WO2006024751A2 - Procede permettant de detecter et d'identifier simultanement differentes especes animales ou vegetales, dans un echantillon de matiere organique - Google Patents

Procede permettant de detecter et d'identifier simultanement differentes especes animales ou vegetales, dans un echantillon de matiere organique Download PDF

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WO2006024751A2
WO2006024751A2 PCT/FR2005/001966 FR2005001966W WO2006024751A2 WO 2006024751 A2 WO2006024751 A2 WO 2006024751A2 FR 2005001966 W FR2005001966 W FR 2005001966W WO 2006024751 A2 WO2006024751 A2 WO 2006024751A2
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seq
species
dna
sequence
nucleotides
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PCT/FR2005/001966
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Fabrice Teletchea
Vincent Laudet
Catherine HÄNNI
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Universite Claude Bernard Lyon I
Ecole Normale Superieure De Lyon
Institut National De Recherche Agronomique
Centre National De La Recherche Scientifique (C.N.R.S.)
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/16—Primer sets for multiplex assays

Definitions

  • the present invention relates to the technical field of traceability of animal or plant species. More specifically, the subject of the invention is a method allowing the simultaneous detection of animal and plant species within a sample of organic material, using the specific hybridization principle, advantageously implemented on a DNA chip, as well as oligonucleotides, probes and primers can be implemented in such a method.
  • the identification of animal and plant species is an essential and crucial step in many current areas such as agri-food, fraud prevention, trade and the protection of biodiversity (Bartlett et al, Biotechnics, 12: 408- 411, 1992, Lockey and Bardsley, T Food Sci Tech 11: 67-77, 2000).
  • This identification uses methods based mainly on three types of data: morpho-anatomy, the presence of specific proteins and more recently DNA.
  • the first method is to determine the species, or sometimes the group of species using diagnostic morpho-anatomical characters. This method applies when the animal is whole (for example at the auction for fish) or there are enough characters to identify it (part of the recognizable body, bone ).
  • Two other methods, which are based on the use of proteins, have been used for the last fifteen years: they are immunological and physicochemical methods.
  • the third approach is to amplify a given fragment with specific oligonucleotides of the desired species, and thus allows to verify the presence of the targeted species and only this one (Maudet and Taberlet, J Dairy Res., 68: 229-35 2001, Rodriguez et al., J Agric Food Chem 51: 1524-9, 2003, Verma et al., Forensic Sci Int 137: 16-20, 2003). Nevertheless, the methods described above are not entirely satisfactory.
  • the method based on morphology is not applicable in the case of processed products or when there are not enough diagnostic characters (blood stains, muscle pieces on a stall ).
  • Protein-based methods are only applicable to fresh substrates because proteins denature by heat, or during preservation processes, such as salting, drying or canning. In addition, it has been shown that these methods are very sensitive to the tissues considered (Lockley and Bardsley, 2000, supra).
  • the method based on the PCR-sequencing is inoperative when several species are mixed because only the majority hope is detected or the sequence is not readable.
  • the last two techniques, (PCR-RFLP and PCR with specific oligonucleotides) require to know precisely the species or the group of species that one seeks to highlight.
  • the present invention proposes to provide a method for simultaneously detecting the presence of a very wide range of species, these species may be present alone or in mixtures, and this in a fresh or degraded product. Furthermore, the invention proposes to provide a method for the simultaneous detection of animal or plant species, which is at the same time specific, sensitive, rapid and relatively inexpensive, in particular with respect to its only competitor, the method of PCR, cloning and sequencing (WO 02/101090).
  • the invention therefore, first of all, a method for simultaneously detecting, in a sample of organic material, the possible presence of biological materials from different animal or plant species belonging to a given plant or animal taxonomic group, comprising at least 40, preferably at least 50 and preferably at least 70 different species, and selecting the species likely to be present, comprising the following successive steps: a) extraction of the DNA from the sample b) amplification of the extracted DNA, by the polymerase chain reaction method (PCR), with at least one pair of primers, each pair of d primer used to amplify, for all animal or plant species belonging to the given taxonomic group, a nucleotide region of the mitochondrial or chloroplast DNA, said nucleotide region being specific to each animal or plant species which belongs to the given taxonomic group, c) bringing the amplification product into contact with a group of probes comprising, for each of the different species of the taxonomic group, at least one probe specific to each animal or plant species belonging to the given plant or animal
  • DNA or nucleotide region "specific to each animal or plant species that belongs to the given taxonomic group” refers to a nucleotide sequence of the mitochondrial or chloroplast genome specific to each animal or plant species belonging to the given taxonomic group.
  • Species-specific probes are derived from these specific regions of the species-specific mitochondrial or chloroplast genome and retain the specificity as defined above (i.e., uniqueness with respect to all other species in the given taxonomic group). ).
  • complementary inverse sequence of a sequence is meant a sequence complementary to the inverse sequence of said sequence.
  • each base is replaced by its complementary base, namely, G by C, C by G, A by T and T by A.
  • the percentage of sequence identity is, in the sense of the invention, determined by the nucleic sequence comparison techniques, performed after alignment. Sequence alignments are made, for example, with the SeaView software (Galtier et al., Comput Biosci., 12, 543-548, 1996) which utilizes the Clustal_w alignment program developed by Thompson et al. Nucleic Acid Res. 22, 4673-4680, 1994). After alignment, the percentage of sequence identity is then calculated between the two aligned fragments of the same length, by counting manually or with commercial software, the number of identical bases and dividing it by the length of the fragment. * 100 on which the comparison was made.
  • a plant or animal species is defined as a group of living plant organisms or living animal organisms, genetically separated from other living organisms, plant or animal, respectively, and able to reproduce only among themselves.
  • a species is designated by the binomial name recognized by international codes of zoological and botanical nomenclature, such as, for example, Bison bison, Bison bonasus, Bos taurus, Capra hircus, Capra ibex, Capra pyraneica, Ovis aries, Rupicapra pyraneica, Rupicapra rupicapra, Camelus bactrianns, Camelus dromaderius, Lama pacos, Alces acces, Cervus elaphus, Rangifer tarandus, Elephas maximus, Loxodonta Africana, Equus asinus, Equus c ⁇ ballus, Felis catus, Homo sapiens, Lepus europaeus, Oryctolagus cuniculus, Macropus giganteus
  • taxonomic group plant or animal is meant a group of species forming a monophyletic group, such as mammals, gadidae.
  • Specific plant or animal taxonomic group means a set of animal species or a set of plant species belonging to a monophyletic set, this set being chosen as a function of the specific application targeted by the method of the invention.
  • Organic matter sample means any solid or liquid material that is assumed to have at least partially an organic origin, that is to say derived from living beings, animals or plants, even after a process of complex transformation.
  • biological material derived from an animal or plant species is meant a material extracted from an individual of an animal or plant species which has a specific DNA of the species.
  • degraded DNA DNA that has been damaged by environmental action or transformation processes.
  • Degraded DNA is usually in the form of small fragments (less than or equal to about 200 pb) and in small quantities.
  • Examples in which I 1 DNA is in degraded form are: - foods (cooked, freeze-dried, dried, smoked, pickled, canned, pasteurized, frozen ”) - fertilizers, flours, seeds (ground, dried, fermented, roasted) %) - eggshells, bones, horns, teeth, hair, hair, feathers, excrement (drying, action of time, temperature Among - alcohols (alcoholic, distilled, fermented, ...) - hides, skins, furs, mummified tissues (tanned, taxidermized, colored, Certainly - scrolls, papers, wood (time action, process of transformation used in stationery, ...) - ivory, amber (action of time , ...) - glues, natural pigments (paints, dyes), soils, sediments (
  • amplification product is meant the DNA fragment or fragments or the amplified DNA sequence (s) obtained after the polymerase chain reaction (PCR). .
  • the amplification product contains several copies of different fragments or amplified DNA sequences, when the sample of organic material to be analyzed comprises a mixture of different DNA fragments, each from a different species. belonging to the given taxonomic group.
  • FIG 1 schematically shows the main steps of the method according to the invention.
  • FIG. 2 shows a summary map of the complete gene coding for cytochrome b in the human species (Genbank accession number: J01415), and the positions of the variable zones, from which the probes in the illustrative example are derived, and the positions of the conserved areas from which the primers originate.
  • 3 presents a summary table of the selected species forming the given taxonomic group, in the illustrative example, of their common names, of the number of sequences used to determine their associated species-specific oligonucleotides (N) and the number or numbers of accessions used.
  • Figure 4 summarizes the 5 steps (AE) used to determine species-specific oligonucleotides in the case of Dicentrarchns labrax bar.
  • Figure 5 presents a summary table of the selected species forming the given taxonomic group, in the illustrative example, and their respective species-specific oligonucleotide with their associated Tm, hairpin and homoduplex.
  • FIG. 6 shows examples of amplifications after migration on 2% agarose gels for the 3 types of fragments, respectively from top to bottom along the middle and the short. Some aspecific bands are visible for some species.
  • FIG. 7 illustrates the various steps of the process according to the invention, from the extraction of the DNA until the detection of any hybridization reactions.
  • FIG. 8 shows the hybridization results of mixtures A, B and C.
  • the present invention is based on the principle illustrated in FIG. 1, which consists of amplifying the DNA of fresh or transformed substrates, by PCR with a single pair of primers allowing for all the species to be detected, to amplify a short specific target species DNA fragment, bringing the amplification product into contact with complementary species-specific probe oligonucleotides, for example, deposited on a DNA chip, to detect whether or not there has been a hybridization reaction. This makes it possible to simultaneously screen the presence of a large number of species, alone or in mixture.
  • the detection principle therefore consists in fixing on a support a given selection of genes or gene fragments, specific species, in the form of a single strand (probes), to incubate it in the presence of the amplification product: the complementary sequence of genes (target) is present in the amplification product, this sequence will specifically recognize on the support its complementary sequence and form a double strand of DNA. This process is called hybridization.
  • the target species specific DNA sequence is of mitochondrial origin for animals and plants or chloroplast for plants.
  • Mitochondrial DNA mtDNA
  • mtDNA mitochondrial origin for animals and plants or chloroplast for plants.
  • mtDNA Mitochondrial DNA
  • it is easier to detect than genomic DNA because it is present from 100 to 1000 copies per cell against two copies for nuclear DNA. It can therefore be more surely detected in organic materials in which the DNA is subjected to various physical factors (temperature, pressure, ...) chemical or biochemical tending to its degradation.
  • it is an excellent species marker that is often used in phylogeny.
  • the method according to the invention must be able to be implemented on a sample containing degraded DNA, where only a short fragment of a few hundred base pairs can be amplified. Therefore, advantageously, the DNA targets and probes specific to each animal or plant species of the selected taxonomic group, belong to a nucleotide region (or its complementary reverse sequence), less than 400 nucleotides, mitochondrial or chloroplast DNA, said nucleotide region being specific to each animal or plant species that belongs to the given taxonomic group.
  • the method according to the invention is particularly suited to the detection and identification of a large number of vertebrate species that are either used in human nutrition or have a particular interest in biodiversity ( endangered species, controlled trade).
  • the taxonomic group chosen corresponds, advantageously, to a group of vertebrate species which comprises in particular one or more species of actinopterygian and / or chondrichthyan fish, and preferably several species of mammals, birds, actinopterygian fish and chondrichthyan.
  • the target DNAs and the specific species probes are advantageously chosen within the DNA encoding cytochrome b, because, in addition to the reasons mentioned above: (i) the sequence of this gene is very variable between the species and thus allows the discrimination of phylogenetically very closely related species, (ii) there are a number of extremely conserved regions along the gene which thus make it possible to draw pairs of primers common to a very large number of species, (iii) the individual variability of this gene within the same species is relatively low (a few%), (iv) this gene has been preferentially used in molecular phylogeny in the last 15 years, it is therefore by far the mitochondrial gene the most represented in the banks (more than 20000 sequences for the only vertebrates in 2001).
  • the specific target DNAs and probes are derived from a fragment of 373 base pairs (with the primers) situated approximately at the center of the gene (total length of the gene approximately 1140 base pairs, variable between the species).
  • This zone comprises 2 transmembrane zones which are the most variable in the gene and is located between two conserved regions which makes it possible to draw primers allowing the amplification of a very large number of vertebrate species.
  • FIG. 2 illustrates precisely the position of these conserved and variable zones on the human mitochondrial DNA encoding cytochrome b (accession number of the reference sequence: J01415 of SEQ ID NO: 1 Anderson et al Nature, 290; 457-465, 1981).
  • Step a) of the process according to the invention consists in extracting the fresh or degraded DNA from the organic sample of interest.
  • Isolation of the nucleic acids from the starting sample can be achieved in a variety of ways. These methods include the use of detergents leading to lysates, the use of enzymes (lysozyme, proteinase K, for example) sonication, mechanical agitation in the presence of beads. In some cases, it may be necessary to purify the extracted nucleic acids in order to get rid of possible contaminants such as nucleases. In this case, the purification of the nucleic acids can be carried out by phenol-chloroform extraction, chromatography, ion exchange, electrophoresis, equilibrium centrifugation or capture by hybridization on a solid support. Commercially available extraction kits or kits may be used.
  • DNA extraction by the phenol / chloroform method is suitable for all types of samples that may contain organic matter, such as fillet, soup, terrine, pâté, fat, flour, fish-based preparations
  • This method employs techniques described in HANNI et al, 1990, CR Acad. Sci. Paris., 310, 365-370 and HANNI et al., 1995, Nucl. Acids Res., 23, 881-882 and is especially described in WO02 / 101090 to which reference may be made for more details.
  • the method comprises a step b) of amplifying the DNA extracted from the biological sample of interest.
  • Amplification of the extracted DNA consists of multiplying the species-specific nucleic acid fragments extracted from the sample. It makes it possible to considerably increase the number of copies of a target nucleic sequence to be detected.
  • PCR Polymerase Chain Reaction
  • PCR a target amplification technique that relies on the repetition of DNA synthesis cycles in vitro by elongation of hybridized nucleotide primers on the target sequence (Saiki et al. al., 1985. Science 230: 1350-1354, EP 0 201 184).
  • the polymerase chain reaction method comprises a repetition of the cycle of the following steps: - heating of the DNA extracted from the mixture of organic origin, so as to separate the DNA into two strands single-stranded hybridization of the single-stranded DNA strands at an appropriate temperature with the oligonucleotide primers according to the invention for amplifying the DNA specific for the species that one seeks to detect and / or identify, - elongation of said appropriate oligonucleotide primers by a polymerase at a suitable temperature, to obtain a single amplification product containing each of said DNA sequences or each of said DNA fragments characteristic of the species or species present.
  • nucleotide primers each complementary to a sequence of one of the two strands of the target DNA are synthesized.
  • Deoxyribonucleoside triphosphates are added in excess to the reaction medium in the presence of a thermostable DNA-dependent DNA polymerase (Taq polymerase). If a
  • Target DNA is present in the sample, the primers hybridize to their specific sites and the polymerase extends the 3 'end of these primers by successive addition of nucleotides complementary to the target.
  • the extended primers dissociate from the target and can, like the original target, fix the nucleotide primers in excess. Repetition of the process (from 30 to 50 times) results in an exponential accumulation of the target sequence between the two primers.
  • the PCR is therefore carried out in the presence of a suitable enzymatic system and a pair of primers of the invention, prior to the hybridization and detection step.
  • one of the primers is labeled, in order to allow later detection during step d) of the method according to the invention.
  • Any commercially available kit, including the Eppendorf Kit can be used for the PCR reaction. In the case of processed products, it is necessary to use amplification protocols (Hanni et al., 1990 and 1995 supra and
  • WO98 / 50401 in particular to overcome any inhibitors present.
  • the amplification product is advantageously purified, according to any conventional technique well known to those skilled in the art.
  • the amplification of the DNA contained in the sample of organic matter of interest is carried out using a pair of primers for amplifying, for all the species of the selected taxonomic group, a DNA fragment. specific to the species.
  • the following pairs of primers are particularly suitable for a group of vertebrates: an oligonucleotide consisting of about 15 to 25 nucleotides, preferably 17 to 23 nucleotides, having at least 80%, preferably at least 90% and advantageously at least 95% sequence identity with SEQ ID sequence
  • CTICCITGAGGICARATRTC OR the sequence SEQ ID No. 3:
  • nucleotides preferably from 17 to 23 nucleotides, having at least 80%, preferably at least 90% and advantageously at least 95% identity of sequence with the sequence SEQ ID No. 4: TRAARTTITCIGGRTCICC or the sequence SEQ ID N 0 5: TRAARTTNTCNGGRTCNCC, an oligonucleotide consisting of about 15 to 25 nucleotides, preferably 17 to 23 nucleotides, having at least 80%, preferably at least 90% and advantageously at least 95% of sequence identity with the SEQ ID sequence
  • oligonucleotide consisting of about 15 to 25 nucleotides, preferably 17 to 23 nucleotides , exhibiting at least 80%, preferably at least 90% and advantageously at least 95% of sequence identity with the sequence SEQ ID No. 8: GAYAAARTTYCITTYCA YCC or the sequence SEQ ID No. 9: GAYAAARTNYCNTTYCAYCC, with I: inosine; R: A or G; and Y: C or T and N: A, G, C or T.
