FR2829148A1 - Identification moleculaire des bacteries du genre staphylococcus - Google Patents

Abstract

Procédé de détection par identification moléculaire d'une bactérie de l'une des espèces du genre Staphylococcus caractérisé en ce qu'on utilise :- un fragment dudit gène rpoB de ladite bactérie, comprenant une séquence nucléotidique choisie parmi l'une des séquences SEQ. ID. n° 11 à 39, les séquences inverses et les séquences complémentaires, ou- un oligonucléotide comprenant une séquence d'au moins 12 motifs nucléotidiques consécutifs incluse dans l'une des séquences SEQ. ID. n° 7 à 10, dans lesquelles N représente un nucléotide choisi parmi l'inosine et un mélange équimolaire de 4 nucléotides différents choisis parmi A, T, C ou G, et parmi les oligonucléotides des séquences inverses et séquences complémentaires.

Description

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Identification moléculaire des bactéries du genre Staphylococcus
La présente invention concerne le domaine du diagnostic. Plus précisément, l'invention concerne une méthode pour l'identification moléculaire des bactéries du genre Staphylococcus par les techniques de détection et/ou d'amplification et séquençage à l'aide de sondes ou d'amorces oligonucléotidiques appliquées à des souches de ce genre bactérien.

Les bactéries du genre Staphylococcus sont des bactéries cocciformes,
Gram-positive et catalase-positive dont on reconnaît actuellement 36 espèces dont 9 comprennent des sous-espèces [Euzéby JP. (1997) Int J Syst Bacteriol 47 : 590-2]. Ces espèces sont coagulase-négative, à l'exception de
Staphylococcus aureus, Staphylococcus intermedius, Staphylococcus delphinii,
Staphylococcus schleiferi subsp. coagulans, et quelques souches de
Staphylococcus hyicus [Kloos WE (1995) ln Manual of Clinical Microbiology, pp 282-298, ASM Press]. Ces espèces sont facilement et fréquemment isolées et cultivées à partir de prélèvements environementaux, de prélèvements cliniques vétérinaires et de prélèvements cliniques humains [Kloos WE (1986) in Bergey's manual of Systematic Bacteriology, pp. 1013-1035, Williams & Wilkins]. Chez l'homme, Staphylococcus aureus est une espèce coagulase-positive responsable d'intoxication alimentaire liée à la production d'une entérotoxine, du choc toxique staphylococcique, et d'infections purulentes caractérisées par des métastases septiques à distance du foyer infectieux initial. Les souches de Staphylococcus aureus résistantes à la méthicilline, qui est l'antibiotique de première ligne pour combattre ces infections, représentent un problème important de santé publique dans le cadre des infections nosocomiales, c'est à dire des infections contractées par les patients dans le cours de leur hospitalisation dans un établissement de soins. Les bactéries des espèces du genre Staphylococcus coagulase-négative font partie de la flore normale chez l'homme. Ces espèces sont également responsables d'infections nosocomiales, en particulier d'infection des matériels étrangers implantés en particulier des prothèses implantées [Kloos WE (1994) Clin. Microbiol. Rev. 7 : 117-140].

Ces différentes espèces posent le problème de leur identification. Les méthodes conventionnelles d'identification phénotypique sont les plus couramment utilisées pour l'identification des bactéries des espèces du genre

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Staphylococcus [Kloos WE (1991) J. Clin. Microbiol. 29 : 738-744] et plusieurs trousses d'identification ainsi que des automates ont été développés pour aider à l'identification phénotypique des bactéries du genre Staphylococcus. Cependant, le degré d'identification en pratique courante est variable [Grant CE (1994) Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 18 : 1-5 ; Perl TM (1994) Diagn. Microbiol. Infect.

Dis. 18,151-5 ; Refshal K (1992) J. Hosp. Infect. 22, 19-31] : par exemple, les bactéries appartenant aux espèces Staphylococcus hominis et Staphylococcus wameri sont confondues par la plupart de ces systèmes, avec des taux d'erreurs de 27 à 36% [Gran CE (1994) Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 18 : 1-5 ; leven M (1995) J. Clin. Microbiol. 33 : 1060-3]. De même, Staphylococcus schleifer peut être mal identifié par les systèmes d'identification automatique [Calvo J (2000) J.

Clin. Microbiol. 38 : 3887-9]. Les méthodes moléculaires peuvent donner en théorie de meilleurs résultats pour l'identification des bactéries du genre Staphylococcus du fait de leurs qualités de sensibilité et de spécificité. Les cibles moléculaires actuellement proposées pour l'identification moléculaire des bactéries du genre Staphylococcus comprennent le gène 16S rADN codant la sous-unité 16S de l'ARN ribosomal [Bialkowska-Hobrzanska H et al. (1990) Eur. J. Microbiol. Infect. Dis. 9 : 588-594], l'entretoise des gènes codant les ARN de

transfert [Maes N. et al. (1997) J. Clin. Microbiol. 35 : 2477-2481], le gène hsp60 codant pour la protéine de stress 60 [Goh SH et al. (1996) J. Clin. Microbiol.

34 : 818-823 ; Goh SH (1997) J. Clin. Microbiol. 35, 3116-3121 ; Kwok AY (1999) Int J Syst Bacteriol 49, 1181-1192] et le gène femA [Vannuffel P et al. Res. Microbiol. 150 : 129-141]. L'hybridation d'oligonucléotides est la technique généralement proposée pour cibler ces régions d'identification. La détection du gène nue est limitée aux bactéries de l'espèce Staphylococcus aureus [Brakstad OG (1992) J. Clin. Microbiol. 30 : 1654-1660] et un fragment chromosomique a été rapporté pour l'identification des bactéries de l'espèce Staphylococcus

epidermidis [Martineau F (1996) J. Clin. Microbiol. 34 : 2888-2893]. Il existe donc toujours une demande d'un outil d'identification moléculaire des bactéries des espèces du genre Staphylococcus utilisable en routine au laboratoire de bactériologie [Kleeman KT (1993) J. Clin. Microbiol. 31, 1318-1321].

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Les inventeurs ont démontré selon la présente invention, que le gène rpoB constitue un marqueur génétique permettant la détection et l'identification spécifique de la bactérie de chaque espèce du genre Staphylococcus.

Plus particulièrement, la présente invention concerne des séquences d'acides nucléiques spécifiques du genre ou de chaque espèce du genre
Staphylococcus dont la séquence nucléotidique est tirée du gène rpoB des dites bactéries.

Selon Lazcano et al. [J. Mol. Evol. (1988) 27 : 365-376], les ARN polymérases sont divisées en deux groupes selon leur origine, l'un constitué par les ARN polymérases virales ARN-ou ADN-dépendantes, et l'autre constitué par les ARN polymérases ADN-dépendantes d'origine eucaryote ou procaryotes (archaébactéries et eubactéries). Les ARN polymérases ADN-dépendantes eubactériennes sont caractérisées par une constitution multimérique simple et conservée notée core enzyme , représentée par aP', ou holoenzyme représentée par apss'c [Yura and Ishihama, Ann. Rev. Genet. (1979) 13 : 59-97].

De nombreux travaux ont mis en évidence le rôle fonctionnel, au sein du complexe enzymatique multimérique, de la sous-unité P de l'ARN polymérase eubactérienne. Les ARN polymérases archaébactérienne et eucaryote présentent, pour leur part, une structure plus complexe pouvant atteindre une dizaine, voire une trentaine de sous-unités [Pühlet et al. Proc. Natl. Acad. Sci.

USA (1989) 86 : 4569-4573].

Les gènes qui codent les différentes sous-unités api'a de l'ARN polymérase ADN-dépendante chez les eubactéries, respectivement les gènes rpoa, rpob, rpoc et rpod, ssont classés en différents groupes comprenant les gènes codant pour des protéïnes constitutives des sous-unités ribosomiques ou pour des enzymes impliqués dans la réplication et la réparation du génome [Yura and Yshihma, Ann. Rev. Genet. (1979) 13 : 59-97]. Certains auteurs ont montré que les séquences des gènes rpoB et rpoc pouvaient être utilisées afin de construire des arbres phylogénétiques [Rowland et al. Biochem. Soc. Trans.

(1992) 21 : 40S] permettant de séparer les différents embranchements et sousembranchements parmi les règnes du vivant.

Avant d'exposer plus en détail l'invention, différents termes, utilisés dans la description et les revendications, sont définis ci-après :

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par acide nucléique extrait de bactéries on entend soit l'acide nucléique total, soit l'ADN génomique, soit les ARN messagers, soit encore l'ADN obtenu à partir de la transcription inverse des ARN messagers ; un fragment nucléotidique ou un oligonucléotide sont deux termes synonymes désignant un enchainement de motifs nucléotidiques caractérisé par une séquence informationnelle des acides nucléiques naturels (ou éventuellement modifiés) et susceptibles de s'hybrider, comme les acides nucléiques naturels, avec un fragment nucléotidique complémentaire ou sensiblement complémentaire, dans des conditions prédéterminées de stringence stricte. L'enchainement peut contenir des motifs nucléotidiques de structure différente de celle des acides nucléiques naturels. Un fragment nucléotidique (ou oligonucléotide) peut contenir par exemple jusqu'à 100 motifs nucléotidiques. it contient généralement au moins 10, et en particulier au moins
12 motifs nucléotidiques et peut être obtenu à partir d'une molécule d'acide nucléique naturelle et/ou par recombinaison génétique et/ou par synthèse chimique, un motif nucléotidique est dérivé d'un monomère qui peut être un nucléotide naturel d'acide nucléique dont les éléments constitutifs sont un sucre, un groupement phosphate et une base azotée choisie parmi l'adénine

(A), la guanine (G), l'uracile (U), la cytosine (C), la thymine (T) ; ou bien le monomère est un nucléotide modifié dans l'un au moins des trois éléments constitutifs précédents ; à titre d'exemple, la modification peut intervenir soit au niveau des bases, avec des bases modifiées telles que l'inosine, qui peut s'hydrider avec toute base A, T, U, C ou G, la méthyl-5-désoxycytidine, la désoxyuridine, la diméthylamino-5-désoxyuridine ou toute autre base modéfiée capable d'hybridation, soit au niveau du sucre, par exemple le emplacement d'ua moins un désoxyribose par un polyamide [Nielsen PE et al., Science (1991) 254 : 1497-1500], soit encore au niveau du groupement phosphate, par exemple par remplacement par des esters choisis notamment parmi les diphosphates, les alkylphosphonates et les phosphorothioates, par hybridation , on entend le processus au cours duquel, dans des conditions appropriées, deux fragments nucléotidiques ayant des séquences suffisamment complémentaires sont suscpetibles de cs'associer par des

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liaisons hydrogène stables et spécifiques, pout former un double brin. Les conditions d'hybridation sont déterminées par la stringence , c'est à dire la rigueur des conditions opératoires. L'hybridation est d'autant plus spécifique qu'elle est effectuée à plus forte stringence. La stringence est fonction notamment de la composition en bases d'un duplex sonde/cible, ainsi que par le degré de mésappariement entre deux acides nucléiques. La stringence peut également être fonction des paramètres de la réaction d'hybridation, tels que la concentration et le type d'espèces ioniques présentes dans la solution d'hybridation, la nature et la concentration d'agents dénaturants et/ou la température d'hybridation. La stringence des conditions dans lesquelles une réaction d'hybridation doit être réalisée dépend notamment des sondes utilisées. Toutes ces données sont bien connues et les conditions appropriées peuvent éventuellement être déterminées dans chaque cas par des expériences de routine. En général, selon la longueur des sondes utilisées, la température pour la réaction d'hybridation est comprise entre environ 20 et
65 C, en particulier entre 35 et 650C dans une solution saline à une concentration d'environ 0,8 à 1 M.

- une sonde est un fragment nucléotidique possédant une spécificité d'hybridation dans des conditions déterminées pour former un complexe d'hybridation avec un acide nucléique ayant, dans le cas présent, une séquence nucléotidique comprise soit dans un ARN messager, soit dans un
ADN obtenu par transcription inverse dudit ARN messager, produit de transcription ; une sonde peut être utilisée à des fins de diagnostic (notamment sondes de capture ou de détection) ou à des fins de thérapie, - une sonde de capture est une sonde immobilisée ou immobilisable sur un support solide par tout moyen approprié, par exemple par covalence, par adsorption, ou par synthèse directe sur un solide. Des exemples de supports comprennent les plaques de microtitration et les puces à ADN, - une sonde de détection est une sonde marquée au moyen d'un agent marqueur choisi par exemple parmi les isotopes radioactifs, les enzymes, en particulier les enzymes susceptibles d'agir sur un substrat chromogéne, fluorigène ou luminescent (notamment une peroxydase ou une phosphatase alcaline), les composés chimiques chromophores, les composés chromogènes,

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fluorigènes ou luminescents, les analogues des bases nucléotidiques et les ligands tels que la biotine, -une sonde d'espèce est une sonde permettant l'identification spécifique de l'espèce d'une bactérie, -une sonde de genre est une sonde permettant l'identification spécifique du genre d'une bactérie, -une amorce est une sonde comprenant par exemple 10 à 100 motifs nucléotidiques et possédant une spécificité d'hybridation dans des conditions déterminées pour les réactions d'amplification enzymatique, -par réaction d'amplification on entend une réaction de polymérisation enzymatique, par exemple dans une technique d'amplification telle que la PCR, initiée par des oligonucléotides amorces et utilisant une ADN polymérase.

-par réaction de séquençage , on entend l'obtention de la séquence d'un fragment d'acide nucléique ou d'un gène complet par un procédé de polymérisation abortive à partir d'amorces oligonucléotidiques et utilisant lesdits didésoxynucléotides (Sanger F, Coulson AR (1975), J. Mol. Biol. 94 :
441) ou par hybridations multiples avec des sondes multiples fixées sur support solide telles qu'utilisées dans les puces ADN par exemple.

Les inventeurs ont déterminé les séquences complètes des gènes rpoB de quatre espèces de bactéries du genre Staphylococcus. Ces quatre espèces ont été choisies par les inventeurs comme représentant les quatre principaux groupes génétiques déterminés sur la base de l'étude du gène 16S dans les bactéries du genre Staphylococcus, à savoir les espèces phylogénétiquement les plus divergentes parmi l'ensemble des espèces actuellement décrites dans ce genre, de sorte que l'alignement des séquences rpoB obtenues chez ces quatre espèces puisse encadrer phylogénétiquement vraisemblablement l'ensemble des séquences rpoB de toutes les espèces de ce genre bactérien.

Les inventeurs ont mis en évidence les séquences consensus et spécifiques SEQ. ID. n 7 à 10 décrites dans le listage des séquences en fin de description. Les inventeurs ont déterminé lesdites séquences SEQ. ID. n 7 et 10 comme étant non seulement consensuelles entre toutes les bactéries du genre Staphylococcus mais en outre spécifiques de la famille des bactéries du genre

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Staphylococcus, excepté Staphylococcus schleifer en ce qui concerne la séquence SEQ. ID. n 8.

Ces séquences sont présentes dans les gènes rpoB de toute bactérie du genre Staphylococcus et spécifiques des bactéries du genre Staphylococcus pouvant être utilisées à titre de sonde de genre pour détecter toute bactérie du genre Staphylococcus excepté Staphylococcus schleiferi en ce qui concerne la séquence SEQ. ID. NO 8.

Dans les séquences SEQ. ID. n 7 et 10, le nucléotide N mentionné dans le listage de séquences en fin de description, peut représenter l'inosine ou un mélange équimolaire de 4 nucléotides différents choisis parmi A, T, C et Gt, ou respectivement A, U, C et G, dans la mesure où, comme mentionné dans les définitions, un oligonucléotide ou un fragment d'acide nucléique selon l'invention peut être sous forme d'un acide des oxyribonucléiques (ADN) ou d'un acide ribonucléique (ARN) pour lesquels, dans ce cas, T est remplacé par U.

Lorsque"N"représente un dit mélange équimolaire de nucléotides à une position donnée, cela signifie que le nucléotide à ladite position donnée représente indifféremment A, T, C ou G (ou respectivement le cas échéant A, U, C ou G) et que l'oligonucléotide selon l'invention est constitué plus précisément d'un mélange équimolaire de 4 groupes d'oligonucléotides dans chacun desquels groupes N a une signification différente à ladite position donnée et représente respectivement chacun des 4 bases A, T, C ou G (ou respectivement A, U, C ou G).

A la position correspondant à un nucléotide N dans les séquences SEQ. ID. n 7 et 10 on trouve des nucléotides variables dans les séquences cibles complémentaires en fonction de l'espèce de la bactérie considérée, mais tous les autres nucléotides sont conservés dans toutes les espèces des bactéries du genre Staphylococcus. Du fait que"N"représente l'inosine qui peut s'hybrider avec toute base ou un mélange équimolaire des 4 bases A, T, C, G, les séquences SEQ. ID. n 7 et 10 peuvent s'hybrider avec la séquence complémentaire incluse dans le gène rpoB de toutes les bactéries du genre Staphylococcus.

En outre, les séquences consensus SEQ. ID. n 9 et SEQ ID n 10 encadrent des séquences hypervariables dont la séquence est spécifique pour

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chaque espèce de bactérie du genre Staphylococcus. Les séquences encadrées par SEQJD. n 9 et 10 peuvent donc être utilisées à titre de sonde d'espèce des bactéries du genre Staphylococcus.

