WO2020065237A1 - Amorces universelles et leur utilisation pour la detection et/ou l'identification d'une plante du genre cucumis - Google Patents

Amorces universelles et leur utilisation pour la detection et/ou l'identification d'une plante du genre cucumis Download PDF

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WO2020065237A1
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cucumis
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ndha
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PCT/FR2019/052284
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Inventor
Nicole GIRAUD
Nelly DUBRULLE
Florian PHILIPPE
Original Assignee
Bionov Sarl
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/6895—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for plants, fungi or algae
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/13—Plant traits

Definitions

  • the present invention relates to new universal primers, as well as their use for the detection and / or G identification of plant species of the genus Cucumis in particular in complex or degraded substrates.
  • the Cucurbitaceae Family contains approximately 15 tribes - 120 genera - 900 species (Renner et al., (2013) The Cucurbitaceae of India: Accepted names, synonyms, geography distribution, and information on images and DNA sequences). Many species of the genus Cucumis are cultivated for their edible fruits (squash, zucchini, cucumbers, pickles, melons, watermelons, chayotes, etc.) and sometimes for their seeds (oil squash, African pistachio).
  • DNA barcoding is one of the molecular biology methods for determining the species present in a sample through the presence of a genetic signature, also called a marker.
  • This marker is a DNA fragment framed by very conserved and therefore universal regions, and which, once sequenced, shows variations in genetic sequences between individuals of different species and identical sequences between individuals of the same species (Hebert , Paul DN et al., (2003) Biological identifications through DNA barcodes).
  • the delimitation of species is based on the ratio “intraspecific divergence / interspecific divergence” (Hebert, Paul DN et al., (2004) Identification of birds through DNA barcodes). This ratio is called the "barcoding gap”.
  • the regions identified are too long to be used in the case of very degraded substrates.
  • the primers can amplify several types of sequence within the same species.
  • the primers are not really universal and it can be difficult to obtain an amplification in certain species.
  • mitochondrial and chloroplast DNAs have also been studied, since they are present in a highly repeated manner in each cell (several hundred copies). It As a result, they represent a much more accessible target for amplification in the case of degraded substrates. Mitochondrial or chloroplastic DNA is however not very variable in plants.
  • Several articles describe universal primers targeting different regions of chloroplast DNA (Bafeel SO, et al., (2012) DNA barcoding of arid wild plants using rbcL gene sequences) which show, for example, that the rbcL gene allows the identification of only 17% of the plant species studied.
  • the markers that can be commonly used for the determination and / or identification of a plant chosen from the species Cucumis anguria, Cucumis dipsaceus, Cucumis melo, Cucumis metulifer, Cucumis myriocarpus and Cucumis sativus have yet to be identified. Indeed, to date, there is no sufficiently variable marker with universal primers to allow good resolution by "DNA barcoding” in these species. This is all the more true for the analysis by "DNA barcoding" of degraded substrates.
  • the determination and / or identification of plants from degraded DNA is very important, in particular for the purposes of quality control of food products, food supplements or cosmetics for which the use of plants is enjoying increasing success. Nevertheless, the regions of plant DNA sufficiently short (to be able to analyze samples of degraded DNA) and sufficiently variable (to make it possible to determine and / or identify plants, in particular plant species) are rare and none have been characterized. In addition, there are no universal primers framing such a DNA fragment of a plant chosen from the species Cucumis anguria, Cucumis dipsaceus, Cucumis melo, Cucumis metulifer, Cucumis myriocarpus and Cucumis sativus (of size 90 and 120 base pairs) for amplifying degraded DNA.
  • one of the aims of the invention is to provide DNA regions of said plants sufficiently short and sufficiently variable to be able to be used in the determination and / or identification of a plant chosen from the Cucumis species. anguria, Cucumis dipsaceus, Cucumis melo, Cucumis metulifer, Cucumis myriocarpus and Cucumis sativus.
  • One of the aims of the invention is also to provide universal primers making it possible to amplify said DNA regions of a plant chosen from the species Cucumis anguria, Cucumis dipsaceus, Cucumis melo, Cucumis metulifer, Cucumis myriocarpus and Cucumis sativus sufficiently short and sufficiently variable.
  • One of the aims of the invention is also to provide a method for determining and / or identifying a plant chosen from the species Cucumis anguria, Cucumis dipsaceus, Cucumis melo, Cucumis metulifer, Cucumis myriocarpus and Cucumis sativus from degraded DNA.
  • the present invention provides new universal primers, as well as their use for the detection and / or identification of a plant of the genus Cucumis, in particular chosen from the species Cucumis anguria , Cucumis dipsaceus, Cucumis melo, Cucumis metulifer, Cucumis myriocarpus and Cucumis sativus.
  • the present invention is also based on the inventors' determination of (i) DNA regions of a plant chosen from the species Cucumis anguria, Cucumis dipsaceus, Cucumis melo, Cucumis metulifer, Cucumis myriocarpus and Cucumis sativus which are sufficiently short and sufficiently variables to be able to be used in the determination and / or identification of said species, and (ii) universal primers making it possible to amplify said DNA regions of said species.
  • short regions of DNA of said species constitute so-called “short” markers and have been identified in the NdhA gene (coding for subunit 1 of NADH plastoquinone oxidoreductase) of the plants chosen from the species Cucumis anguria, Cucumis dipsaceus, Cucumis melo , Cucumis metulifer, Cucumis myriocarpus and Cucumis sativus.
  • the present invention thus relates to the use of a pair of primers for the detection and / or identification of a plant chosen from the genus Cucumis and more particularly from the species Cucumis anguria, Cucumis dipsaceus, Cucumis melo, Cucumis metulifer, Cucumis myriocarpus and Cucumis sativus in a sample capable of containing it, by the amplification of at least one variable region of the NdhA gene, said variable region of the NdhA gene constituting a marker for detection and preferably identification of at least one of said species.
  • the present invention also relates to the primers (or oligonucleotides), in particular the pairs of primers, the target sequences of said primers, and the regions amplified per se.
  • the present invention also relates to the use of the amplified regions for the determination and / or identification of a plant chosen from the species Cucumis anguria, Cucumis dipsaceus, Cucumis melo, Cucumis metulifer, Cucumis myriocarpus and Cucumis sativus.
  • the present invention also relates to the use of a pair of primers for the detection and preferably the identification of a plant chosen from said species, in which the species is Cucumis melo.
  • the present invention also relates to the use of a pair of primers for the detection and preferably the identification of a plant chosen from said species, in which the pair of primers consists of a first primer (a first oligonucleotide) which s hybrid to a sequence of 15 to 30 contiguous nucleotides, chosen from the sequence of SEQ ID NO: 1 of the NdhA gene and a second primer (a second oligonucleotide) which hybridizes to a sequence of 15 to 30 contiguous nucleotides, chosen from the sequence of SEQ ID NO: 2 of the NdhA gene.
  • a first primer a first oligonucleotide
  • a second primer a second oligonucleotide
  • the present invention also relates to the use of a pair of primers in which:
  • the first primer hybridizes to a sequence of 15 to 30 contiguous nucleotides chosen from the sequence of SEQ ID NO: 1 of the NdhA gene, and
  • the second primer hybridizes to a sequence of 15 to 30 contiguous nucleotides chosen from the sequence of SEQ ID NO: 2 of the NdhA gene,
  • variable region of the NdhA gene constituting a marker for detection and / or identification of a plant chosen from the species Cucumis anguria, Cucumis dipsaceus, Cucumis melo, Cucumis metulifer, Cucumis myriocarpus and Cucumis sativus.
  • sequences SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 are located respectively from position 122821 to position 122850 and from position 122957 to position 122986 on the chloroplast of Cucumis melo (n ° Accession Genbank: JF412791.1).
  • the NdhA gene is located between positions 121617 and 123867 on the chloroplast of Cucumis melo.
  • primer and “oligonucleotide” are interchangeable.
  • a primer or an oligonucleotide means a short sequence of nucleotides, the number of which varies from ten to approximately 100 bases (or 100 nucleotides considering the presence of a ose and of one, two or three phosphate groups; base / nucleotide relationship being well known to those skilled in the art).
  • the expression “pair of primers or pair of oligonucleotides” refers to the association of two oligonucleotides.
  • the two oligonucleotides forming the pair of oligonucleotides do not necessarily have the same size: for example the first oligonucleotide which hybridizes to the sequence of SEQ ID NO: 1 can comprise 21 nucleotides and the second oligonucleotide which hybridizes to a sequence of 15 to 30 contiguous nucleotides chosen from the sequence of SEQ ID NO: 2 can comprise 20 nucleotides, for example .
  • the first oligonucleotide corresponds to a sense primer and the second oligonucleotide corresponds to an antisense primer.
  • oligonucleotides hybridize to 15 to 30 successive nucleotides, located one after the other, without discontinuity.
  • SEQ ID NO: 1 must be understood as a sequence of SEQ ID NO: 1 or a sequence having a percentage identity of at least 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or 100% with said SEQ ID NO: 1, in particular 95% and more particularly 98% or 99%.
  • SEQ ID NO: 2 must be understood as a sequence of SEQ ID NO: 2 or a sequence having a percentage identity of at least 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or 100% with said SEQ ID NO: 2, in particular 95% and more particularly 98% or 99%.
  • detection means that the use of the aforementioned pair of oligonucleotides makes it possible to conclude as to the presence or absence of a plant in the sample tested.
  • identification means that the use of the above-mentioned pair of oligonucleotides makes it possible to identify a plant present in the test sample as being a plant chosen from the species Cucumis anguria, Cucumis dipsaceus, Cucumis metulifer, Cucumis myriocarpus, Cucumis sativus and Cucumis melo.
  • detection and / or identification means “detection” or “identification” or “detection and identification”, and more particularly "identification”.
  • sample likely to contain it means that the sample may or may not include a plant chosen from the species Cucumis anguria, Cucumis dipsaceus, Cucumis melo, Cucumis metulifer, Cucumis myriocarpus and Cucumis sativus, and in particular may understand or may not understand the DNA of a plant chosen from the species Cucumis anguria, Cucumis dipsaceus, Cucumis melo, Cucumis metulifer, Cucumis myriocarpus and Cucumis sativus.
  • hybridize means that the primers (or oligonucleotides) forming the primer pair (or pair of oligonucleotides) of the invention hybridize with a reference “marker” sequence of the NdhA gene (in particular the sequences of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2) significantly higher than background noise.
  • the level of the signal generated by the interaction between the sequence capable of selective hybridization (the sequences forming the primer pair of oligonucleotides) and the reference sequences (the target sequences) is generally 10 times, preferably 100 times more intense than that of the interaction of other DNA sequences generating noise background.
  • the stringent hybridization conditions allowing selective hybridization are well known to those skilled in the art.
  • sufficient stringency conditions means for example a hybridization temperature of 40-65 ° C, preferably 50-60 ° C, especially 53-58 ° C, and more particularly 53 ° C, 55 ° C 58 ° C in an amplification buffer with a salt concentration of 0.001 to 0.5M, in particular comprising 2mM MgCfi.
  • Another subject of the present invention is the use of a pair of primers, in which said first oligonucleotide or said second oligonucleotide of the pair of primers hybridizes to its respective target sequence chosen from the sequences SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 of the NdhA gene, at a temperature of 40 to 65 ° C, and more particularly of 50-60 ° C and a salt concentration of 0.001 to 0.5 M, and more particularly of 0, 05 to 0.1 M, and even more particularly from 0.001 to 0.005M.
  • amplification of at least one variable region of the NdhA gene refers to any in vitro enzymatic amplification of a defined DNA sequence of the NdhA gene, for example by a polymerase chain reaction (PCR) ).
  • PCR polymerase chain reaction
  • variable region constituting a marker for detection and / or identification of a plant chosen from the species Cucumis anguria, Cucumis dipsaceus, Cucumis melo, Cucumis metulifer, Cucumis myriocarpus and Cucumis sativus means that the variable region of NdhA gene which is amplified constitutes a region of plant DNA sufficiently short and sufficiently variable to be able to detect and / or identify a plant chosen from the species Cucumis anguria, Cucumis dipsaceus, Cucumis melo, Cucumis metulifer, Cucumis myriocarpus and Cucumis sativus.
  • the invention relates to the use of a pair of primers in which:
  • the first primer has a sequence of 15 to 30 contiguous nucleotides chosen from the sequence of SEQ ID NO: 3 or a sequence having a percentage identity of at least 90%, 91%, 92%, 93%, 94% , 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or 100% with said SEQ ID NO: 3, and
  • the second primer has a sequence of 15 to 30 contiguous nucleotides chosen from the sequence of SEQ ID NO: 4 or a sequence having a percentage identity of at least 90%, 91%, 92%, 93%, 94% , 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or 100% with said SEQ ID NO: 4.
  • the invention relates to the use of a pair of primers in which:
  • the first primer has a sequence of 15 to 30 contiguous nucleotides chosen from the sequence of SEQ ID NO: 3, and
  • the second primer has a sequence of 15 to 30 contiguous nucleotides chosen from the sequence of SEQ ID NO: 4,
  • variable region of the NdhA gene constituting a detection and / or identification marker of a plant chosen from the species Cucumis anguria, Cucumis dipsaceus, Cucumis melo, Cucumis metulifer, Cucumis myriocarpus and Cucumis sativus.
  • said first primer hybridizes to a sequence of at least 20 contiguous nucleotides chosen from the sequence of SEQ ID NO: 1 of the NdhA gene and has a sequence of at least 20 contiguous nucleotides chosen from the sequence from SEQ ID NO: 3.
  • said second primer hybridizes to a sequence of at least 20 contiguous nucleotides chosen from the sequence of SEQ ID NO: 2 of the NdhA gene and has a sequence of at least 20 contiguous nucleotides chosen from the sequence from SEQ ID NO: 4.
  • At least 15 contiguous nucleotides means for example 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 or 30 contiguous nucleotides.