  • the following pairs of primers are particularly preferred:
  • the subject of the invention is also oligonucleotides consisting of about 15 to 25 nucleotides, preferably 17 to 23 nucleotides. , exhibiting at least 80%, preferably at least 90% and advantageously at least 95% of sequence identity with one of the oligonucleotides having one of the following sequences or their respective complementary inverse sequences:
  • sequence SEQ ID No. 7 GGRTGRAANCRNAYTTTRTC - the sequence SEQ ID No. 8: GAYAAARTIYCITTYCAYCC the sequence SEQ ID No. 9: GAYAAARTNYCNTTYCAYCC with I: inosine; R: A or G; and Y: C or T and N: A, G, C or T.
  • the preferred primer pairs SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO : 2 and SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 4 and SEQ ID NO: 8 are found, in all selected vertebrates, in the DNA sequence coding for cytochrome b and frame, as illustrated in FIG. 2, the specific species of DNA fragments that one wishes to amplify.
  • These inosine primers which have chemical affinities with the four bases, amplify all species in the given taxonomic group that has been selected.
  • two pairs of primers one chosen from SEQ ID No. 2 or SEQ ID No. 3 and SEQ ID No. 2, will advantageously be used in combination. 6 or SEQ ID No. 7, the other of SEQ ID No. 4 or SEQ ID No. 5 and SEQ ID No. 8 or SEQ ID No. 9 that make it possible to amplify smaller species-specific DNA fragments. .
  • step c) of the method uses species-specific probes selected for immobilization on a biochip, so as to evaluate the presence of species-specific nucleic acids placed under hybridization conditions with the probes. , by detecting the probes on which these nucleic acids are fixed by hybridization. It is then possible to deduce the species whose biological substances are present in the sample and therefore to identify such species because, in the vast majority of cases, only specific hybridization reactions are observed.
  • specific hybridization is meant a hybridization reaction between a species-specific probe and the target DNA of that species.
  • Each selected species-specific probe DNA is capable of causing a specific hybridization reaction with an amplified nucleic acid, specific to the selected species of which it is the probe, comprising a sequence complementary to that of the oligonucleotide.
  • Most of the known hybridization techniques can be implemented in this process and in particular the so-called “Dot Blot” or “Southern” techniques.
  • the method according to the invention is adapted to be implemented with a biochip and the DNA probes are selected for this purpose.
  • the different probes are therefore preferably able to hybridize under comparable hybridization temperature conditions and do not fold back on themselves under these hybridization conditions.
  • the probes (in this case species-specific oligonucleotides) are thus deposited on a DNA chip support, each probe being fixed in multiple numbers on an elementary site of the active face of the support.
  • the use of DNA chips thus makes it possible to simultaneously search for the presence of a very large number of species, without having to sequence or to clone and then sequencing, in the case of mixtures, the PCR product.
  • the method according to the invention makes it possible to detect at least 40, preferably at least 50, advantageously all the following vertebrate species:
  • the probe DNA of each species advantageously consists of an oligonucleotide comprising at most 50 nucleotides, preferably from 17 to 24 nucleotides, and corresponding to a specific species portion, of the mitochondrial DNA coding for cytochrome b. of said species, approximately between nucleotides 15162 and 15497 of the mitochondrial DNA coding for cytochrome b, the nucleotide numbers corresponding to their position relative to the nucleotide sequence of the human mitochondrial DNA encoding cytochrome b taken as a reference (S.
  • the probe DNA of each species consists of an oligonucleotide comprising at most 50 nucleotides, preferably from 17 to 24 nucleotides, and corresponding to a specific species portion, of the mitochondrial DNA coding for the cytochrome b of the said species, approximately between nucleotides 15162 and 15392 or 15411 and no.
  • nucleotide numbers corresponding to their position relative to the nucleotide sequence of the DNA human mitochondrial coding for cytochrome b as a reference (S. Anderson et al., Genbank, JO 1415), after alignment of the gene of said species encoding cytochrome b with the human reference gene coding for cytochrome b.
  • this specific species portion approximately between nucleotides No. 15162 and No. 15497 corresponds to the following consensus sequence which groups in a generic form all the sequences found in the aforementioned species:
  • V A, C or G
  • H A, C or T D: A, G or T
  • N A, C, G or T
  • the DNA probes correspond to a specific species fragment of the DNA coding for the cytochrome b of the species of which it is the probe which has one of the following sequences, with possibly one to five fewer nucleotides to one either of the 3 'or 5' ends and / or one to five more nucleotides at either end
  • SEQ ID NO: 59 TTGCTGGGGCCACAATA
  • SEQ ID NO: 60 CTTTCTTCGTCCTCCATGTA
  • SEQ ID NO 61 SEQ ID NO TAGCTCTTACACTACTAGCACT 0 62: CTAACCTTTTATCAGCAGTCC
  • SEQ ID NO: 63 AGACCTCCTTGGCTTTGTAA
  • SEQ ID NO: 64 CCTCCTACACCTCTCT ATTTTT
  • SEQ ID NO: 65 ATGCTACCCTAACTCGGTTT
  • SEQ ID NO: 66 CTAATGTCCACTGTCCCCTA
  • SEQ ID NO: 67 GTTCTAATTGGATTAACTAGCCTC
  • SEQ ID NO: 68 ATCGTTTTAATTGGCCTAGCT
  • SEQ ID NO: 70 TAACCAGCGGGGATT AACTC
  • SEQ ID NO: 71 TGGAAACGCCCTTGTACAAT
  • SEQ ID NO: 72 TTCACCTTCTGTTCCTTCATG
  • SEQ ID NO: 73 CATCCTTAGCTCTATTCGCA
  • SEQ ID NO: 74 CATCATTAGCTCTGTTCGCA
  • SEQ ID NO: 75 TCGTAGCTATATTGCTTGGC
  • SEQ ID NO: 76 CTGCTGTACCCT ATGTAGGA
  • SEQ ID NO: 77 CAATTCTGCTTGTTGCACT
  • SEQ ID NO: 78 TGGCAGCAACAATTCTTCAC
  • SEQ ID NO: 79 TTCCCCTTTGTTATCTTAGCG
  • SEQ ID NO: 80 TATGTTGGAACTACCCTCGTT
  • SEQ ID NO: 81 ATATGTCGGAACTACCCTCG
  • SEQ ID NO: 82 TGATCCTGCTAGTAGCACTC
  • SEQ ID NO: 83 ACCTTATTAGCAACCTTAGCA
  • SEQ ID NO: 84 TTCCTTCTCCCCTTCGTTGT
  • SEQ ID NO: 85 TAACTTGTCTTGCCCTATTCG
  • SEQ ID NO: 86 AAGATCTGCTAGGGTTTGCA
  • SEQ ID NO: 87 ATTCCTAATCGTGGGCCTAA
  • SEQ ID NO: 88 TATCCACCTTGTCCTTGTTC
  • the probes may comprise one to five more nucleotides at one and / or the other of the 3 'or 5' ends, of these sequences means that it can include at each end of one to five adjacent bases in the gene encoding the cytochrome b of the species of which it is the target, which amounts to moving the probe sequence a little on the genome.
  • the table 5 indicates, for each probe of sequence SEQ ID N 0 10 to SEQ ID NO: 88, what kind it is specific.
  • the subject of the invention is therefore also the above-mentioned DNA probes, and in particular those corresponding to the sequences SEQ ID No. 10 to SEQ ID No. 88.
  • DNA chip is meant any solid support on which fragments are immobilized. DNA.
  • DNA chips a new tool for genetic analysts and diagnostics. M. Cuzin, Clinical and Biological Transfusion 2001, 8: 291-6, and "How to make a DNA chip” Mickael C Pirrung.
  • the biochip will be intended to receive, in liquid form, the organic sample of interest suspected of containing at least one biological substance from a target species belonging to the group. of vertebrates represented on the DNA chip by a specific probe.
  • a biochip comprises a support having a useful face with an operating surface in contact with the organic sample of interest.
  • the support consists of an inert material, in the sense that it does not substantially interact with the sample, for example silicon, a glass, or a plastic material, for example a thermoset or thermoplastic synthetic resin, such as polypropylene , a polystyrene or a polyacrylamide resin.
  • a set of elementary sites, also called cells, are distributed on the operating surface, in the manner of pixels, for example according to at least two reference axes, each elementary site being addressed, that is to say, identified by coordinates. which are unique to it in any appropriate reference, formed for example by reference axes.
  • DNA probes according to the invention are immobilized by any appropriate means, for example chemical, by covalent bonding, or by means of a spacer arm, by adsorption, absorption, ... by photolithography techniques or by a piezoelectric system, by capillary deposition of preformed ligands in particular.
  • a multiplicity of DNA probes are each fixed in multiple numbers on different elementary sites respectively.
  • at least 400 identical oligonucleotide sequences and preferably at least 1000 sequences are fixed per elemental site.
  • the DNA chip is generally arranged to cooperate with at least one device or instrument that will deliver an output signal in relation to the presence and nature, and possibly the amount of biological substance from said target species.
  • the means for observing, transmitting, or transmitting the signal or output signals, corresponding to the hybridization of the probe DNA with the amplified DNA of the target species, respectively at one or more binding sites make it possible, in final, detecting the formation or absence of formation of hybridization complexes, so as to deduce whether the sample of organic matter may contain biological material from one or more of the animal species belonging to the given group of vertebrates represented on the DNA chip and identify the animal species in question.
  • the probe DNA or the amplified DNA will be advantageously labeled.
  • marking is meant fixing on the probe or the target, covalently or otherwise, a marker, allowing, especially after illumination, the emission of an output signal that can be detected.
  • markers include: enzymes, for example oxidation of a chromogen such as horseradish peroxidase or alkaline phosphatase, fluorophores such as fluorescein, cyanine, Cy3 or Cy5, phycoerythrin, phosphors such as luminol, isoluminol, ABEI (N-4-aminobutyl-N-ethyl-isoluminol) or haptens such as biotin.
  • enzymes for example oxidation of a chromogen such as horseradish peroxidase or alkaline phosphatase, fluorophores such as fluorescein, cyanine, Cy3 or Cy5, phycoerythrin, phosphors such as luminol, isoluminol, ABEI (N-4-a
  • the output signal or signals therefore vary, depending on the markers used, and the type of detection required. It may be light, electrical, electro-optical, electrochemical signals, etc., which are detected separately, taking into account the addressing of the elementary sites of the DNA chip.
  • the reaction or emission constituting the output signal is preferably detected or even measured in an automated manner.
  • biochips may further comprise, in an integrated manner or not with the operating surface and its ligands or probes, various means, brought back to the scale of the biochip, conventionally used in the laboratory, to: - obtain or prepare the sample of interest, from another sample said to start, denaturation, separation, concentration, purification, etc.
  • treating the sample of interest for example by amplification, and / or labeling with a marker, before it is put in contact with the ligands or probes; treating the complex or complexes formed between the target species and the ligand or ligands, for example by labeling, so as to obtain, respectively, or after formation of the complexes, respectively one or more output signals.
  • the present invention solves a dual technical problem encountered in many areas such as agribusiness in particular, food traceability, the fight against fraud, trade, and the protection of biodiversity, that is to say: the identification of the different species of a mixture made possible, even in products where the DNA is degraded or even degraded (cooked dishes, cans, animal remains ...) (Lefranwestis et al., Anti-Fraud DNA, Biofutur, 165, 27-30, 1997).
  • the invention allows the identification of a single species in a fresh product, as well as the identification of several species in a highly degraded product.
  • the present invention makes it possible to fight against a very large number of frauds, and thus to protect consumers against possible reprehensible replacements and the species concerned against overexploitation or prohibited exploitation.
  • the invention is also applicable in more fundamental fields especially in ecology and systematics: monitoring populations from traces (faeces, hair), characterization of the diet of certain carnivorous species (from the study of stomach contents) Determination of in-situ biodiversity Determination of species at various stages when morpho-anatomical characters are non-existent or difficult to detect (eggs, larvae, juveniles). This list is not exhaustive and illustrates the very important potentialities of this new tool.
  • Figure 1 schematically illustrates the principle of the method according to the invention.
  • the illustration of the invention relates to the identification of animal species belonging to four taxonomic groups of vertebrates, which are birds, mammals, actinopterygian fish and chondrichthyans, and more specifically to 79 of them, respectively 9, 40, 28 and 2 species. These species have been chosen because they have a significant economic and / or conservation interest (endangered %) and the sequences for the chosen fragment are available in sequence libraries (Genbank, EMBL ... ). The species chosen, as well as their common names, the number of sequences used as references and their respective accession numbers are shown in Figure 3.
  • Two or three short oligonucleotides for the species in question were chosen in order to maximize the number of autapomorphies (sites unique to the chosen species) within each of them, and on the other hand to place the differences of bases observed with the closest species in the most central positions possible. Indeed, the more the position of the mismatches is less central will be the hybridization thereafter between the species-specific oligonucleotide and other species, for example between the specific oligonucleotide of beef and that of the bison.
  • Homoduplexes pairing between two identical strands
  • Homoduplexes are calculated by the methods described by (Breslauer et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA, 83: 3746-3750, 1986, and Freier et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA, 83: 9373-9377, 1986)
  • the hairpins folding of a probe on itself to form a helix
  • the free energy threshold values used (calculated both at 65 ° C) for secondary structures are for hairpins (DG hairpin): -0.3 kcal / mol and homoduplexes (DG homoduplex): -6, 1 kcal / mol (the calculated values for our oligonucleotides are specified in Figure 5). That is to say within the meaning of the invention, it is considered that a probe oligonucleotide does not fold on itself, if its hairpin and homoduplex are greater than these threshold values.
  • the oligonucleotides probes specific species were prepared according to conventional methods of nucleotide synthesis.
  • a C6 AMINE at the 5 'position was added to each oligonucleotide. This amino modification was added to improve the quality of the oligonucleotides and allow their attachment to selected DNA chip carriers, namely Quantifoil® slides. All the information concerning these oligonucleotides is specified in the table given in FIG. 5.
  • C - PCR PROBE The four primers used are the degenerate oligonucleotides which correspond to the sequences SEQ ID Nos. 2, 4, 6 and 8 modified in 5 by adding phosphate or Cy3. Their position on human cytochrome b (Genbank J01415) is given in Figure 2.
  • the number indicates the position of the 3 'end of the primer on the complete human cytochrome b gene; L indicates that the primers are located on the oriented strand 5'- 3 'in the banks of international sequences; H: indicates that the primers are located on the complementary strand, P for the phosphate and CY3 for the fluorophore.
  • the phosphate was added during the synthesis of the oligonucleotides at the 5 'end of the two primers located on the light strand L15162P and L 15411P and a fluorophore (Cy3) at the 5' end of the two other primers located on the strand.
  • the short fragment having a length of 124 base pairs, is between the primers L15411P and H15497CY3.
  • the total length of the fragments includes each time the primers.
  • D - PCR After extraction, carried out from the Qiagen kit, the targeted fragment is amplified with one of the three pairs of primers. One is labeled with a 5 'fluorophore Cy3 and the other has a 5' phosphate.
  • the probe oligonucleotides were deposited on Quantifoil® slides at a concentration of 25 ⁇ molar, to form the DNA chip.
  • a number checks and standard ranges were deposited on both sides of the deposits of the oligonucleotide probes species-specific to verify that the hybridization went well and, subsequently, facilitate the placement of the grid for the reading of the result with the GeneTAC TM LS IV scanner (using GeneTAC Integrator 3.3 software, Genomic solutions) and its exploitation with analysis software like GenePEX TM cPro 4.1 (Axon Instruments, Inc.).
  • the phosphated strand is digested with lambda exonuclease for 30 minutes at 37 ° C and then purified again.
  • the single-strand is finally resuspended in the hybridization buffer provided by the manufacturer.
  • Hybridization takes place at 50 ° C. in a hybridization oven and this throughout the night.
  • the various steps of the process of the invention are summarized in FIG. 8.
  • the conditions for treating the slide before and after the hybridization are those provided by the manufacturer.
  • each sample was extracted with a commercial kit, then amplified, and then digested. Once these three steps were done separately for each sample, several were pooled (usually 4 or 5) to validate our approach as quickly as possible. These samples were selected phylogenetically enough apart to easily identify which hybridized species on more than one oligonucleotide at a time.

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Abstract

Procédé permettant de détecter simultanément, dans un échantillon de matière organique, la présence éventuelle de différentes espèces animales ou végétales appartenant à un groupe taxonomique végétal ou animal donné comportant au moins 40, de préférence, au moins 50 et avantageusement, au moins 70 espèces différentes et de sélectionner les espèces susceptibles d'être présentes, comprenant les étapes successives suivantes : a) extraction de l'ADN de l'échantillon, b) amplification de l'ADN extrait, par la méthode d'amplification en chaîne par polymerase (PCR), avec au moins un couple d'amorces, commun à toutes les espèces animales ou végétales qui appartiennent au groupe taxonomique donné, c) mise en contact du produit d'amplification avec un groupe de sondes spécifiques à chaque espèce animale ou végétale appartenant au groupe taxonomique végétal ou animal donné, d) détection de la formation ou de l'absence de formation de complexes d'hybridation.