De plus, les séquences SEQJD. n 9 et 10 ont été déterminées comme encadrant un fragment du gène rpoB comprenant une zone dont la longueur variable est d'environ 500 pb et constitue la plus courte séquence spécifique pour chaque espèce de la bactérie du genre Staphylococcus.

Les inventeurs ont ainsi pu mettre en évidence des sondes d'espèce pour chacune des 29 espèces de bactérie du genre Staphylococcus étudiées correspondant aux séquences SEO. ID. nO 11 à 39 encadrées par les séquences consensus SEQ. ID. n 9 et 10.

Les séquences consensus SEQ. ID. NO 7 à 10 mises en évidence selon la présente invention, peuvent être utilisées à titre d'amorce d'amplification ou de réaction de séquençage dans des procédés de détection de bactérie du genre
Staphylococcus par identification moléculaire.

Les séquences SEQ. ID. n 7 à 10 permettent donc non seulement de préparer des sondes de genre des bactérie du genre Staphylococcus mais aussi de détecter et identifier l'espèce de ladite bactérie par amplification et séquençage en utilisant lesdites séquences comme amorces.

Plus précisément, la présente invention fournit un procédé de détection par identification d'une bactérie de l'une des espèces du genre Staphylococcus caractérisé en ce qu'on utilise : - le gène rpob de ladite bactérie ou - un fragment dudit gène rpoB de ladite bactérie, comprenant une séquence nucléotidique choisie parmi l'une des séquences SEQ. ID. n 11 à 39, les séquences inverses et les séquences complémentaires, ou - un oligonucléotide comprenant une séquence d'au moins 12 motifs nucléotidiques consécutifs, incluses dans l'une des séquences SEQ. ID. n 7 à 10, dans lesquelles N représente un nucléotide choisi parmi l'inosine ou un mélange équimolaire de 4 nucléotides différents choisis parmi A, T, C ou G, les séquences inverses et les séquences complémentaires.

Lesdits oligonucléotides comprennent de préférence de 12 à 35 motifs nucléotidiques, et de préférence encore, lesdits oligonucléotides consistent dans

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les séquences SEQ. ID. no 7 à 10, les séquences inverses et les séquences complémentaires.

Dans un premier mode de réalisation d'un procédé de détection selon l'invention, on cherche à mettre en évidence la présence d'une bactérie du genre Staphylococcus et, dans une première variante, on réalise les étapes dans lesquelles :
1-on met en contact au moins une sonde de genre comprenant un dit oligonucléotide comprenant une séquence incluse dans l'une des séquences

SEQ. ID. n 7 à 10, les séquences inverses et les séquences complémentaires, et
2-on détermine la formation ou l'absence de formation d'un complexe d'hybridation entre ladite sonde de genre et les acides nucléiques de l'échantillon, et on détermine la présence d'une dite bactérie du genre Staphylococcus s'il y a formation d'un complexe d'hybridation.

Dans une deuxième variante de réalisation d'un procédé de détection d'une bactérie du genre Staphylococcus, on réalise les étapes dans lesquelles : 1-on met en contact les amorces d'amplification comprenant desdits oligonucléotides comprenant une séquence d'au moins 12 motifs nucléotidiques incluse dans au moins deux séquences tirées des séquences SEQJD. n 7 à 10, séquences inverses et séquences complémentaires, avec un échantillon contenant ou susceptible de contenir des acides nucléiques d'au moins une telle bactérie du genre Staphylococcus, avec : - comme amorce 5' : un oligonucléotide choisi parmi les oligonucléotides comprenant une séquence incluse dans l'une des séquences SEO. ID. nO 7 ou 9 ou les séquences complémentaires, de préférence un oligonucléotide consistant dans lesdites séquences complètes, et - comme amorce 3' : un oligonucléotide comprenant une séquence incluse dans l'une des séquences SEO. ID. nO 10 ou 8 ou respectivement une séquence complémentaire, de préférence un oligonucléotide consistant dans lesdites séquences complètes.

2-on réalise une amplification d'acides nucléiques par réaction de polymérisation enzymatique et on détermine l'apparition ou l'absence d'un

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produit d'amplification, et on détermine ainsi la présence de ladite bactérie dans l'échantillon si un produit d'amplification est apparu.

Plus particulièrement dans cette deuxième variante du premier mode de réalisation, on utilise comme amorce 5'un oligonucléotide de séquence SEQ. ID. n 7 ou 9 ou une séquence complémentaire, et comme amorce 3'un oligonucléotide de séquence SEQJD. n 10 ou respectivement une séquence complémentaire.

Dans un deuxième mode de réalisation du procédé de détection d'une bactérie selon l'invention, on cherche à détecter spécifiquement une espèce donnée d'une bactérie du genre Staphylococcus choisie parmi les espèces

Staphylococcus xylosus, Staphylococcus warneri, Staphylococcus simulans, Staphylococcus sciuri, Staphylococcus schleifer, Staphylococcus saphrophyticus, Staphylococcus saccharolyticus, Staphylococcus pulvers, Staphylococcus muscae, Staphylococcus lugdunensis, Staphylococcus lentis,

Staphylococcus kloosii, Staphylococcus intermedius, Staphylococcus hyicus, Staphylococcus hominis, Staphylococcus haemolyticus, Staphylococcus gallinarum, Staphylococcus felis, Staphylococcus equorum, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus cohni, Staphylococcus chromogenes, Staphylococcus carnosus, Staphylococcus capitis, Staphylococcus auricularis, Staphylococcus aureus subs. aureus, Staphylococcus aureus subs. anaerobius, Staphylococcus arlettae, Staphylococcus caprae.

Dans une première variante de ce deuxième mode de réalisation du procédé selon l'invention, on réalise les étapes dans lesquelles : 1-on met en contact un échantillon contenant ou susceptible de contenir des acides nucléiques d'au moins une telle bactérie, avec au moins une sonde d'espèce consistant dans un dit fragment de gène comprenant une séquence incluse dans l'une des séquences SEQ. ID. n 11 à 39, les séquences inverses et séquences complémentaires, de préférence un oligonucléotide consistant dans l'une desdites séquences SEO. ID. nO 11 à 39, ou un oligonucléotide de séquence inverse ou complémentaire, et 2-on détermine la formation ou l'absence d'un complexe d'hybridation entre ladite sonde et les acides nucléiques de l'échantillon.

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Dans une seconde variante de ce dit deuxième mode de réalisation du procédé selon l'invention dans lequel on cherche à détecter spécifiquement une espèce donnée d'une bactérie du genre Staphylococcus choisie parmi les 29 espèces citées ci-dessus, le procédé comprend les étapes dans lesquelles, dans un échantillon contenant ou susceptible de contenir des acides nucléiques d'au moins une dite bactérie : a) on réalise une réaction de séquençage d'un fragment du gène rpob amplifié d'une dite bactérie donnée à l'aide des amorces nucléotidiques consistant dans des oligonucléotides comprenant une séquence incluse dans les séquences SEQ. ID. n 7 ou 9 comme amorce 5', et SEQ.ID. n 10 comme amorce 3', de préférence des oligonucléotides consistant dans lesdites séquences SEO. ID. nO 7 ou 9 et 10, ou leurs séquences complémentaires, et b) on détermine la présence ou l'absence de l'espèce donnée de ladite bactérie en comparant la séquence dudit fragment obtenu avec la séquence du gène complet rpoB de ladite bactérie ou la séquence d'un fragment du gène rpoB de ladite bactérie comprenant respectivement lesdites séquences n 11 à 39 et séquences complémentaires, et on détermine ainsi la présence de ladite bactérie dans l'échantillon si la séquence du fragment obtenue est identique à la séquence connue du genre ou du fragment de gène rpoB de ladite bactérie.

Plus particulièrement dans cette seconde variante : - à l'étape a) on réalise les étapes comprenant : 1-une première amplification de l'acide nucléique dudit échantillon avec un couple d'amorces 5'et 3'choisi parmi des oligonucléotides comprenant respectivement les séquences SEO. ID. nO 7 et respectivement SEQJD. n 10 ou leurs séquences complémentaires, et on détermine l'apparition ou l'absence d'un produit d'amplification à l'étape 1, et 2-une réaction de séquençage des amplifiats déterminés à l'étape 1 avec les amorces 5'et 3'consistant dans des oligonucléotides comprenant les séquences SEQ.ID. n 9 et respectivement SEO. ID. n010, de préférence consistant dans lesdites séquences SEO. ID. nO 7 et 10 ou leurs séquences complémentaires, de préférence consistant dans lesdites séquences SEQ.ID. n 9 et 10 ou leurs séquences complémentaires, et

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- à l'étape b), on compare les séquences obtenues avec respectivement l'une des séquences SEQ. ID. n 11 à 39 ou leurs séquences complémentaires.

Un autre objet de la présente invention est un gène ou fragment de gène rpoB d'une bactérie du genre Staphylococcus, caractérisé en ce qu'il comprend une séquence telle que décrite dans les séquences SEQ. ID. nO 11 à 39.

Un autre objet de la présente invention est la séquence complète du gène rpoB des bactéries Staphylococcus saccharolyticus, Staphylococcus lugdunensis, Staphylococcus caprae, et Staphylococcus intermedius telles que décrites dans les séquences SEQ. ID. n 3 à 6, comme mentionné précédemment ces fragments de gènes rpoB et gènes complets sont utiles notamment pour un procédé selon l'invention.

La séquence complète du gène rpoB peut être utilisée pour identifier la bactérie pas seulement par l'étude de sa séquence primaire, mais aussi, par l'étude des structures secondaire et tertiaire de l'ARN messager provenant de la transcription de la séquence complète d'ADN.

Un autre objet de la présente invention est un dit fragment de gène rpoB ou oligonucléotide choisi parmi les oligonucléotides ayant une séquence

consistant dans les séquences SEQ ID n 11 à 39 et parmi les oligonucléotides de séquences inverses et séquences complémentaires tels que définis cidessus.

Un autre objet de la présente invention est un oligonucléotide comprenant une séquence d'au moins 12, de préférence de 12 à 35, motifs nucléotidiques consécutifs incluse dans l'une des séquences SEQ. ID. n 7 à 10, dans lesquelles N représente un nucléotide choisi parmi l'inosine et un mélange équimolaire de 4 nucléotides différents choisis parmi A, T, C ou G, et les oligonucléotides de séquences inverses et séquences complémentaires, de préférence consistant dans les séquences SEQ. ID. n 7 et 10 et les séquences inverses et séquences complémentaires dans lesquelles N représente l'inosine.

Les séquences SEQ ID n 7 à 39 peuvent être préparées par synthèse chimique en utilisant les techniques bien connues de l'homme du métier et décrites par exemple dans l'article de Itakura K. et al. [ (1984) Annu.

Rev. Biochem. 53 : 323].

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Une première application d'un oligonucléotide selon l'invention est son utilisation comme sonde pour la détection, dans un échantillon biologique, de bactéries de l'une des espèces du genre Staphylococcus qui comprend une séquence nucléotidique d'au moins 12 motifs nucléotidiques consécutifs incluse dans l'une des séquences SEQ ID nO 7 à 39, et leurs séquences inverses ou complémentaires.

Une sonde comprenant les séquences SEQ. ID. n 7 à 10 sera utilisée à titre de sonde de genre et une sonde comprenant l'une des séquences SEQ. ID. n 11 à 39 sera utilisée à titre de sonde d'espèce.

Les sondes selon l'invention peuvent être utilisées, à des fins de diagnostic, comme mentionné précédemment, par la détermination de la formation ou de l'absence de formation d'un complexe d'hybridation entre la sonde et un acide nucléique cible dans un échantillon, selon toutes les techniques d'hybridation connues et notamment les techniques de dépôt ponctuel sur filtre, dites DOT-BLOT [Maniatis et al. (1982) Molecular Cloning, Cold Spring Harbor], les techniques de transfert d'ADN dites SOUTHERN BLOT southern E. M., J. Mol. Biol. (1975) 98 : 503], les techniques de transfert d'ARN dites NORTHERN BLOT , ou les techniques dites sandwich , en particulier avec une sonde de capture et/ou une sonde de détection, lesdites sondes étant capables de s'hybrider avec deux régions différentes de l'acide nucléique cible, et l'une au moins desdites sondes (généralement la sonde de détection) étant capable de s'hybrider avec une région de la cible qui est spécifique de l'espèce, étant entendu que la sonde de capture et al sonde de détection doivent avoir des séquences nucléotidiques au moins partiellement différentes.

L'acide nucléique à détecter (cible) peut être de l'ADN ou de l'ARN (le premier obtenu après amplification par PCR). Dans le cas de la détection d'une cible de type acide nucléique double brin, il convient de procéder à la dénaturation de ce dernier avant la mise en oeuvre du procédé de détection.

L'acide nucléique cible peut être obtenu par extraction selon les méthodes connues des acides nucléiques d'un échantillon à examiner. La dénaturation d'un acide nucléique double brin peut pêtre effectuée par les méthodes connues

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de dénaturation chimique, physique ou enzymatique, et en particulier par chauffage à une température appropriée, supérieure à 80 C.

Pour mettre en oeuvre les techniques d'hybridation précitées, et en particulier les techniques sandwich , une sonde de l'invention, appelée sonde de capture est immobilisée sur un support solide, et une autre sonde de l'invention, appelée sonde de détection, est marquée avec un agent marqueur.

Les exemples de support et d'agent marqueur sont tels que définis précédemment.

De manière avantageuse, une sonde d'espèce est immobilisée sur un support solide, et une autre sonde d'espèce est marquée par un agent marqueur.

Une autre application d'un oligonucléotide de l'invention est son utilisation comme amorce nucléotidique comprenant un oligonucléotide monocaténaire choisi parmi les oligonucléotides ayant une séquence d'au moins 12 motifs nucléotidiques incluses dans l'une des séquences SEQ ID n 7 à 39, qui est utilisable dans la synthèse d'un acide nucléique en présence d'une polymérase par un procédé connu en soi, notamment dans des méthodes d'amplification utilisant une telle synthèse en présence d'une polymérase (PCR, RT-PCR, etc.).

En particulier, une amorce de l'invention peut être utilisée pour la transcription inverse spécifique d'une séquence d'ARN messager de bactérie d'une espèce du genre Staphylococcus pour obtenir une séquence d'ADN complémentaire correspondante. Une telle transcription inverse peut constituer le premier stade de la technique RT-PCR, le stade suivant étant l'amplification par PCR de l'ADN complémentaire obtenu. On peut également utiliser les amorces de l'invention pour l'amplification spécifique par réaction de polymérisation en chaîne de la séquence totale de l'ADN du gène rpoB d'une espèce du genre Staphylococcus.

Selon un cas particulier ladite amorce comprenant un oligonucléotide de l'invention comprend en outre la séquence sens ou anti-sens d'un promoteur reconnu par une ARN polymérase (promoteurs T7, T3, SP6 par exemple [Studier FW, BA Moffatt (1986) J. Mol. Biol. 189 : 113] : de telles amorces sont utilisables dans des procédés d'amplification d'acide nucléique faisant intervenir une étape de transcription, tels que, par exemple, les techniques NASBA ou

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3SR [Van Gemen B. et al. Abstract MA 1091, in International Conference on AIDS (1991) Florence, Italy].

Un autre objet de l'invention est une amorce nucléotidique comprenant un oligonucélotide monocaténaire choisi parmi les oligonucléotides ayant une séquence comprenant l'une des séquences SEQ ID n 7 à 39 ou une séquence incluse dans SEQ. ID. na 7 à 39 qui est utilisable pour le séquençage total ou partiel du gène rpoB d'une souche quelconque d'une espèce du genre Staphylococcus.

Le séquençage du gène rpoB partiel ou complet chez toute bactérie du genre Staphylococcus perrmet l'identification de toute bactérie Staphylococcus par analyse bioinformatique de cette séquence et la reconnaissance de nouvelles espèces de bactéries Staphylococcus inconnues.

De préférence, dans une utilisation comme amorce ou pour le séquençage des gènes rpoB on utilise les séquences SEQ ID n07 à SEQ ID n 10, dans lesquelles N est l'inosine de préférence, les séquences SEQ ID n07 et SEO. ID. na 10.

La présente invention a également pour objet une trousse de diagnostic utile dans un procédé selon l'invention comprenant au moins un dit fragment de gène dudit oligonucléotide consistant dans les séquences SEQ. ID. n 7 à 39 et les séquences inverses et séquences complémentaires ou un dit oligonucléotide comprenant une séquence incluse dans une des séquences SEQ. ID. n 7 à 10, et/ou au moins un dit fragment de gène rpob d'une dite bactérie comprenant les

séquences SEQ. ID. na 11 à 39, et les oligonucléotides et fragments de gènes de séquences inverses et séquences complémentaires, tels que définis ci-dessus.

Dans la présente description, on entend par"séquences inverses et séquences complémentaires" les séquences suivantes : - la séquence inverse de ladite séquence, - la séquence complémentaire de ladite séquence, et - la séquence complémentaire de la séquence inverse de ladite séquence.

Enfin, un dernier objet de l'invention est une sonde de thérapie génique pour traiter les infections provoquées par une souche appartenant à une espèce du genre Staphylococcus, ladite sonde comprenant un oligonucléotide tel que défini précédemment. Cette sonde de thérapie génique, capable de s'hybrider

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sur l'ARN messager et/ou sur l'ADN génomique desdites bactéries, peut bloquer les phénomènes de traduction et/ou transcription et/ou de réplication.