  • SEQ ID NO: 3 must be understood as a sequence of SEQ ID NO: 3 or a sequence having a percentage identity of at least 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or 100% with said SEQ ID NO: 3, in particular 95% and more particularly 98% or 99%.
  • SEQ ID NO: 4" must be understood as a sequence of SEQ ID NO: 4 or a sequence having a percentage identity of at least 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or 100% with said SEQ ID NO: 4, in particular 95% and more particularly 98% or 99%.
  • the invention relates to the use of a pair of primers in which the first primer has a sequence of 15 to 30 contiguous nucleotides chosen from the group consisting of one of the following sequences: SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: SEQ ID
  • the invention relates to the use of a pair of primers mentioned above, in which the second primer has a sequence of 15 to 30 contiguous nucleotides chosen from the group consisting of one of the following sequences: SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 72,
  • SEQ ID NO: 73 SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO:
  • sequences constitute nonlimiting examples of sequences from 15 to 30 nucleotides chosen from the sequence of SEQ ID NO: 4 which can be used in the context of the present invention.
  • the invention relates to the use of a pair of aforementioned primers, wherein said variable region of the NdhA gene which is amplified has a size of between 90 and 120 base pairs
  • a size comprised from 90 to 120 base pairs means in particular 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106 , 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 116, 117, 118, 119 or 120 base pairs.
  • the invention relates to the use of a pair of aforementioned primers, in which said variable region of the NdhA gene comprises or consists of a sequence chosen from the group consisting of: SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, or SEQ ID NO: 11, or a sequence having a percentage identity of at least 90% with said sequence and in particular 95% and more particularly 98% or 99%.
  • sequence SEQ ID NO: 5 represents a consensus sequence for which the letters "K”, “M” and “W” represent a nucleotide chosen from A, T, C or G.
  • K represents a “T or G”
  • M represents an "A or C”
  • W represents an "A or T”.
  • the invention relates to the use of a pair of aforementioned primers, in which said sample is a product which is capable of containing at least one DNA molecule from a plant chosen from the species Cucumis anguria, Cucumis dipsaceus, Cucumis melo, Cucumis metulifer, Cucumis myriocarpus and Cucumis sativus.
  • the invention relates to the use of a pair of aforementioned primers, in which said sample is a product which comprises or consists of at least one DNA molecule from a plant chosen from the species Cucumis anguria, Cucumis dipsaceus, Cucumis melo, Cucumis metulifer, Cucumis myriocarpus and Cucumis sativus.
  • the invention relates to the use of a pair of aforementioned primers, in which said sample is a product which does not comprise at least one DNA molecule from a plant chosen from the Cucumis anguria species, Cucumis dipsaceus, Cucumis melo, Cucumis metulifer, Cucumis myriocarpus and Cucumis sativus.
  • DNA molecule of a plant chosen from the species Cucumis anguria, Cucumis dipsaceus, Cucumis melo, Cucumis metulifer, Cucumis myriocarpus and Cucumis sativus corresponds to the NdhA gene (or a fragment of said NdhA gene)
  • DNA molecule, corresponding to the amplified part has a maximum of 120 base pairs, according to the determination below: the sequence of the sense primer (20 base pairs for example) + the fragments corresponding to the amplified region ( 90 to 120 base pairs) + the sequence of the antisense primer (20 base pairs for example).
  • the invention relates to the use of a pair of aforementioned primers, in which said sample is chosen from: a product based on a plant chosen from the species Cucumis anguria, Cucumis dipsaceus, Cucumis melo, Cucumis metulifer, Cucumis myriocarpus and Cucumis sativus, a product that contains at least one plant chosen from the species Cucumis anguria, Cucumis dipsaceus, Cucumis melo, Cucumis metulifer, Cucumis myriocarpus and Cucumis sativus process, an extract from a plant chosen from the species Cucumis anguria, Cucumis dipsaceus, Cucumis melo, Cucumis metulifer, Cucumis myriocarpus and Cucumis sativus, a mixture of plants chosen from among the species Cucumis anguria, Cucumis dipsaceus, Cucumis melo, Cucumis metulif
  • the expression “product based on a plant chosen from the species Cucumis anguria, Cucumis dipsaceus, Cucumis melo, Cucumis metulifer, Cucumis myriocarpus and Cucumis sativus” means a product containing at least one plant chosen from the species Cucumis anguria, Cucumis dipsaceus , Cucumis melo, Cucumis metulifer, Cucumis myriocarpus and Cucumis sativus, the DNA integrity of which has not been altered.
  • a product which contains at least one plant chosen from the species Cucumis anguria, Cucumis dipsaceus, Cucumis melo, Cucumis metulifer, Cucumis myriocarpus and Cucumis sativus processed means a product containing at least one of said plants whose integrity of l DNA has been altered.
  • a plant extract means a sample obtained by extraction from a plant chosen from the species Cucumis anguria, Cucumis dipsaceus, Cucumis melo, Cucumis metulifer, Cucumis myriocarpus and Cucumis sativus, that is to say a sample / extract comprising at least DNA from a plant chosen from the species Cucumis anguria, Cucumis dipsaceus, Cucumis melo, Cucumis metulifer, Cucumis myriocarpus and Cucumis sativus, the integrity of said DNA being altered or not altered.
  • a mixture of plants means a mixture containing the DNA of plants of at least two plants chosen from the species Cucumis anguria, Cucumis dipsaceus, Cucumis melo, Cucumis metulifer, Cucumis myriocarpus and Cucumis sativus, in particular plants whose DNA has been processed.
  • a product which does not contain a plant chosen from the species Cucumis anguria, Cucumis dipsaceus, Cucumis melo, Cucumis metulifer, Cucumis myriocarpus and Cucumis sativus means a product containing 0% DNA from a plant chosen from Cucumis anguria, Cucumis dipsaceus, Cucumis melo, Cucumis metulifer, Cucumis myriocarpus and Cucumis sativus.
  • pure plant means a product containing 100% DNA from only one of said species.
  • the invention relates to the use of a pair of aforementioned primers, in which said detection and / or identification of a plant chosen from the species Cucumis anguria, Cucumis dipsaceus, Cucumis melo, Cucumis metulifer, Cucumis myriocarpus and Cucumis sativus is carried out by hybridization under stringent conditions sufficient for the amplification of said variable region of the NdhA gene.
  • sufficient stringency conditions means for example a hybridization temperature of 50-60 ° C, in particular 53-58 ° C, and more particularly 53 ° C, 55 ° C, 58 ° C in a buffer. amplification of a salt concentration of from 0.001 to 0.5M, in particular comprising 2mM MgCfi.
  • the invention relates to the use of a pair of primers mentioned above, in which said hybridization under conditions of sufficient stringency comprises or consists of a hybridization of said first and second primers with:
  • the invention relates to the use of a pair of primers mentioned above, in which said hybridization under conditions of sufficient stringency comprises or consists of:
  • sequences of 15 to 30 contiguous nucleotides chosen from the sequences of SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4 of the NdhA gene which hybridize to a sequence chosen from the sequences SEQ ID NO: 1, or SEQ ID NO : 2 of the NdhA gene at a temperature of 50-60 ° C, especially 55 ° C in an amplification buffer with a salt concentration of 0.001 to 0.5M, in particular comprising 2mM MgCfi.
  • the invention relates to the use of a pair of primers mentioned above, in which said amplification of at least one variable region of the NdhA gene comprises or consists in repeating the cycle comprising or consisting of:
  • a hybridization step of at least one single-stranded DNA molecule from a plant chosen from the species Cucumis anguria, Cucumis dipsaceus, Cucumis melo, Cucumis metulifer, Cucumis myriocarpus and Cucumis sativus resulting from the denaturation of a DNA molecule double strand of a plant chosen from the species Cucumis anguria, Cucumis dipsaceus, Cucumis melo, Cucumis metulifer, Cucumis myriocarpus and Cucumis sativus from a sample capable of containing at least one of said plants, with at least one primer consisting of one of two oligonucleotides forming the above pair of primers.
  • the invention relates to the use of a pair of primers mentioned above, in which said amplification of at least one variable region of the NdhA gene comprises or consists in repeating the cycle comprising or consisting of:
  • the amplification product here corresponds to the amplified variable region of the NdhA gene which constitutes a so-called “short” marker within the meaning of the present invention.
  • the use of a pair of aforementioned primers comprising or consisting of repeating said cycle comprising or consisting of a hybridization step and an elongation step, must also get along as an amplification process.
  • the invention relates to the use of a pair of primers mentioned above, in which said amplification of at least one variable region of the NdhA gene comprises or consists in repeating the cycle comprising or consisting of:
  • the invention relates to the use of a pair of primers mentioned above, in which said amplification of at least one variable region of the NdhA gene comprises or consists in repeating the cycle comprising or consisting of:
  • a step of hybridization of two single-stranded plant DNA molecules derived from the denaturation of a double-stranded plant DNA molecule from a sample capable of containing at least one plant chosen from the Cucumis anguria species , Cucumis dipsaceus, Cucumis melo, Cucumis metulifer, Cucumis myriocarpus and Cucumis sativus, with two primers consisting of the two oligonucleotides forming the above pair of primers.
  • the invention relates to the use of a pair of primers mentioned above, in which said amplification of at least one variable region of the NdhA gene comprises or consists in repeating the cycle comprising or consisting of:
  • a step of hybridization of two single-stranded plant DNA molecules derived from the denaturation of a double-stranded plant DNA molecule from a sample capable of containing at least one plant chosen from the Cucumis anguria species , Cucumis dipsaceus, Cucumis melo, Cucumis metulifer, Cucumis myriocarpus and Cucumis sativus, with two primers consisting of the two oligonucleotides forming the above pair of primers,
  • the invention relates to the use of a pair of primers mentioned above, in which said amplification of at least one variable region of the NdhA gene comprises or consists in repeating the cycle comprising or consisting of:
  • the invention relates to the use of a pair of aforementioned primers, in which said repetition of the cycle is a repetition of at least 25 cycles, in particular 40 cycles and more particularly 49, 50 or 51 cycles.
  • the expression “at least 25 cycles” means for example 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50 or 51 cycles.
  • the invention relates to the use of a pair of aforementioned primers, for the detection and / or identification of a plant chosen from the species Cucumis anguria, Cucumis dipsaceus, Cucumis melo, Cucumis metulifer, Cucumis myriocarpus and Cucumis sativus.
  • Another subject of the present invention is a pair of primers in which
  • a first primer comprises or consists of a sequence of 15 to 30 contiguous nucleotides, complementary to the sequence SEQ ID NO: 1, or of a sequence having a percentage identity of at least 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or 100% with said sequence of SEQ ID NO: 1, and
  • a second primer comprises or consists of a sequence of 15 to 30 contiguous nucleotides, complementary to the sequence SEQ ID NO: 2, or of a sequence having a percentage identity of at least 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or 100% with said sequence of SEQ ID NO: 2.
  • a size of 15 to 30 nucleotides means a size of 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, or 30 nucleotides.
  • Another subject of the present invention is a pair of primers which consists of:
  • a first primer of a size comprised from 15 to 30 contiguous nucleotides, and comprises or consists of a sequence chosen from: SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15 , SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO : 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40 , SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO
  • oligonucleotides correspond to the sequences of the NdhA primer pairs of the present invention.
  • Another subject of the present invention is a marker for the detection and / or identification of a plant chosen from the species Cucumis anguria, Cucumis dipsaceus, Cucumis melo, Cucumis metulifer, Cucumis myriocarpus and Cucumis sativus having a size between 90 and 120 nucleotides, said marker comprising or consisting of an amplified sequence having a percentage identity of at least 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99 %, or 100% with a sequence chosen from SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11.
  • markers correspond to the nucleotide sequences of the regions amplified according to the present invention.
  • Another subject of the present invention is a marker for the detection and / or identification of a plant chosen from the species Cucumis anguria, Cucumis dipsaceus, Cucumis melo, Cucumis metulifer, Cucumis myriocarpus and Cucumis sativus which comprises or consists of a sequence amplified having an identity percentage of at least 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100% with a sequence chosen from SEQ ID NO: 5 to 11 to detect or preferably identify respectively a plant chosen from the species Cucumis anguria, Cucumis dipsaceus, Cucumis melo, Cucumis metulifer, Cucumis myriocarpus and Cucumis sativus.
  • the present invention also relates to a method for amplifying at least one variable region constituting a marker for detection and / or identification of a plant chosen from the species Cucumis anguria, Cucumis dipsaceus, Cucumis metulifer, Cucumis myriocarpus, Cucumis sativus and Cucumis melo.
  • Another subject of the present invention is a method of amplification and identification of at least one variable region of the NdhA gene, said variable region constituting a marker for detecting and preferably identifying a plant chosen from the Cucumis species.
  • anguria, Cucumis dipsaceus, Cucumis melo, Cucumis metulifer, Cucumis myriocarpus and Cucumis sativus comprising or consisting of the following stages:
  • the pair of primers consisting of a first primer which hybridizes to a sequence of 15 to 30 contiguous nucleotides chosen from the sequence of SEQ ID NO: 1 of the NdhA gene and a second primer which hybridizes to a sequence of 15 with 30 contiguous nucleotides chosen from the sequence of SEQ ID NO: 2 of the NdhA gene, b) a step of determining or identifying the presence of a plant chosen from the species Cucumis anguria, Cucumis dipsaceus, Cucumis melo, Cucumis metulifer, Cucumis myriocarpus and Cucumis sativus in said product or sample by detecting at least an amplified variable region of the NdhA gene.
  • the method of amplification and identification of at least one variable region of the NdhA gene according to the present invention further comprises before step a) a step of extracting the nucleic material from a product or sample capable of containing said variable region of the NdhA gene.
  • the method of amplification and identification of at least one variable region of the NdhA gene according to the present invention further comprises a step c) of identification of a plant chosen from the species Cucumis anguria, Cucumis dipsaceus, Cucumis melo, Cucumis metulifer, Cucumis myriocarpus and Cucumis sativus by sequencing said amplified and detected variable region of the NdhA gene.