Description

PROCEDE PERMETTANT DE DETECTER ET D'IDENTIFIER SIMULTANEMENT DIFFERENTES ESPECES ANIMALES OU VEGETALES, DANS UN ECHANTILLON DE MATIERE ORGANIQUE
La présente invention concerne le domaine technique de la traçabilité d'espèces animales ou végétales. Plus précisément, l'invention a pour objet un procédé autorisant la détection simultanée d'espèces animales et végétales au sein d'un échantillon de matière organique, utilisant le principe d'hybridation spécifique, avantageusement mis en œuvre sur puce ADN, ainsi que des oligonucléotides, sondes et amorces pouvant être mis en œuvre dans un tel procédé. L'identification des espèces animales et végétales est une étape essentielle et cruciale dans de nombreux domaines actuels comme l'agro-alimentaire, la répression des fraudes, le commerce et la protection de la biodiversité (Bartlett et al, Biotechnics, 12: 408-411, 1992 ; Lockey et Bardsley, T Food Sci Tech 11: 67-77, 2000).
Cette identification fait appel à des méthodes qui reposent principalement sur trois types de données : la morpho-anatomie, la présence de protéines spécifiques et plus récemment l'ADN. La première méthode consiste à déterminer l'espèce, ou parfois le groupe d'espèces au moyen de caractères morpho-anatomiques diagnostiques. Cette méthode s'applique lorsque l'animal est entier (par exemple à la criée pour les poissons) ou qu'il y a suffisamment de caractères pour l'identifier (partie du corps reconnaissable, os...). Deux autres méthodes, qui reposent sur l'utilisation des protéines, ont été utilisées ces quinze dernières années : ce sont les méthodes immunologiques et physico¬ chimiques. Ces méthodes, uniquement applicables sur des produits frais, ont été principalement développées pour quelques groupes de poissons (Rehbien et al, Food Che. 67, 333-339, 1999; Mackie ét al, Food Che, 71: 1-7, 2000 ; Etienne et al, J Agric Food Chem. 48: 2653-8A.K, 2000 ; Asensio et al, J Agric Food Chem. 51: 1169-72S, 2003). Plus récemment, différentes méthodes utilisant l'ADN et mettant en oeuvre la PCR se sont développées. Les principales méthodes sont les suivantes : PCR-séquençage, PCR-RFLP, PCR-oligonucléotides spécifiques (Lockley et Bardsley, supra). Elles sont toutes basées sur l'amplification d'un fragment particulier d'ADN, généralement au sein du gène codant le cytochrome b (Lockey et Bardsley, 2000 supra). Ensuite, ce fragment est respectivement séquence dans le premier cas et comparé aux banques internationales de séquences (Quinteiro et al, J Agric Food Chem 46: 1662-1669, 1998 ; Quinteiro et al, J Agric Food Chem. 49: 5108-14, 2001 ; Sebastio et al, J Agric Food Chem. 49: 1194-9, 2001 ; Jérôme et al, J Agric Food Chem. 51: 7326-32, 2003 ; Verma et al, Forensic Sci Int. 137: 16-20, 2003 ; Colombo et al., Méat science 66: 753-755, 2004) ou digéré par des enzymes de restriction dans le second cas, le profil obtenu étant alors spécifique de chaque espèce (Quinteiro et al., 1998, supra ; Mackie et al, T Food Sci Tech 10: 9-14, 1999 ; Bellagamba et ai, J Food Prot. 66: 682-5, 2003 ; Quinteiro et al., 2001, supra ; Sebastio et al, supra ; Jérôme et ai, supra ). La troisième approche consiste à amplifier un fragment donné avec des oligonucléotides spécifiques de l'espèce recherchée, et permet donc de vérifier la présence de l'espèce ciblée et uniquement celle-ci (Maudet et Taberlet, J Dairy Res. 68: 229-35, 2001; Rodriguez et al., J Agric Food Chem. 51: 1524- 9, 2003 ; Verma et al, Forensic Sci Int. 137: 16-20, 2003 ). Néanmoins, les méthodes décrites ci-dessus ne donnent pas entière satisfaction.
En effet, la méthode basée sur la morphologie n'est pas applicable dans le cas des produits transformés ou lorsqu'il n'y a pas suffisamment de caractères diagnostiques (taches de sang, morceaux de muscles sur un étal...). Les méthodes basées sur les protéines ne sont applicables que sur des substrats frais car les protéines se dénaturent à la chaleur, ou lors des procédés de conservation, tels que la salaison, le séchage ou l'appertisation. De plus il a été montré que ces méthodes sont très sensibles aux tissus considérés (Lockley et Bardsley, 2000, supra). La méthode basée sur le PCR- séquençage, est inopérante lorsque plusieurs espèces sont en mélange car seule l'espère majoritaire est détectée ou alors la séquence n'est pas lisible. Les deux dernières techniques, (PCR-RFLP et la PCR avec des oligonucléotides spécifiques) nécessitent de connaître précisément l'espèce ou le groupe d'espèces que l'on cherche à mettre en évidence.
Par conséquent, aucune des méthodes existantes ne permet de déterminer quelles sont les espèces présentes dans un mélange, à moins d'utiliser une étape supplémentaire qui est le clonage. Cependant, cette étape supplémentaire est longue et coûteuse.
Dans ce contexte, la présente invention se propose de fournir un procédé permettant de détecter simultanément la présence d'un très large éventail d'espèces, ces espèces pouvant être présentes seules ou en mélanges, et ce dans un produit frais ou dégradé. Par ailleurs, l'invention se propose de fournir un procédé de détection simultanée d'espèces animales ou végétales, qui soit à la fois spécifique, sensible, rapide et relativement peu onéreux, par rapport notamment à son unique concurrente qu'est la méthode de PCR, clonage et séquençage (WO 02/101090).
L'invention a donc, tout d'abord pour objet, un procédé permettant de détecter simultanément, dans un échantillon de matière organique, la présence éventuelle de matières biologiques issues de différentes espèces animales ou végétales appartenant à un groupe taxonomique végétal ou animal donné, comportant au moins 40, de préférence, au moins 50 et avantageusement, au moins 70 espèces différentes, et de sélectionner les espèces susceptibles d'être présentes, comprenant les étapes successives suivantes : a) extraction de PADN de l'échantillon b) amplification de l'ADN extrait, par la méthode d'amplification en chaîne par polymerase (PCR), avec au moins un couple d'amorces, chaque couple d'amorces utilisé permettant l'amplification, pour toutes les espèces animales ou végétales qui appartiennent au groupe taxonomique donné, d'une région nucléotidique de l'ADN mitochondrial ou chloroplastique, la dite région nucléotidique étant spécifique à chaque espèce animale ou végétale qui appartient au groupe taxonomique donné, c) mise en contact du produit d'amplification avec un groupe de sondes comportant, pour chacune des différentes espèces du groupe taxonomique, au moins une sonde spécifique à chaque espèce animale ou végétale appartenant au groupe taxonomique végétal ou animal donné, dans des conditions permettant à chaque sonde de s'hybrider avec un fragment d'ADN amplifié spécifique à l'espèce dont elle est la sonde, si un tel fragment est présent dans le produit d'amplification, chaque sonde étant constituée d'un oligonucléotide comportant au plus 50 nucléotides, de préférence de 17 à 24 nucléotides, et correspondant à un fragment d'ADN mitochondrial ou chloroplastique spécifique à l'espèce animale ou végétale dont il est la sonde, ou à son ADN inverse complémentaire, qui est apte à s'hybrider avec l'ADN cible spécifique à ladite espèce animale ou végétale, d) détection de la formation ou de l'absence de formation de complexes d'hybridation, de façon à déduire si l'échantillon de matière organique contient de la matière biologique issue d'une ou plusieurs des espèces animales ou végétales appartenant au groupe taxonomique donné et sélectionner les espèces susceptibles d'être présentes.
En préalable à la description détaillée de l'invention, certaines définitions des termes employés vont être rappelées.
L'expression ADN ou région nucléotidique « spécifique à chaque espèce animale ou végétale qui appartient au groupe taxonomique donné» désigne une séquence nucléotidique du génome mitochondrial ou chloroplastique, spécifique de chacune des espèces animales ou végétales appartenant au groupe taxonomique donné. Par spécifique, on entend qu'elle est unique, en référence aux autres espèces du groupe taxonomique donné. C'est-à-dire qu'elle ne se retrouve pas à l'identique chez les autres espèces animales ou végétales appartenant au groupe taxonomique donné, car elle appartient à un domaine du génome variable entre les espèces qui permet donc la discrimination d'espèces très proches phylogénétiquement. Les sondes espèce spécifiques sont issues de ces régions spécifiques du génome mitochondrial ou chloroplastique spécifique à l'espèce et conservent la spécificité telle que définie ci-dessus (c'est-à-dire unicité par rapport à toutes les autres espèces du groupe taxonomique donné).
Par « séquence inverse complémentaire » d'une séquence, on entend une séquence complémentaire à la séquence inverse de ladite séquence. Dans la séquence complémentaire d'une séquence donnée, chaque base est remplacée par sa base complémentaire, à savoir, G par C, C par G, A par T et T par A.
Le pourcentage d'identité de séquences, est, au sens de l'invention, déterminé par les techniques de comparaison de séquences nucléiques, réalisées après alignement. Les alignements de séquences sont réalisés, par exemple, avec le logiciel SeaView (Galtier et al. Comput. Applic. Biosci., 12, 543-548, 1996) qui utilise le programme d'alignement Clustal_w, développé par Thompson et al. Nucleic Acid Res. 22, 4673-4680, 1994). Après alignement, le pourcentage d'identité de séquence est alors calculé entre les deux fragments alignés de même longueur, en comptant manuellement ou à l'aide d'un logiciel commercial, le nombre de bases identiques et en le divisant par la longueur du fragment * 100 sur lequel la comparaison a été réalisée.
Une espèce de végétaux ou d'animaux, est définie comme un groupe d'organismes végétaux ou d'organismes animaux vivants, génétiquement séparés des autres organismes vivants, végétaux ou animaux respectivement, et capables de se reproduire uniquement entre eux. Une espèce est désignée par le nom binomial reconnu par les codes internationaux de nomenclature zoologique et botanique, comme par exemple, Bison bison, Bison bonasus, Bos taurus, Capra hircus, Capra ibex, Capra pyraneica, Ovis aries, Rupicapra pyraneica, Rupicapra rupicapra, Camelus bactrianns, Camelus dromaderius, Lama pacos, Âlces alces, Cervus elaphus, Rangifer tarandus, Elephas maximus, Loxodonta Africana, Equus asinus, Equus cάballus, Felis catus, Homo sapiens, Lepus europaeus, Oryctolagus cuniculus, Macropus giganteus, Macropus robustus, Macropus rufus, Mus musculus, Rattus rattus, Mustela erminea, Mustela vison, Ceratotherium simum, Dicerorhinus sumatrensis, Diceros bicornis, Rhinocéros sondaicus, Rhinocéros unicornis, Sus scrofa, Selenarctos thibetanns, Ursus americanus, Ursus arctos, Ursus maritiimus, Anas platyrhynchos, Cairina moschata, Dromaius novaehollandiae, Meleagris gallopavo, Numida meleagris, Coturnix coturnix, Gallus gallus, Rhea americana, Struthio camelus, Anguilla anguilla, Tracluinis trachunis, Cypvimis carpio, Gobio gobio, Rutilus rutilas, Tinca tinca, Gadus morhua, Pollachius virβns, Dicentrarclnts labrax, Dicentrarchus punctatus, Perça fluviatilis, Oncorhynchus kisutch, Oncorhynchus masou, Oncorhynchus mykiss, Salmo salai; Salmo trutta, Salvelinus alpimis, Salvelinus fontinalis, Sarcla sarcla, Scomber japonicus, Scomber scombrus, Thunmis alalunga, Thunnus obesus, Thiumus thynnus, Scyliorhinus canicula, Diplodus sargus, Spams auratus, Spondyliosoma cantharus, Squalus acanthias, Zens faber.
Par "groupe taxonomique végétal ou animal", on entend un groupe d'espèces formant un groupe monophylétique, comme par exemple les mammifères, les gadidae. Par " groupe taxonomique végétal ou animal donné", on entend un ensemble d'espèces animales ou un ensemble d'espèces végétales, appartenant à un ensemble monophylétique, cet ensemble étant choisi en fonction de l'application spécifique visée par le procédé de l'invention. Par "échantillon de matière organique", on entend toute matière solide ou liquide que l'on suppose avoir au moins partiellement une origine organique, c'est-à-dire issue d'êtres vivants, animaux ou végétaux, même après un processus de transformation complexe.
Par "matière biologique issue d'une espèce animale ou végétale", on entend une matière extraite d'un individu d'une espèce animale ou végétale qui présente un ADN spécifique de l'espèce.
Par "permettant de détecter, simultanément, la présence de matières biologiques issues de différentes espèces animales ou végétales ", on désigne le fait de pouvoir repérer simultanément la présence éventuelle de différents fragments d'ADN, chacun de ces fragments étant spécifique d'une espèce animale ou végétale différente. Dans un second temps, par détection des réactions d'hybridation, il est possible de sélectionner les différentes espèces susceptibles d'être présentes (c'est-à-dire pour lesquelles une réaction d'hybridation est constatée), voire identifier précisément les espèces présentes (c'est-à- dire celles dont un ADN spécifique est présent). Par "ADN frais", on désigne un ADN extrait d'un individu vivant ou extrait rapidement après sa mort. L'ADN frais se caractérise par la présence de très grands fragments de plus de 20 000 paires de bases.
Par " ADN dégradé", on désigne un ADN ayant subi des détériorations qui sont liées à l'action de l'environnement ou à des procédés de transformation. L'ADN dégradé se trouve généralement sous forme de petits fragments (inférieur ou égal à environ 200 pb) et en petite quantité. Des exemples dans lesquels I1ADN se trouve sous forme dégradée sont : - aliments (cuit, lyophilisé, séché, fumé, saumuré, appertisé, pasteurisé, congelé...) - engrais, farines, graines (broyé, séché, fermenté, torréfié...) - coquilles d'oeuf, ossements, cornes, dents, poils, cheveux, plumes, excréments (séchage, action du temps, de la température...) - alcools (alcoolisé, distillé, fermenté,...) - cuirs, peaux, fourrures, tissus momifiés (tanné, taxidermisé, coloré,...) - parchemins, papiers, bois (action du temps, procédé de transformation utilisé en papeterie,...) - ivoire, ambre (action du temps,...) - colles, pigments naturels (peintures, teintures), terres, sédiments (procédé de transformation utilisé dans ces domaines) - cadavres et ossements humains ou animaux (action du temps ou de l'environnement) - restes de végétaux, herbiers...
On entend par "produit d'amplification", le ou les fragments d'ADN ou la ou, les séquences d'ADN amplifié(e)s obtenu(e)s à l'issue de la réaction de polymérisation en chaîne (PCR). Le produit d'amplification contient plusieurs copies de différents fragments ou de différentes séquences d'ADN amplifié(e)s, lorsque l'échantillon de matière organique à analyser comporte un mélange de différents fragments d'ADN, provenant chacun d'une espèce différente appartenant au groupe taxonomique donné.
La description de l'invention va maintenant être détaillée, en référence aux figures annexées.
La figure 1 présente schématiquement les principales étapes du procédé selon l'invention.
La figure 2 montre une carte sommaire du gène complet codant pour le cytochrome b chez l'espèce humaine (Genbank numéro d'accès : J01415), et les positions des zones variables, desquelles sont issues les sondes dans l'exemple illustratif, et les positions des zones conservées dont sont issues les amorces. Nomenclature utilisée : L : indique que les amorces sont situées sur le brin orienté 5 '-3' dans les banques de séquences internationales, H: indique que les amorces sont situées sur le brin complémentaire , P: phosphate et Cy3 : fluorophore, 14747 et 15887 : première et dernière bases du cytochrome b sur le génome mitochondrial complet de l'espèce humaine. La figure 3 présente un tableau récapitulatif des espèces choisies formant le groupe taxonomique donné, dans l'exemple illustratif, de leurs noms communs, du nombre de séquences utilisées pour déterminer leurs oligonucléotides espèce-spécifiques associés (N) et le ou les numéros d'accessions utilisés.
La figure 4 résume les 5 étapes (A-E) utilisées pour déterminer des oligonucléotides espèce-spécifiques dans le cas du bar Dicentrarchns labrax. La figure 5 présente un tableau récapitulatif des espèces choisies formant le groupe taxonomique donné, dans l'exemple illυstratif, et de leur oligonucléotide espèce- spécifique respectif avec leur Tm, hairpin et homoduplex associés.
La figure 6 présente des exemples d'amplifications après migration sur des gels d'agarose 2% pour les 3 types de fragments, respectivement de haut en bas le long, le moyen et le court. Quelques bandes aspécifiques sont visibles pour certaines espèces.
La figure 7 illustre les différentes étapes du procédé selon l'invention, de l'extraction de l' ADN jusqu'à la détection des éventuelles réactions d'hybridation. La figure 8 montre les résultats des hybridations des mélanges A, B et C. La présente invention est basée sur le principe illustré figure 1 qui consiste à amplifier l'ADN de substrats frais ou transformés, par PCR avec un seul couple d'amorces permettant, pour toutes les espèces que l'on cherche à détecter, d'amplifier un court fragment d'ADN cible espèce spécifique, mettre en contact le produit d'amplification, avec des olignucléotides sondes espèce-spécifiques complémentaires, par exemple, déposés sur une puce à ADN, pour détecter s'il y a eu ou non réaction d'hybridation. Ceci permet ainsi de cribler simultanément la présence d'un grand nombre d'espèces, seules ou en mélange. Le principe de détection consiste donc à fixer sur un support une sélection donnée de gènes ou de fragments de gènes, espèces spécifiques, sous la forme d'un seul brin (sondes), à l'incuber en présence du produit d'amplification : si la séquence complémentaire de gènes (cible) est présente dans le produit d'amplification, cette séquence va reconnaître spécifiquement sur le support sa séquence complémentaire et former un double brin d'ADN. Ce processus est dénommé hybridation.