Le principe des méthodes de thérapie génique est connu et repose notamment sur l'utilisation d'une sonde correspondant à un brin anti-sens : la formation d'un hybride entre la sonde et le brin sens est capable de perturber au moins l'une des étapes du décryptage de l'information génétique. Les sondes de thérapie génique sont donc utilisables comme médicaments antibactériens, permettant de lutter contre les infections causées par les bactéries des espèces du genre Staphylococcus.

L'invention sera mieux comprise à l'aide de l'exposé ci-après, divisé en exemples, qui concernent des expériences effectuées dans le but de réaliser l'invention et qui sont données à titre purement illustratif.

La figure 1 représente la visualisation des produits d'amplification par coloration au bromure d'éthidium après électrophorèse sur un gel d'agarose obtenu à l'exemple 3.

Exemple 1. Séquence du gène rpoB de quatre espèces du genre Staphylococcus : Staphylococcus saccharolyticus, Staphylococcus lugdunensis, Staphylococcus caprae et Staphylococcus intermedius.

La séquence complète du gène rpoB des bactéries des espèces Staphylococcus saccharolyticus, Staphylococcus lugdunensis, Staphylococcus caprae et Staphylococcus intermedius a été déterminée par amplification enzymatique et séquençage automatique direct utilisant des amorces consensus entre les séquences du gène rpoB chez Staphylococcus aureus (GenBank n d'accès X64172) Bacillus subtillis (GenBank nO d'accès L43593). Cette dernière espèce bactérienne a été choisie comme l'espèce Gram-positive de bas contenu en guanosine plus cytosine la plus proche des espèces du genre Staphylococcus (proximité phylogénétique basée sur la comparaison des séquences du gène 168 rADN).

Plusieurs amorces consensus potentielles ont fait l'objet d'investigations pour obtenir un fragment susceptible de conduire à la séquence complète de

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gènes rpoB par élongations successives à partir d'une série d'amorces spécifiques.

Ces amorces consensus ont les séquences suivantes :
SEQ ID n01 : 5'-AAA CTT AAT AGA AAT TCA AAC TAA A-3'
SEQ ID n 2 : 5'-ATC TGG TAA AGC ATT ACC AA-3' et ont permis d'obtenir un premier fragment F1 d'une longueur de 1.007 paires de bases chez ces quatre espèces. A partir de l'alignement de la séquence de ce premier fragment F1 sur les séquences de Staphylococcus aureus et Bacillus subtilis, un grand nombre de tentatives avec des amorces théoriquement ou potentiellement appropriées ont échoué et finalement une succession d'amorces oligonucléotidiques a été déterminée pour permettre d'amplifier et de séquencer par étapes successives la totalité du gène rpoB chez les quatre espèces Staphylococcus saccharolyticus, Staphylococcus lugdunensis, Staphylococcus caprae et Staphylococcus intermedius. La séquence, la position relative à la séquence du gène rpoB de Staphylococcus aureus dans GenBank (numéro d'accès X64172) et la température d'hybridation de ces amorces sont présentées dans le tableau suivant :

<tb>
<tb> Amorce <SEP> Sequence <SEP> de <SEP> l'amorce <SEP> (5'-3') <SEP> Position <SEP> Tm <SEP> ( C)
<tb> 30 <SEP> F <SEP> GGTTTAGGATTAAAAGATGC <SEP> 30-50 <SEP> 41
<tb> 192 <SEP> F <SEP> GAAGAAGTTGGAGCTACTG <SEP> 192-211 <SEP> 44
<tb> 806F <SEP> AATAAGAGCAGGGAAAGAAAC <SEP> 806-827 <SEP> 43
<tb> 920FAAAGAAAAGAATGAATGAACTT920-94239
<tb> 1165FTATGCTTATGGTATTTAGCTA1165-118639
<tb> 1302 <SEP> F <SEP> AAACTTAATAGAAATTCAAACTAAA <SEP> 1302-1327 <SEP> 58
<tb> 1450 <SEP> F <SEP> GTTCAAACGATAAATAGAGAA <SEP> 1450-1471 <SEP> 39
<tb> 1741 <SEP> F <SEP> GAAACAGATGCTAAAGATGT <SEP> 1741-1761 <SEP> 41
<tb> 1850FCCATATACTGCGAGTGGGAA1850-187047
<tb> 2245 <SEP> F <SEP> TAGAAATTCAATCAATTAAGTATATG <SEP> 2245-2271 <SEP> 62
<tb> 2309 <SEP> F <SEP> TTGGTAATGCTTTACCAGAT <SEP> 2309-2329 <SEP> 41
<tb> 2334FTGCATTACACCAGCAGATATCATTG2334-235970
<tb> 2412 <SEP> F <SEP> GATGATATTGACCATTTAGG <SEP> 2412-243 <SEP> 41
<tb> 2534FTGAAAGAATGTCAATTCAAGA2534-255539
<tb>

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<tb>
<tb> 2663 <SEP> F <SEP> AAACCCATTAGCTGAGTT <SEP> 2663-268 <SEP> 38
<tb> 2995 <SEP> F <SEP> TGGTCGTTTCATGGATGATGAAGTTG <SEP> 2995-3119 <SEP> 74
<tb> 2924 <SEP> F <SEP> AAGATAGCTATGTTGTAGCA <SEP> 2924-2944 <SEP> 41
<tb> 3200 <SEP> F <SEP> CTTAGAGAACGATGACTCTAA <SEP> 3200-3221 <SEP> 43
<tb> 3498 <SEP> F <SEP> TAGTTGGTTTCATGACTTGGGA <SEP> 3498-3520 <SEP> 46
<tb> 3550 <SEP> F <SEP> TTGAAAGTCCAACAAAGCAA <SEP> 3550-3570 <SEP> 38
<tb> 3843 <SEP> F <SEP> GGTAAAGTAACGCCTAAAGGT <SEP> 3843-3864 <SEP> 45
<tb> 4494 <SEP> F <SEP> TGGAGGTATGGGCACTTGAA <SEP> 4494-4514 <SEP> 47
<tb>
Les amplifications ont été réalisées sous un volume final de 50 ut comprenant 2,5 x 10-2 U de Taq polymérase, 1 X de tampon de Taq et 1,8 mM de MgC, 200 uM de dATP, dTTP, dGTP, dCTP et 0, 2 M de chaque amorce. Elles ont été réalisées suivant le programme suivant : 35 cycles comportant une étape de

dénaturation à 94 C pendant 30 secondes, hybridation des amorces à 520C pendant 30 secondes et extension à 720C pendant 60 secondes. Les produits d'amplification ont été purifiés sur colonne puis séquencés à l'aide des amorces oligonucléotidiques de séquençage présentées dans le tableau suivant :

<tb>
<tb> 1759R <SEP> ACATCTTTAGCATCTGTTTC <SEP> 1779-1759 <SEP> 48
<tb> 1460 <SEP> RATCGTTTGAACGCCACTCTT1480-146045
<tb> 1910 <SEP> RTCATAGTAAGTTTGCGCCAT1930-191043
<tb> 2309 <SEP> R <SEP> ATCTGGTAAAGCATTACCAA <SEP> 2329-2309 <SEP> 41
<tb> 2334 <SEP> R <SEP> CAATGATATCTGCTGGTGTAATGCA <SEP> 2354-2334 <SEP> 68
<tb> 2432 <SEP> R <SEP> CCTAAATGGTCAATATCATC <SEP> 2452-2432 <SEP> 41
<tb> 2573 <SEP> R <SEP> CGAATATTAATTAATTGTTG <SEP> 2593-2573 <SEP> 34
<tb> 2892 <SEP> R <SEP> GTGATAGCATGTGTATCTAAATCA <SEP> 2912-2892 <SEP> 64
<tb> 2915 <SEP> RTAACTATCTTCTTCATCAGC2935-291541
<tb> 2924 <SEP> R <SEP> TGCTACAACATAGCTATCTT <SEP> 2944-2924 <SEP> 41
<tb> 2995 <SEP> RCAACTTCATCATCCATGAAACGACCA3015-299574
<tb> Cm32b <SEP> ATGCAACGTCAGGCCGTTCCG <SEP> 3211-3191 <SEP> 64
<tb> 3321 <SEP> R <SEP> AGACGACGAACAGAATTTCA <SEP> 3341-3321 <SEP> 56
<tb> 3610 <SEP> RGCTCGAATGATAACGTGATT3630-361043
<tb>

<Desc/Clms Page number 19>

<tb>
<tb> 4139R <SEP> ACTTGTCCAATGTTCATACG <SEP> 4159-4139 <SEP> 44
<tb> 4502 <SEP> RCATATGCTTCAAGTGCCCATA4523-450245
<tb> 4508 <SEP> RCCAAGTGGTTGTTGTGTAAC2428-450845
<tb> 4871 <SEP> RTTTAGAGCTTTCACTGTTTG4891-487141
<tb> 5000 <SEP> RCACCATATGACCAAGAACGAA5021-500045
<tb> 5018 <SEP> RCAATCAAGGAGCCTACCTCCTT5040-501850
<tb> 5030 <SEP> RGAAATTATTTACATCAATCAA5051-503036
<tb> 5041 <SEP> RTAACTATCTTCTTCATCAGC5061-504141
<tb> 5085 <SEP> R <SEP> CCCAGTCTTTTGTAGGTCCG <SEP> 5105-5085 <SEP> 49
<tb> 5188 <SEP> R <SEP> CCCATTCTTTCACGACGTAC <SEP> 5208-5188 <SEP> 47
<tb>
Les réactions de séquençage ont été réalisées en utilisant les réactifs du kit ABI Prism dRhodamine Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (Perkin Elmer Applied Biosystems) selon les recommandations du fournisseur suivant le programme suivant : 30 cycles comprenant une étape de dénaturation à 940C pendant 10 sec., une étape d'hybridation de l'amorce à 500C pendant 10 sec. et une étape d'extension à 60 C pendant 2 minutes. Les produits de séquençage ont été séparés par électrophorèse sur un gel de polyacrylamide sur un séquenceur 377 DNA Sequencer (Perkin) et analysés pour former des séquences consensus par le logicel Sequence Assembler (Applied Biosystems).

Cette approche nous a permis de déterminer la séquence complète du gène rpoB chez quatre espèces du genre Staphylococcus :
SEQ ID ? 3 : Séquence du gène rpoB de Staphylococcus saccharolyticus. Cette séquence mesure 3.791 paires de bases et possède un contenu en cytosine plus guanosine de 36,8% est déposée dans GenBank sous le numéro GenBank accession AF325871.

5'ATGAAACTTAATAGAAATTCAAACTAAATCTTATGATTGGTTCCTTAAAGAA GGGTTATTAGAAATGTTTAGAGACATTTCACCAATTGAAGATTTCACAGGCA ACCTATCTTTAGAATTTGTAGATTATAGATTAGGTGAACCAAATTATGATTTA GAAGAATCTAAAAATCGTGACGCTACTTATGCTGCACCTCTTCGTGTCAAAG TACGTCTCATTATTAAAGAAACAGGCGAAGTAAAAGAACAAGAAGTCTTCAT GGGTGATTTCCCATTAATGACAGACACAGGTACATTTGTTATCAATGGTGCT

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GAGCGTGTTATCGTGTCTCAATTAGTACGTTCACCATCTGTTTATTTCAACG AAAAAATTGATAAAAACGGTCGTGAAAATTATGATGCGACTATTATTCCTAAC CGTGGTGCTTGGTTAGAATATGAAACAGATGCTAAAGATGTCGTTTATGTTC GTATCGATAGAACACGTAAATTACCATTAACTGTATTGTTACGTGCGCTAGG TTTCTCAACTGATCAAGAAATCGTTGATTTAATAGGAGACAGTGAATATTTAC GTAATACATTAGAAAAAGATGGAACTGAAAATACAGAACAAGCTTTATTAGA

AATTTATGAACGTTTGCGTCCTGGCGAACCACCAACAGTAGAAAATGCTAAA AGCTTATTATATTCACGTTTCTTCGATCCTAAACGCTATGATTTAGCAAGTGT AGGTCGTTATAAAGCTAACAAAAAGTTACATTTAAAACACCGTTTATTTAATC AAAAACTAGCAGAACCAATTGTTAATAGTGAAACAGGTGAGATTGTAGCGGA AGAAGGTACTGTACTTGATCGTCGTAAACTAGATGAAATCATGGACGTATTG

GAGACAAACGCTAATAGCGAAGTCTTTGAACTTGAAGGTAGTGTCATTGATG AACCAGTAGAAATTCAATCAATTAAAGTATATGTTCCTAATGATGAAGAAGGT CGAACTACTACTGTTATTGGTAATGCATTACCAGACTCAGAAGTTAAATGTAT TACTCCGGCTGATATTATCGCCTCAATGAGTTACTTCTTTAACTTATTGAATG GAATTGGTTATACAGATGATATTGACCACTTAGGTAATCGTCGTTTACGTTC AGTTGGTGAATTACTACAAAACCAATTCCGTATCGGTTTfSEQIDN 7) GTCTA GAATGGAACGTGTTGTACGTGAGAGAATGTCAATTCAAGACACTGATTCTAT CACTCCACAACAATTAATTAATATTCGTCCAGTCATTGCATCTATTAAAGAAT

TTTTTGGT AGTTCTCAA TT A TCTCAATTCATGGACCAAGC (SEQIDN09) AAAC CCATTAGCTGAGTTGACTCATAAACGTCGTTTATCAGCTCTAGGACCTGGT GGTTTAACTCGTGAACGCGCTCAAATGGAAGTACGTGACGTGCATTATTCT CACTACGGTCGTATGTGCCCTATTGAAACACCTGAGGGCCCAAACATTGG ATTAATTAACTCATTATCTAGTTATGCAAGAGTAAATGAATTTGGTTTTATT GAAACACCTTATCGTAAAGTTGATTTAGATACTAATTCAATCACTGACCAA ATTGACTACTTAACTGCTGATGAAGAAGATAGTTATGTTGTTGCACAAGCA AACTCACGTCTTGATGAAAATGGGTGCTTCTTAGATGATGAAGTTGTTTGT CGTTTTCGTGGCAATAACACAGTGATGGCTAAAGAAAAAATGGACTATAT GGACGTATCACCTAAACAAGTAGTTTCAGCAGCTACTGCATGTATCCCATT CTTAGAAAACGATGACTCAAACCGAGCATTAATGGGTGCAAACATGCAAC GTCAAGCAGTACCATTAATGAACCCAGAAGCGCCATTTGTTGGAACAGGT ATGGAACATGTAGCfSEQ) DN 10) AGCGCGTGACTCAGGTGCAGCAATTACT GCTAAGCATAGAGGACGTGTTGAACATGTTGAGTCTAATGAAGTTTTAGTTC

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GTCGTTTAGTAGAAGAAAATGGTATTGAACATGAAGGTGAATTAGATCGCTA TCCATTAGCAAAATTCAAACGTTCAAACTCTGGTACATGTTATAACCAACGC CCAATTGTTTCTGTTGGAGACGTTGTTGAATATAACGAAATTTTAGCAGACG GTCCTTCAATGGAACTAGGTGAAATGGCTTTAGGTCGTAACGTAGTTGTAG GTTTCATGACTTGGGACGG (SEQ) DN 8) TTATAACTATGAGGATGCCGTTATC ATGAGCGAACGTTTAGTTAAAGATGATGTCTATACATCTATTCATATCGAAGA ATACGAATCAGAAGCACGTGACACTAAATTAGGACCTGAAGAAATTACTCGT GATATTCCTAATGTGTCTGAAAGTGCGCTTAAAAACTTAGACGATCGTGGTA TCGTTTATGTTGGTGCCGAAGTTAAAGATGGTGACATCTTAGTAGGCAAAGT AACGCCTAAAGGTGTAACGGAACTAACAGCAGAAGAAAGATTATTACATGCT ATTTTCGGTGAAAAGGCTCGTGAAGTTCGTGATACTTCATTACGTGTACCAC ATGGTGCAGGGGGCATCGTATTAGATGTAAAAGTCTTCAACCGTGAAGAGG

GCGATGACACTTTATCTCCTGGTGTAAATCAATTAGTACGTGTTTATATCGTT CAAAAACGTAAAATTCATGTAGGGGATAAAATGTGCGGTCGTCATGGTAATA AAGGTGTTATTTCTAAAATTGTTCCTGAAGAAGATATGCCATACTTACCTGAT GGTCGACCAATCGACATCATGTTAAATCCACTTGGTGTACCTTCACGTATGA ACATTGGACAAGTGCTAGAATTACACTTAGGTATGGCTGCTAAAAACTTAGG CATCCACATTGCATCACCAGTATTTGATGGTGCTAATGATGATGATGTTTGG TCTACAATCGAAGAGGCCGGCATGGCACGTGATGGTAAGACTGTATTATAT GATGGGCGTACGGGTGAACCGTTTGATAACCGTATTTCTGTAGGTGTAATG TACATGCTTAAACTTGCTCACATGGTTGATGACAAATTGCATGCACGTTCAA

CAGGACCATACTCACTCGTTACACAACAACCACTCGGTGGTAAAGCACAATT TGGTGGACAACGTTTCGGTGAGATGGAGGTATGGGCACTTGAAGCATATGG TGCTGCTTATACTTTACAAGAAATCTTAACTTATAAATCTGACGATACAGTAG GACGTGTTAAAACTTACGAATCTATCGTTAAAGGTGAAAACATCTCTAGACC AAGTGTTCCTGAGTCATTCCGAGTACTGATGAAAGAATTACAAAGTTTAGGA TTAGATGTTAAAGTAATGGATGAGCATGATAATGAAATTGAAATGGCAGATG TTGATGATGAAGATGCAACGGAACGCAAAGTAGATTTACAACAAAAAAATGC TCCGGAATCACAAAAAGAAACAACTGATTAATAAGCACTTAAGATAAATGAA TACTTAAAGGGTATGAAATGATTATCATTTCAACTTCTTTAGGTATTCGATTT CAATGAAAGTAATCAATCAAATAGCACAGCTAATCTAAATTGAAGGAGGTAG GCTCCTTGATTGATGTAAATAATTTCCATTATATGAAAATAGGATTAGCTTCA CCTGAAAAGATTCGTTCTTGGTCATATGGTGAAGTTAAGAAACCTGAAACAA

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TAAACTATCGTACTTTAAAGCCAGAAAAAGATGGTCTTTTCTGTGAAAGAATT TTCGGACCTACAAAAGACTGGGAAATTTTTAA-3'
SEQ ID N04 : Séquence du gène rpoB de Staphylococcus lugdunensis
Cette séquence mesure 3.855 paires de bases et possède un contenu en cytosine plus guanosine de 36,4% est déposée dans GenBank sous le numéro GenBank accession AF325870.

