGGGCACTTGAAGCATATG GTGCTGCATACACATTACAAGAAATCTTAACTTATAAATCTGACGATACAGTA GGTCGTGTTAAAACTTACGAATCTATCGTTAAAGGTGAAAATATCTCTAGAC CAAGTGTTCCAGAATCATTCAGAGTATTGATGAAAGAATTACAAAGTTTAGG ATTAGATGTTAAAGTGATGGACGAGCAAGACAACGAAATTGAAATGGCGGA CGTTGATGATGAAGATGCAACTGAACGCAAAGTAGATTTACAACAAAAAAAT GCTCCCGAATCACAAAAAGAAACAACTGATTAATAAGCACTTAAGATAAATG AATCCTAAAGAGGTTATGAGATGGTTGCCATTTCAACCTCTTTAAGGTATTC GATTTCAATGAATGTAAATCAATCAAATAGCACAGCTAATCTAAATTGAAGGA GGTAGGCTCCTTGATTGATGTAAATAATTTCCATTATATGAAAATAGGATTAG CTTCACCTGAAAAAATTCGTTCTTGGTCTTATGGTGAAGTTAA - 3'
SEQ ID N°6 : Séquence du gène rpoB de Staphylococcus intermedius Cette séquence mesure 3.851 paires de bases et possède un contenu en cytosine plus guanosine de 39,2%, elle est déposée dans GenBank sous le numéro GenBank accession AF325869).
5'ATGTAAACTTAATAGAAATTCMAACTAAATCGTATGATTGGTTCTTAAAAGA AGGTTTATTAGAAATGTTCCGTGATATTTCTCCTATTGAAGACTTCACGGGTA ATCTTTCATTAGAATTTGTTGATTATAGATTAGGTGAACCAAAGTATGATTTA GAAGAATCAAAAAACCGTGATGCAACATACGCGGCACCATTACGTGTGAAA GTTCGTTTAATCATTAAAGAAACAGGCGAAGTGAAAGATCAAGAAGTATTTA TGGGTGATTTCCCATTAATGACAGAAACAGGTACTTTTGTGATTAACGGGGC AGAACGTGTTATCGTATCACAATTAGTCCGTTCACCATCTGTATACTTCAATG AAAAATTAGATAAAAACGGATGCGTGAATTATGATGCGACAGTCATTCCTAA CCGTGGTGCTTGGTTGGAATATGAAACAGATGCGAAAGATGTCGTTTATGT GCGTATCGATAGAACGAGAAAGTTACCATTAACAGTATTATTACGTGCGTTA GGTTATTCAACAGACCAAGAAATTATTGAATTAATTGGGGATAATGAATATTT ACGTAATACATTAGAAAAAGATAGCACAGAAAATACAGAGCAAGCATTACTT GAAATTTATGAACGTTTACGTCCAGGTGAACCACCTACTGTAGAAAACGCAA AAAGCTTATTATACTCACGTTTCTTTGACCCTAAACGTTATGATTTAGCAAGC GTTGGACGTTATAAAGCAAACAAAAAGTTACATTTAAAACACCGCCTATTCA ATCAAAAATTAGCTGAACCGATCGTTAATACTGAAACAGGCGAAATTGTTGC TGAAGAAGGCACTGTTTTAGATCGTCGTAAATTAGATGAAATTATGGACGTT CTTGAAACAAATGCGAATGCACAAGTTTATGAACATTCCAAACGGATCATTG ATGAGCCAGTAGAAATTCAATCAATTAAAGTATATGTACCGAATGATGATGA AGAACGTACAACAACAGTTATTGGTAATGCATTCCCAGATTCAGAAGTGAAA TGTATTACACCGGCTGATATTGTGGCATCTATGTCATACTTCTTCAACCTATT ACATGGTATTGGTTACACAGACGATATTGACCACCTTGGTAACCGCCGTCTA CGTTCAGTTGGTGAGTTGTTACAAAACCAATTCCGTATCGGTTT(SEQIDN°7) ATCAAGAATGGAACGTGTGGTACGTGAAAGAATGTCTATTCAAGATACAGAC TCTATCACACCGCAACAATTAATTAATATTCGTCCAGTGATTGCATCAATTAA AGAGTTCTTTGGTAGCTCGCAATTATCTCAATTCATGGACCAAGC(SEQ ID N°9)GAACCCACTTGCTGAGTTGACTCACAAACGTCGTCTATCAGCATTAGG ACCTGGTGGTTTAACGCGTGAACGTGCTCAAATGGAAGTGCGTGACGTAC ACTACTCTCACTATGGTCGTATGTGTCCAATCGAAACACCTGAGGGACCA AACATTGGTTTGATCAACTCATTATCTAGTTATGCACGTGTGAACGAATTT GGTTTTATCGAAACACCATATCGTAAAGTTGATATTGAAACAAATACGATT ACTGACCAAATCGACTACTTAACTGCTGATGAAGAAGATAGTTATGTTGTC GCACAAGCGAACTCACGTCTTGATGAAAACGGTCGCTTTATTGATGATGA GATTGTATGTCGTTTCCGTGGTAACAACACAACGATGGCGAAAGAAAAAA TGGACTACATGGACGTATCGCCGAAACAAGTTGTATCAGCTGCGACAGCG TGTATCCCATTCTTAGAAAACGATGACTCTAACCGTGCGTTAATGGGTGCG AACATGCAGCGTCAAGCGGTACCGTTGTTAAACCCTGAATCTCCATTTGTA GGTACAGGTATGGAACACGTTGCfSEQIDN°10)TGCACGTGACTCAGGTGCT GCTGTCATTTCTAAATATCGCGGTCGTGTTGAACATGTCCAATCTAGCGAGA TTTTAGTCCGTCGTTTAGTTGAAGAAAACGGTCAAGAAGTAGATGGTACGTT AGATCGTTATCCATTAGCGAAATTTAAACGTTCGAACTCAGGTACATGTTATA ACCAACGTCCAATCATCGCAAAAGGTGACATTGTGGAAAAAGGCGAAATCC TTGCTGATGGTCCTTCAATGGAACTTGGTGAAATGGCATTAGGTCAGAAAC GTAGTAGTTGGTTCATGACTTGGGACGG(SEQIDN°8)TTATAACTATGAGGAT GCCGTTATCATGAGTGAACGTTTGGTTAAAGATGATGTGTACACGTCTATTC ATATTGAAGAATACGAATCAGAAGCGCGTGACACAAAACTTGGACCTGAAG AAATCACACGTGATATTCCTAACGTATCTGAAAATGCACTGAAAAACTTAGAT GATCGCGGTATCGTTTATGTAGGTGCGGAAGTTAAAGACGGCGACATCTTA GTGGGTAAAGTAACGCCAAAAGGTGTAACAGAATTAACTGCAGAAGAACGT TTATTACATGCAATCTTTGGTGAAAAAGCACGTGAAGTACGTGATACATCAT TACGTGTACCTCACGGCGCGGGCGGTATTGTACTTGATGTTAAAGTGTTCA ATCGTGAAGAAGGCGATGATTCACTTTCACCAGGTGTGAACCAACTCGTAC GTGTTTACATTGTTCAAAAACGTAAAATTCATGTAGGGGACAAAATGTGTGG TCGTCACGGTAACAAAGGTGTCATCTCTAAAATTGTTCCTGAAGAAGACATG CCGTACTTACCAGACGGTCGTCCAATCGACATCATGTTGAACCCACTCGGT GTACCATCTCGTATGAACATCGGACAAGTTTTAGAGCTCCACTTAGGTATGG CAGCTAAAAACTTAGGTATCCACGTTGCATCACCAGTATTCGATGGTGCGAA CGATGATGACGTATGGTCTACAATTGAAGAAGCAGGTATGGCACGTGATGG TAAAACTGTCCTTTACGATGGACGTACAGGTGAACCATTCGACAACCGTATC TCTGTAGGTGTCATGTACATGCTGAAACTTGCACACATGGTTGATGACAAGC TTCACGCACGTTCTACAGGACCTTACTCACTTGTTACACAACAACCGCTTGG TGGTAAAGCACAGTTTGGTGGACAAAGATTTGGTGAGATGGAGGTATGGGC ACTTGAAGCATACGGTGCAGCATACACATTACAAGAAATCCTCACATACAAA TCAGATGACACAGTAGGTCGTGTGAAAACTTACGAAGCTATCGTTAAAGGT GAAAACATCTCAAGACCAAGTGTTCCTGAATCATTCCGCGTATTGATGAAAG AATTACAAAGTTTAGGTCTTGACGTTAAAGTGATGGACGAACAAGATAACGA AATTGAAATGCGTGACTTAGACGATGATGATATTCCAGATCGCAAAGTCAAC ATTCAACCATCAACTGTTCCTGAATCACAAAAAGAATTTAACGAATAATGATG AATTGTAGATAAGATTAAACGGAATAGAAACACTTGGTTAAGCTTGAGTTTG TGTTCAAATGTGACAGTTGAAATACAACAGATGTCATGTACGATTAATCTATT CGGAAATGTGATCGGAATCCAACGAGAGGGCTTGGGTTTCGATGCATATCC GATACTGCAACATTTTTAAGATAAATTGTAAATCAATCAACTAGCACAGTTAA TTTAAACTAAAGGAGGTAGGCTCCTTGATTGATGTAAATAAATTCCATTACAT GAAAATAGGACTCGCTTCACCTGAAAAAATTCGTTCTTGGTCATATGGTGAG GTCAAAAAGCCAGAAACAATTAACTACCGTACGTTAAAACCAGAAAAAGATG GTAA - 3'
Cette séquence mesure 3.852 paires de bases et possède un contenu en cytosine plus guanosine de 39,2%, elle est déposée dans GenBank sous le numéro GenBank accession AF325869.