Avantageusement, la séquence d'ADN cible espèce spécifique est d'origine mitochondriale pour les animaux et les végétaux ou bien chloroplastique pour les végétaux. L'ADN mitochondrial (ADNmt) s'avère être la molécule la plus appropriée pour ce type d'analyse (Wilson et al, Biol. J. Linnean Soc, 26, 375-400, 1985 ; Herrison. Trends in Evolution and Ecology, 4, 6-11, 1989). D'un point de vue technique, il est plus facile à détecter que l'ADN génomique car il est présent de 100 à 1000 copies par cellule contre deux copies pour l'ADN nucléaire. Il peut donc être plus sûrement détecté dans des matières organiques dans lesquelles l'ADN est soumis à divers facteurs physiques (température, pression,...) chimiques ou biochimiques tendant à sa dégradation. De plus c'est un excellent marqueur d'espèce qui est souvent utilisé en phylogénie.
De façon avantageuse, le procédé selon l'invention doit pouvoir être mis en œuvre sur un échantillon contenant de l'ADN dégradé, où seul un fragment court de quelques centaines de paires de bases peut être amplifié. Par conséquent, de façon avantageuse, les ADN cibles et les sondes spécifiques à chaque espèce animale ou végétale du groupe taxonomique choisi, appartiennent à une région nucléotidique (ou à sa séquence inverse complémentaire), de moins de 400 nucléotides, de l'ADN mitochondrial ou chloroplastique, la dite région nucléotidique étant spécifique à chaque espèce animale ou végétale qui appartient au groupe taxonomique donné.
Le procédé selon l'invention est particulièrement adapté à la détection et à l'identification d'un grand nombre d'espèces de vertébrés qui sont, soit utilisées dans l'alimentation humaine, soit qui ont un intérêt particulier au sein de la biodiversité (espèces en voie de disparition, commerce contrôlé). Aussi, le groupe taxonomique choisi correspond, avantageusement, à un groupe d'espèces de vertébrés qui comprend notamment une ou plusieurs espèces de poissons actinoptérygiens et/ou chondrichtyens, et de préférence plusieurs espèces de mammifères, oiseaux, poissons actinoptérygiens et chondrichtyens. Dans ce cas, les ADN cibles et les sondes espèces spécifiques sont avantageusement choisis au sein de l'ADN codant pour le cytochrome b, car, en plus des raisons mentionnées ci-dessus : (i) la séquence de ce gène est très variable entre les espèces et permet donc la discrimination d'espèces très proches phylogénétiquement, (ii) il existe un certain nombre de régions extrêmement conservées le long du gène qui permettent donc de dessiner des couples d'amorces communs à un très grand nombre d'espèces, (iii) la variabilité individuelle de ce gène au sein de la même espèce est relativement faible (quelques %), (iv) ce gène a été préférentiellement utilisé en phylogénie moléculaire ces 15 dernières années, il est par conséquent de très loin le gène mitochondrial le plus représenté dans les banques (plus de 20000 séquences pour les seuls vertébrés en 2001).
Avantageusement, les ADN cibles et sondes espèces spécifiques sont issues d'un fragment de 373 paires de bases (avec les amorces) situé approximativement au centre du gène (longueur totale du gène environ 1140 paires de bases, variables entre les espèces). Cette zone comprend 2 zones transmembranaires qui sont les plus variables dans le gène et est située entre deux régions conservées ce qui permet de dessiner des amorces permettant l'amplification d'un très grand nombre d'espèces de vertébrés. La figure 2 illustre précisément la position de ces zones conservées et variables sur l'ADN mitochondrial humain codant pour le cytochrome b (Numéro d'accession de la séquence de référence : J01415 de SEQ ID N0I. Anderson et al Nature, ; 290:457-465, 1981).
La nomenclature suivante a été adoptée sur la figure 2 : le nombre indique la position de l'extrémité 3' de l'amorce sur le gène complet du cytochrome b de l'humain avec : L : indique que les amorces sont situées sur le brin orienté 5 '-3' dans les banques de séquences internationales: H: indique que les amorces sont situées sur le brin complémentaire, P: phosphate et Cy3 : fluorophore, 14747 et 15887 première et dernière bases du cytochrome b sur le génome mitochondrial complet de l'espèce humaine (Genbank Numéro d'accession de la séquence de référence : J01415 de SEQ ID N°l). L'étape a) du procédé selon l'invention consiste à extraire l'ADN frais ou dégradé de l'échantillon organique d'intérêt. L'isolement des acides nucléiques de l'échantillon de départ peut être réalisé de diverses façons. Ces procédés comprennent l'utilisation de détergents conduisant à des lysats, l'utilisation d'en:zymes (lysozyme, protéinase K, par exemple) le traitement aux ultrasons, l'agitation mécanique en présence de billes. Dans certains cas, il peut être nécessaire de purifier les acides nucléiques extraits afin de se débarrasser d'éventuels contaminants tels que des nucléases. Dans ce cas, la purification des acides nucléiques peut être réalisée par extraction au phénol-chloroforme, chromatographie, échange d'ions, électrophorèse, centrifugation à l'équilibre ou par capture par hybridation sur un support solide. Des trousses ou kits d'extraction disponibles dans le commerce pourront être utilisés. L'extraction d'ADN par la méthode au phénol/chloroforme s'adresse à tous les types d'échantillons susceptibles de contenir de la matière organique, tels que filet, soupe, terrine, pâté, graisse, farine, préparations à base de poissons .... Cette méthode fait appel à des techniques décrites dans HÀNNI et al, 1990, C. R. Acad. Sci. Paris., 310, 365-370 et HÀNNI et al, 1995, Nucl. Acids Res., 23 ,881-882 et est notamment décrite dans WO02/101090 auquel on pourra se référer pour plus de détails.
Selon l'invention, le procédé comprend une étape b) d'amplification de l'ADN extrait de l'échantillon biologique d'intérêt. L'amplification de l'ADN extrait consiste à multiplier les fragments d'acide nucléique espèce-spécifiques extraits de l'échantillon. Elle permet d'augmenter considérablement le nombre de copies d'une séquence nucléique cible à détecter. Pour cela, on utilise la "Polymerase Chain Reaction" (dite PCR), technique d'amplification de cible qui repose sur la répétition de cycles de synthèse d'ADN in vitro par élongation d'amorces nucléotidiques hybridées sur la séquence cible (Saiki et al. 1985. Science 230 : 1350-1354 ; EP 0 201 184). Pour plus de détails, la méthode d'amplification en chaîne par polymerase (PCR) comprend une répétition du cycle des étapes suivantes : - chauffage de l'ADN extrait du mélange d'origine organique, de façon à séparer l'ADN en deux brins monocaténaires, - hybridation des brins d'ADN monocaténaires à une température adéquate avec les amorces oligonucléotidiques selon l'invention pour amplifier l'ADN spécifiques des espèces que l'on cherche à détecter et/ou identifier, - élongation desdites amorces oligonucléotidiques appropriées par une polymérase à une température adéquate, pour obtenir un produit d'amplification unique contenant chacune desdites séquences d'ADN ou chacun desdits fragments d'ADN caractéristique de Ia ou des espèces présentes.
Brièvement, deux amorces nucléotidiques complémentaires chacune d'une séquence d'un des deux brins de l'ADN cible sont synthétisées. Des désoxyribonucléosides triphosphates sont ajoutés en excès au milieu réactionnel en présence d'une ADN polymérase ADN-dépendante thermostable (Taq polymérase). Si un
ADN cible est présent dans l'échantillon, les amorces s'hybrident sur leurs sites spécifiques et la polymérase étend l'extrémité 3' de ces amorces par addition successive des nucléotides complémentaires de la cible. En réalisant des cycles successifs de montée et descente de température, les amorces étendues se dissocient de la cible et peuvent, comme la cible originale, fixer les amorces nucléotidiques en excès. Par répétition du processus (de 30 à 50 fois), on aboutit à une accumulation exponentielle de la séquence cible comprise entre les deux amorces. La PCR est donc réalisée en présence d'un système en∑ymatique adapté et d'un couple d'amorces de l'invention, préalablement à l'étape d'hybridation puis de détection. Avantageusement, l'une des amorces est marquée, afin de permettre ultérieurement la détection lors de l'étape d) du procédé selon l'invention. Tout kit disponible dans le commerce, et notamment le Kit Eppendorf peut être utilisé pour la réaction de PCR. Dans le cas de produits transformés, il est nécessaire d'utiliser des protocoles d'amplification (Hanni et al. 1990 et 1995 supra et
WO98/50401) pour notamment s'affranchir des éventuels inhibiteurs présents. Le produit d'amplification est avantageusement purifié, selon toute technique classique bien connue de l'homme de l'art.
L'amplification de l'ADN contenu dans l'échantillon de matière organique d'intérêt est réalisée à l'aide d'un couple d'amorces permettant d'amplifier, pour toutes les espèces du groupe taxonomique sélectionné, un fragment d'ADN spécifique de l'espèce. En particulier, les couples d'amorces suivants sont particulièrement adaptées pour un groupe de vertébrés : un oligonucléotide constitué d'environ 15 à 25 nucléotides, de préférence de 17 à 23 nucléotides, présentant au moins 80%, préférentiellement au moins 90% et avantageusement au moins 95% d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID
N°2 : CTICCITGAGGICARATRTC OU la séquence SEQ ID N°3 :
CTNCCNTGAGGNCARATRTC et un oligonucléotide constitué d'environ 15 à
25 nucléotides, de préférence de 17 à 23 nucléotides, présentant au moins 80%, préférentiellement au moins 90% et avantageusement au moins 95% d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID N°4 : TRAARTTITCIGGRTCICC ou la séquence SEQ ID N0 5 : TRAARTTNTCNGGRTCNCC, un oligonucléotide constitué d'environ 15 à 25 nucléotides, de préférence de 17 à 23 nucléotides, présentant au moins 80%, préférentiellement au moins 90% et avantageusement au moins 95% d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID
N° 2 ou la séquence SEQ ID N° 3 et un oligonucléotide constitué d'environ 15 à 25 nucléotides, de préférence de 17 à 23 nucléotides, présentant au moins 80%, préférentiellement au moins 90% et avantageusement au moins 95% d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID N°6 : GGRTGRAAICRIAYTTTRTC ou la séquence SEQ ID N° 7 : GGRTGRAANCRNAYTTTRTC, un oligonucléotide constitué d'environ 15 à 25 nucléotides, de préférence de 17 à 23 nucléotides, présentant au moins 80%, préférentiellement au moins 90% et avantageusement au moins 95% d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID N°4 ou la séquence SEQ ID N°5 et un oligonucléotide constitué d'environ 15 à 25 nucléotides, de préférence de 17 à 23 nucléotides, présentant au moins 80%, préférentiellement au moins 90% et avantageusement au moins 95% d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID N°8 : GAYAAARTTYCITTYCA YCC ou la séquence SEQ ID N°9 : GAYAAARTNYCNTTYCAYCC, avec I : inosine ; R : A ou G ; et Y : C ou T et N : A, G, C ou T. Les couples d'amorces suivants sont particulièrement préférés :
- SEQ ID N° 2 ou SEQ H) N° 3 et SEQ ID N° 4 ou SEQ ID N° 5,
- SEQ ID N0 2 ou SEQ ID N0 3 et SEQ ID N° 6 ou SEQ ID N° 7, (
- SEQ ID N° 4 ou SEQ ID N° 5 et SEQ ID N° 8 ou SEQ ID N° 9. L'invention a également pour objet les oligonucléotides constitués d'environ 15 à 25 nucléotides, de préférence de 17 à 23 nucléotides, présentant au moins 80%, préférentiellement au moins 90% et avantageusement au moins 95% d'identité de séquence avec l'un des oligonucléotides présentant l'une des séquences suivantes ou leurs séquences inverses complémentaires respectives :
- la séquence SEQ ID N° 2 : CTICCITGAGGICARATRTC - la séquence SEQ ID N° 3 : CTNCCNTGAGGNCARATRTC
- la séquence SEQ ID N°4 : TRAARTTITCIGGRTCICC
- la séquence SEQ ID N°5 : TRAARTTNTCNGGRTCNCC
- la séquence SEQ ID N°6 : GGRTGRAAICRIAYTTTRTC
- la séquence SEQ ID N°7 : GGRTGRAANCRNAYTTTRTC - la séquence SEQ ID N°8 : GAYAAARTIYCITTYCAYCC - la séquence SEQ ID N°9 : GAYAAARTNYCNTTYCAYCC avec I : inosine ; R : A ou G ; et Y : C ou T et N : A, G, C ou T.
Les couples d'amorces préférés SEQ ID N° 2 et SEQ ID N° 4, SEQ ID N0 2 et SEQ ID N° 6, SEQ ID N° 4 et SEQ ID N° 8 se retrouvent, chez tous les vertébrés sélectionnés, dans la séquence ADN codant pour le cytochrome b et encadrent, comme illustré figure 2 les fragments d'ADN espèces spécifiques que l'on souhaite amplifier. Ces amorces présentant des inosines qui présentent des affinités chimiques avec les quatre bases, permettent d'amplifier toutes les espèces du groupe taxonomique donné qui a été sélectionné. Par ailleurs, l'utilisation des couples d'amorces suivants : - SEQ ID N0 2 ou SEQ ID N° 3 et SEQ ID N° 4 ou SEQ ID N° 5,
- SEQIDN°2ouSEQIDN°3etSEQIDN°6ouSEQIDN°7,
- SEQIDN°4ouSEQIDN°5etSEQIDN°8ouSEQIDN°9. de séquences dégénérées au niveau des positions R, Y et N, c'est-à-dire d'un mélange d'oligonucléotides dans lesquels R = A et d'oligonucléotides dans lesquelles R = G, au niveau des positions R, d'oligonucléotides dans lesquels Y = C et d'oligonucléotides dans lesquelles Y = T, au niveau des positions Y, d'oligonucléotides dans lesquels N = A, d'oligonucléotides dans lesquels N = G, d'oligonucléotides dans lesquels N = C et d'oligonucléotides dans lesquelles N = T, au niveau des positions N, permet également d'amplifier un plus grand nombre d'espèces. Ledit produit d'amplification est donc susceptible de contenir différents fragments d'ADN caractéristiques de différentes espèces de vertébrés.
Dans le cas où l'échantillon est susceptible de contenir de l'ADN dégradé, on utilisera, avantageusement, en combinaison deux couples d'amorces l'un choisi parmi SEQ ID N° 2 ou SEQ ID N° 3 et SEQ ID N° 6 ou SEQ ID N° 7, l'autre parmi SEQ ID N° 4 ou SEQ ID N° 5 et SEQ ID N° 8 ou SEQ ID N° 9 qui permettent d'amplifier des fragments d'ADN espèce-spécifiques plus petits.
L'étape c) suivante du procédé met en oeuvre des sondes espèces-spécifiques choisies en vue d'être immobilisées sur une biopuce, de façon à évaluer la présence d'acides nucléiques espèces-spécifiques mis dans des conditions d'hybridation avec les sondes, en détectant les sondes sur lesquelles se fixent ces acides nucléiques par hybridation. Il est alors possible, de déduire les espèces dont des substances biologiques sont présentes au sein de l'échantillon et donc d'identifier de telles espèces car, dans la grande majorité des cas, seules des réactions d'hybridation spécifique sont observées. Par « hybridation spécifique », on entend une réaction d'hybridation entre une sonde spécifique d'une espèce et l'ADN cible de cette espèce. Dans certains cas très rares, il ne sera cependant pas possible d'identifier précisément l'espèce présente, certains ADN cible amplifiés pouvant s'hybrider, en plus de s'hybrider avec leur oligonucléotide sonde espèce spécifique, avec un ou deux autres oligonucléotides sondes spécifiques d'une autre espèce, en raison de réaction parasite d'hybridation aspécifique. Mais, le procédé selon l'invention permettra toujours d'éliminer un grand nombre d'espèces qui ne sont pas présentes et de sélectionner les espèces susceptibles d'être présentes.
De façon à réaliser l'identification de la ou des espèces présentes, on choisira avantageusement des sondes espèces spécifiques présentant au plus 87 %, de préférence au plus 85 % d'identité de séquence, les bases différentes étant situées, préférentiellement, dans la partie centrale de la séquence.
Chaque ADN sonde espèce spécifique sélectionnée est susceptible d'entraîner une réaction d'hybridation spécifique avec un acide nucléique amplifié, spécifique à l'espèce sélectionnée dont il est la sonde, comprenant une séquence complémentaire à celle de l' oligonucléotide. La plupart des techniques d'hybridation connues peuvent être mises en oeuvre dans ce procédé et notamment les techniques dites "Dot Blot" ou "Southern".