5'ATGTCTTATGATTGGTTCCTAAAAGAAGGTTTACTAGAAATGTTCCGTGAT ATCTCACCAATTGAAGATTTCACAGGTAACCTATCATTAGAGTTTGTAGATTA CAGATTAGGTGAACCAAAGTATGATTTAGAAGAATCGAAAAATCGTGACGCT ACTTATGCTGCACCTCTTCGTGTTAAAGTGCGTCTCGTTATAAAAGAAACAG GTGAAGTTAAAGAGCAAGAAGTATTTATGGGAGACTTCCCATTAATGACAGA TACAGGTACGTTTGTTATTAATGGTGCAGAGCGTGTTATTGTATCGCAATTA GTACGTTCACCATCCGTTTACTTTAATGAAAAAATTGACAAAAACGGACGAG

AAAATTATGATGCTACAATCATTCCTAACCGTGGTGCCTGGTTAGAATACGA AACAGATGCTAAAGATGTTGTCTATGTTCGTATTGATAGAACTCGTAAATTG CCATTAACTGTCTTATTACGCGCATTAGGCTTTTCAACTGATCAAGAAATTGT TGAGTTGTTAGGCGATAACGAATACTTGCGTAATACATTAGAAAAAGACGGA ACAGAAAACACTGAACAAGCGTTATTAGAAATTTATGAACGTTTACGTCCTG GTGAACCACCAACAGTTGAAAATGCAAAAAGTTTATTATATTCTCGCTTCTTC GATCCGAAACGCTATGATTTAGCAAGCGTTGGACGTTATAAAGCGAACAAAA AATTGCATCTAAAACACCGTTTATTTAATCAAAAATTAGCAGAGCCTATCGTA AACAGCGAAACAGGTGAAATTGTTGCTGAAGAAGGTACTGTATTAGATCGTC GCAAATTAGACGAAATTATGGACGTTCTTGAAACAAATGCGAATAGTGAAGT ATTCGAATTAGAAGGAACAGTAATAGACGAACCGGTTGAAATTCAATCAATC AAAGTCTATGTACCAAATGATGAAGAAGGTTGTACAACAACGATAATTGGTA ATGCTTTACCAGATTCAGAAGTGAAATGTATCACACCTGCAGATATTATTTCT TCTATGAGTTACTTCTTCAACTTATTAGCTGGCATTGGTTACACGGATGATAT CGATCATTTAGGTAACCGTCGTTTACGTTCAGTTGGTGAGTTATTGCAAAAC CAA TTCCGT A TTGGTTT (SEQ ID N07) A TCAAGAA TGGAACGTGTTGTGCGT GAAAGAATGTCAATTCAAGATACCGAATCTATCACACCACAACAATTAATTAA

TATTAGACCAGTTATTGCATCAATTAAAGAATTCTTTGGTAGTTCTCAATTAT CACAATTCA TGGACCAAGC (SEQIDN09) T AACCCATT AGCAGAATT AACACA

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CAAACGTCGTTTATCTGCGTTAGGACCTGGTGGTTTAACACGTGAACGTG CACAAATGGAAGTTCGTGACGTGCATTATTCTCACTATGGCCGTATGTGTC CGATTGAAACACCAGAGGGTCCAAACATTGGTTTGATTAACTCATTATCTA GTTATGCGCGTGTCAACGAGTTTGGCTTTATTGAAACGCCTTATCGTAAAG TAGATATTGATACAAATGCAATCACAGATCAAATTGACTACTTAACTGCTG ATGAAGAAGACAGTTATGTCGTTGCACAAGCGAACTCTCGCCTTGATGAA AATGGTCGTTTCTTAGATGATGAAGTAGTATGCCGTTTCCGCGGTAATAAT ACTGTTATGGCTAAAGAAAAAATGGACTACATGGATGTATCTCCTAAACAA GTTGTTTCAGCTGCGACAGCATGTATTCCATTCTTAGAGAACGATGACTCT AACCGTGCATTGATGGGTGCAAACATGCAACGTCAAGCAGTTCCGTTGAT GAACCCTGAAGCGCCGTTCGTAGGAACAGGTATGGAGCATGTTGC (SEQID N 10) TGCTCGTGACTCTGGTGCTGCGATTACTGCAAAATACAGAGGTCGTGT AGAACACGTTGAATCTAATGAAATCCTAGTGCGTCGATTAATTGAAGAAAAT GGAAAAGAATATGAAGGCGAACTTGATCGCTATCCATTAGCGAAGTTTAAAC GCTCTAACTCTGGTACATGTTATAACCAACGTCCAATTGTTTCTATTGGCGA CGTTGTAGAATACAATGAAATTCTAGCTGACGGTCCATCAATGGAGCTTGGT GAAATGGCATTAGGCCGCAACGTTGTAGTTGGTTTCATGACTTGGGACGG ( SEQIDN 8) CTATAACTATGAAGATGCTGTCATCATGAGTGAACGTTTAGTCAA AGATGACGTTTACACATCTATTCATATTGAAGAATATGAATCAGAAGCACGT GATACGAAATTAGGACCTGAGGAAATCACACGTGATATTCCTAACGTCTCTG AAAGTGCACTTAAAAACTTAGACGATCGCGGTATTGTTTATGTAGGTGCAGA AGTTAAAGATGGCGATATTTTAGTAGGTAAAGTAACGCCTAAAGGTGTCACA GAGCTAACAGCTGAAGAACGTCTATTACATGCAATCTTTGGTGAAAAAGCAC GTGAAGTGCGTGACACTTCATTGCGTGTACCACATGGTGCTGGCGGTATTG TGCTAGATGTTAAAGTCTTCAACCGTGAAGAAGGAGATGACACACTTTCTCC AGGTGTTAACCAATTAGTACGCGTATATATTGTGCAGAAACGTAAAATACAC GTTGGGGACAAAATGTGTGGTCGTCATGGTAACAAAGGTGTCATTTCTAAG ATTGTTCCAGAAGAGGACATGCCTTATTTACCAGATGGACGTCCAATTGATA TTATGTTAAACCCACTTGGTGTGCCATCACGTATGAACATTGGACAAGTTCT AGAGTTGCATTTAGGTATGGCTGCTAAAAACTTAGGTATTCATGTTGCGTCA CCAGTATTTGATGGTGCGAACGATGAAGATGTATGGTCAACAATTGAAGAA GCTGGTATGGCACGTGACGGTAAAACCGTATTATATGATGGCCGTACAGGT GAGCCATTCGACAACCGTATCTCAGTTGGAGTTATGTACATGCTTAAACTTG

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CACATATGGTTGATGACAAATTACATGCTCGTTCAACAGGTCCATACTCATT AGTTACACAACAACCACTTGGTGGTAAAGCACAATTTGGTGGACAACGTTTC GGTGAGATGGAAGTATGGGCACTTGAAGCTTATGGTGCTGCCTATACATTG CAAGAAATCCTTACTTATAAATCTGATGATACGGTAGGCCGTGTTAAAACAT

ACGAAGCTATCGTTAAAGGTGAAAACATTTCTAGACCAAGTGTTCCTGAATC ATTCCGTGTATTGATGAAAGAACTTCAAAGTTTAGGTTTAGATGTGAAAGTG ATGGATGAGCACGATAACGAAATCGAAATGGCAGATGTTGAAGATGAAGAT ACAACAGAGCGCAAAGTAGATTTGCAACAAAAAGATGCGCCACAATCTCAA CAAGAAGAAACTGCTGATTAGTCAATATATTAGATATAAGGAATGGTGTTAG GAACAAGTGCTACGGATGTTTAAACATAATGTGTTTTGAGTTGCATCCATCC

TAACCTTTCCTTAATTTCAATAGATGTAAATCAATCAAATGGCACAGCTAATC TAAATTGAAGGAGGTAGGCTCCTTGATTGATGTAAATAATTTCCATTATATGA AAATCGGTTTAGCCTCACCTGAAAAAATTCGTTCATGGTCATATGGTGAAGT GAAAAAACCAGAAACAATTAATTATCGTACGTTAAAACCAGAAAAAGATGGC TTATTCTGTGAGAGAATATTCGGCCCAACTAAAGATTGGGAATGTAGTTGTG GTAAATACAAACGTGTGCGTTATAAAGGCATGGTTTGTGATAGATGTGGTGT TGTAA-3'
SEQ ID ? 5 : Séquence du gène rpoB de Staphylococcus caprae
Cette séquence mesure 3.698 paires de bases et possède un contenu en cytosine plus guanosine de 37,4% est déposée dans GenBank sous le numéro GenBank accession AF325868.

5'ATGAAACTTAATAGAAATTCAAACTAAATCTTACGATTGGTTCCTTAAAGAA GGTTTATTAGAAATGTTTAGAGACATTTCTCCAATTGAAGATTTCACAGGTAA CCTATCTTTAGAATTTGTAGATTATAGATTAGGTGATCCGAAATACGATTTAG AAGAATCTAAAAACCGTGACGCTACTTATGCTGCACCTCTTCGTGTGAAAGT ACGTCTCATTATTAAAGAAACAGGCGAAGTGAAGGAACAAGAAGTCTTCATG GGTGATTTCCCATTAATGACTGACACAGGTACATTCGTTATCAATGGTGCTG AACGTGTTATCGTTTCTCAATTAGTACGTTCACCATCCGTTTATTTCAACGAG AAAATTGATAAAAATGGACGCGAAAACTACGATGCAACTATCATTCCTAACC GTGGTGCTTGGTTAGAATATGAAACAGATGCGAAAGATGTAGTATACGTTCG TATCGATAGAACTCGTAAATTACCATTGACAGTATTATTACGTGCACTAGATT TCTCAACTGATCAAGAAATTGTTGATTTACTAGGTGAGAGTGAATATTTACGT

<Desc/Clms Page number 25>

AATACATTAGAAAAAGATGGTACTGAAAATACTGAACAAGCATTATTAGAAAT TTATGAACGTTTACGTCCTGGCGAACCACCAACAGTTGAAAATGCTAAAAGC TTATTATACTCACGCTTCTTCGACCCTAAACGTTATGATTTAGCAAGTGTTGG TCGTTACAAAGCTAACAAAAAGTTACATTTAAAACACCGTTTATTTAATCAAA AATTAGCAGAACCTATTGTTAATAGTGAAACAGGTGAGATTGTAGCTGAAGA AGGTACTGTATTAGATCGTCGTAAAATTGACGAAATCATGGACGTTTTAGAA ACAAACGCTAACAGTGAAGTTTTCGAATTAGAAGGTAGCGTTATTGACGAAC CTGTTGAAATTCAATCAATTAAAGTCTATGTACCTAATGATGAAGAAGGTCG CACAACTACTGTAATTGGTAATGCATTACCAGATTCAGAAGTTAAATGTATTA CTCCAGCTGATATCATTGCGTCAATGAGTTATTTCTTCAACTTATTAAATGGT ATTGGTTATACAGATGATATCGACCACTTAGGTAACCGTCGTTTACGTTCAG TTGGTGAACTTTTACAGAACCAATTCCGTATCGGTrn' (SEQIDN 7) ATCAAG AATGGAACGTGTTGTTCGTGAAAGAATGTCTATTCAAGACACTGATTCAATC ACACCACAACAATTAATCAACATTCGTCCGGTTATTGCGTCTATTAAAGAATT CTTCGGAAGTTCACAA TT A TCGCAATTCATGGACCAAGC (SEQIDN09) T AAC CCATTAGCTGAGTTGACTCATAAACGTCGTCTATCAGCATTAGGACCTGGT GGTTTAACGCGTGAACGTGCCCAAATGGAAGTGCGTGACGTTCACTATTC TCACTATGGCCGTATGTGTCCAATCGAAACACCTGAGGGACCAAACATTG GTTIAATCAACTCATTATCAAGTTATGCACGAGTAAATGAATTTGGTTTTAT TGAAACACCTTATCGTAAAGTAGATTTAGATACGAATTCTATCACTGACCA AATTGATTACTTAACTGCTGATGAAGAAGATAGTTATGTTGTTGCCCAAGC GAACTCTCGTTTAGACGAAAATGGTCGTTTCTTAGATGACGAAGTTGTTTG TCGTTTCCGTGGTAATAACACAGTTATGGCTAAAGAGAAAATGGACTACAT GGATGTATCTCCTAAACAAGTAGTATCTGCAGCGACAGCTTGTATTCCATT CTTAGAAAATGATGACTCTAACCGTGCATTAATGGGTGCGAACATGCAAC GTCAAGCAGTACCATTGATGAATCCAGAAGCGCCATTTGTTGGTACAGGT ATGGAACATGTAGC (SEQIDN'10) CGCACGTGATTCAGGTGCAGCGATTACT GCTAAACATAGAGGACGCGTTGAACACGTTGAATCTAACGAAGTATTAGTAC GTCGTTTAGTAGAAGAAAACGGCACTGAACATGAAGGTGAATTAGATCGTTA CCCATTAGCTAAATTCAAACGTTCAAACTCTGGTACATGTTATAACCAACGT CCAATTGTTTCTGTTGGTGATGTAGTAGAATACAATGAAATTTTAGCTGACG GTCCTTCAATGGAATTAAGGTTGAAATGGCATAGGGACGTAACGTTGTTAGT TGGTTTCATGACTTGGGACGG DN 8) TTATAACTACGAGGATGCTGTTA

<Desc/Clms Page number 26>

TCATGAGTGAACGTTTAGTTAAAGATGACGTTTATACTTCTATTCACATTGAA GAATATGAATCTGAAGCTCGTGATACTAAGTTAGGACCTGAAGAAATTACTC GTGACATTCCTAACGTATCTGAAAGTGCACTTAAAAACTTAGACGATCGCGG TATCGTTTATGTTGGTGCTGAAGTTAAAGACGGTGACATCTTAGTAGGTAAA GTAACGCCTAAAGGTGTAACTGAATTAACAGCTGAAGAAAGATTATTACATG CTATCTTCGGTGAAAAGGCTCGTGAAGTCCGCGATACATCATTACGTGTAC CACATGGTGCAGGCGGTATCGTTCTAGATGTTAAAGTATTCAATCGTGAAGA AGGCGATGATACGTTATCTCCAGGTGTAAACCAATTGGTACGTGTTTATATC GTTCAAAAACGTAAAATTCATGTAGGGGACAAAATGTGTGGTCGTCACGGTA ACAAAGGTGTTATCTCTAAAATTGTTCCTGAAGAAGATATGCCATACTTACCA GATGGTCGTCCAATCGACATCATGTTAAACCCACTTGGTGTACCATCACGTA TGAACATCGGACAAGTACTTGAGTTGCATTTAGGTATGGCTGCTAAGAACTT AGGCATCCATGTAGCATCTCCAGTATTCGATGGTGCAAACGATGATGATGTA TGGTCAACAATTGAAGAAGCAGGTATGGCTCGTGATGGTAAAACTGTATTAT ACGATGGACGTACAGGTGAACCATTCGATAACCGTATTTCTGTAGGTGTCAT GTACATGCTTAAACTTGCTCACATGGTTGACGATAAATTACACGCACGTTCA ACTGGACCATACTCACTTGTTACACAACAACCACTTGGTGGTAAAGCACAAT TCGGTGGTCAACGCTTCGGTGAGATGGAGGTATGGGCACTTGAAGCATATG GTGCTGCATACACATTACAAGAAATCTTAACTTATAAATCTGACGATACAGTA GGTCGTGTTAAAACTTACGAATCTATCGTTAAAGGTGAAAATATCTCTAGAC CAAGTGTTCCAGAATCATTCAGAGTATTGATGAAAGAATTACAAAGTTTAGG ATTAGATGTTAAAGTGATGGACGAGCAAGACAACGAAATTGAAATGGCGGA CGTTGATGATGAAGATGCAACTGAACGCAAAGTAGATTTACAACAAAAAAAT

GCTCCCGAATCACAAAAAGAAACAACTGATTAATAAGCACTTAAGATAAATG AATCCTAAAGAGGTTATGAGATGGTTGCCATTTCAACCTCTTTAAGGTATTC GATTTCAATGAATGTAAATCAATCAAATAGCACAGCTAATCTAAATTGAAGGA GGTAGGCTCCTTGATTGATGTAAATAATTTCCATTATATGAAAATAGGATTAG CTTCACCTGAAAAAATTCGTTCTTGGTCTTATGGTGAAGTTAA-3'
SEQ ID ? 6 : Séquence du gène rpoB de Staphylococcus intermedius
Cette séquence mesure 3.851 paires de bases et possède un contenu en cytosine plus guanosine de 39,2%, elle est déposée dans GenBank sous le numéro GenBank accession AF325869).