Exemple 2 : Séquençage partiel du gène rpoB de 26 espèces du genre Staphylococcus.
L'alignement de la séquence rpoB déterminée chez les bactéries des espèces Staphylococcus aureus, Staphylococcus lugdunensis (GenBank accession AF325870), Staphylococcus intermedius (GenBank accession AF325869), Staphylococcus saccharolyticus (GenBank accession AF325871) et Staphylococcus caprae (GenBank accession AF325868) a permis de déterminer les séquences consensus des oligonucléotides suivants positionnés respectivement en position 2491-2511 et 3554-3573 du gène rpoB chez Staphylococcus aureus :
- SEQ ID n°7 : 5'- AACCAATTCCGTATNGGTTT - 3'(où N représente l'inosine)
- SEQ ID n°8= 5'- CCGTCCCAAGTCATGAAAC - 3' déterminant théoriquement l'amplification d'un fragment de 1.063 paires de bases chez toute espèce du genre Staphylococcus. SEQ.ID. n°8 est utilisée à titre d'amorce 3' et représente donc la séquence inverse complémentaire du brin direct représenté dans les séquences SEQ.ID. n° 3 à 6 en position 3554-3573 chez Staphylococcus aureus.
Les inventeurs ont déterminé la position de ces deux amorces SEQ.ID. n° 7 et SEQ.ID. n° 8, de façon à respecter les critères suivants :
1- séquence encadrée par ces deux amorces spécifiques de l'espèce de la bactérie. Cette condition est vérifiée après alignement des fragments de 1063 pb avec l'ensemble des séquences des gènes bactériens rpoB disponibles dans les banques de données informatiques. 2- recherche d'une région d'identification la plus courte possible afin d'augmenter le plus possible la sensibilité de la détection moléculaire
3- recherche d'une région proche de celle préalblement travaillée par les inventeurs dans le monde des entérobactéries [Mollet C. (1997) Mol. Microbiol., 26 :1005-11] afin de tendre vers une zone de travail commune à ces deux genre et famille bactériens.
4- la longueur des amorces de 18 à 22 pb,
5- séquence des amorces présentant une température de fusion voisine,
6- séquence des amorces ne permettant pas d'auto-hybridation ni de complémentarité. L'analyse in silico laissait prévoir que ces deux oligonucléotides SEQ ID n°7 et SEQ ID n°8 devaient permettre l'amplification par procédé PCR un fragment de 1 .063 paires de bases du gène rpoB chez toutes les espèces du genre Staphylococcus. En réalité, l'amorce de la séquence SEQ.ID. n° 8 n'accrochait par sur une espèce rare et pour des raisons indéterminées. En effet, les expériences réalisées au laboratoire ont montré que l'espèce du genre : Staphylococcus schleiferi n'était pas amplifié par cette paires d'amorces oligonucleotidiques, montrant le caractère aléatoire des prédictions réalisées sur les amorces. Les inventeurs ont donc par tâtonnement déterminé un nouvel oligonucleotide de séquence SEQ ID n°10 positionné en position 3241 -3261 dans Staphylococcus aureus, qui combiné avec l'oligonucleotide SEQ ID n°7 dans une réaction d'amplification PCR, a effectivement permis d'obtenir un amplicon du gène rpoB d'une taille de 771 paires de bases (taille pour l'espèce de référence Staphylococcus aureus) chez les 29 espèces du genre Staphylococcus testées par les inventeurs.
SEQ ID n°10 = 5'- GCIACITG ITCCATACCTGT - 3' SEQ.ID. n° 10 est utilisée à titre d'amorce 3'. C'est pourquoi elle correspond à la séquence inverse complémentaire des séquences du brin direct représenté sur les séquences SEQ.ID. n°3 à 6.
Ce produit d'amplification est ensuite séquence par incorporation de deux amorces de séquençage SEQ ID n°9 (localisée en position 2643-2660 du gène rpoB dans les bactéries de l'espèce Staphylococcus aureus) et SEQ ID n°10 : SEQ ID n° 9 = 5'- CAA TTC ATG GAC CAA GC - 3',
Cette dernière amorce a été déterminée pour respecter les contraintes d'une amorce de séquençage, c'est à dire d'une taille supérieure à 15 mères, ne s'hybridant pas avec la deuxième amorce utilisée pour le séquençage, et encadrant une zone d'en général environ 500 paires de bases dont la séquence est spécifique de chaque espèce dans le genre Staphylococcus.
En utilisant ce second jeu d'oligonucléotides de séquences SEQ ID n°9 / SEQ ID n°10, les inventeurs ont donc finalement pu déterminer la séquence partielle du gène rpoB chez 29 espèces du genre Staphylococcus présentées ci- après (SEQ ID n° 11 à SEQ ID n°39). Le fragment du gène rpoB a été amplifié par la technique PCR utilisant 35 cycles d'amplification comportant chacun une phase de dénaturation de 94°C pendant 10 secondes, une phase d'hybridation des amorces SEQ ID n° 7 et 8 ou SEQ ID n°7 et 10 à 52°C pendant 20 secondes et une phase d'elongation à 72°C pendant 60 secondes. Le produit d'amplification est visualisé après coloration par le bromure d'éthidium.
Les bactéries représentant ces 29 espèces du genre Staphylococcus sont les suivantes :
ATCC, collection American Tissue Culture Collection ; CIP : Collection de l'Institut Pasteur collection ; τ, souche type.