  • the present invention relates to a method of amplification and identification of at least one variable region of the NdhA gene, said variable region constituting a marker for detecting and preferably identifying a plant chosen from species Cucumis anguria, Cucumis dipsaceus, Cucumis melo, Cucumis metulifer, Cucumis myriocarpus and Cucumis sativus, consisting of the following stages:
  • the pair of primers consisting of a first primer which hybridizes to a sequence of 15 to 30 contiguous nucleotides chosen from the sequence of SEQ ID NO: 1 of the NdhA gene and a second primer which hybridizes to a sequence of 15 with 30 contiguous nucleotides chosen from the sequence of SEQ ID NO: 2 of the NdhA gene,
  • the expression “in order to possibly obtain at least one amplified variable region of the NdhA gene” means that the amplification method may make it possible to obtain at least one amplified variable region of the NdhA gene, or may not allow to obtain at minus an amplified variable region of the NdhA gene. In the latter case, the failure to obtain at least one amplified variable region of the NdhA gene means that there is no DNA from a plant chosen from the Cucumis anguria species, Cucumis dipsaceus, Cucumis melo, Cucumis metulifer, Cucumis myriocarpus and Cucumis sativus in the test sample.
  • the present invention relates to a aforementioned amplification method, in which said method comprises, after said hybridization step, a step of elongation of the complementary strand of at least one of the two above-mentioned single stranded DNA molecules. plant, by DNA polymerase, from the above primer, in order to obtain at least one amplified variable region of the NdhA gene.
  • the present invention relates to a aforementioned amplification method, in which said method comprises, after said hybridization step, a step of elongation of each of the complementary strands of the two above-mentioned single-stranded DNA molecules of the plant, by DNA polymerase, from the above primers, in order to obtain two amplified variable regions of the NdhA gene.
  • the present invention relates to an abovementioned amplification method, in which said method comprises before said hybridization step a step of denaturation of a double-stranded DNA molecule of plant originating from a sample likely to contain at least one plant chosen from the species Cucumis anguria, Cucumis dipsaceus, Cucumis melo, Cucumis metulifer, Cucumis myriocarpus and Cucumis sativus, in order to obtain two single-stranded DNA molecules from plants.
  • the present invention relates to an aforementioned amplification method, wherein said step of denaturing a plant double stranded DNA molecule is carried out at a temperature of about 95 ° C for about 30 seconds.
  • the present invention relates to an abovementioned amplification method, in which said hybridization step is carried out at a temperature of approximately 50-60 ° C, in particular of approximately 53-55 ° C for approximately 30 seconds. .
  • 50-60 ° C means 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60 ° C.
  • approximately 30 seconds means 30 seconds or values close to 30 seconds, such as 29 seconds or 31 seconds.
  • the present invention relates to an abovementioned amplification method, in which said hybridization step is carried out at a temperature of approximately 50-60 ° C, in particular approximately 55 ° C for approximately 30 seconds.
  • the NdhA primers are used.
  • the present invention relates to an aforementioned amplification method, wherein said elongation step is carried out at a temperature of about 72 ° C for about 1 minute.
  • the duration of hybridization, the duration of elongation and the temperatures of hybridization and elongation depend on the length of the fragment to be amplified and on the speed of the enzyme, and can be adapted as a function of the polymerase used. .
  • the times and temperatures are given with reference to the Taq polymerase used (Hot FlREPol DNA polymerase; Solis).
  • the phrase "about 72 ° C” means 72 ° C or values close to 72 ° C, such as 71 ° C or 73 ° C.
  • the phrase "about 1 minute” means 60 seconds or values close to 60 seconds, such as 59 seconds or 61 seconds.
  • the present invention relates to an abovementioned amplification method, in which said denaturation step is preceded by an initial denaturation step of a double-stranded DNA molecule of plant in order to obtain two molecules of Single stranded DNA from the plant, at a temperature of about 95 ° C for about 10 minutes
  • this denaturation step is to activate the enzyme and denature the DNA molecule.
  • This step can be optional, in the sense that certain enzymes can do without this initial denaturation step.
  • the duration and temperature of this denaturation step depend on the polymerase used (Taq polymerase - Hot FlREPol DNA polymerase; Solis in the case of the present invention).
  • the phrase "about 10 minutes” means 10 minutes (or 600 seconds) or values close to 600 seconds, such as 550 seconds, 559 seconds, 610 seconds or 601 seconds.
  • the present invention relates to a aforementioned amplification method, in which said step of elongation is followed by a step of final elongation of the complementary strand of at least one of the above single-stranded DNA molecules of plant, at a temperature of about 72 ° C for about 7 minutes.
  • approximately 7 minutes means 7 minutes (or 420 seconds) or values close to 420 seconds, such as 410 seconds, 419 seconds, 430 seconds or 429 seconds.
  • duration and temperature of this final elongation step depend on the polymerase used (Taq polymerase - Hot FlREPol DNA polymerase; Solis in the case of the present invention).
  • the present invention relates to an abovementioned amplification method, in which said final elongation step is followed by a temperature reduction step during which the temperature is decreased to a temperature of about 10 ° C.
  • the expression "about 10 ° C” means 10 ° C or values close to 10 ° C, such as 9 ° C or i PC.
  • the aim of this temperature reduction is to stop the enzymatic reaction, bring the sample back to a temperature suitable for working (without burning itself) and keep the sample if ever necessary.
  • the present invention relates to a aforementioned amplification method, in which said method of amplification of at least one variable region of the NdhA gene comprises or consists of the following steps:
  • the present invention relates to a aforementioned amplification method, in which said method of amplification of at least one variable region of the NdhA gene comprises or consists of the following steps:
  • the present invention relates to a aforementioned amplification method, in which said method of amplification of at least one variable region of the NdhA gene comprises or consists of the following steps:
  • step of hybridization of at least one of the two above-mentioned single-stranded DNA molecules at a temperature of approximately 50-60 ° C., in particular approximately 55 ° C. for approximately 30 seconds, - Said step of elongation of the complementary strand of at least one of the two above-mentioned single-strand DNA molecules of a plant, at a temperature of approximately 72 ° C. for approximately 1 minute, in order to obtain at least one amplified variable region of the NdhA gene.
  • the present invention relates to a aforementioned amplification method, in which said method of amplification of at least one variable region of the NdhA gene comprises or consists of the following steps:
  • the present invention relates to an abovementioned amplification method, in which said method comprises obtaining at least one amplified variable region of the NdhA gene.
  • the present invention relates to an abovementioned amplification method, in which said method does not make it possible to obtain at least one amplified variable region of the NdhA gene.
  • the present invention relates to an abovementioned amplification method, in which said method comprises a step of detecting said production of at least one amplified variable region of the NdhA gene in order to obtain an amplified variable region and detected from the NdhA gene.
  • Said step of detecting at least one amplified variable region of the NdhA gene can be done by various techniques, in particular by electrophoresis.
  • the present invention relates to an abovementioned amplification method, in which said method comprises a step of identifying a plant chosen from the species Cucumis anguria, Cucumis dipsaceus, Cucumis melo, Cucumis metulifer, Cucumis myriocarpus and Cucumis sativus by sequencing said amplified and detected variable region of the NdhA gene in order to obtain a sequenced amplified variable region.
  • the present invention relates to an abovementioned amplification method, in which said sequencing is a capillary sequencing or an NGS (Next Generation Sequencing) sequencing.
  • the present invention relates to an abovementioned amplification method, in which said sequencing makes it possible to identify the species to which the plant belongs by comparison between said amplified variable region sequenced and a reference sequence.
  • said reference sequence is chosen from the following sequences SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 , and SEQ ID NO: 11.
  • the present invention relates to an abovementioned amplification method, in which the nature of the sample is known or not.
  • the present invention relates to an abovementioned amplification method, in which the sample is a mixture of plants, a plant-based product, a product which contains at least one processed plant, a plant extract, a a plant-free product, a plant-free plant sample, a plant-free mixture, a pure plant or a fragment of a pure plant having a DNA molecule between 90 and 120 nucleotides in size.
  • the so-called short markers according to the present invention are used in particular for analyzing DNA samples containing a DNA molecule whose size is between 90 and 120 nucleotides.
  • Table _ 1 Summary table of the sequences according to the present invention
  • DNA was extracted from Cucumis products using a protocol adapted from the NucleoMag Trace kit (Machery-Nagel).
  • the DNAs extracted from Cucumis-based products were amplified for a genetic marker using the corresponding primers (Table 2).
  • An 8-base label is added to the 5 ’side of the leader to create a" multiplexing "system and allow sequences to be assigned to their respective samples.
  • the reaction mixture used for the amplification was prepared as follows: buffer: IX; MgC12: 2 mM; dNTP: 0.2 mM each; primers: 0.2 mM each; BSA: 0.16 mg.pL 1 ; Taq Polymerase (Hot FIREPol DNA polymerase; Solis): 2 units; 3 ⁇ L of DNA; for a final volume of 25 pL. It was then amplified on a thermal cycler (Tl 00, Biorad) using the program defined in Table
  • Amplification products were analyzed by capillary electrophoresis (QIAxcel DNA Screening kit, Qiagen).
  • the markers having been correctly amplified were then purified with the NucleoSpin Gel and PCR Clean-up kit (Macherey-Nagel) and assayed with the SimpliNano 4285 v2.0.0 spectrophotometer (GE Healthcare).
  • the samples were then pooled and normalized.
  • the library to be sequenced is prepared from the Truseq PCR-free library preparation Kit (Illumina). 2x150 bp paired-end sequencing was performed on a new generation MiSeq sequencer (Illumina).
  • samples coated in starch microspheres require prior treatment to open the microspheres and release the DNA which they contain.
  • Alpha-amylase is an enzyme used to break down the starch molecule.
  • the DNA of the 9 species-based products of the genus Cucumis was extracted using a protocol adapted from the NucleoMag Trace kit (Machery-Nagel).
  • the DNAs extracted from products based on species of the genus Cucumis were amplified for an NdhA genetic marker using the corresponding primers (Table 4).
  • a label of 8 nucleotide bases is added on the 5 ′ side of the primer in order to create a “multiplexing” system and to allow the assignment of the sequences to their respective samples (COISSAC, Eric, RIAZ, Tiayyba and PUILLANDRE, Nicolas. Bioinformatic Challenges for DNA metabarcoding of plants and animais. Molecular Ecology, 2012, vol. 21, pp. 1834-1847).
  • the reaction mixture used for the amplification was prepared as follows: buffer: IX; MgC12: 2 mM; dNTP: 0.2 mM each; primers: 0.2 mM each; BSA: 0.16 mg.pL 1 ; Taq Polymerase: 2 units; 3 ⁇ L of DNA; for a final volume of 25 pL. Amplification is then carried out on a thermal cycler using the program defined in Table 5.
  • the amplification products were analyzed by capillary electrophoresis (QIAxcel, Qiagen ® ).
  • the amplified markers were then purified with the NucleoSpin Gel and PCR Clean-up kit (Macherey-Nagel ® ).
  • the samples were then mixed and normalized.
  • the library to be sequenced is prepared from the Truseq PCR-free library preparation Kit (Illumina ® ).
  • the amplicons were sequenced using a MiSeq sequencer (Illumina ® ).
  • the NGSFliter program identifies the primers and labels them and assigns each sequence to its sample; Obiuniq gathers the identical sequences together and counts them; Obigrep eliminates sequences shorter than 10 base pairs or counted less than 10 times; Obiclean sorts the sequences by identifying the sequencing errors: Ecotag proposes a taxonomic assignment to each sequence, with a threshold of 95% identity, by comparing with an algae database generated by virtual PCR by the EcoPCR program; finally the sequences with an occurrence of less than 0.003 (0.3%) per taxon and per run are eliminated to avoid bad assignments. Sequencing results:
  • NGS next generation sequencing

Landscapes

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Abstract

La présente invention a pour objet de nouvelles amorces universelles, ainsi que leur utilisation pour la détection et/ou l'identification d'une plante du genre Cucumis. Plus particulièrement, la présente invention concerne l'utilisation d'une paire d'amorces pour la détection et de préférence l'identification d'une plante choisie parmi les espèces Cucumis anguria, Cucumis dipsaceus, Cucumis melo, Cucumis metulifer, Cucumis myriocarpus et Cucumis sativus.

Description

AMORCES UNIVERSELLES ET LEUR UTILISATION POUR LA DÉTECTION ET/OU L’IDENTIFICATION D’UNE PLANTE DU GENRE CUCUMIS
La présente invention a pour objet de nouvelles amorces universelles, ainsi que leur utilisation pour la détection et/ou G identification d'espèces végétales du genre Cucumis notamment dans des substrats complexes ou dégradés.
La Famille des Cucurbitacées contient environl5 tribus- 120 genres-900 espèces (Renner et al., (2013) The Cucurbitaceae of India: Accepted names, synonyms, géographie distribution, and information on images and DNA sequences ). De nombreuses espèces du genre Cucumis sont cultivées pour leurs fruits comestibles (courges, courgettes, concombres, cornichons, melons, pastèques, chayotes, etc.) et parfois pour leurs graines (courge à huile, pistache africaine).
Les différentes méthodes permettant l'identification de végétaux basées sur l'analyse du génome sont connues. Par exemple, le «DNA barcoding» est l’une des méthodes de biologie moléculaire permettant de déterminer les espèces présentes dans un échantillon grâce à la présence d’une signature génétique, également appelé marqueur. Ce marqueur est un fragment d’ADN encadré par des régions très conservées et donc universelles, et qui, une fois séquencé, montre des variations de séquences génétiques entre individus d'espèces différentes et des séquences identiques entre individus d'une même espèce (Hebert, Paul DN et al., (2003) Biological identifications through DNA barcodes).
La délimitation des espèces, grâce au «DNA barcoding», est basée sur le ratio « divergence intraspécifique/divergence interspécifique » (Hebert, Paul DN et al., (2004) Identification of birds through DNA barcodes). Ce ratio est appelé le «barcoding gap».