<Desc/Clms Page number 27>

5'ATGTAAACTTAATAGAAATTCMAACTAAATCGTATGATTGGTTCTTAAAAGA AGGTTTATTAGAAATGTTCCGTGATATTTCTCCTATTGAAGACTTCACGGGTA ATCTTTCATTAGAATTTGTTGATTATAGATTAGGTGAACCAAAGTATGATTTA GAAGAATCAAAAAACCGTGATGCAACATACGCGGCACCATTACGTGTGAAA GTTCGTTTAATCATTAAAGAAACAGGCGAAGTGAAAGATCAAGAAGTATTTA TGGGTGATTTCCCATTAATGACAGAAACAGGTACTTTTGTGATTAACGGGGC AGAACGTGTTATCGTATCACAATTAGTCCGTTCACCATCTGTATACTTCAATG AAAAATTAGATAAAAACGGATGCGTGAATTATGATGCGACAGTCATTCCTAA CCGTGGTGCTTGGTTGGAATATGAAACAGATGCGAAAGATGTCGTTTATGT GCGTATCGATAGAACGAGAAAGTTACCATTAACAGTATTATTACGTGCGTTA GGTTATTCAACAGACCAAGAAATTATTGAATTAATTGGGGATAATGAATATTT ACGTAATACATTAGAAAAAGATAGCACAGAAAATACAGAGCAAGCATTACTT

GAAATTTATGAACGTTTACGTCCAGGTGAACCACCTACTGTAGAAAACGCAA AAAGCTTATTATACTCACGTTTCTTTGACCCTAAACGTTATGATTTAGCAAGC GTTGGACGTTATAAAGCAAACAAAAAGTTACATTTAAAACACCGCCTATTCA ATCAAAAATTAGCTGAACCGATCGTTAATACTGAAACAGGCGAAATTGTTGC TGAAGAAGGCACTGTTTTAGATCGTCGTAAATTAGATGAAATTATGGACGTT CTTGAAACAAATGCGAATGCACAAGTTTATGAACATTCCAAACGGATCATTG ATGAGCCAGTAGAAATTCAATCAATTAAAGTATATGTACCGAATGATGATGA AGAACGTACAACAACAGTTATTGGTAATGCATTCCCAGATTCAGAAGTGAAA TGTATTACACCGGCTGATATTGTGGCATCTATGTCATACTTCTTCAACCTATT ACATGGTATTGGTTACACAGACGATATTGACCACCTTGGTAACCGCCGTCTA

CGTTCAGTTGGTGAGTTGTTACAAAACCAATTCCGTATCGGTTT (SEQIDN 7) ATCAAGAATGGAACGTGTGGTACGTGAAAGAATGTCTATTCAAGATACAGAC TCTATCACACCGCAACAATTAATTAATATTCGTCCAGTGATTGCATCAATTAA AGAGTTCTTTGGTAGCTCGCAATTATCTCAATTCATGGACCAAGC (SEQID N 9) GAACCCACTTGCTGAGTTGACTCACAAACGTCGTCTATCAGCATTAGG ACCTGGTGGTTTAACGCGTGAACGTGCTCAAATGGAAGTGCGTGACGTAC ACTACTCTCACTATGGTCGTATGTGTCCAATCGAAACACCTGAGGGACCA AACATTGGTTTGATCAACTCATTATCTAGTTATGCACGTGTGAACGAATTT GGTTTTATCGAAACACCATATCGTAAAGTTGATATTGAAACAAATACGATT ACTGACCAAATCGACTACTTAACTGCTGATGAAGAAGATAGTTATGTTGTC GCACAAGCGAACTCACGTCTTGATGAAAACGGTCGCTTTATTGATGATGA

<Desc/Clms Page number 28>

GATTGTATGTCGTTTCCGTGGTAACAACACAACGATGGCGAAAGAAAAAA TGGACTACATGGACGTATCGCCGAAACAAGTTGTATCAGCTGCGACAGCG TGTATCCCATTCTTAGAAAACGATGACTCTAACCGTGCGTTAATGGGTGCG AACATGCAGCGTCAAGCGGTACCGTTGTTAAACCCTGAATCTCCATTTGTA

GGT ACAGGT ATGGAACACGTTGC (SEQIDN01 O) TGCACGTGACTCAGGTGCT GCTGTCATTTCTAAATATCGCGGTCGTGTTGAACATGTCCAATCTAGCGAGA TTTTAGTCCGTCGTTTAGTTGAAGAAAACGGTCAAGAAGTAGATGGTACGTT AGATCGTTATCCATTAGCGAAATTTAAACGTTCGAACTCAGGTACATGTTATA ACCAACGTCCAATCATCGCAAAAGGTGACATTGTGGAAAAAGGCGAAATCC TTGCTGATGGTCCTTCAATGGAACTTGGTGAAATGGCATTAGGTCAGAAAC

GTAGTAGTTGGTTCATGACTTGGGACGGfSEQ) DN 8) TTATAACTATGAGGAT GCCGTTATCATGAGTGAACGTTTGGTTAAAGATGATGTGTACACGTCTATTC ATATTGAAGAATACGAATCAGAAGCGCGTGACACAAAACTTGGACCTGAAG AAATCACACGTGATATTCCTAACGTATCTGAAAATGCACTGAAAAACTTAGAT GATCGCGGTATCGTTTATGTAGGTGCGGAAGTTAAAGACGGCGACATCTTA GTGGGTAAAGTAACGCCAAAAGGTGTAACAGAATTAACTGCAGAAGAACGT TTATTACATGCAATCTTTGGTGAAAAAGCACGTGAAGTACGTGATACATCAT TACGTGTACCTCACGGCGCGGGCGGTATTGTACTTGATGTTAAAGTGTTCA

ATCGTGAAGAAGGCGATGATTCACTTTCACCAGGTGTGAACCAACTCGTAC GTGTTTACATTGTTCAAAAACGTAAAATTCATGTAGGGGACAAAATGTGTGG TCGTCACGGTAACAAAGGTGTCATCTCTAAAATTGTTCCTGAAGAAGACATG CCGTACTTACCAGACGGTCGTCCAATCGACATCATGTTGAACCCACTCGGT GTACCATCTCGTATGAACATCGGACAAGTTTTAGAGCTCCACTTAGGTATGG CAGCTAAAAACTTAGGTATCCACGTTGCATCACCAGTATTCGATGGTGCGAA CGATGATGACGTATGGTCTACAATTGAAGAAGCAGGTATGGCACGTGATGG TAAAACTGTCCTTTACGATGGACGTACAGGTGAACCATTCGACAACCGTATC TCTGTAGGTGTCATGTACATGCTGAAACTTGCACACATGGTTGATGACAAGC TTCACGCACGTTCTACAGGACCTTACTCACTTGTTACACAACAACCGCTTGG TGGTAAAGCACAGTTTGGTGGACAAAGATTTGGTGAGATGGAGGTATGGGC ACTTGAAGCATACGGTGCAGCATACACATTACAAGAAATCCTCACATACAAA TCAGATGACACAGTAGGTCGTGTGAAAACTTACGAAGCTATCGTTAAAGGT GAAAACATCTCAAGACCAAGTGTTCCTGAATCATTCCGCGTATTGATGAAAG AATTACAAAGTTTAGGTCTTGACGTTAAAGTGATGGACGAACAAGATAACGA

<Desc/Clms Page number 29>

AATTGAAATGCGTGACTTAGACGATGATGATATTCCAGATCGCAAAGTCAAC ATTCAACCATCAACTGTTCCTGAATCACAAAAAGAATTTAACGAATAATGATG AATTGTAGATAAGATTAAACGGAATAGAAACACTTGGTTAAGCTTGAGTTTG TGTTCAAATGTGACAGTTGAAATACAACAGATGTCATGTACGATTAATCTATT CGGAAATGTGATCGGAATCCAACGAGAGGGCTTGGGTTTCGATGCATATCC GATACTGCAACATTTTTAAGATAAATTGTAAATCAATCAACTAGCACAGTTAA TTTAAACTAAAGGAGGTAGGCTCCTTGATTGATGTAAATAAATTCCATTACAT GAAAATAGGACTCGCTTCACCTGAAAAAATTCGTTCTTGGTCATATGGTGAG GTCAAAAAGCCAGAAACAATTAACTACCGTACGTTAAAACCAGAAAAAGATG GTAA-3'
Cette séquence mesure 3.852 paires de bases et possède un contenu en cytosine plus guanosine de 39,2%, elle est déposée dans GenBank sous le numéro GenBank accession AF325869.

Exemple 2 : Séquençage partiel du gène rpoB de 26 espèces du genre Staphylococcus.

L'alignement de la séquence rpob déterminée chez les bactéries des espèces Staphylococcus aureus, Staphylococcus lugdunensis (GenBank accession AF325870), Staphylococcus intermedius (GenBank accession AF325869), Staphylococcus saccharolyticus (GenBank accession AF325871) et Staphylococcus caprae (GenBank accession AF325868) a permis de déterminer les séquences consensus des oligonucléotides suivants positionnés respectivement en position 2491-2511 et 3554-3573 du gène rpoB chez Staphylococcus aureus : - SEO ID n07 : 5'- AACCAATTCCGTATNGGTTT - 3' (où N représente l'inosine) - SEQ ID n 8= 5'-CCGTCCCAAGTCATGAAAC-3' déterminant théoriquement l'amplification d'un fragment de 1.063 paires de bases chez toute espèce du genre Staphylococcus.

SEO. ID. n08 est utilisée à titre d'amorce 3'et représente donc la séquence inverse complémentaire du brin direct représenté dans les séquences SEQ. ID. n 3 à 6 en position 3554-3573 chez Staphylococcus aureus.

<Desc/Clms Page number 30>

Les inventeurs ont déterminé la position de ces deux amorces SEQ. ID. n 7 et SEQ. ID. nO 8, de façon à respecter les critères suivants : 1-séquence encadrée par ces deux amorces spécifiques de l'espèce de la bactérie. Cette condition est vérifiée après alignement des fragments de 1063 pb avec l'ensemble des séquences des gènes bactériens rpoB disponibles dans les banques de données informatiques.

2-recherche d'une région d'identification la plus courte possible afin d'augmenter le plus possible la sensibilité de la détection moléculaire 3-recherche d'une région proche de celle préalablement travaillée par les inventeurs dans le monde des entérobactéries [Mollet C. (1997) Mol. Microbiol., 26 : 1005-11] afin de tendre vers une zone de travail commune à ces deux genre et famille bactériens.

4-la longueur des amorces de 18 à 22 pb, 5-séquence des amorces présentant une température de fusion voisine, 6-séquence des amorces ne permettant pas d'auto-hybridation ni de complémentarité.

L'analyse in silico laissait prévoir que ces deux oligonucléotides SEQ ID n 7 et SEQ ID n 8 devaient permettre l'amplification par procédé PCR un fragment de 1. 063 paires de bases du gène rpoB chez toutes les espèces du genre Staphylococcus. En réalité, l'amorce de la séquence SEQ. ID. n 8 n'accrochait par sur une espèce rare et pour des raisons indéterminées. En effet, les expériences réalisées au laboratoire ont montré que l'espèce du genre : Staphylococcus schleiferi n'était pas amplifié par cette paires d'amorces oligonucléotidiques, montrant le caractère aléatoire des prédictions réalisées sur les amorces. Les inventeurs ont donc par tâtonnement déterminé un nouvel oligonucléotide de séquence SEQ ID n 10 positionné en position 3241-3261 dans Staphylococcus aureus, qui combiné avec l'oligonucléotide SEQ ID n 7 dans une réaction d'amplification PCR, a effectivement permis d'obtenir un amplicon du gène rpoB d'une taille de 771 paires de bases (taille pour l'espèce de référence Staphylococcus aureus) chez les 29 espèces du genre Staphylococcus testées par les inventeurs.

SEQ ID n 10 = 5'- GCIACITGITCCATACCTGT - 3'

<Desc/Clms Page number 31>

SEQJD. n 10 est utilisée à titre d'amorce 3'. C'est pourquoi elle correspond à la séquence inverse complémentaire des séquences du brin direct représenté sur les séquences SEO. ID. n03 à 6.

Ce produit d'amplification est ensuite séquence par incorporation de deux amorces de séquençage SEO ID n 9 (localisée en position 2643-2660 du gène rpob dans les bactéries de l'espèce Staphylococcus aureus) et SEQ ID n 10 :

SEQ ID n 9 = 5'-CAA TTC ATG GAC CAA GC-3',
Cette dernière amorce a été déterminée pour respecter les contraintes d'une amorce de séquençage, c'est à dire d'une taille supérieure à 15 mères, ne s'hybridant pas avec la deuxième amorce utilisée pour le séquençage, et encadrant une zone d'en général environ 500 paires de bases dont la séquence est spécifique de chaque espèce dans le genre Staphylococcus.

En utilisant ce second jeu d'oligonucléotides de séquences SEQ ID n 9/ SEQ ID n010, les inventeurs ont donc finalement pu déterminer la séquence partielle du gène rpoB chez 29 espèces du genre Staphylococcus présentées ci-

après (SEQ ID n 11 à SEQ ID n 39).

Le fragment du gène rpoB a été amplifié par la technique PCR utilisant 35 cycles d'amplification comportant chacun une phase de dénaturation de 94 C pendant 10 secondes, une phase d'hybridation des amorces SEQ ID n 7 et 8 ou SEQ ID n 7 et 10 à 52 C pendant 20 secondes et une phase d'élongation à 72 C pendant 60 secondes. Le produit d'amplification est visualisé après coloration par le bromure d'éthidium.

Les bactéries représentant ces 29 espèces du genre Staphylococcus sont les suivantes :

<tb>
<tb> Espèce <SEP> Numéro <SEP> d'accès <SEP> GenBank <SEP> Reference
<tb> Staphylococcus <SEP> caprae <SEP> AF325868 <SEP> (SEQ. <SEP> ID. <SEP> n39) <SEP> CIP <SEP> 1040001
<tb> Staphylococcus <SEP> gallinarum <SEP> AF325890 <SEP> (SEQ.ID. <SEP> n <SEP> 27) <SEP> CIP <SEP> 103504
<tb> Staphylococcus <SEP> aureus <SEP> subsp. <SEP> AF325894 <SEP> (SEQ. <SEP> ID. <SEP> n 37) <SEP> CIP <SEP> 103780 <SEP> T
<tb> anaerobius
<tb> Staphylococcus <SEP> aureus <SEP> subsp. <SEP> X64172 <SEP> (SEQ. <SEP> ID. <SEP> n 36) <SEP> CIP <SEP> 103428
<tb> aureus
<tb>

<Desc/Clms Page number 32>

<tb>
<tb> Staphylococcus <SEP> epidermidis <SEP> AF325872 <SEP> (SEQ. <SEP> ID. <SEP> n 30) <SEP> CIP <SEP> 81. <SEP> 55 <SEP> 1
<tb> Staphylococcus <SEP> haemolyticus <SEP> AF325888 <SEP> (SEQ.ID.n 26) <SEP> CIP <SEP> 81. <SEP> 56 <SEP> 1
<tb> Staphylococcus <SEP> intermedius <SEP> AF325869 <SEP> (SEQ.ID.n 23) <SEP> CIP <SEP> 81. <SEP> 60 <SEP> 1
<tb> Staphylococcus <SEP> lugdunensis <SEP> AF325870 <SEP> (SEQ.ID.n <SEP> 20) <SEP> CIP <SEP> 103642
<tb> Staphylococcus <SEP> saccharolyticus <SEP> AF325871 <SEP> (SEQ.ID.n 17) <SEP> CIP <SEP> 103275
<tb> Staphylococcusschleiferi <SEP> AF325886 <SEP> (SEQ. <SEP> ID. <SEP> n 15) <SEP> CIP <SEP> 103643
<tb> subsp. <SEP> schleiferi
<tb> Staphylococcus <SEP> xylosus <SEP> AF325883 <SEP> (SEQ. <SEP> ID. <SEP> n011) <SEP> CIP <SEP> 81. <SEP> 66 <SEP> 1
<tb> Staphylococcus <SEP> capitis <SEP> subs. <SEP> capitis <SEP> AF325885 <SEP> (SEQ. <SEP> ID. <SEP> n 34) <SEP> A <SEP> TCC <SEP> 27840 <SEP> 1
<tb> Staphylococcus <SEP> arlettae <SEP> AF325874 <SEP> (SEQ.ID.n 38) <SEP> ATCC <SEP> 43957
<tb> Staphylococcus <SEP> warneri <SEP> AF325887 <SEP> (SEQ.ID. <SEP> n 12 <SEP> ATCC <SEP> 27836
<tb> Staphylococcus <SEP> hominis <SEP> AF325875 <SEP> (SEQ.ID.n 25) <SEP> ATCC <SEP> 27844
<tb> Staphylococcus <SEP> simulans <SEP> AF325877 <SEP> (SEQ.ID.n 13) <SEP> ATCC <SEP> 27848
<tb> Staphylococcus <SEP> saprophyticus <SEP> AF325873 <SEP> (SEQ.ID.n 16) <SEP> ATCC <SEP> 15305
<tb> Staphylococcus <SEP> equorum <SEP> AF325882 <SEP> (SEQ.ID. <SEP> n 29) <SEP> ATCC <SEP> 43958
<tb> Staphylococcus <SEP> cohnii <SEP> subsp. <SEP> Cohnii <SEP> AF325893 <SEP> (SEQ. <SEP> ID. <SEP> n 31) <SEP> ATCC <SEP> 29974 <SEP> 1
<tb> Staphylococcus <SEP> auricularis <SEP> AF325889 <SEP> (SEQ.ID. <SEP> n 35) <SEP> ATCC <SEP> 33753
<tb> Staphylococcus <SEP> carnets <SEP> subsp. <SEP> AF325880 <SEP> (SEQ. <SEP> ID. <SEP> n 33) <SEP> ATCC <SEP> 51365
<tb> Camosus
<tb> Staphylococcus <SEP> kloosii <SEP> AF325891 <SEP> (SEQ. <SEP> ID. <SEP> n 22) <SEP> A <SEP> TCC <SEP> 43959 <SEP> 1
<tb> Staphylococcus <SEP> chromogenes <SEP> AF325892 <SEP> (SEQ.ID. <SEP> n 32) <SEP> ATCC <SEP> 43764
<tb> Staphylococcus <SEP> hyicus <SEP> subs. <SEP> hyicus <SEP> AF325876 <SEP> (SEQ. <SEP> ID. <SEP> n 24) <SEP> ATCC <SEP> 11249 <SEP> 1
<tb> Staphylococcus <SEP> pulveris <SEP> AF325879 <SEP> (SEQ.ID. <SEP> n 18) <SEP> CCUG <SEP> 33938 <SEP> 1
<tb> Staphylococcus <SEP> muscae <SEP> AF325884 <SEP> (SEQ.ID. <SEP> n 19) <SEP> CIP <SEP> 1035641
<tb> Staphylococcus <SEP> lentus <SEP> AF036973 <SEP> (SEQ.ID.n 21) <SEP> ATCC <SEP> 49574
<tb> Staphylococcus <SEP> felis <SEP> AF325878 <SEP> (SEQ. <SEP> ID. <SEP> n 28) <SEP> CIP <SEP> 103366
<tb> Staphylococcus <SEP> sciuri <SEP> AF325881 <SEP> (SEQ.ID. <SEP> n 14) <SEP> ATCC <SEP> 29062
<tb>
ATCC, collection American Tissue Culture Collection ; CIP : Collection de l'lnstitut Pasteur collection ; T, souche type.