Les fragments d'en général environ 500 paires de bases du gène rpoB des bactéries des espèces du genre Staphylococcus dont la séquence est spécifique de chaque espèce de ce genre et permettant donc l'identification moléculaire des bactéries des 29 espèces testées sont : SEQ ID N°11 : Séquence partielle du gène rpoB chez Staphylococcus xylosus, mesurant 518 paires de bases :
5TTCAGGGTTCATCAATGGCACTGCTTGACGTTGCATGTTTGCACCCATCAA TGCACGGTTAGAGTCATCATTTTCTAAGAAAGGAATACATGCTGTCGCAGCA GAAACAACTTGTTTTGGTGAAACGTCCATGTAATCCATTTTTTCTTTAGCCAT AACTGTGTTATTACCACGGAAACGACAAACAACTTCATCATCTAAGAAACGA CCATTTTCATCTAATTTAGAGTTGGCTTGTGCTACCACATAACTATCCTCTTC ATCAGCTGTTAAGTAATCGATTTGCTCAGTAATGCTGTTTGTTTCAAGGTCTA CTTTACGATAAGGTGTTTCAATGAAACCAAATTCATTCACACGTGCATAACTA GACAATGAGTTGATAAGTCCAATGTTTGGACCTTCAGGCGTTTCGATTGGAC ACATACGGCCATAGTGAGAATAGTGAACGTCACGTACTTCCATTTGAGCAC GTTCACGTGTTAAACCACCAGGTCCTAGAGCAGATAAACGACGTTTGT - 3'
SEQ ID N°12 : Séquence partielle du gène rpoB Staphylococcus warneri mesurant 507 paires de bases :
5'TTCAGGATTCATCAATGGTACTGCTTGACGTTGCATGTTCGCACCCATTAA TGCACGGTTAGAGTCATCGTTTTCTAAGAATGGAATACAAGCTGTAGCGGCT GAAACAACCTGCTTAGGTGAAACGTCCATGTAATCCATTTTTTCTTTAGCCAT TACTGTGTTATTACCACGGAAACGACAAACTACTTCGTCATCTATGAAACGT CCGTTTTCATCTAAACGTGAATTCGCTTGGGCAACAACATAACTATCTTCTTC GTCAGCAGTTAAATAATCAATTTGGTCTGTAATCGCATTAGTGTCTAAATCCA CTTTACGATATGGTGTTTCAATGAAACCAAATTCGTTTACACGTGCATAACTA GATAATGAGTTGATTAATCCAATGTTTGGACCCTCTGGCGTTTCAATTGGAC ACATACGACCATAGTGAGAATAGTGTACGTCACGTACCTCCATTTGTGCACG TTCACGTGTTAAACCACCAGGTCCTAAAGCAGATAA - 3'
SEQ ID N°13 : Séquence partielle du gène rpoB Staphylococcus simulans, mesurant 518 paires de bases : 5'TTCAGGGTTCATCAATGGTACTGCTTGACGTTGCATGTTCGCACCCATTAA CGCACGGTTAGAGTCATCGTTTTCTAAGAATGGGATACATGCTGTCGCTGC AGATACAACTTGTTTAGGAGAAACGTCCATATAGTCCATTTTCTCTCTATCCA TAGTTGTGTTGTTACCACGGAAACGACAAACGATTTCTTCGTCTAAGAAACG ACCTTCGTCATCTAAACGTGAGTTCGCTTGCGCAACAACATAGCTGTCTTCT TCGTCTGCAGTAAGGTAATCGATTTGATCTGTTACCGCATTTTTCTCATGGT CAACTTTACGATATGGTGTTTCAATGAAACCAAATTCATTAACACGCGCATAA CTTGATAATGAGTTGATTAAACCGATGTTCGGACCCTCTGGTGTCTCGATTG GACACATACGGCCATAGTGAGAGTAATGCACGTCACGTACTTCCATTTGTG CACGTTCACGTGTTAAACCACCAGGTCCAAGTGCAGATAGACGACGTTTAT - 3'
SEQ ID N°14 : Séquence partielle du gène rpoB chez Staphylococcus sciuri, mesurant 507 paires de bases :
5TTCTGGGTTCATTAAAGGTACCGCTTGACGTTGCATGTTTGCACCCATAAG CGCACGGTTAGAGTCATCGTTTTCTAAGAATGGAATACATGCTGTCGCTGCA GAAACAACTTGTTTAGGAGATACATCCATGTAGTCCATGCGTTCTTTAGGTT TAGTAGTGTTGTCCCCACGGAAACGACAAAGAACTTCATCATCAACGAATTT ACCTGTTTCATCAAGTACAGAGTTTGCTTGTGCAACTACATAGCTGTCTTCTT CGTCAGCTGTTAAGTAGTCGATTCTGTCAGTAACTTGGTTTGTCTCGATGTT TACCTTACGATAAGGTGTTTCAATGAAACCAAATTCATTAACTCTTGCATAAC TTGATAATGAGTTGATTAAACCAATGTTTGGTCCCTCAGGCGTTTCAATTGG ACACATACGACCATAGTGAGAGTAGTGAACGTCACGTACTTCCATACCAGC ACGCTCACGAGTTAAACCACCCGGTCCTAATGCTGATAG - 3'
SEQ ID N°15 : Séquence partielle du gène rpoB chez Staphylococcus schleiferi, mesurant 518 paires de bases : 5TTCTGGGTTTAACAATGGTACTGCTTGACGTTGCATGTTCGCACCCATCAA TGCACGGTTAGAGTCATCGTTTTCTAAAAACGGAATACATGCTGTCGCAGCT GAAACAACTTGTTTAGGCGATACGTCCATGTAGTCCATTTTTTCTTTAGCCAT AGTTGTGTTGTTACCACGGAAACGACAAACGATTTCGTCATCGATAAAACGT CCGTTTTCATCAAGTCTTGAGTTCGCTTGGGCAACAACATAACTGTCTTCTT CATCAGCAGTAAGGTAATCAATACGGTCTGTAATTGTGTTTGTTTCAAGGTC TACTTTTCTGTATGGAGTTTCAATGAAACCAAATTCATTCACACGTGCATAAC TTGAAAGTGAGTTGATCAAACCAATGTTTGGACCCTCTGGTGTCTCGATTGG ACACATACGGCCATAGTGAGAATAGTGTACGTCACGAACTTCCATTTGTGCA CGTTCACGTGTTAAACCACCAGGCCCTAAAGCTGATAAACGACGTTTGT- 3' SEQ ID N°16 : Séquence partielle du gène rpoB chez Staphylococcus saprophyticus, mesurant 518 paires de bases.
5TTCTGGATTCATCAATGGCACTGCTTGACGTTGCATGTTCGCACCCATCAA TGCACGGTTAGAGTCATCGTTTTCTAAGAAAGGAATACATGCTGTCGCTGCA GAAACAACTTGTTTAGGTGAGACATCCATATAATCCATTTTTTCTTTGGCCAT AACTGTATTATTACCACGGAAACGACAAACAACTTCGTCTGCTATGAAACGG CCATTTTCGTCTAATGTTGAGTTTGCTTGTGCTACAACATAGCTATCTTCTTC ATCAGCTGTTAAATAGTCAATTTGATCCGTGATTGAATTCGTTTCAAGATCCA CTTTACGGTAAGGTGTTTCAATAAAGCCGAATTCATTTACACGCGCATAACT AGATAACGAGTTAATAAGTCCGATGTTTGGACCCTCTGGCGTTTCAATTGGA CACATACGGCCATAGTGAGAATAGTGAACGTCACGTACTTCCATTTGAGCA CGTTCACGCGTTAAACCACCAGGTCCTAGAGCTGATAAACGACGTTTAT - 3'
SEQ ID N°17 : Séquence partielle du gène rpoB chez Staphylococcus saccharolyticus, mesurant 556 paires de bases :
5'AAACCCATTAGCTGAGTTGACTCATAAACGTCGTTTATCAGCTCTAGGACC TGGTGGTTTAACTCGTGAACGCGCTCAAATGGAAGTACGTGACGTGCATTA TTCTCACTACGGTCGTATGTGCCCTATTGAAACACCTGAGGGCCCAAACATT GGATTAATTAACTCATTATCTAGTTATGCAAGAGTAAATGAATTTGGTTTTAT TGAAACACCTTATCGTAAAGTTGATTTAGATACTAATTCAATCACTGACCAAA TTGACTACTTAACTGCTGATGAAGAAGATAGTTATGTTGTTGCACAAGCAAA CTCACGTCTTGATGAAAATGGGTGCTTCTTAGATGATGAAGTTGTTTGTCGT TTTCGTGGCAATAACACAGTGATGGCTAAAGAAAAAATGGACTATATGGACG TATCACCTAAACAAGTAGTTTCAGCAGCTACTGCATGTATCCCATTCTTAGA AAACGATGACTCAAACCGAGCATTAATGGGTGCAAACATGCAACGTCAAGC AGTACCATTAATGAACCCAGAAGCGCCATTTGTTGGA - 3'