D'un point de vue théorique, le séquençage d'une région homologue suffisamment longue (plusieurs centaines de paires de bases) permet l'identification d’une espèce chez les végétaux. Une telle région doit être encadrée par des zones très conservées autorisant la conception d'amorces universelles pour l'amplification. En ce qui concerne l'ADN nucléaire, les ITS (Internai Transcripted Spacer de l'ADN ribosomique) ont été utilisés pour la détection et l'identification de végétaux. Des amorces universelles ont été décrites chez les champignons et se sont avérées fonctionner également chez les végétaux. De ce fait, cette région de quelques centaines de paires de bases a été utilisée pour effectuer des phylogénies entre espèces proches chez les végétaux (Renaud Lahaye et al. (2008) DNA barcoding the floras of biodiversity hotspots). Cependant, l’ADN nucléaire possède des inconvénients. En effet, les régions identifiées sont trop longues pour être utilisées dans le cas de substrats très dégradés. De plus, les amorces peuvent amplifier plusieurs types de séquence au sein d'une même espèce. Enfin, les amorces ne sont pas réellement universelles et il peut être difficile d'obtenir une amplification chez certaines espèces.
Par ailleurs, les ADN mitochondriaux et chloroplastiques ont également été étudiés, car ils sont présents de manière hautement répétées dans chaque cellule (plusieurs centaines de copies). Il en résulte qu'ils représentent une cible pour l'amplification beaucoup plus accessible dans le cas de substrats dégradés. L'ADN mitochondrial ou chloroplastique est cependant trop peu variable chez les végétaux. Plusieurs articles décrivent des amorces universelles ciblant différentes régions de l'ADN chloroplastique (Bafeel S. O., et al., (2012) DNA barcoding of arid wild plants using rbcL gene sequences ) qui montrent par exemple que le gène rbcL permet l’identification de seulement 17% des espèces de plantes étudiées.
Ainsi, les solutions proposées pour l’identification spécifique d’espèces de plantes ne sont pas complètement satisfaisantes car elles concernent soit des séquences trop longues pour être efficaces dans l'analyse de substrats dégradés, soit des fragments trop courts dont le niveau de variabilité n'est pas assez élevé pour être vraiment utile dans leur identification.
Les marqueurs pouvant être utilisés communément pour la détermination et/ou l’identification d’une plante choisie parmi les espèces Cucumis anguria, Cucumis dipsaceus, Cucumis melo, Cucumis metulifer, Cucumis myriocarpus et Cucumis sativus restent encore à être identifiés. En effet, il n’existe pas, à ce jour, de marqueur suffisamment variable et possédant des amorces universelles pour permettre une bonne résolution par le «DNA barcoding» chez ces espèces. Ceci est d’autant plus vrai pour l’analyse par le «DNA barcoding» de substrats dégradés.
La détermination et/ou l’identification de plantes à partir d’ADN dégradé est très importante, notamment à des fins de contrôle-qualité de produits alimentaires, de compléments alimentaires ou cosmétiques pour lesquels l’utilisation de plantes connaît un succès croissant. Néanmoins, les régions d’ADN de plante suffisamment courtes (pour pouvoir analyser des échantillons d’ADN dégradé) et suffisamment variables (pour permettre de déterminer et/ou d’identifier les plantes, notamment les espèces de plantes) sont rares et à ce jour aucune n'a été caractérisée. De plus, il n’existe pas d’amorces universelles encadrant un tel fragment d’ADN d’une plante choisie parmi les espèces Cucumis anguria, Cucumis dipsaceus, Cucumis melo, Cucumis metulifer, Cucumis myriocarpus et Cucumis sativus (de taille comprise de 90 et 120 paires de bases) permettant d’amplifier de l’ADN dégradé.
11 existe donc un réel de besoin de pouvoir déterminer et/ou identifier une plante choisie dans le genre Cucumis à partir d’ADN dégradé.
11 existe également un réel besoin de déterminer des régions d’ADN d’une plante choisie parmi les espèces Cucumis anguria, Cucumis dipsaceus, Cucumis melo, Cucumis metulifer, Cucumis myriocarpus et Cucumis sativus suffisamment courtes et suffisamment variables pour pouvoir être utilisées dans la détermination et/ou l’identification desdites plantes.
11 existe aussi un réel besoin de déterminer des amorces universelles permettant d’amplifier les régions d’ADN desdites plantes suffisamment courtes et suffisamment variables, notamment de nouvelles amorces universelles permettant d’amplifier de l’ADN dégradé (de taille comprise entre 90 et 120 paires de bases). Il existe aussi un réel besoin de déterminer un marqueur suffisamment variable et possédant des amorces universelles pour permettre une bonne résolution par le «DNA barcoding» d’une plante choisie parmi les espèces Cucumis anguria, Cucumis dipsaceus, Cucumis melo, Cucumis metulifer, Cucumis myriocarpus et Cucumis sativus.
C’est pourquoi l’un des buts de l’invention est de fournir des régions d’ADN desdites plantes suffisamment courtes et suffisamment variables pour pouvoir être utilisées dans la détermination et/ou l’identification d’une plante choisie parmi les espèces Cucumis anguria, Cucumis dipsaceus, Cucumis melo, Cucumis metulifer, Cucumis myriocarpus et Cucumis sativus.
L’un des buts de l’invention est également de fournir des amorces universelles permettant d’amplifier lesdites régions d’ADN d’une plante choisie parmi les espèces Cucumis anguria, Cucumis dipsaceus, Cucumis melo, Cucumis metulifer, Cucumis myriocarpus et Cucumis sativus suffisamment courtes et suffisamment variables.
L’un des buts de l’invention est aussi de fournir un procédé de détermination et/ou d’identification d’une plante choisie parmi les espèces Cucumis anguria, Cucumis dipsaceus, Cucumis melo, Cucumis metulifer, Cucumis myriocarpus et Cucumis sativus à partir d’ADN dégradé.
DESCRIPTION DE L'INVENTION
Pour remédier aux inconvénients de l'état de la technique, la présente invention propose de nouvelles amorces universelles, ainsi que leur utilisation pour la détection et/ou l’identification d’une plante du genre Cucumis, en particulier choisie parmi les espèces Cucumis anguria, Cucumis dipsaceus, Cucumis melo, Cucumis metulifer, Cucumis myriocarpus et Cucumis sativus.
La présente invention repose également sur la détermination, par les inventeurs, (i) de régions d’ADN d’une plante choisie parmi les espèces Cucumis anguria, Cucumis dipsaceus, Cucumis melo, Cucumis metulifer, Cucumis myriocarpus et Cucumis sativus suffisamment courtes et suffisamment variables pour pouvoir être utilisées dans la détermination et/ou l’identification desdites espèces, et (ii) des amorces universelles permettant d’amplifier lesdites régions d’ADN desdites espèces.
Ces régions courtes d’ADN desdites espèces constituent des marqueurs dits «courts» et ont été identifiées dans le gène NdhA (codant la sous-unité 1 de la NADH plastoquinone oxydoreductase) des plantes choisies parmi les espèces Cucumis anguria, Cucumis dipsaceus, Cucumis melo, Cucumis metulifer, Cucumis myriocarpus et Cucumis sativus.
La présente invention concerne ainsi Tutilisation d’une paire d’amorces pour la détection et/ou l’identification d’une plante choisie dans le genre Cucumis et plus particulièrement parmi les espèces Cucumis anguria, Cucumis dipsaceus, Cucumis melo, Cucumis metulifer, Cucumis myriocarpus et Cucumis sativus dans un échantillon susceptible d’en contenir, par l’amplification d’au moins une région variable du gène NdhA, ladite région variable du gène NdhA constituant un marqueur de détection et de préférence d’identification d’au moins une desdites espèces. La présente invention concerne aussi les amorces (ou oligonucléotides), notamment les paires d’amorces, les séquences cibles desdites amorces, et les régions amplifiées per se.
La présente invention concerne aussi rutilisation des régions amplifiées pour la détermination et/ou l’identification d’une plante choisie parmi les espèces Cucumis anguria, Cucumis dipsaceus, Cucumis melo, Cucumis metulifer, Cucumis myriocarpus et Cucumis sativus.
La présente invention concerne aussi rutilisation d’une paire d’amorces pour la détection et de préférence l’identification d’une plante choisie parmi lesdites espèces, dans laquelle l’espèce est Cucumis melo.
La présente invention concerne aussi rutilisation d’une paire d’amorces pour la détection et de préférence l’identification d’une plante choisie parmi lesdites espèces, dans laquelle la paire d’amorces consiste en une première amorce (un premier oligonucléotide) qui s’hybride à une séquence de 15 à 30 nucléotides contigus, choisie dans la séquence de SEQ ID NO: 1 du gène NdhA et une deuxième amorce (un deuxième oligonucléotide) qui s’hybride a une séquence de 15 à 30 nucléotides contigus, choisie dans la séquence de SEQ ID NO: 2 du gène NdhA.
La présente invention concerne également l’utilisation d’une paire d’amorces dans laquelle:
-la première amorce s’hybride à une séquence de 15 à 30 nucléotides contigus choisie dans la séquence de SEQ ID NO: 1 du gène NdhA , et
-la deuxième amorce s’hybride à une séquence de 15 à 30 nucléotides contigus choisie dans la séquence de SEQ ID NO: 2 du gène NdhA,
pour la détection et/ou l’identification d’une plante choisie parmi les espèces Cucumis anguria, Cucumis dipsaceus, Cucumis melo, Cucumis metulifer, Cucumis myriocarpus et Cucumis sativus dans un échantillon susceptible d’en contenir, par amplification d’au moins une région variable du gène NdhA, ladite région variable constituant un marqueur de détection et/ou d’identification d’une plante choisie parmi les espèces Cucumis anguria, Cucumis dipsaceus, Cucumis melo, Cucumis metulifer, Cucumis myriocarpus et Cucumis sativus.
Selon la présente invention, les séquences SEQ ID NO: 1 et SEQ ID NO: 2 sont situées respectivement de la position 122821 à la position 122850 et de la position 122957 à la position 122986 sur le chloroplaste de Cucumis melo (n° Accession Genbank: JF412791.1). Le gène NdhA se situe entre les positions 121617 et 123867 sur le chloroplaste de Cucumis melo.
Selon la présente invention, les termes «amorce» et «oligonucléotide» sont interchangeables. Une amorce ou un oligonucléotide signifie une courte séquence de nucléotides, dont le nombre varie d'une dizaine à environ 100 bases (ou 100 nucléotides en considérant la présence d’un ose et d’un, de deux ou de trois groupes phosphate; la relation base/nucléotides étant bien connue de l’homme du métier). Ainsi, l’expression «paire d’amorces ou paire d’oligonucléotides» fait référence à l’association de deux oligonucléotides. Les deux oligonucléotides formant la paire d’oligonucléotides (amorces) n’ont pas nécessairement la même taille: par exemple le premier oligonucléotide qui s’hybride à la séquence de SEQ ID NO: 1 peut comprendre 21 nucléotides et le deuxième oligonucléotide qui s’hybride à une séquence de 15 à 30 nucléotides contigus choisie dans la séquence de SEQ ID NO: 2 peut comprendre 20 nucléotides, par exemple.
Dans un aspect particulier de l’invention, le premier oligonucléotide correspond à une amorce sens et le deuxième oligonucléotide correspond à une amorce anti-sens.
Le terme «contigus» signifie que les oligonucléotides s’hybrident aux 15 à 30 nucléotides successifs, situés les uns à la suite des autres, sans discontinuité.
Le terme « SEQ ID NO: 1» doit s’entendre comme une séquence de SEQ ID NO : 1 ou une séquence ayant un pourcentage d’identité d’au moins 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% avec ladite SEQ ID NO : 1, notamment 95% et plus particulièrement 98% ou 99%.
Le terme «SEQ ID NO: 2» doit s’entendre comme une séquence de SEQ ID NO : 2 ou une séquence ayant un pourcentage d’identité d’au moins 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% avec ladite SEQ ID NO : 2, notamment 95% et plus particulièrement 98% ou 99%.
Le terme «détection» signifie que l’utilisation de la paire d’oligonucléotides susmentionnée permet de conclure quant à la présence ou à l’absence de plante dans l’échantillon testé.
Le terme «identification» signifie que l’utilisation de la paire d’oligonucléotides susmentionnée permet d’identifier une plante présente dans l’échantillon testé comme étant une plante choisie parmi les espèces Cucumis anguria, Cucumis dipsaceus, Cucumis metulifer, Cucumis myriocarpus, Cucumis sativus et Cucumis melo.
L’expression «la détection et/ou l’identification» signifie «la détection» ou «l’identification» ou «la détection et l’identification», et plus particulièrement «l’identification».
L’expression «échantillon susceptible d’en contenir» signifie que l’échantillon peut comprendre ou peut ne pas comprendre une plante choisie parmi les espèces Cucumis anguria, Cucumis dipsaceus, Cucumis melo, Cucumis metulifer, Cucumis myriocarpus et Cucumis sativus, et notamment peut comprendre ou peut ne pas comprendre d’ADN d’une plante choisie parmi les espèces Cucumis anguria, Cucumis dipsaceus, Cucumis melo, Cucumis metulifer, Cucumis myriocarpus et Cucumis sativus.
Le terme «hybrider» signifie que les amorces (ou oligonucléotides) formant la paire d’amorces (ou paire d’oligonucléotides) de l’invention s'hybrident avec une séquence «marqueur» de référence du gène NdhA (notamment les séquences de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2) à un niveau supérieur au bruit de fond de manière significative. Le niveau du signal généré par l'interaction entre la séquence capable de s'hybrider de manière sélective (les séquences formant la paire d’amorces d’oligonucléotides) et les séquences de référence (les séquences cibles) est généralement 10 fois, de préférence 100 fois plus intense que celui de l'interaction des autres séquences d'ADN générant le bruit de fond. Les conditions d'hybridation stringentes permettant une hybridation sélective sont bien connues de l'homme du métier.