Les fragments d'en général environ 500 paires de bases du gène rpoB des bactéries des espèces du genre Staphylococcus dont la séquence est spécifique de chaque espèce de ce genre et permettant donc l'identification moléculaire des bactéries des 29 espèces testées sont :

<Desc/Clms Page number 33>

SEQ ID N011 : Séquence partielle du gène rpoB chez Staphylococcus xylosus, mesurant 518 paires de bases :

5'TTCAGGGTTCATCAATGGCACTGCTTGACGTTGCATGTTTGCACCCATCAA TGCACGGTTAGAGTCATCATTTTCTAAGAAAGGAATACATGCTGTCGCAGCA GAAACAACTTGTTTTGGTGAAACGTCCATGTAATCCATTTTTTCTTTAGCCAT AACTGTGTTATTACCACGGAAACGACAAACAACTTCATCATCTAAGAAACGA CCATTTTCATCTAATTTAGAGTTGGCTTGTGCTACCACATAACTATCCTCTTC ATCAGCTGTTAAGTAATCGATTTGCTCAGTAATGCTGTTTGTTTCAAGGTCTA CTTTACGATAAGGTGTTTCAATGAAACCAAATTCATTCACACGTGCATAACTA GACAATGAGTTGATAAGTCCAATGTTTGGACCTTCAGGCGTTTCGATTGGAC ACATACGGCCATAGTGAGAATAGTGAACGTCACGTACTTCCATTTGAGCAC GTTCACGTGTTAAACCACCAGGTCCTAGAGCAGATAAACGACGTTTGT-3' SEQ ID N012 : Séquence partielle du gène rpoB Staphylococcus warneri mesurant 507 paires de bases : 5'TTCAGGATTCATCAATGGTACTGCTTGACGTTGCATGTTCGCACCCATTAA TGCACGGTTAGAGTCATCGTTTTCTAAGAATGGAATACAAGCTGTAGCGGCT GAAACAACCTGCTTAGGTGAAACGTCCATGTAATCCATTTTTTCTTTAGCCAT TACTGTGTTATTACCACGGAAACGACAAACTACTTCGTCATCTATGAAACGT CCGTTTTCATCTAAACGTGAATTCGCTTGGGCAACAACATAACTATCTTCTTC

GTCAGCAGTTAAATAATCAATTTGGTCTGTAATCGCATTAGTGTCTAAATCCA CTTTACGATATGGTGTTTCAATGAAACCAAATTCGTTTACACGTGCATAACTA GATAATGAGTTGATTAATCCAATGTTTGGACCCTCTGGCGTTTCAATTGGAC ACATACGACCATAGTGAGAATAGTGTACGTCACGTACCTCCATTTGTGCACG TTCACGTGTTAAACCACCAGGTCCTAAAGCAGATAA-3' SEQ ID ? 13 : Séquence partielle du gène rpoB Staphylococcus simulans, mesurant 518 paires de bases : 5'TTCAGGGTTCATCAATGGTACTGCTTGACGTTGCATGTTCGCACCCATTAA CGCACGGTTAGAGTCATCGTTTTCTAAGAATGGGATACATGCTGTCGCTGC AGATACAACTTGTTTAGGAGAAACGTCCATATAGTCCATTTTCTCTCTATCCA TAGTTGTGTTGTTACCACGGAAACGACAAACGATTTCTTCGTCTAAGAAACG

<Desc/Clms Page number 34>

ACCTTCGTCATCTAAACGTGAGTTCGCTTGCGCAACAACATAGCTGTCTTCT TCGTCTGCAGTAAGGTAATCGATTTGATCTGTTACCGCATTTTTCTCATGGT CAACTTTACGATATGGTGTTTCAATGAAACCAAATTCATTAACACGCGCATAA CTTGATAATGAGTTGATTAAACCGATGTTCGGACCCTCTGGTGTCTCGATTG GACACATACGGCCATAGTGAGAGTAATGCACGTCACGTACTTCCATTTGTG CACGTTCACGTGTTAAACCACCAGGTCCAAGTGCAGATAGACGACGTTTAT - 3' SEQ ID N014 : Séquence partielle du gène rpoB chez Staphylococcus sciuri, mesurant 507 paires de bases : 5'TTCTGGGTTCATTAAAGGTACCGCTTGACGTTGCATGTTTGCACCCATAAG CGCACGGTTAGAGTCATCGTTTTCTAAGAATGGAATACATGCTGTCGCTGCA GAAACAACTTGTTTAGGAGATACATCCATGTAGTCCATGCGTTCTTTAGGTT TAGTAGTGTTGTCCCCACGGAAACGACAAAGAACTTCATCATCAACGAATTT ACCTGTTTCATCAAGTACAGAGTTTGCTTGTGCAACTACATAGCTGTCTTCTT CGTCAGCTGTTAAGTAGTCGATTCTGTCAGTAACTTGGTTTGTCTCGATGTT TACCTTACGATAAGGTGTTTCAATGAAACCAAATTCATTAACTCTTGCATAAC TTGATAATGAGTTGATTAAACCAATGTTTGGTCCCTCAGGCGTTTCAATTGG ACACATACGACCATAGTGAGAGTAGTGAACGTCACGTACTTCCATACCAGC ACGCTCACGAGTTAAACCACCCGGTCCTAATGCTGATAG-3' SEQ ID N015 : Séquence partielle du gène rpoB chez Staphylococcus schleifer, mesurant 518 paires de bases :

5'TTCTGGGTTTAACAATGGTACTGCTTGACGTTGCATGTTCGCACCCATCAA TGCACGGTTAGAGTCATCGTTTTCTAAAAACGGAATACATGCTGTCGCAGCT GAAACAACTTGTTTAGGCGATACGTCCATGTAGTCCATTTTTTCTTTAGCCAT AGTTGTGTTGTTACCACGGAAACGACAAACGATTTCGTCATCGATAAAACGT CCGTTTTCATCAAGTCTTGAGTTCGCTTGGGCAACAACATAACTGTCTTCTT CATCAGCAGTAAGGTAATCAATACGGTCTGTAATTGTGTTTGTTTCAAGGTC TACTTTTCTGTATGGAGTTTCAATGAAACCAAATTCATTCACACGTGCATAAC TTGAAAGTGAGTTGATCAAACCAATGTTTGGACCCTCTGGTGTCTCGATTGG ACACATACGGCCATAGTGAGAATAGTGTACGTCACGAACTTCCATTTGTGCA CGTTCACGTGTTAAACCACCAGGCCCTAAAGCTGATAAACGACGTTTGT-3'

<Desc/Clms Page number 35>

SEQ ID N016 : Séquence partielle du gène rpoB chez Staphylococcus saprophyticus, mesurant 518 paires de bases.

5'TTCTGGATTCATCAATGGCACTGCTTGACGTTGCATGTTCGCACCCATCAA TGCACGGTTAGAGTCATCGTTTTCTAAGAAAGGAATACATGCTGTCGCTGCA GAAACAACTTGTTTAGGTGAGACATCCATATAATCCATTTTTTCTTTGGCCAT AACTGTATTATTACCACGGAAACGACAAACAACTTCGTCTGCTATGAAACGG CCATTTTCGTCTAATGTTGAGTTTGCTTGTGCTACAACATAGCTATCTTCTTC

ATCAGCTGTTAAATAGTCAATTTGATCCGTGATTGAATTCGTTTCAAGATCCA CTTTACGGTAAGGTGTTTCAATAAAGCCGAATTCATTTACACGCGCATAACT AGATAACGAGTTAATAAGTCCGATGTTTGGACCCTCTGGCGTTTCAATTGGA CACATACGGCCATAGTGAGAATAGTGAACGTCACGTACTTCCATTTGAGCA CGTTCACGCGTTAAACCACCAGGTCCTAGAGCTGATAAACGACGTTTAT-3' SEQ ID N017 : Séquence partielle du gène rpoB chez Staphylococcus saccharolyticus, mesurant 556 paires de bases : 5'AAACCCATTAGCTGAGTTGACTCATAAACGTCGTTTATCAGCTCTAGGACC TGGTGGTTTAACTCGTGAACGCGCTCAAATGGAAGTACGTGACGTGCATTA

TTCTCACTACGGTCGTATGTGCCCTATTGAAACACCTGAGGGCCCAAACATT GGATTAATTAACTCATTATCTAGTTATGCAAGAGTAAATGAATTTGGTTTTAT TGAAACACCTTATCGTAAAGTTGATTTAGATACTAATTCAATCACTGACCAAA TTGACTACTTAACTGCTGATGAAGAAGATAGTTATGTTGTTGCACAAGCAAA CTCACGTCTTGATGAAAATGGGTGCTTCTTAGATGATGAAGTTGTTTGTCGT TTTCGTGGCAATAACACAGTGATGGCTAAAGAAAAAATGGACTATATGGACG TATCACCTAAACAAGTAGTTTCAGCAGCTACTGCATGTATCCCATTCTTAGA AAACGATGACTCAAACCGAGCATTAATGGGTGCAAACATGCAACGTCAAGC AGTACCATTAATGAACCCAGAAGCGCCATTTGTTGGA-3' SEQ ID ? 18 : Séquence partielle du gène rpoB chez Staphylococcus pulvers, mesurant 508 paires de bases : 5'TTCAGGATTCATTAAAGGCACTGCTTGACGTTGCATGTTTGCACCCATAAG CGCACGGTTAGAGTCATCGTTTTCTAAGAAAGGAATACATGCTGTCGCAGC

AGAAACAACCTGTTTAGGTGATACATCCATGTAATCCATACGTTCTTTAGGTT TCGTAGTATTATCCCCACGGAAACGACAAAGTACTTCATCATCAACGAATTT

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ACCT0TTTCATCAAGTACTGAGTTTGCTTGCGCTACAACATAGCTGTCTTCT TCGTCAGCTGTTAAATAGTCAATTCTGTCAGTAACTTGGTTTGTTTCGATATT

AACCTTACGATAAGGCGTTTCAATAAAACCAAATTCATTAACTCTCGCATAAC TTGATAAAGAGTTAATTAAACCGATGTTTGGTCCCTCAGGTGTTTCAATTGG ACACATACGACCATAGTGAGAATAGTGAACGTCACGTACTTCCATACCAGCA CGTTCACGAAGTTAAACCGCCGGGTCCTAATGCTGATAG-3' SEQ ID D ? 19 : Séquence partielle du gène rpoB chez Staphylococcus muscae, mesurant 518 paires de bases : 5'TTCAGGATTCAACAATGGCACCGCTTGACGTTGCATGTTCGCACCCATTAA

GGCACGGTTAGAGTCATCGTTTTCTAAGAATGGAATACATGCTGTCGCAGC AGAAACAACTTGCTTCGGCGATACGTCCATGTAGTCCATTTTCTCTTTTGCC ATTGTTGTGTTGTTACCACGGAAACGACATACAATCTCATCATCAATAAAGC GACCATTTTCATCTAAACGTGAGTTCGCTTGTGCAACCACATAACTATCTTCT TCATCAGCAGTTAAATAGTCGATTTGATCAGTGATTGTGTTCGTCTCGATAT CAACTTTACGATATGGTGTTTCAATGAAACCAAATTCATTAACACGTGCATAA CTAGATAGTGAGTTGATCAAACCAATGTTCAGTCCCTCTGGTGTCTCAATCG GACACATACGACCATAGTGAGAGTAGTGAACGTCACGCACTTCCATTTGTG CACGTTCACGTGTCAAACCACCAGGCCCTAATGCTGAAAGACGACGCTTAT - 3' SEQ ID ? 20 : Séquence partielle du gène rpoB chez Staphylococcus lugdunensis, mesurant 556 paires de bases : 5'TAACCCATTAGCAGAATTAACACACAAACGTCGTTTATCTGCGTTAGGACC

TGGTGGTTTAACACGTGAACGTGCACAAATGGAAGTTCGTGACGTGCATTA TTCTCACTATGGCCGTATGTGTCCGATTGAAACACCAGAGGGTCCAAACATT GGTTTGATTAACTCATTATCTAGTTATGCGCGTGTCAACGAGTTTGGCTTTAT TGAAACGCCTTATCGTAAAGTAGATATTGATACAAATGCAATCACAGATCAA ATTGACTACTTAACTGCTGATGAAGAAGACAGTTATGTCGTTGCACAAGCGA ACTCTCGCCTTGATGAAAATGGTCGTTTCTTAGATGATGAAGTAGTATGCCG TTTCCGCGGTAATAATACTGTTATGGCTAAAGAAAAAATGGACTACATGGAT GTATCTCCTAAACAAGTTGTTTCAGCTGCGACAGCATGTATTCCATTCTTAG

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AGAACGATGACTCTAACCGTGCATTGATGGGTGCAAACATGCAACGTCAAG CAGTTCCGTTGATGAACCCTGAAGCGCCGTTCGTAGGA-3' SEQ ID ? 21 : Séquence partielle du gène rpoB chez Staphylococcus lentus, mesurant 507 paires de bases : 5'TTCAGGGTTCATTAAAGGTACTGCTTGACGTTGCATGTTCGCACCCATTAA GGCACGGTTAGAGTCATCGTTTTCAAGGAAAGGAATACATGCTGATGGTGC AGAAACAACTTGTTTAGGAGATACATCCATGTAATCCATACGTTCTTTAGGTT TAGTAGTGTTGTCACCACGGAAACGACAAAGAACTTCATCGTCGACGAATCT ACCAGTTTCATCTAATACTGAGTTTGCTTGTGCAACAACATAACTATCTTCTT CATCAGCAGTTAGATAATCAATTCTGTCTGTTACTTGGTTAGTTTCGATATTA ACTTTACGATATGGTGTTTCAATAAAGCCAAACTCGTTAACTCTAGCATAACT TGAAAGTGAGTTGATTAAACCAATGTTTGGTCCCTCTGGTGTCTCAATCGGA CACATACGACCATAGTGAGAATAGTGAACGTCACGTACTTCCATACCAGCA CGTTCACGAGTTAAACCGCCGGGTCCAAGCGCTGATAG-3' SEQ ID ? 22 : Séquence partielle du gène rpoB chez Staphylococcus kloosii, mesurant 505 paires de bases : 5'TTCACGGTTCATCAATGGTACCGCTTGACGTTGCATGTTCGCACCCATTAA GGCACGGTTAGAGTCATCGTTTTCTAAGAAAGGAATACATGCTGTCGCAGC CGAAACAACTTGTTTTGGTGATACGTCCATGTAGTCCATTTTTTCTTTCGCCA TAACTGTGTTGTTACCACGGAAACGACAAACTACTTCATCATCTAAGAAACG ACCATTTTCATCTAATTTAGAGTTAGCTTGCGCTACCACATAGCTATCTTCTT CATCAGCTGTTAAATAGTCAATTTGATCTGTGATTGAATTAGTTTCTAAATCA ACTTTACGGTATGGTGTTTCGATAAAGCCAAATTCATTAACACGTGCATAAC TTGATAATGAGTTGATAAGTCCAATGTTTGGACCCTCTGGCGTTTCGATTGG ACACATACGACCATAGTGAGAATAGTAACGTCACGCACTTCCATTTGAGCAC GTTCACGAGTTAAACCACCAGGTCCAAGCCAGATAG-3' SEQ ID N023 : Séquence partielle du gène rpoB chez Staphylococcus intermedius, mesurant 556 paires de bases : 5'GAACCCACTTGCTGAGTTGACTCACAAACGTCGTCTATCAGCATTAGGAC CTGGTGGTTTAACGCGTGAACGTGCTCAAATGGAAGTGCGTGACGTACACT