SEQ ID N°18 : Séquence partielle du gène rpoB chez Staphylococcus pulveris, mesurant 508 paires de bases : 5TTCAGGATTCATTAAAGGCACTGCTTGACGTTGCATGTTTGCACCCATAAG CGCACGGTTAGAGTCATCGTTTTCTAAGAAAGGAATACATGCTGTCGCAGC AGAAACAACCTGTTTAGGTGATACATCCATGTAATCCATACGTTCTTTAGGTT TCGTAGTATTATCCCCACGGAAACGACAAAGTACTTCATCATCAACGAATTT ACCTGTTTCATCAAGTACTGAGTTTGCTTGCGCTACAACATAGCTGTCTTCT TCGTCAGCTGTTAAATAGTCAATTCTGTCAGTAACTTGGTTTGTTTCGATATT AACCTTACGATAAGGCGTTTCAATAAAACCAAATTCATTAACTCTCGCATAAC TTGATAAAGAGTTAATTAAACCGATGTTTGGTCCCTCAGGTGTTTCAATTGG ACACATACGACCATAGTGAGAATAGTGAACGTCACGTACTTCCATACCAGCA CGTTCACGAAGTTAAACCGCCGGGTCCTAATGCTGATAG - 3'
SEQ ID N°19 : Séquence partielle du gène rpoB chez Staphylococcus muscae, mesurant 518 paires de bases : 5TTCAGGATTCAACAATGGCACCGCTTGACGTTGCATGTTCGCACCCATTAA GGCACGGTTAGAGTCATCGTTTTCTAAGAATGGAATACATGCTGTCGCAGC AGAAACAACTTGCTTCGGCGATACGTCCATGTAGTCCATTTTCTCTTTTGCC ATTGTTGTGTTGTTACCACGGAAACGACATACAATCTCATCATCAATAAAGC GACCATTTTCATCTAAACGTGAGTTCGCTTGTGCAACCACATAACTATCTTCT TCATCAGCAGTTAAATAGTCGATTTGATCAGTGATTGTGTTCGTCTCGATAT CAACTTTACGATATGGTGTTTCAATGAAACCAAATTCATTAACACGTGCATAA CTAGATAGTGAGTTGATCAAACCAATGTTCAGTCCCTCTGGTGTCTCAATCG GACACATACGACCATAGTGAGAGTAGTGAACGTCACGCACTTCCATTTGTG CACGTTCACGTGTCAAACCACCAGGCCCTAATGCTGAAAGACGACGCTTAT - 3'
SEQ ID N°20 : Séquence partielle du gène rpoB chez Staphylococcus lugdunensis, mesurant 556 paires de bases : 5TAACCCATTAGCAGAATTAACACACAAACGTCGTTTATCTGCGTTAGGACC TGGTGGTTTAACACGTGAACGTGCACAAATGGAAGTTCGTGACGTGCATTA TTCTCACTATGGCCGTATGTGTCCGATTGAAACACCAGAGGGTCCAAACATT GGTTTGATTAACTCATTATCTAGTTATGCGCGTGTCAACGAGTTTGGCTTTAT TGAAACGCCTTATCGTAAAGTAGATATTGATACAAATGCAATCACAGATCAA ATTGACTACTTAACTGCTGATGAAGAAGACAGTTATGTCGTTGCACAAGCGA ACTCTCGCCTTGATGAAAATGGTCGTTTCTTAGATGATGAAGTAGTATGCCG TTTCCGCGGTAATAATACTGTTATGGCTAAAGAAAAAATGGACTACATGGAT GTATCTCCTAAACAAGTTGTTTCAGCTGCGACAGCATGTATTCCATTCTTAG AGAACGATGACTCTAACCGTGCATTGATGGGTGCAAACATGCAACGTCAAG CAGTTCCGTTGATGAACCCTGAAGCGCCGTTCGTAGGA- 3'
SEQ ID N°21 : Séquence partielle du gène rpoB chez Staphylococcus lentus, mesurant 507 paires de bases :
5TTCAGGGTTCATTAAAGGTACTGCTTGACGTTGCATGTTCGCACCCATTAA GGCACGGTTAGAGTCATCGTTTTCAAGGAAAGGAATACATGCTGATGGTGC AGAAACAACTTGTTTAGGAGATACATCCATGTAATCCATACGTTCTTTAGGTT TAGTAGTGTTGTCACCACGGAAACGACAAAGAACTTCATCGTCGACGAATCT ACCAGTTTCATCTAATACTGAGTTTGCTTGTGCAACAACATAACTATCTTCTT CATCAGCAGTTAGATAATCAATTCTGTCTGTTACTTGGTTAGTTTCGATATTA ACTTTACGATATGGTGTTTCAATAAAGCCAAACTCGTTAACTCTAGCATAACT TGAAAGTGAGTTGATTAAACCAATGTTTGGTCCCTCTGGTGTCTCAATCGGA CACATACGACCATAGTGAGAATAGTGAACGTCACGTACTTCCATACCAGCA CGTTCACGAGTTAAACCGCCGGGTCCAAGCGCTGATAG - 3'
SEQ ID N°22 : Séquence partielle du gène rpoB chez Staphylococcus kloosii, mesurant 505 paires de bases : 5TTCACGGTTCATCAATGGTACCGCTTGACGTTGCATGTTCGCACCCATTAA GGCACGGTTAGAGTCATCGTTTTCTAAGAAAGGAATACATGCTGTCGCAGC CGAAACAACTTGTTTTGGTGATACGTCCATGTAGTCCATTTTTTCTTTCGCCA TAACTGTGTTGTTACCACGGAAACGACAAACTACTTCATCATCTAAGAAACG ACCATTTTCATCTAATTTAGAGTTAGCTTGCGCTACCACATAGCTATCTTCTT CATCAGCTGTTAAATAGTCAATTTGATCTGTGATTGAATTAGTTTCTAAATCA ACTTTACGGTATGGTGTTTCGATAAAGCCAAATTCATTAACACGTGCATAAC TTGATAATGAGTTGATAAGTCCAATGTTTGGACCCTCTGGCGTTTCGATTGG ACACATACGACCATAGTGAGAATAGTAACGTCACGCACTTCCATTTGAGCAC GTTCACGAGTTAAACCACCAGGTCCAAGCCAGATAG - 3'
SEQ ID N°23 : Séquence partielle du gène rpoB chez Staphylococcus intermedius, mesurant 556 paires de bases :
5'GAACCCACTTGCTGAGTTGACTCACAAACGTCGTCTATCAGCATTAGGAC CTGGTGGTTTAACGCGTGAACGTGCTCAAATGGAAGTGCGTGACGTACACT ACTCTCACTATGGTCGTATGTGTCCAATCGAAACACCTGAGGGACCAAACAT
TGGTTTGATCAACTCATTATCTAGTTATGCACGTGTGAACGAATTTGGTTTTA
TCGAAACACCATATCGTAAAGTTGATATTGAAACAAATACGATTACTGACCA
AATCGACTACTTAACTGCTGATGAAGAAGATAGTTATGTTGTCGCACAAGCG
AACTCACGTCTTGATGAAAACGGTCGCTTTATTGATGATGAGATTGTATGTC
GTTTCCGTGGTAACAACACAACGATGGCGAAAGAAAAAATGGACTACATGG
ACGTATCGCCGAAACAAGTTGTATCAGCTGCGACAGCGTGTATCCCATTCTT
AGAAAACGATGACTCTAACCGTGCGTTAATGGGTGCGAACATGCAGCGTCA
AGCGGTACCGTTGTTAAACCCTGAATCTCCATTTGTAGGT - 3'
SEQ ID N°24 : Séquence partielle du gène rpoB chez Staphylococcus hyicus, mesurant 518 paires de bases :
5'CTCTGGGTTCAATAAAGGCACGGCTTGACGTTGCATGTTCGCACCCATTA ATGCACGGTTCGAGTCATCGTTTTCTAAGAATGGGATACATGCTGTCGCCG CAGAAACAACTTGTTTCGGTGATACGTCCATGTAATCCATTTTTTCTTTAGCC ATTGTTGTATTGTTCCCACGGAAACGACAAACGATTTCGTCGTCGATAAAGC GTCCATTTTCATCTAAACGTGAGTTCGCTTGGGCAACAACATAACTGTCTTC TTCATCCGCAGTTAAGTAATCAATTTGATCTGTTATTGTATTCGTTTCAAGGT CCACTTTACGGTAAGGCGTTTCAATGAAACCAAATTCGTTAACACGCGCATA ACTTGAAAGTGAGTTGATTAATCCAATGTTTGGACCCTCTGGCGTTTCGATT GGACACATACGACCGTAGTGAGAGTAGTGAACGTCACGCACTTCCATTTGG GCACGTTCACGCGTTAAACCACCAGGTCCTAATGCAGATAAACGACGTTTG G - 3'
SEQ ID N°25 : Séquence partielle du gène rpoB chez Staphylococcus hominis, mesurant 518 paires de bases :
5TTCAGGATTCATCAATGGTACTGCTTGACGTTGCATGTTCGCACCCATTAA CGCACGGTTAGAGTCATCGTTTTCAAGGAATGGAATACAAGCTGTCGCTGC TGATACTACTTGTTTAGGAGATACATCCATGTAGTCCATTTTTTCTTTTGCCA TAACAGTGTTGTTACCACGGAAACGACATACCACTTCATCATCTAGGAAACG ACCATTTTCATCTAAACGAGAATTGGCTTGTGCAACTACATAGCTATCTTCTT CATCAGCAGTTAAATAATCAATTTGATCAGTAATCGAATTGGTATCAATATCT ACTTTACGATATGGTGTTTCGATAAAACCAAATTCATTTACACGTGCATAACT AGATAATGAGTTAATTAAACCAATGTTTGGTCCCTCTGGTGTTTCAATTGGA CACATACGACCATAGTGAGAATAGTGTACGTCACGAACTTCCATTTGTGCAC GTTCACGTGTTAAACCACCAGGTCCTAAAGCAGAAAGACGACGTTTAG - 3'