L’expression «conditions de stringence suffisantes» signifie par exemple une température d’hybridation de 40-65°C, de préférence de 50-60°C, notamment 53-58°C, et plus particulièrement 53°C, 55°C, 58°C dans un tampon d’amplification d’une concentration saline comprise de 0,001 à 0,5M notamment comprenant du MgCfi 2mM.
La présente invention a pour autre objet, l’utilisation d’une paire d’amorces, dans laquelle ledit premier oligonucléotide ou ledit deuxième oligonucléotide de la paire d’amorces s’hybride à sa séquence cible respective choisie parmi les séquences SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO:2 du gène NdhA, à une température comprise de 40 à 65°C, et plus particulièrement de 50-60°C et une concentration saline comprise de 0,001 à 0,5 M, et plus particulièrement de 0,05 à 0,1 M, et encore plus particulièrement de à 0,001 à 0,005M.
L’expression «amplification d’au moins une région variable du gène NdhA» fait référence à toute amplification enzymatique in vitro d'une séquence définie d'ADN du gène NdhA, par exemple par une réaction d'amplification en chaîne par polymérase (PCR).
L’expression «ladite région variable constituant un marqueur de détection et/ou d’identification d’une plante choisie parmi les espèces Cucumis anguria, Cucumis dipsaceus, Cucumis melo, Cucumis metulifer, Cucumis myriocarpus et Cucumis sativus» signifie que la région variable du gène NdhA qui est amplifiée constitue une région d’ADN de plante suffisamment courte et suffisamment variable pour pouvoir détecter et/ou identifier une plante choisie parmi les espèces Cucumis anguria, Cucumis dipsaceus, Cucumis melo, Cucumis metulifer, Cucumis myriocarpus et Cucumis sativus.
Dans un autre aspect particulier, l’invention concerne l’utilisation d’une paire d’amorces dans laquelle :
- la première amorce a une séquence de 15 à 30 nucléotides contigus choisie dans la séquence de SEQ ID NO: 3 ou une séquence ayant un pourcentage d’identité d’au moins 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% avec ladite SEQ ID NO : 3, et
- la deuxième amorce a une séquence de 15 à 30 nucléotides contigus choisie dans la séquence de SEQ ID NO: 4 ou une séquence ayant un pourcentage d’identité d’au moins 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% avec ladite SEQ ID NO : 4.
Plus particulièrement, l’invention concerne l’utilisation d’une paire d’amorces dans laquelle :
- la première amorce a une séquence de 15 à 30 nucléotides contigus choisie dans la séquence de SEQ ID NO: 3, et
- la deuxième amorce a une séquence de 15 à 30 nucléotides contigus choisie dans la séquence de SEQ ID NO: 4,
pour la détection et/ou l’identification d’une plante choisie parmi les espèces Cucumis anguria, Cucumis dipsaceus, Cucumis melo, Cucumis metulifer, Cucumis myriocarpus et Cucumis sativus dans un échantillon susceptible d’en contenir, par amplification d’au moins une région variable du gène NdhA, ladite région variable constituant un marqueur de détection et/ou d’identification d’une plante choisie parmi les espèces Cucumis anguria, Cucumis dipsaceus, Cucumis melo, Cucumis metulifer, Cucumis myriocarpus et Cucumis sativus.
Dans un autre aspect préféré, ladite première amorce s’hybride à une séquence d’au moins 20 nucléotides contigus choisie dans la séquence de SEQ ID NO: 1 du gène NdhA et a une séquence d’au moins 20 nucléotides contigus choisie dans la séquence de SEQ ID NO: 3.
Dans un autre aspect préféré, ladite deuxième amorce s’hybride à une séquence d’au moins 20 nucléotides contigus choisie dans la séquence de SEQ ID NO: 2 du gène NdhA et a une séquence d’au moins 20 nucléotides contigus choisie dans la séquence de SEQ ID NO: 4.
L’expression «d’au moins 15 nucléotides contigus » signifie par exemple 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 nucléotides contigus.
Le terme « SEQ ID NO : 3 » doit s’entendre comme une séquence de SEQ ID NO : 3 ou une séquence ayant un pourcentage d’identité d’au moins 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% avec ladite SEQ ID NO : 3, notamment 95% et plus particulièrement 98% ou 99%.
Le terme « SEQ ID NO : 4 » doit s’entendre comme une séquence de SEQ ID NO : 4 ou une séquence ayant un pourcentage d’identité d’au moins 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% avec ladite SEQ ID NO : 4, notamment 95% et plus particulièrement 98% ou 99%.
Dans un aspect particulier, l’invention concerne l’utilisation d’une paire d’amorces dans laquelle la première amorce a une séquence de 15 à 30 nucléotides contigus choisie dans le groupe constitué par l’une des séquences suivantes: SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO : 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO : 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, ou SEQ ID NO: 47. Bien entendu, lesdites séquences constituent des exemples non limitatifs de séquences de 15 à 30 nucléotides choisies dans la séquence de SEQ ID NO:3 pouvant être utilisées dans le cadre de la présente invention.
Dans un aspect particulier, l’invention concerne l’utilisation d’une paire d’amorces susmentionnée, dans laquelle la deuxième amorce a une séquence de 15 à 30 nucléotides contigus choisie dans le groupe constitué par l’une des séquences suivantes: SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO : 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO : 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 72,
SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO : 75, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO:
78, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 82, ou SEQ ID NO: 83. Bien entendu, lesdites séquences constituent des exemples non limitatifs de séquences de 15 à 30 nucléotides choisies dans la séquence de SEQ ID NO: 4 pouvant être utilisées dans le cadre de la présente invention.
Dans un aspect particulier, l’invention concerne rutilisation d’une paire d’amorces susmentionnée, dans laquelle ladite région variable du gène NdhA qui est amplifiée a une taille comprise de 90 à 120 paires de bases
L’expression « une taille comprise de 90 à 120 paires de bases » signifie notamment 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 116, 117, 118, 119 ou 120 paires de bases.
Dans un aspect particulier, l’invention concerne rutilisation d’une paire d’amorces susmentionnée, dans laquelle ladite région variable du gène NdhA comprend ou consiste en une séquence choisie dans le groupe constitué par: SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, ou SEQ ID NO: 11, ou une séquence ayant un pourcentage d’identité d’au moins 90% avec ladite séquence et notamment 95% et plus particulièrement 98% ou 99%.
Selon la présente invention, la séquence SEQ ID NO: 5 représente une séquence consensus pour laquelle les letres «K», «M» et «W» représentent un nucléotide choisi parmi A, T, C ou G. De préférence «K» représente un «T ou G», «M» représente un «A ou C», et «W» représente un «A ou T».
Dans un aspect particulier, l’invention concerne rutilisation d’une paire d’amorces susmentionnée, dans laquelle ledit échantillon est un produit qui est susceptible de contenir au moins une molécule d’ADN d’une plante choisie parmi les espèces Cucumis anguria, Cucumis dipsaceus, Cucumis melo, Cucumis metulifer, Cucumis myriocarpus et Cucumis sativus.
Dans un aspect particulier, l’invention concerne rutilisation d’une paire d’amorces susmentionnée, dans laquelle ledit échantillon est un produit qui comprend ou consiste en au moins une molécule d’ADN d’une plante choisie parmi les espèces Cucumis anguria, Cucumis dipsaceus, Cucumis melo, Cucumis metulifer, Cucumis myriocarpus et Cucumis sativus.
Dans un aspect particulier, l’invention concerne l’utilisation d’une paire d’amorces susmentionnée, dans laquelle ledit échantillon est un produit qui ne comprend pas au moins une molécule d’ADN d’une plante choisie parmi les espèces Cucumis anguria, Cucumis dipsaceus, Cucumis melo, Cucumis metulifer, Cucumis myriocarpus et Cucumis sativus.
Dans un aspect encore plus particulier, lorsque ladite molécule d’ADN d’une plante choisie parmi les espèces Cucumis anguria, Cucumis dipsaceus, Cucumis melo, Cucumis metulifer, Cucumis myriocarpus et Cucumis sativus correspond au gène NdhA (ou un fragment dudit gène NdhA), alors la molécule d’ADN, correspondant à la partie amplifiée, possède au maximum 120 paires de bases, selon la détermination ci-après: la séquence de l’amorce sens (20 paires de bases par exemple) + les fragments correspondant à la région amplifiée (90 à 120 paires de bases) + la séquence de l’amorce anti-sens (20 paires de bases par exemple).
Dans un aspect particulier, l’invention concerne l’utilisation d’une paire d’amorces susmentionnée, dans laquelle ledit échantillon est choisi parmi : un produit à base d’une plante choisie parmi les espèces Cucumis anguria, Cucumis dipsaceus, Cucumis melo, Cucumis metulifer, Cucumis myriocarpus et Cucumis sativus, un produit qui contient au moins une plante choisie parmi les espèces Cucumis anguria, Cucumis dipsaceus, Cucumis melo, Cucumis metulifer, Cucumis myriocarpus et Cucumis sativus processée, un extrait d’une plante choisie parmi les espèces Cucumis anguria, Cucumis dipsaceus, Cucumis melo, Cucumis metulifer, Cucumis myriocarpus et Cucumis sativus, un mélange de plantes choisies parmi les espèces Cucumis anguria, Cucumis dipsaceus, Cucumis melo, Cucumis metulifer, Cucumis myriocarpus et Cucumis sativus, un produit à base d’une plante pure choisie parmi les espèces Cucumis anguria, Cucumis dipsaceus, Cucumis melo, Cucumis metulifer, Cucumis myriocarpus et Cucumis sativus, un produit qui ne contient pas de plante choisie parmi les espèces Cucumis anguria, Cucumis dipsaceus, Cucumis melo, Cucumis metulifer, Cucumis myriocarpus et Cucumis sativus.
L’expression «produit à base d’une plante choisie parmi les espèces Cucumis anguria, Cucumis dipsaceus, Cucumis melo, Cucumis metulifer, Cucumis myriocarpus et Cucumis sativus » signifie un produit contenant au moins une plante choisie parmi les espèces Cucumis anguria, Cucumis dipsaceus, Cucumis melo, Cucumis metulifer, Cucumis myriocarpus et Cucumis sativus dont l’intégrité de l’ADN n’a pas été altérée.
L’expression « un produit qui contient au moins une plante choisie parmi les espèces Cucumis anguria, Cucumis dipsaceus, Cucumis melo, Cucumis metulifer, Cucumis myriocarpus et Cucumis sativus processée» signifie un produit contenant au moins une desdites plantes dont l’intégrité de l’ADN a été altérée.
L’expression « un extrait de plantes » signifie un échantillon obtenu par extraction d’une plante choisie parmi les espèces Cucumis anguria, Cucumis dipsaceus, Cucumis melo, Cucumis metulifer, Cucumis myriocarpus et Cucumis sativus, c’est-à-dire un échantillon/extrait comprenant au moins de l’ADN d’une plante choisie parmi les espèces Cucumis anguria, Cucumis dipsaceus, Cucumis melo, Cucumis metulifer, Cucumis myriocarpus et Cucumis sativus, l’intégrité dudit ADN étant altérée ou non altérée.
L’expression « un mélange de plantes » signifie un mélange contenant de l’ADN de plantes d’au moins deux plantes choisies parmi les espèces Cucumis anguria, Cucumis dipsaceus, Cucumis melo, Cucumis metulifer, Cucumis myriocarpus et Cucumis sativus, notamment des plantes dont l’ADN a été processé. L’expression «un produit qui ne contient pas de plante choisie parmi les espèces Cucumis anguria, Cucumis dipsaceus, Cucumis melo, Cucumis metulifer, Cucumis myriocarpus et Cucumis sativus» signifie un produit contenant 0% d’ADN d’une plante choisie parmi les espèces Cucumis anguria, Cucumis dipsaceus, Cucumis melo, Cucumis metulifer, Cucumis myriocarpus et Cucumis sativus.
L’expression « plante pure » signifie un produit contenant 100% d’ADN d’une seule desdites espèces.
Dans un aspect particulier, l’invention concerne l’utilisation d’une paire d’amorces susmentionnée, dans laquelle ladite détection et/ou identification d’une plante choisie parmi les espèces Cucumis anguria, Cucumis dipsaceus, Cucumis melo, Cucumis metulifer, Cucumis myriocarpus et Cucumis sativus est effectuée par hybridation dans des conditions de stringence suffisantes pour l’amplification de ladite région variable du gène NdhA.
L’expression « conditions de stringence suffisantes » signifie par exemple une température d’hybridation de 50-60°C, notamment 53-58°C, et plus particulièrement 53°C, 55°C, 58°C dans un tampon d’amplification d’une concentration saline comprise de 0,001 à 0,5M notamment comprenant du MgCfi 2mM.
Dans un aspect particulier, l’invention concerne l’utilisation d’une paire d’amorces susmentionnée, dans laquelle ladite hybridation dans des conditions de stringence suffisantes comprend ou consiste en une hybridation desdites première et deuxième amorces avec:
-des séquences de 15 à 30 nucléotides contigus choisies dans les séquences de SEQ ID NO:l, ou SEQ ID NO: 2 du gène NdhA, à une température de 50-60°C, notamment 53- 58°C et plus particulièrement 53°C, 55°C ou 58°C dans un tampon d’amplification d’une concentration saline comprise de 0,001 à 0,5M notamment comprenant du MgCfi 2mM.
Dans un aspect particulier, l’invention concerne l’utilisation d’une paire d’amorces susmentionnée, dans laquelle ladite hybridation dans des conditions de stringence suffisantes comprend ou consistent en:
-des séquences de 15 à 30 nucléotides contigus choisies dans les séquences de SEQ ID NO: 3 et SEQ ID NO: 4 du gène NdhA, qui s’hybrident à une séquence choisie parmi les séquences SEQ ID NO:l, ou SEQ ID NO: 2 du gène NdhA à une température de 50-60°C, notamment 55°C dans un tampon d’amplification d’une concentration saline comprise de 0,001 à 0,5M notamment comprenant du MgCfi 2mM.