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ACTCTCACTATGGTCGTATGTGTCCAATCGAAACACCTGAGGGACCAAACAT TGGTTTGATCAACTCATTATCTAGTTATGCACGTGTGAACGAATTTGGTTTTA TCGAAACACCATATCGTAAAGTTGATATTGAAACAAATACGATTACTGACCA AATCGACTACTTAACTGCTGATGAAGAAGATAGTTATGTTGTCGCACAAGCG AACTCACGTCTTGATGAAAACGGTCGCTTTATTGATGATGAGATTGTATGTC GTTTCCGTGGTAACAACACAACGATGGCGAAAGAAAAAATGGACTACATGG ACGTATCGCCGAAACAAGTTGTATCAGCTGCGACAGCGTGTATCCCATTCTT AGAAAACGATGACTCTAACCGTGCGTTAATGGGTGCGAACATGCAGCGTCA AGCGGTACCGTTGTTAAACCCTGAATCTCCATTTGTAGGT-3' SEQ ID ? 24 : Séquence partielle du gène rpoB chez Staphylococcus hyicus, mesurant 518 paires de bases : 5'CTCTGGGTTCAATAAAGGCACGGCTTGACGTTGCATGTTCGCACCCATTA ATGCACGGTTCGAGTCATCGTTTTCTAAGAATGGGATACATGCTGTCGCCG CAGAAACAACTTGTTTCGGTGATACGTCCATGTAATCCATTTTTTCTTTAGCC ATTGTTGTATTGTTCCCACGGAAACGACAAACGATTTCGTCGTCGATAAAGC GTCCATTTTCATCTAAACGTGAGTTCGCTTGGGCAACAACATAACTGTCTTC TTCATCCGCAGTTAAGTAATCAATTTGATCTGTTATTGTATTCGTTTCAAGGT CCACTTTACGGTAAGGCGTTTCAATGAAACCAAATTCGTTAACACGCGCATA ACTTGAAAGTGAGTTGATTAATCCAATGTTTGGACCCTCTGGCGTTTCGATT GGACACATACGACCGTAGTGAGAGTAGTGAACGTCACGCACTTCCATTTGG GCACGTTCACGCGTTAAACCACCAGGTCCTAATGCAGATAAACGACGTTTG G-3' SEQ ID ? 25 : Séquence partielle du gène rpoB chez Staphylococcus hominis, mesurant 518 paires de bases : 5'TTCAGGATTCATCAATGGTACTGCTTGACGTTGCATGTTCGCACCCATTAA CGCACGGTTAGAGTCATCGTTTTCAAGGAATGGAATACAAGCTGTCGCTGC TGATACTACTTGTTTAGGAGATACATCCATGTAGTCCATTTTTTCTTTTGCCA TAACAGTGTTGTTACCACGGAAACGACATACCACTTCATCATCTAGGAAACG ACCATTTTCATCTAAACGAGAATTGGCTTGTGCAACTACATAGCTATCTTCTT CATCAGCAGTTAAATAATCAATTTGATCAGTAATCGAATTGGTATCAATATCT ACTTTACGATATGGTGTTTCGATAAAACCAAATTCATTTACACGTGCATAACT

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AGATAATGAGTTAATTAAACCAATGTTTGGTCCCTCTGGTGTTTCAATTGGA CACATACGACCATAGTGAGAATAGTGTACGTCACGAACTTCCATTTGTGCAC GTTCACGTGTTAAACCACCAGGTCCTAAAGCAGAAAGACGACGTTTAG-3' SEQ ID ? 26 : Séquence partielle du gène rpoB chez Staphylococcus haemolyticus, mesurant 507 paires de bases : 5'TTCTGTGTTCATCAATGGTACTGCtTGACGTTGCATGTTTGCACCCATTAAT GCACGGTTAGAGTCATCATTTTCAAGGAAAGGAATACATGCTGTCGCAGCT GAAACTACTTGTTTAGGAGATACGTCCATGTAGTCCATTTTCTCTTTAGCCAT AACTGTGTTATTACCACGGAAACGACATACGACTTCATCATCTAAGAAACGA CCATTTTCATCTAAGCGAGAGTTCGCTTGGGCAACTACATAGCTATCTTCTT CATCAGCAGTTAAGTAGTCGATTTGATCTGTAATAGAGTTAGTGTCTAAGTC TACTTTACGATATGGTGTTTCAATGAAACCAAATTCATTCACACGTGCATAAC TTGATAATGAGTTAATCAAACCAATGTTTGGTCCCTCTGGAGTCTCGATCGG ACACATACGACCATAGTGAGAGTAGTGAACGTCACGTACTTCCATTTGAGCA CGTTCACGTGTTAAACCACCAGGTCCTAATGCAGAAAG-3' SEQ ID N027 : Séquence partielle du gène rpoB chez Staphylococcus gallinarum, mesurant 507 paires de bases : 5'TTCAGGATTCATCAAAGGTACAGCTTGACGTTGCATGTTCGCACCCATCAA TGCACGGTTAGAGTCATCGTTTTCTAAGAAAGGAATACATGCTGTCGCAGCA GATACAACCTGTTTAGGTGATACATCCATGTAGTCCATTTTTTCTTTTGCCAT TACAGTGTTGTTACCACGGAAACGACAAACGACTTCATCTTCTACGAAACGA CCATTTTCATCTAATACAGAGTTTGCTTGTGCTACTACATAACTGTCTTCTTC ATCAGCTGTTAAGTAGTCAATTTGATCTGTAATAGATTGTGTTTCAATATCAA CTTTACGATATGGTGTTTCAATGAAACCAAATTCATTTACACGCGCATAACTT GATAATGAGTTGATAAGTCCGATGTTTGGACCCTCAGGTGTTTCGATTGGAC ACATACGGCCATAGTGAGAATAGTGAACGTCACGTACTTCCATTTGAGCAC GTTCACGAGTTAAACCACCAGGTCCTAATGCTGATAG-3'

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SEQ ID ? 28 : Séquence partielle du gène rpoB chez Staphylococcus felis, mesurant 518 paires de bases : 5'TTCGGGATTCATTAAAGGTACAGCTTGACGTTGCATGTTCGCACCCATTAA TGCACGGTTAGAGTCATCGTTTTCTAAGAATGGGATACATGCCGTCGCAGC AGAAACGACTTGCTTAGGCGATACGTCCATGTAGTCCATTTTTTCTTTGGCC

ATCGTTGTATTGTTTCCGCGGAAACGACATACAATCTCGTCATCCAAGAAAC GGCCTTCTTCGTCTAATCGTGCGTTTGCTTGTGCAACAACATAACTATCTTC TTCATCAGCTGTAAGATAGTCAATTTGGTCTGTAATTTTATTTGTCTCAAGAT CGACTTTACGATATGGTGTTTCGATAAATCCAAATTCGTTAACACGTGCATA ACTTGATAATGAGTTGATTAATCCGATGTTCGGCCCCTCTGGCGTTTCAATA GGACACATGCGACCATAGTGAGAGTAGTGAACGTCACGCACTTCCATCTGT GCACGTTCTCTCGTTAAACCACCAGGTCCTAATGCGGATAGACGACGTTTAT - 3' SEQ ID ? 29 : Séquence partielle du gène rpoB chez Staphylococcus equorum, mesurant 507 paires de bases : 5'TTCAGGATTCATCAATGGCACTGCTTGACGTTGCATGTTTGCACCCATCAA

TGCACGGTTAGAGTCATCGTTTTCTAAGAAAGGAATACATGCTGTCGCAGCA GAAACAACTTGTTTAGGTGAAACATCCATGTAGTCCATTTTTTCTTTAGCCAT AACTGTGTTATTACCACGGAAACGACAAACAACTTCGTCTTCTACGAAACGA CCATTTTCATCTAATACAGAGTTTGCTTGAGCTACTACATAGCTGTCTTCTTC GTCAGCTGTTAAGTAGTCAATTTGGTCTGTGATTGAATGTGTTTCAAGATCT ACTTTACGGTAAGGTGTTTCAATGAAACCAAATTCATTCACACGCGCATAAC TAGATAGTGAGTTGATAAGTCCGATATTCGGACCCTCTGGTGTTTCGATTGG ACACATACGACCATAGTGAGAATAGTGAACGTCACGTACTTCCATTTGAGCA CGTTCACGTGTTAAACCGCCGGGTCCTAATGCTGATAA-3' SEQ ID ? 30 : Séquence partielle du gène repos chez Staphylococcus epidermidis, mesurant 518 paires de bases : 5'TTCAGGATTCATTAAAGGCACCGCTTGACGTTGCATGTTTGCTCCCATTAA CGCACGGTTAGAGTCGTCATTTTCTAAGAATGGAATACATGCTGTTGCTGCT GAAACAACTTGTTTTGGTGATACGTCCATGTAATCCATTTTTTCTTTAGCCAT AACAGTGTTATTACCACGGAAACGACAAACAACTTCATCATCTAAGAAACGA

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CCATTTTCATCAAGTCTAGAATTAGCCTGTGCAACAACGTAGCTATCCTCTT CATCAGCTGTCAAATAATCTATTTGATCAGTGATTGAGTTTGTATCTAAATCC ACTTTACGATATGGCGTTTCAATAAAACCAAATTCATTCACTCTAGCATAACT TGACAATGAGTTTATTAAACCAATATTAGGACCCTCAGGTGTTTCAATTGGA CACATACGCCCATAGTGAGAGTAGTGAACGTCACGCACTTCCATTTGAGCA CGTTCACGTGTTAATCCACCAGGCCCTAGAGCAGATAAACGACGTTTGT-3' SEQ ID ? 31 : Séquence partielle du gène rpoB chez Staphylococcus cohnii, mesurant 507 paires de bases : 5'TTCTGGATTCATCAATGGGACTGCTTGACGTTGCATGTTCGCACCCATTAA

TGCACGGTTAGAGTCATCGTTTTCTAAGAATGGAATACATGCTGTTGCTGCA GAAACAACCTGTTTAGGAGATACATCCATGTAATCCATTTTTTCTTTTGCCAT AACTGTGTTATTACCACGGAAACGACAAACAACTTCATCATCTAAGAAGCGA CCATTTTCATCTAACTTAGAATTTGCTTGTGCTACTACATAGCTATCTTCTTC GTCAGCTGTTAAATAATCAATTTGATCTGTGATACTATTCGTTTCAAGATCTA CTTTACGATATGGCGTTTCAATGAAACCAAATTCATTTACACGTGCATAACTT GATAATGAGTTAATCAAACCAATGTTTGGTCCCTCTGGTGTTTCGATTGGAC ACATACGACCGTAGTGAGAGTAGTGAACGTCACGCACTTCCATTTGAGCAC GTTCACGTGTTAAACCACCAGGTCCTAATGCTGATAG-3' SEQ ID ? 32 : Séquence partielle du gène rpoB chez Staphylococcus chromogenes, mesurant 507 paires de bases : 5'CTCAGGATTTAACAAAGGCACCGCTTGACGTTGGATGTTCGCACCCATTA

ACGCACGGTTAGAGTCATCGTTTTCTAAGAACGGAATACATGCAGTTGCCG CAGAAACAACTTGCTTCGGTGATACGTCCATGTAATCCATTTTTTCTTTAGCC ATTGTTGTATTGTTCCCACGGAAACGACAAACGATTTCGTCGTCGATAAAGC GTCCATTTTCATCTAAACGTGAGTTCGCTTGGGCAACAACATAACTGTCTTC TTCGTCCGCAGTTAAATAATCAATTTGATCAGTAATTGCGTTCGTTTCAAGGT CTACTTTACGATACGGCGTTTCAATAAAACCAAATTCATTAACACGCGCATA ACTTGAAAGTGAGTTGATTAATCCAATATTTGGACCCTCTGGTGTTTCGATT GGACACATACGACCGTAGTGAGAATAGTGAACGTCACGCACTTCCATTTGA GCACGTTCACGTGTTAAACCACCTGGTCCTAAAGCAGATAA-3'

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SEQ ID D ? 33 : Séquence partielle du gène rpoB chez Staphylococcus carnosus, mesurant 1.025 paires de bases : 5'TTCTGGATTCATCAATGGTACCGCTTGACGTTGCATGTTCGCACCCATTAA TGCACGGTTAGAGTCATCGTTTTCTAAGAATGGGATACAAGCTGTCGCAGC TGATACTACTTGTTTTGGTGATACGTCCATGTAGTCCATTTTGTCTCTGTCCA TCATTGTGTTGTTACCACGGAAACGACAAACAACTTCTTCGCTGATGAAGTG ACCTTCATCATCTAAACGAGAGTTCGCTTGGGCTACAACATAGCTGTCTTCT TCGTCAGCTGTTAGATAGTCGATTTGATCAGTTACAGTATTAGTTTCAAGGT CAACTTTACGGTATGGTGTTTCAATAAAACCGAACTCGTTAACACGTGCATA

ACTTGATAATGAGTTGATCAAACCAATGTTTGGACCCTCAGGAGTTTCGATT GGACACATACGGCCATAGTGAGAATAGTGAACGTCACGTACTTCCATTTGA GCACGTTCACGAGTTAAACCACCAGGTCCTAATGCAGATAATTCTGGATTCA TCAATGGTACTGCTTGACGTTGCATGTTCGCACCCATTAATGCACGGTTAGA GTCATCATTTTCTAAGAATGGAATACAAGCTGTCGCTGCAGATACTACTTGT TTAGGAGATACATCCATGTAGTCCATTTTCTCTTTAGCCATAACTGTGTTATT ACCACGGAAACGACAAACAACTTCGTCATCTAAGAAACGACCATTTTCGTCT AAACGAGAGTTCGCTTGGGCAACAACATAACTATCTTCTTCATCAGCAGTTA AGTAATCAATTTGGTCAGTGATAGAATTCGTATCTAAATCTACTTTACGATAA GGTGTTTCAATAAAACCAAATTCATTTACTCGTGCATAACTTGATAATGAGTT GATTAAACCAATGTTTGGTCCCTCAGGTGTTTCGATTGGACACATACGGCCA

TAGTGAGAATAGTGAACGTCACGCACTTCCATTTGGGCACGTTCACGCGTT AAACCACCAGGTCCTAATGCTGATAGACGACGTTTAT-3' SEQ ID ? 34 : Séquence partielle du gène rpoB chez Staphylococcus capitis, mesurant 518 paires de bases : 5'TTCAGTGTTCATCAATGGTACCGCTTGACGTTGCATGTTCGCACCCATTAA TGCACGGTTAGAGTCATCGTTTTCTAAGAATGGAATACATGCTGTAGCTGCT GATACAACTTGTTTAGGTGATACGTCCATGTAATCCAI III 1 TCTTTTGCCAT AACTGTGTTATTACCACGGAAACGACAAACAACCTCGTCATCTAAGAAACGA

CCATTTTCGTCTAAACGTGAGTTGGCTTGGGCAACTACATAGCTATCTTCTT CATCAGCAGTTAAGTAATCGATTTGATCTGTGATAGAGTTCGTATCTAAATCA ACTTTACGATACGGTGTCTCGATGAAACCAAATTCATTTACTCGCGCATAAC

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TTGATAATGAGTTAATTAAACCAATATTTGGACCCTCTGGTGTTTCAATTGGA CACATACGACCATAGTGTGAGTAATGAACGTCACGTACTTCCATTTGAGCAC GTTCACGAGTTAAACCACCAGGTCCTAATGCTGATAGACGACGTTTTG-3' SEQ ID ? 35 : Séquence partielle du gène rpoB chez Staphylococcus auricularis, mesurant 507 paires de bases : 5'TTCTGGGTTCATTAAAGGTACCGCTTGACGTTGCATGTTTGCACCCATAAG CGCACGGTTAGAGTCATCGTTTTCTAAGAATGGAATACATGCTGTCGCTGCA GAAACAACTTGTTTAGGAGATACATCCATGTAGTCCATGCGTTCTTTAGGTT TAGTAGTGTTGTCCCCACGGAAACGACAAAGAACTTCATCATCAACGAATTT

ACCTGTTTCATCAAGTACAGAGTTTGCTTGTGCAACTACATAGCTGTCTTCTT CGTCAGCTGTTAAGTAGTCGATTCTGTCAGTAACTTGGTTTGTCTCGATGTT TACCTTACGATAAGGTGTTTCAATGAAACCAAATTCATTAACTCTTGCATAAC TTGATAATGAGTTGATTAAACCAATGTTTGGTCCCTCAGGCGTTTCAATTGG ACACATACGACCATAGTGAGAGTAGTGAACGTCACGTACTTCCATACCAGC ACGCTCACGAGTTAAACCACCCGGTCCTAATGCTGATAG-3' SEQ ID ? 36 : Séquence partielle du gène rpoB chez Staphylococcus aureus, mesurant 518 paires de bases : 5'TTCTGGATTCATCAAAGGCACTGCTTGACGTTGCATGTTCGCACCCATCAA