Le procédé selon l'invention est adapté pour être mis en œuvre avec une biopuce et les ADN sondes sont sélectionnés dans ce but. Les différentes sondes sont donc, préférentiellement, aptes à s'hybrider dans des conditions de température d'hybridation comparables et ne se replient pas sur elle-même dans ces conditions d'hybridation. Les sondes (ici des oligonucléotides spécifiques d'espèces) sont donc déposées sur un support de puce ADN, chaque sonde étant fixée en nombre multiple sur un site élémentaire de la face active du support. L'utilisation des puces à ADN permet ainsi de rechercher simultanément la présence d'un très grand nombre d'espèces, sans avoir à séquencer ou bien à cloner puis séquencer dans le cas de mélanges, le produit de PCR. De façon avantageuse, le procédé selon l'invention permet de détecter au moins 40, de préférence au moins 50, avantageusement toutes les espèces de vertébrés suivantes :
Bison bison, Bison bonasus, Bos taurus, Capra hircus, Capra ibex, Capra pyraneica, Ovis aries, Rupicapra pyraneica, Rupicapra rupicapra, Camelus bactrianus, Camelus dromaderhis, Lama pacos, Alces alces, Cervus elaphus, Rangifer tarandus, Elephas maximus, Loxodonta Africana, Equus asinns, Equus caballus, F élis catus, Homo sapiens, Lepus europaeus, Oryctolagus cuniculus, Macropus giganteus, Macropus robustus, Macropus rufiis, Mus musculm, Rattus rattus, Mustela erminea, Mustela vison, Ceratotherium simum, Dicerorhinus sumatrensis, Diceros bicomis, Rhinocéros sondaicus, Rhinocéros unicornis, Sus scrofa, Selenarctos thibetanus, Ursus americanus, Ursus arctos, Ursus mariturnus, Anas platyrhynchos, Cairina moschata, Dromains novaehollandiae, Meleagris gallopavo, Numida meleagris, Cotwnix cotuπiix, Galhis gallus, R/iea ameiïcana, Struîhio camelus, Anguilla anguilla, Traduiras traclnirus, Cyprinus carpio, Gobio gobio, Rutilas rutilas, Tinca tinca, Gadus morhua, Pollachius virens, Dicentrarchus labrax, Dicentrarchus punctatus, Perça fluviatilis, Oncorhynchus kisutch, Oncorhynchus masou, Oncorhynchus mykiss, Salmo salar, Salmo trutta, Salvelinus alpinus, Salvelinus fontinalis, Sarda sarda, Scomber japonicus, Scomber scombrus, Thunniis alalunga, Thunnus obesus, Thunnus thynnus, Scyliorhinus canicula, Diplodus sargus, Sparus auratus, Spondyliosoma cantharus, Squalus acanthias, Zeus faber. Dans ce cas, l'ADN sonde de chaque espèce est avantageusement constitué d'un oligonucléotide comportant au plus 50 nucléotides, de préférence de 17 à 24 nucléotides, et correspondant à une portion espèce spécifique, de l'ADN mitochondrial codant pour le cytochrome b de la dite espèce, comprise approximativement entre les nucléotides n° 15162 et n° 15497 de l'ADN mitochondrial codant pour le cytochrome b, les numéros des nucléotides correspondant à leur position par rapport à la séquence nucléotidique de l'ADN mitochondrial humain codant pour le cytochrome b prise comme référence (S. Anderson et al. Nature 290, 457-465, 1981 Genbank, J01415), après alignement du gène de ladite espèce codant pour le cytochrome b avec le gène humain de référence codant pour le cytochrome b. L'alignement est par exemple réalisé avec la méthode Clustal__w décrite précédemment. En particulier, l'ADN sonde de chaque espèce est constitué d'un oligonucléotide comportant au plus 50 nucléotides, de préférence de 17 à 24 nucléotides, et correspondant à une portion espèce spécifique, de l'ADN mitochondrial codant pour le cytochrome b de la dite espèce, comprise approximativement entre les nucléotides n° 15162 et n°15392 ou n°15411 et n°15497 de TADN mitochondrial codant pour le cytochrome b, les numéros des nucléotides correspondant à leur position par rapport à la séquence nucléotidique de l'ADN mitochondrial humain codant pour le cytochrome b prise comme référence (S. Anderson et al. supra, Genbank, JO 1415), après alignement du gène de ladite espèce codant pour le cytochrome b avec le gène humain de référence codant pour le cytochrome b. Dans le cas des espèces ci-dessus mentionnées, cette portion espèce spécifique comprise approximativement entre les nucléotides n°15162 et n° 15497 correspond à la séquence consensus suivante qui regroupe sous forme générique toutes les séquences trouvées chez les espèces sus-mentionnées :
CTNCCNTGRGGNCARATRTCNTTYTGRGGNGCNACNGTHATYACNAAY
YTNHTNTCNRCNNTYCCNTAYRTNGGNRNNNHNYTNGTNSARTGRRYY TGRGGNGGNTTYTCNRTNGAYAAHSCNACHYTNAMHCGNTTYTTYRCH WTYCAYTTYHTHYTNCCNTTYNTHRTYINΓYMISNNYND YNNTNNTNCAY HTRHYNTTYYTNCAYGARWCNGGNKCHAAYAAYCCNNYNGGHHTHNH NTCNRA YNBNGA YAAARTHHCNTTYCA YCCNTA YTWYWCNHWYAARG AYNYNYTNGGNNYNNYMVFBNNTNNYNNYNNBNYTNNYNNBHYTNRYH YTVYTHDHNCCNVAYHTNYTNGGVGAYSCNGANAAYTWYY dans laquelle :
M : A ou C
R : A ou G
W : A ou T S : C ou G
Y : C ou T
K : G ou T
V : A, C ou G
H : A, C ou T D : A, G ou T
B : C, G ou T
N : A, C, G ou T
Préférentiellement, les sondes ADN correspondent à un fragment espèce spécifique de l'ADN codant pour le cytochrome b de l'espèce dont elle est la sonde qui a l'une des séquences suivantes, avec éventuellement un à 5 nucléotides de moins à l'une ou l'autre des extrémités 3' ou 5' et/ou un à 5 nucléotides de plus à l'une ou l'autre des extrémités
3' ou 5' :
SEQ ID N° 10 : TACTACTGGTACTATTCACACC SEQ ID N° 11 : ACTAGTACTATTCGCACCGG SEQ ID N° 12 : ATTAAGGACATCTTAGGGGC SEQ ID N° 13 : ATATCTTAGGCGCCATGCTA SEQ ID N° 14 : GTCATCACTAACCTTCTCTCAG SEQ ID N° 15 : CCTTCCATTTTATCCTCCCA SEQ ID N° 16 : ATCCTAGGTGCTATCCTACT SEQ ID N° 17 : GGCATAGACTTAGTCGAGTG SEQ ID N° 18 : CCATCAAAGACATTCTGGGC SEQ ID N0 19 : TTCTCGTACTGTTCTCACCA SEQ ID N° 20 : TGATGCTAGCCCTACTTATC SEQ ID N° 21 : TTTAGGAGCACTGCTACTTATT SEQ ID N° 22 : TCTTAGGTGCCCTACTCTTA SEQ ID N0 23 : CAGCACTCGCTATAGTACAC SEQ ID N0 24 : CAAAGACATTCTAGGCATCC SEQ ID N0 25 : CACTAGGTCTCACTTCAGAC SEQ ID N0 26 : CACTAGCAGGAGTACACCTA SEQ ID N° 27 : TTCTCCTCCTAGTCCTACTC SEQ ID N0 28 : CCTGATCTTGCTCCTACTAA SEQ ID N0 29 : TCGGGACTGAACTAGTAGAA SEQ ID N0 30 : TCTTCCTTCTCTCCTTAATGAC SEQ ID N0 31 : TGCAGCTCTAGTGATAATTCAC SEQ ID N0 32 : GTAGCCATTCTTCTCCTCCT SEQ ID N° 33 : TCCTTGTCCTACTCACACTA SEQ ID N° 34 : TCGCCTTTCATTTT ATCCT ACC SEQ ID N0 35 : CTCCTCATCCT ACTCACATT SEQ ID N° 36 : TTGACCCGATTCTTCGCTT SEQ ID N° 37 : GACTT ACTTGGAGTGTTCAT AC SEQ ID N0 38 : CATCATTTCAGCACTAGCAG SEQ ID N° 39 : CCAATAACCCCTCTGGAATC SEQ ID N0 40 : CCTGGGAATTTT ACTCCT AATCC SEQ ID N0 41 : GGTTCTTTGCTTTCCACTTC SEQ ID N° 42 : CGTATATCGGCACAACTCTC
SEQ H) N0 43 : GCCCTGCTTCTAATTATAGTATT SEQ ID N° 44 : CTGATCCTAGTATTACTCATCCT SEQ ID N° 45 : CTGCCATTCATCATTACCG SEQ DD N0 46 : CTAGCCTTAGCAACTCTAGTC SEQ ID N° 47 : CATCTTGACACTAGCAGCAG SEQ ID N0 48 : TACTTCTCGCCCT AACCTTA SEQ ID N° 49 : ACTTCTCACCCTAGCCTTA SEQ ID N° 50 : CCTAGGTCTTGTATCAGACTGT SEQ ID N0 51 : TTTATTCTTATACTCACCCCCC SEQ ID N° 52 : CCTCTCCTAATCCTAGCCTTT SEQ ID N° 53 : CTAACCCCCTTACTCACATTA SEQ ID N0 54 : AACTCTAGT AGAGTGGGCGT SEQ ID N° 55 : TGATACTTACCCCATTCCTC SEQ ID N° 56 : CATTCTGGGCTTAACTCTCAT SEQ ID N° 57 : TAACCCTAGCCTTCTTCTCA SEQ ID N° 58 : CCCTACTATCCCTAGCATTC
SEQ ID N° 59 : TTGCTGGGGCCACAATA
SEQ ID N° 60 : CTTTCTTCGTCCTCCATGTA
SEQ ID N° 61 : TAGCTCTTACACTACTAGCACT SEQ ID N0 62 : CTAACCTTTTATCAGCAGTCC
SEQ ID N° 63 : AGACCTCCTTGGCTTTGTAA
SEQ ID N° 64 : CCTCCTACACCTGCT ATTTTT
SEQ ID N° 65 : ATGCTACCCTAACTCGGTTT
SEQ ID N° 66 : CTAATGTCCACTGTCCCCTA SEQ ID N° 67 : GTTCTAATTGGATTAACTAGCCTC
SEQ ID N° 68 : ATCGTTTTAATTGGCCTAGCT
SEQ ID N0 69 : CTAATCGCTCTAACAGCTCTAGC
SEQ ID N° 70 : TAACCAGCGGGGATT AACTC
SEQ ID N° 71 : TGGAAACGCCCTTGTACAAT SEQ ID N° 72 : TTCACCTTCTGTTCCTTCATG
SEQ ID N° 73 : CATCCTTAGCTCTATTCGCA
SEQ ID N° 74 : CATCATTAGCTCTGTTCGCA
SEQ ID N° 75 : TCGTAGCTATATTGCTTGGC
SEQ ID N° 76 : CTGCTGTACCCT ATGTAGGA SEQ ID N° 77 : CAATTCTGCTTGTTGCACT
SEQ ID N° 78 : TGGCAGCAACAATTCTTCAC
SEQ ID N° 79 : TTCCCCTTTGTTATCTTAGCG
SEQ ID N° 80 : TATGTTGGAACTACCCTCGTT
SEQ ID N° 81 : ATATGTCGGAACTACCCTCG SEQ ID N° 82 : TGATCCTGCTAGTAGCACTC
SEQ ID N° 83 : ACCTTATTAGCAACCTTAGCA
SEQ ID N° 84 : TTCCTTCTCCCCTTCGTTGT
SEQ ID N° 85 : TAACTTGTCTTGCCCTATTCG
SEQ ID N° 86 : AAGATCTGCTAGGGTTTGCA SEQ ID N° 87 : ATTCCTAATCGTGGGCCTAA
SEQ ID N° 88 : TATCCACCTTGTCCTTGTTC
Dire que les sondes peuvent comprendre un à 5 nucléotides de plus à l'une et/ou l'autre des extrémités 3' ou 5', de ces séquences signifie qu'elle peut inclure à chaque extrémité de une à cinq bases adjacentes dans le gène codant pour le cytochtome b de l'espèce dont elle est la cible, ce qui revient à déplacer un peu la séquence sonde sur le génome. Le tableau présenté figure 5 indique, pour chaque sonde de séquence SEQ ID N0 10 à SEQ ID N° 88, de quelle espèce elle est spécifique.
L'invention a donc également pour objet les ADN sondes ci-dessus mentionnées, et en particulier celles correspondant aux séquences SEQ ID N° 10 à SEQ ID N° 88. Par puce ADN, on entend tout support solide sur lequel sont immobilisés des fragments d'ADN. On pourra notamment se référer à « DNA chips : a new tool for genetic analysas and diagnostics". M. Cuzin. Transfusion clinique et Biologique 2001 ;8 : 291-6 ; et "How to make a DNA chip "Mickael C Pirrung. Angew. chem. Int. ed 2002,41, 1276, 1289. La biopuce va être destinée à recevoir, sous forme liquide, l'échantillon organique d'intérêt suspecté de contenir au moins une substance biologique issue d'une espèce cible appartenant au groupe de vertébrés représenté sur la puce à ADN par une sonde spécifique.
Classiquement, une biopuce comprend un support comportant une face utile avec une surface opératoire en contact avec l'échantillon organique d'intérêt. Le support est constitué en un matériau inerte, au sens où il n'interagit pratiquement pas avec l'échantillon, par exemple du silicium, un verre, ou une matière plastique, par exemple une résine de synthèse thermodurcie ou thermoplastique, tel que du polypropylène, un polystyrène ou une résine polyacrylamide. Un ensemble de sites élémentaires, également nommés cellules, sont distribués sur la surface opératoire, à la manière de pixels, par exemple selon au moins deux axes de référence, chaque site élémentaire étant adressé, c'est-à-dire identifié par des coordonnées qui lui sont uniques dans tout repère approprié, formé par exemple par des axes de références. Ces sites élémentaires peuvent être traités ou non, en vue de l'immobilisation ou de l'ancrage des ADN sondes. Sur chaque site élémentaire, un nombre important d'ADN sondes conformes à l'invention, identiques, sont immobilisés, par tous moyens appropriés, par exemple chimique, par liaison covalente, ou par l'intermédiaire d'un bras espaceur, par adsorption, absorption, ... grâce à des techniques de photolithographie ou par un système piézo-électrique, par dépôt capillaire de ligands préformés notamment. Une multiplicité de sondes ADN sont fixées chacune en nombre multiple sur des sites élémentaires respectivement différents. Avantageusement, au moins 400 séquences d'oligonucléotides identiques et préférentiellement au moins 1000 séquences sont fixées par site élémentaire.
La puce à ADN est généralement agencée pour coopérer avec au moins un appareil ou instrument qui va délivrer un signal de sortie en relation avec la présence et la nature, et éventuellement la quantité de substance biologique issue de ladite espèce cible. Des moyens d'observation, transmission, ou émission du signal ou des signaux de sortie, correspondant à l'hybridation de l'ADN sonde avec l'ADN amplifié de l'espèce cible, respectivement en un ou plusieurs sites de liaison, permettent, en final, la détection de la formation ou de l'absence de formation de complexes d'hybridation, de façon à déduire si l'échantillon de matière organique peut contenir de la matière biologique issue d'une ou plusieurs des espèces animales appartenant au groupe donné de vertébrés représenté sur la puce ADN et identifier la ou les espèces animales en question. Pour permettre cette détection, l'ADN sonde ou l'ADN amplifié sera avantageusement marqué. Par marquage, on entend la fixation sur la sonde ou la cible, de manière covalente ou autre, d'un marqueur, permettant, notamment après illumination, l'émission d'un signal de sortie qui pourra être détecté. A titre d'exemple de marqueurs, on peut citer : les enzymes, par exemple d'oxydation d'un chromogène telles que la peroxydase de raifort ou la phosphatase alcaline, les fluorophores tels que la fluorescéine, la cyanine, Cy3 ou Cy5, la phycoérythrine, les luminophores tels que le luminol, l'isoluminol, l'ABEI (N-4-amino- butyl-N-éthyl-isoluminol) ou encore les haptènes tel que la biotine. Le ou les signaux de sortie varient donc, en fonction des marqueurs mis en oeuvre, et du type de détection requis. II peut s'agir de signaux lumineux, électriques, électro-optiques, électrochimiques, etc.... qui sont détectés séparément, compte tenu, de l'adressage des sites élémentaires de la puce ADN. La réaction ou l'émission constituant le signal de sortie est, de préférence, détectée, voire mesurée, de manière automatisée.
Toutes variantes structurelles connues dans le domaine des biopuces s'appliquent à la puce ADN selon l'invention. On pourra pour plus de détails sur ces possibilités se référer à la description générale des biopuces faite dans la demande de brevet WO03098217. Cette biopuce peut en outre comprendre, de manière intégrée ou non avec la surface opératoire et ses ligands ou sondes, différents moyens, ramenés à l'échelle de la biopuce, classiquement utilisés en laboratoire, pour : - obtenir ou préparer l'échantillon d'intérêt, à partir d'un autre échantillon dit de départ, par dénaturation, séparation, concentration, purification, etc. ; - traiter l'échantillon d'intérêt, par exemple par amplification, et/ou marquage avec un marqueur, avant sa mise en contact avec les ligands ou sondes ; - traiter le ou les complexes formés entre l'espèce cible et respectivement le ou les ligands, par exemple par marquage, afin d'obtenir, simultanément ou postérieurement à la formation des complexes, respectivement un ou des signaux de sortie.