SEQ ID N°26 : Séquence partielle du gène rpoB chez Staphylococcus haemolyticus, mesurant 507 paires de bases :
5'TTCTGTGTTCATCAATGGTACTGCtTGACGTTGCATGTTTGCACCCATTAAT GCACGGTTAGAGTCATCATTTTCAAGGAAAGGAATACATGCTGTCGCAGCT GAAACTACTTGTTTAGGAGATACGTCCATGTAGTCCATTTTCTCTTTAGCCAT AACTGTGTTATTACCACGGAAACGACATACGACTTCATCATCTAAGAAACGA CCATTTTCATCTAAGCGAGAGTTCGCTTGGGCAACTACATAGCTATCTTCTT CATCAGCAGTTAAGTAGTCGATTTGATCTGTAATAGAGTTAGTGTCTAAGTC TACTTTACGATATGGTGTTTCAATGAAACCAAATTCATTCACACGTGCATAAC TTGATAATGAGTTAATCAAACCAATGTTTGGTCCCTCTGGAGTCTCGATCGG ACACATACGACCATAGTGAGAGTAGTGAACGTCACGTACTTCCATTTGAGCA CGTTCACGTGTTAAACCACCAGGTCCTAATGCAGAAAG - 3'
SEQ ID N°27 : Séquence partielle du gène rpoB chez Staphylococcus gallinarum, mesurant 507 paires de bases : 5TTCAGGATTCATCAAAGGTACAGCTTGACGTTGCATGTTCGCACCCATCAA TGCACGGTTAGAGTCATCGTTTTCTAAGAAAGGAATACATGCTGTCGCAGCA GATACAACCTGTTTAGGTGATACATCCATGTAGTCCATTTTTTCTTTTGCCAT TACAGTGTTGTTACCACGGAAACGACAAACGACTTCATCTTCTACGAAACGA CCATTTTCATCTAATACAGAGTTTGCTTGTGCTACTACATAACTGTCTTCTTC ATCAGCTGTTAAGTAGTCAATTTGATCTGTAATAGATTGTGTTTCAATATCAA CTTTACGATATGGTGTTTCAATGAAACCAAATTCATTTACACGCGCATAACTT GATAATGAGTTGATAAGTCCGATGTTTGGACCCTCAGGTGTTTCGATTGGAC ACATACGGCCATAGTGAGAATAGTGAACGTCACGTACTTCCATTTGAGCAC GTTCACGAGTTAAACCACCAGGTCCTAATGCTGATAG - 3' SEQ ID N°28 : Séquence partielle du gène rpoB chez Staphylococcus felis, mesurant 518 paires de bases :
5TTCGGGATTCATTAAAGGTACAGCTTGACGTTGCATGTTCGCACCCATTAA TGCACGGTTAGAGTCATCGTTTTCTAAGAATGGGATACATGCCGTCGCAGC AGAAACGACTTGCTTAGGCGATACGTCCATGTAGTCCATTTTTTCTTTGGCC ATCGTTGTATTGTTTCCGCGGAAACGACATACAATCTCGTCATCCAAGAAAC GGCCTTCTTCGTCTAATCGTGCGTTTGCTTGTGCAACAACATAACTATCTTC TTCATCAGCTGTAAGATAGTCAATTTGGTCTGTAATTTTATTTGTCTCAAGAT CGACTTTACGATATGGTGTTTCGATAAATCCAAATTCGTTAACACGTGCATA ACTTGATAATGAGTTGATTAATCCGATGTTCGGCCCCTCTGGCGTTTCAATA GGACACATGCGACCATAGTGAGAGTAGTGAACGTCACGCACTTCCATCTGT GCACGTTCTCTCGTTAAACCACCAGGTCCTAATGCGGATAGACGACGTTTAT - 3' SEQ ID N°29 : Séquence partielle du gène rpoB chez Staphylococcus equorum, mesurant 507 paires de bases :
5TTCAGGATTCATCAATGGCACTGCTTGACGTTGCATGTTTGCACCCATCAA TGCACGGTTAGAGTCATCGTTTTCTAAGAAAGGAATACATGCTGTCGCAGCA GAAACAACTTGTTTAGGTGAAACATCCATGTAGTCCATTTTTTCTTTAGCCAT AACTGTGTTATTACCACGGAAACGACAAACAACTTCGTCTTCTACGAAACGA CCATTTTCATCTAATACAGAGTTTGCTTGAGCTACTACATAGCTGTCTTCTTC GTCAGCTGTTAAGTAGTCAATTTGGTCTGTGATTGAATGTGTTTCAAGATCT ACTTTACGGTAAGGTGTTTCAATGAAACCAAATTCATTCACACGCGCATAAC TAGATAGTGAGTTGATAAGTCCGATATTCGGACCCTCTGGTGTTTCGATTGG ACACATACGACCATAGTGAGAATAGTGAACGTCACGTACTTCCATTTGAGCA CGTTCACGTGTTAAACCGCCGGGTCCTAATGCTGATAA - 3'
SEQ ID N°30 : Séquence partielle du gène rpoB chez Staphylococcus epidermidis, mesurant 518 paires de bases : 5TTCAGGATTCATTAAAGGCACCGCTTGACGTTGCATGTTTGCTCCCATTAA CGCACGGTTAGAGTCGTCATTTTCTAAGAATGGAATACATGCTGTTGCTGCT GAAACAACTTGTTTTGGTGATACGTCCATGTAATCCATTTTTTCTTTAGCCAT AACAGTGTTATTACCACGGAAACGACAAACAACTTCATCATCTAAGAAACGA CCATTTTCATCAAGTCTAGAATTAGCCTGTGCAACAACGTAGCTATCCTCTT CATCAGCTGTCAAATAATCTATTTGATCAGTGATTGAGTTTGTATCTAAATCC ACTTTACGATATGGCGTTTCAATAAAACCAAATTCATTCACTCTAGCATAACT TGACAATGAGTTTATTAAACCAATATTAGGACCCTCAGGTGTTTCAATTGGA CACATACGCCCATAGTGAGAGTAGTGAACGTCACGCACTTCCATTTGAGCA CGTTCACGTGTTAATCCACCAGGCCCTAGAGCAGATAAACGACGTTTGT - 3'
SEQ ID N°31 : Séquence partielle du gène rpoB chez Staphylococcus cohnii, mesurant 507 paires de bases : 5'TTCTGGATTCATCAATGGGACTGCTTGACGTTGCATGTTCGCACCCATTAA TGCACGGTTAGAGTCATCGTTTTCTAAGAATGGAATACATGCTGTTGCTGCA GAAACAACCTGTTTAGGAGATACATCCATGTAATCCATTTTTTCTTTTGCCAT AACTGTGTTATTACCACGGAAACGACAAACAACTTCATCATCTAAGAAGCGA CCATTTTCATCTAACTTAGAATTTGCTTGTGCTACTACATAGCTATCTTCTTC GTCAGCTGTTAAATAATCAATTTGATCTGTGATACTATTCGTTTCAAGATCTA CTTTACGATATGGCGTTTCAATGAAACCAAATTCATTTACACGTGCATAACTT GATAATGAGTTAATCAAACCAATGTTTGGTCCCTCTGGTGTTTCGATTGGAC ACATACGACCGTAGTGAGAGTAGTGAACGTCACGCACTTCCATTTGAGCAC GTTCACGTGTTAAACCACCAGGTCCTAATGCTGATAG - 3'
SEQ ID N°32 : Séquence partielle du gène rpoB chez Staphylococcus chromogenes, mesurant 507 paires de bases :
5'CTCAGGATTTAACAAAGGCACCGCTTGACGTTGGATGTTCGCACCCATTA ACGCACGGTTAGAGTCATCGTTTTCTAAGAACGGAATACATGCAGTTGCCG CAGAAACAACTTGCTTCGGTGATACGTCCATGTAATCCATTTTTTCTTTAGCC ATTGTTGTATTGTTCCCACGGAAACGACAAACGATTTCGTCGTCGATAAAGC GTCCATTTTCATCTAAACGTGAGTTCGCTTGGGCAACAACATAACTGTCTTC TTCGTCCGCAGTTAAATAATCAATTTGATCAGTAATTGCGTTCGTTTCAAGGT CTACTTTACGATACGGCGTTTCAATAAAACCAAATTCATTAACACGCGCATA ACTTGAAAGTGAGTTGATTAATCCAATATTTGGACCCTCTGGTGTTTCGATT GGACACATACGACCGTAGTGAGAATAGTGAACGTCACGCACTTCCATTTGA GCACGTTCACGTGTTAAACCACCTGGTCCTAAAGCAGATAA - 3' SEQ ID N°33 : Séquence partielle du gène rpoB chez Staphylococcus carnosus, mesurant 1.025 paires de bases :