Dans un aspect particulier, l’invention concerne l’utilisation d’une paire d’amorces susmentionnée, dans laquelle ladite amplification d’au moins une région variable du gène NdhA comprend ou consiste en la répétition du cycle comprenant ou constitué de :
- une étape d’hybridation d’au moins une molécule d’ADN simple brin d’une plante choisie parmi les espèces Cucumis anguria, Cucumis dipsaceus, Cucumis melo, Cucumis metulifer, Cucumis myriocarpus et Cucumis sativus, issue de la dénaturation d’une molécule d’ADN double brin d’une plante choisie parmi les espèces Cucumis anguria, Cucumis dipsaceus, Cucumis melo, Cucumis metulifer, Cucumis myriocarpus et Cucumis sativus provenant d’un échantillon susceptible de contenir au moins une desdites plantes, avec au moins une amorce constituée par un des deux oligonucléotides formant la susdite paire d’amorces.
Dans un aspect particulier, l’invention concerne l’utilisation d’une paire d’amorces susmentionnée, dans laquelle ladite amplification d’au moins une région variable du gène NdhA comprend ou consiste en la répétition du cycle comprenant ou constitué de :
- une étape d’hybridation d’au moins une molécule d’ADN simple brin d’une plante choisie parmi les espèces Cucumis anguria, Cucumis dipsaceus, Cucumis melo, Cucumis metulifer, Cucumis myriocarpus et Cucumis sativus, issue de la dénaturation d’une molécule d’ADN double brin de plante provenant d’un échantillon susceptible de contenir au moins une plante, avec au moins une amorce constituée par un des deux oligonucléotides formant la susdite paire d’amorces,
- une étape d’élongation du brin complémentaire d’au moins une des deux susdites molécules d’ADN simple brin desdites plantes, par l’ADN polymérase, à partir de la susdite amorce, afin d’obtenir un produit d’amplification constituant un marqueur de détection et/ou d’identification d’une plante choisie parmi les espèces Cucumis anguria, Cucumis dipsaceus, Cucumis melo, Cucumis metulifer, Cucumis myriocarpus et Cucumis sativus.
Le produit d’amplification correspond ici à la région variable amplifiée du gène NdhA qui constitue un marqueur dit « court » au sens de la présente invention.
Dans un aspect particulier de l’invention, l’utilisation d’une paire d’amorces susmentionnée, comprenant ou consistant en la répétition dudit cycle comprenant ou étant constitué d’une étape d’hybridation et d’une étape d’élongation, doit également s’entendre comme un procédé d’amplification.
Dans un aspect particulier, l’invention concerne l’utilisation d’une paire d’amorces susmentionnée, dans laquelle ladite amplification d’au moins une région variable du gène NdhA comprend ou consiste en la répétition du cycle comprenant ou constitué de:
- une étape de dénaturation d’une molécule d’ADN double brin d’une plante choisie parmi les espèces Cucumis anguria, Cucumis dipsaceus, Cucumis melo, Cucumis metulifer, Cucumis myriocarpus et Cucumis sativus provenant d’un échantillon susceptible de contenir au moins une desdites plantes afin d’obtenir deux molécules d’ADN simple brin de plante,
- une étape d’hybridation d’au moins une des deux susdites molécules d’ADN simple brin de plante avec au moins une amorce constituée par un des deux oligonucléotides formant la susdite paire d’amorces,
- une étape d’élongation du brin complémentaire d’au moins une des deux susdites molécules d’ADN simple brin de plante par l’ADN polymérase, à partir de la susdite amorce, afin d’obtenir un produit d’amplification constituant un marqueur de détection et/ou d’identification d’une plante choisie parmi les espèces Cucumis anguria, Cucumis dipsaceus, Cucumis melo, Cucumis metulifer, Cucumis myriocarpus et Cucumis sativus.
Dans un aspect particulier, l’invention concerne l’utilisation d’une paire d’amorces susmentionnée, dans laquelle ladite amplification d’au moins une région variable du gène NdhA comprend ou consiste en la répétition du cycle comprenant ou constitué de:
- une étape d’hybridation de deux molécules d’ADN simple brin de plante, issues de la dénaturation d’une molécule d’ADN double brin de plante provenant d’un échantillon susceptible de contenir au moins une plante choisie parmi les espèces Cucumis anguria, Cucumis dipsaceus, Cucumis melo, Cucumis metulifer, Cucumis myriocarpus et Cucumis sativus, avec deux amorces constituées par les deux oligonucléotides formant la susdite paire d’amorces.
Dans un aspect particulier, l’invention concerne l’utilisation d’une paire d’amorces susmentionnée, dans laquelle ladite amplification d’au moins une région variable du gène NdhA comprend ou consiste en la répétition du cycle comprenant ou constitué de:
- une étape d’hybridation de deux molécules d’ADN simple brin de plante, issues de la dénaturation d’une molécule d’ADN double brin de plante provenant d’un échantillon susceptible de contenir au moins une plante choisie parmi les espèces Cucumis anguria, Cucumis dipsaceus, Cucumis melo, Cucumis metulifer, Cucumis myriocarpus et Cucumis sativus, avec deux amorces constituées par les deux oligonucléotides formant la susdite paire d’amorces,
- une étape d’élongation des brins complémentaires des deux susdites molécules d’ADN simple brin de plante, par l’ADN polymérase, à partir des susdites amorces, afin d’obtenir un produit d’amplification constituant un marqueur de détection et/ou d’identification d’une plante choisie parmi les espèces Cucumis anguria, Cucumis dipsaceus, Cucumis melo, Cucumis metulifer, Cucumis myriocarpus et Cucumis sativus.
Dans un aspect particulier, l’invention concerne l’utilisation d’une paire d’amorces susmentionnée, dans laquelle ladite amplification d’au moins une région variable du gène NdhA comprend ou consiste en la répétition du cycle comprenant ou constitué de:
- une étape de dénaturation d’une molécule d’ADN double brin de plante provenant d’un échantillon susceptible de contenir au moins une plante choisie parmi les espèces Cucumis anguria, Cucumis dipsaceus, Cucumis melo, Cucumis metulifer, Cucumis myriocarpus et Cucumis sativus afin d’obtenir deux molécules d’ADN simple brin de plante,
- une étape d’hybridation de deux susdites molécules d’ADN simple brin de plante avec deux amorces constituées par les deux oligonucléotides formant la susdite paire d’amorces,
- une étape d’élongation des brins complémentaires des deux susdites molécules d’ADN simple brin de plante, par l’ADN polymérase, à partir des susdites amorces, afin d’obtenir un produit d’amplification constituant un marqueur de détection et/ou d’identification d’une plante choisie parmi les espèces Cucumis anguria, Cucumis dipsaceus, Cucumis melo, Cucumis metulifer, Cucumis myriocarpus et Cucumis sativus.
Dans un aspect particulier, l’invention concerne rutilisation d’une paire d’amorces susmentionnée, dans laquelle ladite répétition du cycle est une répétition d’au moins 25 cycles, notamment 40 cycles et plus particulièrement 49, 50 ou 51 cycles.
L’expression «au moins 25 cycles» signifie par exemple 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 , 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50 ou 51 cycles.
Dans un aspect particulier, l’invention concerne rutilisation d’une paire d’amorces susmentionnée, pour la détection et/ou l’identification d’une plante choisie parmi les espèces Cucumis anguria, Cucumis dipsaceus, Cucumis melo, Cucumis metulifer, Cucumis myriocarpus et Cucumis sativus.
La présente invention a pour autre objet une paire d’amorces dans laquelle
- une première amorce comprend ou est constituée d’une séquence de 15 à 30 nucléotides contigus, complémentaire de la séquence SEQ ID NO: 1, ou d’une séquence ayant un pourcentage d’identité d’au moins 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% avec ladite séquence de SEQ ID NO: 1, et
- une deuxième amorce comprend ou est constituée d’une séquence de 15 à 30 nucléotides contigus, complémentaire de la séquence SEQ ID NO: 2, ou d’une séquence ayant un pourcentage d’identité d’au moins 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% avec ladite séquence de SEQ ID NO: 2.
L’expression «une taille de 15 à 30 nucléotides» signifie une taille de 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, ou 30 nucléotides.
La présente invention a pour autre objet une paire d’amorces qui consiste en:
-une première amorce d’une taille comprise de 15 à 30 nucléotides contigus, et comprend ou est constituée par une séquence choisie parmi: SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO : 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO : 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO : 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, ou SEQ ID NO: 47, et
-une seconde amorce d’une taille comprise de 15 à 30 nucléotides contigus, et comprend ou est constituée par une séquence choisie parmi: SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO : 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO : 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO : 75, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 82, ou SEQ ID NO: 83, ou une séquence ayant un pourcentage d’identité d’au moins 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% avec lesdites séquences.
Ces oligonucléotides correspondent aux séquences des paires d’amorces NdhA de la présente invention.
La présente invention a pour autre objet un marqueur de détection et/ou d’identification d’une plante choisie parmi les espèces Cucumis anguria, Cucumis dipsaceus, Cucumis melo, Cucumis metulifer, Cucumis myriocarpus et Cucumis sativus ayant une taille comprise entre 90 et 120 nucléotides, ledit marqueur comprenant ou étant constitué par une séquence amplifiée ayant un pourcentage d’identité d’au moins 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100% avec une séquence choisie parmi SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11.
Ces marqueurs correspondent aux séquences nucléotidiques des régions amplifiées selon la présente invention.
La présente invention a pour autre objet un marqueur de détection et/ou d’identification d’une plante choisie parmi les espèces Cucumis anguria, Cucumis dipsaceus, Cucumis melo, Cucumis metulifer, Cucumis myriocarpus et Cucumis sativus qui comprend ou est constitué par une séquence amplifiée ayant un pourcentage d’identité d’au moins 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100% avec une séquence choisie parmi SEQ ID NO: 5 à 11 pour détecter ou de préférence identifier respectivement une plante choisie parmi les espèces Cucumis anguria, Cucumis dipsaceus, Cucumis melo, Cucumis metulifer, Cucumis myriocarpus et Cucumis sativus.
La présente invention concerne aussi un procédé d’amplification d’au moins une région variable constituant un marqueur de détection et/ou d’identification d’une plante choisie parmi les espèces Cucumis anguria, Cucumis dipsaceus, Cucumis metulifer, Cucumis myriocarpus, Cucumis sativus et Cucumis melo.
La présente invention a pour autre objet un procédé d’amplification et d’identification d’au moins une région variable du gène NdhA, ladite région variable constituant un marqueur de détection et de préférence d’identification d’une plante choisie parmi les espèces Cucumis anguria, Cucumis dipsaceus, Cucumis melo, Cucumis metulifer, Cucumis myriocarpus et Cucumis sativus, comprenant ou étant constitué des étapes suivantes:
a) une étape d’amplification de ladite région variable du gène NdhA susceptible d’être contenue dans un produit ou un échantillon, en utilisant
-la paire d’amorces consistant en une première amorce qui s’hybride à une séquence de 15 à 30 nucléotides contigus choisie dans la séquence de SEQ ID NO: 1 du gène NdhA et une deuxième amorce qui s’hybride à une séquence de 15 à 30 nucléotides contigus choisie dans la séquence de SEQ ID NO: 2 du gène NdhA , b) une étape de détermination ou d’identification de la présence d’une plante choisie parmi les espèces Cucumis anguria, Cucumis dipsaceus, Cucumis melo, Cucumis metulifer, Cucumis myriocarpus et Cucumis sativus dans ledit produit ou échantillon par la détection d’au moins une région variable amplifiée du gène NdhA.
Le procédé d’amplification et d’identification d’au moins une région variable du gène NdhA selon la présente invention comprend en outre avant l’étape a) une étape d’extraction du matériel nucléique d’un produit ou échantillon susceptible de contenir ladite région variable du gène NdhA.
Le procédé d’amplification et d’identification d’au moins une région variable du gène NdhA selon la présente invention comprend en outre une étape c) d’identification d’une plante choisie parmi les espèces Cucumis anguria, Cucumis dipsaceus, Cucumis melo, Cucumis metulifer, Cucumis myriocarpus et Cucumis sativus par séquençage de ladite région variable amplifiée et détectée du gène NdhA.
Dans un aspect particulier, la présente invention concerne un procédé d’amplification et d’identification d’au moins une région variable du gène NdhA, ladite région variable constituant un marqueur de détection et de préférence d’identification d’une plante choisie parmi les espèces Cucumis anguria, Cucumis dipsaceus, Cucumis melo, Cucumis metulifer, Cucumis myriocarpus et Cucumis sativus, étant constitué des étapes suivantes:
a) une étape d’extraction du matériel nucléique d’un produit ou échantillon susceptible de contenir ladite région variable du gène NdhA
b) une étape d’amplification de ladite région variable du gène NdhA susceptible d’être contenue dans un produit ou un échantillon, en utilisant
-la paire d’amorces consistant en une première amorce qui s’hybride à une séquence de 15 à 30 nucléotides contigus choisie dans la séquence de SEQ ID NO: 1 du gène NdhA et une deuxième amorce qui s’hybride à une séquence de 15 à 30 nucléotides contigus choisie dans la séquence de SEQ ID NO: 2 du gène NdhA ,
c) une étape de détermination ou d’identification de la présence d’une plante choisie parmi les espèces Cucumis anguria, Cucumis dipsaceus, Cucumis melo, Cucumis metulifer, Cucumis myriocarpus et Cucumis sativus dans ledit produit ou échantillon par la détection d’au moins une région variable amplifiée du gène NdhA,
d) une étape d’identification d’une plante choisie parmi les espèces Cucumis anguria, Cucumis dipsaceus, Cucumis melo, Cucumis metulifer, Cucumis myriocarpus et Cucumis sativus par séquençage de ladite région variable amplifiée et détectée du gène NdhA.