D'après la description faite ci-dessus, la présente invention permet de résoudre un double problème technique rencontré dans de nombreux domaines actuels comme l'agroalimentaire notamment, la traçabilité alimentaire, la lutte contre les fraudes, le commerce, et la protection de la biodiversité, c'est-à-dire : l'identification des différentes espèces d'un mélange rendue possible, même dans des produits où l'ADN est dégradé voir très dégradé (plats cuisinés, boîtes de conserves, restes d'animaux...) (Lefrançois et ai, L'ADN anti-fraudes. Biofutur, 165, 27-30, 1997). L'invention permet aussi bien l'identification d'une espèce seule dans un produit frais, que l'identification de plusieurs espèces dans un produit très dégradé. Aussi, la présente invention permet de lutter contre un très grand nombre de fraudes, et donc de protéger les consommateurs contre les éventuels remplacements répréhensibles et les espèces concernées contre la surexploitation ou l'exploitation prohibée.
L'invention est aussi applicable dans des domaines plus fondamentaux notamment en écologie et en systématique : suivi de populations à partir de traces (fécès, poils), caractérisation du régime alimentaire de certaines espèces carnivores (à partir de l'étude des contenus stomacaux), détermination de la biodiversité in situ détermination des espèces à divers stades lorsque les caractères morpho anatomiques sont inexistants ou difficile à mettre en évidence (oeufs, larves, juvéniles). Cette liste n'est pas exhaustive et illustre les potentialités très importantes de ce nouvel outil.
Un exemple précis de mise en oeuvre de l'invention est détaillé ci-après. La Figure 1 illustre schématiquement le principe du procédé selon l'invention. A - CHOIX DES ESPECES
L'illustration de l'invention porte sur l'identification d'espèces animales appartenant à quatre groupes taxonomiques de vertébrés, que sont les oiseaux, les mammifères, les poissons actinoptérygiens et les chondrichtyens, et plus précisément à 79 d'entre-elles, respectivement 9, 40, 28 et 2 espèces. Ces espèces ont été choisies parce qu'elles ont un intérêt économique et/ou de conservation important (en voie de disparition...) et que les séquences pour le fragment choisi sont disponibles dans les banques de séquences (Genbank, EMBL ...). Les espèces choisies, ainsi que leurs noms communs, le nombre de séquences utilisées comme références et leurs numéros d'accessions respectifs sont indiqués figure 3. Par exemple, pour le bison américain (Bison bison) une seule séquence dont le numéro d'accession est Y15005 était disponible et par conséquent utilisable pour déterminer l'oligonucléotide espèce-spécifique de cette espèce, alors que 11 séquences ont été utilisées pour la chèvre (Capra hircus).
B - CHOIX DES SONDES La détermination des oligonucléotides spécifiques, à l'ensemble sélectionné d'espèces appartenant au groupe taxonomique animal choisi, a été réalisée par bioinformatique. Elle s'est effectuée de la façon suivante : la ou les séquences de l'espèce retenue pour le gène du cytochrome b ainsi que de la totalité des espèces proches disponibles, typiquement appartenant à la même famille, ont été téléchargées à partir de la banque internationale de séquences : Genbank, EMBL. Ces séquences ont ensuite été alignées avec un logiciel d'alignement (SeaView Galtier, et al. SeaView and Phylo_win, two graphie tools for séquence alignment and molecular phylogeny. Comput. Applic. Biosci., 12, 543-548, 1996), et à partir de cet alignement un arbre a été reconstruit utilisant pour cela un autre logiciel (Phylo_win Galtier et al, 1996 supra) et la méthode de reconstruction du Neighbor-Joining ou NJ (Saitou et al. The neighbor-joining method : a new method for reconstructing phylogenetic trees. Mol Biol Evol. 4(4), 406-425, 1987). La ou les séquences de l'espèce choisie, dont les numéros d'accession sont précisés figure 3, ont ensuite été comparées aux autres séquences des espèces proches disponibles. Deux ou trois oligonucléotides courts pour l'espèce considérée ont été choisis afin, d'une part de maximiser le nombre d'autapomorphies (sites uniques à l'espèce choisie) au sein de chacun d'entre eux, et d'autre part de placer les différences de bases observées avec les espèces les plus proches dans les positions les plus centrales possible. En effet, plus la position des mésappariements est centrale moins bien se fera l'hybridation par la suite entre l'oligonucléotide espèce-spécifique et d'autres espèces, par exemple entre l'oligonucléotide spécifique du boeuf et celui du bison. Ces oligonucléotides espèce- spécifiques ont ensuite été comparés à l'ensemble des séquences de banque internationale de séquences grâce au programme BLAST, (Altschul et al, Nucleic Acid Research, 25, 3389-3402, 1997) pour vérifier que leurs séquences étaient bien uniques et ne se retrouvaient pas chez un autre organisme par homoplasie (par hasard). Dans la plupart des cas, chaque sonde choisie pour une espèce, le plus souvent constituée de 20 bases, aura au moins trois bases différentes avec chacune des autres sondes choisies pour les autres espèces. Dans certains cas seulement, deux sondes choisies pour le groupe de vertébrés sélectionné ne différeront que de deux, voire d'une seule base. Les paramètres utilisés, notamment la longueur du mot et la pénalité des indels ont été diminués, respectivement L=7 et g=-2, afin de maximiser le nombre de chance de trouver des séquences très similaires. De plus, pour chacun des oligonucléotides espèce-spécifiques retenus, leur Tm (température de fusion) et leur éventuel repliement (Hairpin et Homoduplex) ont été calculés avec le logiciel ROSO (Raymond et al. Bioinformatics, 20(2) : 271-273, 2004). Ce logiciel utilise pour calculer la Tm (température de fusion (melting température), qui correspond à la température à laquelle la moitié des molécules ciblées est fixée à leurs sondes) le modèle thermodynamique du plus proche voisin tel que décrit par Santa Lucia. Proceeclings of the National Academy of Sciences ofthe USA, 95: 1460-1465 (1998). Les homoduplex (appariement entre deux brins identiques) sont calculés par les méthodes décrites par (Breslauer et al. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA, 83 : 3746-3750, 1986, et Freier et al. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA, 83 : 9373-9377, 1986) Enfin, les hairpins (repliement d'une sonde sur elle-même pour former une hélice) sont calculés par la méthode de (Groebe et Uhlenbeck, 16 : 11725-11735, 1988)).
Les valeurs seuils d'énergie libre utilisées (calculées toutes les deux à 65°C) pour les structures secondaires sont pour les hairpins (DG hairpin) : -0,3 kcal/mol et les homoduplex (DG homoduplex) : -6, 1 kcal/mol (les valeurs calculées pour nos oligonucléotides sont précisées dans figure 5). C'est-à-dire qu'au sens de l'invention, on considère qu'un oligonucléotide sonde ne se replie pas sur lui-même, si son hairpin et son homoduplex sont supérieurs à ces valeurs seuils. Une fois l'ensemble des Tm calculées, celles ci ont été homogénéisées en augmentant ou diminuant la longueur de chacun des fragments afin que l'ensemble des oligonucléotides se situe dans une fenêtre de quelques degrés, soit 3 0C : entre 67 et 700C. Au sens de l'invention, on considère qu'un ensemble d'oligonucléotides sondes est apte à s'hybrider dans des conditions de température d'hybridation comparables, si il existe entre la Tm la plus élevée et la Tm la plus faible, des oligonucléotides du groupe, au plus 3°C d'écart. Ainsi, 79 oligonucléotides espèce- spécifique ont été déposés sur la puce. L'ensemble du protocole (Etape A-E) développé pour déterminer les oligonucléotides est explicité figure 4, en prenant l'exemple du bar Dicentrarchus labrax.
Les oligonucléotides sondes espèces spécifiques ont été préparés selon les méthodes classiques de synthèse nucléotidiques. Une AMINE C6 en position 5' a été ajoutée sur chaque oligonucléotide. Cette amino-modification a été ajoutée pour améliorer la qualité des oligonucléotides et permettre leur fixation sur les supports de puce ADN choisis, à savoir des lames Quantifoil®. L'ensemble des informations concernant ces oligonucléotides est précisé dans le tableau donné à la figure 5. C - SONDE DE PCR Les quatre amorces utilisées sont les oligonucléotides dégénérés qui correspondent aux séquences SEQ ID N°2, 4, 6 et 8 modifiées en 5' par ajout d'un phosphate ou de Cy3. Leur position sur le cytochrome b humain (Genbank J01415) est donnée figure 2. Elles sont nommées L15162P, L15411P, H15392CY3, H15497CY3. Le nombre indique la position de l'extrémité 3' de l'amorce sur le gène complet du cytochrome b de l'humain ; L indique que les amorces sont situées sur le brin orienté 5'- 3' dans les banques de séquences internationales ; H: indique que les amorces sont situées sur le brin complémentaire, P pour le phosphate et CY3 pour le fluorophore.
Le phosphate a été rajouté lors de la synthèse des oligonucléotides à l'extrémité 5' des deux amorces situées sur le brin léger soit L15162P et L 15411P et un fluorophore (Cy3) à l'extrémité 5' des deux autres amorces situées sur le brin lourd soit H15497CY3 et H15392CY3. Ces modifications permettent ainsi, d'une part d'éliminer le brin complémentaire lors de la digestion par une enzyme particulière la lamba exonucléase qui agit pendant 30 minutes à 37°C dans le tampon de l'enzyme lambda exonucléase fourni par le fabriquant (tampon concentré 10 fois contient 0,67M glycine-KOH (pH 9,3) et 2mM MgCl2), et d'autre part de disposer ainsi d'un monobrin marqué avec un fluorophore à l'issue de la PCR. Ce marquage direct (amorce de PCR marquée) permet d'éviter une étape supplémentaire de marquage. Il est donc possible à partir de ces trois couples d'amorces d'obtenir trois fragments de longueur différente : un long, un moyen et un court. Le long fragment, d'une longueur de 373 paires de bases est compris entre les amorces L15162P et H15497CY3. Le fragment moyen, d'une longueur de 269 paires de bases est compris entre les amorces L15162P et H15392CY3. Le fragment court, d'une longueur de 124 paires de bases, est compris entre les amorces L15411P et H15497CY3. La longueur totale des fragments inclut à chaque fois les amorces. D - PCR Après extraction, réalisée à partir du kit de Qiagen, le fragment ciblé est amplifié avec un des trois couples d'amorces. L'une est marquée avec un fluorophore en 5' le Cy3 et l'autre possède un phosphate en 5'.
Les trois couples d'amorces de séquences dégénérées :
- SEQ ID N° 2 et SEQ ID N° 4, - SEQ ID N° 2 et SEQ ID N° 6,
- SEQ ID N0 4 et SEQ ID N0 8. ont été validés pour la totalité des espèces testées, soit 70 espèces sur les 79. Tous les échantillons ont été extraits avec un kit d'extraction commercial. Aucune amplification aspécifique n'a été mise en évidence à l'exception de quelques espèces où généralement 1 ou 2 bandes aspécifîques sont visibles (figure 6), ce qui nuit nullement à la réaction ultérieure d'hybridation. Plusieurs conditions de PCR ont été testées pour l'ensemble des espèces et les meilleurs résultats ont été obtenus avec une hybridation à 45°C.
E-DEPOTDESSONDESSURLAPUCE
Les oligonucléotides sondes ont été déposées sur des lames Quantifoil® à une concentration de 25 μmolaires, pour constituer la puce ADN. De plus, un certain nombre de contrôles et de gammes étalons a été déposé de part et d'autre des dépôts des oligonυcléotides sondes espèce-spécifiques pour vérifier que l'hybridation s'est bien déroulée et, par la suite, faciliter le placement de la grille pour la lecture du résultat avec le scanneur GeneTAC™ LS IV (utilisant le logiciel GeneTAC Integrator 3.3, Genomic solutions) et son exploitation avec les logiciels d'analyse comme GenePEX™ cPro 4.1 (Axon Instruments, Inc.).
F - REACTION D'HYBRIDATION
Après purification avec un kit de purification commercial, le brin phosphaté est digéré par la lambda exonucléase pendant 30 minutes à 37°C, puis de nouveau purifié. Le monobrin est finalement remis en suspension dans le tampon d'hybridation fourni par le fabriquant. L'hybridation se déroule à 500C dans un four à hybridation et ceci pendant toute la nuit. Les différentes étapes du procédé de l'invention sont résumées figure 8. Les conditions de traitement de la lame avant et après l'hybridation sont celles fournies par le fabriquant. F.1. - VALIDATION SUR DES ESPECES CONNUES
Le protocole utilisé pour valider les oligonucléotides espèce-spécifiques est celui développé lors de cette invention et décrit à la figure 8. Ainsi, chaque échantillon a été extrait avec un kit commercial, puis amplifié, puis digéré. Une fois ces trois étapes réalisées séparément pour chaque échantillon, plusieurs ont été mis en commun (généralement 4 ou 5) afin de valider au plus vite notre approche. Ces échantillons ont été choisis suffisamment éloignés phylogénétiquement pour pouvoir identifier facilement quelles espèces hybridées sur plusieurs oligonucléotides à la fois.
70 espèces ont été amplifiées, et testées sur la puce. Toutes se sont hybridées sur son oligonucléotide espèce-spécifique. F.2. VALIDATION DE LA METHODE AVEC DES MELANGES
Deux types de mélange ont été réalisés avec des ADN extraits : des mélanges équimolaires (à concentrations quasi identiques) et des mélanges avec des concentrations différentes. Les concentrations des divers échantillons ont été mesurées sur un spectrophotomètre (Tableau 2). Tableau 2. Récapitulatif des espèces contenues dans les deux mélanges équimolaires, à gauche la composition du mélange A et à droite celle du mélange B. MELANGE A MELANGE B
Espèces Concentrations (ng/μl) Espèces Concentrations (ng/μl)
Al c es al ces 49,4 Rupicapra rupicapra 102,2
Lepus europaeus 43,8 Bison bison 56,6
Cairina moschata 29,6 Cotwm'x oturnix 97
Scomber scombrus 32,6 Anguilla an gui] la 86
Tinca tinca 63,2 Sahno salar 86
Après hybridation, les 5 espèces dans les deux mélanges ont été parfaitement détectées, ce qui veut dire que le procédé selon l'invention permet bien d'identifier les diverses espèces de vertébrés d'un mélange (Figure 9 (A) et (B)). Sur la Figure 9 (A), (B) et (C), les hybridations spécifiques correspondant aux espèces présentes sont indiquées. Les autres points entourés correspondent aux contrôles positifs et négatifs.
Un autre type de test a aussi été réalisé, afin d'évaluer la sensibilité du procédé de l'invention. Pour cela, deux mélanges ont été préparés avec les deux espèces suivantes : Sahno salar et Anguilla anguilla. Ces deux mélanges, mélange 1 et 2, contiennent respectivement 66% de Sahno salar et 33% d'Anguilla anguilla; et 90% de Sahno salar avec 10% d'Anguilla anguilla. Dans les deux cas, les deux espèces sont retrouvées après mise en œuvre de la puce ADN élaborée. L'intensité de fluorescence de l'espèce présente en plus grande quantité {Salmo salar) est beaucoup plus forte que celle d'Anguilla anguilla et ceci dans les deux cas (Figure 9 (C)). F.3. - VALIDATION SUR DES PRODUITS TRANSFORMES
Trois types de produits transformés ont été testés (Tableau 3). L'amplification du fragment long (373 paires de bases) a été possible pour 2 d'entre-eux, soit le saucisson d'âne et le pâté de porc. Pour la conserve de maquereau, seuls le fragment court et le fragment moyen ont pu être amplifiés. Les résultats des hybridations sont résumés ci- dessous (Tableau 3).
Tableau 3. Liste des échantillons testés (noms et composition indiquée sur l'étiquette) et comparaison avec les résultats obtenus par le procédé selon l'invention Echantillons testés Résultats de l'hybridation
Noms Composition
Saucisson d'âne Ane et porc Equus caballuset Sus scrofa
Pâté de porc Porc Sus scrofa
Conserve de maquereau Maquereau Scomber scombrus
Pour le pâté de porc et la conserve de maquereau, le résultat est en accord avec ce qui est indiqué sur l'étiquette. Par contre, pour le saucisson d'âne, il y a eu fraude. En effet, le produit intitulé "Saucisson d'âne" contenait, d'après l'étiquette, du porc et de l'âne. Le test sur puce ADN selon l'invention met en évidence que ce produit contient effectivement du porc, mais aussi du cheval (Eqiuis caballus). De plus, la présence d'âne dans le produit n'a pas été mise en évidence. Ces résultats ont été confirmés par la technique de clonage et séquençage.
L'ensemble de l'invention a donc été validée et ceci sur des espèces seules, en mélange et aussi sur plusieurs produits dégradés.