5TTCTGGATTCATCAATGGTACCGCTTGACGTTGCATGTTCGCACCCATTAA TGCACGGTTAGAGTCATCGTTTTCTAAGAATGGGATACAAGCTGTCGCAGC TGATACTACTTGTTTTGGTGATACGTCCATGTAGTCCATTTTGTCTCTGTCCA TCATTGTGTTGTTACCACGGAAACGACAAACAACTTCTTCGCTGATGAAGTG ACCTTCATCATCTAAACGAGAGTTCGCTTGGGCTACAACATAGCTGTCTTCT TCGTCAGCTGTTAGATAGTCGATTTGATCAGTTACAGTATTAGTTTCAAGGT CAACTTTACGGTATGGTGTTTCAATAAAACCGAACTCGTTAACACGTGCATA ACTTGATAATGAGTTGATCAAACCAATGTTTGGACCCTCAGGAGTTTCGATT GGACACATACGGCCATAGTGAGAATAGTGAACGTCACGTACTTCCATTTGA GCACGTTCACGAGTTAAACCACCAGGTCCTAATGCAGATAATTCTGGATTCA TCAATGGTACTGCTTGACGTTGCATGTTCGCACCCATTAATGCACGGTTAGA GTCATCATTTTCTAAGAATGGAATACAAGCTGTCGCTGCAGATACTACTTGT TTAGGAGATACATCCATGTAGTCCATTTTCTCTTTAGCCATAACTGTGTTATT ACCACGGAAACGACAAACAACTTCGTCATCTAAGAAACGACCATTTTCGTCT AAACGAGAGTTCGCTTGGGCAACAACATAACTATCTTCTTCATCAGCAGTTA AGTAATCAATTTGGTCAGTGATAGAATTCGTATCTAAATCTACTTTACGATAA GGTGTTTCAATAAAACCAAATTCATTTACTCGTGCATAACTTGATAATGAGTT GATTAAACCAATGTTTGGTCCCTCAGGTGTTTCGATTGGACACATACGGCCA TAGTGAGAATAGTGAACGTCACGCACTTCCATTTGGGCACGTTCACGCGTT AAACCACCAGGTCCTAATGCTGATAGACGACGTTTAT - 3'
SEQ ID N°34 : Séquence partielle du gène rpoB chez Staphylococcus capitis, mesurant 518 paires de bases :
5TTCAGTGTTCATCAATGGTACCGCTTGACGTTGCATGTTCGCACCCATTAA TGCACGGTTAGAGTCATCGTTTTCTAAGAATGGAATACATGCTGTAGCTGCT GATACAACTTGTTTAGGTGATACGTCCATGTAATCCATTTTTTCTTTTGCCAT AACTGTGTTATTACCACGGAAACGACAAACAACCTCGTCATCTAAGAAACGA CCATTTTCGTCTAAACGTGAGTTGGCTTGGGCAACTACATAGCTATCTTCTT CATCAGCAGTTAAGTAATCGATTTGATCTGTGATAGAGTTCGTATCTAAATCA ACTTTACGATACGGTGTCTCGATGAAACCAAATTCATTTACTCGCGCATAAC TTGATAATGAGTTAATTAAACCAATATTTGGACCCTCTGGTGTTTCAATTGGA CACATACGACCATAGTGTGAGTAATGAACGTCACGTACTTCCATTTGAGCAC GTTCACGAGTTAAACCACCAGGTCCTAATGCTGATAGACGACGTTTTG - 3'
SEQ ID N°35 : Séquence partielle du gène rpoB chez Staphylococcus auricularis, mesurant 507 paires de bases :
5TTCTGGGTTCATTAAAGGTACCGCTTGACGTTGCATGTTTGCACCCATAAG CGCACGGTTAGAGTCATCGTTTTCTAAGAATGGAATACATGCTGTCGCTGCA GAAACAACTTGTTTAGGAGATACATCCATGTAGTCCATGCGTTCTTTAGGTT TAGTAGTGTTGTCCCCACGGAAACGACAAAGAACTTCATCATCAACGAATTT ACCTGTTTCATCAAGTACAGAGTTTGCTTGTGCAACTACATAGCTGTCTTCTT CGTCAGCTGTTAAGTAGTCGATTCTGTCAGTAACTTGGTTTGTCTCGATGTT TACCTTACGATAAGGTGTTTCAATGAAACCAAATTCATTAACTCTTGCATAAC TTGATAATGAGTTGATTAAACCAATGTTTGGTCCCTCAGGCGTTTCAATTGG ACACATACGACCATAGTGAGAGTAGTGAACGTCACGTACTTCCATACCAGC ACGCTCACGAGTTAAACCACCCGGTCCTAATGCTGATAG - 3'
SEQ ID N°36 : Séquence partielle du gène rpoB chez Staphylococcus aureus, mesurant 518 paires de bases : 5TTCTGGATTCATCAAAGGCACTGCTTGACGTTGCATGTTCGCACCCATCAA TGCACGGTTTGAGTCATCATTTTCTAAGAATGGAATACATGCTGTCGCTGCT GAAACAACTTGCTTCGGCGATACATCCATATAATCCATTTTTTCTTTAGCCAT AACTGTGTTGTTACCACGGAAACGACATACAACTTCATCATCCATGAAACGA CCATTTTCATCTAATTTAGAGTTTGCTTGTGCTACAACATAGCTATCTTCTTC GTCAGCTGTTAAATAGTCAATTTGATCAGTGATAGCATGTGTATCTAAATCAA CTTTACGATATGGTGTTTCAATAAAGCCGAATTCATTTACACGTGCATAACTT GATAATGAGTTAATCAATCCAATGTTTGGTCCCTCAGGTGTTTCAATTGGAC ACATACGGCCATAGTGAGAGTAGTGAACGTCACGTACTTCCATTTGAGCAC GTTCACGTGTTAAACCACCAGGTCCTAATGCTGATAGACGACGTTTAT - 3' SEQ ID N°37 : Séquence partielle du gène rpoB chez Staphylococcus aureus anaerobius, mesurant 507 paires de bases :
5TTCTGGATTCATCAAAGGCACTGCTTGACGTTGCATGTTCGCACCCATCAA TGCACGGTTTGAGTCATCATTTTCTAAGAATGGAATACATGCTGTCGCTGCT GAAACAACTTGCTTCGGCGATACATCCATATAATCCATTTTTTCTTTAGCCAT AACTGTATTGTTACCACGGAAACGACATACAACTTCATCATCCATGAAACGA CCATTTTCATCTAATTTAGAGTTTGCTTGTGCTACAACATAGCTATCTTCTTC GTCAGCTGTTAAATAGTCAATTTGATCAGTGATAGCATGTGTATCTAAATCAA CTTTACGATATGGTGTTTCAATAAAGCCGAATTCATTTACACGTGCATAACTT GATAATGAGTTAATCAATCCAATGTTTGGTCCCTCAGGTGTTTCAATTGGAC ACATACGGCCATAGTGAGAGTAGTGAACGTCACGTACTTCCATTTGAGCAC GTTCACGTGTTAAACCACCAGGTCCTAATGCCGATAG - 3'
SEQ ID N°38 : Séquence partielle du gène rpoB chez Staphylococcus arlettae, mesurant 518 paires de bases :
5TTCACGGTTCATCAACGGTACTGCTTGACGTTGCATGTTCGCACCCATTAA TGCACGGTTAGAGTCATCGTTTTCTAAGAAAGGAATACATGCCGTTGCAGCT GAAACTACTTGCTTAGGTGATACGTCCATGTAGTCCATTTTTTCTTTAGCCAT AACTGTGTTATTACCGCGGAAACGACAAACAACTTCGTCATCTAAAAACTTA CCATTTTCATCTAAGTTAGAGTTGGCTTGTGCTACCACATAGCTGTCCTCTT CATCAGCAGTTAGGTAATCAATTTGATCTGTAATTGAGTTTGTTGCTAAATCT ACTTTACGGTACGGCGTTTCGATAAAGCCAAATTCATTTACACGTGCATAAC TTGATAGTGAGTTAATTAAACCGATGTTTGGTCCCTCTGGTGTTTCGATAGG ACACATACGGCCATAGTGAGAATAGTGTACGTCACGTACTTCCATTTGAGCA CGTTCACGTGTTAAACCACCAGGTCCTAATGCTGATAAACGACGTTTAT-3'
SEQ ID N°39 : Séquence partielle du gène rpoB chez Staphylococcus caprae, mesurant 556 paires de bases :
5TAACCCATTAGCTGAGTTGACTCATAAACGTCGTCTATCAGCATTAGGACC TGGTGGTTTAACGCGTGAACGTGCCCAAATGGAAGTGCGTGACGTTCACTA TTCTCACTATGGCCGTATGTGTCCAATCGAAACACCTGAGGGACCAAACATT GGTTTAATCAACTCATTATCAAGTTATGCACGAGTAAATGAATTTGGTTTTAT TGAAACACCTTATCGTAAAGTAGATTTAGATACGAATTCTATCACTGACCAAA TTGATTACTTAACTGCTGATGAAGAAGATAGTTATGTTGTTGCCCAAGCGAA CTCTCGTTTAGACGAAAATGGTCGTTTCTTAGATGACGAAGTTGTTTGTCGT TTCCGTGGTAATAACACAGTTATGGCTAAAGAGAAAATGGACTACATGGATG TATCTCCTAAACAAGTAGTATCTGCAGCGACAGCTTGTATTCCATTCTTAGA AAATGATGACTCTAACCGTGCATTAATGGGTGCGAACATGCAACGTCAAGC AGTACCATTGATGAATCCAGAAGCGCCATTTGTTGGT-3'
Exemple 3. Identification en aveugle d'une collection de 20 souches bactériennes comprenant 10 souches de bactéries appartenant au genre Staphylococcus.