L’expression «afin d’obtenir éventuellement au moins une région variable amplifiée du gène NdhA » signifie que le procédé d’amplification peut permettre d’obtenir au moins une région variable amplifiée du gène NdhA, ou peut ne pas permettre d’obtenir au moins une région variable amplifiée du gène NdhA. Dans ce dernier cas, la non-obtention d’au moins une région variable amplifiée du gène NdhA signifie qu’il n’y a pas d’ADN d’une plante choisie parmi les espèces Cucumis anguria, Cucumis dipsaceus, Cucumis melo, Cucumis metulifer, Cucumis myriocarpus et Cucumis sativus dans l’échantillon testé.
Dans un aspect particulier, la présente invention concerne un procédé d’amplification susmentionné, dans lequel ledit procédé comprend après ladite étape d’hybridation une étape d’élongation du brin complémentaire d’au moins une des deux susdites molécules d’ADN simple brin de plante, par l’ADN polymérase, à partir de la susdite amorce, afin d’obtenir au moins une région variable amplifiée du gène NdhA.
Dans un aspect particulier, la présente invention concerne un procédé d’amplification susmentionné, dans lequel ledit procédé comprend après ladite étape d’hybridation une étape d’élongation de chacun des brins complémentaires des deux susdites molécules d’ADN simple brin de plante, par l’ADN polymérase, à partir des susdites amorces, afin d’obtenir deux régions variables amplifiées du gène NdhA.
Dans un aspect particulier, la présente invention concerne un procédé d’amplification susmentionné, dans lequel ledit procédé comprend avant ladite étape d’hybridation une étape de dénaturation d’une molécule d’ADN double brin de plante provenant d’un échantillon susceptible de contenir au moins une plante choisie parmi les espèces Cucumis anguria, Cucumis dipsaceus, Cucumis melo, Cucumis metulifer, Cucumis myriocarpus et Cucumis sativus, afin d’obtenir deux molécules d’ADN simple brin de plante.
Dans un aspect particulier, la présente invention concerne un procédé d’amplification susmentionné, dans lequel ladite étape de dénaturation d’une molécule d’ADN double brin de plante est effectuée à une température d’environ 95°C pendant environ 30 secondes.
Dans un aspect particulier, la présente invention concerne un procédé d’amplification susmentionné, dans lequel ladite étape d’hybridation est effectuée à une température d’environ 50- 60°C, notamment d’environ 53-55°C pendant environ 30 secondes.
Le terme «50-60°C» signifie 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60°C.
L’expression «environ 50-60°C» signifie que des valeurs proches de 50°C ou 60°C, telles que 49°C ou 6l°C sont également comprises dans la portée de l’invention.
L’expression « environ 30 secondes » signifie 30 secondes ou des valeurs proches de 30 secondes, telles que 29 secondes ou 31 secondes.
Dans un aspect particulier, la présente invention concerne un procédé d’amplification susmentionné, dans lequel ladite étape d’hybridation est effectuée à une température d’environ 50- 60°C, notamment environ 55°C pendant environ 30 secondes. Dans cet aspect particulier, ce sont les amorces NdhA qui sont utilisées.
Dans un aspect particulier, la présente invention concerne un procédé d’amplification susmentionné, dans lequel ladite étape d’élongation est effectuée à une température d’environ 72°C pendant environ 1 minute. Bien entendu la durée d’hybridation, la durée d’élongation et les températures d’hybridation et d’élongation dépendent de la longueur du fragment à amplifier et de la vitesse de l’enzyme, et peuvent être adaptées en fonction de la polymérase utilisée. Dans le cas de la présente invention les durées et températures sont données en référence à la Taq polymérase utilisée (Hot FlREPol DNA polymérase ; Solis).
L’expression « environ 72°C» signifie 72°C ou des valeurs proches de 72°C, telles que 71 °C ou 73°C.
L’expression «environ 1 minute» signifie 60 secondes ou des valeurs proches de 60 secondes, telles que 59 secondes ou 61 secondes.
Dans un aspect particulier, la présente invention concerne un procédé d’amplification susmentionné, dans lequel ladite étape de dénaturation est précédée d’une étape de dénaturation initiale d’une molécule d’ADN double brin de plante afin d’obtenir deux molécules d’ADN simple brin de plante, à une température d’environ 95°C pendant environ 10 minutes.
Cete étape de dénaturation a pour objectif d’activer l’enzyme et de dénaturer la molécule d’ADN. Cette étape peut être optionnelle, en ce sens que certaines enzymes peuvent se passer de cette étape de dénaturation initiale.
La durée et température de cete étape de dénaturation dépendent de la polymérase utilisée (Taq polymérase - Hot FlREPol DNA polymérase ; Solis dans le cas de la présente invention).
L’expression «environ 95°C» signifie 95°C ou des valeurs proches de 95°C, telles que 94°C ou 96°C.
L’expression « environ 10 minutes » signifie 10 minutes (ou 600 secondes) ou des valeurs proches de 600 secondes, telles que 550 secondes, 559 secondes, 610 secondes ou 601 secondes.
Dans un aspect particulier, la présente invention concerne un procédé d’amplification susmentionné, dans lequel ladite étape d’élongation est suivie d’une étape d’élongation finale du brin complémentaire d’au moins une des susdites molécules d’ADN simple brin de plante, à une température d’environ 72°C pendant environ 7 minutes.
L’expression «environ 7 minutes» signifie 7 minutes (ou 420 secondes) ou des valeurs proches de 420 secondes, telles que 410 secondes, 419 secondes, 430 secondes ou 429 secondes.
La durée et température de cete étape d’élongation finale dépendent de la polymérase utilisée (Taq polymérase - Hot FlREPol DNA polymerase; Solis dans le cas de la présente invention).
Dans un aspect particulier, la présente invention concerne un procédé d’amplification susmentionné, dans lequel ladite étape d’élongation finale est suivie d’une étape de diminution de la température au cours de laquelle la température est diminuée à une température d’environ 10°C.
L’expression « environ 10°C » signifie 10°C ou des valeurs proches de 10°C, telles que 9°C ou i PC. Cete diminution de température a pour objectif de stopper la réaction enzymatique, ramener l’échantillon à une température convenable pour travailler (sans se brûler) et conserver l’échantillon si jamais nécessaire.
Dans un aspect particulier, la présente invention concerne un procédé d’amplification susmentionné, dans lequel ledit procédé d’amplification d’au moins une région variable du gène NdhA comprend ou est constitué des étapes suivantes :
- ladite étape de dénaturation d’une molécule d’ADN double brin de plante, à une température d’environ 95°C pendant environ 30 secondes, afin d’obtenir deux molécules d’ADN simple brin de plante,
- ladite étape d’hybridation d’au moins une des deux susdites molécules d’ADN simple brin, à une température d’environ 50-60°C, notamment environ 53-55°C pendant environ 30 secondes,
- ladite étape d’élongation du brin complémentaire d’au moins une des deux susdites molécules d’ADN simple brin de plante, à une température d’environ 72°C pendant environ 1 minute, afin d’obtenir au moins une région variable amplifiée du gène NdhA.
Dans un aspect particulier, la présente invention concerne un procédé d’amplification susmentionné, dans lequel ledit procédé d’amplification d’au moins une région variable du gène NdhA comprend ou est constitué des étapes suivantes :
- ladite étape de dénaturation initiale d’une molécule d’ADN double brin, à une température de 95°C pendant 10 minutes, suivie de ladite étape de dénaturation d’une molécule d’ADN double brin de plante, à une température d’environ 95°C pendant environ 30 secondes, afin d’obtenir deux molécules d’ADN simple brin de plante,
- ladite étape d’hybridation d’au moins une des deux susdites molécules d’ADN simple brin, à une température d’environ 50-60°C, notamment environ 53-55°C pendant environ 30 secondes,
- ladite étape d’élongation du brin complémentaire d’au moins une des deux susdites molécules d’ADN simple brin de plante, à une température d’environ 72°C pendant environ 1 minute, suivie de ladite étape d’élongation finale du brin complémentaire d’au moins une des deux susdites molécules d’ADN simple brin de plante, à une température d’environ 72°C pendant environ 7 minutes, afin d’obtenir au moins une région variable amplifiée du gène NdhA,
- ladite étape de diminution de la température à une température d’environ l0°C.
Dans un aspect particulier, la présente invention concerne un procédé d’amplification susmentionné, dans lequel ledit procédé d’amplification d’au moins une région variable du gène NdhA comprend ou est constitué des étapes suivantes :
- ladite étape de dénaturation d’une molécule d’ADN double brin de plante, à une température d’environ 95°C pendant environ 30 secondes, afin d’obtenir deux molécules d’ADN simple brin de plante,
- ladite étape d’hybridation d’au moins une des deux susdites molécules d’ADN simple brin, à une température d’environ 50-60°C, notamment environ 55°C pendant environ 30 secondes, - ladite étape d’élongation du brin complémentaire d’au moins une des deux susdites molécules d’ADN simple brin de plante, à une température d’environ 72°C pendant environ 1 minute, afin d’obtenir au moins une région variable amplifiée du gène NdhA.
Dans un aspect particulier, la présente invention concerne un procédé d’amplification susmentionné, dans lequel ledit procédé d’amplification d’au moins une région variable du gène NdhA comprend ou est constitué des étapes suivantes :
- ladite étape de dénaturation initiale d’une molécule d’ADN double brin, à une température d’environ 95°C pendant environ 10 minutes, suivie de ladite étape de dénaturation d’une molécule d’ADN double brin de plante, à une température d’environ 95°C pendant environ 30 secondes, afin d’obtenir deux molécules d’ADN simple brin de plante,
- ladite étape d’hybridation d’au moins une des deux susdites molécules d’ADN simple brin, à une température d’environ 50-60°C, notamment environ 55°C pendant environ 30 secondes,
- ladite étape d’élongation du brin complémentaire d’au moins une des deux susdites molécules d’ADN simple brin de plante, à une température d’environ 72°C pendant environ 1 minute, suivie de ladite étape d’élongation finale du brin complémentaire d’au moins une des deux susdites molécules d’ADN simple brin de plante, à une température d’environ 72°C pendant environ 7 minutes, afin d’obtenir au moins une région variable amplifiée du gène NdhA,
- ladite étape de diminution de la température à une température d’environ l0°C.
Dans un aspect particulier, la présente invention concerne un procédé d’amplification susmentionné, dans lequel ledit procédé comprend l’obtention d’au moins une région variable amplifiée du gène NdhA.
Dans un aspect particulier, la présente invention concerne un procédé d’amplification susmentionné, dans lequel ledit procédé ne permet pas l’obtention d’au moins une région variable amplifiée du gène NdhA.
Dans un aspect encore plus particulier, la présente invention concerne un procédé d’amplification susmentionné, dans lequel ledit procédé comprend une étape de détection de ladite obtention d’au moins une région variable amplifiée du gène NdhA afin d’obtenir une région variable amplifiée et détectée du gène NdhA.
Ladite étape de détection d’au moins une région variable amplifiée du gène NdhA peut se faire par diverses techniques, notamment par électrophorèse.
Dans un aspect particulier, la présente invention concerne un procédé d’amplification susmentionné, dans lequel ledit procédé comprend une étape d’identification d’une plante choisie parmi les espèces Cucumis anguria, Cucumis dipsaceus, Cucumis melo, Cucumis metulifer, Cucumis myriocarpus et Cucumis sativus par séquençage de ladite région variable amplifiée et détectée du gène NdhA afin d’obtenir une région variable amplifiée séquencée. Dans un aspect particulier, la présente invention concerne un procédé d’amplification susmentionné, dans lequel ledit séquençage est un séquençage capillaire ou un séquençage NGS (Next Génération- Sequencing) .
Dans un aspect particulier, la présente invention concerne un procédé d’amplification susmentionné, dans lequel ledit séquençage permet d’identifier l’espèce à laquelle appartient la plante par comparaison entre ladite région variable amplifiée séquencée et une séquence de référence.
Dans un aspect particulier, ladite séquence de référence est choisie parmi les séquences suivantes SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, et SEQ ID NO: 11.
Dans un aspect particulier, la présente invention concerne un procédé d’amplification susmentionné, dans lequel la nature de l’échantillon est connue ou non.
Dans un aspect particulier, la présente invention concerne un procédé d’amplification susmentionné, dans lequel l’échantillon est un mélange de plantes, un produit à base de plante, un produit qui contient au moins une plante processée, un extrait de plante, un produit qui ne contient pas de plante, un échantillon de plante sans plante, un mélange sans plante, une plante pure ou un fragment de plante pure ayant une molécule d’ADN dont la taille est comprise entre 90 et 120 nucléotides.
Dans un aspect particulier, les marqueurs dits courts selon la présente invention sont notamment utilisés pour analyser des échantillons d’ADN contenant une molécule d’ADN dont la taille est comprise entre 90 et 120 nucléotides.
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23
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Tableau _ 1 : Tableau récapitulatif des séquences selon la présente invention
L’invention sera mieux illustrée par les exemples suivants. Les exemples ci-après visent à éclaircir l’objet de l’invention et illustrer des modes de réalisation avantageux, mais en aucun cas visent à restreindre la portée de l’invention.
Exemple 1 : Méthode avec des produits à base de Cucumis
Extraction d’ADN :
Sur produits à base de Cucumis :
L’ADN a été extrait des produits à base de Cucumis en utilisant un protocole adapté du kit NucleoMag Trace (Machery-Nagel).
Amplification PCR :
Sur produits à base de Cucumis :
Les ADNs extraits des produits à base de Cucumis ont été amplifiés pour un marqueur génétique à l’aide des amorces correspondantes (Tableau 2). Une étiquette de 8 bases est ajoutée du côté 5’ de l’amorce afin de créer un système de « multiplexage » et de permettre l’assignation des séquences à leurs échantillons respectifs.
Figure imgf000028_0001
Figure imgf000028_0003
Le mélange réactionnel utilisé pour l’amplification a été préparé comme suit : tampon : IX ; MgC12 : 2 mM ; dNTP : 0,2 mM chacun; amorces: 0,2 mM chacune; BSA: 0,16 mg.pL 1; Taq Polymérase (Hot FIREPol DNA polymérase; Solis) : 2 unités ; 3 pL d’ADN ; pour un volume final de 25 pL. Il a ensuite été amplifié sur un thermocycleur (Tl 00, Biorad) en utilisant le programme défini en Tableau
3.