Claims

REVENDICATIONS
1 - Procédé permettant de détecter simultanément, dans un échantillon de matière organique, la présence éventuelle de matières biologiques issues de différentes espèces animales ou végétales appartenant à un groupe taxonomique végétal ou animal donné comportant au moins 40, de préférence, au moins 50 et avantageusement, au moins 70 espèces différentes et de sélectionner les espèces susceptibles d'être présentes, comprenant les étapes successives suivantes : a) extraction de l'ADN de l'échantillon b) amplification de l'ADN extrait, par la méthode d'amplification en chaîne par polymerase (PCR), avec au moins un couple d'amorces, chaque couple d'amorces utilisé permettant l'amplification, pour toutes les espèces animales ou végétales qui appartiennent au groupe taxonomique donné, nommé ADN cible, d'une région nucléotidique de l'ADN mitochondrial ou chloroplastique, la dite région nucléotidique étant spécifique à chaque espèce animale ou végétale qui appartient au groupe taxonomique donné, c) mise en contact du produit d'amplification avec un groupe de sondes comportant, pour chacune des différentes espèces du groupe taxonomique, au moins une sonde spécifique à chaque espèce animale ou végétale appartenant au groupe taxonomique végétal ou animal donné, dans des conditions permettant à chaque sonde de s'hybrider avec un fragment d'ADN amplifié spécifique à l'espèce dont elle est la sonde, si un tel fragment est présent dans le produit d'amplification, chaque sonde étant constituée d'un oligonucléotide comportant au plus 50 nucléotides, de préférence de 17 à 24 nucléotides, et correspondant à un fragment d'ADN mitochondrial ou chloroplastique spécifique à l'espèce animale ou végétale dont il est la sonde, ou à son ADN inverse complémentaire, qui est apte à s'hybrider avec l'ADN cible spécifique à ladite espèce animale ou végétale, d) détection de la formation ou de l'absence de formation de complexes d'hybridation, de façon à déduire si l'échantillon de matière organique contient de la matière biologique issue d'une ou plusieurs des espèces animales ou végétales appartenant au groupe taxonomique donné et de sélectionner les espèces susceptibles d'être présentes.
2 - Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que la ou les espèces présentes dans l'échantillon sont identifiées. 3 - Procédé selon la revendication 1 ou 2 caractérisé en ce que le groupe de sondes est immobilisé sur un support de puce à ADN.
4 - Procédé selon la revendication 3 caractérisé en ce que les différentes sondes sont aptes à s'hybrider dans des conditions de température d'hybridation comparables et ne se replient pas sur elle-même dans ces conditions d'hybridation. 5 - Procédé selon l'une des revendications 1 à 4 caractérisé en ce que le groupe taxonomique donné est un groupe d'espèces de vertébrés.
6 - Procédé selon la revendication 5 caractérisé en ce que le groupe de vertébrés comprend plusieurs espèces de mammifères, oiseaux, poissons actinoptérygiens et chondrichtyens. 7 - Procédé selon la revendication 5 ou 6 caractérisé en ce que le groupe donné d'espèces comprend au moins 40, de préférence au moins 50, avantageusement toutes les espèces suivantes :
Bison bison, Bison bonasus, Bos taurus, Capra hircus, Capra ibex, Capra pyraneica, Ovis aries, Rupicapra pyraneica, Rupicapra rupicapra, Camelus bactrianus, Camelus dromaderiiis, Lama pacos, Alces alces, Cervus elaphus, Rangifer tarandus, Elephas maximus, Loxodonta Africana, Equus asinus, Equus caballus, Felis catus, Homo sapiens, Lepus europaeus, Oiyctolagus cuniculus, Macropus giganteus, Macropus robustus, Macropus rufus, Mus muscuîus, Rattus rattus, Mustela erminea, Mustela vison, Ceratotherium simum, Dicerorhinus sumatrensis, Diceros bicornis, Rhinocéros sondaicus, Rhinocéros unicornis, Sus scrofa, Selenarctos thibetanus, Ursus americanus, Ursus arctos, Ursus maritumus, Anas platyrhynchos, Cairina moschata, Dromaius novaehollandiae, Meleagris gallopavo, Numida meleagris, Coturnix coturnix, Gallus gallus, Rhea americana, Struthio camelus, Anguilla anguilla, Trachurus trachurus, Cyprinus carpio, Gobio gobio, Rutilus rutilus, Tinca tinca, Gadus morhua, Pollachius virens, Dicentrarchus labrax, Dicentrarchus punctatus, Perça fluviatilis, Oncorhynchus kisutch, Oncorhynchus masou, Oncorhynchus mylάss, Salmo salar, Salmo trutta, Salvelinus alpinus, Salvelinus fontinalis, Sarda sarda, Scomber japonicus, Scomber scombrus, Thimnus olalunga,
Thunnus obesus, Thimnus thynnus, Scyliorhinus canicula, Diplodus sargus, Spams auratus, Spondyliosoma cantharus, Squcdus acanthias, Zeus faber.
8 - Procédé selon la revendication 7 caractérisé en ce que les sondes ADN correspondent à un fragment espèce spécifique de l'ADN codant pour le cytochrome b de l'espèce dont elle est la sonde qui a l'une des séquences suivantes, avec éventuellement un à 5 nucléotides de moins à l'une ou l'autre des extrémités 3' ou 5' et/ou un à 5 nucléotides de plus à l'une ou l'autre des extrémités 3' ou 5' séquences :
SEQIDN010 :TACTACTGGTACTATTCACACC SEQIDN° 11 :ACTAGTACTATTCGCACCGG
SEQIDN° 12:ATTAAGGACATCTTAGGGGC
SEQIDN013 :ATATCTTAGGCGCCATGCTA
SEQIDN° 14 : GTCATCACTAACCTTCTCTCAG
SEQIDN° 15 : CCTTCCATTTTATCCTCCCA SEQIDN° 16:ATCCTAGGTGCTATCCTACT
SEQIDN° 17 :GGCATAGACTTAGTCGAGTG
SEQIDN° 18 : CCATCAAAGACATTCTGGGC
SEQIDN° 19 :TTCTCGTACTGTTCTCACCA
SEQIDN°20 :TGATGCTAGCCCTACTTATC SEQIDN°21 :TTTAGGAGCACTGCTACTTATT
SEQIDN°22 :TCTTAGGTGCCCTACTCTTA
SEQIDN°23 : CAGCACTCGCTATAGTACAC
SEQIDN°24 : CAAAGACATTCTAGGCATCC
SEQIDN°25 : CACTAGGTCTCACTTCAGAC SEQIDN°26 : CACTAGCAGGAGTACACCTA
SEQIDN°27 :TTCTCCTCCTAGTCCTACTC
SEQIDN°28 : CCTGATCTTGCTCCTACTAA
SEQIDN°29 :TCGGGACTGAACTAGTAGAA
SEQIDN°30 :TCTTCCTTCTCTCCTTAATGAC SEQIDN°31 :TGCAGCTCTAGTGATAATTCAC
SEQIDN°32 : GTAGCCATTCTTCTCCTCCT
SEQIDN°33 :TCCTTGTCCTACTCACACTA SEQ ID N0 34 : TCGCCTTTCATTTT ATCCTACC SEQ ID N° 35 : CTCCTCATCCTACTCACATT SEQ ID N° 36 : TTGACCCGATTCTTCGCTT SEQ ID N° 37 : GACTTACTTGGAGTGTTCATAC SEQ ID N° 38 : C ATC ATTTCAGC ACTAGC AG SEQ ID N° 39 : CCAATAACCCCTCTGGAATC SEQ ID N° 40 : CCTGGGAATTTTACTCCTAATCC SEQ ID N° 41 : GGTTCTTTGCTTTCC ACTTC SEQ ID N° 42 : CGTATATCGGCACAACTCTC SEQ ID N° 43 : GCCCTGCTTCTAATTATAGTATT SEQ ID N° 44 : CTGATCCTAGTATTACTCATCCT SEQ ID N° 45 : CTGCCATTCATCATTACCG SEQ ID N° 46 : CTAGCCTTAGCAACTCTAGTC SEQ ID N° 47 : CATCTTGACACTAGCAGCAG SEQ ID N° 48 : TACTTCTCGCCCTAACCTTA SEQ ID N° 49 : ACTTCTCACCCTAGCCTTA SEQ ID N° 50 : CCTAGGTCTTGTATCAGACTGT SEQ ID N° 51 : TTTATTCTTATACTCACCCCCC SEQ ID N° 52 : CCTCTCCTAATCCTAGCCTTT SEQ ID N° 53 : CTAACCCCCTTACTCACATTA SEQ ID N° 54 : AACTCTAGTAGAGTGGGCGT SEQ ID N° 55 : TGATACTTACCCCATTCCTC SEQ ID N° 56 : CATTCTGGGCTTAACTCTCAT SEQ ID N° 57 : TAACCCTAGCCTTCTTCTCA SEQ ID N° 58 : CCCTACTATCCCTAGCATTC SEQ ID N° 59 : TTGCTGGGGCCACAATA SEQ ID N° 60 : CTTTCTTCGTCCTCCATGTA SEQ ID N° 61 : TAGCTCTTACACTACTAGCACT SEQ ID N° 62 : CTAACCTTTTATCAGCAGTCC SEQ ID N° 63 : AGACCTCCTTGGCTTTGTAA SEQ ID N0 64 : CCTCCTACACCTGCTATTTTT SEQ ID N° 65 : ATGCT ACCCTAACTCGGTTT SEQ ID N° 66 : CTAATGTCCACTGTCCCCTA
SEQ ID N° 67 : GTTCTAATTGGATT AACT AGCCTC
SEQ ID N° 68 : ATCGTTTT AATTGGCCTAGCT
SEQ ID N° 69 : CTAATCGCTCTAACAGCTCTAGC SEQ ID N° 70 : TAACCAGCGGGGATT AACTC
SEQ ID N° 71 : TGGAAACGCCCTTGTACAAT
SEQ ID N° 72 : TTCACCTTCTGTTCCTTCATG
SEQ ID N° 73 : CATCCTTAGCTCT ATTCGCA
SEQ ID N° 74 : CATCATT AGCTCTGTTCGCA SEQ ID N° 75 : TCGTAGCT ATATTGCTTGGC
SEQ ID N0 76 : CTGCTGT ACCCT AT GTAGGA
SEQ ID N0 77 : CAATTCTGCTTGTTGCACT
SEQ ID N0 78 : TGGCAGCAACAATTCTTCAC
SEQ ID N° 79 : TTCCCCTTTGTTATCTTAGCG SEQ ID N° 80 : TATGTTGGAACT ACCCTCGTT
SEQ ID N° 81 : ATATGTCGGAACTACCCTCG
SEQ ID N° 82 : TGATCCTGCT AGT AGCACTC
SEQ ID N° 83 : ACCTTATTAGCAACCTTAGCA
SEQ ID N° 84 : TTCCTTCTCCCCTTCGTTGT SEQ ID N° 85 : TAACTTGTCTTGCCCTATTCG
SEQ ID N° 86 : AAGATCTGCTAGGGTTTGCA
SEQ ID N° 87 : ATTCCTAATCGTGGGCCTAA
SEQ ID N° 88 : TATCCACCTTGTCCTTGTTC
9 - Procédé selon la revendication 8 en ce que les sondes sont choisies parmi : SEQ ID N° 10 : T ACTACTGGT ACTATTC AC ACC
SEQ ID N° 11 : ACTAGTACTATTCGCACCGG
SEQ ID N° 12 : ATTAAGGAC ATCTTAGGGGC
SEQ ID N° 13 : ATATCTTAGGCGCCATGCTA
SEQ ID N° 14 : GTCATCACTAACCTTCTCTCAG SEQ ID N° 15 : CCTTCCATTTTATCCTCCCA
SEQ ID N° 16 : ATCCT AGGTGCT ATCCTACT
SEQ ID N° 17 : GGCATAGACTTAGTCGAGTG SEQ ID N° 18 : CCATCAAAGACATTCTGGGC SEQ ID N° 19 : TTCTCGT ACTGTTCTCACCA SEQ ID N° 20 : TGATGCT AGCCCTACTTATC SEQ ID N° 21 : TTTAGGAGCACTGCT ACTT ATT SEQ ID N° 22 : TCTTAGGTGCCCTACTCTTA SEQ ID N° 23 : CAGCACTCGCTAT AGTACAC SEQ ID N° 24 : CAAAGACATTCTAGGCATCC SEQ ID N° 25 : CACTAGGTCTCACTTCAGAC SEQ ID N° 26 : CACTAGCAGGAGTACACCTA SEQ ID N° 27 : TTCTCCTCCTAGTCCTACTC SEQ ID N° 28 : CCTGATCTTGCTCCTACTAA SEQ ID N° 29 : TCGGGACTGAACTAGTAGAA SEQ ID N° 30 : TCTTCCTTCTCTCCTTAATGAC SEQ ID N° 31 : TGCAGCTCTAGTGATAATTCAC SEQ ID N° 32 : GTAGCCATTCTTCTCCTCCT SEQ ID N° 33 : TCCTTGTCCTACTCACACTA SEQ ID N° 34 : TCGCCTTTCATTTTATCCTACC SEQ ID N° 35 : CTCCTCATCCTACTCACATT SEQ ID N° 36 : TTGACCCGATTCTTCGCTT SEQ ID N° 37 : GACTT ACTTGGAGTGTTC ATAC SEQ ID N° 38 : CATCATTTCAGC ACTAGCAG SEQ ID N° 39 : CCAATAACCCCTCTGGAATC SEQ ID N° 40 : CCTGGGAATTTTACTCCTAATCC SEQ ID N° 41 : GGTTCTTTGCTTTCCACTTC SEQ ID N° 42 : CGTAT ATCGGCACAACTCTC
SEQ ID N° 43 : GCCCTGCTTCTAATTATAGTATT SEQ ID N° 44 : CTGATCCTAGTATTACTCATCCT SEQ ID N° 45 : CTGCCATTCATCATTACCG SEQ ID N° 46 : CTAGCCTTAGCAACTCTAGTC SEQ ID N0 47 : CATCTTGACACTAGCAGCAG SEQ ID N0 48 : TACTTCTCGCCCTAACCTTA SEQ ID N0 49 : ACTTCTCACCCTAGCCTTA SEQ ID N° 50 : CCTAGGTCTTGTATCAGACTGT SEQ ID N° 51 : TTTATTCTTATACT CACCCCCC SEQ ID N° 52 : CCTCTCCTAATCCTAGCCTTT SEQ ID N° 53 : CTAACCCCCTTACTCACATTA SEQ ID N° 54 : AACTCTAGTAGAGTGGGCGT SEQ ID N° 55 : TGATACTTACCCCATTCCTC SEQ ID N° 56 : CATTCTGGGCTTAACTCTCAT SEQ ID N° 57 : TAACCCTAGCCTTCTTCTCA SEQ ID N° 58 : C C CT ACT ATCCCT AGC ATTC SEQ ID N° 59 : TTGCTGGGGCCACAATA
SEQ ID N° 60 : CTTTCTTCGTCCTCCATGTA SEQ ID N0 61 : TAGCTCTTACACTACTAGCACT SEQ ID N° 62 : CTAACCTTTTATCAGCAGTCC SEQ ID N° 63 : AGACCTCCTTGGCTTTGTAA SEQ ID N° 64 : CCTCCTACACCTGCTATTTTT SEQ ID N° 65 : ATGCT ACCCTAACTCGGTTT SEQ ID N° 66 : CTAATGTCCACTGTCCCCTA SEQ ID N° 67 : GTTCT AATTGGATTAACTAGCCTC SEQ ID N° 68 : ATCGTTTTAATTGGCCTAGCT SEQ ID N° 69 : CTAATCGCTCTAACAGCTCTAGC SEQ ID N° 70 : TAACCAGCGGGGATTAACTC SEQ ID N0 71 : TGGAAACGCCCTTGTACAAT SEQ ID N° 72 : TTCACCTTCTGTTCCTTCATG SEQ ID N° 73 : CATCCTTAGCTCTATTCGCA SEQ ID N° 74 : CATCATTAGCTCTGTTCGCA SEQ ID N° 75 : TCGTAGCTATATTGCTTGGC SEQ ID N° 76 : CTGCTGTACCCTATGTAGGA SEQ ID N° 77 : CAATTCTGCTTGTTGCACT SEQ ID N0 78 : TGGCAGCAACAATTCTTCAC SEQ ID N° 79 : TTCCCCTTTGTTATCTTAGCG SEQ ID N° 80 : TATGTTGGAACTACCCTCGTT SEQ ID N° 81 : ATATGTCGGAACTACCCTCG SEQ ID N° 82 : TGATCCTGCTAGTAGCACTC SEQ ID N° 83 : ACCTTATTAGCAACCTTAGCA SEQ ID N° 84 : TTCCTTCTCCCCTTCGTTGT SEQ ID N° 85 : TAACTTGTCTTGCCCTATTCG SEQ ID N° 86 : AAGATCTGCTAGGGTTTGCA SEQ ID N° 87 : ATTCCTAATCGTGGGCCTAA SEQ ID N° 88 : TATCCACCTTGTCCTTGTTC.