Une collection de vingt souches appartenant aux espèces bactériennes suivantes: Staphylococcus aureus (souche sensible à la rifampicine), Staphylococcus aureus (souche résistante à la rifampicine), Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus haemolyticus, Staphylococcus saprophyticus, Staphylococcus intermedius, Staphylococcus equorum, Staphylococcus schleiferi, Staphylococcus lugdunensis, Staphylococcus gallinarum, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Streptococcus pneumoniae, Enterococcus faecalis, Steptococcus pyogenes, Corynebacterium amycolatum, Gemella morbilorum, Acinetobacter anitratus, Micrococcus luteus et Propionibacterium acnés a été codée de façon à réaliser une identification moléculaire en aveugle (l'expérimentateur ne connaissant pas a priori l'identité des souches) des souches selon le procédé décrit dans la présente demande de brevet. L'extraction des acides nucléiques ainsi que l'amplification du fragment de 751 paires de bases du gène rpoB ont été réalisées comme décrits dans l'exemple n°2 en incorporant les amorces SEQ ID N°7 (comme amorce 5') et SEQ ID N°10 (comme amorce 3') dans une amplification PCR (Fig. 1). Le séquençage de ces 10 amplifiats a été réalisé en incorporant dans la réaction de séquençage les amorces SEQ ID N°9 (amorce 5') et SEQ ID N°10 (amorce 3') comme décrit dans l'exemple n°2 et la comparaison des séquences obtenues avec les séquences de la banque de données des séquences SEQ.ID. n° 11 à 39 a permis d'identifier les dix souches amplifiées comme étant : Staphylococcus aureus, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus haemolyticus, Staphylococcus saprophyticus, Staphylococcus intermedius, Staphylococcus equorum, Staphylococcus schleiferi, Staphylococcus lugdunensis et Staphylococcus gallinarum. Le décodage de ces 20 souches a montré 100% de concordance entre l'identification moléculaire selon le procédé faisant l'objet de la présente invention et l'identification établie antérieurement par les méthodes phénotypiques standard. Ce résultat illustre la spécificité des jeux d'amorces SEQ ID N°7/SEQ ID N°10 et SEQ ID N°9/SEQ ID N°10 utilisés pour ce travail et le fait que le niveau de sensibilité des souches de Staphylococcus aureus à la rifampicine n'interfère pas avec l'identification de ces souches.
Les autres bactéries choisies pour ce qu'elles sont fréquemment isolées dans les prélèvements cliniques humains ou animaux susceptibles de contenir également des bactéries du genre Staphylococcus, n'ont pas été amplifiées, démontrant ainsi la spécificité des amorces utilisées pour le genre Staphylococcus dans les conditions d'utilisation pour la détection des bactéries du genre Staphylococcus selon l'invention. par rapport aux bactéries d'un autre genre.
Sur la figure 1 sont représentés les produits d'amplification PCR obtenus à partir de quinze souches bactériennes codées, comportant 10 souches appartenant au genre Staphylococcus (colonnes 2 à 5, 8, 9, 11 à 13 et 16) et 5 souches bactériennes de genres bactériens autres que Staphylococcus (colonnes 6, 7,10,14 et 15). Les colonnes 1 et 17 représentent le marqueur de poids moléculaire. Des colonnes correspondant aux témoins négatifs d'amplification (eau stérile) et à d'autres souches autres que Staphylococcus ne sont pas représentées. Les produits d'amplification sont obtenus après incorporation des amorces SEQ ID N°7 et SEQ ID N°10 selon l'invention et sont visualisés par coloration au bromure d'éthidium après électrophorèse sur un gel d'agarose.

Claims

REVENDICATIONS
1. Gène ou fragment de gène rpoB d'une bactérie du genre Staphylococcus, caractérisé en ce qu'il comprend une séquence telle que décrite dans les séquences SEQ.ID. n° 11 à 29 et 31 à 39, les séquences inverses et séquences complémentaires.
2. Gène rpoB d'une des bactéries Staphylococcus saccharolyticus, Staphylococcus lugdunensis, Staphylococcus caprae, et Staphylococcus intermedius selon la revendication 1 , caractérisé en ce qu'il correspond à l'une des séquences telles que décrites dans les séquences SEQ.ID. n° 3 à 6.
3. Fragment d'un gène rpoB d'une bactérie du genre Staphylococcus, caractérisé en ce qu'il consiste dans l'une des séquences SEQ.ID. n° 11 à 39 et les séquences inverses et séquences complémentaires.
4. Oligonucleotide caractérisé en ce qu'il comprend une séquence d'au moins 12, de préférence de 12 à 35, motifs nucléotidiques consécutifs incluse dans l'une des séquences SEQ.ID. n° 7 à 10, dans lesquelles N représente un nucleotide choisi parmi l'inosine et un mélange équimolaire de 4 nucléotides différents choisis parmi A, T, C ou G, et les oligonucléotides de séquences inverses et séquences complémentaires.
5. Oligonucléotides selon la revendication 4, caractérisé en ce qu'ils consistent dans les séquences SEQ.ID. n° 7 à 10, et les séquences inverses et séquences complémentaires dans lesquelles N représente l'inosine.
6. Procédé de détection par identification moléculaire d'une bactérie de l'une des espèces du genre Staphylococcus caractérisé en ce qu'on utilise :
- le gène rpoB de ladite bactérie, ou un fragment dudit gène selon l'une des revendications 1 à 3, ou
- un oligonucleotide selon l'une des revendications 4 ou 5.
7. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce qu'on utilise :
- un fragment du gène rpoB de ladite bactérie selon la revendication 3, ou
- un oligonucleotide selon la revendication 5.
8. Procédé selon l'une des revendications 6 ou 7, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes dans lesquelles :
1 - on met en contact au moins une sonde de genre comprenant un dit oligonucleotide selon la revendication 4 ou 5, avec un échantillon contenant ou susceptible de contenir des acides nucléiques d'au moins une telle bactérie du genre Staphylococcus, et
2- on détermine la formation ou l'absence de formation d'un complexe d'hybridation entre ladite sonde de genre et les acides nucléiques de l'échantillon, et on détermine ainsi la présence de ladite bactérie dans l'échantillon s'il y a formation d'un complexe d'hybridation.
9. Procédé selon l'une des revendications 7 ou 8, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes dans lesquelles :
1- on met en contact les amorces d'amplification comprenant desdits oligonucléotides selon la revendication 4 ou 5 avec un échantillon contenant ou susceptible de contenir des acides nucléiques d'au moins une telle bactérie du genre Staphylococcus, et avec :
- comme amorce 5', un oligonucleotide choisi parmi les oligonucléotides comprenant une séquence incluse dans l'une des séquences SEQ.ID. n° 7 ou 9 ou les séquences complémentaires, de préférence lesdites séquences complètes, et
- comme amorce 3' un oligonucleotide comprenant une séquence incluse dans l'une des séquences SEQ.ID. n° 10 ou 8, ou respectivement une séquence complémentaire, de préférence lesdites séquences complètes. 2- on réalise une amplification d'acides nucléiques par réaction de polymérisation enzymatique et on détermine l'apparition ou l'absence d'un produit d'amplification, et on détermine ainsi la présence de ladite bactérie dans l'échantillon si un produit d'amplification est apparu.
10. Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce qu'on utilise : - comme amorce 5' : l'une des séquences SEQ.ID. N° 7 ou 9 ou une séquence complémentaire, et
- comme amorce 3' : la séquence SEQ.ID. N° 10 ou respectivement une séquence complémentaire.
11. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce qu'on cherche à détecter spécifiquement une espèce donnée d'une bactérie du groupe
Staphylococcus choisie parmi les espèces :
Staphylococcus xylosus, Staphylococcus warneri, Staphylococcus simulans,
Staphylococcus sciuri, Staphylococcus schleiferi, Staphylococcus saphrophyticus, Staphylococcus saccharolyticus, Staphylococcus pulveris, Staphylococcus muscae, Staphylococcus lugdunensis, Staphylococcus lentis, Staphylococcus kloosii, Staphylococcus intermedius, Staphylococcus hyicus, Staphylococcus hominis, Staphylococcus haemolyticus, Staphylococcus gallinarum, Staphylococcus felis, Staphylococcus equorum, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus cohni, Staphylococcus chromogenes, Staphylococcus carnosus, Staphylococcus capitis, Staphylococcus auricularis, Staphylococcus aureus subs. aureus, Staphylococcus aureus subs. anaerobius, Staphylococcus arlettae, Staphylococcus caprae, procédé dans lequel :
1- on met en contact un échantillon contenant ou susceptible de contenir des acides nucléiques d'au moins une telle bactérie, avec au moins une sonde d'espèce consistant dans un fragment de gène selon la revendication 1 ou 3, de préférence un oligonucleotide consistant respectivement dans l'une desdites séquences SEQ.ID. n° 11 à 39, les séquences inverses et séquences complémentaires, et
2- on détermine la formation ou l'absence d'un complexe d'hybridation entre ladite sonde et les acides nucléiques de l'échantillon, et on détermine ainsi la présence de ladite bactérie dans l'échantillon s'il y a formation d'un complexe d'hybridation.
12. Procédé selon l'une des revendications 6 ou 7 , caractérisé en ce qu'on cherche à détecter une espèce donnée d'une bactérie du genre Staphylococcus choisie parmi les espèces : Staphylococcus xylosus, Staphylococcus warneri, Staphylococcus simulans, Staphylococcus sciuri, Staphylococcus schleiferi, Staphylococcus saphrophyticus, Staphylococcus saccharolyticus, Staphylococcus pulveris, Staphylococcus muscae, Staphylococcus lugdunensis, Staphylococcus lentis, Staphylococcus kloosii, Staphylococcus intermedius, Staphylococcus hyicus, Staphylococcus hominis, Staphylococcus haemolyticus, Staphylococcus gallinarum, Staphylococcus felis, Staphylococcus equorum, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus cohni, Staphylococcus chromogenes, Staphylococcus carnosus, Staphylococcus capitis, Staphylococcus auricularis, Staphylococcus aureus subs. aureus, Staphylococcus aureus subs. anaerobius, Staphylococcus arlettae, Staphylococcus caprae, procédé dans lequel, dans un échantillon contenant ou susceptible de contenir des acides nucléiques d'au moins une telle bactérie du genre Staphylococcus, on effectue les étapes dans lesquelles : a) on réalise une réaction de séquençage d'un fragment du gène rpoB amplifié d'une dite bactérie donnée à l'aide des amorces nucléotidiques consistant dans des oligonucléotides comprenant une séquence incluse dans les séquences SEQ.ID. n°7 ou 9 comme amorce 5' et SEQ.ID.n0 10 comme amorce
3', de préférence des oligonucléotides consistant dans lesdites séquences
SEQ.ID. n° 7 ou 9 et 10, et lesdites séquences complémentaires, et b) on détermine la présence ou l'absence de l'espèce donnée de ladite bactérie en comparant la séquence dudit fragment obtenu avec la séquence du gène complet rpoB de ladite bactérie ou la séquence d'un fragment du gène rpoB de ladite bactérie comprenant respectivement lesdites séquences n° 1 1 à
39 et séquences complémentaires, et on détermine ainsi la présence de ladite bactérie dans l'échantillon si la séquence du fragment obtenue est identique à la séquence connue du gène ou du fragment de gène rpoB de ladite bactérie.
13. Procédé selon la revendication 12, caractérisé en ce que :
- à l'étape a) on réalise les étapes comprenant :
1 - une première amplification de l'acide nucléique dudit échantillon avec un couple d'amorces 5' et 3' choisi parmi des oligonucléotides comprenant respectivement les séquences SEQ.ID. n° 7 et respectivement SEQ.ID. n° 10, de préférence consistant dans lesdites séquences SEQ.ID. n° 7 et 10, ou les séquences complémentaires, et on détermine l'apparition ou l'absence d'un produit d'amplification, et 2- une réaction de séquençage des amplifiats déterminés à l'étape 1 avec les amorces 5' et 3' consistant dans des oligonucléotides comprenant les séquences SEQ.ID. n° 9 et respectivement SEQ.ID. n° 10, ou leurs séquences complémentaires, de préférence des oligonucléotides consistant dans lesdites séquences SEQ.ID. n° 9 et 10 ou leurs séquences complémentaires, et - à l'étape b), on compare les séquences obtenues avec respectivement l'une des séquences SEQ.ID. n° 1 1 à 39 ou leurs séquences complémentaires
14. Trousse de diagnostic utile dans un procédé selon l'une des revendications 6 à 13, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins un dit oligonucleotide ou fragment de gène selon l'une des revendications 3 à 5.
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Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2861743B1 (fr) * 2003-11-04 2007-10-19 Univ Aix Marseille Ii Identification moleculaire des bacteries du genre corynebacterium
FI115637B (fi) * 2003-12-19 2005-06-15 Mobidiag Oy Diagnostinen menetelmä hengitystieinfektioita aiheuttavien bakteerien osoittamiseksi ja tunnistamiseksi ja menetelmässä käyttökelpoinen alukeseos
WO2006111028A1 (fr) * 2005-04-21 2006-10-26 Uti Limited Partnership Reaction en chaine de la polymerase (pcr) pour typage sccmec mrsa
CA2684570A1 (fr) 2007-04-19 2008-10-30 Molecular Detection Inc. Methodes, compositions et kits de detection et d'analyse de bacteries resistantes aux antibiotiques
US7811764B2 (en) * 2007-08-14 2010-10-12 University Of Rochester Hybridization-based biosensor containing hairpin probes and use thereof
CN110157821B (zh) * 2019-05-06 2020-08-28 浙江大学 一种用于人葡萄球菌检测的试剂盒
KR102195998B1 (ko) * 2019-09-27 2020-12-29 코스맥스 주식회사 스타필로코커스 시뮬란스 st-9 균주 및 그의 피부 상태 개선 용도
KR102286076B1 (ko) * 2019-09-27 2021-08-05 코스맥스 주식회사 스타필로코커스 갈리나룸 st-4 균주 및 그의 피부 상태 개선 용도

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5994066A (en) * 1995-09-11 1999-11-30 Infectio Diagnostic, Inc. Species-specific and universal DNA probes and amplification primers to rapidly detect and identify common bacterial pathogens and associated antibiotic resistance genes from clinical specimens for routine diagnosis in microbiology laboratories
JP2001510990A (ja) * 1996-11-25 2001-08-07 スミスクライン・ビーチャム・コーポレイション 新規原核生物ポリヌクレオチド、ポリペプチドおよびそれらの使用
KR100234975B1 (ko) * 1997-07-28 1999-12-15 국윤호 마이코박테리아의 rpoB 유전자 분절을 표적으로 하는 PCR-RFLP에 의한 마이코박테리아 균종의 탐지 및 동정방법
ATE369439T1 (de) * 1997-12-15 2007-08-15 Csl Behring Gmbh Markierter primer, geeignet für die detektion von nukleinsäuren
AU1478301A (en) * 1999-11-09 2001-06-06 Glaxo Group Limited Staphylococcus epidermidis nucleic acids and proteins

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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See references of WO03020972A1 *

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