Figure imgf000028_0002
Tableau 3: Programme d’amplification des marqueurs génétiques sur produits à base de Cucumis Séquençage :
Sur produits à base de Cucumis :
Les produits d’amplification ont été analysés par électrophorèse capillaire (QIAxcel DNA Screening kit, Qiagen). Les marqueurs ayant été correctement amplifiés ont ensuite été purifiés avec le kit NucleoSpin Gel and PCR Clean-up (Macherey-Nagel) et dosés au spectrophotomètre SimpliNano 4285 v2.0.0 (GE Healthcare). Les échantillons ont ensuite été poolés et normalisés. La librairie à séquencer est préparée à partir du Truseq PCR-free library préparation Kit (Illumina). Le séquençage en paired-end 2x150 bp a été réalisé sur séquenceur nouvelle génération MiSeq (Illumina).
Exemple 2
Échantillonnage:
Quatre types d’échantillons ont été sélectionnés pour cette étude (énumérés et décrits dans le tableau 6). Les matières premières ont été choisies pour confirmer l’efficacité des amorces étudiées. Les compléments alimentaires (gélules), les produits pour l’alimentation animale et les cosmétiques (crèmes) ont été choisis pour mettre en avant l’outil génétique dans les différents domaines concernés par l’utilisation dedites matières premières.
Traitement à l’alpha-amylase des échantillons enrobés d’amidon:
Les échantillons enrobés dans des microsphères d’amidon (échantillons n°6, 10, 11 et 12, voir tableau 6) nécessitent un traitement préalable pour ouvrir les microsphères et libérer l’ADN qu’elles contiennent. L’alpha-amylase est une enzyme utilisée pour dégrader la molécule d’amidon.
Extraction d’ADN:
L’ADN des 9 produits à base d’espèces du genre Cucumis a été extrait en utilisant un protocole adapté du kit NucleoMag Trace (Machery-Nagel).
Amplification PCR:
Les ADNs extraits des produits à base d’espèces du genre Cucumis ont été amplifiés pour un marqueur génétique NdhA à l’aide des amorces correspondantes (tableau 4). Une étiquette de 8 bases nucléotidiques est ajoutée du coté 5’ de l’amorce afin de créer un système de « multiplexage » et de permettre l’assignation des séquences à leurs échantillons respectifs (COISSAC, Eric, RIAZ, Tiayyba et PUILLANDRE, Nicolas. Bioinformatic Challenges for DNA metabarcoding of plantes and animais. Molecular Ecology, 2012, vol. 21, pp. 1834-1847).
Tableau 4 : Liste des amorces utilisées au cours de l’étude sur les produits à base de Cucumis
Figure imgf000030_0001
Le mélange réactionnel utilisé pour l’amplification à été préparé comme suit : tampon : IX ; MgC12 : 2 mM ; dNTP : 0,2 mM chacun ; amorces : 0,2 mM chacune ; BSA : 0,16 mg.pL 1 ; Taq Polymérase : 2 unités ; 3 pL d’ADN ; pour un volume final de 25 pL. L'amplification est ensuite réalisée sur un thermocycleur en utilisant le programme défini en tableau 5.
Tableau 5 : Programme d’amplification des marqueurs génétiques sur produits à base de Cucumis
Figure imgf000030_0002
Séquençage sur produits à base de Cucumis :
Les produits d’amplification ont été analysés par électrophorèse capillaire (QIAxcel, Qiagen®). Les marqueurs amplifiés ont ensuite été purifiés avec le kit NucleoSpin Gel and PCR Clean-up (Macherey- Nagel®). Les échantillons ont ensuite été mélangés et normalisés. La librairie à séquencer est préparée à partir du Truseq PCR-free library préparation Kit (Illumina®). Le séquençage des amplicons a été réalisé à l’aide d’un séquenceur MiSeq (Illumina®).
Analyse bio informatique sur produits à base de Cucumis :
L’analyse bio informatique des séquences obtenues a été réalisée avec le package Obitools (BOYER, Frédéric, MERCIER, Céline, BONIN, Aurélie, LE BRAS, Yvan, TABERLET, Pierre et COIS SAC, Eric, OBITOOLS : a UNIX-inspired software package for DNA metabarcoding. Molecular Ecology Resources, 2016, vol. 16, no. 1, pp. 176-182) : l’assemblage des séquences sens et antisens a été réalisé par le programme Illumina-pairend. Le programme NGSFliter identifie les amorces et les étiquetes et assigne chaque séquence à son échantillon ; Obiuniq rassemble les séquences identiques entre elles et les compte ; Obigrep élimine les séquences plus courtes que 10 paires de bases ou comptées moins de 10 fois ; Obiclean trie les séquences en repérant les erreurs de séquençage : Ecotag propose une assignation taxonomique à chaque séquence, avec un seuil de 95% identité, en les comparant avec une base de données sur les algues générée par PCR virtuelle par le programme EcoPCR ; enfin les séquences avec une occurrence de moins de 0,003 (0,3%) par taxon et par run sont éliminées pour éviter les mauvaises assignations. Résultats du séquençage :
Les résultats du séquençage nouvelle génération (NGS) sont constitués des différentes séquences génétiques amplifiées dans le produit d’extraction de l’échantillon analysé (tableau 6). Ces séquences d’ADN proviennent des plantes entrant dans la composition initiale du produit et/ou de tissus ou pollens de plantes qui arrivent pendant ou à la fin du processus de fabrication du produit ou lors des transferts et des échantillonnages.
Tableau 6 : Résultats du séquençage des 9 produits à base de melon pour le marqueur NdhA
Figure imgf000032_0001

Claims

REVENDICATIONS
1. Utilisation d’une paire d’amorces pour la détection et de préférence l’identification d’une plante choisie dans le genre Cucumis et plus particulièrement parmi les espèces Cucumis anguria, Cucumis dipsaceus, Cucumis melo, Cucumis metulifer, Cucumis myriocarpus et Cucumis sativus dans un échantillon susceptible d’en contenir, par l’amplification d’au moins une région variable du gène NdhA, ladite région variable du gène NdhA constituant un marqueur de détection et de préférence d’identification d’au moins une desdites espèces, dans laquelle la paire d’amorces consiste en une première amorce qui s’hybride à une séquence de 15 à 30 nucléotides contigus, choisie dans la séquence de SEQ ID NO: 1 du gène NdhA et une deuxième amorce qui s’hybride à une séquence de 15 à 30 nucléotides contigus, choisie dans la séquence de SEQ ID NO: 2 du gène NdhA.
2. Utilisation d’une paire d’amorces pour la détection et de préférence l’identification d’une plante selon la revendication 1, dans laquelle l’espèce est Cucumis melo.
3. Utilisation d’une paire d’amorces selon la revendication 1 ou 2, dans laquelle
- la première amorce a une séquence de 15 à 30 nucléotides contigus choisie dans la séquence SEQ ID NO: 3, et
- la deuxième amorce a une séquence de 15 à 30 nucléotides contigus choisie dans la séquence SEQ ID NO: 4.
4. Utilisation d’une paire d’amorces selon l’une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle ladite région variable du gène NdhA qui est amplifiée a une taille comprise de 90 à 120 paires de bases.
5. Utilisation d’une paire d’amorces selon l’une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle ladite région variable du gène NdhA comprend ou consiste en une séquence choisie dans le groupe constitué par: SEQ ID NO: 5 à 11, ou une séquence ayant un pourcentage d’identité d’au moins 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%.
6. Paire d’amorces dans laquelle:
- une première amorce comprend ou est constituée d’une séquence de 15 à 30 nucléotides contigus, complémentaire de la séquence SEQ ID NO: 1, et
- une deuxième amorce comprend ou est constituée d’une séquence de 15 à 30 nucléotides contigus, complémentaire de la séquence SEQ ID NO: 2.
7. Paire d’amorces selon la revendication 6, dans laquelle:
-la première amorce d’une taille comprise de 15 à 30 nucléotides contigus comprend ou est constituée par une séquence choisie parmi: SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO : 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO : 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO : 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, ou SEQ ID NO: 47, et
-la deuxième amorce d’une taille comprise de 15 à 30 nucléotides contigus comprend ou est constituée par une séquence choisie parmhSEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO : 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO : 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO : 75, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 82, ou SEQ ID NO: 83.
8. Marqueur de détection et de préférence d’identification d’une plante choisie parmi les espèces Cucumis anguria, Cucumis dipsaceus, Cucumis melo, Cucumis metulifer, Cucumis myriocarpus et Cucumis sativus ayant une taille comprise de 90 à 120 paires de bases, ledit marqueur comprenant ou étant constitué par une séquence amplifiée ayant un pourcentage d’identité d’au moins 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100% avec une séquence choisie parmi SEQ ID NO: 5 à 11.
9. Marqueur de détection et de préférence d’identification selon la revendication 8, dans lequel ledit marqueur comprend ou est constitué par une séquence amplifiée ayant un pourcentage d’identité d’au moins 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100% avec une séquence choisie parmi SEQ ID NO: 5 à 11 pour détecter ou de préférence identifier respectivement une plante choisie parmi les espèces Cucumis anguria, Cucumis dipsaceus, Cucumis melo, Cucumis metuliferus, Cucumis miriocarpus, et Cucumis sativus.
10. Procédé d’amplification et d’identification d’au moins une région variable du gène NdhA, ladite région variable constituant un marqueur de détection et de préférence d’identification d’une plante choisie parmi les espèces Cucumis anguria, Cucumis dipsaceus, Cucumis melo, Cucumis metulifer, Cucumis myriocarpus et Cucumis sativus, comprenant ou étant constitué des étapes suivantes:
a) une étape d’amplification de ladite région variable du gène NdhA susceptible d’être contenue dans un produit ou un échantillon, en utilisant
-la paire d’amorces consistant en une première amorce qui s’hybride à une séquence de 15 à
30 nucléotides contigus choisie dans la séquence de SEQ ID NO: 1 du gène NdhA et une deuxième amorce qui s’hybride à une séquence de 15 à 30 nucléotides contigus choisie dans la séquence de SEQ ID NO: 2 du gène NdhA ,
b) une étape de détermination ou d’identification de la présence d’une plante choisie parmi les espèces Cucumis anguria, Cucumis dipsaceus, Cucumis melo, Cucumis metulifer, Cucumis myriocarpus et Cucumis sativus dans ledit produit ou échantillon par la détection d’au moins une région variable amplifiée du gène NdhA.
11. Procédé d’amplification et d’identification d’au moins une région variable du gène NdhA selon la revendication 10, dans lequel ledit procédé comprend en outre avant l’étape a) une étape d’extraction du matériel nucléique d’un produit ou échantillon susceptible de contenir ladite région variable du gène NdhA
12. Procédé d’amplification et d’identification selon la revendication 10 ou 11, dans lequel ledit procédé comprend en outre une étape c) d’identification d’une plante choisie parmi les espèces Cucumis anguria, Cucumis dipsaceus, Cucumis melo, Cucumis metulifer, Cucumis myriocarpus et Cucumis sativus par séquençage de ladite région variable amplifiée et détectée du gène NdhA.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP5366887B2 (ja) * 2010-06-07 2013-12-11 日清食品ホールディングス株式会社 プライマー及び特定植物、特定動物の検出方法
JP5662530B2 (ja) * 2013-08-12 2015-01-28 日清食品ホールディングス株式会社 プライマー及び特定動物の検出方法
CN103509871B (zh) * 2013-09-30 2015-03-25 安徽中医药大学 药典三种秦艽药材的dna条形码鉴别方法

Non-Patent Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"Genbank", Database accession no. JF412791.1
BAFEEL S.O. ET AL., DNA BARCODING OF ARID WILD PLANTS USING RBCL GENE SEQUENCES, 2012
BOYER, FRÉDÉRICMERCIER, CÉLINEBONIN, AURÉLIELE BRAS, YVANTABERLET, PIERRECOIS SAC, ERIC: "OBITOOLS : a UNIX-inspired software package for DNA metabarcoding", MOLECULAR ECOLOGY RESOURCES, vol. 16, no. 1, 2016, pages 176 - 182
COISSAC, ERICRIAZ, TIAYYBAPUILLANDRE, NICOLAS: "Bioinformatic Challenges for DNA metabarcoding of plantes and animais", MOLECULAR ECOLOGY, vol. 21, 2012, pages 1834 - 1847
HEBERT, PAUL DN ET AL., BIOLOGICAL IDENTIFICATIONS THROUGH DNA BARCODES, 2003
HEBERT, PAUL DN ET AL., IDENTIFICATION OF BIRDS THROUGH DNA BARCODES, 2004
KATSUNORI TANAKA ET AL: "Diversification and genetic differentiation of cultivated melon inferred from sequence polymorphism in the chloroplast genome", BREEDING SCIENCE, vol. 63, no. 2, 1 January 2013 (2013-01-01), JP, pages 183 - 196, XP055567462, ISSN: 1344-7610, DOI: 10.1270/jsbbs.63.183 *
RENAUD LAHAYE ET AL., DNA BARCODING THE FLORAS OF BIODIVERSITY HOTSPOTS, 2008
RENNER ET AL., THE CUCURBITACEAE OF INDIA: ACCEPTED NAMES, SYNONYMS, GÉOGRAPHIE DISTRIBUTION, AND INFORMATION ON IMAGES AND DNA SEQUENCES, 2013
TANAKA KATSUNORI ET AL: "Seed size and chloroplast DNA of modern and ancient seeds explain the establishment of Japanese cultivated melon (Cucumis meloL.) by introduction and selection", GENETIC RESOURCES AND CROP EVOLUTION, KLUWER, DORDRECHT, NL, vol. 63, no. 7, 14 September 2015 (2015-09-14), pages 1237 - 1254, XP036057297, ISSN: 0925-9864, [retrieved on 20150914], DOI: 10.1007/S10722-015-0314-7 *

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