10 - Procédé selon l'une des revendications 1 à 9 caractérisé en ce que le couple d'amorces correspond à un couple d'oligonucléotides choisis parmi les couples d'oligonucléotides suivants, ou de leurs séquences inverses complémentaires respectives :
- un oligonucléotide constitué d'environ 15 à 25 nucléotides, de préférence de 17 à 23 nucléotides, présentant au moins 80%, préférentiellement 90% et avantageusement 95% d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID N° 2 : CTICCITGAGGICARATRTC OU la séquence SEQ ID N° 3 :
CTNCCNTGAGGNCARATRTC et un oligonucléotide constitué d'environ 15 à 25 nucléotides, de 17 à 23 nucléotides, présentant au moins 80%, préférentiellement 90% et avantageusement 95% d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID N°4 : TRAARTTITCIGGRTCICC ou la séquence SEQ ID N° 5 : TRAARTTNTCNGGRTCNCC, un oligonucléotide constitué d'environ 15 à 25 nucléotides, de préférence de 17 à 23 nucléotides, présentant au moins 80%, préférentiellement 90% et avantageusement 95% d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID N° 2 : ou la séquence SEQ ID N° 3 et un oligonucléotide constitué d'environ 15 à 25 nucléotides, de 17 à 23 nucléotides, présentant au moins 80%, préférentiellement 90% et avantageusement 95% d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID N°6 : GGRTGRAAICRIAYTTTRTC ou la séquence SEQ ID N° 7 : GGRTGRAANCRNAYTTTRTC,
- un oligonucléotide constitué d'environ 15 à 25 nucléotides, de préférence de 17 à 23 nucléotides, présentant au moins 80%, préférentiellement 90% et avantageusement 95% d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID N°4 ou la séquence SEQ ID N°5 et un oligonucléotide constitué d'environ 15 à 25 nucléotides, de 17 à 23 nucléotides, présentant au moins 80%, préférentiellement 90% et avantageusement 95% d'identité de séquence avec la séquence ID N°8 : GAYAAARTIYCITTYCAYCC ou la séquence ID N°9 : GAYAAARTNYCNTTYCAYCC, avec I : inosine ; R : A ou G ; et Y : C ou T et N : A, G, C ou T.
11 - Procédé selon la revendication 10 caractérisé en ce que le couple d'amorces est choisi parmi les couples d'oligonucléotides suivants :
- SEQ ID N° 2 ou SEQ ID N° 3 et SEQ ID N° 4 ou SEQ ID N° 5,
- SEQ ID N° 2 ou SEQ ID N° 3 et SEQ ID N° 6 ou SEQ ID N° 7, - SEQ ID N° 4 ou SEQ ID N° 5 et SEQ ID N° 8 ou SEQ ID N° 9.
12 - Procédé selon la revendication 10 ou 11 caractérisé en ce que l'amplification de l'étape b) est réalisé avec deux couples d'amorces, préférentiellement avec deux des couples d'amorces suivants ou de leurs séquences complémentaires respectives : un oligonucléotide constitué d'environ 15 à 25 nucléotides, de préférence de 17 à 23 nucléotides, présentant au moins 80%, préférentiellement au moins
90% et avantageusement au moins 95% d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID N° 2 ou SEQ ID N° 3 et un oligonucléotide constitué d'environ 15 à 25 nucléotides, de 17 à 23 nucléotides, présentant au moins
80%, préférentiellement 90% et avantageusement 95% d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID N° 6 ou SEQ ID N° 7, un oligonucléotide constitué d'environ 15 à 25 nucléotides, de préférence de 17 à 23 nucléotides, présentant au moins 80%, préférentiellement au moins 90% et avantageusement au moins 95% d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID N°4 ou SEQ ID N° 5 et un oligonucléotide constitué d'environ 15 à 25 nucléotides, de 17 à 23 nucléotides, présentant au moins
80%, préférentiellement 90% et avantageusement 95% d'identité de séquence avec la séquence ID N°8 ou SEQ ID N° 9. et préférentiellement avec les deux couples d'amorces suivants :
- SEQ ID N° 2 ou SEQ ID N° 3 et SEQ ID N° 6 ou SEQ ID N° 7, - SEQ ID N0 4 ou SEQ ID N0 5 et SEQ ID N0 8 ou SEQ ID N0 9.
13 - Procédé selon l'une des revendications 1 à 12 caractérisé en ce que l'échantillon biologique contient de l'ADN sous forme dégradée. 14 - Oligonucléotides présentant l'une des séquences suivantes:
- la séquence SEQ ID N° 2 : CTICCITGAGGICARATRTC
- la séquence SEQ ID N°4 : TRAARTTITCIGGRTCICC
- la séquence SEQ ID N°6 : GGRTGRAAICRIA YTTTRTC - la séquence SEQ ID N°8 : GAYAAARTIYCITTYCAYCC avec I : inosine ; R : A ou G ; et Y : C ou T
15 - Couples d'amorces choisis parmi les couples d' oligonucléotides suivants :
- SEQ ID N° 2 et SEQ ID N° 4,
- SEQ ID N° 2 et SEQ ID N° 6, - SEQ ID N° 4 et SEQ ID N° 8.
16 - ADN sonde dont la séquence nucléotidique correspond à un fragment espèce spécifique de l'ADN codant pour le cytochrome b de l'espèce dont elle est la sonde qui à l'une des séquences suivantes, avec éventuellement un à 5 nucléotides de moins à l'une ou l'autre des extrémités 3' ou 5' et/ou un à 5 nucléotides de plus à l'une ou l'autre des extrémités 3' ou 5' séquences :
SEQ ID N° 10 : TACTACTGGTACTATTCACACC
SEQ ID N° 11 : ACTAGTACTATTCGCACCGG
SEQ ID N° 12 : ATTAAGGACATCTTAGGGGC
SEQ ID N° 14 : GTCATCACT AACCTTCTCTCAG SEQ ID N° 15 : CCTTCCATTTTATCCTCCCA
SEQ ID N° 17 : GGCATAGACTTAGTCGAGTG
SEQ ID N° 18 : C C ATC A A AGAC ATTCTGGGC
SEQ ID N° 19 : TTCTCGTACTGTTCTCACCA
SEQ ID N° 20 : TGATGCTAGCCCTACTTATC SEQ ID N° 21 : TTTAGGAGCACTGCTACTTATT
SEQ ID N° 22 : TCTTAGGTGCCCT ACTCTTA
SEQ ID N° 23 : CAGCACTCGCTATAGTACAC
SEQ ID N° 24 : CAAAGACATTCTAGGCATCC
SEQ ID N° 25 : CACTAGGTCTCACTTCAGAC SEQ ID N° 26 : CACTAGCAGGAGTACACCTA
SEQ ID N° 27 : TTCTCCTCCTAGTCCTACTC
SEQ ID N° 28 : CCTGATCTTGCTCCTACTAA SEQ ID N° 29 : TCGGGACTGAACTAGTAGAA SEQ ID N0 30 : TCTTCCTTCTCTCCTTA ATGAC SEQ ID N° 31 : TGCAGCTCTAGTGATAATTCAC SEQ ID N° 32 : GTAGCCATTCTTCTCCTCCT SEQ ID N° 33 : TCCTTGTCCTACTCACACTA SEQ ID N° 34 : TCGCCTTTCATTTTATCCTACC SEQ ID N° 35 : CTCCTCATCCTACTCACATT SEQ ID N° 36 : TTGACCCGATTCTTCGCTT SEQ ID N° 37 : GACTTACTTGGAGTGTTCATAC SEQ ID N° 38 : CATCATTTCAGCACTAGCAG SEQ ID N° 39 : CCAATAACCCCTCTGGAATC SEQ ID N° 40 : CCTGGGAATTTTACTCCTAATCC SEQ ID N° 41 : GGTTCTTTGCTTTCCACTTC SEQ ID N° 42 : CGTATATCGGCACAACTCTC SEQ ID N° 43 : GCCCTGCTTCTAATTATAGTATT SEQ ID N° 44 : CTGATCCTAGTATTACTCATCCT SEQ ID N° 45 : CTGCCATTCATCATTACCG SEQ ID N° 46 : CTAGCCTTAGCAACTCTAGTC SEQ ID N° 47 : CATCTTGACACTAGCAGCAG SEQ ID N° 48 : TACTTCTCGCCCTAACCTTA SEQ ID N° 49 : ACTTCTCACCCTAGCCTTA SEQ ID N° 50 : CCTAGGTCTTGTATCAGACTGT SEQ ID N° 51 : TTTATTCTTATACTCACCCCCC SEQ ID N° 52 : CCTCTCCT AATCCTAGCCTTT SEQ ID N° 53 : CTAACCCCCTTACTCACATTA SEQ ID N° 54 : AACTCTAGTAGAGTGGGCGT SEQ ID N° 55 : TGATACTTACCCCATTCCTC SEQ ID N° 57 : TAACCCTAGCCTTCTTCTCA SEQ ID N° 58 : CCCTACTATCCCTAGCATTC SEQ ID N° 59 : TTGCTGGGGCCACAATA
SEQ ID N° 60 : CTTTCTTCGTCCTCCATGTA SEQ ID N° 61 : TAGCTCTTACACTACTAGCACT SEQ ID N0 62 : CT AACCTTTT ATCAGCAGTCC SEQ ID N° 63 : AGACCTCCTTGGCTTTGTAA SEQ ID N° 64 : CCTCCT ACACCTGCTATTTTT SEQ ID N° 65 : ATGCTACCCTAACTCGGTTT SEQ ID N° 66 : CTAATGTCCACTGTCCCCTA
SEQ ID N° 67 : GTTCTAATTGGATTAACTAGCCTC SEQ ID N0 68 : ATCGTTTTAATTGGCCTAGCT SEQ ID N° 69 : CTAATCGCTCTAACAGCTCTAGC SEQ ID N° 70 : TAACCAGCGGGGATT AACTC SEQ ID N° 71 : TGGAAACGCCCTTGTACAAT SEQ ID N° 72 : TTCACCTTCTGTTCCTTCATG SEQ ID N° 73 : CATCCTTAGCTCTATTCGCA SEQ ID N° 74 : CATCATTAGCTCTGTTCGCA SEQ ID N° 75 : TCGTAGCTATATTGCTTGGC SEQ ID N° 76 : CTGCTGT ACCCT ATGT AGGA SEQ ID N° 77 : CAATTCTGCTTGTTGCACT SEQ ID N° 78 : TGGCAGCAACAATTCTTCAC SEQ ID N° 79 : TTCCCCTTTGTTATCTTAGCG SEQ ID N° 80 : TATGTTGGAACTACCCTCGTT SEQ ID N° 81 : ATATGTCGGAACTACCCTCG SEQ ID N° 82 : TGATCCTGCTAGTAGCACTC SEQ ID N° 83 : ACCTTATTAGCAACCTTAGCA SEQ ID N° 84 : TTCCTTCTCCCCTTCGTTGT SEQ ID N° 85 : TAACTTGTCTTGCCCTATTCG SEQ ID N° 86 : AAGATCTGCTAGGGTTTGCA SEQ ID N° 87 : ATTCCTAATCGTGGGCCTAA SEQ ID N° 88 : TATCCACCTTGTCCTTGTTC
17 - ADN sonde qui a l'une des séquences suivantes : SEQ ID N° 10 : TACTACTGGTACTATTCACACC SEQ ID N° 11 : ACTAGT ACTATTCGC ACCGG SEQ ID N° 12 : ATTAAGGACATCTTAGGGGC SEQ ID N° 13 : ATATCTTAGGCGCCATGCTA SEQ ID N° 14 : GTCATCACTAACCTTCTCTCAG SEQ ID N° 15 : CCTTCCATTTTATCCTCCCA SEQ ID N° 16 : ATCCT AGGTGCT ATCCTACT SEQ ID N° 17 : GGC AT AG ACTTAGTCG AGTG SEQ ID N° 18 : CCATCAAAGACATTCTGGGC SEQ ID N° 19 : TTCTCGTACTGTTCTCACCA SEQ ID N° 20 : TGATGCT AGCCCT ACTTATC SEQ ID N° 21 : TTTAGGAGCACTGCT ACTTATT SEQ ID N° 22 : TCTTAGGTGCCCTACTCTTA SEQ ID N° 23 : CAGCACTCGCTATAGTACAC SEQ ID N° 24 : CAAAGACATTCTAGGCATCC SEQ ID N° 25 : CACTAGGTCTCACTTCAGAC SEQ ID N° 26 : CACTAGCAGGAGTACACCTA SEQ ID N° 27 : TTCTCCTCCTAGTCCTACTC SEQ ID N° 28 : CCTGATCTTGCTCCTACTAA SEQ ID N° 29 : TCGGGACTGAACTAGTAGAA SEQ ID N° 30 : TCTTCCTTCTCTCCTT AATGAC SEQ ID N° 31 : TGCAGCTCTAGTGATAATTCAC SEQ ID N° 32 : GTAGCCATTCTTCTCCTCCT SEQ ID N° 33 : TCCTTGTCCTACTCACACTA SEQ ID N° 34 : TCGCCTTTCATTTTATCCTACC SEQ ID N° 35 : CTCCTCATCCTACTCACATT SEQ ID N° 36 : TTGACCCGATTCTTCGCTT SEQ ID N° 37 : GACTTACTTGGAGTGTTCATAC SEQ ID N° 38 : CATCATTTCAGC ACTAGCAG SEQ ID N° 39 : CCAATAACCCCTCTGGAATC SEQ ID N° 40 : CCTGGGAATTTTACTCCTAATCC SEQ ID N° 41 : GGTTCTTTGCTTTCCACTTC SEQ ID N° 42 : CGTAT ATCGGCACAACTCTC SEQ ID N° 43 : GCCCTGCTTCTAATTATAGTATT SEQ ID N° 44 : CTGATCCT AGTATT ACTCATCCT SEQ ID N° 45 : CTGCCATTCATCATTACCG SEQ ID N0 46 : CTAGCCTTAGCAACTCTAGTC SEQ ID N0 47 : C ATCTTGAC ACT AGC AGCAG SEQ ID N° 48 : TACTTCTCGCCCT AACCTTA SEQ ID N° 49 : ACTTCTCACCCT AGCCTTA SEQ ID N0 50 : CCTAGGTCTTGTATCAGACTGT SEQ ID N° 51 : TTTATTCTTAT ACTC ACCCCCC SEQ ID N° 52 : CCTCTCCTAATCCT AGCCTTT SEQ ID N° 53 : CTAACCCCCTTACTCACATTA SEQ ID N° 54 : AACTCT AGT AG AGTGGGC GT SEQ ID N° 55 : TGATACTTACCCCATTCCTC SEQ ID N° 56 : CATTCTGGGCTTAACTCTCAT SEQ ID N° 57 : TAACCCTAGCCTTCTTCTCA SEQ ID N° 58 : CCCTACT ATCCCTAGC ATTC SEQ ID N° 59 : TTGCTGGGGCCACAATA SEQ ID N° 60 : CTTTCTTCGTCCTCCATGTA
SEQ ID N° 61 : TAGCTCTTACACTACTAGCACT SEQ ID N° 62 : CTAACCTTTTATCAGCAGTCC SEQ ID N° 63 : AGACCTCCTTGGCTTTGTAA SEQ ID N° 64 : CCTCCTACACCTGCTATTTTT SEQ ID N° 65 : ATGCTACCCTAACTCGGTTT SEQ ID N° 66 : CTAATGTCCACTGTCCCCTA SEQ ID N° 67 : GTTCT AATTGGATTAACTAGCCTC SEQ ID N° 68 : ATCGTTTTAATTGGCCTAGCT SEQ ID N° 69 : CTAATCGCTCTAACAGCTCTAGC SEQ ID N° 70 : TAACCAGCGGGGATT AACTC SEQ ID N° 71 : TGGAAACGCCCTTGTACAAT SEQ ID N° 72 : TTCACCTTCTGTTCCTTCATG SEQ ID N° 73 : CATCCTTAGCTCTATTCGCA SEQ ID N° 74 : CATCATTAGCTCTGTTCGCA SEQ ID N° 75 : TCGTAGCTATATTGCTTGGC SEQ ID N° 76 : CTGCTGTACCCTATGTAGGA SEQ ID N° 77 : CAATTCTGCTTGTTGCACT SEQ ID N° 78 : TGGCAGCAACAATTCTTCAC SEQ ID N° 79 : TTCCCCTTTGTT ATCTT AGCG SEQ ID N° 80 : T ATGTTGG AACTAC CCTCGTT SEQ ID N° 81 : ATATGTCGGAACTACCCTCG SEQ ID N° 82 : TGATCCTGCTAGTAGCACTC SEQ ID N° 83 : ACCTT ATT AGC AAC CTTAGCA SEQ ID N° 84 : TTCCTTCTCCCCTTCGTTGT SEQ ID N° 85 : TAACTTGTCTTGCCCTATTCG SEQ ID N° 86 : AAGATCTGCTAGGGTTTGCA SEQ ID N° 87 : ATTCCT AATCGTGGGCCT AA SEQ ID N° 88 : TATCCACCTTGTCCTTGTTC.
18 - Puce à ADN comportant un support avec une face active comprenant différents sites élémentaires sur chacun desquels un nombre multiple d'un ADN sonde est immobilisé caractérisé en ce qu'au moins 40, de préférence au moins 50 différents ADN sondes selon l'une des revendications 16 ou 17, sont immobilisés, chacun sur un site élémentaire différent.
19 - Puce à ADN selon la revendication 18 caractérisé en ce que sont immobilisés des ADN sondes spécifiques de différentes espèces de chacune des sous-classes de vertébrés suivantes : mammifères, oiseaux, poissons actinoptérygiens et chondrichtyens.
20 - Puce à ADN selon la revendication 18 ou 19 caractérisé en ce que tous les ADN sondes de séquences SEQ ID N0 10 à SEQ ID N° 88 sont immobilisés, chacun sur un site élémentaire différent.
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