TGCACGGTTTGAGTCATCATTTTCTAAGAATGGAATACATGCTGTCGCTGCT GAAACAACTTGCTTCGGCGATACATCCATATAATCCATTTTTTCTTTAGCCAT AACTGTGTTGTTACCACGGAAACGACATACAACTTCATCATCCATGAAACGA CCATTTTCATCTAATTTAGAGTTTGCTTGTGCTACAACATAGCTATCTTCTTC GTCAGCTGTTAAATAGTCAATTTGATCAGTGATAGCATGTGTATCTAAATCAA CTTTACGATATGGTGTTTCAATAAAGCCGAATTCATTTACACGTGCATAACTT GATAATGAGTTAATCAATCCAATGTTTGGTCCCTCAGGTGTTTCAATTGGAC ACATACGGCCATAGTGAGAGTAGTGAACGTCACGTACTTCCATTTGAGCAC GTTCACGTGTTAAACCACCAGGTCCTAATGCTGATAGACGACGTTTAT-3'

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SEQ ID N037 : Séquence partielle du gène rpoB chez Staphylococcus aureus anaerobius, mesurant 507 paires de bases : 5'TTCTGGATTCATCAAAGGCACTGCTTGACGTTGCATGTTCGCACCCATCAA

TGCACGGTTTGAGTCATCATTTTCTAAGAATGGAATACATGCTGTCGCTGCT GAAACAACTTGCTTCGGCGATACATCCATATAATCCATTTTTTCTTTAGCCAT AACTGTATTGTTACCACGGAAACGACATACAACTTCATCATCCATGAAACGA CCATTTTCATCTAATTTAGAGTTTGCTTGTGCTACAACATAGCTATCTTCTTC GTCAGCTGTTAAATAGTCAATTTGATCAGTGATAGCATGTGTATCTAAATCAA CTTTACGATATGGTGTTTCAATAAAGCCGAATTCATTTACACGTGCATAACTT GATAATGAGTTAATCAATCCAATGTTTGGTCCCTCAGGTGTTTCAATTGGAC ACATACGGCCATAGTGAGAGTAGTGAACGTCACGTACTTCCATTTGAGCAC GTTCACGTGTTAAACCACCAGGTCCTAATGCCGATAG-3' SEQ ID ? 38 : Séquence partielle du gène rpoB chez Staphylococcus arlettae, mesurant 518 paires de bases : 5'TTCACGGTTCATCAACGGTACTGCTTGACGTTGCATGTTCGCACCCATTAA TGCACGGTTAGAGTCATCGTTTTCTAAGAAAGGAATACATGCCGTTGCAGCT GAAACTACTTGCTTAGGTGATACGTCCATGTAGTCCATTTTTTCTTTAGCCAT AACTGTGTTATTACCGCGGAAACGACAAACAACTTCGTCATCTAAAAACTTA CCATTTTCATCTAAGTTAGAGTTGGCTTGTGCTACCACATAGCTGTCCTCTT

CATCAGCAGTTAGGTAATCAATTTGATCTGTAATTGAGTTTGTTGCTAAATCT ACTTTACGGTACGGCGTTTCGATAAAGCCAAATTCATTTACACGTGCATAAC TTGATAGTGAGTTAATTAAACCGATGTTTGGTCCCTCTGGTGTTTCGATAGG ACACATACGGCCATAGTGAGAATAGTGTACGTCACGTACTTCCATTTGAGCA CGTTCACGTGTTAAACCACCAGGTCCTAATGCTGATAAACGACGTTTAT-3' SEQ ID D ? 39 : Séquence partielle du gène rpoB chez Staphylococcus caprae, mesurant 556 paires de bases : 5'TAACCCATTAGCTGAGTTGACTCATAAACGTCGTCTATCAGCATTAGGACC TGGTGGTTTAACGCGTGAACGTGCCCAAATGGAAGTGCGTGACGTTCACTA TTCTCACTATGGCCGTATGTGTCCAATCGAAACACCTGAGGGACCAAACATT GGTTTAATCAACTCATTATCAAGTTATGCACGAGTAAATGAATTTGGTTTTAT

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TGAAACACCTTATCGTAAAGTAGATTTAGATACGAATTCTATCACTGACCAAA TTGATTACTTAACTGCTGATGAAGAAGATAGTTATGTTGTTGCCCAAGCGAA CTCTCGTTTAGACGAAAATGGTCGTTTCTTAGATGACGAAGTTGTTTGTCGT TTCCGTGGTAATAACACAGTTATGGCTAAAGAGAAAATGGACTACATGGATG TATCTCCTAAACAAGTAGTATCTGCAGCGACAGCTTGTATTCCATTCTTAGA AAATGATGACTCTAACCGTGCATTAATGGGTGCGAACATGCAACGTCAAGC AGTACCATTGATGAATCCAGAAGCGCCATTTGTTGGT-3' Exemple 3. Identification en aveugle d'une collection de 20 souches bactériennes comprenant 10 souches de bactéries appartenant au genre Staphylococcus.

Une collection de vingt souches appartenant aux espèces bactériennes suivantes : Staphylococcus aureus (souche sensible à la rifampicine), Staphylococcus aureus (souche résistante à la rifampicine), Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus haemolyticus, Staphylococcus saprophyticus, Staphylococcus intermedius, Staphylococcus equorum, Staphylococcus schleiferi, Staphylococcus lugdunensis, Staphylococcus gallinarum, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Streptococcus pneumoniae, Enterococcus faecalis, Steptococcus pyogenes, Corynebacterium amycolatum, Gemella morbilorum, Acinetobacter anitratus, Micrococcus luteus et Propionibacterium acnes a été codée de façon à réaliser une identification moléculaire en aveugle (l'expérimentateur ne connaissant pas a priori l'identité des souches) des souches selon le procédé décrit dans la présente demande de brevet.

L'extraction des acides nucléiques ainsi que l'amplification du fragment de 751 paires de bases du gène repos ont été réalisées comme décrits dans l'exemple n 2 en incorporant les amorces SEQ ID ? 7 (comme amorce 5') et SEQ ID ? 10 (comme amorce 3') dans une amplification PCR (Fig. 1). Le séquençage de ces 10 amplifiats a été réalisé en incorporant dans la réaction de séquençage les amorces SEQ ID ? 9 (amorce 5') et SEQ ID D ? 10 (amorce 3') comme décrit dans l'exemple n 2 et la comparaison des séquences obtenues avec les séquences de la banque de données des séquences SEQ. ID. n 11 à 39 a permis d'identifier les dix souches amplifiées comme étant : Staphylococcus aureus, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus

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haemolyticus, Staphylococcus saprophyticus, Staphylococcus intermedius,
Staphylococcus equorum, Staphylococcus schleiferi, Staphylococcus lugdunensis et Staphylococcus gallinarum. Le décodage de ces 20 souches a montré 100% de concordance entre l'identification moléculaire selon le procédé faisant l'objet de la présente invention et l'identification établie antérieurement par les méthodes phénotypiques standard. Ce résultat illustre la spécificité des jeux d'amorces SEQ ID N07/SEO ID N010 et SEQ ID N 9/SEQ ID N010 utilisés pour ce travail et le fait que le niveau de sensibilité des souches de Staphylococcus aureus à la rifampicine n'interfère pas avec l'identification de ces souches.

Les autres bactéries choisies pour ce qu'elles sont fréquemment isolées dans les prélèvements cliniques humains ou animaux susceptibles de contenir également des bactéries du genre Staphylococcus, n'ont pas été amplifiées, démontrant ainsi la spécificité des amorces utilisées pour le genre Staphylococcus dans les conditions d'utilisation pour la détection des bactéries du genre Staphylococcus selon l'invention. par rapport aux bactéries d'un autre genre.

Sur la figure 1 sont représentés les produits d'amplification PCR obtenus à partir de quinze souches bactériennes codées, comportant 10 souches appartenant au genre Staphylococcus (colonnes 2 à 5,8, 9,11 à 13 et 16) et 5 souches bactériennes de genres bactériens autres que Staphylococcus (colonnes 6,7, 10,14 et 15). Les colonnes 1 et 17 représentent le marqueur de poids moléculaire. Des colonnes correspondant aux témoins négatifs d'amplification (eau stérile) et à d'autres souches autres que Staphylococcus ne sont pas représentées. Les produits d'amplification sont obtenus après incorporation des amorces SEQ ID N07 et SEO ID N010 selon l'invention et sont visualisés par coloration au bromure d'éthidium après électrophorèse sur un gel d'agarose.

Claims (14)

1. REVENDICATIONS 1. Gène ou fragment de gène rpoB d'une bactérie du genre Staphylococcus, caractérisé en ce qu'il comprend une séquence telle que décrite dans les séquences SEQ. ID. n 11 à 39.
2. 2. Gène rpoB d'une des bactéries Staphylococcus saccharolyticus, Staphylococcus lugdunensis, Staphylococcus caprae, et Staphylococcus intermedius selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il correspond à l'une des séquences telles que décrites dans les séquences SEQ. ID. n 3 à 6.
3. 3. Fragment d'un gène selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il consiste dans l'une des séquences SEQ. ID. n 11 à 39 et les séquences inverses et séquences complémentaires.
4. 4. Oligonucléotide caractérisé en ce qu'il comprend une séquence d'au moins 12, de préférence de 12 à 35, motifs nucléotidiques consécutifs incluse dans l'une des séquences SEQ. ID. n 7 à 10, dans lesquelles N représente un nucléotide choisi parmi l'inosine et un mélange équimolaire de 4 nucléotides différents choisis parmi A, T, C ou G, et les oligonucléotides de séquences inverses et séquences complémentaires.
5. 5. Oligonucléotides selon la revendication 4, caractérisé en ce qu'ils consistent dans les séquences SEQJD. n 7 à 10, et les séquences inverses et séquences complémentaires dans lesquelles N représente l'inosine.
6. 6. Procédé de détection par identification moléculaire d'une bactérie de l'une des espèces du genre Staphylococcus caractérisé en ce qu'on utilise : - le gène rpob de ladite bactérie, ou un fragment dudit gène selon l'une des revendications 1 à 3, ou - un oligonucléotide selon l'une des revendications 4 ou 5.
7. 7. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce qu'on utilise : - un fragment du gène rpoB de ladite bactérie selon la revendication 3, ou - un oligonucléotide selon la revendication 5.
8. 8. Procédé selon l'une des revendications 6 ou 7, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes dans lesquelles : 1-on met en contact au moins une sonde de genre comprenant un dit oligonucléotide selon la revendication 4 ou 5, avec un échantillon contenant ou

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   2-on détermine la formation ou l'absence de formation d'un complexe d'hybridation entre ladite sonde de genre et les acides nucléiques de l'échantillon, et on détermine ainsi la présence de ladite bactérie dans l'échantillon s'il y a formation d'un complexe d'hybridation.

   susceptible de contenir des acides nucléiques d'au moins une telle bactérie du genre Staphylococcus, et
9. 9. Procédé selon l'une des revendications 7 ou 8, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes dans lesquelles : 1-on met en contact les amorces d'amplification comprenant desdits oligonucléotides selon la revendication 4 ou 5 avec un échantillon contenant ou susceptible de contenir des acides nucléiques d'au moins une telle bactérie du genre Staphylococcus, et avec : - comme amorce 5', un oligonucléotide choisi parmi les oligonucléotides comprenant une séquence incluse dans l'une des séquences SEQ. ID. n 7 ou 9 ou les séquences complémentaires, de préférence lesdites séquences complètes, et - comme amorce 3'un oligonucléotide comprenant une séquence incluse dans l'une des séquences SEQ. ID. n 10 ou 8, ou respectivement une séquence complémentaire, de préférence lesdites séquences complètes.

   2-on réalise une amplification d'acides nucléiques par réaction de polymérisation enzymatique et on détermine l'apparition ou l'absence d'un produit d'amplification, et on détermine ainsi la présence de ladite bactérie dans l'échantillon si un produit d'amplification est apparu.
10. 10. Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce qu'on utilise : -- comme amorce 5' : l'une des séquences SEQ. ID. NO 7 ou 9 ou une séquence complémentaire, et - comme amorce 3' : la séquence SEQ. ID. NO 10 ou respectivement une séquence complémentaire.
11. 11. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce qu'on cherche à détecter spécifiquement une espèce donnée d'une bactérie du groupe Staphylococcus choisie parmi les espèces :

    

    Staphylococcus xylosus, Staphylococcus warneri, Staphylococcus simulas, Staphylococcus sciuri, Staphylococcus schleiferi, Staphylococcus

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    Staphylococcus kloosii, Staphylococcus intermedius, Staphylococcus hyicus, Staphylococcus hominis, Staphylococcus haemolyticus, Staphylococcus gallinarum, Staphylococcus felis, Staphylococcus quorum, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus cohni, Staphylococcus chromogenes, Staphylococcus carnosus, Staphylococcus capitis, Staphylococcus auricularis, Staphylococcus aureus subs. aureus, Staphylococcus aureus subs. anaerobius, Staphylococcus arlettae, Staphylococcus caprae, procédé dans lequel : 1-on met en contact un échantillon contenant ou susceptible de contenir des acides nucléiques d'au moins une telle bactérie, avec au moins une sonde d'espèce consistant dans un fragment de gène selon la revendication 1 ou 3, de préférence un oligonucléotide consistant respectivement dans l'une desdites séquences SEQ. ID. n 11 à 39, les séquences inverses et séquences complémentaires, et 2-on détermine la formation ou l'absence d'un complexe d'hybridation entre ladite sonde et les acides nucléiques de l'échantillon, et on détermine ainsi la présence de ladite bactérie dans l'échantillon s'il y a formation d'un complexe d'hybridation.

    

    saphrophyticus, Staphylococcus saccharolyticus, Staphylococcus pulveris, Staphylococcus muscae, Staphylococcus lugdunensis, Staphylococcus lentis,
12. 12. Procédé selon l'une des revendications 6 ou 7, caractérisé en ce qu'on cherche à détecter une espèce donnée d'une bactérie du genre

    

    Staphylococcus choisie parmi les espèces : Staphylococcus xylosus, Staphylococcus warneri, Staphylococcus simulans, Staphylococcus sciuri, Staphylococcus schleiferi, Staphylococcus saphrophyticus, Staphylococcus saccharolyticus, Staphylococcus pulveris, Staphylococcus muscae, Staphylococcus lugdunensis, Staphylococcus lentis, Staphylococcus kloosii, Staphylococcus intermedius, Staphylococcus hyicus, Staphylococcus hominis, Staphylococcus haemolyticus, Staphylococcus gallinarum, Staphylococcus felis, Staphylococcus equorum, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus cohni, Staphylococcus chromogenes, Staphylococcus ca rnos us, Staphylococcus capitis, Staphylococcus auricularis, Staphylococcus aureus subs. aureus, Staphylococcus aureus subs. anaerobius, Staphylococcus arlettae,

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    Staphylococcus caprae, procédé dans lequel, dans un échantillon contenant ou susceptible de contenir des acides nucléiques d'au moins une telle bactérie du genre Staphylococcus, on effectue les étapes dans lesquelles : a) on réalise une réaction de séquençage d'un fragment du gène rpoB amplifié d'une dite bactérie donnée à l'aide des amorces nucléotidiques consistant dans des oligonucléotides comprenant une séquence incluse dans les séquences SEQ. ID. n 7 ou 9 comme amorce 5'et SEQ. ID. no 10 comme amorce 3', de préférence des oligonucléotides consistant dans lesdites séquences SEQ. ID. n 7 ou 9 et 10, et lesdites séquences complémentaires, et b) on détermine la présence ou l'absence de l'espèce donnée de ladite bactérie en comparant la séquence dudit fragment obtenu avec la séquence du gène complet rpoB de ladite bactérie ou la séquence d'un fragment du gène repos de ladite bactérie comprenant respectivement lesdites séquences n 11 à 39 et séquences complémentaires, et on détermine ainsi la présence de ladite bactérie dans l'échantillon si la séquence du fragment obtenue est identique à la séquence connue du gène ou du fragment de gène rpoB de ladite bactérie.
13. 13. Procédé selon la revendication 12, caractérisé en ce que : - à l'étape a) on réalise les étapes comprenant : 1-une première amplification de l'acide nucléique dudit échantillon avec un couple d'amorces 5'et 3'choisi parmi des oligonucléotides comprenant

    

    respectivement les séquences SEQ. ID. n 7 et respectivement SEQ. ID. n 10, de préférence consistant dans lesdites séquences SEQ. ID. n 7 et 10, ou les séquences complémentaires, et on détermine l'apparition ou l'absence d'un produit d'amplification, et 2-une réaction de séquençage des amplifias déterminés à l'étape 1 avec les amorces 5'et 3'consistant dans des oligonucléotides comprenant les séquences SEQ. ID. n 9 et respectivement SEQ. ID. n 10, ou leurs séquences complémentaires, de préférence des oligonucléotides consistant dans lesdites séquences SEO. ID. nO 9 et 10 ou leurs séquences complémentaires, et - à l'étape b), on compare les séquences obtenues avec respectivement l'une des séquences SEQ. ID. n 11 à 39 ou leurs séquences complémentaires

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14. 14. Trousse de diagnostic utile dans un procédé selon l'une des revendications 6 à 13, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins un dit oligonucléotide ou fragment de gène selon l'une des revendications 3 à 5.